DE69433592T2

DE69433592T2 - Die erzielung hoher titer des rekombinanten aav-vektors

Info

Publication number: DE69433592T2
Application number: DE69433592T
Authority: DE
Inventors: Terence R. Flotte; Barrie J. Carter; William B. Guggino; Rikki Solow
Original assignee: Johns Hopkins University; Targeted Genetics Corp
Current assignee: Johns Hopkins University; Ampliphi Biosciences Corp
Priority date: 1993-11-09
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2005-02-10
Anticipated expiration: 2014-11-04
Also published as: DK0733103T3; WO1995013365A1; ATE260980T1; EP0733103A1; PT733103E; DE69433592D1; AU1129395A; ES2216005T3; JP2005110694A; CA2176117C; CA2176117A1; AU688428B2; EP0733103A4; EP0733103B1; JPH09509564A; US5658776A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Gentherapie und insbesondere Materialien und Verfahren, die zum Erzeugen hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren zur Verwendung in gentherapeutischen Verfahren verwendet werden.
Hintergrund der Erfindung
AAV-Vektoren sind für die Gentherapie nützlich, aber ein großes Hindernis war bisher das Unvermögen, ausreichende Quantitäten solcher rekombinanter Vektoren in Mengen herzustellen, die für die Anwendung in der Humangentherapie klinisch nützlich wären. Dies ist ein besonderes Problem für in vivo Anwendungen, wie die direkte Abgabe an die Lunge.
Adeno-assoziierte Virus- (AAV-) Vektoren gehören zu einer kleinen Zahl rekombinanter Virusvektorsysteme, die sich als in vivo Gentransfermittel nützlich erwiesen haben (Überblick bei Carter, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3:533:539; Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129) und daher potenziell von großer Bedeutung für die Humangentherapie sind. AAV-Vektoren sind zur hochfrequenten, stabilen DNA-Integration und -Expression in zahlreichen Zellen imstande, einschließlich zystischer Fibrose- (CF), bronchialer und nasaler Epithelzellen (Flotte et al., 1992a, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7:349-356; Egan et al., 1992, Nature, 358:581-584; Flotte et al., 1993a, J. Biol. Chem., 268:3781-3790; Flotte et al., 1993b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, in Druck), von menschlichem Knochenmark abgeleiteter Erythroleukämiezellen (Walsh et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7257-7261) und mehreren anderen. AAV bedürfen keiner aktiven Zellteilung für eine stabile Expression, was ein deutlicher Vorteil gegenüber Retroviren wäre, insbesondere in Gewebe, wie dem menschlichen Atemwegepithel, wo die meisten Zellen terminal differenziert und nicht teilend sind.
AAV ist ein defektes Parvovirus, das nur in Zellen wächst, in welchen bestimmte Funktionen durch ein co-infizierendes Helfervirus bereitgestellt sind (siehe 1). Allgemeine Überblicke über das AAV finden sich bei Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Band I, S. 169–228, Berns, 1990, Virology, S. 1743–1764, Raven Press (New York). Beispiele für co-infizierende Viren, die Helferfunktionen für das AAV-Wachstum und die Replikation bereitstellen, sind Adenoviren, Herpesviren und in einigen Fällen Pockenviren, wie Impfpocken. Die Eigenschaft der Helferfunktion ist nicht bekannt, scheint aber eine gewisse indirekte Wirkung des Helfervirus zu sein, das der Zelle die AAV-Replikation ermöglicht. Dieses Konzept wird durch die Beobachtung unterstützt, dass in bestimmen Fällen eine AAV-Replikation bei einem geringen Maß an Effizienz in Abwesenheit einer Helfervirus-Co-Infektion auftreten kann, wenn die Zellen mit Mitteln behandelt werden, die entweder genotoxisch sind oder den Zellzyklus aufbrechen.
Obwohl AAV bis zu einem beschränkten Maße in Abwesenheit eines Helfervirus unter bestimmten unüblichen Bedingungen replizieren können, wie zuvor festgehalten wurde, ist das allgemeinere Ergebnis, dass die Infektion von Zellen mit AAV in Abwesenheit von Helferfunktionen zu einer Integration des AAV in das Wirtszellgenom führt. Das integrierte AAV-Genom kann gewonnen und repliziert werden, um eine Menge an infektiösen AAV-Nachkommenpartikeln zu erhalten, wenn Zellen, die ein integriertes AAV-Provirus enthalten mit einem Helfervirus, wie Adenovirus, superinfiziert werden. Da die Integration von AAV ein effizientes Ereignis zu sein scheint, legt dies nahe, dass AAV ein nützlicher Vektor zur Einführung von Genen in Zellen für eine stabile Expression für Anwendungen wie der Humangentherapie sein könnte. Jüngere Ergebnisse (Kotin & Berns, 1989, Virology, 170; 460–467; Kotin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2211-2215; Samulski et al., 1991, EMBO J. 10:3941-3950) haben nahegelegt, dass AAV eine gewisse Präferenz für eine Integration an einer Stelle auf dem Humanchromosom 19 haben könnte, aber das allgemeine Prinzip und der Mechanismus dieses Phänomens sind noch nicht vollständig geklärt.
AAV hat einen sehr weiten Wirtsbereich, weder mit offensichtlicher Speziesnoch Gewebespezifität, und repliziert in nahezu jeder Zelllinie, die ihren Ursprung beim Menschen, Affen oder Nagetier hat, vorausgesetzt, ein geeigneter Helfer ist vorhanden. AAV ist überall vorkommend und wurde von einer Vielzahl von Tierspezies isoliert, einschließlich der meisten Säugetier- und mehrere Vogelspezies.
AAV wird nicht mit der Ursache für irgendeine Erkrankung in Zusammenhang gebracht. AAV ist kein transformierendes oder onkogenes Virus. Die AAV-Integration in Chromosome von Humanzelllinien bewirkt keine signifikante Veränderung in den Wachstumseigenschaften oder morphologischen Eigenschaften der Zellen. Diese Eigenschaften von AAV sind auch eine Empfehlung für einen möglicherweise nützlichen humangentherapeutischen Vektor, da die meisten der anderen viralen Systeme, die für diese Anwendung vorgeschlagen sind, wie Retroviren, Adenoviren, Herpesviren oder Pockenviren, krankheitserregende Viren sind.
AAV-Partikel bestehen aus einem Proteincapsid mit drei Capsidproteinen, VP1, VP2 und VP3, die ein DNA-Genom einschließen. Das AAV-DNA-Genom ist ein lineares, einzelsträngiges DNA-Molekül mit einem Molekulargewicht von etwa 1,5 × 10⁶ Dalton oder einer Länge von etwa 4680 Nucleotiden. Stränge jeder Komplementärrichtung, "Plus"- oder "Minus-" Stränge, sind in einzelne Partikel verpackt, aber jedes Partikel hat nur ein DNA-Molekül. Gleiche Anzahlen von AAV-Partikeln enthalten entweder einen Plus- oder einen Minus-Strang. Jeder Strang ist gleichermaßen infektiös, und die Replikation erfolgt durch Umkehr des elterlichen infizierenden Einzelstrangs zu einer doppelsträngigen Form und anschließende Amplifizierung eines großen Pools doppelsträngiger Moleküle, von welchen Nachkommen-Einzelstränge abgelöst und in Capside verpackt werden. Doppel- oder einzelsträngige Kopien von AAV-Genomen, die in bakterielle Plasmide oder Phagemide eingesetzt sind, sind infektiös, wenn sie in Adenovirus-infizierte Zellen transfiziert werden, und dies hat die Untersuchung der AAV-Genetik und die Entwicklung von AAV-Vektoren ermöglicht. Der Replikationszyklus von AAV ist in 1 dargestellt.
Das AAV2-Genom hat eine Kopie der 145 Nucleotid langen ITR ("inverted terminal repeat" – invertierte terminate Wiederholung) jedes Endes einer einmaligen Sequenzregion mit einer Länge von etwa 4470 Nucleotiden (Srivastava et al., 1983, J. Virol., 45:555-564), die zwei offene Hauptleserahmen für die rep- und cap-Gene enthält (Hermonat et al., J. Virol. 51:329-339; Tratschin et al., 1984a, J. Virol., 51:611-619). Die einmalige Region enthält drei Transkriptionspromotoren, p₅, p₁₉ und p₄₀ (Laughlin et al., 1979, Proc. Natl.. Acad. Sci. USA, 76:5567-5571), die zur Expression der rep- und cap-Gene verwendet werden. Die ITR-Sequenzen sind in cis erforderlich und sind ausreichend, um einen funktionellen Replikationsursprung (ori) bereitzustellen, und sind auch ausreichend, um Signale zu liefern, die für eine Integration in das Zellgenom erforderlich sind, wie auch für ein effizientes Ausschneiden und Gewinnen aus Wirtszellenchromosomen oder aus rekombinanten Plasmiden. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die ITR direkt als Transkriptionspromotor in einem AAV-Vektor dienen kann (Flotte et al., 1993, siehe oben).
Die rep- und cap-Gene sind in trans erforderlich, um Funktionen für die Replikation beziehungsweise Encapsidation eines viralen Genoms bereitzustellen. Das rep-Gen wird von zwei Promotoren, p₅ und p₁₉, exprimiert. Die Transkription von p₅ ergibt eine ungespleißte 4,2 kb mRNA, die für ein Protein, Rep78, codiert und eine gespleißte 3,9 kb mRNA, die für ein Protein, Rep68, codiert. Die Transkription von p₁₉ ergibt eine ungespleißte mRNA, die für Rep52 codiert, und eine gespleißte 3,3 kb mRMA, die für Rep40 codiert. Somit umfassen die vier Rep-Proteine alle eine gemeinsame interne Regionsequenz, unterscheiden sich aber in Hinblick auf ihre Amino- und Carboxyl-Endregionen. Nur Rep78 und Rep68 sind für eine AAV-Doppelstrang-DNA-Replikation notwendig, aber Rep52 und Rep40 scheinen für die Nachkommen-Einzelstrang-DNA-Akkumulation erforderlich zu sein. Mutationen in Rep78 und Rep68 sind phänotypisch Rep^– , während Mutationen, die nur Rep52 und Rep40 betreffen, Rep⁺,. aber Ssd^– sind. Rep68 und Rep78 binden spezifisch an die Haarnadelstruktur der AAV-ITR und besitzen mehrere Enzymaktivitäten, die zur Lösung der Replikation an den AAV-Termini notwendig sind. Rep52 und Rep40 haben keine dieser Eigenschaften.
Die Rep-Proteine, vorwiegend Rep78 und Rep68 weisen mehrere pleiotrope regulatorische Aktivitäten auf, einschließlich der positiven und negativen Regulation von AAV-Genen und der Expression von einigen heterologen Promotoren, wie auch hemmende Wirkungen auf das Zellwachstum (Tratschin et al., 1986, Mol. Cell Biol., 6:2884-2894; Labow et al., 1987, Mol. Cell Biol., 7:1320-1325; Khleif et al., Virology, 181:738-741). Der AAV-p₅-Promotor ist durch Rep78 oder Rep68 negativ autoreguliert (Tratschin et al., 1986, Mol. Cell Biol., 6:2884-2894). Wegen der hemmenden Wirkungen der Expression von rep auf das Zellwachstum wurde eine konstitutive Expression von rep in Zelllinien nicht leicht erreicht. Zum Beispiel berichteten Mendelson et al. (1988, Virology, 166:154-165) von einem sehr geringen Maß an Expression einiger Rep-Proteine in bestimmten Zelllinien nach einer stabilen Integration von AAV-Genomen.
