DE69033197T2 - Therapeutische Nukleoside - Google Patents

Therapeutische Nukleoside

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Purinnukleosid-Analoga, die einen ungesättigten carbocyclischen Ring anstelle des Zuckerrestes enthalten, pharmazeutisch akzeptable Derivate davon und ihre Verwendung in der medizinischen Therapie, insbesondere zur Behandlung bestimmter Virusinfektionen.
  • AIDS (erworbenes Immundefizienzsyndrom) ist eine immunsuppressive oder immundestruktive Krankheit, die daran Erkrankte für tödliche einhergehende (opportunistische) Infektionen anfällig macht. In charakteristischer Weise ist AIDS mit einer fortschreitenden Verarmung an T-Zellen verknüpft, insbesondere der Helfer-Induktor-Untergruppe, die den OKT&sup4;-Oberflächenmarker trägt.
  • Das menschliche Immundefizienz Virus (HIV) wurde in reproduzierbarer Weise aus Patienten mit AIDS oder mit den Symptomen, die häufig AIDS vorangehen, isoliert. HIV ist cytopathisch und scheint bevorzugt T-Zellen zu infizieren und zu zerstören, die den OKT&sup4;-Marker tragen, und es ist heutzutage allgemein anerkannt, daß HIV das ätiologische Agens für AIDS ist.
  • Seit der Entdeckung, daß HIV das ätiologische Agens für AIDS ist, wurden zahlreiche Vorschläge für Anti-HIV-Chemotherapeutika gemacht, die wirksam bei der Behandlung von AIDS-Kranken sein können. So beschreibt z. B. US-A-4 724 232 3'-Azido-3'-desoxythmidin (das den Zulassungsnamen Zidovudin trägt), seine pharmazeutisch akzeptablen Derivate und ihre Verwendung bei der Behandlung von menschlichen Retrovirusinfektionen, einschließlich AIDS und verbundenen klinischen Zuständen. Vince et al., Antiviral Research, 9 (1/2), 120 (1988), beschreibt bestimmte carbocyclische Nukleosid-Analoga und ihre Verwendung gegen HIV. Auf der Second International Conference on Antiviral Research, Williamsburg, VA, 10.-14. April 1988, wurde (±)-9-(cis- 4-(Hydroxymethyl)-2-cyclopentenyl)guanin (NSC-614846) offenbart, das ebenfalls als Carbovir bekannt ist.
  • Weltweit ist das Hepatitis-B-Virus (HBV) ein weiteres virales Pathogen von Hauptbedeutung. Es ist am häufigsten in den asiatischen Ländern und vorherrschend im Afrika der Sub-Sahara. Das Virus ist ätiologisch mit dem primären Leberzellenkarzinom verbunden.
  • Die Vereinigten Staaten beherbergen derzeit eine geschätzte Gruppe von 500 000 bis 1 Millionen infektiösen Trägern. Chronische aktive Hepatitis wird sich in über 25% der Träger entwickeln und schreitet häufig zur Zirrhose fort. Es wird angenommen, daß 5000 Menschen jedes Jahr in den USA an mit HBV zusammenhängender Zirrhose sterben, und daß vielleicht 1000 an mit HBV zusammenhängendem Leberkrebs sterben. Selbst wenn ein universeller HBV - Impfstoff vorhanden ist, wird der Bedarf an wirksamen Anti - HBV- Verbindungen fortbestehen. Das große Reservoir an anhaltend infizierten Trägern, das auf 220 Millionen weltweit geschätzt wird, wird aus einer Impfung keinen Vorteil ziehen und wird weiterhin ein hohes Risiko für eine HBV-induzierte Lebererkrankung aufweisen. Diese Trägerpopulation dient als Infektionsquelle für empfängliche Individuen, die das Auftreten der Erkrankung fortsetzen, insbesondere in endemischen Gebieten oder Hochrisiko- Gruppen, wie intravenösen Drogenabhängigen und Homosexuellen. Daher besteht ein hoher Bedarf an wirksamen Antivirusmitteln, sowohl zur Bekämpfung der chronischen Infektion als auch zur Reduktion des Fortschreitens zum Leberzellenkarzinom.
  • Klinische Wirkungen einer Infektion mit dem HBV-Virus reichen von Kopfschmerz, Fieber, Unwohlsein, Übelkeit, Erbrechen, Appetitlosigkeit bis zu Bauchschmerzen. Die Vermehrung des Virus wird gewöhnlich durch die Immunreaktion kontrolliert, wobei ein Erholungsverlauf beim Menschen Wochen oder Monate andauert, aber die Infektion kann ernsthafter sein, was zu einer fortbestehenden chronischen Lebererkrankung führt, wie oben umrissen.
  • FR-A-2626002 offenbart bestimmte optisch aktive Isomere von carbocyclischen Purinnukleosiden, einschließlich Carbovir, und ihre Verwendung bei der Behandlung des HIV-Virus. EP-A-366385 offenbart Aminosäureester des carbocyclischen Purinnukleosids Carbovir.
  • EP-B-349242 offenbart bestimmte 6-substituierte carbocyclische Purinnukleoside und ihre Verwendung in der medizinischen Therapie, insbesondere bei der Behandlung von HIV- und HBV-Infektionen. Unter solchen Nukleosiden sind die Verbindungen (±)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9- yl]-2-cyclopenten-2-methanol und (±)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylmethylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1-methanol, d. h. jeweils in der Form einer racemischen Mischung ihrer relevanten Enantiomere. Wir haben jetzt gefunden, daß die individuellen isolierten Enantiomere der oben genannten zwei Verbindungen und ihre pharmazeutischen Derivate eine vorteilhafte Antivirus-Aktivität aufweisen, insbesondere gegen HIV- und HBV-Infektionen, die mit einer geringen Zelltoxizität gekoppelt ist, und/oder die nützlich als Zwischenstufen zur Herstellung von Verbindungen mit solcher Aktivität sind.
  • Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung werden enantiomere Verbindungen der allgemeinen Formel
  • bereitgestellt (worin R eine Cyclopropylamino- oder N-Cyclopropyl-N- methylamino-Gruppe darstellt und A die 2-Cyclopenten-1-methanol-4-yl-Gruppe in der (1S,4R)-Konfiguration darstellt) und ihre Derivate (z. B. Ester, Salze und Salze von Estern), wobei die Verbindungen und ihre Derivate jeweils in Form eines Enantiomers sind, das im wesentlichen frei (z. B. in einem Ausmaß von weniger als 10% G/G, bevorzugt weniger als 5% G/G) von dem entsprechenden anderen Enantiomer ist.
  • Die enantiomeren Verbindungen der Formel (I), d. h. die im wesentlichen frei von dem entsprechenden anderen Enantiomer sind, umfassen somit:
  • 1) (1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9- yl]-2-cyclopenten-1-methanol,
  • 2) (1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropyl-N-methylamino)-9H- purin-9-yl]-2-cyclopenten-1-methanol.
  • Es wurde gefunden, daß die obigen Verbindungen 1) und 2), die nachfolgend als die (1S,4R)-enantiomeren Verbindungen der Formel (I) mit einer negativen (-) optischen Rotation bezeichnet werden, eine besonders hochwirksame Aktivität gegen HIV- und HBV-Infektionen aufweisen, und diese Verbindungen und ihre pharmazeutisch akzeptablen Derivate stellen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Die Verbindungen haben den weiteren Vorteil, daß sie bei Verabreichung zum Durchtritt durch die Blut-Hirn-Schranke fähig sind, so daß sie hohe Spiegel der Verbindungen oder aktiven Metaboliten davon im zentralen Nervensystem bereitstellen, wo die Äußerungen von HIV-Infektionen besonders schwächend sind. Die obige Verbindung 1) ist in Hinsicht auf ihre außergewöhnlich hohe Wirksamkeit gegen HIV- und HBV-Infektionen besonders bevorzugt. Es wurde ebenfalls gefunden, daß die Verbindung eine wesentlich niedrigere Toxizität gegen Knochenmarksstammzellen als das oben bezeichnete 3'-Azido-3'-desoxythymidin (Zidovudin) aufweist.
  • Die obigen (1S,4R)-enantiomeren Verbindungen der Formel (I) und ihre pharmazeutisch akzeptablen Derivate werden nachfolgend als erfindungsgemäße antivirale Verbindungen bezeichnet.
  • Gemäß weiteren Merkmalen der vorliegenden Erfindung stellen wir bereit:
  • a) erfindungsgemäße antivirale Verbindungen zur Verwendung in der medizinischen Therapie, insbesondere zur Behandlung oder Prophylaxe einer Retrovirusinfektion oder einer Hepatitis-B-Virusinfektion; und
  • b) Verwendung einer erfindungsgemäßen antiviralen Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe jeder der oben genannten Infektionen oder Zustände.
  • Beispiele für Retrovirusinfektionen, die erfindungsgemäß behandelt oder vorgebeugt werden können, schließen menschliche Retrovirusinfektionen ein, wie solche mit dem menschlichen Immundefizienz-Virus (HIV), HIV-1, HIV-2 und dem lymphotropen T-Zellen-Virus (HLTV), z. B. HTLV-I- oder HTLV- II-Infektionen. Die erfindungsgemäßen antiviralen Verbindungen sind besonders nützlich zur Behandlung von AIDS und damit zusammenhängenden klinischen Zuständen, wie dem mit AIDS zusammenhängenden Komplex ("AIDS- related complex", ARC), fortgeschrittener allgemeiner Lymphadenopathie (PGL), mit AIDS zusammenhängenden neurologischen Zuständen, wie multiple Sklerose oder tropische Paraparese, und Anti-HIV-Antikörperpositiven und HIV-positiven Zuständen, z. B. bei asymptomatischen Patienten, und Thrombopenica purpura. Die Verbindungen können ebenfalls bei der Behandlung oder Vorbeugung von Psoriasis verwendet werden.
  • Mit einem "pharmazeutisch akzeptablen Derivat" in bezug auf die (1S,4R)-enantiomeren Verbindungen der Formel (I) ist jedes pharmazeutisch akzeptable Salz, jeder Ester oder jedes Salz eines solchen Esters einer (1S,4R)-enantiomeren Verbindung der Formel (I) gemeint.
  • Bevorzugte Ester der (1S,4R)-enantiomeren Verbindungen der Formel (I) schließen ein: Carbonsäureester, in denen die Nicht-Carbonyl-Einheit der Estergruppierung ausgewählt ist gerad- oder verzweigtkettigem Alkyl, z. B. n-Propyl, t-Butyl, n-Butyl, Alkoxyalkyl (z. B. Methoxymethyl), Aralkyl (z. B. Benzyl), Aryloxyalkyl (z. B. Phenoxymethyl), Aryl (z. B. Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Halogen, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy oder Amino); Sulfonatester, wie Alkyl- oder Aralkylsulfonyl (z. B. Methansulfonyl); Aminosäureester (z. B. L-Valyl oder L-Isoleucyl); und Mono-, Di- oder Triphosphatester.
  • Die Phosphatester von Verbindungen der Formel (I) können weiter verestert sein, z. B. mit einem C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkohol oder einem reaktiven Derivat davon, oder mit einem 2,3-Di(C&sub6;&submin;&sub2;&sub4;)acylglycerin, z. B. 2,3-Bis- (hexanoyloxy)propylhydrogenphosphat- und 2,3-Bis-(hexadecanoyloxy) propylhydrogenphosphat-Derivaten. Zusätzlich zu solch weiter veresterten Phosphat-Derivaten der Verbindungen der Formel (I) schließt die vorliegende Erfindung ferner solche Derivate der racemischen Verbindungen der Formel (I) ein.
  • Bezüglich der oben beschriebenen Ester enthält jede vorhandene Alkyl- Einheit, wenn nicht anders angegeben, vorteilhafterweise 1 bis 18 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Jede vorhandene Aryl- Einheit in solchen Estern umfaßt vorteilhafterweise eine Phenyl-Gruppe.
  • Pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze der (1S,4R)- enantiomeren Verbindungen der Formel (I) schließen ein- oder zweibasige Salze mit der entsprechenden Säure ein, z. B. organischen Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Isethionsäure, Lactobionsäure und Bernsteinsäure; organischen Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure und p-Toluolsulfonsäure; und organischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Sulfatmethansulfonatsulfaminsäure. Die Salzsäure-Salze (d. h. die Mono- und Dihydrochloride) sind besonders bevorzugt.
  • Die obigen erfindungsgemäßen antiviralen Verbindungen können in Kombination mit anderen Therapeutika zur Behandlung der obigen Infektionen oder Zustände eingesetzt werden. Beispiele für solche weiteren Therapeutika schließen Mittel ein, die wirksam zur Behandlung von Virusinfektionen oder damit verbundenen Zuständen sind, wie 3'-Azido-3'-desoxythymidin (Zidovudin), 2',3'-Didesoxynukleoside, wie 2,3-Didesoxycytidin, 2,3'- Didesoxyadenosin und 2',3'-Didesoxyinosin, acyclische Nukleoside (z. B. Acyclovir), Interferone wie α-Interferon, Nierenausscheidungs-Inhibitoren, wie Probenicid, Nukleosid-Transportinhibitoren wie Dipyridamol, Dilazep, Mio-, Lido- oder Soluflazin oder Hexobendin, Immunmodulatoren, wie Interleukin II und Granulocyten-Macrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren, lösliches CD&sub4; oder genetisch erzeugte Derivate davon, und Phosphonoameisensäure. Die Verbindungsbestandteile einer solchen Kombinationstherapie können simultan verabreicht werden, in entweder separaten oder kombinierten Formulierungen oder zu unterschiedlichen Zeiten, z. B. nacheinander, so daß eine kombinierte Wirkung erreicht wird.
