DE102015216558A1 - METHOD AND TESTKIT FOR THE QUICK INSULATION OF NUCLEIC ACIDS FROM SMOKING SURFACES - Google Patents
METHOD AND TESTKIT FOR THE QUICK INSULATION OF NUCLEIC ACIDS FROM SMOKING SURFACES Download PDFInfo
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Abstract
Die Erfindung betriff ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren – in Anwesenheit von organischen Substanzen sowie mindestens einem Bestandteil eines Lysepuffers – an eine feste Phase mit rauer Oberfläche angebunden werden, anschließend gewaschen und eluiert werden. Bei der rauen Oberfläche handelt es sich vorzugsweise um eine nicht-glatte Kunststoff- oder Gummi-Oberfläche. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Testkit und ein entsprechendes Gerät zur Isolierung von Nukleinsäuren.The invention relates to a method for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing samples, characterized in that free or liberated by lysis nucleic acids - in the presence of organic substances and at least one component of a lysis buffer - are attached to a solid phase with a rough surface, then washed and be eluted. The rough surface is preferably a non-smooth plastic or rubber surface. The invention also provides a test kit and a corresponding device for isolating nucleic acids.
Description
Gegenstand der Erfindung ist ein völlig neuartiges, universelles, stark vereinfachtes sowie extrem schnelles Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäuren enthaltenden unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien, welches sowohl eine sehr hohe Qualität der zu isolierenden Nukleinsäuren garantiert als auch die Isolierung extrem hoher Nukleinsäure-Ausbeuten ermöglicht. Das Verfahren kann sowohl manuell im Labor, unter Feldbedingungen als auch vollständig automatisiert durchgeführt werden. Es basiert auf der Anbindung von Nukleinsäuren an eine nicht-glatte Oberfläche.The invention relates to a completely novel, universal, greatly simplified and extremely rapid method for isolating nucleic acids from nucleic acids containing a wide variety of starting materials, which guarantees both a very high quality of the nucleic acids to be isolated as well as the isolation of extremely high nucleic acid yields. The procedure can be carried out either manually in the laboratory, under field conditions or completely automated. It is based on the binding of nucleic acids to a non-smooth surface.
Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden (
Diese "klassischen Verfahren“ zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.These "classical methods" for the isolation of nucleic acids from cells and especially from tissues are very time-consuming (sometimes longer than 48 h), require a considerable amount of equipment and are also not feasible under field conditions, and such methods are due to the chemicals used such as phenol and chloroform in a not insignificant health hazard.
Die nächste Verfahrensgeneration zur Isolierung von Nukleinsäuren basiert auf einer von Vogelstein und Gillespie (
Aufgabe der ErfindungObject of the invention
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zu Grunde, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen technischen Lösungen zu beseitigen. The invention was therefore based on the object to eliminate the disadvantages of the technical solutions described in the prior art.
Lösung der AufgabeSolution of the task
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren bereitgestellt, welches deutlich einfacher in der Durchführung ist als die bekannten Verfahren; welches es erlaubt, eine Nukleinsäure-Isolierung auch unter Feldbedingungen (und durch Nichtspezialisten) durchführen zu können, welches extrem schnell in der Durchführung ist – insbesondere im Kontext mit einer automatisierten Extraktion – und welches es erlaubt, extrem hohe Ausbeuten an Nukleinsäuren mit hoher Qualität zu isolieren. Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgaben in all den definierten Punkten. Der Kern der Erfindung ist, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren, die mindestens einen Bestandteil eines Lysepuffers enthalten, vorzugsweise Salze – in Anwesenheit von organischen Substanzen – an eine feste Phase mit rauer Oberfläche angebunden werden, anschließend gewaschen und eluiert werden. De Begriff „raue Oberfläche“ ist so zu verstehen, dass durch Berühren der Oberfläche erkennbar ist, dass diese nicht glatt ist.The problem has been solved according to the features of the claims. According to the invention, a method for the isolation of nucleic acids has been provided which is considerably simpler to carry out than the known methods; which allows nucleic acid isolation to be carried out under field conditions (and by non-specialists) which is extremely fast to perform - especially in the context of automated extraction - and which allows extremely high yields of high quality nucleic acids isolate. The present invention solves these problems in all the defined points. The essence of the invention is that free or lysed nucleic acids containing at least one component of a lysis buffer, preferably salts - in the presence of organic substances - are attached to a solid phase with a rough surface, then washed and eluted. The term "rough surface" is to be understood that by touching the surface can be seen that this is not smooth.