Die Proteine VP1, VP2 und VP3 haben alle eine gemeinsame überlappende Sequenz, unterscheiden sich aber darin, dass VP1 und VP2 eine zusätzliche aminoterminale Sequenz enthalten. Alle drei werden von demselben cap-Gen-Leserahmen codiert, der von einer gespleißten 2,3 kb mRNA exprimiert wird, die von dem p₄₀-Promotor transkribiert wird. VP2 und VP3 werden von derselben mRNA unter Verwendung wechselnder Initiationscodons erzeugt. Für VP1 codiert eine Minor-mRNA unter Verwendung einer 3'-Donorstelle, die 30 Nucleotide stromaufwärts von dem 3'-Donor liegt, der für die Major-mRNA verwendet wird, die für VP2 und VP3 codiert. VP1, VP2 und VP3 sind alle für die Capsidproduktion notwendig. Mutationen, die alle drei Proteine (Cap^–) eliminieren, verhindern eine Ansammlung einer einzelsträngigen Nachkommen-AAV-DNA, während Mutationen im VP1-Aminoterminus (Lip^–, Inf^–) eine einzelsträngige Produktion ermöglichen, aber eine Zusammenfügung stabiler infektiöser Partikel vermeiden.
Die genetische Analyse von AAV, die zuvor beschrieben wurde, beruht auf der Mutationsanalyse von AAV-Genomen, die molekular zu bakteriellen Plasmiden geklont wurden. In einer früheren Arbeit wurden molekulare Klone infektiöser Genome von AAV durch Einfügen doppelsträngiger Moleküle von AAV in Plasmide durch Verfahren wie das GC-Tailing (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 79:2077-2081), Hinzufügen synthetischer Linker, die Restriktionsendonuclease enthalten (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) oder durch direkte, stumpfendige Ligation (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666) konstruiert. Es wurde dann gezeigt, dass die Transfektion solcher AAV-rekombinanter Plasmide in Säugetierzellen, die auch mit einem geeigneten Helfervirus, wie Adenovirus, infiziert waren, zu einer Gewinnung und Exzision des AAV-Genoms frei von Plasmidsequenzen und Replikation des gewonnenen Genoms und Erzeugung einer Ausbeute von infektiösen Nachkommen-AAV-Partikeln führte (siehe 1). Dies schuf die Basis für die Durchführung einer genetischen Analyse von AAV, wie oben zusammengefasst, und ermöglichte die Konstruktion von AAV-transduzierenden Vektoren.
Basierend auf der genetischen Analyse wurden die allgemeinen Prinzipien der AAV-Vektorkonstruktion definiert, wie kürzlich zusammengefasst (Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 3:533-539; Muzyczka, 1992, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129). AAV-Vektoren werden in AAV rekombinanten Plasmiden durch Substituieren von Teilen der AAV-Codierungssequenz durch Fremd-DNA konstruiert, um ein Vektorplasmid zu erzeugen. In dem Vektorplasmid müssen die terminalen (ITR) Abschnitte der AAV-Sequenz intakt bleiben, da diese Regionen in cis für mehrere Funktionen notwendig sind, einschließlich der Exzision von dem Plasmid nach der Transfektion, der Replikation des Vektorgenoms und der Integration und Gewinnung aus einem Wirtszellengenom. Der Vektor kann dann in ein AAV-Partikel verpackt werden, um ein AAV-transduzierendes Virus durch Transfektion des Vektorplasmids in Zellen zu erzeugen, die mit einem geeigneten Helfervirus, wie Adenovirus oder Herpesvirus, infiziert sind. Um eine Replikation und Encapsidation des Vektorgenoms in AAV-Partikel zu erreichen, muss das Vektorplasmid für alle AAV-Funktionen, die in trans notwendig sind, nämlich rep und cap, komplementiert werden, die bei der Konstruktion des Vektorplasmids deletiert wurden.
Es gibt wenigstens zwei wünschenswerte Merkmale jedes AAV-Vektors, der zur Verwendung in der Humangentherapie bestimmt ist. Erstens muss der transduzierende Vektor bei ausreichend hohen Titern erzeugt werden, damit er als Abgabesystem brauchbar ist. Dies ist besonders für Gentherapiestratageme wichtig, die auf eine in vivo Abgabe des Vektors gerichtet sind. Es ist wahrscheinlich, dass für viele gewünschte Anwendungen von AAV-Vektoren, wie die Behandlung einer zystischen Fibrose durch direkte in vivo Abgabe an den Atemweg, die erforderliche Dosis an transduzierendem Vektor höher als 10¹⁰ sein kann. Zweitens müssen die Vektorzubereitungen frei von Wildtyp-AAV-Virus sein. Hohe Titer von AAV-Vektoren sind aus mehreren Gründen schwierig zu erreichen, die die bevorzugte Encapsidation von Wildtyp-AAV-Genomen umfassen, wenn diese vorhanden sind oder durch Rekombination erzeugt werden, sowie die Unfähigkeit, ausreichende komplementierende Funktionen, wie rep oder cap zu erzeugen. Geeignete Zelllinien, die solche komplementierenden Funktionen exprimieren, wurden nicht erzeugt, zum Teil wegen mehrerer Hemmfunktionen des rep-Gens.
Die ersten AAV-Vektoren, die beschrieben wurden, enthielten fremde Reportergene, wie neo oder cat oder dhfr, die von AAV-Transkriptionspromotoren oder einem SV40-Promotor exprimiert wurden (Tratschin et al., 1984b, Mol. Cell. Biol., 4:2071-2081; Hermonat & Muzyczka, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:3251-3260; McLaughlin et al., 1988, J. Virol., 62:1963-1973; Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349-356). Diese Vektoren wurden in AAV-transduzierende Partikel durch Co-Transfektion in Adenovirus-infizierte Zellen gemeinsam mit einem zweiten Verpackungsplasmid verpackt, das die AAV-rep- und -cap-Gene enthielt, die von den natürlichen Wildtyp-AAV-Transkriptionspromotoren exprimiert werden. In einem Versuch, eine Verpackung des Verpackungsplasmids zu vermeiden, das die rep- und cap-Gene enthielt, die von den natürlichen Wildtyp-AAV-Transkriptionspromotoren exprimiert werden. In einem Versuch, eine Verpackung des Verpackungsplasmids in AAV-Partikel zu vermeiden, wurden mehrere Methoden angewandt. In einigen Fällen (Hermonat & Muzyczka, 1984; McLaughlin et al., 1988) war in dem Verpackungsplasmid eine große Region von Bakteriophage Lambda DNA in der AAV-Sequenz eingesetzt, um ein übergroßes Genom zu erzeugen, das nicht verpackt werden konnte. In anderen Fällen (Tratschin et al., 1984b; Tratschin et al., 1985, Lebkowski et al., 1988) waren bei dem Verpackungsplasmid die ITR-Regionen von AAV deletiert, so dass es nicht exzisiert und repliziert und daher nicht verpackt werden konnte. Mit allen diesen Methoden konnte die Erzeugung von Partikeln, die Wildtyp-AAV-DNA enthielten, nicht vermieden werden und es konnten keine effektiven hohen Titer von AAV-transduzierenden Partikeln erzeugt werden. Tatsächlich wurden Titer von nicht mehr als 10⁴ ml von Hermonat & Muzyczka, 1984, angegeben. Die Produktion von Wildtyp-AAV-Partikeln in diesen Studien war wahrscheinlich auf die Gegenwart einer überlappenden Homologie zwischen AAV-Sequenzen, die in dem Vektor und den Verpackungsplasmiden vorhanden waren, zurückzuführen. Senapathy und Carter (1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666) zeigten, dass das Ausmaß der Rekombination in einem solchen System etwa gleich dem Ausmaß an Sequenzüberlappung ist. In einem Überblick über die frühe Arbeit (Carter 1989, Handbook of Parvoviruses, Band II, S. 247–284, CRC Press, Boca Raton, FL) wurde nahegelegt, dass Titer von 10⁶ pro ml erhalten werden könnten, aber dies beruhte auf den oben genannten Studien, in welchen große Mengen an Wildtyp-AAV die Vektorzubereitung kontaminierten. Solche Vektorzubereitungen, die Wildtyp-AAV enthalten, sind für die Humangentherapie nicht nützlich. Ferner wiesen diese frühen Vektoren geringe Transduktionseffizienzen auf und transduzierten nicht mehr als 1 oder 2 % von Zellen in Kulturen verschiedener Humanzelllinien, obwohl die Vektoren in Multiplizität von bis zu 50 000 Partikeln pro Zelle zugeführt wurden. Dies könnte teilweise die Kontamination mit Wildtyp-AAV-Partikeln und die Gegenwart des AAV-rep-Gens in dem Vektor reflektieren. Ferner zeigten Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3829), dass das Vorhandensein des Wildtyp-AAV die Aus beute an verpacktem Vektor deutlich erhöhte. Somit kann die Ausbeute an verpacktem Vektor in Verpackungssystemen, in welchen die Produktion an Wildtyp-AAV beseitigt wird, tatsächlich geringer sein. Dennoch ist es für die Verwendung in jeder klinischen Anwendung am Menschen wichtig, die Produktion an Wildtyp-AAV zu beseitigen.
Zusätzliche Studien (McLaughlin et al., 1988; Lebkoswski et al., 1988) zur Erzeugung von AAV-Vektoren, die das AAV-rep- oder -cap-Gen nicht enthalten, stießen weiterhin auf die Erzeugung von Wildtyp-AAV und erzeugten weiterhin sehr geringe Transduktionsfrequenzen auf Humanzelllinien. Daher berichteten McLaughlin et al., 1988, dass AAV-rep^–cap^–=Vektoren, die das neo-Gen enthielten, das mit demselben Verpackungsplasmid verpackt war, das früher von Hermonat & Muzyczka (1984) verwendet wurde, weiterhin Wildtyp-AAV enthielten. Folglich war es nur möglich, dieses Virus bei einer Multiplizität von 0,03 Partikeln pro Zelle (d.h., 300 infektiösen Einheiten pro 10 000 Zellen) zu verwenden, um Doppeltreffer mit Vektor- und Wildtyp-Partikel zu vermeiden. Nachdem das Experiment auf diese Weise, durch Infizieren von 32 000 Zellen mit 1000 infektiösen Einheiten, durchgeführt wurde, wurden durchschnittlich 800 Geneticin-resistente Kolonien erhalten. Obwohl dies so interpretiert wurde, dass das Virus imstande sei, eine Transduktionsfrequenz von 80 % zu erreichen, waren tatsächlich nur 2,5 % der Zellen transduziert. Somit war der effektiv nützliche Titer dieses Vektors begrenzt. Ferner zeigt diese Studie nicht, dass der tatsächliche Titer der Vektorzubereitung höher als jene war, die zuvor von Hermonat & Muzyczka (1984) erhalten worden waren. Ebenso verpackten Lebkowski et al., 1988, AAV-Vektoren, die weder ein rep- noch ein cap- Gen enthielten, und verwendeten ein ori-Verpackungsplasmid pBalA, das mit jenem identisch ist, das früher von Tratschin et al. (1984b, 1985) verwendet wurde, und berichteten von Transduktionsfrequenzen, die ähnlich nieder waren, da für mehrere Humanzelllinien nicht mehr als 1 % der Zellen zu einer Geneticinresistenz transduziert werden konnten, auch nicht mit den am höchsten konzentrierten Vektormaterialien. Lebkowski et al. (1988) gaben die tatsächlichen Vektortiter nicht aussagekräftig an, aber die biologischen Tests, die nicht mehr als 1 % Transduktionsfrequenz zeigten, wenn 5 × 10⁶ Zellen drei ml einer Vektorzubereitung ausgesetzt wurden, lassen darauf schließen, dass der Titer geringer als 2 × 10⁴ war. Ebenso enthält das pBa1-Verpackungsplasmid überlappende Homologie mit der ITR-Sequenz in dem Vektor und führt zur Erzeugung von Wildtyp-AAV durch Rekombination.
