DE4321904A1

DE4321904A1 - Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen

Info

Publication number: DE4321904A1
Application number: DE4321904A
Authority: DE
Inventors: Petra Feuser; Ralf Dr Hermann; Joachim Dr Schorr; Metin Dr Colpan; Helge Dr Bastian
Original assignee: DIAGEN INST MOLEKULARBIO
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 1995-01-12
Anticipated expiration: 2013-07-02
Also published as: DK0658164T3; JPH08501321A; DE4321904B4; EP0658164A1; ATE200293T1; CA2142910A1; US6383393B1; CA2142910C; DE59409712D1; EP0658164B1; WO1995001359A1; ES2155477T3; PT658164E

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäure gemischen gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1, die Verwendung des Verfahrens zur Reinigung von Nucleinsäurefragmenten, die Modifizierungsreaktionen unterzogen worden sind, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, eine wäßrige Lösung, die im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar ist sowie die Verwendung dieser Lösung.

Die Adsorption von Nucleinsäuren an Glas- oder Silicagelpar tikeln in Gegenwart von chaotropen Salzen ist bekannt (Vogel stein, B. and Gillespie, D. (1979) Preparative and analytical purification of DNA from agarose., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615-619). Gemäß dieser Methode wird DNA aus Agaros egelen sowie RNA- und DNA-Präparate aus verschiedenen Extrak ten unter Verwendung von hohen Konzentrationen chaotroper Salze in Natriumiodid, Natriumperchlorat oder Guanidin thiocyanat isoliert und gereinigt (Boom, R. et al. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 und Yamado, O. et al. (1990) A new method for extracting DNA or RNA for polymerase chain reaction. J. Viro. Methods 27, 203-210). Zwar sind die genauen pysikalischen Vorgänge, die zu einer Adsorption der Nucleinsäuren in Gegenwart chaotroper Reagenzien an mineralische Träger führen nicht im Detail geklärt, jedoch geht man davon aus, daß die Ursache für die Adsorption in der Störung übergeordneter Strukturen des wäßrigen Milieus zu suchen ist. Dabei wird die in Lösung befindliche Nuclein säure an der Oberfläche der Glas- bzw. Silicalgelpartikel adsorbiert oder denaturiert. Die Adsorption ist in Anwesen heit von hohen Konzentrationen chaotroper Salze fast quanti tativ. Die Elution der adsorbierten Nucleinsäuren erfolgt in Anwesenheit von Puffern mit geringer Ionenstärke (Salz konzentration). Durch die Verfahren des Standes der Technik werden Nucleinsäurefragmente einer Größe von 200 bis 3000 Basenpaaren (bp) ermöglicht. Es war bislang jedoch nicht möglich, kurze einzel- oder doppelsträngige Nucleinsäurefrag mente (100 bp und kleiner) von sehr kurzen (20 bis 40 Nucleo tide) einzelsträngigen Oligonucleotiden (Primern) quantitativ zu trennen.

Diese Nucleinsäuregemische entstehen typischerweise als Amplifikationsprodukte zum Beispiel gemäß der Polymerase kettenreaktion (PCR). Die aus dieser Reaktion entstehenden Produkte werden häufig anschließend molekularbiologisch analysiert, indem die üblichen Techniken wie DNA-Sequen zierung, DNA-Hybridisierung, Klonierung, Restriktion und Transformation durchgeführt werden. Damit lassen sich analytische Parameter wie Aussagen über Genmutationen für die genetische Beratung oder Erregernachweise in der medi zinischen Diagnostik (HIV) gewinnen. Um das Potential dieser Diagnostikverfahren nutzen zu können, ist eine quantitative Trennung bzw. Reinigung dieser häufig recht kleinen DNA- Fragmente (100 Basenpaare) sehr wichtig.

Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Reinigungsmethoden basieren auf der Ultrafiltration, der High Pressure Liquid Chromatoaranhy (HPLC) oder der Extraktion von Nucleinsäure fragmenten aus Agarosegelen in Anwesenheit chaotroper Salze durch Niederschlagen auf Glas- oder Silicagelpartikel. Diese Methoden sind jedoch nur mit niedriger Effizienz zur Trennung von Nucleinsäuregemischen bestehend beispielsweise aus einem kurzen doppelsträngigen DNA-Fragment (100 bp) und einem kleineren einzelsträngigen Oligonucleotid (zum Beispiel 39 mer) geeignet.

Das technische Problem der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem es möglich ist, die oben genannten Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden. Gelöst wird das Problem durch ein Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die darauf folgenden Unteransprüche 2 bis 8 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Ver fahrens.

Der Anspruch 9 betrifft eine Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Reinigung von Nucleinsäurefragmenten nach Modifizierungsreaktionen. Der Anspruch 11 betrifft eine Vor richtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Anspruch 12 betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Der Anspruch 14 betrifft eine wäßrige Lösung verwendbar im erfindungsgemäßen Verfahren und Anspruch 16 betrifft eine Zusammenstellung der Komponenten gemäß Anspruch 15 und Anspruch 11.

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die an sich bekannte Eigenschaft von Nucleinsäuren aus, in Gegenwart chaotroper Salze, Salzlösungen hoher Ionenstärke (hoher Kon zentrationen), Reagenzien wie z. B. Harnstoff oder von Mischungen dieser Substanzen auf mineralischen Träger niederzuschlagen und durch Einwirkung von Lösungen geringer Ionenstärke (Salzkonzentration) zu eluieren. So schlägt die PCT/EP 92/02775 der Anmelderin vor, ein Nucleinsäuregemisch zunächst in einem Medium niederer Ionenstärke auf einem Anionenaustauschermaterial zu adsorbieren, danach die Nucleinsäure mit einem Puffer höherer Ionenstärke zu desorbieren und danach im Puffer mit dieser höheren Ionenstärke in Gegenwart von niederen Alkoholen und/oder Polyethylenglycol und/oder Trichloressigsäure (TCA) die Nucleinsäuren auf einem mineralischen Trägermaterial zu adsorbieren. Die Nucleinsäuren werden dann vorzugsweise mit Wasser oder einer Pufferlösung geringer Ionenstärke eluiert.