Der Erfindung lag folgende Beobachtung zu Grunde. Wenn man eine Nukleinsäure enthaltende Proben mit Extraktionsreagenzien von kommerziell verfügbaren Kits (z.B. innuPREP Blood DNA Kit/IPC16, Analytik Jena AG; DNeasy Blood & Tissue Kit; Fa. Qiagen) bearbeitet und man anstelle eines mineralischen Trägermaterials ein beliebiges nicht-glattes Plastikmaterial (beispielsweise angerautes Polypropylen) einsetzt und dieses in Kontakt mit der in Bearbeitung befindlichen Probe bringt, bindet Nukleinsäure an das Plastikmaterial. Die nachfolgenden Schritte des Waschens können mit bekannten alkoholhaltigen Waschpuffern oder auch nur mit einem Alkohol durchgeführt werden, ebenso können für die Elution bekannte Niedrigsalzpuffer oder auch Wasser eingesetzt werden. Der einzige Unterschied ist, dass anstelle des mineralischen Trägermaterials ein Plastikmaterial eingesetzt wird. Es zeigte sich schon nach den ersten Experimenten, dass damit alle Prozessschritte viel einfacher und schneller umgesetzt werden können. Es zeigt sich auch, dass dieser Effekt mit allen eingesetzten Plastikmaterialien zu beobachten war. Die Besonderheit bei all den durchgeführten Versuchen bestand aber anfangs darin, dass die verwendeten Plastikmaterialien auf einem 3D-Drucker gefertigt wurden. Dadurch wird die Oberfläche nicht glatt, sondern geriffelt – also rau, da sich beim 3D-Druck ein Körper bildet, der schichtförmig aufgebaut ist. Durchgeführt wurden die ersten Experimente dabei unter Nutzung eines Extraktionsautomaten (Thermo Electron), dem sog. Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Es handelt sich dabei um ein Gerät zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel. Das Gerät verwendet dabei Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen und in die für eine Standardextraktion notwendigen Puffer eintauchen. Diese Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren zweckentfremdet eingesetzt. Dazu wurden mittels eines 3D-Druckers Hülsen aus verschiedenen Materialien gedruckt, welche dann auf die Plastikkämme aufgesteckt wurden. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzten Reagenzien wurden dabei z.B. teilweise aus dem kommerziell verfügbaren Extraktionskit (innuPREP Blood DNA Mini Kit/IPC16; Analytik Jena AG) genommen. Der Ablauf der Extraktion folgte folgendem workflow. Unter Verwendung des Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min. lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen vorbefüllt:
- Kavität 1: 400 µl Isopropanol
- Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
- Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
- Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
- Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)
- Well 1: 400 μl isopropanol
- Cavity 2: 800 μl Washing Solution LS (from the extraction kit)
- Well 3: 800 μl 80% ethanol
- Well 4: 800 μl 80% ethanol
- Well 5: 200 μl Elution Buffer (from the extraction kit)
Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Bei diesem Prozess bewegen sich die Plastikkämme sukzessive von Kavität 1 bis Kavität 5. Dabei erfolgt in jeder Kavität eine vertikale Bewegung der Plastikkämme in die jeweils vorliegende Pufferlösung. Der Extraktionsprozess basiert dabei auf den klassischen Prinzipien der Nukleinsäure-Isolierung unter Verwendung von magnetischen Partikeln. Es werden aber keine Partikel eingesetzt. In der Kavität 1 erfolgt die Bindung der Nukleinsäuren an den Plastikkamm mit den aufgesteckten Hülsen. Die gebundene Nukleinsäure wird sukzessive durch die Kavitäten 2–4 bewegt. Hier erfolgen die Waschschritte. Danach folgt ein kurzer Trocknungsschritt zur Entfernung von Ethanol. Final wird die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen mit Hülsen abgelöst. Der Ablauf ist dabei deutlich vereinfacht, da keine Magnetpartikel prozessiert wurden. Das notwendige Sammeln der Magnetpartikel entfällt als Schritt, da ja keine Partikel für die Extraktion eingesetzt wurden. Dadurch war das Verfahren in ca. 15 min beendet. Wie schon aufgeführt, zeigte sich, dass mit allen eingesetzten Plastikmaterialien unter Verwendung einer kommerziell verfügbaren Extraktionschemie und unter Anwendung eines Standard-Extraktionsprotokolls Nukleinsäuren über die Anbindung an das eingesetzte Plastikmaterial isoliert werden können. Diese Beobachtungen waren überraschend. Es war zwar bekannt, dass Biomoleküle unspezifisch an Plastikmaterialien adsorbieren, dies aber aus wässrigen Lösungen, in denen sie vorliegen und dies auch nur in extrem geringen Mengen. Auch gibt es Beschreibungen, Plastikmaterialien für die Isolierung von Nukleinsäuren einzusetzen. Dies aber dadurch, dass man Plastikmaterialien chemisch an ihren Oberflächen so modifiziert, dass sie dieselben funktionalen Gruppen wie silikatische Materialien tragen (OH-Gruppen) oder auch andere funktionale Gruppen an Plastikoberflächen synthetisiert wurden (COOH-Gruppen). Dies ist z.B. in der Patentschrift
- 1. Lysieren einer Nukleinsäure enthaltenden Probe (oder Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Probe). Dazu wird die Probe mit einem klassischen Lysepuffer oder einem Puffer versetzt, die man bisher aus Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren kennt. Diese Puffer können chaotrope Salze oder nichtchaotrope Salze oder Mischungen dieser beiden Gruppen enthalten. Darüber hinaus können diese Puffer weitere Komponenten enthalten wie Chealtbildner, Trispuffer, Netz- und Dispergiermittel etc. Das Verfahren funktioniert aber auch mit Puffern, welche keine Salze enthalten und z.B. nur aus einem Detergenz, Tris und EDTA bestehen. Zusätzlich können auch noch proteolytische Enzyme eingesetzt werden.
