DE4321904A1

DE4321904A1 - Process for the chromatographic purification and separation of nucleic acid mixtures

Info

Publication number: DE4321904A1
Application number: DE4321904A
Authority: DE
Inventors: Petra Feuser; Ralf Dr Hermann; Joachim Dr Schorr; Metin Dr Colpan; Helge Dr Bastian
Original assignee: DIAGEN INST MOLEKULARBIO
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 1995-01-12
Anticipated expiration: 2013-07-02
Also published as: DE59409712D1; EP0658164B1; CA2142910A1; DE4321904B4; EP0658164A1; WO1995001359A1; DK0658164T3; ES2155477T3; PT658164E; CA2142910C; US6383393B1; JPH08501321A; ATE200293T1

Abstract

A method for the purification and separation of nucleic acid mixtures by chromatography including adsorbing the nucleic acids to be separated and purified from a solution with a high concentration of salts (ionic strength) and/or a high concentration of alcohol on a substrate and subsequent desorbing from the substrate by means of a solution with lower concentration of salts (ionic strength).

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäure gemischen gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1, die Verwendung des Verfahrens zur Reinigung von Nucleinsäurefragmenten, die Modifizierungsreaktionen unterzogen worden sind, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, eine wäßrige Lösung, die im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar ist sowie die Verwendung dieser Lösung.The present invention relates to a method for chromatographic purification and separation of nucleic acid mixtures according to the preamble of claim 1, the use the procedure for the purification of nucleic acid fragments, the Modification reactions have been subjected to Device for carrying out the method, an aqueous one Solution that can be used in the method according to the invention as well as using this solution.

Die Adsorption von Nucleinsäuren an Glas- oder Silicagelpar tikeln in Gegenwart von chaotropen Salzen ist bekannt (Vogel stein, B. and Gillespie, D. (1979) Preparative and analytical purification of DNA from agarose., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615-619). Gemäß dieser Methode wird DNA aus Agaros egelen sowie RNA- und DNA-Präparate aus verschiedenen Extrak ten unter Verwendung von hohen Konzentrationen chaotroper Salze in Natriumiodid, Natriumperchlorat oder Guanidin thiocyanat isoliert und gereinigt (Boom, R. et al. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 und Yamado, O. et al. (1990) A new method for extracting DNA or RNA for polymerase chain reaction. J. Viro. Methods 27, 203-210). Zwar sind die genauen pysikalischen Vorgänge, die zu einer Adsorption der Nucleinsäuren in Gegenwart chaotroper Reagenzien an mineralische Träger führen nicht im Detail geklärt, jedoch geht man davon aus, daß die Ursache für die Adsorption in der Störung übergeordneter Strukturen des wäßrigen Milieus zu suchen ist. Dabei wird die in Lösung befindliche Nuclein säure an der Oberfläche der Glas- bzw. Silicalgelpartikel adsorbiert oder denaturiert. Die Adsorption ist in Anwesen heit von hohen Konzentrationen chaotroper Salze fast quanti tativ. Die Elution der adsorbierten Nucleinsäuren erfolgt in Anwesenheit von Puffern mit geringer Ionenstärke (Salz konzentration). Durch die Verfahren des Standes der Technik werden Nucleinsäurefragmente einer Größe von 200 bis 3000 Basenpaaren (bp) ermöglicht. Es war bislang jedoch nicht möglich, kurze einzel- oder doppelsträngige Nucleinsäurefrag mente (100 bp und kleiner) von sehr kurzen (20 bis 40 Nucleo tide) einzelsträngigen Oligonucleotiden (Primern) quantitativ zu trennen.The adsorption of nucleic acids on glass or silica gel par particles in the presence of chaotropic salts is known (Vogel stein, B. and Gillespie, D. (1979) Preparative and analytical purification of DNA from agarose., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615-619). According to this method, DNA is made from Agaros leeches as well as RNA and DNA preparations from various extracts using high concentrations of chaotropic Salts in sodium iodide, sodium perchlorate or guanidine thiocyanate isolated and purified (Boom, R. et al. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 and Yamado, O. et al. (1990) A new method for extracting DNA or RNA for polymerase chain reaction. J. Viro. Methods 27, 203-210). Although are the exact physical processes leading to adsorption of the nucleic acids in the presence of chaotropic reagents mineral carriers do not clarify in detail, however one assumes that the cause of the adsorption in the disturbance of superordinate structures of the aqueous environment is to be found. The nuclein in solution acidity on the surface of the glass or silica gel particles adsorbed or denatured. The adsorption is in property of high concentrations of chaotropic salts almost quanti tative. The adsorbed nucleic acids are eluted in the presence of buffers with low ionic strength (salt concentration). By the methods of the prior art become nucleic acid fragments of a size from 200 to 3000 Base pairs (bp). However, it has not been so far possible short single or double stranded nucleic acid question elements (100 bp and smaller) of very short (20 to 40 nucleos tide) single-stranded oligonucleotides (primers) quantitative to separate.

Diese Nucleinsäuregemische entstehen typischerweise als Amplifikationsprodukte zum Beispiel gemäß der Polymerase kettenreaktion (PCR). Die aus dieser Reaktion entstehenden Produkte werden häufig anschließend molekularbiologisch analysiert, indem die üblichen Techniken wie DNA-Sequen zierung, DNA-Hybridisierung, Klonierung, Restriktion und Transformation durchgeführt werden. Damit lassen sich analytische Parameter wie Aussagen über Genmutationen für die genetische Beratung oder Erregernachweise in der medi zinischen Diagnostik (HIV) gewinnen. Um das Potential dieser Diagnostikverfahren nutzen zu können, ist eine quantitative Trennung bzw. Reinigung dieser häufig recht kleinen DNA- Fragmente (100 Basenpaare) sehr wichtig.These mixtures of nucleic acids typically arise as Amplification products, for example according to the polymerase chain reaction (PCR). The resulting from this reaction Products often become molecular biological afterwards analyzed using common techniques such as DNA sequences ornamentation, DNA hybridization, cloning, restriction and Transformation. With that you can analytical parameters such as statements about gene mutations for genetic counseling or pathogen detection in medi win clinical diagnostics (HIV). To the potential of this Being able to use diagnostic procedures is quantitative Separation or purification of these often very small DNA Fragments (100 base pairs) very important.

Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Reinigungsmethoden basieren auf der Ultrafiltration, der High Pressure Liquid Chromatoaranhy (HPLC) oder der Extraktion von Nucleinsäure fragmenten aus Agarosegelen in Anwesenheit chaotroper Salze durch Niederschlagen auf Glas- oder Silicagelpartikel. Diese Methoden sind jedoch nur mit niedriger Effizienz zur Trennung von Nucleinsäuregemischen bestehend beispielsweise aus einem kurzen doppelsträngigen DNA-Fragment (100 bp) und einem kleineren einzelsträngigen Oligonucleotid (zum Beispiel 39 mer) geeignet.The cleaning methods currently available are based on ultrafiltration, the high pressure liquid Chromatoaranhy (HPLC) or the extraction of nucleic acid fragments from agarose gels in the presence of chaotropic salts by depositing on glass or silica gel particles. These However, methods are only with low efficiency for separation of nucleic acid mixtures consisting, for example, of one short double-stranded DNA fragment (100 bp) and one smaller single-stranded oligonucleotide (e.g. 39 suitable).

Das technische Problem der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem es möglich ist, die oben genannten Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden. Gelöst wird das Problem durch ein Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die darauf folgenden Unteransprüche 2 bis 8 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Ver fahrens.The technical problem of the present invention exists in providing a method by which it is possible the above-mentioned disadvantages of the prior art avoid. The problem is solved by a method for chromatographic purification and separation of Nucleic acid mixtures according to the features of claim 1. The subsequent sub-claims 2 to 8 relate preferred embodiments of the Ver driving.

Der Anspruch 9 betrifft eine Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Reinigung von Nucleinsäurefragmenten nach Modifizierungsreaktionen. Der Anspruch 11 betrifft eine Vor richtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Anspruch 12 betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Der Anspruch 14 betrifft eine wäßrige Lösung verwendbar im erfindungsgemäßen Verfahren und Anspruch 16 betrifft eine Zusammenstellung der Komponenten gemäß Anspruch 15 und Anspruch 11.The claim 9 relates to a use of the invention Process for the purification of nucleic acid fragments Modification reactions. The claim 11 relates to a front direction for performing the method according to the invention and claim 12 relates to a preferred embodiment of the device according to the invention. The claim 14 relates to a aqueous solution usable in the inventive method and Claim 16 relates to a compilation of the components according to claim 15 and claim 11.

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die an sich bekannte Eigenschaft von Nucleinsäuren aus, in Gegenwart chaotroper Salze, Salzlösungen hoher Ionenstärke (hoher Kon zentrationen), Reagenzien wie z. B. Harnstoff oder von Mischungen dieser Substanzen auf mineralischen Träger niederzuschlagen und durch Einwirkung von Lösungen geringer Ionenstärke (Salzkonzentration) zu eluieren. So schlägt die PCT/EP 92/02775 der Anmelderin vor, ein Nucleinsäuregemisch zunächst in einem Medium niederer Ionenstärke auf einem Anionenaustauschermaterial zu adsorbieren, danach die Nucleinsäure mit einem Puffer höherer Ionenstärke zu desorbieren und danach im Puffer mit dieser höheren Ionenstärke in Gegenwart von niederen Alkoholen und/oder Polyethylenglycol und/oder Trichloressigsäure (TCA) die Nucleinsäuren auf einem mineralischen Trägermaterial zu adsorbieren. Die Nucleinsäuren werden dann vorzugsweise mit Wasser oder einer Pufferlösung geringer Ionenstärke eluiert.The method according to the invention uses the known one Property of nucleic acids in the presence of chaotropic Salts, salt solutions of high ionic strength (high con concentrations), reagents such as B. urea or of Mixtures of these substances on mineral carriers to precipitate and lower through the action of solutions To elute ionic strength (salt concentration). This is how it beats PCT / EP 92/02775 by the applicant, a nucleic acid mixture initially in a medium of low ionic strength on one To adsorb anion exchange material, then the Nucleic acid with a buffer of higher ionic strength desorb and then in the buffer with this higher one Ionic strength in the presence of lower alcohols and / or Polyethylene glycol and / or trichloroacetic acid (TCA) die Nucleic acids on a mineral carrier material adsorb. The nucleic acids are then preferably with Water or a buffer solution of low ionic strength eluted.

