DE4321904A1 - Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen - Google Patents
Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von NucleinsäuregemischenInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäure
gemischen gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1, die Verwendung
des Verfahrens zur Reinigung von Nucleinsäurefragmenten, die
Modifizierungsreaktionen unterzogen worden sind, eine
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, eine wäßrige
Lösung, die im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar ist
sowie die Verwendung dieser Lösung.
Die Adsorption von Nucleinsäuren an Glas- oder Silicagelpar
tikeln in Gegenwart von chaotropen Salzen ist bekannt (Vogel
stein, B. and Gillespie, D. (1979) Preparative and analytical
purification of DNA from agarose., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76: 615-619). Gemäß dieser Methode wird DNA aus Agaros
egelen sowie RNA- und DNA-Präparate aus verschiedenen Extrak
ten unter Verwendung von hohen Konzentrationen chaotroper
Salze in Natriumiodid, Natriumperchlorat oder Guanidin
thiocyanat isoliert und gereinigt (Boom, R. et al. (1990)
Rapid and simple method for purification of nucleic acids,
J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 und Yamado, O. et al.
(1990) A new method for extracting DNA or RNA for polymerase
chain reaction. J. Viro. Methods 27, 203-210). Zwar sind
die genauen pysikalischen Vorgänge, die zu einer Adsorption
der Nucleinsäuren in Gegenwart chaotroper Reagenzien an
mineralische Träger führen nicht im Detail geklärt, jedoch
geht man davon aus, daß die Ursache für die Adsorption in
der Störung übergeordneter Strukturen des wäßrigen Milieus
zu suchen ist. Dabei wird die in Lösung befindliche Nuclein
säure an der Oberfläche der Glas- bzw. Silicalgelpartikel
adsorbiert oder denaturiert. Die Adsorption ist in Anwesen
heit von hohen Konzentrationen chaotroper Salze fast quanti
tativ. Die Elution der adsorbierten Nucleinsäuren erfolgt
in Anwesenheit von Puffern mit geringer Ionenstärke (Salz
konzentration). Durch die Verfahren des Standes der Technik
werden Nucleinsäurefragmente einer Größe von 200 bis 3000
Basenpaaren (bp) ermöglicht. Es war bislang jedoch nicht
möglich, kurze einzel- oder doppelsträngige Nucleinsäurefrag
mente (100 bp und kleiner) von sehr kurzen (20 bis 40 Nucleo
tide) einzelsträngigen Oligonucleotiden (Primern) quantitativ
zu trennen.
Diese Nucleinsäuregemische entstehen typischerweise als
Amplifikationsprodukte zum Beispiel gemäß der Polymerase
kettenreaktion (PCR). Die aus dieser Reaktion entstehenden
Produkte werden häufig anschließend molekularbiologisch
analysiert, indem die üblichen Techniken wie DNA-Sequen
zierung, DNA-Hybridisierung, Klonierung, Restriktion und
Transformation durchgeführt werden. Damit lassen sich
analytische Parameter wie Aussagen über Genmutationen für
die genetische Beratung oder Erregernachweise in der medi
zinischen Diagnostik (HIV) gewinnen. Um das Potential dieser
Diagnostikverfahren nutzen zu können, ist eine quantitative
Trennung bzw. Reinigung dieser häufig recht kleinen DNA-
Fragmente (100 Basenpaare) sehr wichtig.
Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Reinigungsmethoden
basieren auf der Ultrafiltration, der High Pressure Liquid
Chromatoaranhy (HPLC) oder der Extraktion von Nucleinsäure
fragmenten aus Agarosegelen in Anwesenheit chaotroper Salze
durch Niederschlagen auf Glas- oder Silicagelpartikel. Diese
Methoden sind jedoch nur mit niedriger Effizienz zur Trennung
von Nucleinsäuregemischen bestehend beispielsweise aus einem
kurzen doppelsträngigen DNA-Fragment (100 bp) und einem
kleineren einzelsträngigen Oligonucleotid (zum Beispiel 39
mer) geeignet.
Das technische Problem der vorliegenden Erfindung besteht
darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem es möglich ist,
die oben genannten Nachteile des Standes der Technik zu
vermeiden. Gelöst wird das Problem durch ein Verfahren zur
chromatographischen Reinigung und Trennung von
Nucleinsäuregemischen gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1.
Die darauf folgenden Unteransprüche 2 bis 8 betreffen
bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Ver
fahrens.
Der Anspruch 9 betrifft eine Verwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Reinigung von Nucleinsäurefragmenten nach
Modifizierungsreaktionen. Der Anspruch 11 betrifft eine Vor
richtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
und Anspruch 12 betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Vorrichtung. Der Anspruch 14 betrifft eine
wäßrige Lösung verwendbar im erfindungsgemäßen Verfahren und
Anspruch 16 betrifft eine Zusammenstellung der Komponenten
gemäß Anspruch 15 und Anspruch 11.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die an sich bekannte
Eigenschaft von Nucleinsäuren aus, in Gegenwart chaotroper
Salze, Salzlösungen hoher Ionenstärke (hoher Kon
zentrationen), Reagenzien wie z. B. Harnstoff oder von
Mischungen dieser Substanzen auf mineralischen Träger
niederzuschlagen und durch Einwirkung von Lösungen geringer
Ionenstärke (Salzkonzentration) zu eluieren. So schlägt die
PCT/EP 92/02775 der Anmelderin vor, ein Nucleinsäuregemisch
zunächst in einem Medium niederer Ionenstärke auf einem
Anionenaustauschermaterial zu adsorbieren, danach die
Nucleinsäure mit einem Puffer höherer Ionenstärke zu
desorbieren und danach im Puffer mit dieser höheren
Ionenstärke in Gegenwart von niederen Alkoholen und/oder
Polyethylenglycol und/oder Trichloressigsäure (TCA) die
Nucleinsäuren auf einem mineralischen Trägermaterial zu
adsorbieren. Die Nucleinsäuren werden dann vorzugsweise mit
Wasser oder einer Pufferlösung geringer Ionenstärke eluiert.
Es hat sich nun herausgestellt, daß zur Trennung von Nuclein
säuren die vorherige Reinigung an Anionenaustauscher
materialien unterbleiben kann. Überraschenderweise läßt sich
auch durch die Adsorption von Nucleinsäuren in Gegenwart
chaotroper Salze hoher Konzentration und Desorption der
Nucleinsäuren mit Lösungen geringer Ionenstärke eine hervor
ragende Fraktionierung eines Nucleinsäuregemisches erzielen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es mithin er
möglicht, in einem Arbeitsschritt durch Adsorption der zu
trennenden Nucleinsäuren und Elution in effizienter Weise
interessierende Nucleinsäurefraktionen zu erhalten, ohne
vorherige Reinigungsschritte.
Sollen nucleinsäurehaltige Proben als Quellen der zu reini
genden und isolierenden Nucleinsäuren dienen, werden diese
Quellen in an sich bekannter Weise aufgeschlossen, beispiels
weise durch Detergenzbehandlung oder mechanische Einflüsse
wie Ultraschall oder Zerkleinern. Dabei kann die zur Aufnahme
der Nucleinsäuren verwendete Lösung bereits chaotrope Salze
in hoher Konzentration enthalten. Nach Entfernung eventuell
vorhandener grober Zellbestandteile durch Zentrifugation oder
Filtration (WO 93/11218 und WO 93/11211) wird die Lösung dann
mit einem mineralischen Trägermaterial in Kontakt gebracht,
um aus der Lösung mit hoher Ionenstärke chaotroper Salze die
Nucleinsäuren auf dem mineralischen Träger zu adsorbieren.
Eine Abwandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht
darin, den Aufschluß der Nucleinsäuren direkt in dem
Puffersystem, das zur Adsorption eingesetzt wird, durch
zuführen. Dann wird eine besonders günstige Nucleinsäure
verteilung gewinnbar.
Üblicherweise werden Nucleinsäuren aus eukaryontischen
und/oder prokaryontischen Zellen (darunter auch Protozoen
und Pilze) und/oder aus Viren gewonnen. Dabei werden die
Zellen und/oder Viren beispielsweise unter stark de
naturierenden und gegebenenfalls reduzierenden Bedingungen
aufgeschlossen (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, S.,
1982, Molecular Clonin Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
University Press, Cold Spring Harbor).
Weit verbreitet ist der Aufschluß der Zellen mit Detergenzien
als denaturierende Reagenzien und die Verwendung von be
stimmten Enzymen zum Abbau der Proteinstrukturen und nuclein
säurespaltenden Enzymen. So werden beispielsweise Natrium
dodecylsulfat (SDS) und EDTA als denaturierende Agenzien
verwendet und Proteinase K zum Abbau von Proteinen. Das
Ergebnis dieses Aufschlußverfahrens ist meistens eine
hochviskose gallertartige Struktur, aus der die Nucleinsäuren
mittels Phenolextraktion isoliert werden. Die Nucleinsäuren
bleiben dabei in großer Länge erhalten und werden nach
Dialyse und Präzipitation aus der wäßrigen Phase entfernt.
Dieses Aufschlußverfahren ist gegenüber Nicht-Nucleinsäure-
Strukturen so aggressiv, daß dem Verfahren auch Gewebestücke
unterworfen werden können.
Wegen der arbeitsintensiven Technik mit mehrfachem Wechsel
der Reaktionsgefäße ist diese Methode jedoch für große
Probenaufkommen und Routinepräparationen ungünstig. Dieses
Verfahren ist zwar automatisierbar, jedoch bewältigt eine
handelsübliche Apparatur gegenwärtig etwa 8 Proben gleich
zeitig in vier Stunden (Applied Biosystems A 371). Das
Verfahren ist somit teuer und eignet sich nicht für die
Durchschleusung großer Probenserien. Weiterhin ist nach
teilig, daß die Folgereaktionen, wie enzymatische Amplifi
kation, infolge der großen Längen der isolierten Nuclein
säuren gestört sind. Darüber hinaus sind die anfallenden
Lösungen hochviskos und schwer handhabbar. Insbesondere DNA
sehr großer Länge ist eher störend, da die mit dem Verfahren
gemäß dem Stand der Technik gewonnenen Nucleinsäuren ge
sondert zerkleinert werden müssen, um weiterverarbeitet
werden zu können.