  • Die erfindungsgemäßen antiviralen Verbindungen, die hier nachfolgend ebenfalls als Wirkstoff(e) bezeichnet werden, können zur Therapie auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, nasal, topisch (einschließlich bukkal und sublingual), vaginal und parenteral (einschließlich subkutan, intramuskulär, intravenös und intradermal). Es ist ersichtlich, daß der bevorzugte Weg mit dem Zustand und Alter des Empfängers, der Art der Infektion und dem gewählten Wirkstoff variieren wird.
  • Im allgemeinen wird eine geeignete Dosis für jede der oben genannten Zustände (z. B. AIDS) im Bereich von 3,0 bis 120 mg/kg Körpergewicht des Empfängers (z. B. Mensch) pro Tag liegen, bevorzugt im Bereich von 6 bis 90 mg/kg Körpergewicht/Tag und am meisten bevorzugt im Bereich von 15 bis 60 mg/kg Körpergewicht/Tag. Die gewünschte Dosis wird bevorzugt als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Unterdosen angeboten, die zu geeigneten Intervallen über den Tag verteilt verabreicht werden. Diese Unterdosen können in Einheitsarzneiformen verabreicht werden, die z. B. 10 bis 1500 mg, bevorzugt 20 bis 1000 mg und am meisten bevorzugt 50 bis 700 mg des Wirkstoffs je Einheitsarzneiform enthalten.
  • Idealerweise sollte der Wirkstoff verabreicht werden, um Spitzenplasma-Konzentrationen des Wirkstoffs von 1 bis 75 uM zu erreichen, bevorzugt 2 bis 50 uM, am meisten bevorzugt ca. 3 bis 30 uM. Dies kann z. B. erreicht werden durch die intravenöse Injektion einer 0,1 bis 5%igen Lösung des Wirkstoffs, gegebenenfalls in Kochsalzlösung oder oral verabreicht als Bolus, der 1 bis 100 mg/kg des Wirkstoffs enthält. Wünschenswerte Blutspiegel können aufrecht erhalten werden durch eine kontinuierliche Infusion, um 0,01 bis 5,0 mg/kg/h bereitzustellen, oder durch unterbrochene Infusionen, die 0,4 bis 15 mg/kg des Wirkstoffs enthalten.
  • Obwohl es möglich ist, den Wirkstoff allein zu verabreichen, ist es bevorzugt, ihn als pharmazeutische Formulierung anzubieten. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen wenigstens einen Wirkstoff wie oben definiert zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Arzneimittelzusatzstoff. Formulierungen schließen diejenigen ein, die angepaßt sind zur oralen, rektalen, nasalen, topischen (einschließlich bukkalen und sublingualen), vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intramuskulären, intravenösen und intradermalen) Verabreichung. Die Formulierungen können zweckmäßig in Einheitsarzneiform angeboten werden und können durch alle auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren schließen den Schritt des In-Verbindung-Bringens des Wirkstoffs mit dem Träger ein, der einen oder mehrere Nebenbestandteile bildet. Allgemein werden die Formulierungen hergestellt durch einheitliches und inniges In-Verbindung-Bringen des Wirkstoffs mit flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägern oder beiden und, falls erforderlich, anschließendem Formen des Produkts.
  • Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die zur oralen Verabreichung angepaßt sind, können als diskrete Einheiten angeboten werden, wie Kapseln oder Tabletten, die jeweils eine vorher festgelegte Menge des Wirkstoffs enthalten; als Pulver oder Granalien; als Lösung oder Suspension in einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Flüssigkeit; oder als flüssige Öl-in- Wasser-Emulsion oder flüssige Wasser-in-Öl-Emulsion. Der Wirkstoff kann ebenfalls als Bolus, Elektuarium oder Paste angeboten werden.
  • Eine Tablette kann hergestellt werden durch Verpressen oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Nebenbestandteilen. Verpreßte Tabletten können hergestellt werden durch Verpressen des Wirkstoffs in freifließender Form, wie ein Pulver oder Granalien, gegebenenfalls vermischt mit einem Bindemittel (z. B. Povidon, Gelatine, Hydroxypropylmethylcellulose), Schmiermittel, inerten Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Tablettensprengmittel (z. B. Natriumstärkeglykolat, vernetztes Povidon, vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktiven oder Dispergiermittel, in einer geeigneten Maschine.
  • Geformte Tabletten können hergestellt werden durch Formen einer Mischung der mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchteten pulverförmigen Verbindung in einer geeigneten Maschine. Die Tabletten können gegebenenfalls umhüllt oder gekerbt werden und können so formuliert werden, um eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs darin bereitzustellen, wobei z. B. Hydroxypropylmethylcellulose in unterschiedlichen Anteilen verwendet wird, um das gewünschte Freisetzungsprofil zu liefern. Tabletten können gegebenenfalls mit einer magensaftresistenten Umhüllung versehen werden, um eine Freisetzung in anderen Teilen des Darms als dem Magen zu ergeben.
  • Zur topischen Verabreichung im Mund angepaßte Formulierungen schließen Lutschtabletten ein, die den Wirkstoff in einer geschmackskorrigierten Basis umfassen, gewöhnlich Saccharose und Gummi arabicum oder Tragacanth-Harz; Pastillen, die den Wirkstoff in einer inerten Basis umfassen, wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi arabicum; und Mundspülungen, die den Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.
  • Zur rektalen Verabreichung angepaßte Formulierungen können als Suppositorium mit einer geeigneten Base angeboten werden, die z. B. Kakaobutter oder ein Salicylat umfaßt.
  • Zur vaginalen Verabreichung angepaßte Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Spray-Formulierungen angeboten werden, die zusätzlich zum Wirkstoff solche Träger enthalten, wie sie als geeignet auf diesem Gebiet bekannt sind.
  • Zur parenteralen Verabreichung angepaßte Formulierungen schließen wäßrige und nicht-wäßrige isotonische sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidantien, Puffermittel, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zum Blut des beabsichtigten Empfängers machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in versiegelten Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, z. B. Ampullen und Phiolen, und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe von sterilem flüssigen Träger, z. B. Wasser für Injektionen, direkt vor der Verwendung erfordert. Unvorbereitete Injektionslösungen und -suspensionen können hergestellt werden aus sterilen Pulver, Granalien und Tabletten der zuvor beschriebenen Art.
  • Bevorzugte Einheitsarzneiformulierungen sind diejenigen, die eine tägliche Dosis oder Einheit, tägliche Unterdosis wie oben aufgeführt oder einen geeigneten Anteil davon eines Wirkstoff enthalten.
  • Es sollte selbstverständlich sein, daß die Formulierungen dieser Erfindung zusätzlich zu den oben speziell genannten Bestandteilen andere Stoffe einschließen können, die auf diesem Gebiet bezüglich des betreffenden Formulierungstyps herkömmlich ist, z. B. können diejenigen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, weitere Stoffe wie Verdickungsmittel und Geschmacksstoffe einschließen.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ferner das folgende Verfahren zur Herstellung von enantiomeren Verbindungen der obigen Formel (I) und Derivaten davon ein. Die enantiomeren Ausgangsstoffe und Vorstufen für solche Stoffe, die wie nachfolgend bezüglich des Verfahrens beschrieben eingesetzt werden, sind jeweils in Form eines Enatiomers, das im wesentlichen frei (z. B. in dem oben genannten Maß bezüglich der Verbindungen der Formel (I)) von dem anderen Enantiomer ist. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt entweder:
  • A) Behandeln einer enantiomeren Verbindung der Formel (II):
  • (worin A wie zuvor definiert ist und Z eine Vorstufengruppe für die wie in Formel (I) definierte R-Gruppe darstellt) mit einem Mittel oder unter Bedingungen, die dazu dienen, die Vorstufengruppe Z zur gewünschten R-Gruppe zu konvertieren; oder
  • B) Umsetzen einer enantiomeren Verbindung der Formel (III):
  • (worin A und R wie zuvor definiert sind, R² Wasserstoff oder eine Formyl-Gruppe darstellt und R³ eine Amino-Schutzgruppe darstellt, z. B. eine Acyl-Gruppe, wie eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoyl-Gruppe, z. B. Formyl, Acetyl oder Isobutyryl) mit einem Mittel, das zum Bewirken der Bildung des Imidazol- Rings in der gewünschten Verbindung der Formel (I) dient, gefolgt von Entfernung der R³-Amino-Schutzgruppe; oder
  • C) Umsetzen einer enantiomeren Verbindung der Formel (IV):
  • (worin A und R wie zuvor definiert sind und R³ eine Amino-Schutzgruppe ist, z. B. wie oben bezüglich Formel (III) beschrieben) mit einem Mittel, das zum Bewirken der Entfernung der R³-Amino-Schutzgruppe dient, und gegebenenfalls Durchführen einer oder beider der folgenden Konvertierungen in jeder gewünschten Reihenfolge:
  • i) wenn eine Verbindung der Formel (I) gebildet wird, Konvertieren der Verbindung zu einem Derivat davon; oder
  • ii) wenn ein Derivat einer Verbindung der Formel (I) gebildet wird, Konvertieren des Derivats zur Stammverbindung der Formel (I) oder zu einem weiteren solchen Derivat.
  • Verfahren A) kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden, z. B. durch Behandlung einer Verbindung der Formel (II), in der Z eine Abgangsgruppe darstellt (z. B. ein Halogen, wie eine Chlor-Gruppe), mit einem geeigneten Amin, d. h. Cyclopropylamin oder N-Cyclopropyl-N-methylamin, bevorzugt in einem Überschuß, um die wie oben definierte Amino-Gruppe R einzuführen, vorteilhafterweise im Rückfluß oder bei einer Temperatur von mehr als 50ºC, bevorzugt in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, z. B. Methanol oder Ethanol.
  • Verfahren B) kann z. B. durchgeführt werden durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (III) mit Ameisensäure oder einem reaktiven Ameisensäure-Derivat (z. B. Triethylorthoformiat oder Diethoxymethylacetat), gegebenenfalls mit einem Verschnittmittel, wie Dimethylacetamid oder Dimethylformamid, bei erhöhter Temperatur, bevorzugt bei 75 bis 90ºC. Diese Reaktion wird zweckmäßig durch Zugabe von wenig mehr als der äquivalenten Menge einer starken wasserfreien Säure bewirkt, z. B. mit 1,1 Äquivalenten Ethansulfonsäure pro Äquivalent der Verbindung der Formel (III), wobei in diesem Fall niedrigere Temperaturen (z. B. 25ºC) verwendet werden.
  • Verfahren C) kann z. B. durchgeführt werden durch Umsetzen einer enantiomeren Verbindung der Formel (IV) mit einem sauren Mittel, z. B. verdünnter wäßriger Salzsäure.
  • Die Verbindungen der Formel (II), die als Ausgangsstoffe im Verfahren A) eingesetzt werden, können z. B. in einer analogen Weise zu Verfahren B) hergestellt werden, d. h. durch Umsetzen einer entsprechenden enantiomeren Verbindung der Formel (V):
  • (worin A, Z, R² und R³ wie zuvor definiert sind) oder eines Derivats davon mit einem Mittel, das zum Bewirken der Bildung des Imidazol-Rings in der gewünschten Verbindung der Formel (II) und zum Bewirken der Entfernung der R³-Amino-Schutzgruppe dient. Die Reaktion kann durchgeführt werden unter Verwendung derjenigen Mittel und Bedingungen, die oben für Verfahren B) beschrieben werden.
  • Die Verbindungen der Formel (III), die als Ausgangsstoffe in Verfahren B) eingesetzt werden, können z. B. hergestellt werden durch Behandeln einer enantiomeren Verbindung der obigen Formel (V) mit, einem Mittel oder unter Bedingungen, die zur Konvertierung der Vorstufengruppe Z zur gewünschten R-Gruppe dienen, in einer zu der für Verfahren A) beschriebenen analogen Weise.
  • Die Verbindungen der oben genannten Formel (IV) können z. B. hergestellt werden durch Umsetzen einer enantiomeren Verbindung der Formel
  • (worin A, Z und R³ wie zuvor definiert sind) mit einem Mittel oder unter Bedingungen, die zur Konvertierung der Vorstufengruppe Z zur gewünschten R-Gruppe dienen, d. h. in einer zu der für Verfahren A) beschriebenen analogen Weise.
  • Die Verbindungen der obigen Formel (VI) können z. B. hergestellt werden durch Umsetzen einer enantiomeren Verbindung der obigen Formel (V) mit einem Mittel, das zum Bewirken der Bildung des Imidazol-Rings in der gewünschten Verbindung der Formel (VI) dient, z. B. durch Behandeln mit Ameisensäure oder einem reaktiven Ameisensäure-Derivat, wie oben bezüglich Verfahren B) beschrieben.