Es hat sich nun herausgestellt, daß zur Trennung von Nuclein säuren die vorherige Reinigung an Anionenaustauscher materialien unterbleiben kann. Überraschenderweise läßt sich auch durch die Adsorption von Nucleinsäuren in Gegenwart chaotroper Salze hoher Konzentration und Desorption der Nucleinsäuren mit Lösungen geringer Ionenstärke eine hervor ragende Fraktionierung eines Nucleinsäuregemisches erzielen.It has now been found that for the separation of nuclein acidify the previous cleaning on anion exchangers materials can be omitted. Surprisingly, also by the adsorption of nucleic acids in the presence chaotropic salts of high concentration and desorption of Nucleic acids with solutions of low ionic strength achieve excellent fractionation of a nucleic acid mixture.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es mithin er möglicht, in einem Arbeitsschritt durch Adsorption der zu trennenden Nucleinsäuren und Elution in effizienter Weise interessierende Nucleinsäurefraktionen zu erhalten, ohne vorherige Reinigungsschritte.By the method according to the invention it is therefore he possible to adsorb in one step separating nucleic acids and elution in an efficient manner to obtain nucleic acid fractions of interest without previous cleaning steps.

Sollen nucleinsäurehaltige Proben als Quellen der zu reini genden und isolierenden Nucleinsäuren dienen, werden diese Quellen in an sich bekannter Weise aufgeschlossen, beispiels weise durch Detergenzbehandlung oder mechanische Einflüsse wie Ultraschall oder Zerkleinern. Dabei kann die zur Aufnahme der Nucleinsäuren verwendete Lösung bereits chaotrope Salze in hoher Konzentration enthalten. Nach Entfernung eventuell vorhandener grober Zellbestandteile durch Zentrifugation oder Filtration (WO 93/11218 und WO 93/11211) wird die Lösung dann mit einem mineralischen Trägermaterial in Kontakt gebracht, um aus der Lösung mit hoher Ionenstärke chaotroper Salze die Nucleinsäuren auf dem mineralischen Träger zu adsorbieren. Samples containing nucleic acid are to be used as sources of purity serve and isolating nucleic acids, they will Open sources in a known manner, for example wise through detergent treatment or mechanical influences like ultrasound or crushing. It can be used for recording of the nucleic acids used already chaotropic salts Contained in high concentration. Possibly after removal existing coarse cell components by centrifugation or Filtration (WO 93/11218 and WO 93/11211) then becomes the solution brought into contact with a mineral carrier material, to transform the solution with high ionic strength into chaotropic salts Adsorb nucleic acids on the mineral support.

Eine Abwandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, den Aufschluß der Nucleinsäuren direkt in dem Puffersystem, das zur Adsorption eingesetzt wird, durch zuführen. Dann wird eine besonders günstige Nucleinsäure verteilung gewinnbar.A modification of the method according to the invention exists in the digestion of the nucleic acids directly in the Buffer system that is used for adsorption by respectively. Then a particularly favorable nucleic acid distribution obtainable.

Üblicherweise werden Nucleinsäuren aus eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen (darunter auch Protozoen und Pilze) und/oder aus Viren gewonnen. Dabei werden die Zellen und/oder Viren beispielsweise unter stark de naturierenden und gegebenenfalls reduzierenden Bedingungen aufgeschlossen (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, S., 1982, Molecular Clonin Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor).Usually nucleic acids from eukaryotic and / or prokaryotic cells (including protozoa and fungi) and / or obtained from viruses. The Cells and / or viruses, for example under strongly de naturing and possibly reducing conditions open-minded (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, S., 1982, Molecular Clonin Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor).

Weit verbreitet ist der Aufschluß der Zellen mit Detergenzien als denaturierende Reagenzien und die Verwendung von be stimmten Enzymen zum Abbau der Proteinstrukturen und nuclein säurespaltenden Enzymen. So werden beispielsweise Natrium dodecylsulfat (SDS) und EDTA als denaturierende Agenzien verwendet und Proteinase K zum Abbau von Proteinen. Das Ergebnis dieses Aufschlußverfahrens ist meistens eine hochviskose gallertartige Struktur, aus der die Nucleinsäuren mittels Phenolextraktion isoliert werden. Die Nucleinsäuren bleiben dabei in großer Länge erhalten und werden nach Dialyse und Präzipitation aus der wäßrigen Phase entfernt. Dieses Aufschlußverfahren ist gegenüber Nicht-Nucleinsäure- Strukturen so aggressiv, daß dem Verfahren auch Gewebestücke unterworfen werden können.Disintegration of cells with detergents is widespread as denaturing reagents and the use of be agreed enzymes to break down the protein structures and nuclein acid-splitting enzymes. For example, sodium dodecyl sulfate (SDS) and EDTA as denaturing agents used and proteinase K to break down proteins. The The result of this digestion process is usually one highly viscous gelatinous structure from which the nucleic acids be isolated by means of phenol extraction. The nucleic acids remain in great length and become Dialysis and precipitation removed from the aqueous phase. This digestion process is compared to non-nucleic acid Structures so aggressive that the process also involves pieces of tissue can be subjected.

Wegen der arbeitsintensiven Technik mit mehrfachem Wechsel der Reaktionsgefäße ist diese Methode jedoch für große Probenaufkommen und Routinepräparationen ungünstig. Dieses Verfahren ist zwar automatisierbar, jedoch bewältigt eine handelsübliche Apparatur gegenwärtig etwa 8 Proben gleich zeitig in vier Stunden (Applied Biosystems A 371). Das Verfahren ist somit teuer und eignet sich nicht für die Durchschleusung großer Probenserien. Weiterhin ist nach teilig, daß die Folgereaktionen, wie enzymatische Amplifi kation, infolge der großen Längen der isolierten Nuclein säuren gestört sind. Darüber hinaus sind die anfallenden Lösungen hochviskos und schwer handhabbar. Insbesondere DNA sehr großer Länge ist eher störend, da die mit dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik gewonnenen Nucleinsäuren ge sondert zerkleinert werden müssen, um weiterverarbeitet werden zu können.Because of the labor-intensive technology with multiple changes of the reaction vessels, however, this method is for large ones Sample volumes and routine preparations are unfavorable. This Although the process can be automated, one can do it commercial equipment currently about 8 samples the same early in four hours (Applied Biosystems A 371). The The process is therefore expensive and is not suitable for Passing through large sample series. Furthermore is after partly that the subsequent reactions, such as enzymatic amplifi cation, due to the long lengths of the isolated nuclein acids are disturbed. In addition, the accruing Solutions highly viscous and difficult to handle. Especially DNA very long length is rather annoying because of the procedure nucleic acids obtained according to the prior art secretes need to be crushed to be processed to be able to.

Der Aufschluß von eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren in alkalischem Milieu in Gegenwart von Detergenzien, ist technisch zwar einfach, liefert jedoch auch Nucleinsäuren mit großer Länge, die wie oben geschildert von Nachteil sind.Digestion of eukaryotic and / or prokaryotic Cells and / or viruses in an alkaline environment in the presence of Detergents is technically simple, but also delivers Long length nucleic acids as described by Disadvantage are.

An die Rohpräparation der Nucleinsäuren schließen sich Folge reaktionen an. Diese Folgereaktionen erfordern eine bestimmte Qualität der Nucleinsäuren. So müssen diese weitestgehend unversehrt sein, die Ausbeute der Präparation muß hoch und reproduzierbar sein, außerdem müssen die Nucleinsäuren in hoher Reinheit, frei von Proteinen und Zellmetaboliten vorliegen. Der Präparationsweg muß einfach und wirtschaftlich sein und die Möglichkeit zur Automation bieten. Die Prä paration der Nucleinsäuren muß ohne die Gefahr von Kreuz kontamination anderer Proben möglich sein, insbesondere wenn enzymatische Amplifikationsreaktionen, wie Polymerase Chain Reaction (PCR) (Saiki, r., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, s.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. & Ehrlich, H.A. (1988), Science 239, 487-491) und Ligase Chain Reaction (LCR) (EP-A-8 83 11 741.8), Anwendung finden. Für diese Folgereaktionen ist es wünschenswert, die Nuclein säuren in nicht zu großer Kettenlänge zu erhalten, die Zellen möglichst quantitativ aufzuschließen und im übrigen die oben genannten Nachteile der im Stand der Technik bekannten Aufschlußverfahren zu vermeiden. This is followed by the crude preparation of the nucleic acids reactions. These subsequent reactions require a specific one Quality of the nucleic acids. So they have to be as far as possible be intact, the preparation must be high and be reproducible, and the nucleic acids must also be in high purity, free of proteins and cell metabolites available. The preparation route must be simple and economical be and offer the possibility of automation. The pre The nucleic acids must be separated without the risk of cross contamination of other samples may be possible, especially if enzymatic amplification reactions such as polymerase chain Reaction (PCR) (Saiki, r., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, s.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. & Ehrlich, H.A. (1988) Science 239, 487-491) and ligase Chain Reaction (LCR) (EP-A-8 83 11 741.8) find application. For these subsequent reactions it is desirable to use the nuclein to maintain acids in not too long chain length, the cells open up as quantitatively as possible and the rest of the above mentioned disadvantages of the known in the prior art To avoid digestion processes.

