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Verfahren zur Gewinnung der einzelnen Bestandteile des herzwirksamen
Meerzwiebelglykosids Eingehende Untersuchungen über das herzwirksame Glykosid aus
der Meerzwiebel, so wie es beispielsweise nach den Verfahren der Patentschriften
446 782 und 448 536 erhalten wird, haben ergeben, daß es sich in zwei Komponenten
zerlegen läßt, die in der Droge nebeneinander vorkommen und bei der Gewinnung der
wirksamen Substanz einander so hartnäckig begleiten, daß die bisherigen Isolierungsmethoden
stets zu einem Gemisch führten, obschon die Komponenten einzeln sich in ihren physikalischen
und chemischen Eigenschaften deutlich voneinander unterscheiden lassen. In physiologischer
Hinsicht konnte bisher nur in bezug auf die Intensität der Wirkung auf das Herz,
nicht aber in qualitativer Hinsicht ein Unterschied zwischen den beiden Komponenten
festgestellt werden.
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In einer Arbeit von Ewins (Journ. of Pharmacology and exp.Therapeutics,
Bd. III [rgzz], S. 155) wird bereits vermutet, daß in der Meerzwiebelzweiwirksame
Substanzen nebeneinander vorkommen, doch werden diese von Ewins nicht als einheitliche
Stoffe charakterisiert. Nach der Art ihrer Isolierung und vor allem aus der geringen
Wirksamkeit wenigstens des einen der von Ewin s hergestellten Präparate geht hervor,
da.ß diese nur mehr oder weniger weitgehend zersetzte Produkte von natürlichem Glvkosid
darstellen können. Die Ewinschen Präparate zeigen denn auch gegenüber den nach dem
vorliegenden Verfahren gewonnenen Komponenten sowohl in der Darstellung wie in ihren
Eigenschaften so große Unterschiede, daß es sich bei Ewins auf keinen Fall um dieselben
Körper handeln kann wie im vorliegenden Verfahren, das zu bisher noch nicht beschriebenen
Substanzen führt.
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Das vorliegende Verfahren zur Trennung des natürlichen herzwirksamen
Meerzwiebelglykosids in zwei Komponenten beruht auf dem bisher noch unbekannten
Unterschied in der Löslichkeit der beiden Komponenten in Wasser und in wässerigen
Medien. Die schwerer lösliche Komponente sei mit a, die leichter lösliche
mit b
bezeichnet. Durch das Auffinden einer neuen Farbenreaktion des Scillaglykosids,
die weiter unten beschrieben werden soll, war es möglich geworden, das natürliche
Meerzwiebelglykosid in einzelne voneinander verschiedene Fraktionen zu zerlegen,
während die physiologische Wirksamkeit wegen ihrer Gleichartigkeit für beide Komponenten
zur Unterscheidung derselben nicht anwendbar gewesen wäre. Während die Komponente
a in Essigsäureanhydrid bei Zusatz von konzentrierter Schwefelsäure eine zunächst
karminrote, dann sofort eine smaragdgrüne Färbung zeigt, gibt die Komponente b unter
denselben Bedingungen eine rein blaue Farbe ohne das Auftreten einer anfänglichen
roten Phase. Da sich die beiden Komponenten, wie bereits erwähnt, in der Droge und
bei der Isolierung des Glykosids hartnäckig begleiten, so war es nicht vorauszusehen,
daß es auf so
einfache Weise, wie im vorliegenden Verfahren beschrieben,
gelingen würde, ca und b voneinander zu trennen. In Ausnutzung des aufgefundenen
Löslichkeitsunterschiedes der beiden Komponenten und unter Verwendung der Farbreaktionen
als Kontrolle ist es gelungen, innerhalb des Grundgedankens der Erfindung das Verfahren
durch verschiedene technische Maßnahmen und bis zu einem gewissen Grade auch ohne
Rücksicht auf den Reinheitsgrad des Ausgangspräparates durchzuführen. Es hat sich
z. B. gezeigt, daß der Unterschied in der Löslichkeit der Komponenten in Wassei
oder wässerigen Medien auch bestehen bleibt, wenn a und b in Form
von Tannoiden vorliegen, sogar dann, wenn diese wie in einem aus der Droge hergestellten
alkoholischen Rohextrakt mit einer großen Menge von Ballaststoffen begleitet werden.