  • Besonders bevorzugte Zwischenstufen zur Herstellung von (1S,4R)-cis- 4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1-methanol, d. h. der bevorzugten obigen Verbindung 1), schließen ein:
  • a) (1R,4S)-cis-N-[6-(Cyclopropylamino)-9-(4-(hydroxymethyl)- 2-cyclopenten-1-yl)-9H-purin-2-yl]isobutyramid;
  • b) (1R,4S)-cis-N-[Chlor-5-formamido-6-(4-(hydroxymethyl)-2- cyclopenten-1-yl)amino)-2-pyrimidinyl]acetamid;
  • c) (1S,4R)-cis(2-Amino-6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten- 1-methanol;
  • d) (1R,4S)-cis-N-[6-Chlor-9-(4-(hydroxymethyl)-2-cyclopenten-1-yl)-9H-purin-2-yl]isobutyramid.
  • Die enantiomeren Verbindungen der Formel (V), die als Ausgangsstoffe wie oben beschrieben eingesetzt werden, können z. B. hergestellt werden durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (VII)
  • (worin Z, R² und R³ wie zuvor definiert sind und R&sup4; eine Abgangsgruppe darstellt, z. B. ein Halogen, wie eine Chlor-Gruppe) oder eines Derivats davon mit einer enantiomeren Verbindung der Formel (VIIIA) oder (VIIIB)
  • oder eines Derivats davon.
  • Die zuletzt genannte Reaktion wird vorteilhafterweise in Gegenwart einer Base bewirkt, wie eines tertiären Amins, z. B. Triethylamin oder Trimethylamin, vorteilhafterweise in einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethoxyethan oder Ethanol.
  • Die Verbindungen der Formel (VIIIA) oder (VIIIB) mit der geeigneten enantiomeren Konfiguration können erhalten werden durch Komplexieren der entsprechenden racemischen Verbindung, d. h. (±)-4-Amino-2-cyclopenten-1- methanol, mit einer optisch aktiven Carbonsäure (z. B. Dibenzoyl-D-weinsäure) und anschließender fraktionierter Kristallisation der resultierenden diastereomeren Salze. Alternativ kann eine enzymatische Trennung eingesetzt werden, wie z. B. beschrieben in J. Med. Chem. 1987, 30, 746 und J. Med. Chem., 1985, 28, 1385.
  • Die als Ausgangsstoffe oben eingesetzten Verbindungen der Formel (VII) können in einer herkömmlichen Weise hergestellt werden, z. B. durch Reduzieren einer Verbindung der Formel (IX)
  • (worin Z, R³ und R&sup4; wie zuvor definiert sind), um die Konvertierung der NO&sub2;-Gruppe zu einer NH&sub2;-Gruppe zu bewirken, und gegebenenfalls durch Konvertieren der resultierenden NH&sub2;-Gruppe zu einer Formamido-Gruppe, z. B. durch Behandlung mit Ameisensäure/Essigsäureanhydrid.
  • Die Verbindungen der Formel (IX) können in herkömmlicher Weise hergestellt werden. Diejenigen Verbindungen, in denen Z ein Halogen darstellt, z. B. eine Chlor-Gruppe, können z. B. hergestellt werden durch Halogenieren, z. B. unter Verwendung von Phosphoroxychlorid, einer entsprechenden Verbindung der Formel (X)
  • (worin R³ und R&sup4; wie zuvor definiert sind).
  • Die Verbindungen der Formel (X) können ebenfalls in herkömmlicher Weise hergestellt werden, z. B. durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XI)
  • (worin R&sup4; wie zuvor definiert ist) mit einem geeigneten Mittel, das zu Einführung der Amino-Schutzgruppe dient, z. B. durch Reaktion mit einer geeigneten Carbonsäure oder einem funktionellen Derivat davon, z. B. Isobuttersäureanhydrid. Die Verbindung der Formel (XI) kann hergestellt werden durch Nitrierung einer entsprechenden Verbindung der Formel (XII)
  • (worin R&sup4; wie zuvor definiert ist).
  • Eine Verbindung der Formel (I) kann allgemein zu einem Ester davon durch Reaktion mit einem geeigneten Veresterungsmittel konvertiert werden, z. B. einem Säurehalogenid oder -anhydrid. Die Verbindung der Formel (I), einschließlich Estern davon, kann zu Salzen davon in herkömmlicher Weise konvertiert werden, z. B. durch Behandlung mit einer geeigneten Säure. Ein Ester oder Salz einer Verbindung der Formel (I) kann zur Stammverbindung z. B. durch Hydrolyse konvertiert werden.
  • So kann das O-Monophosphat einer Verbindung der Formel (I) hergestellt werden durch Behandeln der Stammverbindung mit einem geeigneten Phosphorylierungsmittel, z. B. Phosphoroxychlorid wie in M. Yoshikawa, T. Kato und T. Takenishi, Bulletin Chem. Soc. Japan, 1969, 42, 3505. Die entsprechenden O-Di- und O-Triphosphate können hergestellt werden durch Verfahren, die beschrieben werden in "Nucleotide Analogs" von K.H. Sheit, John Wiley and Sons, New York 1980, S. 211-215 und in D.E. Hoard und D.G. Ott, J. Amer. Chem. Soc. 1965, 87, 1785, z. B. durch Herstellen des Imidazolat-Derivats des relevanten O-Monophosphats und durch anschließende Reaktion dieses Derivats mit Phosphat, um das O-Diphosphat zu ergeben, oder mit Pyrophosphat, um das O-Triphosphat zu ergeben. Zur Herstellung der oben genannten veresterten Phosphat-Derivate kann die Stammverbindung der Formel (I) mit einem geeigneten Dialkanoylphosphatidylcholin-Derivat in Gegenwart einer geeigneten Phospholipase behandelt werden, z. B. Phospholipase D, wie beschrieben in S. Shuto et al., Nucleic Acid Research, 1988, 20, Seite 35 oder durch Reaktion einer Verbindung der Formel (I) mit einem geeigneten Phosphorylierungsmittel, wie Phosphoroxychlorid, gefolgt von Aufarbeiten mit einem geeigneten Alkohol, wie beschrieben in A. Rosowsky & S. Kim, Nucleic Acid Chemistry, Teil 3, L.B. Townsend & R.S. Tipson (Herausgeber), John Wiley & Sons, New York, 1986, 255.
  • Die Enantiomere der Verbindungen der Formel (I) können in herkömmlicher Weise getrennt und isoliert werden, z. B. durch chromatographische Trennung von diastereomeren Estern, die durch Acylierung der Hydroxyl- Gruppe an der Cyclopentenyl-Einheit mit geeigneten optisch aktiven Carbonsäure-Derivaten hergestellt werden, z. B. mit Naproxen (J. Org. Chem. 1986, 51, 1287)
  • Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung der Erfindung gedacht. In den Beispielen wurden die optischen Drehungen bezüglich der Natrium-D- Linie (589 nm) bei 20ºC angegeben. Der in den Beispielen A bis 6 verwendete Begriff "Wirkstoff" meint eine erfindungsgemäße antivirale Verbindung, insbesondere die obige Verbindung 1).
    • Beispiel 1 (±)-Cis-4-[(2-Amino-4-chlor-6-pyrimidinyl)amino]-2-cyclopenten-1- methanol
  • cis-4-Acetamidocyclopent-2-enmethylacetat [US-A-4 268 672] (14,88 g, 0,073 mol) und Bariumhydroxid-Octahydrat (46,19 g, 0,146 mol) wurden in Wasser (300 ml) unter Stickstoff für 18 h zum Rückfluß erhitzt. Die resultierende Lösung wurde mit Kohlendioxid neutralisiert. Der Niederschlag wurde mit Wasser und anschließend Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden zu einem Sirup eingedampft (11,16 g), der mit 2-Amino-4,6- dichlorpyrimidin (23,91 g, 0,146 mol) und Triethylamin (30,5 ml, 0,219 mol) in 1-Butanol (100 ml) im Rückfluß für 1,5 h kondensiert wurde. Nach Zugabe von 1 N NaOH (73 ml) wurde die resultierende Mischung zur Trockene eingedampft und der zurückbleibende Feststoff in CHCl&sub3; (200 ml) aufgeschlämmt. Nicht umgesetztes 2-Amino-4,6-dichlorpyrimidin wurde abfiltriert und mit Chloroform (100 ml) gewaschen. Das Chloroform-Filtrat wurde aufkonzentriert und an einer Silicagel-Säule chromatographiert. Zusätzliches Pyrimidin- Ausgangsmaterial wurde mit 2,5% Methanol-Chloroform eluiert. Die Titelverbindung wurde mit 3,5% Methanol-Chloroform als schmutzigweißer fester Schaum eluiert (15,90 g, 91%).
  • ¹H-NMR (Me&sub2;SO-d&sub6;) δ: 1,15-1,28 und 2,26-2,41 (2 m, 2, CH&sub2;), 2,60- 2,71 (m, 1,1'-H), 3,4 (m, überlappend H&sub2;O, CH&sub2;OH), 4,625 (t, J = 5,3, 1, CH&sub2;OH), 4,95 (br s, 1, CH-N), 5,67-5,87 (m, 2, CH=CH), 6,38 (br s, 1, NH&sub2;), 7,12 (br s, 1, NH);
  • MS (CI): M+1, 241, 243. Analyse:
    • Beispiel 2 (±)-cis-4-[[2-Amino-6-chlor-5-[(4-chlorphenyl)azo]-4-pyrimidinyl]- amino]-2-cyclopenten-1-methanol
  • (±)-cis-4-[(2-Amino-4-chlor-6-pyrimidinyl)amino]-2-cyclopenten-1- methanol aus Beispiel 1 (11,58 g, 48,1 mmol) und Natriumacetat-Trihydrat (97 g) wurden in Eisessig (225 ml) und Wasser (225 ml) aufgelöst. Eine kalte Lösung (0-5ºC) von 4-Chlorbenzoldiazoniumchlorid wurde hergestellt aus 4-Chloranilin (6,74 g, 52,8 mol), konzentrierter Salzsäure (14,7 ml), Wasser (52 ml) und Natriumnitrit (4,01 g, 58,2 mmol in 47 ml Wasser). Diese kalte Lösung wurde während 5 min zur ersten Lösung hinzugetropft. Der resultierende gelbe Niederschlag wurde nach 18 h abfiltriert, mit Wasser gewaschen und mit Ethanol extrahiert, um die Titelverbindung als dunkelgelbes Pulver (12,56 g, 69%) zu ergeben, Smp. 218-220ºC (Zers.).
  • ¹H-NMR (Me&sub2;SO-d&sub6;) δ: 10,25 (d, 1, NH), 7,69 und 7,54 (beide, d, J = 8,9, C&sub6;H&sub4;), überlappend 7,6 (br, 6, NH&sub2;), 5,80-5,95 (m, 2, CH=CH), 5,24 (m, 1, CHN), 4,75 (t, 1, CH&sub2;OH), 3,41 (t, 2, CH&sub2;OH), 2,75 (m, 1, CH), 2,41 (m, 1, CH), 1,44-1,53 (m, 1, CH). Analyse:
    • Beispiel 3 (±)-cis-4-[(2,5-Diamino-4-chlor-6-pyrimidinyl)amino]-2-cyclopenten-1- methanol
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 2 (11,67 g) wurde in Ethanol (235 ml), Eisessig (30 ml) und Wasser (235 ml) suspendiert. Die Mischung wurde unter Stickstoff zum Rückfluß erhitzt. Zinkstaub (13,5 g) wurde in kleinen Portionen während 30 min hinzugegeben, währenddessen sich die Verbindung auflöste. Die Reaktion wurden für zusätzliche 20 min erhitzt, und dann wurde das überschüssige Zink von der heißen Lösung abfiltriert und mit Ethanol gewaschen. Die Filtrate wurden eingedampft, und der Rückstand wurde an einer Silicagel-Säule unter Elution mit Chloroform (1 l) und Chloroform : Methanol/4 : 1 (1,8 l) gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung als rotorange-farbenes Öl zu ergeben (11,2 g, > 100% Ausbeute). Eine reine Probe wurde während einer weiteren Reaktion im kleinen Maßstab erhalten, um das Produkt als hellgelben Feststoff in 76%iger Ausbeute zu erhalten.
  • ¹H-NMR (Me&sub2;SO-d&sub6;) δ: 1,29 und 2,39 (m, 2, CH&sub2;), 2,69 (t, 1, 1'-H), 3,37 (d, 2, CH&sub2;OH), 3,91 (br, 2, NH&sub2;), 4,60 (br, 1 CH&sub2;OH), 5,02 (m, 1, CHNH), 5,56 (br s, 2, NH&sub2;), 5,74 (m, 1, CH), 5,86 (m, 1, =CH), 6,36 (d, 1, CHNH).
    • Beispiel 4 (±)-cis-4-(2-Amino-6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten-1-methanol
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 3 (ca. 9,7 g) wurde in Diethoxymethylacetat (100 g) aufgelöst und für zwei Tage zum Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter Hochvakuum bei 50ºC entfernt, und Dioxan (40 ml) und 0,5 N HCl (60 ml) wurden hinzugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 1,25 gerührt und dann abgekühlt. Die Reaktion wurde mit kaltem 5 N Natriumhydroxid auf pH 7 neutralisiert und dann mit Chloroform : Methanol/3 : 1 mehrere Male extrahiert. Die organischen Schichten wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule unter Elution mit 2% MeOH-CHCl&sub3; gereinigt, um 3,7 g (46% Ausbeute) der Titelverbindung zu ergeben, Smp. 138-139ºC.