Laface et al. (1988) verwendete denselben Vektor wie jenen, der von Hermonat & Muzyczka (1984) verwendet worden war, der auf dieselbe Weise hergestellt war, und erreichten eine Transduktionsfrequenz von 1,5 % in murinen Knochenmarkkulturen, wobei sich wieder ein sehr geringer Titer zeigte.
Samulski et al. (1987, J. Virol., 61:3096-3101) konstruierten ein Plasmid, das als pSub201 bezeichnet wurde, das ein intaktes AAV-Genom in einem bakteriellen Plasmid ist, aber eine Deletion of 13 Nucleotiden am Ende jeder ITR aufweist und somit weniger effizient als andere AAV-Plasmide gewonnen und repliziert wird, die das gesamte AAV-Genom enthalten. Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828) konstruierten AAV-Vektoren auf der Basis von pSub201, die aber rep und cap deletiert haben und entweder ein hyg- oder neo-Gen enthalten, das von einem frühen SV40 Genpromotor exprimiert wird. Sie verpackten diese Vektoren durch Co-Transfektion mit einem Verpackungsplasmid, das als pAAV/Ad bezeichnet wird, das aus der gesamten AAV-Nucleotidseugenz von Nucleotid 190 bis 4490 besteht, das an jedem Ende mit einer Kopie der Adenovirus-ITR eingeschlossen ist. In diesem Verpackungsplasmid wurden die AAV-rep- und cap-Gene von den natürlichen AAV-Promotoren p₅, p₁₉ und p₄₀ exprimiert. Es wurde angenommen, dass die Funktion der Adenovirus-ITR in pAAV/Ad den Expressionswert von AAV-Capsidproteinen verstärkt. Rep wird jedoch von seinem homologen Promotor exprimiert und wird negativ reguliert und daher ist seine Expression begrenzt. Unter Verwendung ihres Encapsidationssystems erzeugten Samulski et al., 1989, AAV-Vektormaterialien, die im Wesentlichen frei von Wildtyp-AAV waren, aber transduzierende Titer von nur 3 × 10⁴ Hygromycin-resistenten Einheiten pro ml Überstand hatten. Wenn ein Wildtyp-AAV-Genom in dem Verpackungsplasmid verwendet wurde, war der Titer der AAV-Vektorzubereitung auf 5 × 10⁴ erhöht. Der geringe Titer, der in diesem System erzeugt wurde, scheint somit teilweise auf den Defekt in den ITR-Sequenzen des pSub201-Ausgangsplasmids zurückzuführen zu sein, das zur Vektorkonstruktion verwendet wurde, und teilweise auf die begrenzende Expression von AAV-Genen von pAAV/Ad. In einem Versuch, den Titer der AAVneo-Vektorzubereitung zu erhöhen, erzeugten Samulski et al., 1989, Vektormaterialien durch Transfizieren, im Bulk, von dreißig 10 cm Schalen mit 293-Zellen und Konzentrieren des Vektormaterials durch Bandierung in CsCl. Dies erzeugte ein AAVneo Vektormaterial, das insgesamt 10⁸ Partikel enthielt, wie durch einen DNA-Dot-Blot-Hybridisierungstest gemessen wurde. Wenn dieses Vektormaterial in Multiplizitäten von bis zu 1000 Partikeln pro Zelle verwendet wurde, wurde eine Transduktionsfrequenz von 70 erhalten. Dies legt nahe, dass das Partikel/Transduktionsverhältnis etwa 500 bis 1000 Partikel ist, da bei dem Verhältnis von einer transduzierenden Einheit pro Zelle der erwartete Anteil von Zellen, die transduziert sein sollten, gemäß der Poissonschen Verteilung 63 % ist.
Obwohl das System von Samulski et al., 1989, unter Verwendung des Vektorplasmids pSub201 und des Verpackungsplasmids pAAV/Ad keine überlappende AAV-Sequenzhomologie zwischen den zwei Plasmiden hatte, gibt es eine überlappende Homologie an den Xbal-Stellen und eine Rekombination dieser Stellen führt zur Erzeugung eines vollständigen Wildtyp-AAV. Das heißt, obwohl keine überlappende Homologie der AAV-Sequenz vorhanden ist, ist die vollständige AAV-Sequenz in den zwei Plasmiden enthalten, und daher kann eine Rekombination einen Wildtyp-AAV erzeugen, was unerwünscht ist. Dass diese Rekombinationsklasse in AAV-Plasmiden auftritt, wurde von Senapathy & Carter (1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666) gezeigt. Wegen der Probleme eines geringen Titers und der Möglichkeit, Wildtyp-Rekombinante zu erzeugen, besitzt daher das System, das von Samulski et al., 1989, beschrieben wurde, keine Nützlichkeit für die Humangentherapie.
Mehrere andere Berichte haben AAV-Vektoren beschrieben. Srivastava et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8078-8082) beschrieben einen AAV-Vektor auf der Basis des pSub201-Plasmids von Samulski et al. (1987), in dem die Kodierungssequenzen von AAV durch die Kodierungssequenzen eines anderen Parvovirus, B19, ersetzt waren. Dieser Vektor wurde in AAV-Partikel unter Verwendung des pAAV/Ad-Verpackungsplasmids verpackt und erzeugte einen funktionalen Vektor, aber es wurden keine Titer angegeben. Dieses System beruht auf pSub201 und hat daher den Mangel, der zuvor für dieses Plasmid beschrieben wurde. Zweitens enthielten sowohl der Vektor als auch das Verpackungsplasmid überlappende AAV-Sequenzen (die ITR-Regionen) und daher ist eine Rekombination, die zu kontaminierendem Wildtyp-Virus führt, äußerst wahrscheinlich.
WO92/10574 betrifft die Hemmung von HIV. Dieses Dokument betrifft Pasmide mit einem rep-Gen, das funktionsfähig an den HIV-LTR-Promotor gebunden ist eine AAVITR-Sequenz enthält.
Chatterjee et al. (1991, Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 85–89), Wong et al. (1991, Vaccines 91, Gold Spring Harbor Laboratory Press, S. 183–189), und Chatterjee et al. (1992, Science, 258:1485-1488) beschreiben AAV-Vektoren, die zum Exprimieren von Antisense-RNA bestimmt sind, die gegen infektiöse Viren, wie HIV oder Herpes simplex Virus, gerichtet ist.
Die Autoren gaben jedoch keine Titer für ihre AAV-Vektormaterialien an. Ferner verpackten sie ihre Vektoren unter Verwendung eines Ori^–-Verpackungsplasmids, das jenem analog ist, das von Tratschin et al. (1984b, 1985) verwendet wurde, das das Ba1A-Fragment des AAV-Genoms enthält, und daher enthielt ihr Verpackungsplasmid AAV-Vektorsequenzen, die mit AAV-Sequenzen Homologie aufweisen, die in ihren Vektorkonstrukten vorhanden waren. Dies führt auch zur Erzeugung von Wildtyp-AAV. So verwendeten Chatterjee et al. und Wong et al. ein Verpackungssystem, von dem bekannt ist, dass es nur einen geringen Titer ergibt, und das wegen der überlappenden Homologie in den Vektor- und Verpackungssequenzen zur Erzeugung von Wildtyp-AAV-Genomen führen kann.
Andere Berichte haben die Verwendung von AAV-Vektoren zur Expression von Genen in Humanlymphozyten (Muro-Cacho et al., 1992, J. Immunotherapy, 11:231-237) oder einer humanen, erythroiden Leukämiezelllinie (Walsh et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7257-7261) mit Vektoren, die auf dem pSub201-Vektorplasmid basieren, und pAAV/Ad-Verpackungsplasmid beschrieben. Auch hier wurden keine Titer von Vektormaterialien angegeben und waren offensichtlich gering, da ein selektives Markergen zur Identifizierung jener Zellen verwendet wurde, die erfolgreich mit dem Vektor transduziert waren.
Es wurde von der Transduktion humaner Luftweg-Epithelzellen, die in vitro von einem Patienten mit zystischer Fibrose gezüchtet wurden, mit einem AAV-Vektor berichtet, der das selektive Markergen neo von dem AAV-p₅-Promotor exprimiert (Flotte et al., 1992, Am. H. Respir. Cell. Mol. Biol., 7:349-356). In dieser Studie wurde der AAVneo-Vektor in AAV-Partikeln unter Verwendung des pAAV/Ad-Verpackungsplasmids verpackt. Bis zu 70 % der Zellen in der Kultur konnten zu einer Geneticinresistenz transduziert werden und das Partikel/Transduktionsverhältnis war ähnlich jenem, das von Samulski et al.
(1989) berichtet wurde. Somit war eine Multiplizität von bis zu mehreren hundert Vektorpartikeln pro Zelle erforderlich, um eine Transduktion von 70 % der Zellen zu erreichen. Die Transduktion von humanen Luftweg-Epithelzellen in einer in vitro Kultur unter Verwendung eines AAV-transduzierenden Vektors, der das CFTR-Gen von dem AAV-ITR-Promotor exprimiert, zeigte, dass die Zellen funktional hinsichtlich des elektrophysiologischen Defekts in der Chloridkanalfunktion korrigiert werden konnten, der in Zellen von Patienten mit zystischer Fibrose vorhanden ist (Egan et al., Nature, 1992, 358:581-584; Flotte et al., J. Biol. Chem., 268:3781-3790).
Die oben genannten Studien legen nahe, dass AAV-Vektoren eine mögliche Nützlichkeit als Vektoren zur Behandlung von Erkrankungen des Menschen durch Gentherapie haben könnten. Die Fähigkeit, ausreichende Mengen an AAV-Vektoren zu erzeugen, war jedoch eine ernsthafte Beschränkung in der Entwicklung einer Humangentherapie unter Verwendung von AAV-Vektoren. Ein Aspekt dieser Einschränkung hat auch zu dem bisherigen Fehlen von Studien geführt, die AAV-Vektoren in in vitro Tiermodellen verwenden. Dies reflektiert allgemein die Schwierigkeit, die mit der Erzeugung ausreichender Mengen an AAV-Vektormaterialien mit ausreichend hohem Titer verbunden ist, um bei der Analyse einer in vivo Abgabe und Genexpression nützlich zu sein. Einer der einschränkenden Faktoren für die AAV-Gentherapie war die relative Ineffizienz der Vektorverpackungssysteme, die verwendet wurden. Wegen des Mangels an Zelllinien, die die AAV-trans-komplementierenden Funktionen exprimieren, wie rep und cap, wurde eine Verpackung von AAV-Vektoren in Adenovirus-infizierten Zellen durch Co-Transfektion eines Verpackungsplasmids und eines Vektorplasmids erreicht. Die Effizienz dieses Verfahrens kann durch die Effizienz der Transfektion jedes der Plasmidkonstrukte begrenzt sein, wie auch durch das Ausmaß der Expression von Rep-Proteinen von den Verpackungsplasmiden, die bisher beschrieben wurden. Jedes dieser Probleme scheint mit den biologischen Aktivitäten der AAV-Rep-Proteine in Zusammenhang zu stehen. Zusätzlich, wie zuvor festgehalten wurde, haben alle der zuvor beschriebenen Verpackungssysteme die Fähigkeit, Wildtyp-AAV durch Rekombination zu erzeugen.