Ob in der einzelnen Ausführungsform des Verfahrens die Komponententrennung durch
fraktionierte Auflösung in Wasser oder wässerigen Medien, wobei a ungelöst bleibt,
oder durch fraktionierte Fällung, z. B. unter Zusatz von Salzen, wobei a zuerst
ausfällt, oder durch fraktionierte Ausschüttelung der in Wasser schwerer löslichen
Komponente mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Essigester, wobei a zuerst
übergeht, oder durch fraktionierte Adsorption, z. B. an Tierkohle, erfolgt, die
Trennung der Komponenten geschieht in allen Fällen auf Grund der verschiedenen Löslichkeit
der beiden Komponenten, wobei b in der wässerigen Lösung bleibt. Die Komponente
b kann daraus auf verschiedene Weise, z. B. durch erschöpfendes Aussalzen oder Fällen
mit einem Gerbstoff oder durch Ausschütteln oder erschöpfende Adsorption aus der
eingeengten Lösung oder durch Einengen der b-Lösung zur Trockne und Herauslösen
des Glykosids aus dem Rückstand mit einem organischen Lösungsmittel, gewonnen werden.
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Wird die Komponententrennung mit den Tannoiden durchgeführt, so ist
vor der Isolierung der Komponenten noch eine Behandlung mit gerbstoffällenden Mitteln
in bekannter Weise durchzuführen.
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Die Trennung des_ Scillaglykosids in zwei Komponenten wird vollständiger,
die Komponenten werden reiner, wenn man die bei einer ersten Trennungsoperation
gewonnenen Fraktionen einer nochmaligen Trennung wiederum auf Grund der verschiedenen
Löslichkeit in wässerigen Medien, aber auf eine von der ersten abweichenden Art
durchführt. Doch ist eine solche Wiederholung für die letzte Reinigung der Komponente
a in der Regel nicht notwendig, da diese nach einer ersten Trennung schon z. B.
durch Umfällen und Kristallisation aus Methanol leicht absolut frei von b gewonnen
werden kann.
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Wie das Verfahren im einzelnen ausgeführt werden kann, geht am besten
aus den folgenden Beispielen hervor, die unter Benutzung der oben angeführtenVariationsmöglichkeiten
immer unter Ausnutzung des Löslichkeitsunterschieds der beiden Komponenten in wässerigen
Medien durch den Fachmann leicht vermehrt werden könnten.
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Die reine Komponente a (Scillaren a), die in der Regel
2/3 des natürlichen Gesamtglykosids der Meerzwiebel ausmacht, kristallisiert aus
97prozentigem Methanol in 4- und 6eckigen, länglichen, glashellen Tafeln, die unter
geeigneten Bedingungen bis zu 1o mm Länge anwachsen können. An der Luft verwittern
die Kristalle ziemlich rasch unter Abgabe von einem Kristalllösungsmittel, die aber
erst im Hochvakuum bei 76 ° vollständig wird und im ganzen 61/2% beträgt. Beim Erhitzen
auf höhere Temperatur beginnt Scillaren a bei i76° (korr.) zu sintern; bei i86°
treten Bläschen auf, bei 21o° Zersetzung. Das vom Kristallösungsmittel befreite
kristallisierte Scillaren a stellt ein weißes Pulver dar, das in Wasser und Chloroform
nur sehr schwer, in Äther praktisch unlöslich ist, sich auch in kaltem Methyl- und
Äthylalkohol ziemlich schwer und nur in der Wärme in diesen beiden Lösungsmitteln
leichter löst. In einer Mischung von 75 Vol.-Teilen Äthylalkohol und 25 Vol.-Teilen
Wasser zeigt eine 5 prozentige Lösung der Komponente a eine optische Drehung von
(a)D-78°. e Die Elementaranalyse ergab: i. 62,35% C, 7,69% H: o,1678 g gaben 03835
9 CO, und 0,1153 g H,0; 2. 62,22% C, 7,48% H: 4.136 mg gaben 9435 mg C02
und 2,765 mg H20.
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Berechnet für C"H"0": 62,39% C 757% H. Scillaxen a ist gegen hydrolytische
Agentien sehr empfindlich; eine teilweise Spaltung unter Abnahme der physiologischen
Wirksamkeit vollzieht sich schon beim Erwärmen einer wässerigen Lösung des Glykosids
auf 7o bis ioo °. Verdünnte Mineralsäure spaltet, am besten in wässerig-methylalkoholischer
Lösung, beim kurzen Erwärmen des Glykosids in ein in schönen Säulen auskristallisierendes
Aglykon (Scillaridin a) und ein Disaccharid, welch letzteres bei längerer Hydrolyse
in wässeriger 1prozentiger Schwefelsäure in i Mol. Glykose und i Mol. Rhamnose gespalten
wird. Die gesamte Hydrolyse vollzieht sich nach dem Schema
| C3sHs2013-r C24Hso03 -I-' CrH120s + CGH1205 |
Scillaren
a Scillaridin
a Glykose Rhamnose Scillaridin a kristallisiert
aus 95prozentigem Alkohol in farblosen, glänzenden Prismen, die kein Kristallösungsmittel
enthalten. Es ist in Wasser und Äther unlöslich, in Chloroform, Pyridin und Eisessig
mäßig bis schwer löslich, sehr schwer in kaltem Alkohol und Methylalkohol;
in
der Siedehitze ist zur Lösung etwa die 500fache Menge 96prozentiger Alkohol notwendig.