- 2. Zugabe eines Bindungspuffers, welcher eine alkoholische Komponente und weitere Zusätze enthält oder Zugabe eines Alkohols allein oder auch Zugabe von Aceton oder Benzin.
- 3. Inkontaktbringen dieser Mischung mit einem Plastikmaterial, dessen Oberfläche angeraut ist.
- 4. Entfernen des Plastikmaterials aus der Mischung oder Entfernen der Mischung vom Plastikmaterial.
- 5. Ggf. Waschen des Plastikmaterials.
- 6. Ggf. Trocknung des Plastikmaterials.
- 7. Ablösen der Nukleinsäure vom Plastikmaterial mit einem Elutionspuffer (Niedrigsalzpuffer oder Wasser).
- 1. Lysing a sample containing nucleic acid (or providing a sample containing nucleic acid). For this purpose, the sample is mixed with a classical lysis buffer or a buffer which has hitherto been known from methods for isolating nucleic acids. These buffers may contain chaotropic salts or non-chaotropic salts or mixtures of these two groups. In addition, these buffers may contain other components such as chelating agents, Tris buffer, wetting and dispersing agents, etc. The method also works with buffers which contain no salts and consist for example only of a detergent, Tris and EDTA. In addition, proteolytic enzymes can also be used.
- 2. Addition of a binding buffer which contains an alcoholic component and further additives or addition of an alcohol alone or else addition of acetone or gasoline.
- 3. Contact this mixture with a plastic material whose surface is roughened.
- 4. Remove the plastic material from the mixture or remove the mixture from the plastic material.
- 5. If necessary Washing the plastic material.
- 6. If necessary Drying of the plastic material.
- 7. Remove the nucleic acid from the plastic material with an elution buffer (low salt buffer or water).
Das Verfahren ist universell einsetzbar und kann sowohl automatisiert als auch manuell durchgeführt werden. Damit ist es auch in idealster Weise für den Einsatz einer Nukleinsäure-Extraktion unter Feldbedingungen nutzbar, da die notwendigen Schritte einfach durchführbar sind. Die einzusetzenden Plastikmaterialien sind ebenfalls nicht limitierend. Eingesetzt werden können auch sogenannte Kompositmaterialien, die Mischungen aus Polymeren und z.B. organischen Komponenten oder metallischen Komponenten darstellen. Wesentlich ist nur die Bereitstellung einer angerauten Oberfläche. Die Architektur des Plastikmaterials ist ebenfalls nicht limitierend. Beispielsweise kann auch eine Standardpipettenspitze an ihrer Innenseite gemäß der Erfindung aufgeraut werden und für die Extraktion von Nukleinsäuren manuell oder automatisiert eingesetzt werden. Dazu wird entsprechend des beschriebenen Extraktions-workflows mittels multipler Pipettierschritte das Extraktionsprotokoll sukzessive abgearbeitet. Dem Fachmann wird damit deutlich, wie extrem einfach mittels der vorliegenden Erfindung nunmehr eine Extraktion von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann. Die vorliegende Erfindung zeigt einen weiteren enormen Vorteil. Enthält eine biologische Probe große Mengen an Nukleinsäuren, so kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Plastik eine extrem große Menge an Nukleinsäuren extrahiert werden. Dies Ausbeuten übersteigen dabei die erzielbaren Ausbeuten mit bekannten Extraktionsverfahren unter Verwendung von mineralischen Trägermaterialien um ein Vielfaches. Damit ist das Verfahren auch ideal für die Bearbeitung von großen Probenvolumina geeignet. Auch zeigt sich, dass sowohl genomische DNA, RNA als auch Plasmid DNA isoliert werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann als automatisierter Extraktionsprozess multiple Proben extrem schnell bearbeiten. Beispielhaft können mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter der zweckentfremdeten Verwendung des KingFisher ml, 15 Proben in 15 Minuten gleichzeitig bearbeitet werden. Auch kann dieses Verfahren ohne Verlust an Quantität und Qualität der zu isolierenden Nukleinsäure weiter verkürzt werden. Dies kann dann auch auf andere Automatenstationen übertragen werden. Z.B. kann die Extraktion auch in aufgerauten Pipettenspitzen mit allen gängigen Pipettierautomaten umgesetzt werden. Mit der Erfindung steht damit eine völlig neuartige Plattformtechnologie für die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren zur Verfügung, welche eine Vielzahl von ganz deutlichen Vorteilen gegenüber den bekannten Extraktionsverfahren zeigt. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Gerät zur Isolierung von Nukleinsäuren, umfassend angeraute Pipettenspitzen.The method is universally applicable and can be carried out both automatically and manually. Thus, it is also ideally suited for the use of a nucleic acid extraction under field conditions, since the necessary steps are easy to carry out. The plastic materials to be used are likewise not limiting. It is also possible to use so-called composite materials which are mixtures of polymers and, for example, organic components or metallic components. It is only essential to provide a roughened surface. The architecture of the plastic material is also not limiting. For example, a standard pipette tip can be roughened on its inside according to the invention and used manually or automatically for the extraction of nucleic acids. To The extraction protocol is successively processed according to the described extraction workflow by means of multiple pipetting steps. It will thus be clear to the person skilled in the art how an extraction of nucleic acids can now be carried out extremely simply by means of the present invention. The present invention shows another enormous advantage. If a biological sample contains large amounts of nucleic acids, an extremely large amount of nucleic acids can be extracted by means of the method according to the invention and the plastic according to the invention. These yields exceed the achievable yields by known extraction methods using mineral support materials many times. Thus, the method is also ideally suited for the processing of large sample volumes. It also shows that both genomic DNA, RNA and plasmid DNA can be isolated. The method according to the invention can process multiple samples extremely quickly as an automated extraction process. By way of example, using the method according to the invention under the misused use of the KingFisher ml, 15 samples can be processed simultaneously in 15 minutes. Also, this method can be further shortened without loss of quantity and quality of the nucleic acid to be isolated. This can then be transferred to other automatic stations. For example, the extraction can also be implemented in roughened pipette tips with all common pipetting machines. The invention thus provides a completely new platform technology for the isolation and purification of nucleic acids, which shows a large number of very distinct advantages over the known extraction methods. The invention thus also provides a device for isolating nucleic acids comprising roughened pipette tips.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.The invention will be explained in more detail with reference to embodiments. The embodiments do not represent a limitation of the invention.
Ausführungsbeispieleembodiments
Beispiel 1. Nachweis der Bindung von Nukleinsäuren an rauen Oberflächen unter Nutzung einer kommerziell verfügbaren ExtraktionschemieExample 1. Detection of binding of nucleic acids to rough surfaces using commercially available extraction chemistry
Der Nachweis, dass Nukleinsäuren an raue Oberflächen binden und isoliert werden können, wurde wie folgt durchgeführt. Die Extraktion wurde dabei automatisiert umgesetzt. Zum Einsatz kam ein Magnetpartikelprozessor (KingFisher ml; Thermo Electron). Das Gerät verwendet Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen, die für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Diese Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren zweckentfremdet eingesetzt und sollten der Bindung und nachfolgenden Extraktion der Nukleinsäure dienen. Das Plastikmaterial ist Polypropylen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Plastikkämme mittels eines Schleifgerätes angeraut. Eingesetzt wurden ebenfalls unbehandelte Plastikkämme. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde dabei teilweise aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16X (Analytik Jena AG) genommen. Mittels eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:
- Kavität 1: 400 µl Isopropanol
- Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
- Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
- Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
- Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)
- Well 1: 400 μl isopropanol
- Cavity 2: 800 μl Washing Solution LS (from the extraction kit)
- Well 3: 800 μl 80% ethanol
- Well 4: 800 μl 80% ethanol
- Well 5: 200 μl Elution Buffer (from the extraction kit)
Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Bei diesem Prozess bewegen sich die Plastikkämme sukzessive von Kavität 1 bis Kavität 5. Dabei erfolgt in jeder Kavität eine vertikale Bewegung der Plastikkämme innerhalb der jeweils vorliegenden Pufferlösung. Der Extraktionsprozess basiert dabei auf den klassischen Prinzipien der Nukleinsäureisolierung unter Verwendung von magnetischen Partikeln. Es werden aber keine Partikel eingesetzt. In der Kavität 1 erfolgt die Bindung der Nukleinsäuren an den Plastikkamm. Die gebundene Nukleinsäure wird sukzessive durch die Kavitäten 2–4 bewegt. Hier erfolgen die Waschschritte. Danach folgt ein kurzer Trocknungsschritt zur Entfernung von Ethanol. Final wird die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen abgelöst. Wie schon aufgeführt, wurden dabei Plastikkämme eingesetzt, deren Oberfläche aufgeraut wurden sowie die ursprünglichen unbehandelten Plastikkämme. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:
- 1. DNA Leiter (1b Leiter)
- 2. unbehandelter Plastikkamm
- 3. unbehandelter Plastikkamm
- 4.
aufgerauter Plastikkamm 1 - 5.
aufgerauter Plastikkamm 2 - 6.