Es hat sich nun herausgestellt, daß zur Trennung von Nuclein säuren die vorherige Reinigung an Anionenaustauscher materialien unterbleiben kann. Überraschenderweise läßt sich auch durch die Adsorption von Nucleinsäuren in Gegenwart chaotroper Salze hoher Konzentration und Desorption der Nucleinsäuren mit Lösungen geringer Ionenstärke eine hervor ragende Fraktionierung eines Nucleinsäuregemisches erzielen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es mithin er möglicht, in einem Arbeitsschritt durch Adsorption der zu trennenden Nucleinsäuren und Elution in effizienter Weise interessierende Nucleinsäurefraktionen zu erhalten, ohne vorherige Reinigungsschritte.

Sollen nucleinsäurehaltige Proben als Quellen der zu reini genden und isolierenden Nucleinsäuren dienen, werden diese Quellen in an sich bekannter Weise aufgeschlossen, beispiels weise durch Detergenzbehandlung oder mechanische Einflüsse wie Ultraschall oder Zerkleinern. Dabei kann die zur Aufnahme der Nucleinsäuren verwendete Lösung bereits chaotrope Salze in hoher Konzentration enthalten. Nach Entfernung eventuell vorhandener grober Zellbestandteile durch Zentrifugation oder Filtration (WO 93/11218 und WO 93/11211) wird die Lösung dann mit einem mineralischen Trägermaterial in Kontakt gebracht, um aus der Lösung mit hoher Ionenstärke chaotroper Salze die Nucleinsäuren auf dem mineralischen Träger zu adsorbieren.

Eine Abwandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, den Aufschluß der Nucleinsäuren direkt in dem Puffersystem, das zur Adsorption eingesetzt wird, durch zuführen. Dann wird eine besonders günstige Nucleinsäure verteilung gewinnbar.

Üblicherweise werden Nucleinsäuren aus eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen (darunter auch Protozoen und Pilze) und/oder aus Viren gewonnen. Dabei werden die Zellen und/oder Viren beispielsweise unter stark de naturierenden und gegebenenfalls reduzierenden Bedingungen aufgeschlossen (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, S., 1982, Molecular Clonin Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor).

Weit verbreitet ist der Aufschluß der Zellen mit Detergenzien als denaturierende Reagenzien und die Verwendung von be stimmten Enzymen zum Abbau der Proteinstrukturen und nuclein säurespaltenden Enzymen. So werden beispielsweise Natrium dodecylsulfat (SDS) und EDTA als denaturierende Agenzien verwendet und Proteinase K zum Abbau von Proteinen. Das Ergebnis dieses Aufschlußverfahrens ist meistens eine hochviskose gallertartige Struktur, aus der die Nucleinsäuren mittels Phenolextraktion isoliert werden. Die Nucleinsäuren bleiben dabei in großer Länge erhalten und werden nach Dialyse und Präzipitation aus der wäßrigen Phase entfernt. Dieses Aufschlußverfahren ist gegenüber Nicht-Nucleinsäure- Strukturen so aggressiv, daß dem Verfahren auch Gewebestücke unterworfen werden können.

Wegen der arbeitsintensiven Technik mit mehrfachem Wechsel der Reaktionsgefäße ist diese Methode jedoch für große Probenaufkommen und Routinepräparationen ungünstig. Dieses Verfahren ist zwar automatisierbar, jedoch bewältigt eine handelsübliche Apparatur gegenwärtig etwa 8 Proben gleich zeitig in vier Stunden (Applied Biosystems A 371). Das Verfahren ist somit teuer und eignet sich nicht für die Durchschleusung großer Probenserien. Weiterhin ist nach teilig, daß die Folgereaktionen, wie enzymatische Amplifi kation, infolge der großen Längen der isolierten Nuclein säuren gestört sind. Darüber hinaus sind die anfallenden Lösungen hochviskos und schwer handhabbar. Insbesondere DNA sehr großer Länge ist eher störend, da die mit dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik gewonnenen Nucleinsäuren ge sondert zerkleinert werden müssen, um weiterverarbeitet werden zu können.

Der Aufschluß von eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren in alkalischem Milieu in Gegenwart von Detergenzien, ist technisch zwar einfach, liefert jedoch auch Nucleinsäuren mit großer Länge, die wie oben geschildert von Nachteil sind.

An die Rohpräparation der Nucleinsäuren schließen sich Folge reaktionen an. Diese Folgereaktionen erfordern eine bestimmte Qualität der Nucleinsäuren. So müssen diese weitestgehend unversehrt sein, die Ausbeute der Präparation muß hoch und reproduzierbar sein, außerdem müssen die Nucleinsäuren in hoher Reinheit, frei von Proteinen und Zellmetaboliten vorliegen. Der Präparationsweg muß einfach und wirtschaftlich sein und die Möglichkeit zur Automation bieten. Die Prä paration der Nucleinsäuren muß ohne die Gefahr von Kreuz kontamination anderer Proben möglich sein, insbesondere wenn enzymatische Amplifikationsreaktionen, wie Polymerase Chain Reaction (PCR) (Saiki, r., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, s.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. & Ehrlich, H.A. (1988), Science 239, 487-491) und Ligase Chain Reaction (LCR) (EP-A-8 83 11 741.8), Anwendung finden. Für diese Folgereaktionen ist es wünschenswert, die Nuclein säuren in nicht zu großer Kettenlänge zu erhalten, die Zellen möglichst quantitativ aufzuschließen und im übrigen die oben genannten Nachteile der im Stand der Technik bekannten Aufschlußverfahren zu vermeiden.