Beim Erhitzen wird es bei 2z5° (korr.) gelb, bei 224° sintert es, und bei 229 bis
23o° entsteht eine rote Schmelze. Wird Scillaridin a im Hochvakuum auf z80 bis Zoo
° erhitzt, so sublimiert ein großer Teil unter Bildung von schönen Kristallen. Scillaridin
a verliert bei der Sublimation 1 Mol. Wasser und geht dabei über in C24H2g02.
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Die Elementaranalyse von Scillaridin a ergab: I. 78,75% C> 8240/0
H: 4,348 mg gaben 12,555 mg C02 und 3,200 mg H20; 2. 78,7x % C, 8,33% H :
4792 mg gaben 13,830 mg C02 und 3,565 mg H20.
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Berechnet für C24H"03: C = 78,6q.0/0, H = 8,260/0. Molekulargewicht
in Phenol ergab 36o, berechnet 366.
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Sublimat des Scillaridins a: Die Elementaranalyse ergab 1. 82,69%
C, 8,o60/0 H: 4,390 mg gaben 13,310 mg C02 und 3,16o mg H20; 2. 82,9o0/0 C, 8,07%
H: 4,533 mg gaben 13,78o mg C02 und 3,267 mg H20.
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Berechnet für C24H2802: C = 82,700/a, H @ 8,1o0/,. Molekulargewicht
in Phenol ergab 353, berechnet 348.
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Farbreaktion: Sowohl Scillaren a als auch das Aglykon Scillaridin
a und der aus letzterem durch Sublimation im Hochvakuum erhaltene Körper geben alle
in qualitativer Hinsicht ein und dieselbe Farbreaktion mit Essigsäureanhydrid und
konz. H2S04. Wenn beispielsweise einige Milligramm der Substanz mit einem Gemisch
von iooTeilen Essigsäureanhydrid und 2 Teilen konz. HIS04 übergossen werden, so
wird die Substanz aufgelöst unter Bildung einer anfangs karminroten Farbe, die aber
sehr rasch in Smaragdgrün übergeht, das längere Zeit bestehen bleibt.
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Das krist. Scillaren a hat eine physiologische Wirksamkeit von etwa
105o Froschdosen (F. D. nach Houghton-Straub) pro 1 mg; das Aglykon Scillaridin
a ist dagegen fast unwirksam.
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Die Komponente b (Scillaren b), deren Kristallisation
bis jetzt nicht gelang, ist in reinem Zustand ein weißes Pulver, das im Gegensatz
zu a in Wasser und in den Alkoholen sehr leicht löslich ist; schwer löslich ist
b in Chloroform, Äther und Essigester, wenn auch hierin etwas leichter als a. Im
Gegensatz zu a dreht b die Ebene des polarisierten Lichtes nach rechts.
b ist gegen Hydrolyse beständiger als a, verdünnte Mineralsäuren verseifen
es unter den Bedingungen, wie sie bei a angegeben sind, viel langsamer; es wird
dabei ein ebenfalls gut kristallisierendes Aglykon (Scillaridin b), aber in nur
sehr geringer Ausbeute gewonnen.
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Scillaridin b kann aus Methylalkohol umkristallisiert werden und scheidet
sich daraus in farblosen, glänzenden spießförmigen Nadeln ab, die kein Kristallösungsmittel
enthalten. Es löst sich nicht in Wasser und Äther; in den übrigen Lösungsmitteln
ist es etwas leichter löslich als das Scillaridin a.
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Die Elementaranalyse ergab x. 73,=3% C, 7,42% H: 4,716 mg gaben I2,645
mg C02 und 1127 mg H20; 2. 73,=2% C, 7,43 H: 4856 mg gaben 13,020 mg C02 und 3,225
mg H20.
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Berechnet für C"H"03: C = 73,0%> H = 7.36%. Molekulargewicht in Phenol
ergab: 244, berechnet 246. Scillaridin b sintert bei 225' und schmilzt bei
228 bis 229° zu einer roten Flüssigkeit; sublimieren läßt es sich nicht.