  • ¹H-NMR (Me&sub2;SO-d&sub6;) δ: 1,63 und 2,61 (m, 2, CH&sub2;), 2,87 (m, 1, 1'-H), 3,44 (d, 2, CH&sub2;OH); 5,44 (m, 1, CH-N), 5,89 (m, 1, =CH), 6,14 (m, 1, =CH), 6,82 (br s, 2, NH&sub2;), 8,02 (s, 1, 8-H), (CH&sub2;OH nicht gesehen - unter H&sub2;o- Peak).
  • UV: pH 1 λmax 315 (ε 7370); 218 (26200); 2, λ sh 239,5 (5650).
  • pH 7,4 λmax 307 (ε 8000); 245,5 (4600); 223 (26400).
  • MS (EI) 265,267 (m) (Cl) 266,268 (m + 1). Analyse:
    • Beispiel 5 (±)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten- 1-methanol
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 4 (0,50 g) wurde in Ethanol (40 ml) aufgelöst, und Cyclopropylamin (0,65 ml, 5 Äquivalente) wurde hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter Stickstoff für 6 h zum Rückfluß erhitzt. Zusätzliche 0,65 ml Cyclopropylamin wurden hinzugegeben, und die Reaktion wurde für weitere 5,5 h zum Rückfluß erhitzt. Die Lösungsmittel wurden verdampft, und Chloroform (25 ml) und gesättigte Natriumbicarbonat-Lösung (5 ml) wurden hinzugegeben. Die wäßrige Schicht wurde mehrere Male mit CHCl&sub3; unter Erhalt des Rohproduktes extrahiert. Dieses wurden an einer Silicagel-Säule unter Elution mit 3% Methanol-Ethylacetat gereinigt, um 0,43 g (80%) (±)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1- methanol zu ergeben. Dieses wurde aus Acetonitril umkristallisiert, um 0,3 g eines weißen Pulvers zu ergeben; Smp. erweicht bei 93-130ºC; Schmelze bei 165ºC.
  • ¹H-NMR (Me&sub2;SO-d&sub6;) δ: 0,56 und 0,63 (2 m, 4, 2-Cyclopropyl CH&sub2;), 1,56 und 2,60 (2 m, 2, Cyclopentenyl-CH&sub2;), 2,85 (m, 1, 1'-H), 3,02 (m, 1, Cyclopropyl CH-NH), 3,43 (m, 2, CH&sub2;OH), 4,71 (t, 1, CH&sub2;OH), 5,40 (m, 1, 4'-H), 5,77 (s, 2, NH&sub2;), überlappend 5,84 (m, 1, =CH&sub2;), 6,09 (m, 1, =CH), 7,23 (d, 1, NH-CH), 7,58 (s, 1, Purin-8-H);
  • MS (CI) 287 (m+1).
  • UV: pH 1: λmax 296 (ε 14000); 255 (10700); pH 7,0: λmax 284 (15900);
  • 259 (9200); pH 13 λmax 284 (15800); 259 (9100). Analyse:
    • Beispiel 6 (±)-cis-4-(2-Amino-6-(cyclopropylmethylamino)-9H-purin-9-yl)-2- cyclopenten-1-methanol
  • (±)-cis-4-(2-Amino-6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten-1-methanol (0,53 g, 2 mmol) aus Beispiel 4, N-Methyl-N-cyclopropylamin (Karl Industries, Aurora, OH; 0,8477 g, 12 mmol) und Methanol (20 ml) wurden in eine Parr-Bombe gegeben und für 5 h auf 62ºC erhitzt. Die Lösung wurde aufkonzentriert und dann mit Ethanol verdünnt, bevor sie durch Zugabe von 1,0 N NaOH auf pH 12 gebracht wurde. Die Lösung wurde aufkonzentriert, und der Rückstand wurde durch Elution aus einer Silicagel-Säule mit 3% Methanol-Chloroform (0,547 g, 91,2%) gereinigt. Kristallisation einer solchen Probe aus Wasser-Ethanol lieferte ein weißes Pulver, Smp. 130-131ºC.
  • ¹H-NMR (Me&sub2;SO-d&sub6;) δ: 7,61 (s, 1H, Purin H-8), 6,10 (m, 1H, CH=), 5,84 (m, 1H, CH=), 5,7 (br s, 2H, NH&sub2;), 5,40 (m, 1H, CHN), 4,70 (br t, 1H, OH), 3,43 (m, 2H, CH&sub2;OH), 3,24 (br s, 4H, CH&sub3;, NCH Cyclopropyl), 2,85 (m, 1H, CH), 2,66-2,57 und 1,61-1,51 (m, 2, Cyclopentenyl CH&sub2;), 0,90-0,65 (m, 4H, 2CH&sub2; von Cyclopropyl). Analyse:
    • Beispiel 7 (-)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten- 1-methanol
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 5 (0,600 g, 2,00 mmol) wurde in 1,3- Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-(1H)-pyrimidinon (Aldrich, 12 ml) aufgelöst. Phosphorylchlorid (0,76 ml, 8,0 mmol) wurde zur gerührten und gekühlten Lösung (-10ºC) hinzugegeben. Nach 3 min wurde kaltes Wasser (100 ml) hinzugegeben und die resultierende Lösung mit 3 M Ammoniumhydroxid neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wurde mit Wasser auf 1 l verdünnt und auf eine 2,5 · 20 cm Säule aus DEAE Sephadex A25 (Pharmacia) aufgetragen, die mit 50 mM Ammoniumbicarbonat voräquilibriert worden war. Die Säule wurde zuerst mit 4 l 50 mN Ammoniumbicarbonat gewaschen. Das O-Monophosphat von (±)cis-4-[2-Amino-6-cycloprcpylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1- methanol wurde dann mit einem 2 l-Gradienten von 50 auf 300 mM Ammoniumbicarbonat eluiert. Die das Nukleotid enthaltenden Fraktionen (d. h. das obige O-Monophosphat) wurden zu einem weißen Pulver eingedampft, um Ammoniumbicarbonat zu entfernen; 71%, berechnet nach UV-Extinktion; ein Peak gemäß HPLC (siehe unten). Schlangengift-5'-Nukleotidase (EC 3.1.3.5) von Crotalus atrox (1000 IE, Sigma) wurde zu 1,4 mmol des in Wasser (20 ml) aufgelösten Nukleotids hinzugegeben. Die Lösung wurde bei 37ºC für 22 h inkubiert, und zu diesem Zeitpunkt wurde zusätzliches Enzym (1000 IE) hinzugegeben. Die Inkubierung wurde für weitere 3 Tage fortgesetzt. HPLC- Analyse (0,4 · 10 cm Whatman Partisil 10 starke Anionenaustauschersäule; Elution mit einem Gradienten von 20 mM auf 1 M Ammoniumphosphat, pH 5,5, 5% Methanol enthaltend; UV-Detektion bei 284 nm) an diesem Punkt zeigte, daß 50% des Ausgangsnukleotids zum Stammnukleosid dephosphoryliert worden war. Diese Mischung wurde wieder auf eine DEAE-Sephadex-Säule des oben beschriebenen Typs aufgetragen. Elution mit 4 l 50 mM Ammoniumbicarbonat ergab Fraktionen, die die Titelverbindung enthielten. Verdampfung des Wassers hinterließ ein weißes Pulver. Dieses Material wurde weiter durch Chromatographie an Silicagel mit MeOH : CHCl&sub3;/1 : 9 unter Erhalt eines farblosen Glases gereinigt. Das Glas wurde in Acetonitril verfestigt, um (-)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1- methanol als weißen gummiartigen Feststoff zu ergeben, der als fester Schaum bei 0,5 mmHg bei 68ºC getrocknet wurde (260 mg, 86% aus Racemat);
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) und Massenspektrum sind identisch mit denjenigen des Racemats (Titelverbindung aus Beispiel 5);
  • [α]²&sup0;D -59,7º, [α]²&sup0;&sub4;&sub3;&sub6; -127,8º [α]²&sup0;&sub3;&sub6;&sub5; -218,1º (c = 0,15, Methanol). Analyse:
  • Fortgesetzte Elution der zuletzt genannten Sephadex-Säule mit einem 2 l-Gradienten von 50 auf 300 mM Ammoniumbicarbonat ergab das O-Monophosphat (des der Titelverbindung entsprechenden (+)-Enantiomers), das gegenüber 5'-Nukleotidase stabil war.
    • Beispiel 8 (-)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten- 1-methanol-O-monophosphat
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 7 (0,35 g, 1,2 mmol) wurde in 1,3- Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-(1H)-pyrimidinon (Aldrich, 5 ml) aufgelöst. Phosphorylchlorid (Aldrich, 0,43 ml, 4,6 mmol) wurde zur gerührten und gekühlten Lösung (-10ºC) hinzugegeben. Nach 3 min wurde kaltes Wasser (20 ml) hinzugegeben und die resultierende Lösung mit 3 M Ammoniumhydroxid neutralisiert. Ionenaustauscherchromatographie wie in Beispiel 7 beschrieben ergab das Nukleotid als Diammoniumsalz nach Verdampfung des Wassers als weißes Pulver (95% Ausbeute, quantifiziert durch UV); HPLC- Analyse wie in Beispiel 7 zeigt einen Peak;
  • UV λmax nm (0,1 M HCl); 254, 297; (pH 7 Phosphat-Puffer): 259, 284; (0,1 M NaOH): 259, 284. Das Basen/Phosphat-Verhältnis betrug 1,0/1,3, bestimmt nach dem Verfahren von B. Ames (Methods in Enzymology 8 : 115, 1966).
  • [α]²²D -69,9º, [α]²&sup0;&sub5;&sub7;&sub8; -73,0º, [α]²&sup0;&sub5;&sub4;&sub6; -84,0º (c = 0,52, MeOH : H&sub2;O/4 : 1)
    • Beispiel 9 (-)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylmethylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 6 (2,00 g, 6,50 mmol) wurde in 1,3- Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinon (Aldrich, 20 ml) aufgelöst. Phosphorylchlorid (2,28 ml, 24,0 mmol) wurde zur gerührten und gekühlten Lösung (-10ºC) hinzugegeben. Nach 3 min wurde kaltes Wasser (80 ml) hinzugegeben. Die Lösung wurde mit Chloroform (3 · 80 ml) extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit Ethanol (400 ml) verdünnt und der pH mit gesättigtem wäßrigem NaOH auf 6 eingestellt. Die ausgefällten anorganischen Salze wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde weiter mit Ethanol auf ein Volumen auf 1 l verdünnt und der pH mit zusätzlichem NaOH auf 8 eingestellt. Der resultierende Niederschlag wurde filtriert und getrocknet, um das O-Monophosphat von (±)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylmethylamino) -9Hpurin-9-yl]-2-cyclopenten-1-methanol als weißes Pulver zu ergeben (4,0 mmol, 62%, quantifiziert durch UV-Extinktion); HPLC-Analyse wie in Beispiel 7 zeigt einen Peak. Dieses racemische O-Monophosphat wurde in Wasser (200 ml) aufgelöst und Schlangengift-5'-Nukleotidase (EC 3.1.3.5) von Crotalus atrox (5000 IE, Sigma) wurde hinzugegeben. Nach Inkubierung bei 37ºC für 10 Tage zeigte die HPLC-Analyse wie in Beispiel 7 beschrieben, daß 50% des Ausgangsnukleotids zum Nukleosid dephosphoryliert worden war. Dies wurde auf einer 5 · 14 cm Säule aus DEAE Sephadex A25 (Pharmacia) getrennt, die mit 50 mM Ammoniumbicarbonat voräquilibriert worden war. Die Titelverbindung wurde mit 2 l 50 mM Ammoniumbicarbonat eluiert. Verdampfen des Wassers ergab ein weißes Pulver, das in Methanol aufgelöst wurde, an Silicagel adsorbiert und auf eine Silicagel-Säule aufgetragen wurde. Die Titelverbindung wurde mit Methanol : Chloroform/1 : 9 als farbloses Glas eluiert. Eine Acetonitril-Lösung wurde eingedampft, um einen weißen festen Schaum zu ergeben, getrocknet bei 0,3 mmHg über P&sub2;O&sub5;; 649 mg (72% aus Racemat); ¹H-NMR in DMSO-d&sub6; und Massenspektrum sind identisch mit denjenigen des Racemats (Titelverbindung aus Beispiel 6);
  • [α]²&sup0;D -48,0º, [α]²&sup0;&sub4;&sub3;&sub6; -97,1º, [α]²&sup0;&sub3;&sub6;&sub5; -149º (c = 0,14 Methanol). Analyse:
  • Fortgesetzte Elution der Sephadex-Säule mit 2 l 100 mM Ammoniumbicarbonat und anschließend mit 2 l 20 mM Ammoniumbicarbonat ergab das O-Monophosphat des der Titelverbindung entsprechenden (+)-Enantiomers, das gegenüber 5'-Nukleotidase stabil war.