Es ist mithin wünschenswert, daß ein Verfahren die Isolierung und Konzentrierung von Nucleinsäuren aus intakten eukaryon tischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren oder aus Körperflüssigkeiten ermöglicht. Insbesondere soll die dabei anfallende Nucleinsäure sich durch nicht zu große Kettenlängen auszeichnen, in wenigen Schritten isolierbar sein und direkt den erforderlichen Folgereaktionen unter worfen werden können.

Die weiter oben angegebene Modifikation des erfindungsgemäßen Verfahrens die dies ermöglicht, besteht darin, daß die Quellen der Nucleinsäuren wie eukaryontische und/oder prokaryontische Zellen und/oder Viren lysiert werden.

Der Aufschluß nucleinsäurehaltiger Quellen, wie eukaryon tische und/oder prokaryontische Zellen und/oder Viren, kann dabei vorzugsweise durch physikalische oder chemische Einwirkung erfolgen. Dabei kann die Lyse entweder mechanisch wie mit Ultraschall oder durch osmotischen Schock oder chemisch mittels Detergenzien und/oder chaotropen Agenzien und/oder organischen Lösungsmitteln (z. B. Phenol, Chloroform, Ether) oder alkalischem Aufschluß erreicht werden.

Diese Verfahrensweise führt zur Präparation von Nucleinsäuren mit hoher Reinheit und erlaubt es, eine qualitativ und quantitativ reproduzierbare Analytik durchzuführen, insbesondere in Kombination mit enzymatischen Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren. Es hat sich gezeigt, daß Aufschlußmethoden mit Detergenzien und/oder chaotropen Agenzien, konzentrierten Salzlösungen, Reagenzien wie Harnstoff, Mischungen dieser Substanzen und/oder organischen Lösungsmitteln oder physikalische Aufschlußmethoden, wie Erhitzen einer Probe, die Folgeanwendungen erleichtert. Man erhält bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Beispiel kürzere zelluläre DNA (< 50 kb) beziehungsweise Gesamtnucleinsäuren aus Zellen und/oder Viren und/oder Körperflüssigkeiten. Die Reinigungsmethode (d. h. die Be dingungen der Bindung und Elution der Nucleinsäuren) führt zu einer Fragmentierung der Nucleinsäuren.

Die Kombination aus chaotropen Agenzien hoher Ionenstärke und hydrophoben organischen oder anorganischen Polymeren und/oder Alkoholen und/oder Trichloressigsäure (TCA) im Ad sorptionspuffer gewährleistet, daß die Nucleinsäuren im Gegensatz zu herkömmlichen Reinigungsverfahren nach der Lyse quantitativ und hochspezifisch an der Oberfläche des minera lischen Trägermaterials wie Quarzfasern fixiert werden und so vor weiterführenden Angriffen der Nucleasen geschützt sind, während kontaminierende Bestandteile des Lysates nicht binden. In diesem fixierten Zustand der Nucleinsäuren können restliche kontaminierende Bestandteile leicht ausgewaschen werden, gefolgt von der Elution der sauberen Nucleinsäure in einem kleinen Volumen. Man erhält so reproduzierbare Kettenlängen von durchschnittlich 20 bis 40 kb. Weniger als 10% sind kürzer als 10 kb unter den Aufschlußbedingungen, wie sie in den Beispielen 7 bis 9 beschrieben werden. Dies stellt eine optimale Längenverteilung für eine anschließende enzymatische Nucleinsäureamplifikation dar.

Die spezielle Kombination von Salzen, insbesondere chaotropen Agenzien, und Alkoholen ermöglicht es erstmals, Nucleinsäuren eines breiten Kettenlängenspektrums (10-100 000 Basenpaare) gleichzeitig zu isolieren und zu reinigen.

Die wäßrige Adsorptionslösung hoher Salzkonzentration enthält 1 bis 50 Vol.-% aliphatischen Alkohols einer Kettenlänge von 1 bis 5 C-Atomen oder Polyethylenglykol.

Als mineralische Träger kommen poröse oder nicht poröse Materialien auf Basis von Metalloxiden und Metallmischoxiden in Frage, wie solche aus Silicagel, Materialien, die über wiegend aus Glas bestehen, Aluminiumoxid, Zeolithe, Titan dioxid, Zirkondioxid.

Gegebenenfalls kann das mineralische Trägermaterial mit den daran adsorbierten Nucleinsäuren mit einer Lösung gewaschen werden, die aufgrund eines relativ hohen Alkoholgehaltes eine Desorption der Nucleinsäuren verhindert.

Danach werden die adsorbierten Nucleinsäuren mit einem Puffer geringer Salzkonzentration (Ionenstärke) eluiert und die erhaltenen Nucleinsäuren oder Nucleinsäurefraktionen ge sammelt.

Als chaotrope Salze kommen Natriumperchlorat, Guanidin hydrochlorid (GuHCl), Guanidinisothiocyanat (GTC), Kalium iodid in Konzentrationen von 1 bis 8 M in Betracht. Nutzbar sind ebenfalls konzentrierte Salzlösungen < 1 M NaCl, KCl, LiCl etc., Reagenzien wie beispielsweise Harnstoff (< 1 M) und Kombinationen dieser Bestandteile. Die in der Lösung der chaotropen Salze vorhandenen niederen Alkohole sind Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol und Pentanol in Mengen von 1 bis 50%, insofern sie in diesen Bereichen mit Wasser mischbar sind. Die vorzugsweise verwendbaren Ethylenglykole weisen Molekulargewichte von 1000 bis 100 000, insbesondere von 6000 bis 8000 auf. Das Polyethylenglykol kann dem Puffer hoher Ionenstärke in Mengen von 1 bis 30% zugesetzt sein.

