DE3889340T2

DE3889340T2 - Verbreitung von arzneimittelsystemen.

Info

Publication number: DE3889340T2
Application number: DE3889340T
Authority: DE
Inventors: Kenneth D Bagshawe; Michael Jarman; Caroline Joy Springer
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd; Zeneca Ltd
Current assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd; Syngenta Ltd
Priority date: 1987-03-09
Filing date: 1988-03-09
Publication date: 1994-09-01
Anticipated expiration: 2008-03-10
Also published as: EP0408546B1; HK37197A; ATE104861T1; DE3889340D1; JPH02504630A; WO1988007378A1; GB8705477D0; EP0408546A1; JP2739122B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Arzneimittelverabreichungssysteme und insbesondere auf Systeme, bei denen eine Wechselwirkung zwischen Proarzneimitteln und gezielten Triggern für die Vorarzneimittel auftritt.
Die pharmakologische Wirkung von bei der Behandlung von Krankheiten verwendeten Arzneimitteln wird weitgehend durch Unterschiede zwischen den Zellentypen im Körper und deren anatomischem Ort bestimmt. Es ist vorteilhaft, daß die Wirkung von gewissen Arzneimitteln in gewissen Geweben konzentriert ist. Es wurden Arzneimittel entwickelt, die aufgrund von Affinitäten für gewisse Molekülgruppen ein modifiziertes Rückhalteschema im Körper zeigen. Versuche zur Entwicklung von Arzneimitteln, die in gewissen Geweben, wie z. B. Krebsgeweben, selektiv festgehalten werden, haben sich jedoch als schwierig erwiesen, und zwar wegen des Fehlens von spezifischen Molekülkonfigurationen in diesen Geweben, wenn man einmal von den verschiedenen mit Krebs assoziierten Antigenen absieht.
Eine der Hauptschwierigkeiten bei der Behandlung von menschlichem Krebs ist diejenige der Selektivität. Die meisten verwendeten Arzneimittel sind für normales Gewebe genauso cytotoxisch wie für Krebsgewebe.
Es wurden bereits Versuche unternommen, die Behandlung von Krebs dadurch zu verbessern, daß man Antikrebsarzneimittel oder Radionuclide mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten, welche eine gewisse Spezifität für mit Krebs assoziierte Antigene besitzen, koppelt. Die verhältnismäßig hohe Größe dieser Antikörperkonjugate hat jedoch eine langsame Diffusion durch den Körper und in die Tumore zur Folge. Die Konjugate werden dort in einem größeren Ausmaß festgehalten, wo das Antigen eine höhere Konzentration aufweist. Ein maximaler Verteilungsunterschied zwischen Tumorstellen und Nichttumorstellen wird deshalb erst viele Stunden oder Tage nach der Verabreichung erzielt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Konzentration des Antikörper/Arzneimittel-Komplexes sowohl im Nichttumorgewebe als auch im Tumorgewebe auf einen verhältnismäßig niedrigen Wert gefallen. Die Wirksamkeit einer Therapie hängt teilweise vom Konzentrationsverhältnis des aktiven Mittels im Tumorgewebe und im Nichttumorgewebe und von der Zeitdauer ab, während der eine wirksame Konzentration aufrechterhalten wird (oftmals als "Fläche unter der Kurve" (AUC) bezeichnet). Die langsame Weiterleitung von Antikörper/Arzneimittel-Komplexen ergibt Zeit · Konzentrations-Werte, die für therapeutische Zwecke ungünstig sind. Zwar kann demonstriert werden, daß sich 2 bis 10% einer Antikörperdosis in einem Tumortarget von Mäusen lokalisieren, doch liegt beim Menschen die entsprechende Zahl in der Nähe von 0,1%. In der Vergangenheit wurden Versuche unternommen, Antikrebsarzneimittel zu entwickeln, welche die Form von Proarzneimitteln besitzen und welche durch Enzyme aktiviert werden, von denen vermutet wird, daß sie reichlich in gewissen Tumoren vorliegen. Jedoch waren diese Versuche nicht erfolgreich, weil es sich gezeigt hat, daß diese Enzyme entweder nicht in den Tumoren in einer ausreichenden Menge vorlagen oder daß die Verteilung nicht ausreichend speziell war, um die nötige Spezifität der Wirkung zu erzielen. Die enzymatische Aktivierung von Proarzneimitteln in eine aktive Form ist jedoch im Prinzip gut durchführbar, und einige der vielfach verwendeten Antikrebsarzneimittel, wie z. B. Cyclophosphamid und Iphosphamid, sind in der verabreichten Form in aktiv, werden jedoch durch Leberenzyme in aktive Metaboliten umgewandelt.