Aufgerauter Plastikkamm 3
- 1. DNA conductor (1b conductor)
- 2. untreated plastic comb
- 3. untreated plastic comb
- 4. roughened
plastic comb 1 - 5. roughened
plastic comb 2 - 6. Brushed
plastic comb 3
Wie die Ergebnisse eindrucksvoll zeigen, bindet die Nukleinsäure (sowohl DNA als auch RNA) an den unbehandelten Kämmen nicht. Sie bindet aber hocheffizient an den aufgerauten Kämmen und kann nachfolgend mit klassischen Waschpuffern gewaschen und final wieder von den Kämmen abgelöst werden. Damit entspricht der Prozess exakt den klassischen Abläufen der Isolierung von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel oder mittels dem Fachmann bekannter mineralischer Trägermaterialien. Der Prozess ist aber sehr viel schneller und einfacher in der Durchführung. Mit diesem Beispiel wurde damit gezeigt, dass allein durch ein Anrauen einer Plastikoberfläche dieses Material für die Extraktion von Nukleinsäuren unter Verwendung bekannter Extraktionsreagenzien eingesetzt werden kann.As the results impressively show, the nucleic acid (both DNA and RNA) does not bind to the untreated ridges. However, it binds highly efficiently to the roughened combs and can subsequently be washed with classic washing buffers and finally detached again from the combs. Thus, the process corresponds exactly to the classical processes of isolating nucleic acids by means of magnetic particles or mineral carriers known to those skilled in the art. The process is much faster and easier to carry out. With this example, it was shown that solely by roughening a plastic surface, this material can be used for the extraction of nucleic acids using known extraction reagents.
Beispiel 2: Testung unterschiedlicher Plastikmaterialien mit rauen Oberflächen für die Extraktion von Nukleinsäuren unter Nutzung einer kommerziell verfügbaren ExtraktionschemieExample 2: Testing of Rough Surface Plastic Materials for the Extraction of Nucleic Acids Using Commercially Available Extraction Chemistry
Der Nachweis, dass Nukleinsäuren an raue Oberflächen von unterschiedlichen Plastikmaterialien binden und isoliert werden können, wurde wie folgt durchgeführt. Die Extraktion wurde dabei automatisiert umgesetzt. Zum Einsatz kam wieder der Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Die Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren wieder zweckentfremdet eingesetzt. Als Material zur Bindung der Nukleinsäure diente wie im Ausführungsbeispiel 1 ein angerauter Plastikkamm. Als Kontrolle wurde ein nicht behandelter Kamm eingesetzt. Zur Testung anderer Materialien wurden mittels eines 3-D-Druckers Plastikringe aus unterschiedlichen Materialien hergestellt, welche wiederum auf die Kämme des KingFisher ml Gerätes gesteckt wurden. Auch diese Ringe wurden wieder mit einem Schleifgerät angeraut. Bei den unterschiedlichen Materialien handelte es sich um angeraute Kämme der Plastik des KingFisher ml (Polypropylen), des Weiteren um das Material Biofila Linen (Fa. TwoBEars), einem Kompositmaterial bestehend aus Lignin und einem Komplexpolymer aus aromatischen Alkoholen, um das Material Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS), das Material aus Polylaktit (PLA), um das Material Polycarbonat (PC) sowie das Material Polystyrol (PS). Die Kämme vom KingFisher ml wurden dabei unterschiedlich angeraut (Typ A: ca. 3 cm des Kammes, Typ B: ca. 1 cm des Kammes; C. nur die Spitze des Kammes). Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde wiederum teilwiese aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DANN Kit/IPC16 (Analytik Jena AG) genommen. Unter Verwendung eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:
- Kavität 1: 400 µl Isopropanol
- Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
- Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
- Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
- Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)
- Well 1: 400 μl isopropanol
- Cavity 2: 800 μl Washing Solution LS (from the extraction kit)
- Well 3: 800 μl 80% ethanol
- Well 4: 800 μl 80% ethanol
- Well 5: 200 μl Elution Buffer (from the extraction kit)
Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Der Ablauf der Extraktion erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Die Plastikkämme (unbehandelt bzw. angeraut) sowie die Plastikkämme mit den aufgesteckten Plastikringen wurden wiederum sukzessive durch die einzelnen Kavitäten mit den vorgelegten Pufferlösungen bewegt. Final wurde die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen abgelöst. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Konzentration sowie Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:
- 1. DNA Leiter (1b Leiter)
- 2. unbehandelter Plastikkamm
- 3. aufgerauter Plastikkamm Typ A
- 4. aufgerauter Plastikkamm Typ B
- 5. aufgerauter Plastikkamm Typ C
- 6. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus BioFila
- 7. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus ABS
- 8. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA
- 9. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PC
- 10. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PS
- 1. DNA conductor (1b conductor)
- 2. untreated plastic comb
- 3. roughened plastic comb type A
- 4. roughened plastic comb type B
- 5. roughened plastic comb type C.