Der Mangel an Zelllinien, die stabil funktionales Rep exprimieren, reflektiert offensichtlich eine zytotoxische oder zytostatische Funktion von Rep, wie durch die Hemmung von Rep durch eine neo-resistenten Kolonieformation gezeigt wird (Labow et al., 1987; Trempe et al., 1991). Dies scheint auch mit der Neigung von Rep in Zusammenhang zu stehen, den immortalisierten Phänotyp in gezüchteten Zellen umzukehren, wodurch die Produktion von Zelllinien, die funktionales Rep stabil exprimieren, extrem schwierig wird. Es wurden mehrere Versuche unternommen, Zelllinien zu erzeugen, die Rep exprimieren. Mendelson et al. (1988, Virology, 166:154-165) berichteten, dass sie in einer Zelllinie nach einer stabilen Transfektion von HeLa oder 293-Zellen mit Plasmiden, die ein AAV-rep-Gen enthielten, eine gewisse geringe Expression von AAV-Rep52-Protein erreichten, aber nicht von Rep78- oder Rep68-Protein. Auf Grund des Fehlens von Rep78- und Rep68-Proteinen konnte der Vektor in der Zelllinie nicht erzeugt werden. Eine andere Zelllinie lieferte eine kaum erfassbare Menge an Rep78, die nicht funktional war.
Vincent et al. (1990, Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 353-359) versuchten Zelllinien herzustellen, die die AAV-rep- und -cap-Gene enthielten, die von den normalen AAV-Promotoren exprimiert werden, aber diese Versuche waren nicht erfolgreich, entweder weil die Vektoren mit einem hundertfachen Überschuss an Wildtyp-AAV-Partikeln kontaminiert waren, oder weil die Vektoren bei nur sehr geringen Titern von weniger als 4 × 10³ erzeugt wurden.
In einer anderen Methode konstruierten Lebkowski et al. (US Patent 5,173,414, erteilt am 22. Dez. 1992) Zelllinien, die AAV-Vektoren in einem episomalen Plasmid enthielten. Diese Zelllinien konnten dann mit Adenovirus infiziert und mit den trans-komplementierenden AAV-Funktionen rep und cap transfiziert werden, um Zubereitungen eines AAV-Vektors zu erzeugen. Es wird beansprucht, dass dies die Herstellung von AVV-Materialien höherer Titer ermöglicht. In den dargestellten Beispielen ist jedoch die einzige dargestellte Information, die sich auf den Titer bezieht, dass eine Humanzelllinie, K562, bei Effizienzen von nur 1 % oder weniger transduziert werden konnte, was nicht auf eine Produktion hoher Titer eines AW-Vektors hinweist. In diesem System wird der Vektor als Episomal (nichtintegriertes Konstrukt) getragen und es wird behauptet, dass integrierte Kopien des Vektors nicht bevorzugt sind.
Die Methode zum Verpacken von AAV-Vektoren, die von Lebowski et al., 1992, beschrieben ist, hat mehrere unerwünschte Aspekte. Erstens ist es nicht wünschenswert, den Vektor als nichtintegriertes, episomales Plasmid hoher Kopiezahl in einer Zelllinie zu halten, da die Kopiezahl pro Zelle nicht streng kontrolliert werden kann und episomale DNA eher eine Neuanordnung erfährt, die zur Herstellung defekter Vektoren führt. Zweitens muss in diesem System der Vektor noch durch Infizieren der Zelllinie mit Adenovirus und Einführen eines Plasmids, das die AAV-rep- und -cap-Gene enthält, verpackt werden. Das Plasmid, das von Lebkowski et al., 1992, verwendet wurde, war wieder pBa1, das, wie zuvor festgehalten wurde, eine überlappende Homologie mit den Vektor-ITR-Sequenzen hat und zur Erzeugung von Wildtyp-AAV führt. Drittens wird in dem pBa1-Verpackungsplasmid, das von Lebkowski et al., 1988, 1992, verwendet wird, das rep-Gen von seinem p₅-Promotor exprimiert und ist daher negativ autoreguliert und daher ist wahrscheinlich, dass die rep-Expression begrenzt ist.
Das Problem suboptimaler Werte der rep-Expression nach einer Plasmidtransfektion kann mit einer anderen biologischen Aktivität dieser Proteine in Zusammenhang stehen. Es gibt einen Hinweis (Tratschin et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6:2884-2894), dass AAV-Rep-Proteine ihre eigene Expression von dem AAV-p₅-Promotor herabregulieren, der in allen zuvor beschriebenen Verpackungskonstrukten verwendet wurde, wie pAAV/Ad (Samulski et al., 1989) oder pBa1 (Lebkowski et al., 1988, 1992).
Kurzdarstellung der Erfindung
Eine der grundlegenden Herausforderungen für die Gentherapie war die Entwicklung von Strategien zur Transduktion von Zellen und Geweben, die nicht leicht ex vivo manipuliert werden können, oder die nicht aktiv teilen. AAV-Vektoren können einen in vivo Gentransfer zum Beispiel im Atmungstrakt bewirken, aber hohe Titer sind kritisch, so dass die Abgabe einer ausreichend hohen Multiplizität von Vektor in einem möglichst geringen Volumen möglich ist. Dadurch erhält eine optimale Verpackungsmethodologie in der Bestimmung der Durchführbarkeit einer Gentherapie auf AAV-Basis zentrale Bedeutung. Stabile AAV-Verpackungszelllinien ohne Helfer waren unzuverlässig, vorwiegend auf Grund der Aktivitäten des Rep-Proteins, das seine eigene Expression herabreguliert und die zellulare Immortalisierung umkehrt. Die Verfahren, die in dieser Erfindung beschrieben sind, umgehen diese Probleme effektiv und haben deutliche Verbesserungen in der Verpackungseffizienz ermöglicht.
Die Verwendung eines HIV-LTR-Promotors zum Exprimieren hoher Werte von AAV-Rep-Proteinen wurde an anderer Stelle berichtet (Antoni et al., 1991), aber die Anwendung dieses Expressionssystems zur Verpackung rekombinanter AAV-Vektoren ist eine neue Entwicklung.
Tatsächlich wurde bisher nicht gezeigt, dass die Werte der Rep-Expression im Co-Transfektions-AAV-Vektor-Verpackungsprozess begrenzend sind. Die Tatsache, dass eine zehnfache Erhöhung im Verpackungstiter durch Erhöhen der Rep-Expression erreicht wurde, liefert einen direkten Beweis, dass die Rep-Werte unter diesem Umstand begrenzend sind. Die Tatsache, dass eine pARtat-Co-Transfektion die Verpackungseffizienz nicht weiter erhöhte, könnte entweder anzeigen, dass (1) das Ausmaß der Expression von dem HIV-Promotor in 293-Zellen selbst in Abwesenheit von tat maximimiert war, oder (2), dass die Werte von Rep, die nur mit pRS5 erreicht wurden, ausreichend waren um sicherzustellen, dass die Rep-Expression für die Verpackungseffizienz nicht mehr einschränkend war. Es wäre nun offensichtlich, dass andere, Nicht-AAV-Promotoren zur Erzeugung von Rep in Verpackungsplasmiden analog zu pRS5 verwendet werden könnten.
Ebenso ist das Phänomen der Gewinnung integrierter rekombinanter AAV-Genome bekannt (Tratschin et al., 1985; Flotte et al., 1993a), wurde aber noch nie zur Herstellung einer vektorproduzierenden Zelllinie verwendet, wie hierin beschrieben wurde.
Die gesamte Verpackungseffizienz des pRS5-Vektor-Zellliniensystems war wenigstens 10⁴ Partikel pro Verpackungszelle, was mehr als ausreichend ist, um eine Herstellung von rekombinanten AAV-Vektorreagenzien klinischer Güte zu ermöglichen. Es wurde keine Wildtyp-AAV-Erzeugung bei diesem Verfahren beobachtet, was ein zusätzlicher Vorteil gegenüber den meisten Co-Transfektionsverfahren ist. Diese Verfahren machen die Produktion von rekombinanten AAV-Vektoren klinischer Güte zur Verwendung in der Gentherapie möglich.
Hierin werden Verfahren und Konstrukte beschrieben, die die Herstellung hoher Titer von AAV-Vektoren ohne Erzeugung von Wildtyp-AAV ermöglichen.
Daher ist eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren, umfassend:

(a) Bereitstellen von Zellen, die wenigstens eine intakte Kopie eines stabil integrierten rekombinanten AAV-Vektors enthalten, wobei der AAV-Vektor AAV invertierte terminale Wiederholungsregionen (ITR-Regionen) und einen Transkriptionspromotor umfasst, der funktionsfähig an ein Zielpolynucleotid gebunden ist, und wobei die Expression des rep-Gens in diesen Zellen einschränkend ist;
(b) Bereitstellen eines AAV-Verpackungsplasmids, das die Expression des Produktes des rep-Gens ermöglicht, wobei in dem Plasmid das rep-Gen funktionsfähig an einen heterologen Promotor gebunden ist und dem Verpackungsplasmid eine überlappende Homologie mit AAV-Sequenzen in dem Vektor in der Zelle fehlt, die in (a) bereitgestellt wurde;
(c) Einsetzen des AAV-Verpackungsplasmids in die Zelle und Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, die eine Replikation von AAV ermöglichen; und
(d) Isolieren rekombinanter AAV-Vektoren, die in Schritt (c) erzeugt wurden.

In dieser Ausführungsform sind Verfahren enthalten, in welchen der Promotor in dem Verpackungsplasmid, an den Rep funktionsfähig gebunden ist, HIV-LTR ist, und jene Verfahren, in welchen das Verpackungsplasmid pRS5 ist.
In dieser Ausführungsform sind auch Verfahren enthalten, in welchen das Zielpolynucleotid für ein Polypeptid codiert, das als CFTR ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator") fungieren kann.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verpackungssystem zum Erzeugen hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren, umfassend:

(a) Zellen, die wenigstens eine intakte Kopie eines stabil integrierten rekombinanten AAV-Vektors enthalten, wobei der AAV-Vektor AAV invertierte terminale Wiederholungsregionen (ITR-Regionen) und einen Transkriptionspromotor umfasst, der funktionsfähig an ein Zielpolynucleotid gebunden ist, und wobei die Expression des rep-Gens in diesen Zellen einschränkend ist; und
(b) ein AAV-Verpackungsplasmid, das die Expression des Produktes des rep-Gens ermöglicht, wobei in dem Plasmid das rep-Gen funktionsfähig an einen heterologen Promotor gebunden ist und dem Verpackungsplasmid eine überlappende Homologie mit AAV-Sequenzen in dem Vektor in der Zelle, die in (a) bereitgestellt wird, fehlt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verpackungsplasmid zur Verwendung in der Produktion zum Erzeugen hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren, das die Expression von dem Produkt des rep-Gens ermöglicht, wobei das Plasmid aus einem rep-Gen besteht, das funktionsfähig an einen heterologen Promotor gebunden ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Diagramm des AAV-Lebenszyklus.
2 ist ein Schema, das die Produktion des Verpackungsplasmids pRS5 und das Verhältnis von HIV1-LTR-Promotor und der Codierungssequenz von AAV2-rep- und -cap-Genen zeigt.
3 ist eine Halbtonreproduktion von Southern-Blots von Hirt-Extraktions-DNA-Proben, die gewinnbare intakte AAV-neo-Genome zeigt, die in stabilen Zelllinien vorhanden sind.
4 ist eine Halbtonreproduktion von Dot-Blot-Hybridisierungen, die den Nachweis von neo in Kontroll- und verpackten AAV-neo-Genomen vergleicht.
5 ist eine Halbtonreproduktion von Southern-Blots von Hirt-Extraktions-DNA-Proben, die die Gewinnung des AAV-CFTR-Vektors (TRF42) aus vektorproduzierenden 293-Zell-Klonen zeigt.