Es wurde auch gezeigt, daß ein bestimmtes Alkylierungsmittel, nämlich Anilinsenf, durch Konjugation mit einer Glucuronidase in der Leber rasch inaktiviert wird. Das Anilinsenf- Glucuronid kann durch eine Glucuronidase in eine aktive Form zurückgewandelt werden. Unglücklicherweise tritt ein solches Enzym nur bei einer Krebstype in ausreichender Menge auf, und zwar nur in Versuchsmäusen.
Ein weiteres Beispiel ist die Freisetzung des Alkylierungsmittels Phenylendiaminsenf aus dem Peptidyl-Proarzneimittel Valin-Leucin-Lysin-Phenylendiamin-Senf durch Plasmin. Plasmin wird durch die Wirkung von Plasminogenaktivatoren auf Plasminogen erzeugt.
Kürzlich haben wir gezeigt, daß es möglich ist, einen Antikörper oder ein Antikörperfragment mit einem Enzym zu konjugieren, und daß das erhaltene Konjugat seine Antikörperaktivität und seine Enzymaktivität beibehält. Wir waren nunmehr in der Lage, dieses System weiterzuentwickeln, um die selektive Verabreichung und Freisetzung einer cytotoxischen Verbindung an einer vorgewählten Stelle in aktiver Form zu ermöglichen.
Demgemäß betrifft die Erfindung in ihrer breitesten Form ein Zweikomponentensystem für die gemeinsame Anwendung, welches aus den folgenden Komponenten besteht:
(1) einer ersten Komponente, die aus einem Antikörperfragment besteht, welches zu einer Bindung mit einem tumorassoziierten Antigen fähig ist, wobei das Antikörperfragment mit einem Enzym verbunden ist, welches zur Umwandlung eines Proarzneimittels eines cytotoxischen Arzneimittels in das cytotoxische Arzneimittel fähig ist, und (2) einer zweiten Komponente, die ein Proarzneimittel eines cytotoxischen Arzneimittels ist und die unter dem Einfluß des Enzyms, das an das Antikörperfragment von (1) oben gebunden ist, in das cytotoxische Arzneimittel umwandelbar ist.
Der Ausdruck "Tumor", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle Formen eines neoplastischen Zellenwachstums, einschließlich Leukämie.
Gemäß der Erfindung ergibt die Verabreichung der ersten Komponente an einen Säuger mit einem Tumor unter der Voraussetzung, daß die erste Komponente eine solche ist, die das tumorassoziierte Antigen des Tumors erkennt und sich damit verbindet, eine selektive Konzentrierung der ersten Komponente in der Region des Tumors. Nach einer bestimmten Zeit im Anschluß an die Verabreichung der ersten Komponente hat sich ein Teil des Antikörper/Enzym-Komplexes lokalisiert und spezifisch mit tumorassoziierten Antigenen verbunden.
Durch die Auswahl eines geeigneten Proarzneimittels, das normalerweise beträchtlich weniger cytotoxisch ist als das Arzneimittel selbst ergibt sich eine Freisetzung einer wirksamen Menge des cytotoxischen Arzneimittels dort, wo der Antikörper/Enzym-Komplex eine hohe Konzentration aufweist, nämlich an der Targetstelle.
Es ist deshalb ersichtlich, daß ein gewisses Ausmaß einer selektiven Therapie erreicht werden kann, das beträchtlich über dem Selektivitätswert liegt, der durch die bisherigen Methoden erreicht worden ist, insbesondere solche Methoden, bei denen das cytotoxische Arzneimittel direkt an einen gegen ein tumorassoziiertes Antigen gerichteten Antikörper gebunden ist, oder solche Verfahren, die auf dem Vorliegen von endogenen Enzymen in ausreichenden Konzentrationen beruhen, um das cytotoxische Arzneimittel aus dem Proarzneimittel freizusetzen.
Die vorliegende Erfindung ist im Prinzip auf die Verabreichung jeder Type von cytotoxischen Arzneimitteln in Proarzneimittelform anwendbar.