Es ist mithin wünschenswert, daß ein Verfahren die Isolierung und Konzentrierung von Nucleinsäuren aus intakten eukaryon tischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren oder aus Körperflüssigkeiten ermöglicht. Insbesondere soll die dabei anfallende Nucleinsäure sich durch nicht zu große Kettenlängen auszeichnen, in wenigen Schritten isolierbar sein und direkt den erforderlichen Folgereaktionen unter worfen werden können.It is therefore desirable that a method of isolation and concentration of nucleic acids from intact eukaryons tables and / or prokaryotic cells and / or viruses or from body fluids. In particular, the the resulting nucleic acid is not too large Mark chain lengths, isolable in just a few steps be and directly under the required follow-up reactions can be thrown.

Die weiter oben angegebene Modifikation des erfindungsgemäßen Verfahrens die dies ermöglicht, besteht darin, daß die Quellen der Nucleinsäuren wie eukaryontische und/oder prokaryontische Zellen und/oder Viren lysiert werden.The modification of the invention specified above The method that makes this possible is that the Sources of nucleic acids such as eukaryotic and / or prokaryotic cells and / or viruses are lysed.

Der Aufschluß nucleinsäurehaltiger Quellen, wie eukaryon tische und/oder prokaryontische Zellen und/oder Viren, kann dabei vorzugsweise durch physikalische oder chemische Einwirkung erfolgen. Dabei kann die Lyse entweder mechanisch wie mit Ultraschall oder durch osmotischen Schock oder chemisch mittels Detergenzien und/oder chaotropen Agenzien und/oder organischen Lösungsmitteln (z. B. Phenol, Chloroform, Ether) oder alkalischem Aufschluß erreicht werden.Digestion of sources containing nucleic acids, such as eukaryon table and / or prokaryotic cells and / or viruses, can preferably by physical or chemical Influence. The lysis can either be mechanical like with ultrasound or by osmotic shock or chemically using detergents and / or chaotropic agents and / or organic solvents (e.g. phenol, chloroform, Ether) or alkaline digestion.

Diese Verfahrensweise führt zur Präparation von Nucleinsäuren mit hoher Reinheit und erlaubt es, eine qualitativ und quantitativ reproduzierbare Analytik durchzuführen, insbesondere in Kombination mit enzymatischen Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren. Es hat sich gezeigt, daß Aufschlußmethoden mit Detergenzien und/oder chaotropen Agenzien, konzentrierten Salzlösungen, Reagenzien wie Harnstoff, Mischungen dieser Substanzen und/oder organischen Lösungsmitteln oder physikalische Aufschlußmethoden, wie Erhitzen einer Probe, die Folgeanwendungen erleichtert. Man erhält bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Beispiel kürzere zelluläre DNA (< 50 kb) beziehungsweise Gesamtnucleinsäuren aus Zellen und/oder Viren und/oder Körperflüssigkeiten. Die Reinigungsmethode (d. h. die Be dingungen der Bindung und Elution der Nucleinsäuren) führt zu einer Fragmentierung der Nucleinsäuren.This procedure leads to the preparation of nucleic acids with high purity and allows a qualitative and perform quantitatively reproducible analysis, especially in combination with enzymatic processes for Amplification of nucleic acids. It has been shown that Digestion methods with detergents and / or chaotropic Agents, concentrated salt solutions, reagents such as Urea, mixtures of these substances and / or organic Solvents or physical digestion methods, such as Heating a sample that facilitates follow-up applications. Man receives when using the method according to the invention Example of shorter cellular DNA (<50 kb) respectively Total nucleic acids from cells and / or viruses and / or Body fluids. The cleaning method (i.e. loading conditions of binding and elution of the nucleic acids) fragmentation of the nucleic acids.

Die Kombination aus chaotropen Agenzien hoher Ionenstärke und hydrophoben organischen oder anorganischen Polymeren und/oder Alkoholen und/oder Trichloressigsäure (TCA) im Ad sorptionspuffer gewährleistet, daß die Nucleinsäuren im Gegensatz zu herkömmlichen Reinigungsverfahren nach der Lyse quantitativ und hochspezifisch an der Oberfläche des minera lischen Trägermaterials wie Quarzfasern fixiert werden und so vor weiterführenden Angriffen der Nucleasen geschützt sind, während kontaminierende Bestandteile des Lysates nicht binden. In diesem fixierten Zustand der Nucleinsäuren können restliche kontaminierende Bestandteile leicht ausgewaschen werden, gefolgt von der Elution der sauberen Nucleinsäure in einem kleinen Volumen. Man erhält so reproduzierbare Kettenlängen von durchschnittlich 20 bis 40 kb. Weniger als 10% sind kürzer als 10 kb unter den Aufschlußbedingungen, wie sie in den Beispielen 7 bis 9 beschrieben werden. Dies stellt eine optimale Längenverteilung für eine anschließende enzymatische Nucleinsäureamplifikation dar.The combination of chaotropic agents with high ionic strength and hydrophobic organic or inorganic polymers and / or alcohols and / or trichloroacetic acid (TCA) in the ad sorption buffer ensures that the nucleic acids in the Contrary to conventional cleaning processes after lysis quantitative and highly specific on the surface of the minera mischen carrier material such as quartz fibers are fixed and protected against further attacks by the nucleases while contaminating components of the lysate are not tie. In this fixed state the nucleic acids can remaining contaminating components easily washed out followed by elution of the clean nucleic acid in a small volume. You get reproducible Chain lengths of 20 to 40 kb on average. Less than 10% are shorter than 10 kb under the digestion conditions, as described in Examples 7 to 9. This provides an optimal length distribution for a subsequent enzymatic nucleic acid amplification.

Die spezielle Kombination von Salzen, insbesondere chaotropen Agenzien, und Alkoholen ermöglicht es erstmals, Nucleinsäuren eines breiten Kettenlängenspektrums (10-100 000 Basenpaare) gleichzeitig zu isolieren und zu reinigen.The special combination of salts, especially chaotropic ones Agents, and alcohols allow nucleic acids for the first time a wide range of chain lengths (10-100,000 base pairs) isolate and clean at the same time.

Die wäßrige Adsorptionslösung hoher Salzkonzentration enthält 1 bis 50 Vol.-% aliphatischen Alkohols einer Kettenlänge von 1 bis 5 C-Atomen oder Polyethylenglykol.The aqueous adsorption solution contains high salt concentration 1 to 50 vol .-% aliphatic alcohol with a chain length of 1 to 5 carbon atoms or polyethylene glycol.

Als mineralische Träger kommen poröse oder nicht poröse Materialien auf Basis von Metalloxiden und Metallmischoxiden in Frage, wie solche aus Silicagel, Materialien, die über wiegend aus Glas bestehen, Aluminiumoxid, Zeolithe, Titan dioxid, Zirkondioxid. Porous or non-porous come as mineral carriers Materials based on metal oxides and mixed metal oxides in question, such as those made of silica gel, materials that have consist mainly of glass, aluminum oxide, zeolites, titanium dioxide, zirconium dioxide.

Gegebenenfalls kann das mineralische Trägermaterial mit den daran adsorbierten Nucleinsäuren mit einer Lösung gewaschen werden, die aufgrund eines relativ hohen Alkoholgehaltes eine Desorption der Nucleinsäuren verhindert.If necessary, the mineral carrier material with the nucleic acids adsorbed thereon are washed with a solution be a due to a relatively high alcohol content Prevents desorption of the nucleic acids.

Danach werden die adsorbierten Nucleinsäuren mit einem Puffer geringer Salzkonzentration (Ionenstärke) eluiert und die erhaltenen Nucleinsäuren oder Nucleinsäurefraktionen ge sammelt.After that, the adsorbed nucleic acids with a buffer low salt concentration (ionic strength) elutes and the obtained nucleic acids or nucleic acid fractions collects.

Als chaotrope Salze kommen Natriumperchlorat, Guanidin hydrochlorid (GuHCl), Guanidinisothiocyanat (GTC), Kalium iodid in Konzentrationen von 1 bis 8 M in Betracht. Nutzbar sind ebenfalls konzentrierte Salzlösungen < 1 M NaCl, KCl, LiCl etc., Reagenzien wie beispielsweise Harnstoff (< 1 M) und Kombinationen dieser Bestandteile. Die in der Lösung der chaotropen Salze vorhandenen niederen Alkohole sind Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol und Pentanol in Mengen von 1 bis 50%, insofern sie in diesen Bereichen mit Wasser mischbar sind. Die vorzugsweise verwendbaren Ethylenglykole weisen Molekulargewichte von 1000 bis 100 000, insbesondere von 6000 bis 8000 auf. Das Polyethylenglykol kann dem Puffer hoher Ionenstärke in Mengen von 1 bis 30% zugesetzt sein.Sodium perchlorate and guanidine come as chaotropic salts hydrochloride (GuHCl), guanidine isothiocyanate (GTC), potassium Iodide in concentrations of 1 to 8 M into consideration. Usable are also concentrated salt solutions <1 M NaCl, KCl, LiCl etc., reagents such as urea (<1 M) and combinations of these components. The solution in the lower alcohols present in chaotropic salts are methanol, Ethanol, isopropanol, butanol and pentanol in quantities of 1 up to 50% insofar as they are in these areas with water are miscible. The preferably usable ethylene glycols have molecular weights of 1000 to 100,000, in particular from 6000 to 8000. The polyethylene glycol can High ionic strength buffers are added in amounts of 1 to 30% his.