Die Partikelgröße der mineralischen Trägermaterialien beträgt vorzugsweise 0,1 µm bis 1000 µm. Werden poröse mineralische Träger verwendet wie beispielsweise poröses Silicagel, poröses Glas, poröses Aluminiumoxid, Zeolithe weisen die Poren vorzugsweise eine Porengröße von 2 bis 1000 nm auf. Das Trägermaterial kann beispielsweise in Form loser Schüttungen vorliegen und mit den die zu trennenden und reinigenden Nucleinsäuren enthaltenden Lösungen in Kontakt gebracht werden.

Vorzugsweise sind jedoch die porösen und nicht porösen Trägermaterialien als Filterschichten ausgebildet und in einem Hohlkörper mit Ein- und Auslaßöffnung angeordnet. Die Filterschichten bestehen entweder aus gerichteten (gewebten) oder ungerichteten Fasern aus Glas, Quarz, Keramik oder anderen Materialien wie Mineralien oder aus einer Membran, in der Silicagel angeordnet ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in hervorragender Weise geeignet, Nucleinsäuregemische zu trennen, insbesondere auch kurzkettige Nucleinsäuren, die sich in den Kettenlängen nur geringfügig unterscheiden. So lassen sich beispielsweise DNA- Fragmente einer Größe von beispielsweise 100 bp von kleineren einzelsträngigen Oligonucleotiden zum Beispiel einem 39 mer trennen. Dabei wird die DNA-Ausbeute dann um 60 bis 70% gesteigert, verglichen mit anderen konventionellen Reini gungsmethoden, wie Ultrafiltration, HPLC oder Verwendung chaotroper Salze allein.

Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem der Aufschluß der Nucleinsäuren enthaltenden Quellen im Aufnahme- (Adsorptions-)puffer erfolgt, wird eine Nucleinsäure präparation mit bestimmten Längenspektrum der Nucleinsäure möglich.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, Nucleinsäure gemische jeglicher Herkunft zu bearbeiten. So lassen sich Nucleinsäuren aus biologischen Quellen wie Geweben jeder Art, Körperflüssigkeiten wie Blut, Faeces nach entsprechender Probenvorbereitung, die jedenfalls eine Aufnahme der Probe in einer Lösung hoher Salzkonzentration, vorzugsweise hoher Konzentration an chaotropen Ionen umfaßt, gewinnen. Auch Nucleinsäuren, die durch chemische Reaktionen entstanden sind, wie solche, die durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten wurden oder Plasmid-DNA, genomische DNA und RNA und/oder Nucleinsäuren, die aus Mikroorganismen stammen, lassen sich erfindungsgemäß trennen und reinigen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ebenfalls geeignet, sogenannte Plasmid-DNA-Minipräparationen aus Escherichia Coli für die anschließende Klonierung oder Sequenzierung zu verwenden; ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von DNA und/oder RNA aus Vollblut, Plasma, Serum, Geweben, Zellkultur, Bakterien, insbesondere Mycobakterium tuberlosis, Viren wie Cytomegalie-Virus (Nucleinsäure DNA) aus RNA-Viren wie HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis-δ. Nucleinsäuren im Sinne des er findungsgemäßen sind auch Oligonucleotide. Die Nucleinsäuren können desweiteren aus Sequenzierreaktionen oder anderen vergleichbaren Reaktionen stammen. Die Präparation von DNA oder RNA aus Vollblut ist inbesondere geeignet zur an schließenden HIA-Typisierung. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Isolierung von Nucleinsäuren aus Mycobakterium tuberkulosis. Hierbei müssen recht drastische Aufschlußmethoden eingehalten werden, wobei konventionelle Isolierungstechniken nur unbefriedigende Resultate liefern.

Eine im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise zu ver wendende Vorrichtung ist ein insbesondere zylindrischer Hohlkörper mit einer Ein- und Auslaßöffnung. In der Nähe der Auslaßöffnung, in Fließrichtung der Lösung durch den Hohlkörper gesehen, ist das mineralische Trägermaterial angeordnet, an welchem die Nucleinsäuren zu adsorbiert werden. Eine Einrichtung, die in einer bevorzugten Aus führungsform aus zwei übereinander angeordneten, einen Zwischenraum bildenden Polyethylenfritte besteht, fixiert das Trägermaterial, welches sich im Zwischenraum zwischen den Polyethylenfritten befindet, in dem Lumen des Hohl körpers. Die Einrichtung zur Befestigung des Trägermaterials kann auch eine selbsttragende Membran sein, in der das Trägermaterial eingebettet ist. Die Befestigung des Träger materials bzw. der Einrichtungen, die das Trägermaterial fixieren, kann durch Reibungs- oder Spannungskräfte, wie sie beispielsweise durch Einklemmen dieser Einrichtungen in dem Hohlkörper entstehen, bewirkt werden und/oder durch eine Fixierung der Einrichtungen mit einem Spannring erfolgen.

Die Porengröße der Einrichtung, vorzugsweise Polyethylen- oder Polypropylenfritten, muß dabei groß genug sein, um die Bestandteile des Lysates verstopfungsfrei hindurchfließen zu lassen. Vorzugsweise haben die Einrichtungen eine Porengröße von 5 bis 200 µm. Diese Vorrichtung erlaubt erstmals die einfache, schnelle und reproduzierbare Isolierung von Nucleinsäuren auch aus hochviskosen Lysaten, die sehr viel Protein enthalten (z. B. Blutlysate, welche einen sehr hohen Hämoglobingehalt aufweisen).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das mineralische Trägermaterial eine netzartige Membran aus Silicagel-, Glas- oder Quarzfasern, mit einer Porengröße < 0,5 µm, an die die freigesetzten Nucleinsäuren adsorbiert werden.

Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform stellt eine Vorrichtung dar, bei der das mineralische Trägermaterial ein partikelförmiges anorganisches Polymeres wie Kieselgel oder Quarzgel mit einer Partikelgröße von 15 bis 25 µm ist.

Der Hohlkörper kann zum Beispiel ein handelsübliches Röhrchen sein. Zwischen den zwei eng eingepreßten Einrichtungen, zum Beispiel Polyethylenfritten mit einer Porengröße von 50 bis 200 µm, befindet sich eine oder mehrere Lagen einer Membran mit 0,1 bis 1 µm großen Poren, welche aus Silica-, Glas- oder Quarzfasern oder Kieselgelen besteht. Die Membran weist eine Dicke von ca. 0,2 bis 1,0 mm, insbesondere 0,6 mm auf.

Die Kapazität des Membranmaterials ist etwa 20 bis 100 µg DNA. Durch Übereinanderlegen entsprechender Membranen läßt sich selbstverständlich die Kapazität für DNA erhöhen. Bei geringer mechanischer Belastung ist auch ein randständiges Verschweißen oder Verkleben der Membran denkbar, wodurch die stabilisierende Wirkung der Einrichtungen entfallen kann, so daß die Membran den Hohlkörper ohne die Einrichtungen verschließt. Dabei kann die Membran durch das Aufsetzen eines Spannringes im Hohlkörper fixiert werden.

Es ist ebenfalls möglich, mit dem beschriebenen Kieselgel, das zwischen 2 Polyethylen-Fritten mit einer Porengröße von 35 µm angeordnet ist, kleine Säulen zu füllen. Vorzugsweise wird die obere Einrichtung mit größeren Poren (100-200 µm) gewählt. Die Säulen werden vorzugsweise mit ca. 70 mg Silicagel entsprechend 3 mm Füllhöhe beschickt.

Bevorzugt ist auch die Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens in Strips mit je 8 parallelen Präparations möglichkeiten, im Mikrotitrationsplattenformat (96 Prä parationsmöglichkeiten fast gleichzeitig) und/oder in Kombination mit einem Filtrationsschritt und/oder einem Entsalzungsschritt. (Siehe Patentanmeldungen P 41 27 276.5, P 41 39 664.2 des gleichen Anmelders).

In einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung wird eine 0,5 bis 1,5 mm dicke Polyethylenfritte mit einer Porosität von ca. 10 µm in eine Zentrifugen-Chromato graphiesäule in Form eines im wesentlichen zylindrischen Hohlkörpers eingeklemmt. Über diese Fritte ist eine etwa doppelt so dicke Schicht aus Silicagel einer Partikelgröße von etwa 10 bis 15 µm und einer Porosität von 40 bis 120 Å und mit einer zweiten Fritte, die von gleicher Art sein kann wie die erste Fritte, verschlossen. Vorzugsweise kann die Silicagelschicht durch Druck zwischen den Fritten komprimiert werden.

Eine andere Ausführungsform der Chromatographiesäule weist als Trägermaterial Glasfaserbruchstücke mit einer Länge von 10 bis 300 µm zwischen zwei Polyethylenfritten auf, die eine Porosität von ca. 50 µm besitzen. Als Trägermaterial kommen auch Glasfaserpapiere, Quarzfaserpapiere, Glasfasergewebe und andere mineralische Papiere und Gewebe in Betracht.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung weist eine Membran, in die Silicagelpartikel eingebettet sind, in der Nähe der Auslaßöffnung auf. In diesem Fall kann die vorzugsweise selbsttragende Membran insbesondere mit einem Spannring fixiert werden. Als Silicagelmembran kommt in vorteilhafterweise eine Empore-SI-Membran der Firma Baker in Betracht. Ebenfalls, insbesondere mit einem Spannring, läßt sich eine Silicalgelmembran bestehend aus Silicagel und porösem PVC im Lumen des zylindrischen Hohlkörpers befestigen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die beschriebene Vorrichtung beispielsweise in einer ihrer Ausführungsformen mit der Lösung des zu trennenden Nucleinsäuregemisches beschickt. Die Lösung wird dann durch Anlegen eines Unterdrucks oder Zentrifugation oder gleichwirkende Maßnahme sowie Kombinationen davon durch den mineralischen Träger passiert. Dabei werden die Nucleinsäuren an dem Trägermaterial adsorbiert, sofern die Lösung eine hohe Ionenstärke (Salzkonzentration) aufweist.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Isolierung von high copy Plasmid-DNA

Das Plasmid pUC 18 enthaltende E. coli Zellen aus einer 3 ml HB 101 Kultur werden abzentrifugiert und in 0,25 ml Puffer P1 (10 mM Tris-HCl, pH 8, 100 µg/ml RNAseA) resuspendiert und durch die Zugabe von 0,25 ml Puffer P2 (0,2 M NaOH, 2% SDS) lysiert. Die Probe wird durch die Zugabe von 0,35 ml Puffer N3 (4,2 M Guanidinhydrochlorid, 0,9 M K-Acetat, pH 4,8) neutralisiert und gleichzeitig auf eine Endkonzentration von 1,75 M GuHCl eingestellt. Die lysierte Probe wird 10 min. bei 13 000 rpm in einer Eppendorf-Minizentrifuge abzen trifugiert, um die Zellbruchstücke und das ausgefallene SDS zu entfernen. Der Überstand mit der Plasmid-DNA wird sofort auf eine Zentrifugen-Chromatographiesäule pipettiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird in einem 2 ml Zentri fugenröhrchen zentrifugiert und durch nochmaliges Zentri fugieren von 0,5 ml PB Puffer (5 M Guanidinhydrochlorid, 30% Isopropanol) gewaschen, um Verunreinigungen und Proteine zu entfernen. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird 1× durch Durchzentrifugieren von 80% Ethanol/Wasser salzfrei gewaschen und anschließend 30 bis 60 sec. zentrifugiert, um das überschüssige Ethanol komplett zu entfernen. Zur Elution werden 0,05-0,2 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) durch die Zentrifugen-Chromatographiesäule in ein 1,5-ml- Zentrifugenröhrchen zentrifugiert. Die Plasmid-DNA liegt jetzt in konzentrierter Form in einer Lösung mit sehr niedriger Salzkonzentration vor. Die Ausbeute beträgt 15 µg bis 20 µg Plasmid-DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,75.