Die Eigenschaften, die jede der Komponenten des Systems haben müssen, werden nunmehr beschrieben. Das antigenische Target oder Epitop, gegen welches der Antikörper gerichtet ist, sollte idealerweise eine stark exprimierte Komponente der Krebszellenmembrane sein, und zwar auch ein solches, welches nicht in Körperflüssigkeiten sekretiert wird. Jedoch zeigen Erfahrungen mit Immunoszintigraphie, daß ein Antigen oder Epitop in gewissem Ausmaß durch normaler Zellen exprimiert werden kann und daß es durch Krebszellen oder normale Zellen in Körperflüssigkeiten abgegeben werden kann, ohne daß die selektive Verteilung des Antikörpers zu den Krebsstellen beeinträchtigt wird, vorausgesetzt, daß es durch die Krebszellen reichlicher sekretiert wird.
Es wurde bereits beträchtliche Forschungsarbeit an Antikörpern und Antikörperfragmenten, die gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sind, ausgeführt, und es sind bereits Antikörper leicht verfügbar, die beispielsweise menschliches chorionisches Gonadotrophin (HCG), alfa-Fetoprotein, carcinoembryonisches Antigen (CEA), placentale alkalische Pbosphatase (PLAP), prostat-spezifisches Antigen, Ca-125 und menschliche Milchfettmembranproteine erkennen und binden.
Der bei der Herstellung des Antikörperfragment/Enzym-Konjugats verwendete Antikörper sollte eine hohe Affinität für das Targetantigen oder Epitop aufweisen, jedoch wurden bereits Antikörper mit einem großen Bereich von Affinitäten erfolgreich bei der Immunoszintigraphie verwendet. Die Antikörper gehören im allgemeinen der IgG-Klasse an, aber andere Klassen von Immunoglobulinen sind nicht ausgeschlossen. Sie können polyclonal oder vorzugsweise monoclonal und weitgehend frei von Verunreinigungen sein. Antikörperfragmente können durch Standardverfahren hergestellt werden. Das im Konjugat verwendete Antikörperfragment kann ein oder mehrere Antigenbindestellen enthalten, und diese können durch verschiedene Techniken mit Enzym konjugiert werden, wie z. B. chemische Bindung oder die Erzeugung eines Hybridmoleküls durch genetische Maßnahmen. Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindestellen, die ähnliche oder unterschiedliche Spezifitäten aufweisen, können durch Standardverfahren hergestellt werden, die das Fc-Fragment entfernen, oder sie können durch Verbinden zweier Fragmente mit nur einer Antigenbindestelle oder durch genetische Maßnahmen erzeugt werden. Die Natur der chemischen Bindung oder Brücke zwischen den beiden Fragmenten sollte derart sein, daß sie in vivo nicht zerbrochen wird, und die Brücke zwischen den Fragmenten in einem künstlichen Antikörper kann durch eine geeignete chemische Struktur zum Verbinden von Enzymen geschaffen werden. Da Enzyme Makromoleküle sind, ist ein Konjugat, das einen intakten Antikörper und ein Enzym enthält, wesentlich größer als der Antikörper alleine, wodurch die Lieferung des Komplexes an die Krebsstellen weiter verzögert werden kann. Antikörperfragmente, wie F(ab')&sub2;, sind kleiner und unterliegen nicht einer nichtspezifischen Bindung aufgrund der Fc-Komponente, weshalb sie als Antikörperkomponente im Antikörper/Enzym-Konjugat verwendet werden, obwohl andere Antikörperfragmente, wie z. B. Fab&sub1;, nicht ausgeschlossen sind.
Es ist eine große Auswahl von geeigneten Enzymen verfügbar, wie z. B. Hydrolasen, Amidasen, Sulphatasen, Lipasen, Glucuronidasen und Carboxypeptidasen sowie Phosphatasen, z. B. Carboxypeptidase G2.
Aus der Verwendung eines nicht-mammalischen Enzyms ergeben sich Vorteile, da eine vorzeitige Freisetzung des cytotoxischen Arzneimittels aus dem Proarzneimittel durch endogene Enzyme vermieden wird, wenn die Freisetzung des cytotoxischen Arzneimittels aus dem Proarzneimittel nur durch die Einwirkung eines nicht-mammalischen Enzyms er reichbar ist.
Das Anitkörperfragment und das Enzym werden normalerweise in einem Verhältnis von 1 : 1 miteinander verknüpft, da dies die einfachste Anordnung ergibt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf solche 1 : 1-Verhältnisse beschränkt.