Der Aufschluß von eukaryontischen und/oder prokaryontischen
Zellen und/oder Viren in alkalischem Milieu in Gegenwart von
Detergenzien, ist technisch zwar einfach, liefert jedoch auch
Nucleinsäuren mit großer Länge, die wie oben geschildert von
Nachteil sind.
An die Rohpräparation der Nucleinsäuren schließen sich Folge
reaktionen an. Diese Folgereaktionen erfordern eine bestimmte
Qualität der Nucleinsäuren. So müssen diese weitestgehend
unversehrt sein, die Ausbeute der Präparation muß hoch und
reproduzierbar sein, außerdem müssen die Nucleinsäuren in
hoher Reinheit, frei von Proteinen und Zellmetaboliten
vorliegen. Der Präparationsweg muß einfach und wirtschaftlich
sein und die Möglichkeit zur Automation bieten. Die Prä
paration der Nucleinsäuren muß ohne die Gefahr von Kreuz
kontamination anderer Proben möglich sein, insbesondere wenn
enzymatische Amplifikationsreaktionen, wie Polymerase Chain
Reaction (PCR) (Saiki, r., Gelfand, D.H., Stoffel, S.,
Scharf, s.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. &
Ehrlich, H.A. (1988), Science 239, 487-491) und Ligase
Chain Reaction (LCR) (EP-A-8 83 11 741.8), Anwendung finden.
Für diese Folgereaktionen ist es wünschenswert, die Nuclein
säuren in nicht zu großer Kettenlänge zu erhalten, die Zellen
möglichst quantitativ aufzuschließen und im übrigen die oben
genannten Nachteile der im Stand der Technik bekannten
Aufschlußverfahren zu vermeiden.
Es ist mithin wünschenswert, daß ein Verfahren die Isolierung
und Konzentrierung von Nucleinsäuren aus intakten eukaryon
tischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren oder
aus Körperflüssigkeiten ermöglicht. Insbesondere soll die
dabei anfallende Nucleinsäure sich durch nicht zu große
Kettenlängen auszeichnen, in wenigen Schritten isolierbar
sein und direkt den erforderlichen Folgereaktionen unter
worfen werden können.
Die weiter oben angegebene Modifikation des erfindungsgemäßen
Verfahrens die dies ermöglicht, besteht darin, daß die
Quellen der Nucleinsäuren wie eukaryontische und/oder
prokaryontische Zellen und/oder Viren lysiert werden.
Der Aufschluß nucleinsäurehaltiger Quellen, wie eukaryon
tische und/oder prokaryontische Zellen und/oder Viren, kann
dabei vorzugsweise durch physikalische oder chemische
Einwirkung erfolgen. Dabei kann die Lyse entweder mechanisch
wie mit Ultraschall oder durch osmotischen Schock oder
chemisch mittels Detergenzien und/oder chaotropen Agenzien
und/oder organischen Lösungsmitteln (z. B. Phenol, Chloroform,
Ether) oder alkalischem Aufschluß erreicht werden.
Diese Verfahrensweise führt zur Präparation von Nucleinsäuren
mit hoher Reinheit und erlaubt es, eine qualitativ und
quantitativ reproduzierbare Analytik durchzuführen,
insbesondere in Kombination mit enzymatischen Verfahren zur
Amplifikation von Nucleinsäuren. Es hat sich gezeigt, daß
Aufschlußmethoden mit Detergenzien und/oder chaotropen
Agenzien, konzentrierten Salzlösungen, Reagenzien wie
Harnstoff, Mischungen dieser Substanzen und/oder organischen
Lösungsmitteln oder physikalische Aufschlußmethoden, wie
Erhitzen einer Probe, die Folgeanwendungen erleichtert. Man
erhält bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum
Beispiel kürzere zelluläre DNA (< 50 kb) beziehungsweise
Gesamtnucleinsäuren aus Zellen und/oder Viren und/oder
Körperflüssigkeiten. Die Reinigungsmethode (d. h. die Be
dingungen der Bindung und Elution der Nucleinsäuren) führt
zu einer Fragmentierung der Nucleinsäuren.
Die Kombination aus chaotropen Agenzien hoher Ionenstärke
und hydrophoben organischen oder anorganischen Polymeren
und/oder Alkoholen und/oder Trichloressigsäure (TCA) im Ad
sorptionspuffer gewährleistet, daß die Nucleinsäuren im
Gegensatz zu herkömmlichen Reinigungsverfahren nach der Lyse
quantitativ und hochspezifisch an der Oberfläche des minera
lischen Trägermaterials wie Quarzfasern fixiert werden und
so vor weiterführenden Angriffen der Nucleasen geschützt
sind, während kontaminierende Bestandteile des Lysates nicht
binden. In diesem fixierten Zustand der Nucleinsäuren können
restliche kontaminierende Bestandteile leicht ausgewaschen
werden, gefolgt von der Elution der sauberen Nucleinsäure
in einem kleinen Volumen. Man erhält so reproduzierbare
Kettenlängen von durchschnittlich 20 bis 40 kb. Weniger als
10% sind kürzer als 10 kb unter den Aufschlußbedingungen,
wie sie in den Beispielen 7 bis 9 beschrieben werden. Dies
stellt eine optimale Längenverteilung für eine anschließende
enzymatische Nucleinsäureamplifikation dar.
Die spezielle Kombination von Salzen, insbesondere chaotropen
Agenzien, und Alkoholen ermöglicht es erstmals, Nucleinsäuren
eines breiten Kettenlängenspektrums (10-100 000 Basenpaare)
gleichzeitig zu isolieren und zu reinigen.
Die wäßrige Adsorptionslösung hoher Salzkonzentration enthält
1 bis 50 Vol.-% aliphatischen Alkohols einer Kettenlänge von
1 bis 5 C-Atomen oder Polyethylenglykol.
Als mineralische Träger kommen poröse oder nicht poröse
Materialien auf Basis von Metalloxiden und Metallmischoxiden
in Frage, wie solche aus Silicagel, Materialien, die über
wiegend aus Glas bestehen, Aluminiumoxid, Zeolithe, Titan
dioxid, Zirkondioxid.
Gegebenenfalls kann das mineralische Trägermaterial mit den
daran adsorbierten Nucleinsäuren mit einer Lösung gewaschen
werden, die aufgrund eines relativ hohen Alkoholgehaltes eine
Desorption der Nucleinsäuren verhindert.
Danach werden die adsorbierten Nucleinsäuren mit einem Puffer
geringer Salzkonzentration (Ionenstärke) eluiert und die
erhaltenen Nucleinsäuren oder Nucleinsäurefraktionen ge
sammelt.
Als chaotrope Salze kommen Natriumperchlorat, Guanidin
hydrochlorid (GuHCl), Guanidinisothiocyanat (GTC), Kalium
iodid in Konzentrationen von 1 bis 8 M in Betracht. Nutzbar
sind ebenfalls konzentrierte Salzlösungen < 1 M NaCl, KCl,
LiCl etc., Reagenzien wie beispielsweise Harnstoff (< 1 M)
und Kombinationen dieser Bestandteile. Die in der Lösung der
chaotropen Salze vorhandenen niederen Alkohole sind Methanol,
Ethanol, Isopropanol, Butanol und Pentanol in Mengen von 1
bis 50%, insofern sie in diesen Bereichen mit Wasser
mischbar sind. Die vorzugsweise verwendbaren Ethylenglykole
weisen Molekulargewichte von 1000 bis 100 000, insbesondere
von 6000 bis 8000 auf. Das Polyethylenglykol kann dem
Puffer hoher Ionenstärke in Mengen von 1 bis 30% zugesetzt
sein.
Die Partikelgröße der mineralischen Trägermaterialien beträgt
vorzugsweise 0,1 µm bis 1000 µm. Werden poröse mineralische
Träger verwendet wie beispielsweise poröses Silicagel,
poröses Glas, poröses Aluminiumoxid, Zeolithe weisen die
Poren vorzugsweise eine Porengröße von 2 bis 1000 nm auf.
Das Trägermaterial kann beispielsweise in Form loser
Schüttungen vorliegen und mit den die zu trennenden und
reinigenden Nucleinsäuren enthaltenden Lösungen in Kontakt
gebracht werden.
Vorzugsweise sind jedoch die porösen und nicht porösen
Trägermaterialien als Filterschichten ausgebildet und in
einem Hohlkörper mit Ein- und Auslaßöffnung angeordnet. Die
Filterschichten bestehen entweder aus gerichteten (gewebten)
oder ungerichteten Fasern aus Glas, Quarz, Keramik oder
anderen Materialien wie Mineralien oder aus einer Membran,
in der Silicagel angeordnet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in hervorragender Weise
geeignet, Nucleinsäuregemische zu trennen, insbesondere auch
kurzkettige Nucleinsäuren, die sich in den Kettenlängen nur
geringfügig unterscheiden. So lassen sich beispielsweise DNA-
Fragmente einer Größe von beispielsweise 100 bp von kleineren
einzelsträngigen Oligonucleotiden zum Beispiel einem 39 mer
trennen. Dabei wird die DNA-Ausbeute dann um 60 bis 70%
gesteigert, verglichen mit anderen konventionellen Reini
gungsmethoden, wie Ultrafiltration, HPLC oder Verwendung
chaotroper Salze allein.
Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem der
Aufschluß der Nucleinsäuren enthaltenden Quellen im Aufnahme-
(Adsorptions-)puffer erfolgt, wird eine Nucleinsäure
präparation mit bestimmten Längenspektrum der Nucleinsäure
möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, Nucleinsäure
gemische jeglicher Herkunft zu bearbeiten. So lassen sich
Nucleinsäuren aus biologischen Quellen wie Geweben jeder Art,
Körperflüssigkeiten wie Blut, Faeces nach entsprechender
Probenvorbereitung, die jedenfalls eine Aufnahme der Probe
in einer Lösung hoher Salzkonzentration, vorzugsweise hoher
Konzentration an chaotropen Ionen umfaßt, gewinnen. Auch
Nucleinsäuren, die durch chemische Reaktionen entstanden
sind, wie solche, die durch Polymerasekettenreaktion (PCR)
erhalten wurden oder Plasmid-DNA, genomische DNA und RNA
und/oder Nucleinsäuren, die aus Mikroorganismen stammen,
lassen sich erfindungsgemäß trennen und reinigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ebenfalls geeignet,
sogenannte Plasmid-DNA-Minipräparationen aus Escherichia Coli
für die anschließende Klonierung oder Sequenzierung zu
verwenden; ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße
Verfahren zur Isolierung von DNA und/oder RNA aus Vollblut,
Plasma, Serum, Geweben, Zellkultur, Bakterien, insbesondere
Mycobakterium tuberlosis, Viren wie Cytomegalie-Virus
(Nucleinsäure DNA) aus RNA-Viren wie HIV, Hepatitis B,
Hepatitis C, Hepatitis-δ. Nucleinsäuren im Sinne des er
findungsgemäßen sind auch Oligonucleotide. Die Nucleinsäuren
können desweiteren aus Sequenzierreaktionen oder anderen
vergleichbaren Reaktionen stammen. Die Präparation von DNA
oder RNA aus Vollblut ist inbesondere geeignet zur an
schließenden HIA-Typisierung. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist insbesondere geeignet zur Isolierung von Nucleinsäuren
aus Mycobakterium tuberkulosis. Hierbei müssen recht
drastische Aufschlußmethoden eingehalten werden, wobei
konventionelle Isolierungstechniken nur unbefriedigende
Resultate liefern.
Eine im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise zu ver
wendende Vorrichtung ist ein insbesondere zylindrischer
Hohlkörper mit einer Ein- und Auslaßöffnung. In der Nähe der
Auslaßöffnung, in Fließrichtung der Lösung durch den
Hohlkörper gesehen, ist das mineralische Trägermaterial
angeordnet, an welchem die Nucleinsäuren zu adsorbiert
werden. Eine Einrichtung, die in einer bevorzugten Aus
führungsform aus zwei übereinander angeordneten, einen
Zwischenraum bildenden Polyethylenfritte besteht, fixiert
das Trägermaterial, welches sich im Zwischenraum zwischen
den Polyethylenfritten befindet, in dem Lumen des Hohl
körpers. Die Einrichtung zur Befestigung des Trägermaterials
kann auch eine selbsttragende Membran sein, in der das
Trägermaterial eingebettet ist. Die Befestigung des Träger
materials bzw. der Einrichtungen, die das Trägermaterial
fixieren, kann durch Reibungs- oder Spannungskräfte, wie sie
beispielsweise durch Einklemmen dieser Einrichtungen in dem
Hohlkörper entstehen, bewirkt werden und/oder durch eine
Fixierung der Einrichtungen mit einem Spannring erfolgen.
Die Porengröße der Einrichtung, vorzugsweise Polyethylen-
oder Polypropylenfritten, muß dabei groß genug sein, um die
Bestandteile des Lysates verstopfungsfrei hindurchfließen
zu lassen. Vorzugsweise haben die Einrichtungen eine
Porengröße von 5 bis 200 µm. Diese Vorrichtung erlaubt
erstmals die einfache, schnelle und reproduzierbare
Isolierung von Nucleinsäuren auch aus hochviskosen Lysaten,
die sehr viel Protein enthalten (z. B. Blutlysate, welche
einen sehr hohen Hämoglobingehalt aufweisen).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das
mineralische Trägermaterial eine netzartige Membran aus
Silicagel-, Glas- oder Quarzfasern, mit einer Porengröße
< 0,5 µm, an die die freigesetzten Nucleinsäuren adsorbiert
werden.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform stellt eine
Vorrichtung dar, bei der das mineralische Trägermaterial ein
partikelförmiges anorganisches Polymeres wie Kieselgel oder
Quarzgel mit einer Partikelgröße von 15 bis 25 µm ist.
Der Hohlkörper kann zum Beispiel ein handelsübliches Röhrchen
sein. Zwischen den zwei eng eingepreßten Einrichtungen, zum
Beispiel Polyethylenfritten mit einer Porengröße von 50 bis
200 µm, befindet sich eine oder mehrere Lagen einer Membran
mit 0,1 bis 1 µm großen Poren, welche aus Silica-, Glas- oder
Quarzfasern oder Kieselgelen besteht. Die Membran weist eine
Dicke von ca. 0,2 bis 1,0 mm, insbesondere 0,6 mm auf.
Die Kapazität des Membranmaterials ist etwa 20 bis 100 µg
DNA. Durch Übereinanderlegen entsprechender Membranen läßt
sich selbstverständlich die Kapazität für DNA erhöhen. Bei
geringer mechanischer Belastung ist auch ein randständiges
Verschweißen oder Verkleben der Membran denkbar, wodurch die
stabilisierende Wirkung der Einrichtungen entfallen kann,
so daß die Membran den Hohlkörper ohne die Einrichtungen
verschließt. Dabei kann die Membran durch das Aufsetzen eines
Spannringes im Hohlkörper fixiert werden.
Es ist ebenfalls möglich, mit dem beschriebenen Kieselgel,
das zwischen 2 Polyethylen-Fritten mit einer Porengröße von
35 µm angeordnet ist, kleine Säulen zu füllen. Vorzugsweise
wird die obere Einrichtung mit größeren Poren (100-200 µm)
gewählt. Die Säulen werden vorzugsweise mit ca. 70 mg
Silicagel entsprechend 3 mm Füllhöhe beschickt.
Bevorzugt ist auch die Anwendung des oben beschriebenen
Verfahrens in Strips mit je 8 parallelen Präparations
möglichkeiten, im Mikrotitrationsplattenformat (96 Prä
parationsmöglichkeiten fast gleichzeitig) und/oder in
Kombination mit einem Filtrationsschritt und/oder einem
Entsalzungsschritt. (Siehe Patentanmeldungen P 41 27 276.5,
P 41 39 664.2 des gleichen Anmelders).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung wird
eine 0,5 bis 1,5 mm dicke Polyethylenfritte mit einer
Porosität von ca. 10 µm in eine Zentrifugen-Chromato
graphiesäule in Form eines im wesentlichen zylindrischen
Hohlkörpers eingeklemmt. Über diese Fritte ist eine etwa
doppelt so dicke Schicht aus Silicagel einer Partikelgröße
von etwa 10 bis 15 µm und einer Porosität von 40 bis 120 Å
und mit einer zweiten Fritte, die von gleicher Art sein kann
wie die erste Fritte, verschlossen. Vorzugsweise kann die
Silicagelschicht durch Druck zwischen den Fritten komprimiert
werden.
Eine andere Ausführungsform der Chromatographiesäule weist
als Trägermaterial Glasfaserbruchstücke mit einer Länge von
10 bis 300 µm zwischen zwei Polyethylenfritten auf, die eine
Porosität von ca. 50 µm besitzen. Als Trägermaterial kommen
auch Glasfaserpapiere, Quarzfaserpapiere, Glasfasergewebe
und andere mineralische Papiere und Gewebe in Betracht.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung
weist eine Membran, in die Silicagelpartikel eingebettet
sind, in der Nähe der Auslaßöffnung auf. In diesem Fall kann
die vorzugsweise selbsttragende Membran insbesondere mit
einem Spannring fixiert werden. Als Silicagelmembran kommt
in vorteilhafterweise eine Empore-SI-Membran der Firma Baker
in Betracht. Ebenfalls, insbesondere mit einem Spannring,
läßt sich eine Silicalgelmembran bestehend aus Silicagel und
porösem PVC im Lumen des zylindrischen Hohlkörpers
befestigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird die beschriebene Vorrichtung beispielsweise
in einer ihrer Ausführungsformen mit der Lösung des zu
trennenden Nucleinsäuregemisches beschickt. Die Lösung wird
dann durch Anlegen eines Unterdrucks oder Zentrifugation oder
gleichwirkende Maßnahme sowie Kombinationen davon durch den
mineralischen Träger passiert. Dabei werden die Nucleinsäuren
an dem Trägermaterial adsorbiert, sofern die Lösung eine hohe
Ionenstärke (Salzkonzentration) aufweist.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher
erläutert.
Das Plasmid pUC 18 enthaltende E. coli Zellen aus einer 3
ml HB 101 Kultur werden abzentrifugiert und in 0,25 ml Puffer
P1 (10 mM Tris-HCl, pH 8, 100 µg/ml RNAseA) resuspendiert
und durch die Zugabe von 0,25 ml Puffer P2 (0,2 M NaOH, 2%
SDS) lysiert. Die Probe wird durch die Zugabe von 0,35 ml
Puffer N3 (4,2 M Guanidinhydrochlorid, 0,9 M K-Acetat, pH
4,8) neutralisiert und gleichzeitig auf eine Endkonzentration
von 1,75 M GuHCl eingestellt. Die lysierte Probe wird 10 min.
bei 13 000 rpm in einer Eppendorf-Minizentrifuge abzen
trifugiert, um die Zellbruchstücke und das ausgefallene SDS
zu entfernen. Der Überstand mit der Plasmid-DNA wird sofort
auf eine Zentrifugen-Chromatographiesäule pipettiert. Die
Zentrifugen-Chromatographiesäule wird in einem 2 ml Zentri
fugenröhrchen zentrifugiert und durch nochmaliges Zentri
fugieren von 0,5 ml PB Puffer (5 M Guanidinhydrochlorid, 30%
Isopropanol) gewaschen, um Verunreinigungen und Proteine
zu entfernen. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird 1×
durch Durchzentrifugieren von 80% Ethanol/Wasser salzfrei
gewaschen und anschließend 30 bis 60 sec. zentrifugiert, um
das überschüssige Ethanol komplett zu entfernen. Zur Elution
werden 0,05-0,2 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5)
durch die Zentrifugen-Chromatographiesäule in ein 1,5-ml-
Zentrifugenröhrchen zentrifugiert. Die Plasmid-DNA liegt
jetzt in konzentrierter Form in einer Lösung mit sehr
niedriger Salzkonzentration vor. Die Ausbeute beträgt 15 µg
bis 20 µg Plasmid-DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von
1,75.