Die Partikelgröße der mineralischen Trägermaterialien beträgt vorzugsweise 0,1 µm bis 1000 µm. Werden poröse mineralische Träger verwendet wie beispielsweise poröses Silicagel, poröses Glas, poröses Aluminiumoxid, Zeolithe weisen die Poren vorzugsweise eine Porengröße von 2 bis 1000 nm auf. Das Trägermaterial kann beispielsweise in Form loser Schüttungen vorliegen und mit den die zu trennenden und reinigenden Nucleinsäuren enthaltenden Lösungen in Kontakt gebracht werden.The particle size of the mineral carrier materials is preferably 0.1 µm to 1000 µm. Become porous mineral Carrier used such as porous silica gel, porous glass, porous aluminum oxide, zeolites have the Pores preferably have a pore size of 2 to 1000 nm. The carrier material can, for example, be in the form of bulk There are fillings and with which to separate and solutions containing cleaning nucleic acids in contact to be brought.

Vorzugsweise sind jedoch die porösen und nicht porösen Trägermaterialien als Filterschichten ausgebildet und in einem Hohlkörper mit Ein- und Auslaßöffnung angeordnet. Die Filterschichten bestehen entweder aus gerichteten (gewebten) oder ungerichteten Fasern aus Glas, Quarz, Keramik oder anderen Materialien wie Mineralien oder aus einer Membran, in der Silicagel angeordnet ist.However, the porous and non-porous are preferred Carrier materials designed as filter layers and in a hollow body with inlet and outlet opening. The Filter layers consist of either directional (woven) or undirected fibers made of glass, quartz, ceramic or other materials like minerals or from a membrane, is arranged in the silica gel.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in hervorragender Weise geeignet, Nucleinsäuregemische zu trennen, insbesondere auch kurzkettige Nucleinsäuren, die sich in den Kettenlängen nur geringfügig unterscheiden. So lassen sich beispielsweise DNA- Fragmente einer Größe von beispielsweise 100 bp von kleineren einzelsträngigen Oligonucleotiden zum Beispiel einem 39 mer trennen. Dabei wird die DNA-Ausbeute dann um 60 bis 70% gesteigert, verglichen mit anderen konventionellen Reini gungsmethoden, wie Ultrafiltration, HPLC oder Verwendung chaotroper Salze allein.The process according to the invention is excellent suitable to separate nucleic acid mixtures, in particular also short chain nucleic acids that are only in chain lengths differ slightly. For example, DNA Fragments of, for example, 100 bp in size from smaller ones single stranded oligonucleotides for example a 39 mer separate. The DNA yield is then increased by 60 to 70% increased compared to other conventional Reini tion methods, such as ultrafiltration, HPLC or use chaotropic salts alone.

Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem der Aufschluß der Nucleinsäuren enthaltenden Quellen im Aufnahme- (Adsorptions-)puffer erfolgt, wird eine Nucleinsäure präparation mit bestimmten Längenspektrum der Nucleinsäure möglich.When using the method according to the invention, in which the Digestion of the sources containing nucleic acids in the (Adsorption) buffer occurs, becomes a nucleic acid preparation with certain length spectrum of the nucleic acid possible.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, Nucleinsäure gemische jeglicher Herkunft zu bearbeiten. So lassen sich Nucleinsäuren aus biologischen Quellen wie Geweben jeder Art, Körperflüssigkeiten wie Blut, Faeces nach entsprechender Probenvorbereitung, die jedenfalls eine Aufnahme der Probe in einer Lösung hoher Salzkonzentration, vorzugsweise hoher Konzentration an chaotropen Ionen umfaßt, gewinnen. Auch Nucleinsäuren, die durch chemische Reaktionen entstanden sind, wie solche, die durch Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten wurden oder Plasmid-DNA, genomische DNA und RNA und/oder Nucleinsäuren, die aus Mikroorganismen stammen, lassen sich erfindungsgemäß trennen und reinigen. The method according to the invention allows nucleic acid to process mixtures of any origin. So you can Nucleic acids from biological sources such as tissues of any kind, Body fluids such as blood, faeces after appropriate Sample preparation, which in any case is a recording of the sample in a solution of high salt concentration, preferably high Concentration of chaotropic ions includes, gain. Also Nucleic acids created by chemical reactions are like those made by polymerase chain reaction (PCR) were obtained or plasmid DNA, genomic DNA and RNA and / or nucleic acids derived from microorganisms, can be separated and cleaned according to the invention.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ebenfalls geeignet, sogenannte Plasmid-DNA-Minipräparationen aus Escherichia Coli für die anschließende Klonierung oder Sequenzierung zu verwenden; ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von DNA und/oder RNA aus Vollblut, Plasma, Serum, Geweben, Zellkultur, Bakterien, insbesondere Mycobakterium tuberlosis, Viren wie Cytomegalie-Virus (Nucleinsäure DNA) aus RNA-Viren wie HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis-δ. Nucleinsäuren im Sinne des er findungsgemäßen sind auch Oligonucleotide. Die Nucleinsäuren können desweiteren aus Sequenzierreaktionen oder anderen vergleichbaren Reaktionen stammen. Die Präparation von DNA oder RNA aus Vollblut ist inbesondere geeignet zur an schließenden HIA-Typisierung. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Isolierung von Nucleinsäuren aus Mycobakterium tuberkulosis. Hierbei müssen recht drastische Aufschlußmethoden eingehalten werden, wobei konventionelle Isolierungstechniken nur unbefriedigende Resultate liefern.The method according to the invention is also suitable so-called plasmid DNA mini-preparations from Escherichia Coli for subsequent cloning or sequencing use; the invention is also suitable Process for isolating DNA and / or RNA from whole blood, Plasma, serum, tissues, cell culture, bacteria, in particular Mycobacterium tuberlosis, viruses such as cytomegalovirus (Nucleic acid DNA) from RNA viruses such as HIV, hepatitis B, Hepatitis C, hepatitis δ. Nucleic acids in the sense of he inventive are also oligonucleotides. The nucleic acids can also from sequencing reactions or others comparable reactions. The preparation of DNA or RNA from whole blood is particularly suitable for closing HIA typing. The method according to the invention is particularly suitable for the isolation of nucleic acids from Mycobacterium tuberculosis. This must be right drastic digestion methods are followed, whereby conventional insulation techniques only unsatisfactory Deliver results.

Eine im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise zu ver wendende Vorrichtung ist ein insbesondere zylindrischer Hohlkörper mit einer Ein- und Auslaßöffnung. In der Nähe der Auslaßöffnung, in Fließrichtung der Lösung durch den Hohlkörper gesehen, ist das mineralische Trägermaterial angeordnet, an welchem die Nucleinsäuren zu adsorbiert werden. Eine Einrichtung, die in einer bevorzugten Aus führungsform aus zwei übereinander angeordneten, einen Zwischenraum bildenden Polyethylenfritte besteht, fixiert das Trägermaterial, welches sich im Zwischenraum zwischen den Polyethylenfritten befindet, in dem Lumen des Hohl körpers. Die Einrichtung zur Befestigung des Trägermaterials kann auch eine selbsttragende Membran sein, in der das Trägermaterial eingebettet ist. Die Befestigung des Träger materials bzw. der Einrichtungen, die das Trägermaterial fixieren, kann durch Reibungs- oder Spannungskräfte, wie sie beispielsweise durch Einklemmen dieser Einrichtungen in dem Hohlkörper entstehen, bewirkt werden und/oder durch eine Fixierung der Einrichtungen mit einem Spannring erfolgen.A ver preferably in the inventive method turning device is a particularly cylindrical Hollow body with an inlet and outlet opening. Near the Outlet opening, in the direction of flow of the solution through the Seen as a hollow body is the mineral carrier material arranged, on which the nucleic acids to be adsorbed become. A facility that is in a preferred off leadership form of two one above the other There is a gap between the polyethylene frit the carrier material, which is in the space between the polyethylene frit is in the lumen of the cavity body. The device for fastening the carrier material can also be a self-supporting membrane in which the Carrier material is embedded. The attachment of the carrier materials or the facilities that the carrier material can fixate by frictional or tensile forces like them for example by pinching these devices in the Hollow bodies arise, are caused and / or by a The devices are fixed with a clamping ring.

Die Porengröße der Einrichtung, vorzugsweise Polyethylen- oder Polypropylenfritten, muß dabei groß genug sein, um die Bestandteile des Lysates verstopfungsfrei hindurchfließen zu lassen. Vorzugsweise haben die Einrichtungen eine Porengröße von 5 bis 200 µm. Diese Vorrichtung erlaubt erstmals die einfache, schnelle und reproduzierbare Isolierung von Nucleinsäuren auch aus hochviskosen Lysaten, die sehr viel Protein enthalten (z. B. Blutlysate, welche einen sehr hohen Hämoglobingehalt aufweisen).The pore size of the device, preferably polyethylene or polypropylene frits, must be large enough to hold the Flow components of the lysate through without clogging allow. The devices preferably have one Pore size from 5 to 200 µm. This device allows for the first time the simple, fast and reproducible Isolation of nucleic acids also from highly viscous lysates, which contain a lot of protein (e.g. blood lysates, which have a very high hemoglobin content).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das mineralische Trägermaterial eine netzartige Membran aus Silicagel-, Glas- oder Quarzfasern, mit einer Porengröße < 0,5 µm, an die die freigesetzten Nucleinsäuren adsorbiert werden.In a particularly preferred embodiment, this is mineral carrier material from a mesh-like membrane Silica gel, glass or quartz fibers with a pore size <0.5 µm to which the released nucleic acids adsorb become.

Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform stellt eine Vorrichtung dar, bei der das mineralische Trägermaterial ein partikelförmiges anorganisches Polymeres wie Kieselgel oder Quarzgel mit einer Partikelgröße von 15 bis 25 µm ist.Another preferred embodiment is a Device in which the mineral carrier material particulate inorganic polymer such as silica gel or Quartz gel with a particle size of 15 to 25 microns.

Der Hohlkörper kann zum Beispiel ein handelsübliches Röhrchen sein. Zwischen den zwei eng eingepreßten Einrichtungen, zum Beispiel Polyethylenfritten mit einer Porengröße von 50 bis 200 µm, befindet sich eine oder mehrere Lagen einer Membran mit 0,1 bis 1 µm großen Poren, welche aus Silica-, Glas- oder Quarzfasern oder Kieselgelen besteht. Die Membran weist eine Dicke von ca. 0,2 bis 1,0 mm, insbesondere 0,6 mm auf.The hollow body can, for example, be a commercially available tube his. Between the two tightly pressed devices to Example polyethylene frits with a pore size of 50 to 200 µm, there is one or more layers of a membrane with 0.1 to 1 µm pores made of silica, glass or Quartz fibers or silica gels exist. The membrane has one Thickness of about 0.2 to 1.0 mm, in particular 0.6 mm.

Die Kapazität des Membranmaterials ist etwa 20 bis 100 µg DNA. Durch Übereinanderlegen entsprechender Membranen läßt sich selbstverständlich die Kapazität für DNA erhöhen. Bei geringer mechanischer Belastung ist auch ein randständiges Verschweißen oder Verkleben der Membran denkbar, wodurch die stabilisierende Wirkung der Einrichtungen entfallen kann, so daß die Membran den Hohlkörper ohne die Einrichtungen verschließt. Dabei kann die Membran durch das Aufsetzen eines Spannringes im Hohlkörper fixiert werden.The capacity of the membrane material is approximately 20 to 100 µg DNA. By stacking appropriate membranes the capacity for DNA naturally increases. At low mechanical stress is also marginal Welding or gluing the membrane is conceivable, which the stabilizing effect of the facilities can be eliminated, so that the membrane the hollow body without the facilities closes. The membrane can be replaced by attaching a Clamping ring are fixed in the hollow body.

Es ist ebenfalls möglich, mit dem beschriebenen Kieselgel, das zwischen 2 Polyethylen-Fritten mit einer Porengröße von 35 µm angeordnet ist, kleine Säulen zu füllen. Vorzugsweise wird die obere Einrichtung mit größeren Poren (100-200 µm) gewählt. Die Säulen werden vorzugsweise mit ca. 70 mg Silicagel entsprechend 3 mm Füllhöhe beschickt.It is also possible to use the silica gel described, that between 2 polyethylene frits with a pore size of 35 µm is arranged to fill small columns. Preferably the upper device with larger pores (100-200 µm) chosen. The columns are preferably about 70 mg Silica gel loaded with 3 mm filling height.

Bevorzugt ist auch die Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens in Strips mit je 8 parallelen Präparations möglichkeiten, im Mikrotitrationsplattenformat (96 Prä parationsmöglichkeiten fast gleichzeitig) und/oder in Kombination mit einem Filtrationsschritt und/oder einem Entsalzungsschritt. (Siehe Patentanmeldungen P 41 27 276.5, P 41 39 664.2 des gleichen Anmelders).It is also preferred to use the one described above Procedure in strips with 8 parallel preparations each possibilities in microtitration plate format (96 pre possible almost simultaneously) and / or in Combination with a filtration step and / or a Desalination step. (See patent applications P 41 27 276.5, P 41 39 664.2 by the same applicant).

In einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung wird eine 0,5 bis 1,5 mm dicke Polyethylenfritte mit einer Porosität von ca. 10 µm in eine Zentrifugen-Chromato graphiesäule in Form eines im wesentlichen zylindrischen Hohlkörpers eingeklemmt. Über diese Fritte ist eine etwa doppelt so dicke Schicht aus Silicagel einer Partikelgröße von etwa 10 bis 15 µm und einer Porosität von 40 bis 120 Å und mit einer zweiten Fritte, die von gleicher Art sein kann wie die erste Fritte, verschlossen. Vorzugsweise kann die Silicagelschicht durch Druck zwischen den Fritten komprimiert werden.In a preferred embodiment of the device a 0.5 to 1.5 mm thick polyethylene frit with a Porosity of approx. 10 µm in a centrifuge chromato graphical column in the form of a substantially cylindrical Hollow body clamped. About this frit is about twice as thick a layer of silica gel with a particle size of about 10 to 15 µm and a porosity of 40 to 120 Å and with a second frit, which can be of the same type like the first frit, closed. Preferably, the Layer of silica gel compressed by pressure between the frits become.

Eine andere Ausführungsform der Chromatographiesäule weist als Trägermaterial Glasfaserbruchstücke mit einer Länge von 10 bis 300 µm zwischen zwei Polyethylenfritten auf, die eine Porosität von ca. 50 µm besitzen. Als Trägermaterial kommen auch Glasfaserpapiere, Quarzfaserpapiere, Glasfasergewebe und andere mineralische Papiere und Gewebe in Betracht. Another embodiment of the chromatography column has Glass fiber fragments with a length of 10 to 300 µm between two polyethylene frits, one Porosity of about 50 microns. Come as a backing also glass fiber papers, quartz fiber papers, glass fiber fabrics and other mineral papers and fabrics.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung weist eine Membran, in die Silicagelpartikel eingebettet sind, in der Nähe der Auslaßöffnung auf. In diesem Fall kann die vorzugsweise selbsttragende Membran insbesondere mit einem Spannring fixiert werden. Als Silicagelmembran kommt in vorteilhafterweise eine Empore-SI-Membran der Firma Baker in Betracht. Ebenfalls, insbesondere mit einem Spannring, läßt sich eine Silicalgelmembran bestehend aus Silicagel und porösem PVC im Lumen des zylindrischen Hohlkörpers befestigen.Another preferred embodiment of the device has a membrane in which silica gel particles are embedded are close to the outlet opening. In this case the preferably self-supporting membrane in particular be fixed with a clamping ring. Comes as a silica gel membrane advantageously an Empore-SI membrane from Baker into consideration. Also, especially with a clamping ring, can be a silica gel membrane consisting of silica gel and porous PVC in the lumen of the cylindrical hollow body fasten.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die beschriebene Vorrichtung beispielsweise in einer ihrer Ausführungsformen mit der Lösung des zu trennenden Nucleinsäuregemisches beschickt. Die Lösung wird dann durch Anlegen eines Unterdrucks oder Zentrifugation oder gleichwirkende Maßnahme sowie Kombinationen davon durch den mineralischen Träger passiert. Dabei werden die Nucleinsäuren an dem Trägermaterial adsorbiert, sofern die Lösung eine hohe Ionenstärke (Salzkonzentration) aufweist.In a preferred embodiment of the invention The described device is used, for example in one of its embodiments with the solution of the separating nucleic acid mixture. The solution will be then by applying a vacuum or centrifugation or equivalent measure as well as combinations thereof by the mineral carrier happens. The nucleic acids adsorbed on the carrier material, provided the solution is high Ionic strength (salt concentration).

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert.The invention is illustrated by the following examples explained.

example 1 Isolation of high copy plasmid DNA

Das Plasmid pUC 18 enthaltende E. coli Zellen aus einer 3 ml HB 101 Kultur werden abzentrifugiert und in 0,25 ml Puffer P1 (10 mM Tris-HCl, pH 8, 100 µg/ml RNAseA) resuspendiert und durch die Zugabe von 0,25 ml Puffer P2 (0,2 M NaOH, 2% SDS) lysiert. Die Probe wird durch die Zugabe von 0,35 ml Puffer N3 (4,2 M Guanidinhydrochlorid, 0,9 M K-Acetat, pH 4,8) neutralisiert und gleichzeitig auf eine Endkonzentration von 1,75 M GuHCl eingestellt. Die lysierte Probe wird 10 min. bei 13 000 rpm in einer Eppendorf-Minizentrifuge abzen trifugiert, um die Zellbruchstücke und das ausgefallene SDS zu entfernen. Der Überstand mit der Plasmid-DNA wird sofort auf eine Zentrifugen-Chromatographiesäule pipettiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird in einem 2 ml Zentri fugenröhrchen zentrifugiert und durch nochmaliges Zentri fugieren von 0,5 ml PB Puffer (5 M Guanidinhydrochlorid, 30% Isopropanol) gewaschen, um Verunreinigungen und Proteine zu entfernen. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird 1× durch Durchzentrifugieren von 80% Ethanol/Wasser salzfrei gewaschen und anschließend 30 bis 60 sec. zentrifugiert, um das überschüssige Ethanol komplett zu entfernen. Zur Elution werden 0,05-0,2 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) durch die Zentrifugen-Chromatographiesäule in ein 1,5-ml- Zentrifugenröhrchen zentrifugiert. Die Plasmid-DNA liegt jetzt in konzentrierter Form in einer Lösung mit sehr niedriger Salzkonzentration vor. Die Ausbeute beträgt 15 µg bis 20 µg Plasmid-DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,75.E. coli cells containing the plasmid pUC 18 from a third ml of HB 101 culture are centrifuged off and placed in 0.25 ml of buffer P1 (10 mM Tris-HCl, pH 8, 100 µg / ml RNAseA) resuspended and by adding 0.25 ml of buffer P2 (0.2 M NaOH, 2% SDS) lysed. The sample is made by adding 0.35 ml Buffer N3 (4.2 M guanidine hydrochloride, 0.9 M K acetate, pH 4.8) neutralized and at the same time to a final concentration adjusted from 1.75 M GuHCl. The lysed sample is 10 min. Strip at 13,000 rpm in an Eppendorf mini centrifuge centrifuged around the cell debris and the failed SDS to remove. The supernatant with the plasmid DNA is removed immediately pipetted onto a centrifuge chromatography column. The Centrifuge chromatography column is in a 2 ml centri centrifuged and by centrifugation again add 0.5 ml PB buffer (5 M guanidine hydrochloride, 30% Isopropanol) washed to remove impurities and proteins to remove. The centrifuge chromatography column is 1 × by centrifuging 80% ethanol / water salt-free washed and then centrifuged for 30 to 60 sec remove the excess ethanol completely. For elution 0.05-0.2 ml of elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) through the centrifuge chromatography column into a 1.5 ml Centrifuge tubes centrifuged. The plasmid DNA lies now in a concentrated form in a solution with very low salt concentration. The yield is 15 µg up to 20 µg plasmid DNA with an A260 / A280 ratio of 1.75.