- 6. Plastic comb with roughened ring made of BioFila
- 7. Plastic comb with roughened ring of ABS
- 8. Plastic comb with roughened PLA ring
- 9. Plastic comb with roughened ring of PC
- 10. Plastic comb with roughened ring of PS
Wie die Ergebnisse zeigen, bindet die Nukleinsäure an den unbehandelten Kämmen nicht. Sie bindet aber hocheffizient an den aufgerauten Kämmen und den aufgerauten Ringen. Damit ist gezeigt, dass die Bindung unabhängig von der Materialart ist. Alle angerauten Materialien binden hocheffizient Nukleinsäuren. Es zeigt sich ebenfalls, dass die angeraute Fläche (im Falle der Kämme) sogar nur sehr gering sein muss, um Nukleinsäuren zu binden. Es zeigt sich aber auch, dass größere Flächen auch noch höhere Mengen an Nukleinsäuren binden (die Flächen bei den eingesetzten Ringen ist größer als die angerauten Oberflächen der Kämme). Die Qualität der Nukleinsäuren ist exzellent. As the results show, the nucleic acid does not bind to the untreated combs. But it binds highly efficiently to the roughened combs and roughened rings. This shows that the bond is independent of the material type. All roughened materials efficiently bind nucleic acids. It also shows that the roughened surface (in the case of the combs) even has to be very low in order to bind nucleic acids. However, it has also been shown that larger areas also bind higher amounts of nucleic acids (the areas in the rings used are larger than the roughened surfaces of the combs). The quality of the nucleic acids is excellent.
Beispiel 3: Vergleich eines klassischen Kits zur Isolierung von Nukleinsäuren mit dem erfindungsgemäßen VerfahrenExample 3 Comparison of a Classic Kit for the Isolation of Nucleic Acids with the Method According to the Invention
Mit diesem Beispiel sollte der Vergleich zwischen einem klassischen Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Als Vergleichs Kit wurde der Kit DNeasy Blood&Tissue Kit der Fa. Qiagen eingesetzt. Dieser basiert auf der Lyse der Zellen, der Bindung der Nukleinsäuren an die Oberfläche einer Spin Filtersäule mit einer Silikamembran, dem nachfolgenden Waschen der gebundenen Nukleinsäure und der finalen Elution der Nukleinsäure von der Silikamembran. Dieses Kit ist ein Standard Kit zur Extraktion von Nukleinsäuren und wird weltweit dafür eingesetzt. Es wurde nach vorliegendem Manual gearbeitet.With this example, the comparison between a classical kit for the isolation of nucleic acids with the method according to the invention should be carried out. The kit used was the Kit DNeasy Blood & Tissue Kit from Qiagen. This is based on the lysis of the cells, the binding of the nucleic acids to the surface of a spin filter column with a silica membrane, the subsequent washing of the bound nucleic acid and the final elution of the nucleic acid from the silica membrane. This kit is a standard extraction kit for nucleic acids and is used worldwide. It was worked according to this manual.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde wiederum der KingFisher ml eingesetzt. Als raue Oberfläche wurden ein aufgerauter Kamm sowie ein auf den Kamm gesteckter Ring aus angerautem PLA eingesetzt. Der Ablauf der Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgte wie in den beiden Ausführungsbeispielen 1 und 2 aufgeführt. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 bzw. 2 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Konzentration sowie Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:
- 1. DNA Leiter (1b Leiter)
- 2. Qiagen Kit (ca. 1 × 106 Zellen)
- 3. Qiagen Kit (ca. 2 × 106 Zellen)
- 4. erfindungsgemäßes Verfahren; aufgerauter Plastikkamm (ca. 1 × 106 Zellen)
- 5. erfindungsgemäßes Verfahren; aufgerauter Plastikkamm (ca. 2 × 106 Zellen)
- 6. erfindungsgemäßes Verfahren; Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (ca. 1 × 106 Zellen)
- 7. erfindungsgemäßes Verfahren; Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (ca. 2 × 106 Zellen)
- 1. DNA conductor (1b conductor)
- 2. Qiagen Kit (about 1 × 10 6 cells)
- 3. Qiagen Kit (about 2 × 10 6 cells)
- 4. Method according to the invention; roughened plastic comb (about 1 × 10 6 cells)
- 5. Method according to the invention; roughened plastic comb (about 2 × 10 6 cells)
- 6. Method according to the invention; Plastic comb with roughened PLA ring (about 1 × 10 6 cells)
- 7. Method according to the invention; Plastic comb with roughened PLA ring (about 2 × 10 6 cells)
Wie die Ergebnisse zeigen, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine sehr viel höhere Menge an Nukleinsäuren gebunden und isoliert werden, als mit einem klassischen Kit. Damit sind die Bindungskapazitäten deutlich höher, als die Bindungskapazitäten eines kommerziell verfügbaren Silikamembran-Verfahrens. Dies unterstreicht den enormen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.As the results show, a much higher amount of nucleic acids can be bound and isolated with the method according to the invention than with a classical kit. Thus, the binding capacities are significantly higher than the binding capacities of a commercially available silica membrane method. This underscores the enormous advantage of the method according to the invention.