Nach Beispiel 1 wird ein Zell-Lysat einer 5 ml Plasmid pUC
18/XL 1 Blue Kultur hergestellt und durch eine Zentrifugen-
Chromatographiesäule, welche eine Silicalgelschüttung
enthält, zentrifugiert und gewaschen. Die Plasmid-DNA wird
mit 0,1 ml auf 80°C erwärmtem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH
8,5, 1 mM EDTA) eluiert. Die Ausbeute beträgt 15-20 µg
Plasmid DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,7.
Nach Beispiel 1 wird ein Zell-Lysat einer 5 ml Plasmid
pBR322/XL 1 Blue Kultur hergestellt und durch eine Zentri
fugen-Chromatographiesäule mit einer Glas- oder Quarzfaser
membran zentrifugiert und gewaschen. Die Plasmid-DNA wird
mit 0,1 ml auf 80°C erwärmten TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH
8,5, 1mM EDTA) eluiert. Die Ausbeute beträgt 5-10 µg
Plasmid DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,7.
Eine 100 µl PCR-Amplifikationsreaktion wird mit 500 µl Puffer
PB (5 M GuHCl, 30% Isopropanol) vermischt, wobei ein vor
heriges Abt rennen des den Reaktionsansatz überschichtenden
Paraffinöls nicht nötig ist. Dieses Gemisch wird auf eine
Zentrifugen-Chromatographiesäule, welche eine Silicagel
membran enthält, pipettiert und in einem 1,5 ml Zentrifugen
röhrchen zentrifugiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule
wird durch Behandeln mit 80% EtOH/Wasser annähernd salzfrei
gewaschen. Zur Elution werden 50 µl Elutionspuffer (10 mM
Tris, pH 8,5) durch die Zentrifugen-Chromatographiesäule in
ein anderes Zentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das so
gereinigte PCR Produkt ist frei von Primern, dNTPs, Poly
merase und Salzen und kann beispielsweise direkt für eine
Sequenzierungsreaktion in einem ABI-Sequencer unter Ver
wendung des "Cyle-Sequencing" Protokolls eingesetzt werden.
1 µg DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease behandelt.
Diese DNA Restriktionsreaktion wird nach Beispiel 4 mit 500 µl
PB Puffer vermischt und es wird weiter wie in Beispiel
4 verfahren. Die nach Elution erhaltene DNA ist frei von
Restriktionsendonucleasen und Salzen, das 260/280 Verhältnis
beträgt 1,8.
1 µg DNA werden mit Hilfe des Oligolabellings, in Anwesenheit
von Gamma P32-ATP radioaktiv markiert. Der Reaktionsansatz
wird wie in Beispiel 4 behandelt. Hierdurch wird die
markierte DNA von nicht eingebauten dNTPs, Gamma-P32 ATP,
Salzen und Klenow-Polymerase gereinigt und kann direkt für
die Hybridisierungsreaktion eingesetzt werden.
Gesamt-Nucleinsäure-Präparation aus Blut: 200 µl Citrat-,
Heparin- oder EDTA-Blut werden in einem 1,5 ml PPN-Röhrchen
mit 200 µl einer Lösung aus einem 4-8 M chaotropen Salz
(Guanidinhydrochlorid (GuHCl), Guanidinisothiocyanat (GTC),
Kaliumjodid), evtl. einem organischen Lösungsmittel (Phenol,
Chloroform, Ether) und einem 5-100%igen Detergens (NP4O;
Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) versetzt. Anschließend
werden 200-1000 µg einer Protease zugefügt und es wird für
10 min. bei 70°C oder für längere Zeit bei niedrigeren
Temperaruren (z. B. 30 min bei Raumtemperatur) inkubiert. In
diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse
aller eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen
und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser
Pathogene) und Denaturierung und enzymatischer Abbau von
Proteinen (gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren
gebundenen Proteine). Durch Zugabe von 210 µl eines 95-100%igen
Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol,
PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole)
werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen
erzeugt und das so eingestellte Lysat wird auf die
Vorrichtung aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird
das Lysat sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet,
wobei die Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder
Gelpartikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl
pH 7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol,
n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz-
oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden
die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen,
Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem
Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destiliertem
(deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser
Elutionsverfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA
direkt ohne weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in
Folgereaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden
können. Die Präparation von Nucleinsäuren aus anderen
Körperflüssigkeiten wie z. B. Sperma, Sputum, Urin, Stuhl,
Schweiß, Speichel, Nasenschleim, Serum, Plasma, Liquor etc.
ist auch möglich.
Diese einfache Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren weist
ein hohes Automatisierungspotential insbesondere in Ver
bindung mit den Anmeldungsgegenständen der DE-A 41 27 276.5,
WO 93/11218, WO 93/11211 und DE-A 41 39 664.2 auf.
1-50 µl Citrat-, Heparin- oder EDTA-Blut, oder gefrorenes
und wieder aufgetautes Blut, oder renaturiertes Blut aus
getrockneten Spuren in Textilgewebe, werden in einem 1,5 ml
PPN-Röhrchen mit 1-50 µl einer Lösung aus einem 4-8 M
chaotropen Salz (Guanidinnydrochlorid, Guanidinisothiocyanat,
Kaliumjodid), evtl. einem organischen Lösungsmittel (Phenol,
Chloroform, Ether) und einem 1-100%igen Detergenz (NP4O;
Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) versetzt. Anschließend
werden 1-200 µg einer Protease zugefügt und es wird für
1 min. bei 70°C oder für längere Zeit bei niedrigeren
Temperaturen (z. B. 10 min bei Raumtemperatur) inkubiert.
In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse
aller eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen
und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser
Pathogene) und Denaturierung und enzymatischer Abbau von
Proteinen (gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren
gebundenen Proteine). Durch Zugabe von 1/2 Volumen eines 95-100%igen
Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol,
Isopropanol, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige
Alkohole) oder organischen Polymeren (PEG) werden für
Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt und
das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung
aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird das Lysat
sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet, wobei die
Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder Gel
partikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH
7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-
Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz-
oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden
die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen,
Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem
Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destilliertem
(deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser Elutions
verfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA direkt ohne
weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in
Folgereaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden
kann.
Dieses Verfahren ist auch zur Präparation von Nucleinsäuren
aus kleinsten Mengen anderer Körperflüssigkeiten (Sperma,
Sputum, Urin, Stuhl, Schweiß, Speichel, Nasenschleim, Serum,
Plasma, Liquor etc.) oder getrockneten Spuren derselben
geeignet.
Diese einfache Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren weist
ein hohes Automatisierungspotential insbesondere in Ver
bindung mit den Anmeldungsgegenständen der DE-A 41 27 276.5,
WO 93/11218, WO 93/11211 und DE-A 41 39 664.2 auf.
100 µg bis 10 mg eines Gewebes werden in einem PPN-Röhrchen
mit einer Lösung aus einem 4-8 M chaotropen Salz (Guanidin
hydrochlorid, Guanidinisothiocyanat, Kaliumjodid), evtl.
einem organischen Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Ether)
und einem 5-100%igen Detergens (NP4O; Tween 20, Triton
X-100, SDS, CTAB) versetzt und mit Hilfe eines kommerziell
erhältlichen Homogenisators oder durch Mörsern in flüssigem
Stickstoff homogenisiert. Anschließend werden 100-1000 µg
einer Protease zugefügt und es wird für 10-20 min. bei 70°C
oder für längere Zeit bei niedrigeren Temperaruren (z. B. 30 -
60 min bei Raumtemperatur) inkubiert. In diesem Schritt
erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryon
tischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren
(gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und
Denaturierung und enzymatischer Abbau von Proteinen
(gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen
Proteine). Durch Zugabe von ½ Volumen eines 95-100%igen
Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG,
sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole)
werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen
erzeugt und das so eingestellte Lysat wird auf die
Vorrichtung aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird
das Lysat sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet,
wobei die Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder
Gelpartikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl
pH 7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol,
n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz-
oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden
die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen,
Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem
Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destilliertem
(deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser Elutions
verfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA direkt ohne
weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in Folge
reaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden können.
Diese einfache Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren
funktioniert reproduzierbar aus allen Geweben, u. a. auch aus
Tumoren und weist ein hohes Automatisierungspotential,
insbesondere in Verbindung mit den Anmeldungsgegenständen
der DE-A-41 27 276.5, WO 93/11218, Wo 93/11211 und
DE-A-41 39 664.2 des gleichen Anmelders auf.
Ein DNA-Fragment wird in einem Agarosegel (TAE oder TBE 0,5-2%
aufgetrennt. Das zu isolierende DNA-Fragment wird aus dem
Gel ausgeschnitten und in einem 1,5 ml Eppendorf-Gefäß mit
300 µl QX1 Puffer (7 M NaPO₄, 10 mM NaAc, pH 5,3) vermischt.
Nach 10 minütiger Inkubation bei 50°C hat sich die Agarose
aufgelöst. Diese Lösung wird auf eine Zentrifugen-Chromato
graphiesäule nach Beispiel 1 gegeben und durchzentrifugiert.
Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird nun mittels
Zentrifugieren von 80% Ethanol/Wasser durch die Säule
salzfrei gewaschen und anschließend 1 min. zentrifugiert,
um überschüssiges Ethanol komplett zu entfernen. Zur Elution
werden 0,05 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf
die Chromatographiesäule gegeben und durchzentrifugiert.