6 ist eine Graphik des Prozentsatzes von Lungenkarzinomzellen, die für den CD44-Marker gefärbt sind, wie durch Antikörperfärbung und FACS-Analyse bestimmt wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
AAV-Vektoren haben für die Humangentherapie Relevanz, insbesondere für Erkrankungen wie die zystische Fibrose und Sichelzellenanämie. Die hierin beschriebene Erfindung stellt Methoden und Verfahren zur Verwendung in der Produktion hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren zur Verwendung in der Gentherapie bereit.
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie verwendet, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z.B., Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe (1989), Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Hrg., 1984), Animal Cell Culture (R.I. Freshney, Hrg., 1987), die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller und M.P. Calos, Hrg., 1987), Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrg.), Current Protocols in Molecular Biolgy (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Siedman, J.A. Smith, und K. Struhl, Hrg., 1987) und Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach und W. Strober, Hrg., 1991).
Die Erzeugung hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren, die heterologe Polynucleotide umfassen, die eine Transkription benötigen, wird durch das folgende Verfahren ausgeführt.
In dem Verfahren werden geklonte Zellen bereitgestellt, die ein geeignetes AAV-Vektorplasmid enthalten. Das AAV-Vektorplasmid besteht aus den AAV-ITR-Regionen und einem Transkriptionspromotor, der funktionsfähig an ein Zielpolynucleotid gebunden ist. Der Transkriptionspromotor, der an das Zielpolynucleotid gebunden ist, ermöglicht die Bildung von Transkripten, und enthält zum Beispiel Nicht-AAV-Promotoren, wie auch AAV-Promotoren, wie p₅, p₁₉, p₄₀, und AAV-ITR-Promotoren. Die Transkriptions- und/oder Translationsprodukte des Zielpolynucleotids sind vorzugsweise in der Gentherapie von Nutzen. Daher enthalten Zielpolynucleotide Gene, die zur Gentherapie abgegeben werden, zum Beispiel jene, die für Untereinheitsketten von Hämoglobin, Enzymen, Proteinen, wie den "cystic fibrosis transmembrane conductane regulator (CFTR), und dergleichen codieren. Zielpolynucleotide können auch Polynucleotide sein, die, wenn sie transkribiert sind, eine Aktivität wie Anti- Sense-Moleküle, wie Köder, die an Transkriptions- oder Translationsfaktoren binden, wie Ribozyme und dergleichen haben.
Eine Vorraussetzung für die geklonten Zellen, die für das Verfahren bereitgestellt werden, ist, dass sie wenigstens eine intakte Kopie des AAV-Vektorplasmids enthalten, die stabil in die Zelle integriert ist und durch Infektion der transfizierten Zelle mit einem Helfervirus, wie Adenovirus, gewonnen werden können, wenn auch komplementäre AAV-rep- oder rep- und cap-Funktionen vorhanden sind.
In den in der Folge dargestellten Beispielen wurde ein AAVneo-Vektor verwendet, wobei die anfängliche Selektion der Zelllinie, die den Vektor enthält, durch Geneticinselektion durchgeführt wurde. Für den Fachmann ist jedoch offensichtlich, dass zur Erzeugung von Zelllinien, die einen Vektor enthalten, wie einen AAV-Vektor, der ein CFTR-Gen enthält, in dem kein selektiver Marker vorhanden ist, die Zellen gemeinsam mit dem gewünschten Vektorplasmid und einem zweiten Plasmid, das den selektiven Marker enthält, transfiziert werden können. Nach der Selektion von Zellklonen auf der Basis des selektiven Markers wäre es offensichtlich, ein direktes Screening zu verwenden, um jene sofort zu identifizieren, aus welchen ein Vektor mit hohem Titer gewonnen werden kann. Ein Beispiel dafür wird von Flotte et al. (1993a) berichtet, obwohl in diesem Beispiel die Zellen durch Infektion mit AAV-Virus und Adenovirus gewonnen wurden. Wie Flotte et al. (1993a) vermerkten, konnten auch produzierende Zelllinien erhalten werden, die einen gewinnbaren AAV-Vektor enthielten, der keinen selektierbaren Marker im Vektor aufwies. In diesem Beispiel umfassten die AAV-Vektorplasmide Konstrukte, die die humane CFTRcDNA enthielten, die funktionsfähig an einen AAV-Promotor gebunden war, der aus der ITR bestand. Zelllinien, die stabil integrierte Kopien dieser Vektoren enthielten, wurden durch Co-Transfektion der Humanepithelzelllinie IB-3 mit dem AAV-CFTR-Vektorplasmid und einem zweiten Plasmid, das den selektierbaren Macker neo enthielt, abgeleitet. Nach der Selektion von Kolonien in Geneticin wurden einzelne Klone erhalten, die den stabil integrierten Vektor enthielten, aus dem der Vektor durch anschließende Infektion mit Helfer-Adenovirus- und Wildtyp-AAV-Partikeln gewonnen werden konnte. Dies ermöglicht eindeutig die Erzeugung von Klonen mit stabil integrierten Kopien eines Vektors, in welchen der Vektor selbst keinen selektierbaren Marker hat.
Das Verfahren enthält auch die Bereitstellung eines komplementierenden Verpackungsplasmids, aus dem Rep- oder Rep- und Cap-Proteine von rep- oder rep- und cap-Genen exprimiert werden können. Dem Verpackungsplasmid fehlt überlappende Homologie mit Sequenzen in dem Vektor zwischen den und einschließlich der AAV-ITR-Sequenzen. Ferner kann die Kombination aus dem Verpackungsplasmid und dem Vektor kein komplettes AAV-Genom ergeben. In dem Beispiel, das unten angeführt ist, fehlen die 120 Nucleotide langen Sequenzen um den AAV-p₅-Promotor sowohl beim Verpackungsplasmid als auch beim Vektor. Zusätzlich wird in dem Verpackungsplasmid das rep-Gen nicht von dem AAV-p₅-Promotor transkribiert, sondern ist vielmehr funktionsfähig an einen heterologen Transkriptionspromotor gebunden, der durch die Expression von rep nicht stark negativ autoreguliert ist.
In dem bevorzugten Beispiel eines Verpackungsplasmids, wie durch pRS5 dargestellt, wurde HIV-LTR als heterologer Promotor verwendet, aber es kann jeder heterologe Promotor, und vorzugsweise ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor, verwendet werden. HIV-LTR ist ein Beispiel für beide Arten von Promotor. Im allgemeinen ist dieser Promotor durch die Wirkung des tat-Proteins auf einen sehr hohen Expressionswert induzierbar. In dem hier gezeigten, bevorzugten Beispiel zeigt der HIV-LTR-Promotor jedoch hohe Werte einer konstitutiven Expression von rep, wenn er in 293-Zellen verwendet wird. Dies ist darauf zurückzuführen, dass 293-Zellen das Adenovirus-EIA-Genprodukt exprimieren, von dem bekannt ist, dass es den HIV-LTR-Promotor transaktiviert. Somit muss in 293-Zellen (die eine bevorzugte Zelllinie zur Etablierung vektorhaltiger Zellen sind) die zusätzliche Transaktivierung des HIV-LTR-Promotors in pRS5 nicht notwendig sein, um einen maximalen Wert an funktionaler rep-Expression zu erhalten. Wenn vektorproduzierende Zelllinien in anderen Zellen gebildet werden, dann könnte die Transaktivierung von pRS5 durch Zugabe eines tat-Expressionsplasmids wie pARtat (Antoni et al. 1991) wünschenswert sein. Solche Zelllinien könnten jede Humanzelllinie, wie HeLa, A549, KB, Detroit, WI38, oder jede Zelllinie, in der geeignete Helferfunktionen exprimiert werden können, enthalten. Wenn humanes Adenovirus als Helfer verwendet wird, könnte dieses auch die gewünschte Affenzelllinie, VERO, enthalten. Als Alternative, wenn Herpesviren oder Pockenviren, wie Impfpocken oder Avipox, zur Bereitstellung der Helferfunktion verwendet werden, kann jede geeignete Human-, Nagetier- oder Affenzelllinie als vektorproduzierende Zelle ausreichend sein.
Das pRS5-Verpackungsplasmid dient als Modell sowohl für einen induzierbaren als auch konstitutiven Promotor. Für den Fachmann wäre offensichtlich, dass viele andere induzierbare oder konstitutive Promotoren in einem Verpackungsplasmidkonstrukt verwendet werden könnten. Das primäre Merkmal des Verpackungsplasmids ist, dass es den Wildtyp-AAV-p₅-Promotor nicht enthält und daher durch rep nicht stark negativ autoreguliert ist. Beispiele für andere solche Promotoren wären Mutationen des Wildtyp-p₅-Promotors, die eine Homologie mit dem Eltern-Wildtyp-Promotor entfernen oder negative regulatorische Elemente dieses Promotors inaktivieren, wie die YYI-Region des p₅-Promotors. Zu Beispielen für induzierbare Promotoren zählen: Metallioneninduzierbare Promotoren, wie Metallothioneinpromotor; Steroidhormon-induzierbare Promotoren, wie der MMTV-Promotor; oder der Wachstumshormonpromotor; Promotoren, die durch das Helfervirus, wie Adenovirus, induzierbar wären; frühe Gen-Promotoren, die durch Adenovirus-EIA-Protein induzierbar sind, oder der Adenovirus-Major-Late-Promotor; Herpesvirus-Promotor, der durch Herpesvirus-Proteine induzierbar ist, wie VP16 oder 1CP4 oder Impfpocken- oder Pockenvirus-induzierbare Promotoren oder Promotoren, die durch Pockenvirus-RNA-Polymerase induzierbar sind, oder ein bakterieller Promotor, wie jener von T7-Phage, der durch eine Pockenvirus-RNA-Polymerase induzierbar wäre, oder ein bakterieller Promotor, wie jener von T7-RNA-Polymerase.
Es gibt viele starke konstitutive Promotoren, die zur Verwendung als heterologer Promotor für die rep-Expression in dem Verpackungsplasmid geeignet sind, einschließlich des Adenovirus-Major-Late-Promotors, des Cytomegalovirus-Immediate-Early-Promotors, des β-Wirkungspromotors, oder des β-Globinpromotors. Promotoren, die durch RNA-Polymerase III aktiviert werden, könnten auch verwendet werden.
Die Wirksamkeit des Verpackungsplasmids für die Komplementation der Rep- und Cap-Funktionen zur Verpackung des AAV-Vektorplasmids kann unter Verwendung von AAV-Expressionsvektoren getestet werden, denen die Rep- und/oder Cap-Funktion fehlt, und die zusätzlich einen Marker enthalten. Solche Expressionsvektoren sind in der Wissenschaft bekannt und enthalten zum Beispiel das pAAVp₅neo-Konstrukt (Flotte et al., 1992). In den Beispielen wurde pAAVp₅neo als Vektorkonstrukt zum Testen jeder der beschriebenen Ver packungstechniken verwendet, da es sowohl für die Partikelzahl mit Hilfe des DNA-Blot-Dots (Samulski et al., 1989) als auch mit Hilfe neo-transduzierender Titer titriert werden konnte.
Das Verpackungsplasmid wird durch jede geeignete Technik, die in der Wissenschaft bekannt ist, wie zum Beispiel Transfektion, Elektroporation und dergleichen, in Zellen eingeführt, die das integrierte AAV-Vektorplasmid enthalten. Nach dem Einführen des Verpackungsplasmids werden die Zellen 3 bis 5 Tage unter Bedingungen gezüchtet, die eine Replikation von AAV ermöglichen, Lysate werden hergestellt und die rekombinanten AAV-Vektorpartikel werden durch Techniken, die in der Wissenschaft bekannt sind, gereinigt.
Die in der Folge angeführten Beispiele dienen als weitere Richtlinie für den praktizierenden Durchschnittsfachmann und sind in keiner Weise als Einschränkung der Erfindung zu verstehen.