Example 2 Isolation of high copy plasmid DNA from 5 ml cultures

Nach Beispiel 1 wird ein Zell-Lysat einer 5 ml Plasmid pUC 18/XL 1 Blue Kultur hergestellt und durch eine Zentrifugen- Chromatographiesäule, welche eine Silicalgelschüttung enthält, zentrifugiert und gewaschen. Die Plasmid-DNA wird mit 0,1 ml auf 80°C erwärmtem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA) eluiert. Die Ausbeute beträgt 15-20 µg Plasmid DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,7.According to Example 1, a cell lysate of a 5 ml plasmid pUC 18 / XL 1 Blue culture produced and by a centrifuge Chromatography column, which contains a silica gel bed contains, centrifuged and washed. The plasmid DNA is with 0.1 ml of TE buffer heated to 80 ° C (10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 1 mM EDTA) eluted. The yield is 15-20 µg Plasmid DNA with an A260 / A280 ratio of 1.7.

Example 3 Isolation of low copy plasmid DNA

Nach Beispiel 1 wird ein Zell-Lysat einer 5 ml Plasmid pBR322/XL 1 Blue Kultur hergestellt und durch eine Zentri fugen-Chromatographiesäule mit einer Glas- oder Quarzfaser membran zentrifugiert und gewaschen. Die Plasmid-DNA wird mit 0,1 ml auf 80°C erwärmten TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1mM EDTA) eluiert. Die Ausbeute beträgt 5-10 µg Plasmid DNA mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,7.According to Example 1, a cell lysate is a 5 ml plasmid pBR322 / XL 1 Blue culture produced and by a centri joint chromatography column with a glass or quartz fiber centrifuged and washed membrane. The plasmid DNA is with 0.1 ml of TE buffer heated to 80 ° C (10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 1mM EDTA) eluted. The yield is 5-10 µg Plasmid DNA with an A260 / A280 ratio of 1.7.

Example 4 Cleaning amplification products

Eine 100 µl PCR-Amplifikationsreaktion wird mit 500 µl Puffer PB (5 M GuHCl, 30% Isopropanol) vermischt, wobei ein vor heriges Abt rennen des den Reaktionsansatz überschichtenden Paraffinöls nicht nötig ist. Dieses Gemisch wird auf eine Zentrifugen-Chromatographiesäule, welche eine Silicagel membran enthält, pipettiert und in einem 1,5 ml Zentrifugen röhrchen zentrifugiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird durch Behandeln mit 80% EtOH/Wasser annähernd salzfrei gewaschen. Zur Elution werden 50 µl Elutionspuffer (10 mM Tris, pH 8,5) durch die Zentrifugen-Chromatographiesäule in ein anderes Zentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das so gereinigte PCR Produkt ist frei von Primern, dNTPs, Poly merase und Salzen und kann beispielsweise direkt für eine Sequenzierungsreaktion in einem ABI-Sequencer unter Ver wendung des "Cyle-Sequencing" Protokolls eingesetzt werden.A 100 ul PCR amplification reaction is done with 500 ul buffer PB (5 M GuHCl, 30% isopropanol) mixed, one before Hert separation of the layer covering the reaction mixture Paraffin oil is not necessary. This mixture is made on a Centrifuge chromatography column, which is a silica gel Contains membrane, pipetted and in a 1.5 ml centrifuge centrifuged tubes. The centrifuge chromatography column becomes almost salt-free by treatment with 80% EtOH / water washed. 50 µl of elution buffer (10 mM Tris, pH 8.5) through the centrifuge chromatography column in centrifuged another centrifuge tube. That so purified PCR product is free of primers, dNTPs, poly merase and salts and can be used directly for a Sequencing reaction in an ABI sequencer under Ver using the "Cyle-Sequencing" protocol.

Example 5 Purification of DNA after restriction reactions

1 µg DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease behandelt. Diese DNA Restriktionsreaktion wird nach Beispiel 4 mit 500 µl PB Puffer vermischt und es wird weiter wie in Beispiel 4 verfahren. Die nach Elution erhaltene DNA ist frei von Restriktionsendonucleasen und Salzen, das 260/280 Verhältnis beträgt 1,8. 1 µg of DNA is treated with a restriction endonuclease. This DNA restriction reaction is carried out according to Example 4 with 500 ul PB buffer mixed and it continues as in example 4 proceed. The DNA obtained after elution is free of Restriction endonucleases and salts, the 260/280 ratio is 1.8.

Example 6 Purification of DNA after enzymatic radioactive labeling

1 µg DNA werden mit Hilfe des Oligolabellings, in Anwesenheit von Gamma P32-ATP radioaktiv markiert. Der Reaktionsansatz wird wie in Beispiel 4 behandelt. Hierdurch wird die markierte DNA von nicht eingebauten dNTPs, Gamma-P32 ATP, Salzen und Klenow-Polymerase gereinigt und kann direkt für die Hybridisierungsreaktion eingesetzt werden.1 µg of DNA are prepared with the help of oligolabelling radioactively labeled by Gamma P32-ATP. The reaction approach is treated as in Example 4. This will make the labeled DNA from unincorporated dNTPs, gamma-P32 ATP, Salts and Klenow polymerase purified and can be used directly for the hybridization reaction can be used.

Example 7 Nucleic acid preparation from blood

Gesamt-Nucleinsäure-Präparation aus Blut: 200 µl Citrat-, Heparin- oder EDTA-Blut werden in einem 1,5 ml PPN-Röhrchen mit 200 µl einer Lösung aus einem 4-8 M chaotropen Salz (Guanidinhydrochlorid (GuHCl), Guanidinisothiocyanat (GTC), Kaliumjodid), evtl. einem organischen Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Ether) und einem 5-100%igen Detergens (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) versetzt. Anschließend werden 200-1000 µg einer Protease zugefügt und es wird für 10 min. bei 70°C oder für längere Zeit bei niedrigeren Temperaruren (z. B. 30 min bei Raumtemperatur) inkubiert. In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und Denaturierung und enzymatischer Abbau von Proteinen (gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen Proteine). Durch Zugabe von 210 µl eines 95-100%igen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt und das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird das Lysat sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet, wobei die Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder Gelpartikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen, Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destiliertem (deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser Elutionsverfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA direkt ohne weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in Folgereaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden können. Die Präparation von Nucleinsäuren aus anderen Körperflüssigkeiten wie z. B. Sperma, Sputum, Urin, Stuhl, Schweiß, Speichel, Nasenschleim, Serum, Plasma, Liquor etc. ist auch möglich.Total nucleic acid preparation from blood: 200 µl citrate, Heparin or EDTA blood are in a 1.5 ml PPN tube with 200 µl of a solution of a 4-8 M chaotropic salt (Guanidine hydrochloride (GuHCl), guanidine isothiocyanate (GTC), Potassium iodide), possibly an organic solvent (phenol, Chloroform, ether) and a 5-100% detergent (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB). Subsequently 200-1000 µg of a protease are added and it is used for 10 min. at 70 ° C or for longer periods at lower temperatures Temperatures (e.g. 30 min at room temperature) incubated. In This step is followed by efficient lysis all eukaryotic and / or prokaryotic cells and / or viruses (simultaneous inactivation of infectious Pathogens) and denaturation and enzymatic degradation of Proteins (simultaneous removal of the nucleic acids bound proteins). By adding 210 µl of a 95-100% Alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, PEG, secondary and tertiary, short or long chain alcohols) become highly specific binding conditions for nucleic acids is generated and the lysate set in this way is transferred to the Device applied. By centrifugation or pressure the lysate is then passed through the membrane or gel matrix, the nucleic acids being reversible on the membrane fibers or Bind gel particles. With 0.7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 30-80% of a pure alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, PEG, secondary and tertiary, short or long-chain alcohols) or an alcohol mixture the impurities such as proteins, heme, heparin, iron ions, Metabolites etc. washed out. The DNA is either with a Low salt buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.0) or distilled (deionized) water eluted. The advantage of this Elution method is that the DNA thus obtained directly without further precipitation or rebuffering steps in Follow-up reactions, in particular the PCR, can be used can. The preparation of nucleic acids from others Body fluids such as B. sperm, sputum, urine, stool, Sweat, saliva, nasal mucus, serum, plasma, cerebrospinal fluid etc. is possible, too.