Das zu isolierende DNA-Fragment wird aus dem PAA-Gel ausge
schnitten und in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt, zer
kleinert und mit 500 µl PAA-Elutionspuffer (500 mM NH₄Ac, 100
mM MgAc₂, 1 mM EDTA, 0-1% SDS) vermischt. Das Gemisch wird
30 min. bei 50°C inkubiert und anschließend mit 300 µl QX1
Puffer versetzt und über eine Zentrifugen-Chromatographie
säule zentrifugiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule
wird nun mit 80% Ethanol/Wasser salzfrei gewaschen und
anschließend 1 min. zentrifugiert, um überschüssiges Ethanol
komplett zu entfernen. Zur Elution werden 0,1 ml Elutions
puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Chromatographiesäule
gegeben und durchzentrifugiert.
Eine 100 µl PCR-Amplifikationsreaktion wird mit 500 µl Puffer
QXB (5 M GuHCl) vermischt, wobei ein vorheriges Abtrennen
des den Reaktionsansatz überschichtenden Paraffinöls nicht
nötig ist. Zur weiteren Aufreinigung wird wie in Beispiel
4 verfahren.
Ein 100 µl Amplifikationsansatz einer asymmetrischen PCR wird
mit 500 µl PB-Puffer (5 M GuHC, 30% Isopropanol) vermischt.
Zur weiteren Aufreinigung wird wie in Beispiel 4 verfahren.
Zur Elution werden 0,05 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl,
pH 8,5) auf die Chromatographiesäule gegeben und durch
zentrifugiert. Das Eluat enthält ca. 90% des einzelsträngigen
PCR-Produktes, welches direkt für die zweite Amplifikation
oder zum Sequenzieren eingesetzt werden kann.
Bis zu 50 mg eines Gewebes oder bis zu 10⁶ Zellen werden in
400 µl einer gepufferten chaotropen Lösung (4 M GTC, 25 mM
Natriumcitrat pH 7,5, 2% 2-Mercaptoethanol) - gegebenenfalls
versetzt mit einem 5-100%igem Detergens (NP40, Tween 20,
Triton-X-100, SDS, CTAB, Sarkosyl) - homogenisiert. In diesem
Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller
eukaryontischer und/oder prokaryontischen Zellen und/oder
Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene)
und Denaturierung von Proteinen (insbesondere Ribonucleasen;
gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen
Proteine). Durch Zugabe von 260 µl eines 100%igen Alkohols
(Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol) werden für
Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt. Das
so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen.
Anschließend werden Verunreinigungen wie Proteine, Häm,
Heparin, Metabolite und Polysaccharide mit 700 µl eines
Waschpuffers bestehend aus 1 M GTC, 25 mM Tris/HCl, pH 7,5,
40% eines Alkoholes (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Iso
propanol) sowie 700 µl eines Waschpuffers bestehend aus 10
mM Tris/HCl, pH 7,5, 80% eines Alkoholes (Methanol, Ethanol,
n-Propanol, Isopropanol) ausgewaschen. Die Nucleinsäuren
werden entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris, pH
7,5) oder destilliertem (deionisiertem) Wasser eluiert.
Claims (16)
1. Verfahren zur chromatographischen Reinigung und
Trennung von Nucleinsäuregemischen durch Adsorption der
zu trennenden und reinigenden Nucleinsäuren aus einer
Lösung, die eine hohe Salzkonzentration (Ionenstärke)
und/oder eine hohe Alkoholkonzentration aufweist an
einen Träger, gefolgt von einer Desorption von dem
Träger mittels einer Lösung mit geringerer Salzkonzen
tration (Ionenstärke), dadurch gekennzeichnet, daß das
Nucleinsäuregemisch
- - an einem porösen oder nicht porösen mineralischen Träger aus Metalloxiden und/oder Metallmisch oxiden, Silicalgel, Materialien, die überwiegend aus Glas bestehen, Aluminiumoxid, Zeolithe, Titandioxid, Zirkondioxid aus einer wäßrigen Adsorptionslösung mit hoher Salzkonzentration (Ionenstärke) und mit 1 bis 50 Vol.-% ali phatischen Alkohols einer Kettenlänge von C₁-C₅ und/oder Polyethylenglykol (PEG) und/oder hydro phobe, anorganische und/oder organische Polymere und/oder Trichloressigsäure (TCA) adsorbiert wird,
- - gegebenenfalls mit einer Waschlösung gewaschen und danach
- - mit einer Lösung geringerer Salzkonzentration (Ionenstärke) eluiert wird und die erhaltene Nucleinsäure oder Nucleinsäurefraktion gesammelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Salze in der
Adsorptionslösung chaotrope Salze verwendet werden wie
Natriumperchlorat, Guanidinhydrochlorid, Guanidin
isothiocyanat, Natriumjodid in Konzentrationen von 1
bis 8 M.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die
Ionenstärken der Salzlösungen mit 1 bis 10 M Lithium
chlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumacetat,
Reagenzien wie z. B. Harnstoff und/oder Mischungen
davon eingestellt wird.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei die Partikelgröße des mineralischen Träger
materials 0,1 µm bis 1000 µm beträgt.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4,
wobei verwendete poröse mineralische Trägermaterialien
eine Porengröße von 2 bis 1000 nm aufweisen.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5,
wobei die porösen oder nicht porösen Trägermaterialien
in Form von losen Schüttungen vorliegen.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5,
wobei die porösen oder nicht porösen Trägermaterialien
als Filterschichten ausgebildet sind in Form von
Filterschichten aus Glas, Quarz oder Keramik und/oder
einer Membran, in der Silicagel angeordnet ist und/oder
als Partikel oder Fasern aus mineralischen Trägern und
Geweben aus Quarz oder Glaswolle vorliegen.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7,
wobei die zu trennenden und zu reinigenden Nuclein
säuren aus biologischen Quellen wie Zellkulturen,
Geweben jeder Art, Körperflüssigkeiten wie Blut,
Plasma, Serum, Urin, Faeces, Mikroorganismen wie
Bakterien, insbesondere Mycobakteriumtuberkulosis,
Viren wie Cytomegalie-Virus, HIV, Hepatitis B,
Hepatitis C, Hepatitis-8-Virus, stammen, die Nuclein
säuren durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erhaltene
Produkte, Plasmid-DNA, genomische DNA, RNA, Nuclein
säuren aus Mikroorganismen wie Plasmid-DNA, chromo
somale DNA oder RNA und/oder Nucleinsäuren aus Sequenz
analysen sind.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8,
wobei die Nucleinsäuren nach Fraktionierung zu weniger
als 10% kürzer als 10 kb sind.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9,
wobei die Nucleinsäuren Oligonucleotide sind.
11. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der
Ansprüche 1 bis 10 zur Reinigung und Trennung von
Nucleinsäurefragmenten nach Modifizierungsreaktionen.
12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem
der Ansprüche 1 bis 10 aus einem Hohlkörper mit Ein-
und Auslaßöffnung, wobei im Lumen des Hohlkörpers eine
Einrichtung angeordnet ist, die das Trägermaterial zur
Adsorption der zu trennenden Nucleinsäuren fixiert,
dadurch gekennzeichnet, daß
- - die Einrichtung zwei übereinander angeordnete, einen Zwischenraum ausbildenden Polyethlenfritten sind, wobei das Trägermaterial zwischen den Polyethylenfritten angeordnet ist oder
- - die Einrichtung eine selbsttragende Membran ist, in welcher das Trägermaterial eingebettet ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Befestigung der
Einrichtungen im Lumen des Hohlkörpers durch Reibungs
und/oder Spannungskräfte und/oder durch Fixierung mit
einem Spannring erfolgt.
14. Wäßrige Lösung enthaltend Salze hoher Konzentrationen
und 1-50 Vol-%, C₁-C₅ Alkohole und/oder PEG
und/oder hydrophobe anorganische und/oder organische
Polymere.
15. Verwendung einer Lösung nach Anspruch 13 als Puffer
lösung zur Bindung von Nucleinsäuren an mineralische
Träger aus Nucleinsäuren enthaltenden Gemischen.
16. Zusammenstellungen in Kitform enthaltend eine wäßrige
Lösung nach Anspruch 14 sowie Vorrichtungen nach einem
der Ansprüche 12 und/oder 13.