    • Beispiel 10 (1S,4R)-4-Amino-2-cyclopenten-1-methanoldibenzoyl-D-tartrat
  • (±)-cis-4-Acetamidocyclopent-2-enmethylacetat [US-A-4 268 672] (14,88 g, 0,073 mol) und Bariumhydroxid-Octahydrat 2(46,19 g, 0,146 mol) wurden in Wasser (300 ml) unter Stickstoff für 18 h zum Rückfluß erhitzt. Die resultierende Lösung wurde mit Kohlendioxid neutralisiert. Der Niederschlag wurde mit Wasser und anschließend Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden zu einem Sirup eingedampft (Essigsäuresalz von (±)-4-Amino-2-cyclopenten-1-methanol), der zum freien Amin durch Rühren mit einem Überschuß Amberlite IRA-400 (OH&supmin;)-Harz in Wasser konvertiert wurde. Das Harz wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und das Filtrat zu einem blaßgelben Sirup eingedampft, der durch Verdampfen von Teilen von Ethanol getrocknet wurde. Eine solche Probe des Amins (2,26 g, 20,0 mmol) und Dibenzoyl-D-weinsäure (Aldrich, 3,62 g, 10,0 mmol als 99%) wurden in heißem absolutem Ethanol (35 ml) aufgelöst. Acetonitril (ca. 150 ml) im Rückfluß wurde bis zum Trübungspunkt hinzugegeben, und man ließ die Lösung langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Die sich bildenden weißen Nadeln wurden dreimal aus der gleichen Lösungsmittelkombination umkristallisiert, um die Titelverbindung als weiße Plättchen zu ergeben (1,07 g, 37%);
  • Smp. 160-162ºC;
  • [α]²&sup0;D +66,9º, [α]²&sup0;&sub4;&sub3;&sub6; +165º [α]²&sup0;&sub3;&sub6;&sub5; +325º (c = 0,28, Methanol).
  • Röntgenkristallographie dieses Salzes erlaubte es, die absolute Konfiguration des Kations aufgrund der bekannten Konfiguration des D-Dibenzoylweinsäure-Dianions festzulegen. Dieses Salz kristallisierte in der Raumgruppe C2 mit einem C&sub6;H&sub1;&sub2;NO-Kation und einem halben C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub4;O&sub8;-Dianion als asymmetrische Einheit. Analyse:
    • Beispiel 11 (1R,4S)-4-Amino-2-cyclopenten-1-methanoldibenzoyl-L-tartrat
  • Dieses Salz wurde wie in Beispiel 10 beschrieben gebildet und kristallisiert, außer daß Dibenzoyl-L-weinsäure verwendet wurde. Drei Kristallisationen aus Ethanol-Acetonitril ergaben die Titelverbindung als weiße Plättchen (1,00 g, 34%); Smp. 160-162ºC;
  • [α]²&sup0;D -68,2º, [α]²&sup0;&sub4;&sub3;&sub6; -169º, [α]²&sup0;&sub3;&sub6;&sub5; -333º (c = 0,24, Methanol). Analyse:
    • Beispiel 12 (±)-cis-N-[4-Chlor-5-formamido-6-[[4-(hydroxymethyl)-2-cyclopenten-1- yl]amino]-2-pyrimidinyl]acetamid
  • N-(5-Amino-4,6-dichlorpyrimidin-2-yl)acetamid (J. Org. Chem. 1975, 40, 3141) wurde durch Zugabe von 96%iger Ameisensäure (20 ml) zu einer Lösung von (0,75 g, 3,4 mmol), aufgelöst in Essigsäureanhydrid (20 ml), formyliert. Die resultierende Lösung wurde bei 25ºC für 1 h gerührt und dann eingedampft, um N-(4,6-Dichlor-5-formamido-2-pyrimidinyl)acetamid als bräunliches Pulver zu ergeben (0,77 g, 91%); Struktur durch ¹H-NMR und Massenspektrum bestätigt. Dieses bräunliche Pulver (840 mg, 3,37 mmol), (±)-cis-4-Amino-2-cyclopenten-1-methanol (940 mg, 8,2 mmol) und Triethylamin (0,80 g, 8,0 mmol) wurden in Ethanol (50 ml) in einem Ölbad (70-80ºC) unter Stickstoff für 50 min erwärmt und zu einem dunklen Öl eingedampft, das an Silicagel chromatographiert wurde. Die Titelverbindung wurde mit 5% Methanol-Chloroform als pfirsichfarbener fester Schaum (840 mg) eluiert. Kristallisation aus Methanol ergab weiße Granalien (575 mg, 52%); Smp. 189-193ºC.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 10,23 (br, 1,0, NHAc), 9,3 (br, 1,0, NHCHO), 8,15 und 7,90 (beide s, gesamt 1,0, HC=O aus zwei Konformeren, Peaks fallen bei 60ºC zusammen), 7,42 und 7,22 (beide d, J = 8,3, gesamt 1,0, CH-NH aus zwei Konformeren, Peaks fallen bei 60ºC zusammen), 5,9 und 5,7 (beide m, 2,0, CH=CH), 5,05 (m, 1, CH-N), 4,73 (m, 1, OH), 3,39 (m, 2, CH&sub2;OH), 2,72 (m, 1, CH), 2,40 (m, 1, 1/2 CH&sub2;), 1,36 (m, 1, 1/2 CH&sub2;), 1,36 (m, 1, 1/2 CH&sub2;). Analyse:
    • Beispiel 13 (±)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten- 1-methanol
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 12 (0,91 g, 2,79 mmol) wurde in trockenem DMF (1 ml) aufgelöst. Triethylorthoformiat (10 ml) und Ethansulfonsäure (0,29 ml, 3,4 mmol) wurden hinzugegeben, und die Lösung wurde für 24 h auf 65ºC erhitzt. Die Lösung wurde zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup wurde in 1 N HCl (15 ml) aufgelöst und für 3 h gerührt. Der pH wurde mit 5 N Natriumhydroxid auf 7 eingestellt, und die resultierende Mischung (ein Öl bildete sich) wurde mit i-Propanol : Chloroform/1 : 3 (3 · 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und zu einem roten Glas (0,93 g) eingedampft. Eine Lösung dieses Glases in Methanol (20 ml) wurde mit Cyclopropylamin (2 ml) in einer Parr-Bombe für 18 h auf 70ºC erhitzt. Die resultierende Lösung wurde zu einem dunklen Glas eingedampft, das an Silicagel adsorbiert wurde. Elution mit 7% Methanol- Ethylacetat ergab die Titelverbindung (148 mg, 19%) als weißes Pulver nach Verreiben mit Acetonitril; ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) ist identisch mit denjenigen der Titelverbindung aus Beispiel 5.
    • Beispiel 14 {+)-(1R,4S)-cis-N-[4-Chlor-5-formamido-6-{[4-(hydroxymethyl)-2- cyclopenten-1-yl]amino}-2-pyrimidinyl]acetamid
  • (1S,4R)-4-Amino-2-cyclopenten-1-methanoldibenzoyl-D-tartrat, hergestellt wie in Beispiel 10 beschrieben (2,76 g, 9,02 mmol), wurde in Wasser (20 ml) aufgelöst und auf eine Säule aus 65 ml Amberlite IA-400 (OH- Form) Anionenaustauscherharz aufgetragen. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Basische Fraktionen wurden vereinigt und zu einem Öl-Rückstand eingedampft, der durch Verdampfen von absolutem Ethanol und dann bei 0,5 mm getrocknet wurde, um (1S,4R)-4-Amino-2-cyclopenten-1-methanol (1,2 g) als blaßgelbes Öl (das sich schnell in Luft verdunkelt) zu ergeben, welches unverzüglich verwendet wurde. Dieses Öl wurde in Ethanol (5 ml) aufgelöst und zu einer Lösung aus N-(4,6-Dichlor-5-formamido-2-pyrimidinyl)acetamid (2,07 g, 8,31 mmol), hergestellt wie in Beispiel 15 beschrieben, und Triethylamin (2,50 g, 24,8 mmol) hinzugegeben. Die resultierende dunkle Lösung wurde unter Stickstoff für 50 min erhitzt (Ölbad, 75-80ºC). Die Lösung wurde zu einem Sirup eingedampft, der auf eine Silicagel-Säule aufgetragen wurde. Die Titelverbindung wurde mit 3 bis 5% Methanol- Chloroform als schwachgelber fester Schaum (1,59 g, 54%) eluiert; ¹H-NMR ist identisch mit denjenigen der kristallisierten Probe. Eine solche Probe wurde aus Ethanol kristallisiert, um weiße Granalien zu ergeben, Smp. 194-195ºC; ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) ist identisch mit demjenigen der Titelverbindung aus Beispiel 12;
  • [α]²&sup0;D +2,7, [α]²&sup0;&sub5;× +3,6º, [α]²&sup0;&sub5;&sub4;&sub6; +2,9º [α]²&sup0;&sub4;&sub3;&sub6; -2,5º [α]²&sup0;&sub3;&sub6;&sub5; -41,2º (c = 0,238, Methanol).
    • Beispiel 15 (-)-(1S,4R)-cis(2-Amino-6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten-1- methanol
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 14 (1,15 g, 3,53 mmol) wurde vorsichtig in Diethoxylmethylacetat (45 ml) unter Stickstoff für 3,5 h zum Rückfluß erhitzt. Die resultierende blaßgelbe Lösung wurde bei 0,5 mmHg zu einem gelben Sirup aufkonzentriert. Der Sirup wurde mit 1 N HCl (50 ml) für 1,0 h gerührt. Diese Lösung wurde mit Natriumbicarbonat neutralisiert und zur Trockene eingedampft. Die zurückbleibenden Feststoffe wurden mit Methanol extrahiert und das Methanol-lösliche Material auf eine Silicagel- Säule aufgetragen. Elution der Säule mit 10% Methanol-Ethylacetat ergab die Titelverbindung als blaßgelben festen Schaum (730 mg, 78%); ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) ist identisch mit demjenigen des Racemats (Titelverbindung aus Beispiel 4);
  • [α]²&sup0;D -114,9º (c = 0,26, MeOH).
    • Beispiel 16 (-)-(1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl)-2- cyclopenten-1-methanol
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 15 (560 mg, 2,11 mmol) in Methanol (12 ml) wurde mit Cyclopropylamin (2,4 ml) in einer Parr-Bombe bei 78ºC für 17 h erhitzt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand an Silicagel chromatographiert. Die Titelverbindung wurde mit 5 bis 7% Methanol-Ethylacetat als farbloser fester Schaum eluiert (367 mg, 59%);
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) ist identisch mit demjenigen aus Beispiel 8;
  • [α]²&sup0;D -59,0º (c = 0,28, MeOH) bestätigt die absolute Konfiguration der Titelverbindung aus Beispiel 7.
    • Beispiel 17 (1S,4R)-4-Amino-2-cyclopenten-1-methanoldibenzoyl-D-tartrat
  • 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-on [Daluge und Vince, J. Org. Chem. 1978, 43 2311 und US-A-4 268 672] (44,0 g, 0,400 mol) wurde in 2 N HCl in Methanol (0,5 l) bei 25ºC für 1,5 h gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden verdampft, um (±)-cis-Methyl-4-amino-2-cyclopenten-1-carboxylat-Hydrochlorid als schmutzigweißes Pulver (71,1 g) zurückzulassen.
  • Verreiben einer solchen Probe mit Diethylether ergab ein weißes Pulver, Smp. 92,5-95ºC [J. Org. Chem. 1981, 46, 3271; Smp. 82-83ºC];
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 8,25 (br s, 3, NH&sub3;&spplus;), 6,1 und 5,9 (beide m, 2, CH-CH), 3,64 (s) überlappend 3,75 - 3,6 (m, insgesamt 4, OMe und CH), 2,65 - 2,45 und 2,05 - 1,85 (beide m, 2, CH&sub2;). Analyse:
  • (±)-cis-Methyl-4-amino-2-cyclopenten-1-carboxylat-Hydrochlorid (17,7 g, 0,100 mol) und Diisobutylaluminiumhydrid (0,500 mol als 1 M Lösung in Hexan) wurden in Hexan (200 ml) für 6 h zum Rückfluß erhitzt. Die resultierende Lösung wurde abgekühlt, und 10 ml wäßriges 1 M Ammoniumchlorid und dann Methanol (200 ml) wurden hinzugegeben. Diese Mischung wurde für 30 min zum Rückfluß erhitzt, und MgSO&sub4; (10 g) wurde hinzugegeben. Die Feststoffe wurden abfiltriert und mit zusätzlichem Methanol gewaschen. Die Filtrate wurden zu einem dunklen Öl (15,5 g) eingedampft; ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) ist identisch zu demjenigen von (±)-4-Amino-2-cyclopenten-1- methanol, hergestellt wie in Beispiel 13 beschrieben. Eine solche Probe nach Reinigung durch Chromatographie an Silicagel (EtOH : CHCl&sub3; : NH&sub4;OH/10 : 90 : 1) wurde mit Dibenzoyl-D-weinsäure zur Bildung der Titelverbindung kristallisiert.