Beispiel 4: Extraktion von Nukleinsäure aus BlutExample 4: Extraction of nucleic acid from blood
Mit diesem Beispiel wird gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auch aus Blutproben DNA isoliert werden kann und dabei die Ausbeuten extrem hoch sind. Eingesetzt wurden 3 ml Vollblutproben. Nach Lyse der Erythrozyten wurden die kernhaltigen Zellen pelletiert und wiederum nach Zugabe eines Lysepuffers (Lysepuffer CBV) aus dem kommerziell verfügbaren Kit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16 (Analytik Jena AG) sowie unter Zugabe von Proteinase K bei 60°C für 30 min lysiert. Eluiert wurde in 300 µl Elution Buffer.This example shows that DNA can also be isolated from blood samples by means of the method according to the invention and the yields are extremely high. 3 ml of whole blood samples were used. After lysis of the erythrocytes, the nucleated cells were pelleted and in turn lysed after addition of a lysis buffer (lysis buffer CBV) from the commercially available kit innuPREP Blood DNA Kit / IPC16 (Analytik Jena AG) and with the addition of proteinase K at 60 ° C for 30 min. Elution was done in 300 μl elution buffer.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde wiederum der KingFisher ml eingesetzt. Als raue Oberflächen wurde ein auf den Kamm gesteckter Ring aus angerautem Material BioFila sowie PLA eingesetzt. Der Ablauf der Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgte wie in den Ausführungsbeispielen 1 bis 3 aufgeführt.The KingFisher ml was again used for the process according to the invention. The rough surfaces used were a combed ring of roughened BioFila and PLA. The course of the extraction by means of the method according to the invention was carried out as listed in the working examples 1 to 3.
Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:
Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, auch aus Vollblutproben zu isolieren, wobei die erzielbaren Ausbeuten extrem hoch sind.As the results show, it is possible with the method according to the invention to also isolate from whole blood samples, wherein the recoverable yields are extremely high.
Beispiel 5: Extraktion von Nukleinsäure aus NIH 3T3 Zellen sowie aus Vollblutproben mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer modifizierten PipettenspitzeExample 5: Extraction of Nucleic Acid from NIH 3T3 Cells and Whole Blood Samples by the Method of the Invention Using a Modified Pipette Tip
Mit diesem Beispiel wird gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens extrem einfach und schnell Nukleinsäuren mittels einer modifizierten Pipettenspitze isoliert werden können.With this example it is shown that by means of the method according to the invention nucleic acids can be isolated extremely easily and quickly by means of a modified pipette tip.
Als Pipettenspitze wurde eine 1ml Pipettenspitze der Fa. Sarstedt eingesetzt. Diese Pipettenspitze wurde um ca. 5 mm gekürzt. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde dann die Innenseite der Pipettenspitze mittels eines Schleifgerätes aufgeraut.The pipette tip was a 1 ml pipette tip from Sarstedt. This pipette tip was shortened by about 5 mm. According to the method according to the invention, the inside of the pipette tip was then roughened by means of a grinding device.
Eingesetzt wurden 1 × 106 NIH 3T3 Zellen sowie 2 ml Vollblut (die Erythrozyten wurden lysiert und die kernhaltigen Zellen pelletiert und diese Zellen dann eingesetzt). Sowohl die Zellen als auch die pelletierten kernhaltigen Blutzellen wurden wie in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen behandelt und mit dem Lysepuffer CBV lysiert. Das Lysat wurde in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 400 µl Isopropanol versetzt. Nachfolgend wurde die aufgeraute Pipettenspitze eingesetzt und mittels einer Pipette wurde der Ansatz 20× auf- und abpipettiert. Danach wurden 3 weitere 2 ml-Reaktionsgefäße mit den bekannten alkoholischen Waschpuffern (LS, 80%iger Ethanol, 80%iger Ethanol) befüllt. Die Pipettenspitze wurde dann sukzessive in die jeweiligen Waschpuffer getaucht und es wurde jeweils 5× auf- und abpipettiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Spitze getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der gebundenen Nukleinsäure erfolgte mit 200 µl Elution Buffer für die NIH 3T3 Zellen sowie mit 400 µl für die Vollblutprobe. Dieser wurde wiederum in ein 2 ml-Reaktionsgefäß gegeben. Es wurde 20× auf- und abpipettiert. Nach Entfernung der Pipettenspitze liegt die isolierte Nukleinsäure im Reaktionsgefäß vor. Das Verfahren ist extrem einfach und schnell. 1 × 10 6 NIH 3T3 cells and 2 ml whole blood were used (the erythrocytes were lysed and the nucleated cells were pelleted and these cells were then used). Both the cells and the pelleted nucleated blood cells were treated as in the previous embodiments and lysed with the lysis buffer CBV. The lysate was transferred to a 2 ml reaction vessel and 400 μl of isopropanol were added. Subsequently, the roughened pipette tip was used and by means of a pipette, the batch was pipetted up and down 20 ×. Thereafter, 3 more 2 ml reaction vessels were filled with the known alcoholic washing buffers (LS, 80% ethanol, 80% ethanol). The pipette tip was then successively in the each washing buffer dipped and it was in each
Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:
Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, allein unter Verwendung einer Pipettenspitze, deren Innenseite erfindungsgemäß aufgeraut wurde, Nukleinsäure zu Binden und zu isolieren. Auch hier zeigt sich, dass die Ausbeuten extrem hoch sind. Mittels der unbehandelten Pipettenspitze können keine Nukleinsäuren isoliert werden.As the results show, it is possible with the method according to the invention to bind and isolate nucleic acid solely by using a pipette tip whose inside has been roughened according to the invention. Again, it shows that the yields are extremely high. By means of the untreated pipette tip no nucleic acids can be isolated.