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4321904A DE4321904B4 (de) | 1993-07-01 | 1993-07-01 | Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen |
US08/392,882 US6383393B1 (en) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | Chromatographic purification and separation process for mixtures of nucleic acids |
DE59409712T DE59409712D1 (de) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | Verfahren zur chromatographischen reinigung und trennung von nucleinsäuregemischen |
CA002142910A CA2142910C (en) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | A method for the purification and separation of nucleic acid mixtures by chromatography |
DK94922869T DK0658164T3 (da) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | Fremgangsmåde til chromatografisk oprensning og adskillelse af nukleinsyreblandinger |
PCT/EP1994/002056 WO1995001359A1 (de) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | Verfahren zur chromatographischen reinigung und trennung von nucleinsäuregemischen |
EP94922869A EP0658164B1 (de) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | Verfahren zur chromatographischen reinigung und trennung von nucleinsäuregemischen |
PT94922869T PT658164E (pt) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | Processo para a purificacao cromatografica e separacao de misturas de acidos nucleicos |
ES94922869T ES2155477T3 (es) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | Purificacion cromatografica y procedimiento de separacion de acidos nucleicos. |
JP7503247A JPH08501321A (ja) | 1993-07-01 | 1994-06-24 | クロマトグラフィーによる核酸混合物の精製分離法 |
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ES (1) | ES2155477T3 (de) |
PT (1) | PT658164E (de) |
WO (1) | WO1995001359A1 (de) |
Cited By (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995021178A1 (de) * | 1994-02-07 | 1995-08-10 | Qiagen Gmbh | Steigerung der transfektionseffizienz von nucleinsäuren durch die verwendung von isopropanol in wässrigen lösungen |
DE19600362A1 (de) * | 1996-01-08 | 1997-07-10 | Wolf Prof Dr Bertling | Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung von Nucleinsäure-Molekülen |
WO1998005767A1 (en) * | 1996-08-06 | 1998-02-12 | Vical Incorporated | Purification of plasmid dna by peg-precipitation and column chromatography |
WO1999040098A1 (de) * | 1998-02-04 | 1999-08-12 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren |
WO2001059098A2 (de) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Eppendorf Ag | Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren |
WO2002074954A1 (de) * | 2001-03-21 | 2002-09-26 | Eppendorf Ag | Verfahren zur isolierung von plasmiden aus suspendierten bakterien- oder hefezellen |
DE102007013099A1 (de) | 2007-03-14 | 2008-09-18 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren und Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's |
EP2189530A2 (de) * | 2008-11-19 | 2010-05-26 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Verfahren zur Trennung genomischer DNA und Plasmid-DNA voneinander und Kit dafür |
DE102010031401A1 (de) | 2010-07-15 | 2012-01-19 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Viren sowie Zellen und zur nachfolgenden Nukleinsäureisolierung |
WO2012062753A1 (de) * | 2010-11-09 | 2012-05-18 | Qiagen Gmbh | Verfahren und vorrichtung zur isolierung und reinigung von doppelsträngigen nukleinsäuren |
EP1960520B1 (de) * | 2005-11-28 | 2014-02-12 | AJ Innuscreen GmbH | Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren aus beliebigen ausgangsmaterialien |
WO2014071965A1 (en) | 2012-11-12 | 2014-05-15 | Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel | Nucleic-acid binding compounds |
EP2285816B1 (de) | 2008-05-30 | 2015-04-01 | Qiagen GmbH | Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren |
DE102015216558A1 (de) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen |
WO2016169678A1 (de) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Aj Innuscreen Gmbh | Vorrichtung und verfahren zur extraktion von nukleinsäuren |
DE102015211394A1 (de) | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Aj Innuscreen Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren |
DE102015211393A1 (de) | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Aj Innuscreen Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Extraktion von Nukleinsäuren |
KR20170128392A (ko) * | 2015-03-20 | 2017-11-22 | 도레이 카부시키가이샤 | 핵산의 회수 방법 |
WO2018167138A1 (de) | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen |
EP2215103B1 (de) * | 2007-10-31 | 2019-08-07 | Akonni Biosystems | Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren |
EP3514233A4 (de) * | 2016-09-14 | 2020-05-06 | Toray Industries, Inc. | Verfahren zur rückgewinnung von zellfreier dna |
WO2023089180A1 (de) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Ist Innuscreen Gmbh | Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren |
Families Citing this family (140)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995034569A1 (de) * | 1994-06-14 | 1995-12-21 | Invitek Gmbh | Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien |
DE19506887C2 (de) * | 1995-02-17 | 1999-10-14 | Invitek Gmbh | Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und hochreiner Total RNS |
WO1997003348A1 (en) * | 1995-07-13 | 1997-01-30 | Immunological Associates Of Denver | Self-contained device integrating nucleic acid extraction, amplification and detection |
DE19717717B4 (de) * | 1997-04-18 | 2007-08-02 | InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH | Verfahren zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren der Lunge |
US5817798A (en) * | 1997-09-17 | 1998-10-06 | Abbott Laboratories | Rapid RNA isolation procedure in the presence of a transition metal ion |
DE19746874A1 (de) * | 1997-10-23 | 1999-04-29 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren an hydrophoben Oberflächen - insbesondere unter Verwendung hydrophober Membranen |
JP4025399B2 (ja) * | 1997-10-28 | 2007-12-19 | 株式会社日立製作所 | 核酸の回収方法及び装置 |
US6111096A (en) * | 1997-10-31 | 2000-08-29 | Bbi Bioseq, Inc. | Nucleic acid isolation and purification |
US7670768B1 (en) | 1998-02-02 | 2010-03-02 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Processes for isolating, amplifying and characterizing DNA |
EP1053353A1 (de) * | 1998-02-02 | 2000-11-22 | Gentra Systems Inc. | Elutionsreagentien, verfahren und reagentiensätze zur isolierung von dns |
JPH11266864A (ja) * | 1998-03-19 | 1999-10-05 | Hitachi Ltd | 核酸の精製方法および精製用装置 |
EP0969090A1 (de) * | 1998-05-27 | 2000-01-05 | QIAGEN GmbH | Schnelles und einfaches Verfahren zur Isolierung von zirkulären Nucleinsäuren |
JP2000166556A (ja) * | 1998-12-10 | 2000-06-20 | Hitachi Ltd | 核酸の回収方法及び装置 |
GB2346615B (en) * | 1998-11-17 | 2003-10-15 | Cambridge Molecular Tech | Isolating nucleic acid |
US7790865B1 (en) | 1999-02-02 | 2010-09-07 | Qiagen North American Holdings, Inc | Eluting reagents, methods and kits for isolating DNA |
US6383783B1 (en) * | 1999-09-21 | 2002-05-07 | 3M Innovative Properties Company | Nucleic acid isolation by adhering to hydrophobic solid phase and removing with nonionic surfactant |
US6936414B2 (en) * | 1999-12-22 | 2005-08-30 | Abbott Laboratories | Nucleic acid isolation method and kit |
WO2001057247A2 (de) | 2000-02-04 | 2001-08-09 | Qiagen Gmbh | Nukleinsäure-isolierung aus stuhlproben und anderen biologischen materialien, die reich an inhibitoren sind |
US7183002B2 (en) | 2000-03-24 | 2007-02-27 | Qiagen, Gmbh | Porous ferro- or ferrimagnetic glass particles for isolating molecules |
DE10033991A1 (de) * | 2000-07-12 | 2002-01-24 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren |
US20030228600A1 (en) * | 2000-07-14 | 2003-12-11 | Eppendorf 5 Prime, Inc. | DNA isolation method and kit |
JP3752417B2 (ja) * | 2000-09-07 | 2006-03-08 | 株式会社日立製作所 | 核酸の精製方法および精製装置 |
WO2002078847A1 (fr) * | 2001-03-28 | 2002-10-10 | Hitachi, Ltd. | Instrument et procede permettant de recuperer de l'acide nucleique |
JP3602071B2 (ja) | 2001-06-05 | 2004-12-15 | 株式会社日立製作所 | 核酸の精製分離方法 |
US20050032105A1 (en) | 2001-10-12 | 2005-02-10 | Bair Robert Jackson | Compositions and methods for using a solid support to purify DNA |
US7148343B2 (en) | 2001-10-12 | 2006-12-12 | Gentra Systems, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA |
US7893228B2 (en) | 2001-10-12 | 2011-02-22 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA |
JP2002191351A (ja) * | 2001-10-19 | 2002-07-09 | Hitachi Ltd | 核酸の精製用装置および核酸捕捉用チップ |
DE10153957A1 (de) * | 2001-11-06 | 2003-05-22 | Quiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren |
GB0127803D0 (en) * | 2001-11-20 | 2002-01-09 | Glaxo Group Ltd | Processing nucleic acid |
AU2002359522A1 (en) | 2001-11-28 | 2003-06-10 | Applera Corporation | Compositions and methods of selective nucleic acid isolation |
CN100382870C (zh) | 2001-12-28 | 2008-04-23 | 株式会社日立高新技术 | 提取装置与化学分析装置及化学分析方法 |
US6770565B2 (en) * | 2002-01-08 | 2004-08-03 | Applied Materials Inc. | System for planarizing metal conductive layers |
GB0207975D0 (en) * | 2002-04-05 | 2002-05-15 | Genovision As | Isolating nucleic acid |
US20050115903A1 (en) * | 2002-04-09 | 2005-06-02 | Genesystems | Method and apparatus for extracting nucleic acids from a complex mixture |
JP4095886B2 (ja) * | 2002-05-08 | 2008-06-04 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 化学分析装置及び遺伝子診断装置 |
US7384602B2 (en) | 2002-05-08 | 2008-06-10 | Hitachi High-Technologies Corporation | Chemical analysis apparatus and genetic diagnostic apparatus |
US7482116B2 (en) | 2002-06-07 | 2009-01-27 | Dna Genotek Inc. | Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum |
US7122640B2 (en) * | 2002-06-10 | 2006-10-17 | Phynexus, Inc. | Open channel solid phase extraction systems and methods |
JP2004028872A (ja) * | 2002-06-27 | 2004-01-29 | Dna Chip Research Inc | 基盤スポット用溶液及びスポット方法 |
US7998705B2 (en) | 2002-08-06 | 2011-08-16 | FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U.S.A., Inc | Increased dynamic binding capacity in ion exchange chromatography by addition of polyethylene glycol |