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Farbreaktion: Sowohl das Glykosid wie das Aglykon b geben ein und
dieselbe Farbreaktion. Werden einige Milligramm mit einer Mischung von Zoo Teilen
Essigsäureanhydrid und 2 Teilen konz. HIS04 übergossen, so löst sich die Substanz
unter Bildung einer tiefblau gefärbten Lösung. Eine rote Anfangsphase tritt nicht
auf (zum Unterschied der Komponente a). Die blaue Farbe bleibt längere Zeit bestehen.
Die physiologische Wirksamkeit von Scillaren b beträgt pro 1 mg Substanz 15oobis
160o Froschdosen (F. D. nach Houghton-Straub).
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Beispiel I 30g natürliches Reinglykosid, wie es z. B nach Patent
446782 erhalten wird, werden in Zoo ccm Methanol gelöst und in looo ccm Wasser unter
Rühren eingetragen. Hierbei fällt die Hauptmenge der schwer löslichen Komponente
a als weißer Niederschlag aus, der sich beim Abtreiben des Methanols im Vakuum bei
niedriger Temperatur noch vermehrt. Die Ausscheidung wird abgenutscht und scharf
abgepreßt und stellt die Komponente a in sehr reiner Form dar. Für die Kristallisation
löst man das Präparat in 50 ccm Methylalkohol, woraus es sich sehr bald wieder
in Kristallen ausscheidet; ein Zeichen für die hohe Reinheit des Ausgangspräparates.
Tritt die Kristallisation auch nach einigem Stehen im Eisschrank nicht ein, was
bei weniger gutem Ausgangsmaterial der Fall sein kann, so wird die konz. methylalkoholische
Lösung nochmals in etwa die fünffache Menge Wasser gegossen, einige Zeit in der
Kälte stehengelassen, abfiltriert und wie oben mit wenig Methylalkohol zur Kristallisation
angesetzt, die in der Regel bald einsetzt und durch Kratzen oder Impfen beschleunigt
werden kann, Stehen im Eisschrank vervollständigt die Kristallisation.
Das
wässerige Filtrat enthält nun die leicht lösliche Komponente b mit einem nur noch
geringen Anteil der Komponente a und sehr oft noch mit einer kleinen gerbstoffähnlichen
Verunreinigung, die sich in dieser Fraktion anreicherte, in Lösung. Die Entfernung
dieser Begleitstoffe gelingt durch Zusatz von 25 ccm gesättigter Kochsalzlösung
je 11 wässeriger Lösung und von etwas wasserunlöslichem Gerbstoffällungsmittel,
z. B. 5 g frisch gefälltem Bleihydroxyd, Durchschütteln und Abfiltrieren. Gegebenenfalls
ist noch mit etwas Gerbstofffällungsmittel nachzubehandeln, bis dieses weiß bleibt.
Eine letzte organische Verunreinigung entfernt man durch Ausschütteln der b-Glykosidlösung
mit etwas Äther. Dann wird diese im Vakuum bei niedriger Temperatur zur Trockne
verdampft. Aus dem Trockenrückstand wird die Komponente b z. B. mit wenig absolutem
Alkohol herausgelöst, worauf man im Vakuum zur Trockne eindampft. Der Trockenrückstand
stellt die reine Glykosidkomponente b dar mit den in der Beschreibung genannten
Eigenschaften.
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Beispiel 2 Das Ausgangsmaterial für die Komponententrennung in diesem
Beispiel wurde so gewonnen, daß man sorgfältig getrocknete und gepulverte glykosidreiche
Meerzwiebel mit Alkohol erschöpfend extrahierte, den Extrakt im Vakuum bei niedriger
Temperatur zur Trockne verdampfte, in Wasser wieder auflöste und unter Zusatz von
etwa ioo g NaCl je Liter mit Essigester erschöpfend ausschüttelte. Das beim Verdampfen
des Essigesters im Vakuum in der Kälte zur Trockne hinterbleibende Produkt stellt
eine Mischung der Komponenten a und b
in Form ihrer Tannoide dar. Davon
werden 40 g in einer Reibschale mit wenig Wasser zunächst zu einem homogenen Brei
verrieben und dieser Brei unter weiterer Wasserzugabe und Reiben verdünnt, wobei
die schwer lösliche Komponente a gewöhnlich flockig ausfällt. Sich bildende Klumpen
werden durch Kneten mit etwas Wasser ebenfalls in den körnigen Zustand übergeführt.