Beispiel 2 Isolierung von high copy Plasmid-DNA aus 5 ml Kulturen

Nach Beispiel 1 wird ein Zell-Lysat einer 5 ml Plasmid pUC 18/XL 1 Blue Kultur hergestellt und durch eine Zentrifugen- Chromatographiesäule, welche eine Silicalgelschüttung enthält, zentrifugiert und gewaschen. Die Plasmid-DNA wird mit 0,1 ml auf 80°C erwärmtem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA) eluiert. Die Ausbeute beträgt 15-20 µg Plasmid DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,7.

Beispiel 3 Isolierung von low copy Plasmid-DNA

Nach Beispiel 1 wird ein Zell-Lysat einer 5 ml Plasmid pBR322/XL 1 Blue Kultur hergestellt und durch eine Zentri fugen-Chromatographiesäule mit einer Glas- oder Quarzfaser membran zentrifugiert und gewaschen. Die Plasmid-DNA wird mit 0,1 ml auf 80°C erwärmten TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1mM EDTA) eluiert. Die Ausbeute beträgt 5-10 µg Plasmid DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,7.

Beispiel 4 Reinigung von Amplifikationsprodukten

Eine 100 µl PCR-Amplifikationsreaktion wird mit 500 µl Puffer PB (5 M GuHCl, 30% Isopropanol) vermischt, wobei ein vor heriges Abt rennen des den Reaktionsansatz überschichtenden Paraffinöls nicht nötig ist. Dieses Gemisch wird auf eine Zentrifugen-Chromatographiesäule, welche eine Silicagel membran enthält, pipettiert und in einem 1,5 ml Zentrifugen röhrchen zentrifugiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird durch Behandeln mit 80% EtOH/Wasser annähernd salzfrei gewaschen. Zur Elution werden 50 µl Elutionspuffer (10 mM Tris, pH 8,5) durch die Zentrifugen-Chromatographiesäule in ein anderes Zentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das so gereinigte PCR Produkt ist frei von Primern, dNTPs, Poly merase und Salzen und kann beispielsweise direkt für eine Sequenzierungsreaktion in einem ABI-Sequencer unter Ver wendung des "Cyle-Sequencing" Protokolls eingesetzt werden.

Beispiel 5 Reinigung von DNA nach Restriktionsreaktionen

1 µg DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease behandelt. Diese DNA Restriktionsreaktion wird nach Beispiel 4 mit 500 µl PB Puffer vermischt und es wird weiter wie in Beispiel 4 verfahren. Die nach Elution erhaltene DNA ist frei von Restriktionsendonucleasen und Salzen, das 260/280 Verhältnis beträgt 1,8.

Beispiel 6 Reinigung von DNA nach enzymatischer radioaktiver Markierung

1 µg DNA werden mit Hilfe des Oligolabellings, in Anwesenheit von Gamma P32-ATP radioaktiv markiert. Der Reaktionsansatz wird wie in Beispiel 4 behandelt. Hierdurch wird die markierte DNA von nicht eingebauten dNTPs, Gamma-P32 ATP, Salzen und Klenow-Polymerase gereinigt und kann direkt für die Hybridisierungsreaktion eingesetzt werden.

Beispiel 7 Nucleinsäure-Präparation aus Blut

Gesamt-Nucleinsäure-Präparation aus Blut: 200 µl Citrat-, Heparin- oder EDTA-Blut werden in einem 1,5 ml PPN-Röhrchen mit 200 µl einer Lösung aus einem 4-8 M chaotropen Salz (Guanidinhydrochlorid (GuHCl), Guanidinisothiocyanat (GTC), Kaliumjodid), evtl. einem organischen Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Ether) und einem 5-100%igen Detergens (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) versetzt. Anschließend werden 200-1000 µg einer Protease zugefügt und es wird für 10 min. bei 70°C oder für längere Zeit bei niedrigeren Temperaruren (z. B. 30 min bei Raumtemperatur) inkubiert. In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und Denaturierung und enzymatischer Abbau von Proteinen (gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen Proteine). Durch Zugabe von 210 µl eines 95-100%igen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt und das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird das Lysat sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet, wobei die Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder Gelpartikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen, Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destiliertem (deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser Elutionsverfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA direkt ohne weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in Folgereaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden können. Die Präparation von Nucleinsäuren aus anderen Körperflüssigkeiten wie z. B. Sperma, Sputum, Urin, Stuhl, Schweiß, Speichel, Nasenschleim, Serum, Plasma, Liquor etc. ist auch möglich.

Diese einfache Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren weist ein hohes Automatisierungspotential insbesondere in Ver bindung mit den Anmeldungsgegenständen der DE-A 41 27 276.5, WO 93/11218, WO 93/11211 und DE-A 41 39 664.2 auf.