Das Plasmid pRS5 in der E. coli DH5 Zelllinie (E. coli::pRS5 Stamm) wurde am 9. November 1993 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer 69483. Die Hinterlegung erfolgte unter den Bedingungen des Budapester Vertrags. Nach der Annahme und Erteilung dieser Anmeldung als United States Patent werden alle Restriktionen hinsichtlich der Verfügbarkeit der Hinterlegung unwiderruflich aufgehoben; und der Zugriff auf die genannten Hinterlegungen wird während der Anhängigkeit der oben genannten Anmeldung für jenen möglich sein, der vom Bevollmächtigten dazu unter 37 CFR § 1.14 und 35 USC § 1.22 bestimmt wird. Ferner werden die genannten Hinterlegungen für einen Zeitraum von dreißig (30) Jahren ab dem Tag der Hinterlegung, oder fünf (5) Jahren nach der letzten Anfrage nach der Hinterlegung, oder über die geltend machbare Laufzeit des US Patents, was auch immer länger ist, aufrechterhalten. Die hierin erwähnten, hinterlegten Materialien sollen nur der Einfachheit dienen und sind zur Ausführung der vorliegenden Erfindung angesichts der vorliegenden Beschreibungen nicht notwendig.
BEISPIELE
Beispiel 1
Verpackungsplasmid pRS5
Im Verpackungsplasmid pRS5 ist der AAV-p₅-Promotor durch einen heterologen Promotor ersetzt, so dass die Expression des rep-Genpolypeptids dessen eigene Synthese nicht negativ autoreguliert.
Das Plasmid pRS5 wurde durch Ligieren des großen (5 kb) HindlIII bis Sphl Fragments des zuvor beschrieben pHIVrep- (Antoni et al., J Virol., 65:396-404) Plasmids (das den HIV-LTR-Promotor und rep-Gensequenzen, einschließlich der AAV-Nucleotide 263 bis 1886, flankiert von der pBR322 Plasmidsequenz, enthält) mit dem HindlII bis Sphl Fragment von einem Plasmid, das als pcap1 bezeichnet wird (das das AAV-cap-Gen von den Nucleotiden 1886 bis 4491 ohne AAV-ITR, wieder flankiert von pBR322-Sequenzen, enthält) konstruiert (siehe 2). Nach dem Ligieren dieser zwei Fragmente wurde ein Verpackungsplasmid, pRS5, erzeugt, in dem das AAV-rep-Gen (Rep 68- und 78-Proteine) von dem HIV-LTR-Promotor transkribiert ist, wobei die internen AAVp₁₉- und p₄₀-Promotoren die kleineren Rep-Produkte (40 kD und 52 kD Rep-Proteine) beziehungsweise die Cap-Proteine transkribieren. Somit enthält pRS5 die gesamte AAV-Codierungssequenz innerhalb der AAV-Nucleotidsequenz von Nucleotid 263 bis 4491, die die rep-Codierungssequenz für Rep 78 und Rep 68 enthält, die funktionsfähig an den heterologen HIV-LTR-Promotor gebunden ist und Rep 52 und Rep 40 von dem AAV-p₁₉-Promotor und die AAV-Capsidproteine vom p40-Promotor exprimiert. Die Karte dieses Konstrukts ist in 1 dargestellt.
Das pAAVp₅neo-Konstrukt (Flotte et al., 1992) wurde als Vektorkonstrukt zur Testung jeder der beschriebenen Verpackungstechniken verwendet, da es sowohl für die Partikelzahl mit Hilfe des DNA-Dot-Blots (Samulski et al., 1989) als auch mit Hilfe neo-transduzierender Titer titriert werden konnte.
Beispiel 2
Zelllinien
Humane 293-31 Zellen (Graham et al., 1967, J. Gen. Virol., 36:59-72) wurden in Eagle's Modified Essential Medium mit 10 % fötalem Kälberserum bei 37 °C in 5 % CO₂ gezüchtet. Die 293-Zelllinie wurde sowohl zum Verpacken von Vektorzubereitungen als auch für neo-Transduktionsexperimente verwendet, um die neo-transduzierenden Titer zu verifizieren.
Beispiel 3
Verpacken von AAV-Virionen mit einem HIV-LTR-Promotor-rep-Genplasmid
Das pRS5-Konstrukt wurde zum Verpacken des pAAVp₅neo-Vektorplasmids durch Co-Transfektion in Adenovirus-Typ 5 (Ad5)-infizierte 293-Zellen verwendet (Flotte et al., 1992). Insgesamt wurden zehn 10 cm Schalen, die jeweils 2 × 10⁶ 293-Zellen (semikonfluent) enthielten, mit 2 × 10⁶ p.f.U. (Plage-bildenden Einheiten) Ad5 (m.o.i. ("multiplicity of infection") = 1) 1 h vor der Transfektion mit jeweils 12,5 μg pRS5 und pAAVp_Sneo infiziert. Dann wurden die Zellen 3 Tage bei 37 °C inkubiert und dann geerntet. Die Zellen wurden danach abgeschabt und durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit (4000 U/min × 10 min) gepoolt.
Das Zellpellet wurde dann in 4 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, resuspendiert, durch dreimaliges Gefrieren-Auftauen lysiert, mehrere Male durch eine 25 g Nadel geschoben, um die Viskosität zu verringern, und mit Mikrokokken-Nuclease (40 μl eines 300 μ/μl Stamms, inkubiert bei 37 °C × 20 min, und dann bei 4 °C über 10 min) behandelt. Dann wurde CsCl auf eine Enddichte von 1,41 g/cc zugegeben. Jedes Röhrchen wurde mit 0,5 bis 1,0 ml Mineralöl bedeckt und in einem Rotor mit frei ausschwingenden Bechern (SW50) bei 35 000 U/min 12 h bei 4 °C zentrifugiert.
Dann wurden serielle 0,5 ml Fraktionen gesammelt und jede durch DNA-Dot-Blot-Hybridisierung (Samulski et al., 1989) titriert, wobei zehnfache Verdünnungen jeder Fraktion auf Nitrocellulosefilter geblottet und mit einer ³²p-markierten DNA-Sonde, die aus einem 2,3 kb neo-Genfragment hergestellt wurde, unter Verwendung des Random-Priming-Kits von Boehringer Mannheim hybridisiert. Die selektierten Fraktionen wurden dann gegen Ringers Mineralsalzmedium, pH 7,4, dialysiert und bei –20 °C zur Verwendung in transduzierenden Titerexperimenten aufbewahrt.
Beispiel 4
Bestimmung transduzierender Titer von AAV-neo Vektormaterialien
AAV-neo-Vektormaterialien, die wie zuvor angeführt hergestellt wurden, wurden in 293-31-Zellen durch Infizieren der 293-31-Zellen bei zehnfach zunehmenden Partikelmultiplizitäten, die von 10 bis 1000 Partikel pro Zelle reichten, infiziert. In jedem Fall wurden Zellen in Mikrotiter-Näpfchen mit 10⁴ Zellen pro Näpfchen geimpft, und dann 2 h durch direkte Inokulation des Vektors in das Medium infiziert. Die Zellen aus jedem Näpfchen wurden dann 24 h später trypsiniert und auf 4 – 100 mm Schalen ausgestrichen. Drei Schalen jedes Satzes wurden dann in G418 bei einer Dosis von 200 μg/ml selektiert (aktiv, beginnend 48 h nach der ursprünglichen Infektion). Die vierte Schale jedes Satzes wurde als Kontrolle der Ausstreicheffizienz ohne G418 gezüchtet. Die Zellen wurden 10 bis 14 Tage selektiert und dann mit Safranin-Rot gefärbt. Geneticin-resistente Kolonien wurden gezählt und eine Transduktionsfrequenz durch Dividieren der mittleren Zahl von Genkolonien in jedem Satz durch die Anzahl von Kolonien, die in der Ausstreicheffizienz-Kontrollplatte erkennbar waren, bestimmt. In diesem Test wurde eine Transduktionseinheit (t.u. – "transducing unit") dann als jenes Impfmaterialvolumen pro Zelle definiert, das zum Transduzieren von 63% der Zellen zur Geneticinresistenz erforderlich war.
Beispiel 5
Verbesserung der Co-Transfektion einer AAV-Vektorverpackung durch Verwendung eines HIV-LTR-Protomor-Expressionsvektors
In Tabelle 1 (Versuche 1 bis 3) sind die Ergebnisse von DNA-Blot-Dot-Titrationen von AAV-neo-Partikelzubereitungen dargestellt, die durch die zuvor etablierte pAAV/Ad-Co-Transfektionstechnik und eine parallele pRS5-Co-Transfektion erzeugt wurden.
Tabelle 1. Partikeltiter von AAV-Vektorzubereitungen
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass Titer, die mit der pRS5-Konstruktion erreicht wurden, das durch Co-Transfektion eingeführt wurde (Experiment 4), ungefähr fünf- bis zehnmal höher waren als jene, die unter Verwendung des pAAV/Ad-Verpackungsplasmids erhalten wurden. Die Zugabe des HIV-trans-Transkriptionsaktivator- (tat-) Gens durch Plasmid-Tri-Transfektion führte zu einer sehr geringen zusätzlichen Verpackungseffizienz. In dem Experiment, das in 3 dargestellt ist, gab es nur einen 30 % Anstieg im Partikeltiter der Fraktion mit Maximaltiter, von 3,0 × 10¹⁰ nur mit pRS5 auf 4,0 × 10¹⁰ mit pRS5 + pARtat. Auf Grund dieser Ergebnisse schien es wahrscheinlich, dass die Werte der rep- und cap-Expression in dieser Technik nicht mehr einschränkend waren.
Das Experiment in 3 wurde wie folgt durchgeführt.
Beispiel 6
Gewinnung intakter AAV-neo-Genome, die in stabilen Zelllinien vorhanden sind
In diesem Beispiel wurde eine Kultur aus 2 × 10⁶ humanen 293-Zellen mit 5 Mikrogramm des AAV-Vektorplasmids pAAVp₅neo (pSA206) transfiziert. Einzelne Kolonien wurden unter Verwendung von 200 Mikrogramm aktivem G418 (Gibco-BRL) pro ml Medium, beginnend 48 h nach der Transfektion, auf Geneticinresistenz selektiert. Einzelne G-418-resistente Kolonien wurden mit sterilen Klonierungszylindern isoliert und zu stabilen Zelllinien expandiert. Von mehreren dieser Zelllinien wurden 2 × 10⁶ Zellen sowohl mit Adenovirus Typ 5 (moi = 2) als auch Wildtyp AAV2 (moi = 2) infiziert. 48 Stunden später wurde DNA mit geringem Molekulargewicht unter Verwendung des Hirtschen High Salt-Detergent-Verfahrens selektiert und mittels 0,7% Agarosegel-Elektrophorese und Southern-Blotting mit einer zufallsgeprimten ³²p-markierten neo-DNA-Sonde analysiert. Die Ergebnisse der Southern-Blot-Hybridisierung der Hirt-extrahierten DNA sind in 3 dargestellt.
Die Figur zeigt, dass von 7 bis 8 einzelnen untersuchten Zelllinien (Spur A bis G) die Vektorsequenz gewonnen und repliziert werden konnte. Spur H zeigt ein Beispiel einer Geneticin-resistenten Zelllinie, aus welcher der Vektor nicht gewonnen werden konnte.
Die erwarteten intrazellularen replizierenden Spezies der Vektorgenome (RFm für monomere, doppelsträngige, replizierende Form und RFd für doppelsträngige, dimere, replizierende Form) und die einzelsträngigen Nachkommen-Genome (SS) sind angegeben. In wenigstens 6 der 8 Beispiele (Spüren A bis D und Spuren F und G) wurden nicht neugeordnete Kopien des Vektors gewonnen.