WO2004013162A2 (en) * | 2002-08-06 | 2004-02-12 | Akzo Nobel Nv. | Increased dynamic binding capacity in ion exchange chromatography by addition of polyethylene glycol |
US7364846B2 (en) * | 2002-10-11 | 2008-04-29 | Molecular Devices Corporation | Gene expression profiling from FFPE samples |
US20040110132A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-10 | Affymetrix, Inc. | Method for concentrate nucleic acids |
US7601491B2 (en) * | 2003-02-06 | 2009-10-13 | Becton, Dickinson And Company | Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor |
US20040157219A1 (en) * | 2003-02-06 | 2004-08-12 | Jianrong Lou | Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor |
JP4077339B2 (ja) * | 2003-03-06 | 2008-04-16 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 高等植物の糖リン酸の網羅的分析法 |
JPWO2004094634A1 (ja) * | 2003-04-22 | 2006-07-13 | アークレイ株式会社 | 核酸の単離方法ならびに核酸単離用のキット及び装置 |
CN100395257C (zh) * | 2003-05-08 | 2008-06-18 | 慈溪市中鼎生物技术有限公司 | 钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的dna提取方法和试剂盒 |
WO2004108741A1 (en) * | 2003-06-04 | 2004-12-16 | Qiagen As | Process for the concentration and/or isolation of nucleic acid or nucleic acid-containing species |
US8377715B2 (en) * | 2003-07-14 | 2013-02-19 | Phynexus, Inc. | Method and device for sample preparation |
US20050059054A1 (en) * | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Richard Conrad | Methods and compositions for preparing RNA from a fixed sample |
US20050059024A1 (en) | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for isolating small RNA molecules |
US20050026175A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | John Link | Devices and methods for isolating RNA |
US20050026153A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | Iannotti Claudia A. | Devices and methods for isolating RNA |
US20050042660A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Hall Gerald Edward | Devices and methods for isolating RNA |
US7031802B2 (en) * | 2003-08-13 | 2006-04-18 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Semi-autonomous operation of a robotic device |
CA2482097C (en) | 2003-10-13 | 2012-02-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for isolating nucleic acids |
US20050227251A1 (en) | 2003-10-23 | 2005-10-13 | Robert Darnell | Method of purifying RNA binding protein-RNA complexes |
EP1526176A3 (de) * | 2003-10-24 | 2005-05-11 | Agilent Technologies Inc. (a Delaware Corporation) | Vorrichtungen und Methoden zur RNA Isolation. |
US7846333B2 (en) | 2003-11-24 | 2010-12-07 | Effendorf AG | Porous media |
DE602004026912D1 (de) | 2003-12-16 | 2010-06-10 | Qiagen North American Holdings | Formulierungen und verfahren zum denaturieren von proteinen |
EP1709197A4 (de) * | 2003-12-30 | 2007-07-04 | Sigma Aldrich Co | Rasche präparation von nukleinsäuren mittels enzymatischen verdaus |
WO2005078088A1 (ja) | 2004-02-12 | 2005-08-25 | Gl Sciences Incorporated | Dnaなどの分離精製機構 |
SE0400886D0 (sv) * | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Amersham Biosciences Ab | Process of purification |
US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
JP4080462B2 (ja) * | 2004-07-09 | 2008-04-23 | 株式会社日立製作所 | 核酸の回収方法 |
US20060024776A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-02-02 | Mcmillian Ray | Magnetic particle capture of whole intact organisms from clinical samples |
WO2006017427A1 (en) * | 2004-08-03 | 2006-02-16 | Becton, Dickinson And Company | Use of magnetic material to fractionate samples |
AU2005271688B2 (en) * | 2004-08-03 | 2011-10-06 | Becton, Dickinson And Company | Use of magnetic material to direct isolation of compounds and fractionation of multipart samples |
EP1774041B9 (de) | 2004-08-03 | 2013-04-17 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren durch Lyse mikrobieller Proben |
US20060099605A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-05-11 | Hall Gerald E Jr | Devices and methods for isolating RNA |
AU2005305012C1 (en) | 2004-11-05 | 2012-07-19 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Compositions and methods for purifying nucleic acids from stabilization reagents |
US20070042384A1 (en) * | 2004-12-01 | 2007-02-22 | Weiwei Li | Method for isolating and modifying DNA from blood and body fluids |
US7842794B2 (en) | 2004-12-17 | 2010-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
US20060166223A1 (en) * | 2005-01-26 | 2006-07-27 | Reed Michael W | DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces |
EP1690938A1 (de) | 2005-02-11 | 2006-08-16 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäuren bei erhöhter Temperatur an einer Matrix immobilisiert werden |
JP4764966B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2011-09-07 | 独立行政法人科学技術振興機構 | メッセンジャーrnaの分離方法 |
US20060223073A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Boyes Barry E | Methods of using a DNase I-like enzyme |
US20060223072A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Boyes Barry E | Methods of using a DNase I-like enzyme |
JP4791750B2 (ja) * | 2005-04-15 | 2011-10-12 | ジーエルサイエンス株式会社 | Dnaなどの分離精製方法及び分離精製機構 |
WO2006119435A2 (en) * | 2005-05-04 | 2006-11-09 | Invitrogen Corporation | Identification of cancer biomarkers and phosphorylated proteins |
US20060270843A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Hall Gerald E Jr | Methods for isolation of nucleic acids |
US20060269929A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Hall Gerald E Jr | Methods and kits for DNA purification on polymeric membranes at low ionic strength |
US20070190535A1 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-16 | Hall Gerald E Jr | Size fractionation of nucleic acid samples |
US20100035331A1 (en) * | 2006-02-15 | 2010-02-11 | Tosoh Corporation | Method for extracting of nucleic acid from biological material |
US20070202511A1 (en) * | 2006-02-28 | 2007-08-30 | Sigma-Aldrich Co. | Methods and compositions for the rapid isolation of small RNA molecules |
US8679741B2 (en) | 2006-05-31 | 2014-03-25 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for the extraction and amplification of nucleic acid from a sample |
US7608399B2 (en) * | 2006-06-26 | 2009-10-27 | Blood Cell Storage, Inc. | Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples |
EP1873241A1 (de) * | 2006-06-30 | 2008-01-02 | Qiagen AS | Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäuren |
US10131935B2 (en) * | 2006-07-11 | 2018-11-20 | Aj Innuscreen Gmbh | Method for parallel isolation of viral nucleic acids |
JP4297148B2 (ja) * | 2006-09-22 | 2009-07-15 | ソニー株式会社 | 核酸回収装置及び核酸回収方法 |
WO2008045505A2 (en) | 2006-10-10 | 2008-04-17 | Xenomics, Inc. | Compositions, methods and kits for isolating nucleic acids from body fluids using anion exchange media |
CA2614069C (en) | 2006-12-11 | 2016-05-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives |
EP1932913B1 (de) | 2006-12-11 | 2013-01-16 | Roche Diagnostics GmbH | Nukleinsäureisolation mithilfe von Polidocanol und Derivaten davon |
EP2126074B1 (de) * | 2006-12-13 | 2010-12-01 | Roche Diagnostics GmbH | Verwendung von acetalen zur isolation von nukleinsäuren |
ES2394815T3 (es) * | 2006-12-13 | 2013-02-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Utilización de TDE para el aislamiento de ácidos nucleicos |
US20080147437A1 (en) * | 2006-12-19 | 2008-06-19 | Doud Gregory P | Intelligent Guided Registration Within A Health Information System |
JP2011503244A (ja) * | 2006-12-21 | 2011-01-27 | インヴィトロジェン ダイナル エーエス | 核酸の単離方法またはリン酸化タンパク質の単離方法における粒子およびその使用 |
US7960180B2 (en) * | 2007-02-20 | 2011-06-14 | University Of Notre Dame Du Lac | Methods and apparatus to capture and release microbe particles using amino-functionalized silica |
DK2171098T3 (en) * | 2007-06-29 | 2018-05-22 | Becton Dickinson Co | PROCEDURES FOR EXTRACTION AND CLEANING COMPONENTS IN BIOLOGICAL SAMPLES |
US20090048438A1 (en) * | 2007-08-13 | 2009-02-19 | Taigen Bioscience Corporation. | Method for washing a column and method for extracting membrane-bound target molecules |
JP4097687B2 (ja) * | 2007-09-21 | 2008-06-11 | 株式会社日立製作所 | 核酸の回収方法 |
WO2009117167A1 (en) * | 2008-01-02 | 2009-09-24 | Blood Cell Storage, Inc. | Devices and processes for nucleic acid extraction |
DE102008010693A1 (de) | 2008-02-22 | 2009-08-27 | Qiagen Gmbh | Neue Matrixmaterialien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen |
DE102008010692A1 (de) | 2008-02-22 | 2009-08-27 | Qiagen Gmbh | Neue Matrices, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen |
DE102008026058A1 (de) * | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Qiagen Gmbh | Lyse, Binde- und/oder Waschreagenz verwendbar zur Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren |
DE102008032501A1 (de) * | 2008-07-10 | 2010-01-14 | Qiagen Gmbh | Schnelles Analyseverfahren biologischer Mischproben |
CN102264899A (zh) * | 2008-11-04 | 2011-11-30 | 血细胞保存公司 | 弯曲的玻璃表面上的核酸提取 |
US8293101B2 (en) | 2009-03-13 | 2012-10-23 | Terrasep, Llc | Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography |
EP3514244B1 (de) | 2009-04-03 | 2021-07-07 | Sequenom, Inc. | Verfahren für die herstellung von nukleinsäuren |
JPWO2010134245A1 (ja) * | 2009-05-20 | 2012-11-08 | オリンパス株式会社 | 哺乳細胞由来核酸の回収方法、核酸解析方法、及び採便用キット |
EP2345719A1 (de) * | 2010-01-18 | 2011-07-20 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Isolierung kleiner RNA |
WO2012044991A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-04-05 | Phynexus, Inc. | Purification of nucleic acids |
US9051563B2 (en) * | 2011-01-14 | 2015-06-09 | Zymo Research Corporation | Nucleic acid purification |
WO2012159063A2 (en) | 2011-05-19 | 2012-11-22 | Blood Cell Strorage, Inc. | Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction |
EP3928715A1 (de) | 2011-06-19 | 2021-12-29 | DNA Genotek, Inc. | Vorrichtungen, lösungen und verfahren zur probenentnahme |
EP2729570B1 (de) | 2011-07-04 | 2017-11-22 | Qiagen GmbH | Reagens für die isolierung und/oder aufreinigung von nukleinsäuren |
GB2561425B (en) | 2012-03-16 | 2019-01-16 | Cambridge Entpr Ltd | Apparatus for obtaining liquid from a solid phase |
US9206469B2 (en) | 2012-07-18 | 2015-12-08 | Zymo Research Corporation | Nucleic acid purification |