Beispiel 8 Gesamt-Nucleinsäure-Präparation aus geringsten Blutmengen oder Spuren

1-50 µl Citrat-, Heparin- oder EDTA-Blut, oder gefrorenes und wieder aufgetautes Blut, oder renaturiertes Blut aus getrockneten Spuren in Textilgewebe, werden in einem 1,5 ml PPN-Röhrchen mit 1-50 µl einer Lösung aus einem 4-8 M chaotropen Salz (Guanidinnydrochlorid, Guanidinisothiocyanat, Kaliumjodid), evtl. einem organischen Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Ether) und einem 1-100%igen Detergenz (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) versetzt. Anschließend werden 1-200 µg einer Protease zugefügt und es wird für 1 min. bei 70°C oder für längere Zeit bei niedrigeren Temperaturen (z. B. 10 min bei Raumtemperatur) inkubiert.

In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und Denaturierung und enzymatischer Abbau von Proteinen (gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen Proteine). Durch Zugabe von 1/2 Volumen eines 95-100%igen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) oder organischen Polymeren (PEG) werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt und das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird das Lysat sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet, wobei die Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder Gel partikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol, n- Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen, Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destilliertem (deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser Elutions verfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA direkt ohne weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in Folgereaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden kann.

Dieses Verfahren ist auch zur Präparation von Nucleinsäuren aus kleinsten Mengen anderer Körperflüssigkeiten (Sperma, Sputum, Urin, Stuhl, Schweiß, Speichel, Nasenschleim, Serum, Plasma, Liquor etc.) oder getrockneten Spuren derselben geeignet.

Beispiel 9 Gesamt-Nucleinsäure-Präparation aus Gewebe

100 µg bis 10 mg eines Gewebes werden in einem PPN-Röhrchen mit einer Lösung aus einem 4-8 M chaotropen Salz (Guanidin hydrochlorid, Guanidinisothiocyanat, Kaliumjodid), evtl. einem organischen Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Ether) und einem 5-100%igen Detergens (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) versetzt und mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Homogenisators oder durch Mörsern in flüssigem Stickstoff homogenisiert. Anschließend werden 100-1000 µg einer Protease zugefügt und es wird für 10-20 min. bei 70°C oder für längere Zeit bei niedrigeren Temperaruren (z. B. 30 - 60 min bei Raumtemperatur) inkubiert. In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryon tischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und Denaturierung und enzymatischer Abbau von Proteinen (gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen Proteine). Durch Zugabe von ½ Volumen eines 95-100%igen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt und das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird das Lysat sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet, wobei die Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder Gelpartikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen, Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destilliertem (deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser Elutions verfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA direkt ohne weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in Folge reaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden können.

Diese einfache Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren funktioniert reproduzierbar aus allen Geweben, u. a. auch aus Tumoren und weist ein hohes Automatisierungspotential, insbesondere in Verbindung mit den Anmeldungsgegenständen der DE-A-41 27 276.5, WO 93/11218, Wo 93/11211 und DE-A-41 39 664.2 des gleichen Anmelders auf.

Beispiel 10 Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Ein DNA-Fragment wird in einem Agarosegel (TAE oder TBE 0,5-2% aufgetrennt. Das zu isolierende DNA-Fragment wird aus dem Gel ausgeschnitten und in einem 1,5 ml Eppendorf-Gefäß mit 300 µl QX1 Puffer (7 M NaPO₄, 10 mM NaAc, pH 5,3) vermischt. Nach 10 minütiger Inkubation bei 50°C hat sich die Agarose aufgelöst. Diese Lösung wird auf eine Zentrifugen-Chromato graphiesäule nach Beispiel 1 gegeben und durchzentrifugiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird nun mittels Zentrifugieren von 80% Ethanol/Wasser durch die Säule salzfrei gewaschen und anschließend 1 min. zentrifugiert, um überschüssiges Ethanol komplett zu entfernen. Zur Elution werden 0,05 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Chromatographiesäule gegeben und durchzentrifugiert.

Beispiel 11 Reinigung von DNA-Fragmenten aus Polyacrylamid (PAA)-Gelen

Das zu isolierende DNA-Fragment wird aus dem PAA-Gel ausge schnitten und in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt, zer kleinert und mit 500 µl PAA-Elutionspuffer (500 mM NH₄Ac, 100 mM MgAc₂, 1 mM EDTA, 0-1% SDS) vermischt. Das Gemisch wird 30 min. bei 50°C inkubiert und anschließend mit 300 µl QX1 Puffer versetzt und über eine Zentrifugen-Chromatographie säule zentrifugiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird nun mit 80% Ethanol/Wasser salzfrei gewaschen und anschließend 1 min. zentrifugiert, um überschüssiges Ethanol komplett zu entfernen. Zur Elution werden 0,1 ml Elutions puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Chromatographiesäule gegeben und durchzentrifugiert.

Beispiel 12 Reinigung von großen (< 3000 bp) PCR-Fragementen

Eine 100 µl PCR-Amplifikationsreaktion wird mit 500 µl Puffer QXB (5 M GuHCl) vermischt, wobei ein vorheriges Abtrennen des den Reaktionsansatz überschichtenden Paraffinöls nicht nötig ist. Zur weiteren Aufreinigung wird wie in Beispiel 4 verfahren.

Beispiel 13 Reinigung von einzelsträngigen PCR-Produkten

Ein 100 µl Amplifikationsansatz einer asymmetrischen PCR wird mit 500 µl PB-Puffer (5 M GuHC, 30% Isopropanol) vermischt. Zur weiteren Aufreinigung wird wie in Beispiel 4 verfahren. Zur Elution werden 0,05 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Chromatographiesäule gegeben und durch zentrifugiert. Das Eluat enthält ca. 90% des einzelsträngigen PCR-Produktes, welches direkt für die zweite Amplifikation oder zum Sequenzieren eingesetzt werden kann.