    • Beispiel 18 [cis-4-(2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9yl)-2-cyclopenten-1- yl]methyl-R-2,3-bis-(hexadecanoyloxy)propylhydrogenphosphat
  • Eine Lösung aus L-α-Dipalmitoylphosphatidylcholin (150 mg, 0,2 mmol, Sigma) in 6 ml Chloroform wurde in einen Kolben gegeben, der (±)-cis-4-(2- Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten-1-methanol (300 mg, 1,03 mmol) Phospholipase D, Typ VII (aus Streptomyces, 1,0 mg, spezifische Aktivität 185 Einheiten/mg, Sigma) und pH 4,5-Puffer (1,5 ml, 250 mM in CaCl&sub2;, 200 mM in NaOAc, eingestellt auf pH 4, 5 durch Zugabe von 0,1 N HCL) enthielt. Die resultierende Doppelphase wurde bei 45ºC (Ölbad) für 1 h gerührt. Die Schichten getrennt und die wäßrige Schicht mit Chloroform (3 · 6 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 1 N HCL gewaschen, getrocknet und aufkonzentriert. Eine solche Probe wurde durch Elution aus 2 Silicagel-Säulen mit 12% Methanol-Chloroform gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben, 120 mg (47%). Dieses Material wurde unter Verwendung von Ethylacetat-Acetonitril zur Erzeugung eines hellgelben Pulvers verfestigt, Smp. 155-157ºC;
  • ¹H-NMR (CD&sub3;CD-CDCl&sub3;) δ: 7,78 (s, überlappendes Lösungsmittel, Purin H-8), 6,12 und 5,88 (m, 2, HC=CH), 5,53 (m, 1, CHN Cyclopenten), 5,22 (m, 1, CO&sub2;CH), 4,37 (dd, J = 3, 12; 1, 0,5 POCH&sub2; Glycerin), 4,12 (m, 1, 0,5 POCH&sub2; Glycerin), 3,42 (m, 4, OCH&sub2; Glycerin, OCH&sub2;), 3,11 (br m, 1, CH), 2,90 (m, 1, NCH), 2,78 (m, 1, 0,5 CH&sub2; Cyclopenten), 2,27 (m, 4, 2CH&sub2;CO&sub2;), 1,70 (m, 1, 0,5 CH&sub2; Cyclopenten), 1,56 (br m, 4, 2CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;), 1,27 (br m, 38, 24 CH&sub2;), 0,88 (m, 6, 2CH&sub3;), 0,83 (m, 2, CH&sub2; Cyclopropyl), 0,60 (m, 2, CH&sub2; Cyclopropyl). Analyse:
    • Beispiel 19 [cis-4-(2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten-1- yljmethyl-R-2,3-bis-(hexanoyloxy)propylhydrogenphosphat
  • Eine Lösung aus L-α-Dicaproylphosphatidylcholin (300 mg, 0,66 mmol, Sigma) in 15 ml CHCl&sub3; wurden in einen Kolben gegeben, der (±)cis-4-(2- Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten-1-methanol (378 mg, 1,32 mmol), Phospholipase D, Typ II (aus Streptomyces, 1,04 mg, spezifische Aktivität 185 Einheiten/mg, Sigma), pH 4,5 Puffer (4,5 ml, 250 mM in CaCl&sub2;, 200 mM in NaOAc, eingestellt auf pH 4,5 mit HCl) und CHCl&sub3; (3 ml) enthielt. Die resultierende Doppelphase wurde bei 45ºC (Ölbad) für 4 h gerührt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht mit 1 N HCl (2 · 4 ml) gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Schichten wurden mit Chloroform (10 ml) zurückgewaschen. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde auf eine Silicagel-Säule gegeben, und die Titelverbindung wurde mit 16% Methanol-Chloroform eluiert und zum Erhalt eines feinen gelben Pulvers aufkonzentriert. Dieses Material wurde in Ethanol aufgelöst und aufkonzentriert (3 · 50 ml), bevor es im Hochvakuum getrocknet wurde, um 103 mg (21% Ausbeute) eines hellgelben Pulvers zu ergeben, Smp. 182-185ºC.
  • ¹H-NMR (DMSOd&sub6;) α: 7,61 (s, 1, Purin H8), 7,22 (br s, 1, NH), 6,09 (m, 1, 0,5 CH=CH), 5,89 (m, überlappend br s bei 5,83, 3, 0,5 CH=CH, NH&sub2;), 5,41 (br m, 1, CHN), 5,09 (br m, 1, CO&sub2;CH), 4,30 (dd; J = 2,7, 12; 1, 0,5 POCH&sub2; Glycerin), 4,08 (m, 1, 0,5 POCH&sub2; Glycerin), 3,80 (br m überlappend br m bei 3,75, 4, OCH&sub2; Glycerin, OCH&sub2;), 3,02 (br m, 2, CH, NCH Cyclopropropyl), 2,65 (m, 1, 0,5 CH&sub2; Cyclopenten), 2,23 (+, J = 7,5, 4, 2CH&sub2;CO&sub2;), 1,48 (br m, 5, 2 CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;, 0,5 CH&sub2; Cyclopenten), 1,23 (br m, 8, 2 (CH&sub2;)&sub2;), 0,84 (m, 6, 2 CH&sub3;), 0,67 und 0,58 (m, 4, 2 CH&sub2; Cyclopropyl). Analyse:
  • Das vorhergehende Beispiel ist eine Anpassung des Verfahrens von Satoshi Shuto et al., Tetrahedron Letters, Band 28, Nr. 2, S. 199-202, 1987.
    • Beispiel 20 N-(4-Chlor-1,6-dihydro-5-nitro-6-oxo-2-pyrimidinyl)isobutyramid
  • 6-Chlor-5-nitroisocytosin (J. Chem. Soc., 1960, 5041; J. Org. Chem., 1975, 40,3141) wurde durch Erhitzen des gelben Feststoffs (14,88 g, 78,09 mmol) auf 100ºC für 1 h in Isobuttersäureanhydrid (250 ml) und konzentrierter Schwefelsäure (3-4 Tropfen) geschützt. Die resultierende Lösung wurde mit wasserfreiem Methanol (100 ml) behandelt, bei 50ºC für 1/2 h gerührt, zu einem Drittel des ursprünglichen Volumens aufkonzentriert, und die Titelverbindung (14,97 g, 74%) wurde durch Filtration als blaßgelbe Kristalle aufgefangen; Smp. 196-199ºC (Zers.);
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 1,12 (d, J = 6,9, H&sub2;, 6H, (CH&sub3;)&sub2;CH), 2,75 (m, J = 6,9, H&sub2;, 1H, (CH&sub3;)&sub2;CH), 12,41 (br s, 1H). Analyse:
    • Beispiel 21 N-(4,6-Dichlor-5-nitro-2-pyrimidinyl)isobutyramid
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 20 (10,0 g, 38,37 mmol) wurde in Phosphoroxychlorid (200 ml) und N,N-Diethylanilin (3-4 Tropfen) für 5 h unter Stickstoff zum Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, zur Trockene aufkonzentriert, und der Sirup wurde in kaltem Methylenchlorid (~-10ºC) (200 ml) aufgelöst. Die organische Schicht wurde mit gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat (100 ml) unter kräftigem Rühren behandelt, und die Temperatur wurde unterhalb 5ºC gehalten, während festes Natriumbicarbonat portionsweise hinzugegeben wurde, um den pH auf 5 bis 7 anzuheben. Die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Phase wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Phasentrennpapier filtriert, aufkonzentriert und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung (7,71 g, 72%) als gelbweißen Feststoff zu ergeben, der ausreichend rein zum Einsatz im nächsten Schritt war. Umkristallisation des Feststoffs aus Hexan/Methylenchlorid lieferte eine analytische Probe, Smp.: 166-169ºC;
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 1,09 (d, J = 6,9 Hz, 6H, (CH&sub3;)&sub2;CH), 2,79 (m, J = 6,9 Hz, 1H, (CH&sub3;)&sub2;CH), 11,61 (s, 1H). Analyse:
    • Beispiel 22 N-(4,6-Dichlor-5-formamido-2-pyrimidinyl)isobutyramid
  • Die Titelverbindung aus Beispiel 21 (6,77 g, 24,26 mmol) wurde in eine Parr-Flasche gegeben, die 220 ml absolutes EtOH und 10,0 g (naß) Raney-Nickel-Katalysator enthielt, der zuvor unter Wasserstoff (40 psi) für 10 min geschüttelt worden war. Die Mischung wurde unter Wasserstoff (40 psi) für 1 h geschüttelt, über Kieselgur filtriert, und das Filtrat wurde zu einem gelbweißen Feststoff aufkonzentriert, der im Hochvakuum über Nacht getrocknet wurde. Dieser Feststoff wurde in 1,2-Dichlorethan (250 ml) bei 0ºC gerührt. Essigsäureanhydrid (30 ml) wurde hinzugegeben, gefolgt von Ameisensäure (30 ml) tropfenweise unter Stickstoff. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur für 2 h gerührt, zur Hälfte des ursprünglichen Volumens aufkonzentriert und mit Toluol zur Entfernung restlicher Ameisen-/Essigsäure azeotrop destilliert. Der rohe Feststoff wurde mit Methanol verreiben, um die Titelverbindung (4,92 g, 73%) als schmutzigweißen Feststoff zu ergeben; Smp. 206-209c (Zers.);
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 1,08 (d, J = 6,8 Hz, 6,0 (CH&sub3;)&sub2;CH), 2,74 (m, J = 6,8 Hz, 1,0 (CH&sub3;)&sub2;CH), 8,18 (d, J = 10,3 Hz) und 10,26 (br s) [insgesamt 1,0, NHCHD aus zwei Konformeren], 11,17 (br s, 1,0). Analyse:
    • Beispiel 23 (+)-(1R,4S)-cis-N-[4-Chlor-5-formamido-6-{[4-(hydroxymethyl)-2- cyclopenten-1-yl]amino}-2-pyrimidinyl]isobutyramid
  • (1S,4R)-4-Amino-2-cyclopenten-1-methanoldibenzoyl-D-tartrat (2,44 g, 8,15 mmol), hergestellt wie in Beispiel 10 beschrieben, wurde in 90% Ethanol (20 ml) aufgelöst, und die Lösung zu einer Säule aus Amberlite IRA-400 (OH&supmin;)-Harz (30 ml) hinzugegeben, das zuvor mit dem gleichen Lösungsmittel vorgewaschen worden war.
  • Elution mit 90% Ethanol ergab basische Fraktionen, die bei Aufkonzentrieren und Verdampfen mit Teilen aus Toluol-Ethanol (1S,4R)-4-Amino- 2-cyclopenten-1-methanol als blaßgelbes Öl (1,4 g) zurückließen, das unverzüglich mit N-(4,6-Dichlor-5-formamido-2-pyrimidinyl)isobutyramid (2,26 g, 8,15 mmol), hergestellt wie in Beispiel 22 beschrieben, in 1,2- Dimethoxyethan (100 ml) mit Triethylamin (2,3 ml, 16,3 mmol) bei 95 bis 110ºC für 1,5 h kondensiert wurde. Die resultierende Lösung wurde zu einem dunkelgelben Sirup eingedampft, der an Silicagel chromatographiert wurde. Elution der Säule mit 5 bis 7,5% Methanol-Chloroform ergab die Titelverbindung als blaßgelben Feststoff (2,45 g, 84%). Kristallisation einer solchen Probe aus Acetonitril ergab die Titelverbindung als feine weiße Kristalle; Smp. 194,5-195,5ºC.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 10,21 (s, 1, NHCOCHMe&sub2;), 9,29 (s, 1, NHCHO), 8,12 (s, 1, CHO), 7,18 (d, J = 7,9, 1, CHNH), 5,8 und 5,7 (beide m, 2 CH=CH), 5,08 (m, 1, CHN), 4,71 (t, J = 5,06, 1, OH), 3,37 (m, 2, CH&sub2;OH), 2,9 - 2,6 (m, 2, OHNe und CH), 2,40 (m, 1, 0,5CH&sub2;), 1,33 (m, 1, 0,5CH&sub2;);
  • [α]²&sup0;D +4,4º, [α]²&sup0;&sub3;&sub6;&sub5; -20,7º (c = 0,237, MeOH). Analyse:
    • Beispiel 24 (-)-(1R,4S)-cis-N-[6-(Cyclopropylamino)-9-(4-(hydroxymethyl)-2- cyclopenten-1-yl)-9H-purin-2-yl]isobutyramid
  • (+)-(1R,4S)-cis-N-[4-Chlor-5-formamido-6-{[4-(hydroxymethyl)-2- cyclopenten-1-yl]amino}-2-pyrimidinyl]isobutyramid (1,949 g, 5,44 mmol), hergestellt wie in Beispiel 23 beschrieben, wurde mit Triethylorthoformiat (30 ml) in einem Eis-Wasser-Bad gerührt, während konzentrierte Salzsäure (2,0 ml) während 2 min hinzugetropft wurde. Die resultierende klare Lösung wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt und der zurückbleibende Sirup (der ein (1R,4S)- cis-N-(6-Chlor-9-(4-hydroxymethyl)-2-cyclopenten-1-yl)-9H-purin-2- yl]isobutyramidorthoester-Konjugat enthielt) in Ethanol (30 ml) mit Cyclopropylamin (10 g) für 2,5 h zum Rückfluß erhitzt. Eindampfen ließ einen Sirup zurück, der in 10% Isopropanol-Chloroform (200 ml) aufgelöst wurde. Diese Lösung wurde kräftig mit gesättigtem wäßrigem Natriumbicarbonat (25 ml) gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht mit zusätzlichem 10% Isopropanol-Chloroform gewaschen. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO&sub4;). Verdampfen ließ ein blaßgelbes Glas (2,4 g) zurück, das an Silicagel chromatographiert wurde. Die Titelverbindung wurde mit 2 bis 3% Methanol-Ethylacetat als weißer Feststoff (1,02 g, 53%) eluiert; Umkristallisation einer solchen Probe aus Methanol-Acetonitril ergab die Verbindung als weiße Nadeln; Smp. 197,5-198,SC.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ: 9,75 (s, 1, NHCO), 7,93 (s, 1, Purin H-8), 7,82 (br s, 1 N H-Cyclopropyl), 6,12 und 5,92 (beide m, 2, CH=CH), 5,50 (m, 1, CH-N), 4,73 (t, J = 5,3, 1, OH), 3,46 (m, 2, CH&sub2;-O), 3,25 - 3,00 (m, 2, C&sub1;-IMe2 und CH), 2,91 (m, 1 CH), 2,75 - 2,6 (m, 1, 0,5 CH&sub2;), 1,7 - 1,6 (m, 1, 0,5CH&sub2;), 1,07 (d, J = 6,8, 6, CHMe&sub2;), 0,75 - 0,6 (m, 4,2 Cyclopropyl, CH&sub2;);
  • [α]²&sup0;D 70,7º, [α]²&sup0;&sub4;&sub3;&sub6; -159,0º (c = 1,02, MeOH). Analyse:
  • Fortgesetzte Elution der Säule mit 5% Methanol-Ethylacetat ergab zusätzliche Titelverbindung, die mit ca. 10% (-)-(1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6- (cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1-methanol verunreinigt war, als blaßgelben festen Schaum (928 mg).