Diese einfache Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren weist ein hohes Automatisierungspotential insbesondere in Ver bindung mit den Anmeldungsgegenständen der DE-A 41 27 276.5, WO 93/11218, WO 93/11211 und DE-A 41 39 664.2 auf.This simple method of isolating nucleic acids shows a high automation potential especially in Ver binding with the objects of application of DE-A 41 27 276.5, WO 93/11218, WO 93/11211 and DE-A 41 39 664.2.

Example 8 Total nucleic acid preparation from the smallest amount of blood or traces

1-50 µl Citrat-, Heparin- oder EDTA-Blut, oder gefrorenes und wieder aufgetautes Blut, oder renaturiertes Blut aus getrockneten Spuren in Textilgewebe, werden in einem 1,5 ml PPN-Röhrchen mit 1-50 µl einer Lösung aus einem 4-8 M chaotropen Salz (Guanidinnydrochlorid, Guanidinisothiocyanat, Kaliumjodid), evtl. einem organischen Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Ether) und einem 1-100%igen Detergenz (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) versetzt. Anschließend werden 1-200 µg einer Protease zugefügt und es wird für 1 min. bei 70°C oder für längere Zeit bei niedrigeren Temperaturen (z. B. 10 min bei Raumtemperatur) inkubiert.1-50 µl of citrate, heparin or EDTA blood, or frozen and thawed blood, or renatured blood dried traces in textile fabric, are in a 1.5 ml PPN tubes with 1-50 µl of a solution from a 4-8 M chaotropic salt (guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, Potassium iodide), possibly an organic solvent (phenol, Chloroform, ether) and a 1-100% detergent (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB). Subsequently 1-200 µg of a protease are added and it is used for 1 min. at 70 ° C or for longer periods at lower temperatures Incubated temperatures (e.g. 10 min at room temperature).

In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und Denaturierung und enzymatischer Abbau von Proteinen (gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen Proteine). Durch Zugabe von 1/2 Volumen eines 95-100%igen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) oder organischen Polymeren (PEG) werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt und das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird das Lysat sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet, wobei die Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder Gel partikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol, n- Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen, Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destilliertem (deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser Elutions verfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA direkt ohne weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in Folgereaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden kann.In this step, the efficient lysis takes place at the same time all eukaryotic and / or prokaryotic cells and / or viruses (simultaneous inactivation of infectious Pathogens) and denaturation and enzymatic degradation of Proteins (simultaneous removal of the nucleic acids bound proteins). By adding 1/2 volume of a 95-100% Alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, Isopropanol, secondary and tertiary, short or long chain Alcohols) or organic polymers (PEG) are used for Nucleic acids generated highly specific binding conditions and the lysate thus set is applied to the device applied. The lysate is removed by centrifugation or pressure then passed through the membrane or gel matrix, the Nucleic acids reversibly attached to the membrane fibers or gel bind particles. With 0.7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 30-80% of a pure alcohol (methanol, ethanol, n- Propanol, isopropanol, PEG, secondary and tertiary, short or long-chain alcohols) or an alcohol mixture the impurities such as proteins, heme, heparin, iron ions, Metabolites etc. washed out. The DNA is either with a Low salt buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.0) or distilled (deionized) water eluted. The advantage of these elutions The method consists in that the DNA obtained in this way directly without further precipitation or rebuffering steps in Follow-up reactions, in particular the PCR, can be used can.

Dieses Verfahren ist auch zur Präparation von Nucleinsäuren aus kleinsten Mengen anderer Körperflüssigkeiten (Sperma, Sputum, Urin, Stuhl, Schweiß, Speichel, Nasenschleim, Serum, Plasma, Liquor etc.) oder getrockneten Spuren derselben geeignet. This procedure is also used to prepare nucleic acids from the smallest amounts of other body fluids (sperm, Sputum, urine, stool, sweat, saliva, nasal mucus, serum, Plasma, liquor etc.) or dried traces of the same suitable.

Example 9 Total tissue nucleic acid preparation

100 µg bis 10 mg eines Gewebes werden in einem PPN-Röhrchen mit einer Lösung aus einem 4-8 M chaotropen Salz (Guanidin hydrochlorid, Guanidinisothiocyanat, Kaliumjodid), evtl. einem organischen Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Ether) und einem 5-100%igen Detergens (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) versetzt und mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Homogenisators oder durch Mörsern in flüssigem Stickstoff homogenisiert. Anschließend werden 100-1000 µg einer Protease zugefügt und es wird für 10-20 min. bei 70°C oder für längere Zeit bei niedrigeren Temperaruren (z. B. 30 - 60 min bei Raumtemperatur) inkubiert. In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryon tischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und Denaturierung und enzymatischer Abbau von Proteinen (gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen Proteine). Durch Zugabe von ½ Volumen eines 95-100%igen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt und das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen. Durch Zentrifugation oder Druck wird das Lysat sodann durch die Membran oder Gelmatrix geleitet, wobei die Nucleinsäuren reversibel an die Membranfasern oder Gelpartikel binden. Mit 0,7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 30-80% eines reinen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, PEG, sekundäre und tertiäre, kurz- oder langkettige Alkohole) oder eines Alkoholgemisches werden die Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Eisenionen, Metabolite etc. ausgewaschen. Die DNA wird entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,0) oder destilliertem (deionisierten) Wasser eluiert. Der Vorteil dieser Elutions verfahren besteht darin, daß die so gewonnene DNA direkt ohne weitere Fällungs- oder Umpufferungsschritte in Folge reaktionen, insbesondere der PCR, eingesetzt werden können.100 µg to 10 mg of tissue are placed in a PPN tube with a solution of a 4-8 M chaotropic salt (guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, potassium iodide), possibly an organic solvent (phenol, chloroform, ether) and a 5-100% detergent (NP4O; Tween 20, Triton X-100, SDS, CTAB) and with the help of a commercial available homogenizer or by mortar in liquid Homogenized nitrogen. Then 100-1000 µg added a protease and it is kept for 10-20 min. at 70 ° C or for a long time at lower temperatures (e.g. 30 - Incubated for 60 min at room temperature). In this step the efficient lysis of all eukaryons takes place simultaneously tables and / or prokaryotic cells and / or viruses (simultaneous inactivation of infectious pathogens) and Denaturation and enzymatic degradation of proteins (simultaneous removal of those bound to the nucleic acids Proteins). By adding ½ volume of a 95-100% Alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, PEG, secondary and tertiary, short or long chain alcohols) become highly specific binding conditions for nucleic acids is generated and the lysate set in this way is transferred to the Device applied. By centrifugation or pressure the lysate is then passed through the membrane or gel matrix, the nucleic acids being reversible on the membrane fibers or Bind gel particles. With 0.7 ml 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 30-80% of a pure alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, PEG, secondary and tertiary, short or long-chain alcohols) or an alcohol mixture the impurities such as proteins, heme, heparin, iron ions, Metabolites etc. washed out. The DNA is either with a Low salt buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.0) or distilled (deionized) water eluted. The advantage of these elutions The method consists in that the DNA obtained in this way directly without further precipitation or re-buffering steps in a row reactions, especially PCR, can be used.

Diese einfache Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren funktioniert reproduzierbar aus allen Geweben, u. a. auch aus Tumoren und weist ein hohes Automatisierungspotential, insbesondere in Verbindung mit den Anmeldungsgegenständen der DE-A-41 27 276.5, WO 93/11218, Wo 93/11211 und DE-A-41 39 664.2 des gleichen Anmelders auf.This simple method of isolating nucleic acids works reproducibly from all tissues, u. a. also from Tumors and has a high automation potential, especially in connection with the objects of registration DE-A-41 27 276.5, WO 93/11218, Wo 93/11211 and DE-A-41 39 664.2 by the same applicant.

Example 10 Purification of DNA fragments from agarose gels

Ein DNA-Fragment wird in einem Agarosegel (TAE oder TBE 0,5-2% aufgetrennt. Das zu isolierende DNA-Fragment wird aus dem Gel ausgeschnitten und in einem 1,5 ml Eppendorf-Gefäß mit 300 µl QX1 Puffer (7 M NaPO₄, 10 mM NaAc, pH 5,3) vermischt. Nach 10 minütiger Inkubation bei 50°C hat sich die Agarose aufgelöst. Diese Lösung wird auf eine Zentrifugen-Chromato graphiesäule nach Beispiel 1 gegeben und durchzentrifugiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird nun mittels Zentrifugieren von 80% Ethanol/Wasser durch die Säule salzfrei gewaschen und anschließend 1 min. zentrifugiert, um überschüssiges Ethanol komplett zu entfernen. Zur Elution werden 0,05 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Chromatographiesäule gegeben und durchzentrifugiert.A DNA fragment is placed in an agarose gel (TAE or TBE 0.5-2% separated. The DNA fragment to be isolated is extracted from the Cut out the gel and put it in a 1.5 ml Eppendorf tube 300 ul QX1 buffer (7 M NaPO₄, 10 mM NaAc, pH 5.3) mixed. After 10 minutes of incubation at 50 ° C, the agarose has cleared dissolved. This solution is based on a centrifuge chromato graphies column given in Example 1 and centrifuged. The centrifuge chromatography column is now using Centrifuge 80% ethanol / water through the column washed salt-free and then 1 min. centrifuged, to completely remove excess ethanol. For elution 0.05 ml of elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) the chromatography column and centrifuged.