Im ganzen wird i 1 Wasser verwendet. Durch Zusatz von 25 ccm einer gesättigten Kochsalzlösung
wird die Ausscheidung der Komponente a vervollständigt, die man nach kurzem Stehen
abfiltriert, trocknet und beispielsweise so in das Glykosid überführt, daß man das
Tannoid a in einer Mischung von Wasser und Alkohol i: i oder Wasser und Methanol
i : i auflöst, die Lösung mit unlöslichem Gerbstoffällungsmittel, z. B. mit Bleihydroxyd,
behandelt und das Lösungsmittel im Vakuum bei niedriger Temperatur verjagt, wobei
das Seillaren a ausfällt. Wie in Beispiel i angegeben, kann es nun in den kristallisierten
Zustand übergeführt werden. Die nach dem Abtrennen der Tannbidkomponente a erhaltene
wässerige Lösung der Komponente b reagiert zumeist schwach sauer und wird nach vorsichtiger
Neutralisation mit z. B. verdünnter Natronlauge mit kleinen Portionen eines unlöslichen
Gerbstoffällungsmittels, z. B. Bleihydroxyd, so oft geschüttelt, bis letzteres weiß
bleibt. Aus der zuletzt abfiltrierten Lösung entfernt man geringe Mengen Verunreinigungen
von saurer Natur durch Ansäuern mit i ccm 2n-H,S04 je Liter und durch erschöpfendes
Ausschütteln mit etwas Chloroform und dampft die wieder neutral gemachte wässerige
Lösung des Glykosids b nun im Vakuum sorgfältig zur Trockne ein. Absoluter Alkohol
löst aus dem Rückstand das Glykosid b in reiner Form heraus; nach dem Verjagen des
Lösungsmittels im Vakuum bei niedriger Temperatur hinterbleibt es mit den Eigenschaften,
wie sie oben beschrieben wurden.
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Beispiel 3 i5o g eines Rohextraktpräparates aus Bulbus Scillae (wie
in Beispiel 2 durch Extraktion von sorgfältig getrocknetem und gepulvertem Bulbus
Scillae mit Alkohol erhalten) werden in q.5o ccm Methanol gelöst und filtriert.
In das Filtrat werden unter Umrühren q. bis q.1/2 1 Chloroform eingetragen, wobei
sich die Hauptmenge der Verunreinigungen ausscheidet. Nach dem Stehen über Nacht
wird die Flüssigkeit abgegossen, durch Filtration geklärt und im Vakuum zur Trockne
verdampft.
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50 g des Trockenrückstandes werden mit wenig Wasser zu einem
homogenen Brei angerieben, welcher mit Wasser bis zu i ooo ccm verdünnt wird. Hierbei
erfolgt eine erste Trennung in die Komponenten a und b. Um die Abscheidung der Komponente
a zu begünstigen und die Filtration zu erleichtern, wird vorteilhaft etwas Salz
zugesetzt, beispielsweise 25 ccm einer gesättigten Kochsalzlösung. Nach kurzem Stehen
wird abgenutscht, mit wenig Lösungsmittel nachgewaschen und scharf abgesaugt. Der
noch feuchte Rückstand wird so lange mit Äther ausgewaschen, bis sich der Äther
nicht mehr färbt. Dann wird er in 50o ccm Methylalkohol gelöst, mit der gleichen
Menge Wasser verdünnt und mit etwa 25o g frisch gefälltem Bleihydroxyd 2 Stunden
geschüttelt, vom Blei abfiltriert, mit Methanolwasser x : i nachgewaschen und im
Vakuum zur Trockne verdampft. Der Trockenrückstand (Seillaren a) ist nach zweimaligem
Umfällen aus Methanolwasser so rein, daß das Glykosid aus Methanol wie in Beispiel
i kristallisiert werden kann.
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Das wässerige Filtrat mit der Komponente b wird wie in den Beispielen
i und 2 mit einem unlöslichen Gerbstoffällungsmittel behandelt. Saure Beimengungen
entfernt man, wie in Beispiel ?, angegeben, durch Zusatz von etwas
Schwefelsäure
und durch wiederholtes Ausschütteln mit Chloroform. Die wieder neutral gemachte
Lösung wird alsdann mit Ammon-Sulfat gesättigt und daraus das Glykosid b mit Essigester
erschöpfend ausgeschüttelt. Die Essigesterlösung wird im Vakuum bei tiefer Temperatur
bis fast zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit trockenem Äther übergossen,
digeriert und abfiltriert. Die Eigenschaften des alsdann getrockneten Präparates
stimmen mit den oben angegebenen überein.