    • Beispiel 25 (-)-(1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol
  • (-)-(1R,4S)-cis-N-[6-(cyclopropylamino)-9-(4-(hydroxymethyl)-2- cyclopenten-1-yl)-9H-purin-2-yl]isobutyramid (1,33 g, 3,73 mmol), hergestellt wie in Beispiel 24 beschrieben, wurde mit 1 N Salzsäure (40 ml) für 2 Tage bei Umgebungstemperatur gerührt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und die Mischung zur Trockene eingedampft. Die zurückbleibenden Feststoffe wurden mit heißem EtOH (3 · 25 ml) verrieben. Das Ethanol wurde unter Erhalt eines gelben Glases verdampft, das an Silicagel chromatographiert wurde. Die Titelverbindung wurde mit 3% Methanol-Ethylacetat als farbloser fester Schaum (857 mg, 80%) eluiert, ¹H-NMR und [α]²&sup0;D sind identisch mit denjenigen der Titelverbindung aus Beispiel 16.
    • Beispiel 26 (-)-(1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol-Hydrochlorid
  • (-)-(1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol (1,90 g, ca. 6,3 mmol gemäß ¹H-NMR) wurde in 1 N Salzsäure (7,0 ml) und Ethanol aufgelöst. Die Lösung wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand erneut in Ethanol (15 ml) aufgelöst. Ethylacetat wurde langsam auf ein Gesamtvolumen von 80 ml hinzugegeben. Das schmutzigweiße Pulver, das sich bildete, wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung (2,07 g, 97%) zu ergeben; Smp. erweicht bei 125-130ºC, Zers. oberhalb 138ºC;
  • [α]²&sup0;&sub5;&sub8;&sub9; -27,1º [α]²&sup0;&sub4;&sub3;&sub6; -52,3º (c = 0,199, MeOH). Analyse:
    • Beispiel 27 {-)-(1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol-Dihydrochlorid
  • (-)-(1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol (857 mg, 3,00 mmol) wurde in Ethanol-Ethylacetat aufgelöst, und 1 N etherische Salzsäure (12 ml) wurde hinzugegeben. Der feine weiße Niederschlag wurde mit Ethylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung (642 mg, 75%) zu ergeben;
  • Smp. 176-180ºC (Zers.). Analyse:
    • Beispiel 28 (1S,4R)-4-(2-amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten- 1-methanol-O-diphosphat
  • Das (-)-(1S,4R)-cis-4-(2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl)-2- cyclopenten-1-methanol-O-monophosphat, hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben, wurde zum Triethylammoniumsalz konvertiert durch Verwendung einer Lösung, die 0,49 mmol des Monophosphats als Ammoniumsalz enthielt, Kombinieren mit 5 ml 0,5 M Triethylammoniumbicarbonat und Trocknen im Vakuum, gefolgt von weiteren 5 ml 0,5 M Triethylammoniumbicarbonat und zweifachem Wiederholen. Dann wurden dreimal 5 ml Acetonitril hinzugegeben und im Vakuum getrocknet. Dies wurde in 7 ml 1,3-Dimethyl-3,4,5,6- tetrahydro-2(1H)-pyrimidinon (Aldrich) aufgelöst, dann wurden 0,39 g 1,1'- Carbonyldiimidazol (Aldrich, 2,4 mmol) hinzugegeben und für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Methanol (0,16 ml, 4,0 mmol) wurde hinzugegeben und für 30 min gerührt. Tributylammoniumpyrophosphat (hergestellt durch Austauschen des Salzes von Tetranatriumpyrophosphat gegen Wasserstoff an einem Ionenaustauscherharz, dann Neutralisierung mit Tributylamin und Trocknen, 2,4 mmol) wurde hinzugegeben, für 18 h bei Raumtemperatur gerührt, und dann wurden 50 ml Wasser hinzugegeben. Sowohl das O-Disphosphat als auch das O-Triphosphat wurden gebildet, da das Tributylammoniumpyrophosphat Orthophosphat-Verunreinigungen enthielt.
  • Die Reaktionsprodukte wurden durch DEAE Sephadex-Ionenaustauscherchromatographie in einer 2,5 · 18 cm Säule aus DEAE Sephadex A25 (Pharmacia) aufgetrennt, die mit 50 mM Ammoniumbicarbonat (ABC) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1 l 100 mM ABC gewaschen, dann mit einem linearen 2 l-Gradienten von 100 auf 800 mM ABC, um die Titelverbindung zu eluieren, gefolgt vom Triphosphat, wie in größerem Detail in Beispiel 29 beschrieben. Die Fraktionen, die das Diphosphat enthielten, wurden vereinigt, im Vakuum getrocknet, erneut in Wasser aufgelöst, und dann zweimal wiederholt, um das Ammoniumsalz der Titelverbindung (0,032 mmol, 6% Ausbeute) zu liefern.
  • UV-Abtastung: in 0,1 M HCl λmax = 254 und 298 nm; bei pH 7 λmax = 259 und 284 nm: in 0,1 M NaOH λmax = 258 und 284 nm.
  • Eine Aliquote des Diphosphats wurde mit alkalischer Phosphatase (Rinderdarm, Boehringer Mannheim) behandelt, zu verschiedenen Zeiten untersucht und an Dünnschichtchromatographie entwickelt (PEr-Cellulose, Brinkman, 1 M LiCl/1 M Ameisensäure 1 : 1). Eine sequenzielle Konvertierung von Diphosphat zu Monophosphat zu Nukleosid wurde beobachtet. Die Endmenge von freigesetztem Phosphat wurde durch das Verfahren von Bencini bestimmt (D.A. Bencini, J.R. Wild, und G.A. O'Donovan, Analytical Biochemistry 132: 254-258 (1983)), und das Basen/Phosphat-Verhältnis wurde zu 1,0/4,7 bestimmt, was die Gegenwart von anorganischen Phosphat anzeigt. Die W- Reinheit betrug 97% nach analytischer HPLC (starke Anionenaustauschersäule eluiert mit einem Gradienten von 10 mM auf 1 M Ammoniumphosphat, pH 5,5).
    • Beispiel 29 (1S,4R)-4-(2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten- 1-methanol-O-triphosphat
  • Fortgesetzte Elution der in Beispiel 28 beschriebenen Säule ergab beim Verdampfen das Ammoniumsalz der Titelverbindung. Dieses Salz wurde zum Natriumsalz durch Durchlauf durch eine Dowex AG 50 W-X8 (Bio-Rad) Harzsäule (Natrium-Form, 20 ml) konvertiert. Die das Nukleotid enthaltenden Fraktionen wurden im Vakuum aufkonzentriert, um 0,4 mmol (81%) zu liefern. W- Abtastung: in 0,1 M HCl λ max = 254 und 299 nm; bei pH 7 λmax = 259 und 284 nm; in 0,1 M NaOH λ max = 259 und 284 nm. Optische Drehung in Wasser bei 6,14 g/100 ml betrug [α]²&sup0; = -47,1º bei analytischer HPLC (starker Anionen-Gradient von 10 mM auf 1 M Ammoniumdiphosphat vorhanden). Eine Aliquote des Triphosphats wurde mit alkalischer Phosphatase (Rinderdarm, Boehringer Mannheim) behandelt, zu verschiedenen Zeiten untersucht und an Dünnschichtchromatographie (PEI-Cellulose, Brinkman, 1 M LiCl/1 M Ameisensäure 1 : 1) entwickelt. Eine sequenzielle Konvertierung von Triphosphat zu Diphosphat zu Monophosphat zu Nukleosid wurde beobachtet. Die Endmenge an freigesetztem Phosphat wurde durch das Verfahren von Bencini bestimmt (D.A. Bencini, J.R. Wild und G.A. O'Donovan, Analytical Biochemistry 132: 254 = 258 (1983)), und das Basen-/Phosphat-Verhältnis wurde zu 1,0/2,8 bestimmt.
    • Beispiel 30 (1S,4R)-4-[2-Amino-6-(cyclopropylmethylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol
  • (1S,4R)-4-(2-Amino-6-chlor-9H-purin-9-yl)-2-cyclopenten-1-methanol (274 mg, 1,00 mmol), N-Cyclopropyl-N-methylamin (0,71 g, 10 mmol) und absolutes Ethanol (6 ml). Der Rückstand wurde an Silicagel chromatographiert. Die Titelverbindung wurde mit 10% Methanol-Chloroform als farbloses Glas eluiert. Verdampfen aus einer Ethanol-Lösung und Trocknen mit Phosphorpentoxid bei 0,2 mmHg ergab die Titelverbindung als weißen festen Schaum (293 mg, 98%); ¹H-NMR und [α]²&sup0;&sub5;&sub8;&sub9; sind identisch mit denjenigen der Titelverbindung aus Beispiel 9.
    • Beispiel A Tablettenformulierungen
  • Die folgenden Formulierungen A, B und C werden hergestellt durch Naßgranulieren der Bestandteile mit einer Lösung aus Povidon, gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verpressen. Formulierung A Formulierung B
    • Formulierung C mg/Tablette
  • Wirkstoff 100
  • Lactose 200
  • Stärke 50
  • Povidon 5
  • Magnesiumstearat 4
  • 359
  • Die folgenden Formulierungen D und E werden hergestellt durch Direktverpressen der vermischten Bestandteile. Die Lactose in Formulierung E ist vom Direktverpressungs-Typ (Dairy Crest - "Zeparox").
    • Formulierung D mg/Tablette
  • Wirkstoff 250
  • Vorgequollene Stärke NF15 150
  • 400
    • Formulierung E mg/Tablette
  • Wirkstoff 250
  • Lactose 150
  • Avicel 100
  • 500
    • Formulierung F (Formulierung mit kontrollierter Freisetzung)
  • Die Formulierung wird hergestellt durch Naßgranulierung der Bestandteile (unten) mit einer Lösung aus Povidon, gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verpressen.
    • mg/Tablette
  • (a) Wirkstoff 500
  • (b) Hydroxypropylmethylcellulose (Methocel K4M Premium) 112
  • (c) Lactose B. P. 53
  • (d) Povidon B. P. 28
  • (e) Magnesiumstearat 7
  • 700
  • Die Arzneistoff-Freisetzung findet über einen Zeitraum von ca. 6 bis 8 h statt und ist nach 12 h beendet.
    • Beispiel B Kapsel-Formulierungen Formulierung A
  • Eine Kapselformulierung wird hergestellt durch Vermischen der Bestandteile der Formulierung D in obigem Beispiel A und Einfüllen in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel. Formulierung B (unten) wird in einer ähnlichen Weise hergestellt.
    • Formulierung B mg/Kapsel
  • (a) Wirkstoff 250
  • (b) Lactose B. P. 143
  • (c) Natriumstärkeglykolat 25
  • (d) Magnesiumstearat 2
  • 420
    • Formulierung C mg/Kapsel
  • (a) Wirkstoff 250
  • (b) Macrogol 4000 B. P. 350
  • 600
  • Kapseln der Formulierung C werden hergestellt durch Schmelzen des Macrogol 4000 BP, Dispergieren des Wirkstoffs in der Schmelze und Einfüllen der Schmelze in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel.
    • Formulierung D mg/Kapsel
  • Wirkstoff 250
  • Lecithin 100
  • Erdnußöl 100
  • 450
  • Kapseln der Formulierung D werden hergestellt durch Dispergieren des Wirkstoffs im Lecithin und Erdnußöl und Einfüllen der Dispersion in weiche elastische Gelatinekapseln.