Beispiel 7
Die Verwendung von Zelllinien mit integriertem gewinnbarem AAV-Vektor verbessert die Verpackungseffizienz
Nach der Verbesserung der Expression von AAV-rep-und-cap-Genen mit dem pRS5-Konstrukt sollte die Effizienz der Verpackung durch die Herstellung gleichförmiger Zellpopulationen weiter verbessert werden, die integrierte, aber gewinnbare Kopien des AAV-neo-Vektorgenoms enthielten. Die Kombination einer pRS5-Transfektion von rep und cap mit der stabilen Zugabe des pAAVp₅neo-Vektors zu den Zelllinien führte zu einer signifikanten Verbesserung in der Verpackungseffizienz.
Zelllinien wurden durch Transfizieren von AAVp₅neo durch Infizieren sowohl mit Wildtyp-AAV2 als auch Ad5 bei einer moi von 5 für jedes Virus hergestellt. Die Hirt-Extraktion wurde zur Isolierung replizierender viraler DNA verwendet und diese DNA-Proben wurden durch Elektrophorese und Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung einer ³²p-markierten neo-Sonde analysiert. Wie in 3 dargestellt, waren gewinnbare AAV-neo-Rekombinanten in nahezu allen dieser Zelllinien vorhanden. Die Muster der Banden enthielten, wie erwartet, Einzelstränge (unscharfe Bande nahe dem Boden des Gels), doppelsträngiges Monomer mit einer Größe von 2,7 kb, Dimer mit 5,4 kg, größere multimere Formen.
Zwei Zelllinien, die auf gleiche Weise hergestellt und als neo4-6 und neo4-9 bezeichnet wurden, wurden konstruiert und für anschließende Verpackungsexperimente verwendet. Es wurde ein direkter Vergleich zwischen der Co-Transfektion von pRS5 und pAAVp₅neo in die 203-Zellen und einer einzelnen Transfektion von pRS5 in entweder die neo4-6 oder neo4-9 Zelllinie vorgenommen. Wie in Tabelle 1 dargestellt, erzeugte die neo4-6 Zelllinie Titer von verpacktem AAV-neo, die 2,6 × 10¹¹ betrugen.
Dieser Partikeltiter stellt eine mehrfache Verbesserung gegenüber dem 293-Zellen-Co-Transfektionsverfahren dar, und ergab die höchsten Titer jeder Methode oder Kombination von Methoden, die verwendet wurden. Der Gesamtpartikeltiter von nahezu 2,6 × 10¹¹ Partikeln wurde beginnend mit 2 × 10⁷ Zellen erreicht und stellt somit eine Ausbeute von 10⁴ Partikeln pro Zelle dar.
Die oben genannten Tests beruhen alle auf einer DNA/Dot-Blot-Technik, die theoretisch auch Kopien von AAV-neo-Genomen erfassen könnte, die nicht in AAV-Partikeln verpackt sind. Die Ergebnisse von zwei Arten von Kontrollexperimenten schlossen diese Möglichkeit aus. Erstens wurden AAVp₅neo- und pRS5-Plasmide wie zuvor in 293-Zellen co-transfiziert, aber in Abwesenheit einer Ad5-Infektion. Lysate dieser Zellen wurden wie jede der anderen Zubereitungen, die oben genannt sind, behandelt. Wie in 4 dargestellt, zeigte die Kontroll-Dot-Blot-Hybridisierung, dass die neo-Signale, verpackte AAV-neo-Genome reflektierten.
Die DNA-Dot-Blot-Hybridisierung wurde wie folgt ausgeführt: Beginnend mit 50 Mikrolitern jeder Fraktion wurden fünf zehnfache serielle Verdünnungen in PBS hergestellt. Zur Lyse der Virionen wurde 1/10 Volumen (5 μl) 3N NaOH zugegeben und die Mischung 1 h bei 65 °C inkubiert. Ein gleiches Volumen (50 μl) 2M NH₄Oac, pH 7,0, wurde zugegeben und das gesamte 100 μl Volumen wurde auf 0,45 μm Nyonfilter mit einem Schleicher und Schuell Minifold I Mikroproben-Filtrationssammler übertragen. Diese Filter wurden dann mit zufallsgeprimten, ^32-p-markierten neo-DNA-Sonden unter Standardbedingungen hybridisiert.
Serielle zehnfache Verdünnungen von Kontrollmaterialien, die wie beschrieben hergestellt worden waren, wurden mit Verdünnungen eines AAV-neo-Materials verglichen, das durch pRS5-Transfektion der neo4-9-Zelllinie nach der Adenovirusinfektion hergestellt wurde (dargestellt in Spalte A). Spalte B zeigt die pRS5-Transfektion der neo4-9-Zelllinie ohne Adenovirusinfektion. Spalte C zeigt die Adenovirusinfektion der neo4-6-Zelllinie ohne pRS5-Transfektion. Spalte D zeigt die Adenovirusinfektion von pSA206-transfizierten 293-Zellen ohne pRS5-Co-Transfektion. In keinem Fall ergab die übertragene Zell- oder Plasmid-DNA ein signifikantes neo-Signal. Die Ergebnisse von 4 zeigen, dass kein erfassbares AAV-neo-Signal in der DNA/Dot-Blot-Hybridisierung von diesem Experiment erfassbar war, was eindeutig darauf hinweist, dass in diesen gereinigten Zubereitungen Plasmid-DNA nicht vorhanden war.
Dann wurde ein direkter Vergleich der transduzierenden Titer der AAV-neo-Vektormaterialien durchgeführt, die in dem dualen Plasmidtransfektionssystem oder durch Gewinnen eines Vektors aus stabilen Linien erhalten worden waren. Wie Tabelle 2 zeigt, war die Transduktionsfrequenz, die mit einer äquivalenten Anzahl von Vektorpartikeln erhalten wurde, die in jedem System erzeugt wurden, ähnlich. Dies zeigt, dass die Vektorpartikel, die durch Gewinnen des Vektors aus stabilen Zelllinien erzeugt wurden, gleiche biologische Effizienz und transduzierendes Potenzial aufwiesen wie jene, die in der dualen Transfektion erzeugt wurden. Somit wiesen die Vektoren, die aus Zelllinien gewonnen wurden, keine signifikanten biologischen Veränderungen auf.
Tabelle 2. Biologische Äquivalenz von AAV-neo-Vektorzubereitungen^a
Die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass die kombinierten Modifizierungen, die hier beschrieben sind, zu Erhöhungen bei Vektortitern von etwa dem 50- bis 100-Fachen führen können. Ebenso kann dieses Verfahren im Vergleich zu den früher veröffentlichten Berichten (z.B., Samulski et al., 1989) Vektorpartikel von wenigstens 2 × 10¹¹ ergeben, was drei Größenordnungen höher ist, als zuvor von einer gleichen Anzahl von Zellen erhalten wurde (d.h., humane 293-Zellen, die in insgesamt zehn 10 cm Zellkulturschalen gezüchtet wurden).
Beispiel 8
Verpackung von AAV-Vektoren, die für CFTR codieren
Ein AAV-CFTR-Vektor, pTRF42, der die CFTR-cDNA enthält, die von einer AAV-ITR als Promotor in Abwesenheit eines selektierbaren Markers exprimiert wurde, wurde zur Erzeugung stabiler Vektorerzeugungslinien in der 293-Zelllinie durch Co-Transfektion mit einem pSVneo-Plasmid verwendet. Dieser Vektor konnte aus den stabilen Zelllinien gewonnen werden und der gewonnene Vektor war intakt und nicht neugeordnet.
Die Konstruktion von pTRF42 wurde beschrieben (Flotte et al., 1993a, J. Biol. Chem., 268:3781-3790). Dieses Konstrukt enthält einen AAV-CFTR-Vektor, der aus 145 Nucleotiden des AAV-5'-Endes (der ITR), gefolgt von einem In-Frame-ATG- (Met) Initiationskodon besteht, der direkt in die CFTR-Codierungssequenz ab Aminosäure 1119 gelesen wird. Der Rest der CFTR-cDNA ist intakt bis zum nativen Terminationskodon und bis zu Nucleotid 4629 der ursprünglichen Sequenz. Darauf folgt ein synthetisches Polyadenylierungssignal und dann AAV-Nucleotide 4490-4681 (3' ITR). Vier Mikrogramm dieses Vektors wurden mit einem Mikrogramm des pSV2neo-Plasmids in 2 × 10⁶ humane 293-Zellen co-transfiziert, die dann mit 200 μg aktivem G-418 48 h nach der Transfektion selektiert wurden. G-418-resistente Klone wurden dann mit Klonierungszylindern isoliert und expandiert. Die Klone wurden durch Gewinnung mit kombinierter Wildtyp-AAV2- und Ad5-Infektion analysiert (jeweils moi = 2), wie bei den neo-Vektor-haltigen Linien. Die DNA- (Hirt-) Extrakte mit geringem Molekulargewicht wurden wieder durch 0,7 % Agarosegel-Elektrophorese und Southern-Blotting mit einer zufallsgeprimten, ³²pmarkierten CFTR-cDNA-Sonde analysiert. Auch hier zeigte sich, dass die Zelllinien gewinnbare, intakte Vektorsequenzen in den Größen hatten, die für die monomeren und dimeren, replizierenden Formen (RF) vorhergesagt wurden, nämlich 4,6 beziehungsweise 9,2 kb. Dies bestätigte die Nützlichkeit der Methode, die gewinnbare, vektorhaltige Zelllinien mit dem klinisch signifikanten Beispiel eines AAV-CFTR-Vektors verwendete.
Die zuvor beschriebenen Prinzipien und Lehren wurden zur Herstellung zusätzlicher Veranschaulichungsbeispiele der vorliegenden Erfindung verwendet, von welchen einige in der Folge beschrieben sind, die die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung näher zeigen.
Beispiel 9
Integration des lacZ-Gens in Lungenatemwegepithel
Die in vivo Aktivität von Vektoren, die durch die vorangehenden Methoden verpackt wurden, wurde unter Verwendung des lacZ-Gens getestet, das für ein Enzym mit β-Galactosidase-Aktivität codiert. Der AAVp₅lacZ-Vektor wurde durch Aufschluss des pAAVp₅neo-Konstrukts mit HindlII und BamHI und Ligieren des großen Fragments (das die AAV ITRs, die den AAVp₅-Promotor flankieren, und eine synthetische Polyadenylierungssequenz enthält) mit einem HindlII- bis BamHI-Fragment von pSVBgal, das das E. coli lacZ-Gen enthält, hergestellt. Dieses anfängliche Konstrukt wurde dann durch Aufschluss mit HindlII und Kpnl, Auffüllen ("Blunting") mit T4-Polymerase (Boehringer Mannheim) und Religation des großen Fragments modifiziert. Diese Endmanipulation ermöglichte die Entfernung eines Sequenzzwischensegments, enthaltend vier ATG-Kodons out-of-frame mit der lacZ-Codierungssequenz. Der Vektor wurde dann unter Verwendung des pRS5-Plasmids wie zuvor beschrieben verpackt.
Aliquote des verpackten AAVp₅lacZ, die 10¹⁰ Partikel in 0,2 bis 0,5 ml enthielten, wurden durch intraperitoneale Injektion an drei abgesetzte C57B1-Mäuse verabreicht. Aliquote derselben Vehikellösung, gegen die der Vektor dialysiert worden war, wurden in drei weitere Mäuse injiziert, die als Kontrolle dienten. Das Gewicht dieser Mäuse betrug jeweils etwa 30 gm, mit einer geschätzten Gesamtkörperzellenanzahl von 10⁸ bis 10⁹ Zellen. Die durchschnittliche Vektordosis pro Zelle war daher zwischen 10 und 100 Partikeln pro Zelle, abhängig vom Blutstrom. Vier Tage später wurden die Tiere durch eine Pentobarbital-Überdosis getötet und Proben der Bauchwand, Lunge, Leber, Milz, Nieren und Bauchspeicheldrüse entnommen und in 2,5 % Glutaraldehyd fixiert.