US10745686B2 (en) * | 2013-02-08 | 2020-08-18 | Qiagen Gmbh | Method for separating DNA by size |
CN103439174A (zh) * | 2013-09-18 | 2013-12-11 | 武汉大学 | 以二氧化钛为固相对样品中核苷的萃取方法 |
CA2941764C (en) | 2014-03-07 | 2023-10-24 | Dna Genotek Inc. | Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples |
KR20220158867A (ko) | 2014-04-25 | 2022-12-01 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | 메신저 rna 의 정제 방법 |
CA2950419C (en) * | 2014-05-27 | 2023-04-25 | Dna Genotek Inc. | Composition and method for stabilizing and maintaining the viability of hardy microorganisms |
US9145581B1 (en) | 2014-10-17 | 2015-09-29 | Daniel Lai | Rapid nucleic acid extraction method and apparatus |
US20180291365A1 (en) * | 2015-06-05 | 2018-10-11 | Qiagen Gmbh | Method for separating dna by size |
CN107683335A (zh) * | 2015-06-09 | 2018-02-09 | 拜奥卡蒂斯股份有限公司 | 用于核酸分离的自动化方法 |
CN108138366A (zh) | 2015-07-23 | 2018-06-08 | 比奥卡尔齐斯股份有限公司 | 优化的临床样品测序 |
EP3135769A1 (de) | 2015-08-26 | 2017-03-01 | Qiagen GmbH | Kits und verfahren zur extraktion von rna |
US10287625B2 (en) * | 2016-03-18 | 2019-05-14 | Norgen Biotek Corp. | Methods and kits for separating nucleic acids by size |
WO2017201612A1 (en) * | 2016-05-27 | 2017-11-30 | Norgen Biotek Corp. | Preservation of cell-free nucleic acids in biological samples |
EP3538538A4 (de) | 2016-11-10 | 2020-11-04 | Talis Biomedical Corporation | Polynukleotide zur verstärkung und detektion von neisseria gonorrhoeae |
US20190284617A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-09-19 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of chlamydia trachomatis |
IL299270B2 (en) * | 2017-01-30 | 2024-10-01 | Regeneron Pharmaceuticals Inc | Preparations and methods for reducing biological load in chromatography |
WO2019131760A1 (ja) * | 2017-12-27 | 2019-07-04 | 東レ株式会社 | 核酸の回収方法 |
US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
WO2022003565A1 (en) * | 2020-07-01 | 2022-01-06 | Medimmune, Llc | Detergent and method for purifying a biotherapeutic |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3639949A1 (de) * | 1986-11-22 | 1988-06-09 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren |
DE3717211A1 (de) * | 1987-05-22 | 1988-12-01 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und verfahren zur trennung und reinigung von molekuelen |
US5075430A (en) * | 1988-12-12 | 1991-12-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Process for the purification of DNA on diatomaceous earth |
NL8900725A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
US5187083A (en) * | 1990-11-13 | 1993-02-16 | Specialty Laboratories, Inc. | Rapid purification of DNA |
CA2067711C (en) * | 1991-05-03 | 2000-08-08 | Daniel Lee Woodard | Solid phase extraction purification of dna |
US5155018A (en) * | 1991-07-10 | 1992-10-13 | Hahnemann University | Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources |
DE4143639C2 (de) * | 1991-12-02 | 2002-10-24 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren |
-
1993
- 1993-07-01 DE DE4321904A patent/DE4321904B4/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-24 WO PCT/EP1994/002056 patent/WO1995001359A1/de not_active Application Discontinuation
- 1994-06-24 PT PT94922869T patent/PT658164E/pt unknown
- 1994-06-24 ES ES94922869T patent/ES2155477T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-24 CA CA002142910A patent/CA2142910C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-24 DK DK94922869T patent/DK0658164T3/da active
- 1994-06-24 JP JP7503247A patent/JPH08501321A/ja active Pending
- 1994-06-24 DE DE59409712T patent/DE59409712D1/de not_active Revoked
- 1994-06-24 AT AT94922869T patent/ATE200293T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-24 EP EP94922869A patent/EP0658164B1/de not_active Revoked
- 1994-06-24 US US08/392,882 patent/US6383393B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5792651A (en) * | 1994-02-07 | 1998-08-11 | Qiagen Gmbh | Enhancement of the transfection efficiency of nucleic acids by using isopropanol in aqueous solutions |
WO1995021178A1 (de) * | 1994-02-07 | 1995-08-10 | Qiagen Gmbh | Steigerung der transfektionseffizienz von nucleinsäuren durch die verwendung von isopropanol in wässrigen lösungen |
DE19600362A1 (de) * | 1996-01-08 | 1997-07-10 | Wolf Prof Dr Bertling | Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung von Nucleinsäure-Molekülen |
DE19600362C2 (de) * | 1996-01-08 | 1998-11-12 | Wolf Prof Dr Bertling | Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung von Nucleinsäure-Molekülen |
WO1998005767A1 (en) * | 1996-08-06 | 1998-02-12 | Vical Incorporated | Purification of plasmid dna by peg-precipitation and column chromatography |
US6355792B1 (en) | 1998-02-04 | 2002-03-12 | Merck Patent Gesellschaft | Method for isolating and purifying nucleic acids |
WO1999040098A1 (de) * | 1998-02-04 | 1999-08-12 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren |
WO2001059098A2 (de) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Eppendorf Ag | Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren |
DE10006591A1 (de) * | 2000-02-11 | 2001-08-23 | Eppendorf Ag | Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren |
WO2001059098A3 (de) * | 2000-02-11 | 2002-05-23 | Eppendorf Ag | Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren |
DE10006591B4 (de) * | 2000-02-11 | 2007-03-29 | Eppendorf Ag | Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren |
WO2002074954A1 (de) * | 2001-03-21 | 2002-09-26 | Eppendorf Ag | Verfahren zur isolierung von plasmiden aus suspendierten bakterien- oder hefezellen |
EP1960520B1 (de) * | 2005-11-28 | 2014-02-12 | AJ Innuscreen GmbH | Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren aus beliebigen ausgangsmaterialien |
DE102007013099A1 (de) | 2007-03-14 | 2008-09-18 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren und Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's |
EP2215103B1 (de) * | 2007-10-31 | 2019-08-07 | Akonni Biosystems | Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren |
EP2285816B1 (de) | 2008-05-30 | 2015-04-01 | Qiagen GmbH | Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren |
US9790250B2 (en) | 2008-05-30 | 2017-10-17 | Qiagen Gmbh | Method for isolating short-chain nucleic acids |
US10738069B2 (en) | 2008-05-30 | 2020-08-11 | Qiagen Gmbh | Method for isolating nucleic acids |
US9809612B2 (en) | 2008-05-30 | 2017-11-07 | Qiagen Gmbh | Method for isolating nucleic acids |
EP2189530A2 (de) * | 2008-11-19 | 2010-05-26 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Verfahren zur Trennung genomischer DNA und Plasmid-DNA voneinander und Kit dafür |
EP2189530A3 (de) * | 2008-11-19 | 2010-08-11 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Verfahren zur Trennung genomischer DNA und Plasmid-DNA voneinander und Kit dafür |
DE102010031401A1 (de) | 2010-07-15 | 2012-01-19 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Viren sowie Zellen und zur nachfolgenden Nukleinsäureisolierung |
WO2012007581A1 (de) | 2010-07-15 | 2012-01-19 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur anreicherung von bakterien, viren sowie zellen und zur nachfolgenden nukleinsäureisolierung |
US9458452B2 (en) | 2010-11-09 | 2016-10-04 | Qiagen Gmbh | Method and device for isolating and purifying double-stranded nucleic acids |
WO2012062753A1 (de) * | 2010-11-09 | 2012-05-18 | Qiagen Gmbh | Verfahren und vorrichtung zur isolierung und reinigung von doppelsträngigen nukleinsäuren |
WO2014071965A1 (en) | 2012-11-12 | 2014-05-15 | Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel | Nucleic-acid binding compounds |
KR102488291B1 (ko) | 2015-03-20 | 2023-01-13 | 도레이 카부시키가이샤 | 핵산의 회수 방법 |
EP3272866A4 (de) * | 2015-03-20 | 2018-10-24 | Toray Industries, Inc. | Verfahren zur entnahme von nukleinsäuren |
KR20170128392A (ko) * | 2015-03-20 | 2017-11-22 | 도레이 카부시키가이샤 | 핵산의 회수 방법 |
WO2016169677A1 (de) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen |
WO2016169679A1 (de) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Aj Innuscreen Gmbh | Vorrichtung und verfahren zur automatisierten extraktion von nukleinsäuren |
DE102015216558A1 (de) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen |
WO2016169678A1 (de) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Aj Innuscreen Gmbh | Vorrichtung und verfahren zur extraktion von nukleinsäuren |
DE102015211394A1 (de) | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Aj Innuscreen Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren |
DE102015211393A1 (de) | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Aj Innuscreen Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Extraktion von Nukleinsäuren |
DE102015211394B4 (de) | 2015-06-19 | 2022-07-28 | Ist Innuscreen Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren |
EP3514233A4 (de) * | 2016-09-14 | 2020-05-06 | Toray Industries, Inc. | Verfahren zur rückgewinnung von zellfreier dna |
DE102017204267A1 (de) | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen |
WO2018167138A1 (de) | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen |
US11702648B2 (en) | 2017-03-14 | 2023-07-18 | Ist Innuscreen Gmbh | Process for concentrating cells from a sample and then isolating nucleic acids from said cells |
WO2023089180A1 (de) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Ist Innuscreen Gmbh | Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren |
DE102021130283A1 (de) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Ist Innuscreen Gmbh | Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren |
DE102021130283B4 (de) | 2021-11-19 | 2024-03-21 | Ist Innuscreen Gmbh | Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2142910A1 (en) | 1995-01-12 |
ES2155477T3 (es) | 2001-05-16 |
CA2142910C (en) | 2002-08-27 |
JPH08501321A (ja) | 1996-02-13 |
EP0658164B1 (de) | 2001-04-04 |
ATE200293T1 (de) | 2001-04-15 |
DK0658164T3 (da) | 2001-06-18 |
US6383393B1 (en) | 2002-05-07 |
DE4321904B4 (de) | 2013-05-16 |
WO1995001359A1 (de) | 1995-01-12 |
EP0658164A1 (de) | 1995-06-21 |
DE59409712D1 (de) | 2001-05-10 |
PT658164E (pt) | 2001-09-28 |
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