    • Formulierung E (Kapsel mit kontrollierter Freisetzung)
  • Die folgende Kapsel-Formulierung mit kontrollierter Freisetzung wird hergestellt durch Extrudieren der Bestandteile a, b und c unter Verwendung eines Extruders, gefolgt von Sphäronisieren des Extrudats und Trocknen. Die getrockneten Pellets werden dann mit einer die Freisetzung kontrollierenden Membran (d) umhüllt und in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel gefüllt.
    • mg/Kapsel
  • (a) Wirkstoff 250
  • (b) Mikrokristalline Cellulose 125
  • (c) Lactose B. P. 125
  • (d) Ethylcellulose 13
  • 513
    • Beispiel C
  • Injizierbare Formulierung A Wirkstoff 0,200 g
  • Salzsäure-Lösung, 0,1 M, oder Natriumhydroxid-Lösung 0,1 M, in genügender Menge auf pH 4,0 bis 7,0
  • steriles Wasser in genügender Menge auf 10 ml
  • Der Wirkstoff wird im Großteil des Wassers (35-40ºC) aufgelöst und der pH mit Salzsäure oder Natriumhydroxid, je nach Bedarf, auf 4,0 bis 7,0 eingestellt. Der Ansatz wird dann mit Wasser zum Volumen aufgefüllt und durch einen sterilen Mikroporenfiler in sterile 10 ml Braunglas-Phiolen (Typ 1) filtriert und mit sterilen Verschlüssen und Übersiegeln versiegelt.
    • Formulierung B
  • Wirkstoff 0,125 g
  • steriler pyrogenfreier Phosphatpuffer pH 7, in genügender Menge auf 25 ml
    • Beispiel D
  • Intramuskuläre Injektion
  • Wirkstoff 0,20 g
  • Benzylalkohol 0,10 g
  • Glycofurol 75 1,45 g
  • Wasser zur Injektion in
  • genüßgender Menge auf 3,00 ml
  • Der Wirkstoff wird im Glycofurol aufgelöst. Der Benzylalkohol wird dann hinzugegeben und aufgelöst, und Wasser wird auf 3 ml hinzugegeben. Die Mischung wird denn durch einen sterilen Mikroporenfilter filtriert und in sterilen 3 ml Braunglas-Phiolen (Typ 1) versiegelt.
    • Beispiel E
  • Sirup
  • Wirkstoff 0,25 g
  • Sorbit-Lösung 1,50 g
  • Glycerin 2,00 g
  • Natriumbenzoat 0,005 g
  • Geschmack, Pfirsich 17.42.3169 0,0125 ml
  • gereinigtes Wasser, in genügender Menge auf 5,00 ml
  • Der Wirkstoff wird in einer Mischung aus dem Glycerin und dem Großteil des gereinigten Wassers aufgelöst. Eine wäßrige Lösung des Natriumbenzoats wird dann zur Lösung hinzugegeben, gefolgt von Zugabe der Sorbit- Lösung und schließlich des Geschmackstoffs. Das Volumen wird mit gereinigtem Wasser aufgefüllt und gut vermischt.
    • Beispiel F Suppositorium mg/Suppositorium
  • Wirkstoff 250
  • Hartfett, BR (Witepsol H15 - Dynamit Nobel) 1770
  • 2020
  • Ein Fünftel des Witepsol H15 wird in einem Tiegel mit Dampfmantel bei maximal 45ºC geschmolzen. Der Wirkstoff wird durch ein 200 um-Sieb gesiebt und zur geschmolzenen Basis unter Vermischen und unter Verwendung eines mit einem Schneidkopf ausgerüsteten Silverson hinzugegeben, bis eine glatte Dispersion erhalten wird. Während die Mischung auf 45ºC gehalten wird, wird das übrige Witepsol H15 zur Suspension hinzugegeben und gerührt, um eine homogene Mischung sicherzustellen. Die gesamte Suspension wird durch ein 250 um-Sieb aus rostfreiem Stahl geleitet und unter kontinuierlichem Rühren auf 40ºC abkühlen gelassen. Bei einer Temperatur von 38 bis 40ºC werden 2,02 g der Mischung in geeignete 2 ml Plastikformen gefüllt. Die Suppositorien werden auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
    • Beispiel G Pessare mg/Pessar
  • Wirkstoff 250
  • wasserfreie Dextrose 380
  • Kartoffelstärke 363
  • Magnesiumstearat 7
  • 1000
  • Die obigen Bestandteile werden direkt vermischt und Pessare durch Direktverpressen der resultierenden Mischung hergestellt.
    • Antivirale Aktivität a) Anti-HIV-Aktivität
  • (1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol wurde auf Anti-HIV-Aktivität in Zellen gemäß dem Verfahren untersucht, das beschrieben wird von D.R. Averett, J. Virol. Methods, 23, 1989, 263-276, und es wurde gefunden, daß es einen IC&sub5;&sub0;-Wert von 4,0 ± 1,4 uM hat (Mittelwert von 10 Bestimmungen).
    • b) Anti-HBV-Aktivität
  • Es wurde gezeigt, daß die menschliche HBV-Erzeuger-Zellinie von HepG2,2.2.15, beschrieben und charakterisiert von Sells et al., PNAS 84: 1005, 1987 und J. Virol. 62: 2836, 1988, viele Eigenschaften der chronisch mit HBV infizierten Leberzellen teilt. Sie ist infektiös, wie es durch die Fähigkeit zur Verursachung von Erkrankungen beim Schimpansen gezeigt wurde.
  • Um Verbindungen auf Anti-HBV-Aktivität zu untersuchen, wurden Einzelschichtenkulturen mit der Testverbindung (50-200 uM) für 10 Tage behandelt. Überstehendes Medium, das extrazelluläre virale DNA enthielt (Dane-Teilchen), wurde an den Tagen 3, 6 und 10 geerntet, mit Proteinase K (1 mg/ml) und Natriumdodecylsulfat (1%) behandelt und für 1 h bei 50ºC inkubiert. Die DNA wurde mit gleichen Volumina von Phenol, gefolgt von Chloroform extrahiert und dann durch Ammoniumacetat und Propanol ausgefällt. Die DNA-Ausfällung wurde aufgelöst und an Nitrocellulose unter Verwendung des Verfahrens von Schleicher und Schüll aufgefangen (S & S. 10 Optical Ave., Keene, NH 03431, Veröffentlichung #700, 1987) und behandelt, wie beschrieben von Southern, J. Mol. Biol., 98, 503, 1975. Die Zellen wurden geerntet, und die intrazelluläre DNA wurde nach Zell-Lyse mit Guanidinisothiocyanat erhalten. Die intrazelluläre DNA wurde in der gleichen Weise wie die extrazelluläre DNA behandelt. Nach Ausfällung durch Ammoniumacetat und Propanol wurde die intrazelluläre DNA-Ausfällung aufgelöst, durch Restriktionsendonuklease (HindIII) geschnitten, auf Agarosegel aufgetragen und dann wie von Southern beschrieben behandelt, um die Menge der vervielfältigten intermediären Formen zu bestimmen. Die antivirale Wirkung des Arzneistoffs wurde bestimmt, indem wenigstens eine 100- fach Reduktion der Menge der in das Kulturmedium extrudierten Dane-Teilchen und eine ähnliche Abnahme der intrazellulären vervielfältigten Zwischenstufen gemessen wurde.
  • (1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(N-cyclopropyl-N-methylamino)-9H-purin-9- yl]-2-cyclopenten-1-methanol wurde durch das obige Verfahren untersucht, und es wurde gefunden, daß es eine hochwirksame Anti-HBV-Aktivität von 100 uM besitzt.

Claims (20)

1. (1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol, im wesentlichen frei von dem entsprechenden anderen Enantiomer.
2. (1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(N-cyclopropyl-N-methylamino)-9H- purin-9yl]-2-cyclopenten-1-methanol, im wesentlichen frei von dem entsprechenden anderen Enantiomer.
3. Enantiomere Verbindung gemäss Anspruch 1 oder 2, die insoweit frei von dem entsprechenden anderen Enantiomer ist, dass weniger als 10 Gew.-% des entsprechenden anderen Enantiomeren vorhanden sind.
4. Enantiomere Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, die insoweit, frei von dem entsprechenden anderen Enantiomer ist, dass das entsprechende andere Enantiomer in weniger als 5 Gew.-% vorhanden ist.
5. (1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2- cyclopenten-1-methanol gemäss Anspruch 1, das frei von dem entsprechenden anderen Enantiomeren ist.
6. (1S,4R)-cis-4-[2-Amino-6-(N-cyclopropyl-N-methylamino)-9H- purin-9yl]-2-cyclopenten-1-methanol gemäss Anspruch 2, das frei von dem entsprechenden anderen Enantiomer ist.
7. Pharmazeutisch verträgliches Salz, pharmazeutisch verträglicher Ester oder pharmazeutisch verträgliches Salz eines solchen Esters einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Ester ausgewählt wird aus Carbonsäureestern, bei denen der Nicht-Carbonylrest der Estergruppe ausgewählt ist aus geradkettigen oder verzweigten C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-Alkoxy-C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-alkyl-, Ar-C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-alkyl-, Aryloxy-C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-alkyl- oder Arylgruppen; Sulfonsäureestern, ausgewählt aus C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;-Alkyl- oder Ar-C&sub1;&submin;&sub1;&sub8;- alkylsulfonyl; Aminosäureestern und Mono-, Di- oder Triphosphatestern.
8. Pharmazeutische Formulierung, umfassend eine Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Streckmittel.
9. Pharmazeutische Formulierung gemäss Anspruch 8, hergerichtet zur oralen Verabreichung.
10. Pharmazeutische Formulierung gemäss Anspruch 8, hergerichtet zur parenteralen Verabreichung.
11. Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in der medizinischen Therapie.
12. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung eines. Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von retroviralen Infektionen.
13. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe einer Human Immunodeficiency Virus (HIV)-Infektion.
14. Verwendung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prophylaxe einer Hepatitis B Virusinfektion.
15. Verwendung gemäss den Ansprüchen 12 bis 14, wobei das Medikament in Form einer Dosismenge im Bereich von 3,0 bis 120 mg pro kg Körpergewicht des Patienten pro Tag vorliegt.
16. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend:
A) Behandeln einer enantiomeren Verbindung mit der Formel (II):
(worin A eine Cyclopenten-1-methanol-4-ylgruppe in der (1S,4R)- Konfiguration und Z eine Vorläufergruppe für eine R-Gruppe, die eine Cyclopropylamino- oder N-Cyclo-N-methylaminogruppe darstellt, bedeuten) mit einem Mittel oder unter Bedingungen zur Umwandlung der Vorläufergruppe Z in die gewünschte R-Gruppe, oder
B) Umsetzen einer enantiomeren Verbindung mit der Formel (III):
(worin A und R wie oben definiert sind, R² Wasserstoff oder eine Formylgruppe und R³ eine Aminoschutzgruppe bedeuten) mit einem Mittel zur Bildung des Imidazolrings in der gewünschten Verbindung mit der Formel (I), und Entfernen der R³-Aminoschutzgruppe, oder
C) Umsetzen einer enantiomeren Verbindung mit der Formel (IV):
(worin A und R wie oben definiert sind und R³ eine Aminoschutzgruppe ist) mit einem Mittel zum Entfernen der R³-Aminoschutzgruppe, und wahlweise Durchführen einer oder beider der folgenden Umsetzungen in irgendeiner gewünschten Reihenfolge:
i) Wenn eine Verbindung gemäss Anspruch 1 oder 2 gebildet wird, Umwandeln der Verbindung in ein pharmazeutisch verträgliches Salz, einen pharmazeutisch verträglichen Ester oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz eines solchen Esters, oder
ii) wenn ein pharmazeutisch verträgliches Salz, ein pharmazeutisch verträglicher Ester oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz eines solchen Esters einer Verbindung gemäss Anspruch 1 oder 2 gebildet wird, Umwandeln des pharmazeutisch verträglichen Salzes, des pharmazeutisch verträglichen Esters oder des pharmazeutisch verträglichen Salzes eines solchen Esters in die Stammverbindung gemäss Anspruch 1 oder 2, oder in ein weiteres pharmazeutisch verträgliches Salz, einen weiteren pharmazeutisch verträglichen Ester oder ein weiteres pharmazeutisch verträgliches Salz eines solchen Esters, wobei der Ester wie in Anspruch 7 definiert ist.
17. Enantiomere Verbindung mit der Formel (IV):
(worin A und R wie in Anspruch 16 definiert sind und R³ eine C&sub1;&submin;&sub6;- Alkanoylgruppe ist).
18. Verbindung gemäss Anspruch 17, bei der es sich um (1R,4S)-cis- N-(Cyclopropylamino)-9-)4-(hydroxymethyl)-2-cyclopenten-1yl)-9H-purin-2- yl]isobutyramid, das im wesentlichen frei von dem entsprechenden (1S,4R) Enantiomeren ist, handelt
19. Enantiomere Verbindung mit der Formel (VI):
(worin A wie in Anspruch 16 definiert ist, Z eine Halogengruppe bedeutet und R³ eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoylgruppe ist).
20. Verbindung gemäss Anspruch 19, bei der es sich um (1S,4R)-cis- N-[6-Chloro-9-(4-(hydroxymethyl)-2-cyclopenten-1-yl)-9H-purin-2- yl]isobutyramid, das im wesentlichen frei von dem entsprechenden (1R,4S) Enantiomeren ist, handelt.
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