Ein in situ PVR-Test wurde an 5-Mikron, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten unter Verwendung vektorspezifischer Primer und eines nicht radioaktiven, Digoxigenin-dUTP, Anti-Digoxigenin, alkalischen Phosphatase-Immunodetektionssystems durchführt, wie bereits beschrieben (Flotte et al., 1993). Es wurden Primer aus der lacZ-Sequenz gewählt (5'-Primer: 5'-ACAACTT-TAACGCCGTGCGCT-3'; 3'-Primer: 5'-TGCAGGAGCTCGTTATCGCTA-3'). Nach einem heißen Start bei 82 °C wurde eine 40-Zyklen PCR durchgeführt mit direkter Eingliederung der Digoxidenin-markierten dUTP (Boehringer Mannheim) in die Rekationsprodukte. Digoxigenin-markierte Nucleotide wurden dann mit einem mit alkalischer Phosphatase bezeichnetem ("tagged") Anti-Digoxigenin-Antikörper (Genius III Kit, Bohringer Mannheim) und einer immunohistochemischen Färbung (NBT, X-phos) nachgewiesen.
Verschiedene Gewebeschnitte für injizierte Vektor- und Kontrollmäuse wurden durch Lichtmikroskopie untersucht. Die Zellen, die Vektor-DNA enthielten, wurden durch ein dunkelviolettbraunes Reaktionsprodukt angezeigt, das den Nucleus überlagerte. Die Färbung wurde eindeutig in Schnitten von vektorinjizierten Mäusen beobachtet, nicht aber in jenen von den Kontrollen. Vektor-DNA wurde in allen Zelltypen in den Lungen erfasst, wie auch in den meisten Hepatozyten und pankreatischen Azinuszellen. Nach der Absorption über die Lymphgefäße wären Vektorpartikel in den venösen Kreislauf eingetreten und auf den Lungenkreislauf getroffen, was wahrscheinlich für den sehr effizienten Gentransfer in der Lunge verantwortlich ist. Sobald die Vektorpartikel durch den Lungen- und in den Körperkreislauf gegangen sind, würden sie wahrscheinlich äußerst effektiv zu anderen Organen mit starkem Blutstrom verteilt werden.
Beispiel 10
Expression des lacZ-Gens in vivo
Serielle Schnitte derselben Gewebeproben, die für die in situ PCR-Erfassung verwendet wurden, wurden auf β-Galactosidase-Aktivität mit X-gal-Reagens (0,2 %, 37 °C, 16 h) gefärbt. Schnitte von Mäusen, denen AAVp₅lacZ injiziert wurde, wurden mit jenen verglichen, denen Vehikelkontrollen injiziert wurden. In den Kontrolltieren war keine endogene β-Galactosidase-Aktivität in Schnitten, die von der Lunge, Milz, Leber, Bauchspeicheldrüse, Niere oder dem Bauchfell genommen wurden, nachweisbar.
Lungenschnitte zeigten eine lacZ-Expression in den gesamten Segmenten des Atemwegepithels von vektorinjizierten Tieren, nicht aber von Kontrollen. In einigen der Atemwege waren > 75 % von 200 untersuchten Zellen positiv gefärbt. Etwa 25 % der Atemwege zeigten dieses Maß an positiver Färbung (4 bis 6 untersuchte Atemwege pro Schnitt, ein bis zwei Schnitte pro Tier), während andere Regionen der Lunge geringere Expressionswerte hatten.
Milzschnitte zeigten β-Galactosidase-Aktivität in nicht lymphoiden Bereichen von vektorinjizierten Tieren, nicht aber in Kontrollen. Lymphoide Follikel in der Milz waren im Wesentlichen negativ. In Nicht-Epithelzellen in den Lungen oder in Zellen der Leber, der Bauchwand und der Nieren von vektorbehandelten Tieren wurde eine spärliche Färbung beobachtet, während in der Bauchspeicheldrüse keine Expression nachweisbar war.
Die Verteilung von Vektor-DNA, wie durch einen in situ PCR-Test nachgewiesen, wird mit der Verteilung der β-Galactosidase-Aktivität in Tabelle 3 wie folgt verglichen (n= 3): (--) keine Färbung, (+) X-gal gefärbte Zellen < 1 %, (++) 1 bis 25 % Färbung, (+++) > 25 % Färbung, (nd) nicht durchgeführt.
TABELLE 3 Gewebeverteilung von lacZ-Gentransfer und Expression
Die Expression der β-Galactosidase-Aktivität hängt daher sowohl von der Verteilung des DNA-Vektors als auch der Gewebespezifität des Promotors ab. Zum Beispiel ist der p₅-Promotor in Atemweg-Epithelzellen sehr aktiv, aber weitaus weniger aktiv in anderen Zellen, die getestet wurden, wie jenen, die von der Bauchspeicheldrüse abgeleitet wurden.
Beispiel 11
Integration und Expression des CD44-Gens in Lungenkarzinomzellen
Der pSAcd44-Vektor, der den Zellenoberflächenmarker CD44 von dem p₅-Promotor exprimiert, wurde direkt von dem pSA206- (AAVp₅neo-) Konstrukt subgeclont. Die Partikelzahlen wurden durch Dot-Blot-Analyse bestimmt. Dieser Vektor und das pRS5-Verpackungsplasmid wurden in den Lungenkarzinomzelllinien H209 und N82 co-transfektiert. Pro Aliquot wurden verschiedene Dosen des Vektors in 4 × 10⁴ Zellen getestet. 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen auf eine Zellenoberflächen-Genexpression unter Verwendung eines Anti-CD44-Antikörpers fluoreszierend gefärbt. Die Zellen wurden dann durch einen Fluoreszenz-aktivierten Zellzähler geleitet, um den Anteil zu bestimmen, der positiv gefärbt war.
Ergebnisse dieser Analyse sind in 6 dargestellt, Virustiter sind in Einheiten von 10⁴ angegeben; somit stellt "1000" auf der horizontalen Achse 250 Vektorpartikel pro Karzinomzelle dar. Die hohe Frequenz einer CD44-Expression wurde bei Dosen von nur 100 Partikeln pro Zelle erreicht.

Claims

Verfahren zum Erzeugen hoher Titer rekombinanter Adeno-assoziierter Virus- (AAV-) Vektoren, wobei das Verfahren das Inkubieren einer Zelle unter Bedingungen umfasst, die eine Replikation und Verpackung von AAV ermöglichen, wobei die Zelle umfasst: (a) wenigstens eine intakte Kopie eines rekombinanten AAV-Vektors, die stabil in die Zelle integriert ist, wobei der AAV-Vektor AAV invertierte terminale Wiederholungsregionen ("inverted terminal repeat regions" – ITR-Regionen) und einen Transkriptionspromotor umfasst, der funktionsfähig an ein Zielpolynucleotid gebunden ist, und wobei die Expression des rep-Gens für die Verpackung in diesen Zellen einschränkend ist; (b) ein AAV-Verpackungsplasmid, das die Expression des Produktes des rep-Gens ermöglicht, wobei in dem Plasmid das rep-Gen funktionsfähig an einen heterologen Promotor gebunden ist und dem Verpackungsplasmid eine überlappende Homologie mit AAV-Sequenzen in dem Vektor (a) der Zelle fehlt, so dass das Verpackungsplasmid und der integrierte Vektor nicht zur Bildung eines vollständigen AAV-Genoms rekombinieren können, wodurch rekombinante AAV-Vektoren erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der heterologe Promotor von (b) HIV-LTR ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Zielpolynucleotid für ein CFTR-Polypeptid ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator polypeptide") codiert.
Verpackungssystem zum Erzeugen hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren, wobei das System umfasst: (a) Zellen, die wenigstens eine intakte Kopie eines rekombinanten AAV-Vektors enthalten, die stabil in die Zelle integriert ist, wobei der AAV-Vektor AAV invertierte terminale Wiederholungsregionen (ITR-Regionen) und einen Transkriptionspromotor umfasst, der funktionsfähig an ein Zielpolynucleotid gebunden ist, und die Expression des rep-Gens für die Verpackung in diesen Zellen einschränkend ist; und (b) ein AAV-Verpackungsplasmid, das die Expression des Produktes des rep-Gens ermöglicht, wobei in dem Plasmid das rep-Gen funktionsfähig an einen heterologen Promotor gebunden ist und dem Verpackungsplasmid eine überlappende Homologie mit AAV-Sequenzen in dem Vektor in der Zelle, die in (a) bereitgestellt wird, fehlt, so dass das Verpackungsplasmid und der integrierte Vektor nicht zur Bildung eines vollständigen AAV-Genoms rekombinieren können.
Verpackungssystem nach Anspruch 4, wobei der heterologe Promotor in (b) HIV-LTR ist.
Verpackungssystem nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Zielpolynucleotid für ein CFTR-Polypeptid ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator polypeptide") codiert.
Verpackungsplasmid zur Verwendung in der Produktion zum Erzeugen hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren, das die Expression des Produktes des rep-Gens ermöglicht, wobei das Plasmid ein rep-Gen umfasst, das funktionsfähig an einen heterologen Promotor gebunden ist und dem Verpackungsplasmid eine überlappende Homologie mit AAV-Sequenzen in einem stabil integrierten rekombinanten AAV-Vektor in einer Zelle fehlt, so dass das Verpackungsplasmid und der integrierte Vektor nicht zur Bildung eines vollständigen AAV-Genoms rekombinieren können, wobei die Zelle wenigstens eine intakte Kopie des AAV-Vektors umfasst, wobei der AAV-Vektor AAV invertierte terminale Wiederholungsregionen (ITR-Regionen) und einen Transkriptionspromotor umfasst, der funktionsfähig an ein Zielpolynucleotid gebunden ist.
Verpackungsplasmid nach Anspruch 7, wobei der Promotor in dem Verpackungsplasmid, an den rep funktionsfähig gebunden ist, HIV-LTR ist.
Zelle zum Erzeugen hoher Titer rekombinanter AAV-Vektoren, umfassend: (a) wenigstens eine intakte Kopie eines rekombinanten AAV-Vektors, die stabil in die Zelle integriert ist, wobei der AAV-Vektor AAV invertierte terminale Wiederholungsregionen (ITR-Regionen) und einen Transkriptionspromotor umfasst, der funktionsfähig an ein Zielpolynucleotid gebunden ist, und wobei die Expression des rep-Gens für die Verpackung in diesen Zellen einschränkend ist; und (b) ein AAV-Verpackungsplasmid, das die Expression des Produktes des rep-Gens ermöglicht, wobei in dem Plasmid das rep-Gen funktionsfähig an einen heterologen Promotor gebunden ist und dem Verpackungsplasmid eine überlappende Homologie mit AAV-Sequenzen in dem Vektor in der Zelle, wie unter (a) definiert, fehlt, so dass das Verpackungsplasmid und der integrierte Vektor nicht zur Bildung eines vollständigen AAV-Genoms rekombinieren können.
Zelle nach Anspruch 11 der 12, wobei der heterologe Promotor von (b) HIV-LTR ist.
Zelle nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Zielpolynucleotid für ein CFTR-Polypeptid ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator polypeptide") codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Plasmid pRS5 (ATCC Zugriffsnummer: 69483) ist.
Verpackungssystem nach einem der Ansprüche 4 bis 6, Verpackungsplasmid gemäß Anspruch 7 oder 8 oder Zelle gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Plasmid pRS5 (ATCC Zugriffsnummer: 69483) ist.