Beispiel 6: Testung unterschiedlicher Lysepuffer in Kombination mit unterschiedlichen alkoholischen bzw. nichtalkoholischen Lösungen zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels des erfindungsgemäßen VerfahrensExample 6: Testing of Different Lysis Buffers in Combination with Different Alcoholic or Non-Alcoholic Solutions for the Extraction of Nucleic Acids by the Method of the Invention
Eingesetzt wurde wiederum der Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Als Material zur Bindung der Nukleinsäure diente ein mit einem Schleifgerät angerauter Ring aus BioFila Material, welcher auf die Kämme der Plastik des KingFisher ml aufgesteckt wurden. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die Lyse der Zellen wurde mit drei verschiedenen Puffern durchgeführt:
- 1. Puffer A, enthaltend ein chaotropes Salz: Harnstoff, SDS, Tris HCl, EDTA
- 2. Puffer B, enthaltend kein Salz: SDS; Tris HCl; EDTA
- 3. Puffer C enthaltend ein nichtchaotropes Salz: Natriumchlorid, CTAB; Tris HCl, EDTA
- 1. Buffer A, containing a chaotropic salt: urea, SDS, Tris HCl, EDTA
- 2. Buffer B containing no salt: SDS; Tris HCl; EDTA
- 3. Buffer C containing a non-chaotropic salt: sodium chloride, CTAB; Tris HCl, EDTA
Die Zellen wurden in 200 µl H2O resuspendiert und mit 200 µl des jeweiligen Lysepuffers sowie 20 µl versetzt und bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:
- Kavität 1: 400 µl Isopropanol oder absoluter Ethanol oder Aceton
- Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16)
- Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
- Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
- Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16)
- Well 1: 400 μl isopropanol or absolute ethanol or acetone
- Cavity 2: 800 μl Washing Solution LS (from the extraction kit innuPREP Blood DNA Kit / IPC16)
- Well 3: 800 μl 80% ethanol
- Well 4: 800 μl 80% ethanol
- Well 5: 200 μl Elution Buffer (from the innuPREP Blood DNA Kit / IPC16 extraction kit)
Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zu dort schon vorliegenden verschiedenen Lösungen (Isopropanol; absoluter Ethanol bzw. Aceton) gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Der Ablauf der Extraktion erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben Konzentration und Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:
- 1. DNA Leiter (1b Leiter)
- 2. Lysepuffer A + Isopropanol
- 3. Lysepuffer A + abs. Ethanol
- 4. Lysepuffer A + Aceton
- 5. Lysepuffer B + Isopropanol
- 6. Lysepuffer B + abs. Ethanol
- 7. Lysepuffer B + Aceton
- 8. Lysepuffer C + Isopropanol
- 9. Lysepuffer C + abs. Ethanol
- 10. Lysepuffer C + Aceton
- 1. DNA conductor (1b conductor)
- 2. lysis buffer A + isopropanol
- 3. lysis buffer A + abs. ethanol
- 4. Lysis buffer A + acetone
- 5. Lysis buffer B + isopropanol
- 6. lysis buffer B + abs. ethanol
- 7. Lysis buffer B + acetone
- 8. Lysis buffer C + isopropanol
- 9. lysis buffer C + abs. ethanol
- 10. Lysis buffer C + acetone
Wie die Ergebnisse zeigen, können für das erfindungsgemäße Verfahren unterschiedlich zusammengesetzte Lysepuffer wie auch Kombination dieser Lysepuffer mit Alkoholen bzw. auch mit einem Nichtalkohol eingesetzt werden. Dabei können im Lysepuffer chaotrope Salze, kein Salz oder aber nichtchaotrope Salze enthalten sein.As the results show, differently composed lysis buffers as well as combinations of these lysis buffers with alcohols or else with a non-alcohol can be used for the process according to the invention. In this case, chaotropic salts, no salt or else non-chaotropic salts can be present in the lysis buffer.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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