Example 11 Purification of DNA fragments from polyacrylamide (PAA) gels

Das zu isolierende DNA-Fragment wird aus dem PAA-Gel ausge schnitten und in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt, zer kleinert und mit 500 µl PAA-Elutionspuffer (500 mM NH₄Ac, 100 mM MgAc₂, 1 mM EDTA, 0-1% SDS) vermischt. Das Gemisch wird 30 min. bei 50°C inkubiert und anschließend mit 300 µl QX1 Puffer versetzt und über eine Zentrifugen-Chromatographie säule zentrifugiert. Die Zentrifugen-Chromatographiesäule wird nun mit 80% Ethanol/Wasser salzfrei gewaschen und anschließend 1 min. zentrifugiert, um überschüssiges Ethanol komplett zu entfernen. Zur Elution werden 0,1 ml Elutions puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Chromatographiesäule gegeben und durchzentrifugiert.The DNA fragment to be isolated is extracted from the PAA gel cut and transferred to a 2 ml Eppendorf tube, cut reduced and with 500 µl PAA elution buffer (500 mM NH₄Ac, 100 mM MgAc₂, 1 mM EDTA, 0-1% SDS) mixed. The mixture will 30 min. incubated at 50 ° C and then with 300 µl QX1 Buffer added and via a centrifuge chromatography centrifuged column. The centrifuge chromatography column is now washed salt-free with 80% ethanol / water and then 1 min. centrifuged to remove excess ethanol to remove completely. 0.1 ml of elution is used for the elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) onto the chromatography column given and centrifuged.

Example 12 Cleaning of large (<3000 bp) PCR fragments

Eine 100 µl PCR-Amplifikationsreaktion wird mit 500 µl Puffer QXB (5 M GuHCl) vermischt, wobei ein vorheriges Abtrennen des den Reaktionsansatz überschichtenden Paraffinöls nicht nötig ist. Zur weiteren Aufreinigung wird wie in Beispiel 4 verfahren.A 100 ul PCR amplification reaction is done with 500 ul buffer QXB (5 M GuHCl) mixed, with prior separation of the paraffin oil covering the reaction mixture is necessary. For further purification, as in example 4 proceed.

Example 13 Purification of single-stranded PCR products

Ein 100 µl Amplifikationsansatz einer asymmetrischen PCR wird mit 500 µl PB-Puffer (5 M GuHC, 30% Isopropanol) vermischt. Zur weiteren Aufreinigung wird wie in Beispiel 4 verfahren. Zur Elution werden 0,05 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Chromatographiesäule gegeben und durch zentrifugiert. Das Eluat enthält ca. 90% des einzelsträngigen PCR-Produktes, welches direkt für die zweite Amplifikation oder zum Sequenzieren eingesetzt werden kann. A 100 µl amplification batch of an asymmetric PCR is used mixed with 500 ul PB buffer (5 M GuHC, 30% isopropanol). The procedure for example 4 is followed for further purification. 0.05 ml of elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) on the chromatography column and by centrifuged. The eluate contains approximately 90% of the single-stranded PCR product, which is used directly for the second amplification or can be used for sequencing.

Example 14 Total nucleic acid preparation from tissue or cells

Bis zu 50 mg eines Gewebes oder bis zu 10⁶ Zellen werden in 400 µl einer gepufferten chaotropen Lösung (4 M GTC, 25 mM Natriumcitrat pH 7,5, 2% 2-Mercaptoethanol) - gegebenenfalls versetzt mit einem 5-100%igem Detergens (NP40, Tween 20, Triton-X-100, SDS, CTAB, Sarkosyl) - homogenisiert. In diesem Schritt erfolgen gleichzeitig die effiziente Lyse aller eukaryontischer und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und Denaturierung von Proteinen (insbesondere Ribonucleasen; gleichzeitig Entfernung der an die Nucleinsäuren gebundenen Proteine). Durch Zugabe von 260 µl eines 100%igen Alkohols (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol) werden für Nucleinsäuren hochspezifische Bindebedingungen erzeugt. Das so eingestellte Lysat wird auf die Vorrichtung aufgetragen.Up to 50 mg of tissue or up to 10⁶ cells are in 400 µl of a buffered chaotropic solution (4 M GTC, 25 mM Sodium citrate pH 7.5, 2% 2-mercaptoethanol) - if necessary mixed with a 5-100% detergent (NP40, Tween 20, Triton-X-100, SDS, CTAB, Sarkosyl) - homogenized. In this Step, the efficient lysis of all takes place at the same time eukaryotic and / or prokaryotic cells and / or Viruses (simultaneous inactivation of infectious pathogens) and denaturation of proteins (especially ribonucleases; simultaneous removal of those bound to the nucleic acids Proteins). By adding 260 µl of a 100% alcohol (Methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol) are used for Nucleic acids generated highly specific binding conditions. The Lysate thus adjusted is applied to the device.

Anschließend werden Verunreinigungen wie Proteine, Häm, Heparin, Metabolite und Polysaccharide mit 700 µl eines Waschpuffers bestehend aus 1 M GTC, 25 mM Tris/HCl, pH 7,5, 40% eines Alkoholes (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Iso propanol) sowie 700 µl eines Waschpuffers bestehend aus 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 80% eines Alkoholes (Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol) ausgewaschen. Die Nucleinsäuren werden entweder mit einem Niedrigsalzpuffer (10 mM Tris, pH 7,5) oder destilliertem (deionisiertem) Wasser eluiert.Then contaminants such as proteins, heme, Heparin, metabolites and polysaccharides with 700 µl one Wash buffer consisting of 1 M GTC, 25 mM Tris / HCl, pH 7.5, 40% of an alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, iso propanol) and 700 µl of a wash buffer consisting of 10 mM Tris / HCl, pH 7.5, 80% of an alcohol (methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol) washed out. The nucleic acids are either with a low salt buffer (10 mM Tris, pH 7.5) or distilled (deionized) water.

Claims

1. A method for the chromatographic purification and separation of nucleic acid mixtures by adsorbing the nucleic acids to be separated and purified from a solution having a high salt concentration (ionic strength) and / or a high alcohol concentration on a support, followed by desorption from the support by means of a solution with lower salt concentration (ionic strength), characterized in that the nucleic acid mixture

- on a porous or non-porous mineral carrier made of metal oxides and / or mixed metal oxides, silica gel, materials consisting mainly of glass, aluminum oxide, zeolites, titanium dioxide, zirconium dioxide from an aqueous adsorption solution with a high salt concentration (ionic strength) and with 1 to 50 vol .-% aliphatic alcohol of a chain length of C₁-C₅ and / or polyethylene glycol (PEG) and / or hydrophobic, inorganic and / or organic polymers and / or trichloroacetic acid (TCA) is adsorbed,
- optionally washed with a washing solution and then
- is eluted with a solution of lower salt concentration (ionic strength) and the nucleic acid or nucleic acid fraction obtained is collected.

2. The method according to claim 1, wherein as salts in the Adsorption solution chaotropic salts are used like Sodium perchlorate, guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, sodium iodide in concentrations of 1 up to 8 sts

3. The method according to claim 1 and / or 2, wherein the Ionic strengths of the salt solutions with 1 to 10 M lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, sodium acetate, Reagents such as B. urea and / or mixtures of it is set.

4. The method according to at least one of claims 1 to 3, where the particle size of the mineral carrier materials is 0.1 µm to 1000 µm.

5. The method according to at least one of claims 1 to 4, being used porous mineral carrier materials have a pore size of 2 to 1000 nm.

6. The method according to at least one of claims 1 to 5, the porous or non-porous carrier materials in the form of loose fill.

7. The method according to at least one of claims 1 to 5, the porous or non-porous carrier materials are designed as filter layers in the form of Filter layers made of glass, quartz or ceramic and / or a membrane in which silica gel is arranged and / or as particles or fibers from mineral carriers and Fabrics made of quartz or glass wool are available.

8. The method according to at least one of claims 1 to 7, where the nuclein to be separated and purified acids from biological sources such as cell cultures, Tissues of all kinds, body fluids like blood, Plasma, serum, urine, faeces, microorganisms such as Bacteria, especially mycobacterium tuberculosis, Viruses such as cytomegalovirus, HIV, hepatitis B, Hepatitis C, hepatitis 8 virus, stem from the nuclein acids obtained by polymerase chain reaction (PCR) Products, plasmid DNA, genomic DNA, RNA, nuclein acids from microorganisms such as plasmid DNA, chromo somale DNA or RNA and / or nucleic acids from sequence are analyzes.

9. The method according to at least one of claims 1 to 8, whereby the nucleic acids after fractionation to less are less than 10% shorter than 10 kb.

10. The method according to at least one of claims 1 to 9, where the nucleic acids are oligonucleotides.

11. Use of the method according to at least one of the Claims 1 to 10 for cleaning and separation of Nucleic acid fragments after modification reactions.

12. An apparatus for performing the method according to one of claims 1 to 10 from a hollow body with inlet and outlet opening, wherein a device is arranged in the lumen of the hollow body, which fixes the carrier material for adsorption of the nucleic acids to be separated, characterized in that

- The device are two stacked polyethylene frits forming an intermediate space, the carrier material being arranged between the polyethylene frits or
- The device is a self-supporting membrane in which the carrier material is embedded.

13. The apparatus of claim 12, wherein the attachment of the Devices in the lumen of the hollow body due to friction and / or tension forces and / or by fixing with a clamping ring.

14. Aqueous solution containing salts of high concentrations and 1-50 vol%, C₁-C₅ alcohols and / or PEG and / or hydrophobic inorganic and / or organic Polymers.

15. Use of a solution according to claim 13 as a buffer solution for binding nucleic acids to mineral Carriers of mixtures containing nucleic acids.

16. Assemblies in kit form containing an aqueous Solution according to claim 14 and devices according to one of claims 12 and / or 13.