Beispiel 14 Gesamt-Nucleinsäurepräparation aus Gewebe oder Zellen

Bis zu 50 mg eines Gewebes oder bis zu 10⁶ Zellen werden in 400 µl einer gepufferten chaotropen Lösung (4 M GTC, 25 mM Natriumcitrat pH 7,5, 2% 2-Mercaptoethanol) - gegebenenfalls versetzt mit einem 5-100%igem Detergens (NP40, Tween 20, Triton-X-100, SDS, CTAB, Sarkosyl) - homogenisiert. In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryontischer und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und Denaturierung von Proteinen (insbesondere Ribonucleasen; gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen Proteine). Durch Zugabe von 260 µl eines 100%igen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol) werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt. Das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen.

Anschließend werden Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Metabolite und Polysaccharide mit 700 µl eines Waschpuffers bestehend aus 1 M GTC, 25 mM Tris/HCl, pH 7,5, 40% eines Alkoholes (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Iso propanol) sowie 700 µl eines Waschpuffers bestehend aus 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 80% eines Alkoholes (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol) ausgewaschen. Die Nucleinsäuren werden entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris, pH 7,5) oder destilliertem (deionisiertem) Wasser eluiert.

Claims

1. Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen durch Adsorption der zu trennenden und reinigenden Nucleinsäuren aus einer Lösung, die eine hohe Salzkonzentration (Ionenstärke) und/oder eine hohe Alkoholkonzentration aufweist an einen Träger, gefolgt von einer Desorption von dem Träger mittels einer Lösung mit geringerer Salzkonzen tration (Ionenstärke), dadurch gekennzeichnet, daß das Nucleinsäuregemisch

- an einem porösen oder nicht porösen mineralischen Träger aus Metalloxiden und/oder Metallmisch oxiden, Silicalgel, Materialien, die überwiegend aus Glas bestehen, Aluminiumoxid, Zeolithe, Titandioxid, Zirkondioxid aus einer wäßrigen Adsorptionslösung mit hoher Salzkonzentration (Ionenstärke) und mit 1 bis 50 Vol.-% ali phatischen Alkohols einer Kettenlänge von C₁-C₅ und/oder Polyethylenglykol (PEG) und/oder hydro phobe, anorganische und/oder organische Polymere und/oder Trichloressigsäure (TCA) adsorbiert wird,
- gegebenenfalls mit einer Waschlösung gewaschen und danach
- mit einer Lösung geringerer Salzkonzentration (Ionenstärke) eluiert wird und die erhaltene Nucleinsäure oder Nucleinsäurefraktion gesammelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Salze in der Adsorptionslösung chaotrope Salze verwendet werden wie Natriumperchlorat, Guanidinhydrochlorid, Guanidin isothiocyanat, Natriumjodid in Konzentrationen von 1 bis 8 M.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die Ionenstärken der Salzlösungen mit 1 bis 10 M Lithium chlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumacetat, Reagenzien wie z. B. Harnstoff und/oder Mischungen davon eingestellt wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Partikelgröße des mineralischen Träger materials 0,1 µm bis 1000 µm beträgt.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei verwendete poröse mineralische Trägermaterialien eine Porengröße von 2 bis 1000 nm aufweisen.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die porösen oder nicht porösen Trägermaterialien in Form von losen Schüttungen vorliegen.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die porösen oder nicht porösen Trägermaterialien als Filterschichten ausgebildet sind in Form von Filterschichten aus Glas, Quarz oder Keramik und/oder einer Membran, in der Silicagel angeordnet ist und/oder als Partikel oder Fasern aus mineralischen Trägern und Geweben aus Quarz oder Glaswolle vorliegen.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die zu trennenden und zu reinigenden Nuclein säuren aus biologischen Quellen wie Zellkulturen, Geweben jeder Art, Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Faeces, Mikroorganismen wie Bakterien, insbesondere Mycobakteriumtuberkulosis, Viren wie Cytomegalie-Virus, HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis-8-Virus, stammen, die Nuclein säuren durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erhaltene Produkte, Plasmid-DNA, genomische DNA, RNA, Nuclein säuren aus Mikroorganismen wie Plasmid-DNA, chromo somale DNA oder RNA und/oder Nucleinsäuren aus Sequenz analysen sind.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nucleinsäuren nach Fraktionierung zu weniger als 10% kürzer als 10 kb sind.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Nucleinsäuren Oligonucleotide sind.

11. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Reinigung und Trennung von Nucleinsäurefragmenten nach Modifizierungsreaktionen.

12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 aus einem Hohlkörper mit Ein- und Auslaßöffnung, wobei im Lumen des Hohlkörpers eine Einrichtung angeordnet ist, die das Trägermaterial zur Adsorption der zu trennenden Nucleinsäuren fixiert, dadurch gekennzeichnet, daß

- die Einrichtung zwei übereinander angeordnete, einen Zwischenraum ausbildenden Polyethlenfritten sind, wobei das Trägermaterial zwischen den Polyethylenfritten angeordnet ist oder
- die Einrichtung eine selbsttragende Membran ist, in welcher das Trägermaterial eingebettet ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Befestigung der Einrichtungen im Lumen des Hohlkörpers durch Reibungs und/oder Spannungskräfte und/oder durch Fixierung mit einem Spannring erfolgt.

14. Wäßrige Lösung enthaltend Salze hoher Konzentrationen und 1-50 Vol-%, C₁-C₅ Alkohole und/oder PEG und/oder hydrophobe anorganische und/oder organische Polymere.

15. Verwendung einer Lösung nach Anspruch 13 als Puffer lösung zur Bindung von Nucleinsäuren an mineralische Träger aus Nucleinsäuren enthaltenden Gemischen.

16. Zusammenstellungen in Kitform enthaltend eine wäßrige Lösung nach Anspruch 14 sowie Vorrichtungen nach einem der Ansprüche 12 und/oder 13.