Um chemisch ein Enzym und einen Antikörper zufriedenstellend in einem 1 : 1-Verhältnis zu verbinden, muß ein heterobifunktionelles Verbindungsmittel verwendet werden, das unter physiologischen Bedingungen nicht labil ist. Beispielsweise kann Carboxypeptidase G2 mit einem geeigneten Antikörper verbunden werden, indem der Antikörper mit Thiolgruppen angereichert wird und das Enzym mit einem bifunktionellen Mittel behandelt wird, das zu einer Reaktion mit diesen Thiolgruppen fähig ist, wie z. B. der N-Hydroxy-succinimidester von Jodoessigsäure NHIA (Rector et al), N-Maleimidobenzoyl-succinimidester MBS (Sigma Ltd.), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyl-dithio)-propionat SPDP (Pharmacia Ltd.). Jedoch können auch andere vorveröffentlichte Reaktionen verwendet werden, die eine nicht-labile Bindung ergeben. Auch die Verwendung von handelsüblichen bifunktionellen Mitteln ist möglich. Die erhaltene Verbindung ist bezüglich der Brücke nichts besonderes. Es müssen nur die enzymatische und die immunologische Aktivität aufrechterhalten werden. Die Bindungsverfahren können auf fragmentierte Antikörper (wie Fab'&sub2;-anti-HCG) und auch auf Antikörper oder fragmentierte Antikörper angewendet werden, die sich gegen andere bekannte tumorassoziierte Antigene richten, wie sie oben genannt wurden.
Es ist leicht einzusehen, daß das Prinzip der vorliegenden Erfindung auf die Verabreichung eines jeden cytotoxischen Arzneimittels angewendet werden kann, welches sich in ein Proarzneimittel umwandeln läßt, das unter der selektiven Wirkung eines Enzyms in das cytotoxische Arzneimittel zurückverwandelt wird. So können Proarzneimittel aus den verschiedenen Klassen von Antitumorverbindungen hergestellt werden, wie z. B.
1. Alkylierungsmittel (Stickstoffsenfe), z. B. Cyclophosphamid, Bisulphan, Chlorambucil, Nitrosoharnstoffe usw.;
2. intercalierende Mittel, z. B. Adriamycin und Dactinomycin;
3. Spindelgifte, z. B. Vinca-Alkaloide; und
4. Antimetaboliten, z. B. Antifolate, Antipurine, Antipyrimidine oder Hydroxyharnstoff.
Unsere Versuche haben sich zu diesem Zeitpunkt auf die Verwendung von Stickstoffsenfen konzentriert. Ein Proarzneimittel, welches bei der vorliegenden Erfindung von Interesse ist, ist Bis(2-chloroethyl)-aminobenzoesäure, bei der der Carbonsäurerest durch Amidierung mit Glutaminsäure geschützt ist. Die Glutamylseitenkette kann später enzymatisch entfernt werden, z. B. durch die Verwendung von Carboxypeptidase, um den Stickstoffsenffreizusetzen.
Gewisse der Stickstoffsenfe, die auf Benzoesäure basieren, und substituierte Derivate davon, welche durch Amidierung der carboxygruppe mit beispielsweise Glutaminsäure geschützt sind, stellen neue Verbindungen dar.
Die neuen Verbindungen umfassen solche der Formel,
worin M für eine disubstituierte Amino-"senf"-Gruppe steht und R für den Rest einer α-Aminosäure RNH&sub2; steht, wobei M Die neuen Verbindungen können entweder aus der entsprechenden Verbindung der Formel
oder
bedeutet.
Die neuen Verbindungen können entweder aus der entsprechenden Verbindung der Formel
durch Umsetzung mit einem Reagenz, das die HO-Gruppe durch Cl oder CH&sub3;SO&sub3; ersetzt, oder durch Umsetzung des Stickstoffsenfs der Formel
oder eines reaktiven Carboxyderivats davon mit einer carboxy-geschützten Aminosäure RNH&sub2; und Entfernung der Carboxyschutzgruppe hergestellt werden.
Beispielsweise können diese neuen Verbindungen, z. B. wenn die Benzoesäure durch eine (2-Chloroethyl)(2-chloroethyl)amino-Gruppe zu substituieren ist, aus einer im Handel verfügbaren Verbindung der Formel I, nämlich dem durch Ethyl geschützten Derivat von p-Aminobenzoyl-glutaminsäure, durch die folgenden Reaktionen hergestellt werden:
Andere neue Benzoesäurestickstoffsenf-Derivate stehen für die Demonstrierung des Nutzeffekts der Erfindung zur Verfügung, wie z. B. p-N-Bis-(mesyl)-amino-benzoyl-glutaminsäure.
Zwar sind die Benzoesäurestickstoffsenfe zur Demonstration der verschiedenen Aspekte des vorliegenden Systems auf experimentellem Wege brauchbar, aber der Unterschied in der Toxizität zwischen dem aktiven Arzneimittel und dem Proarzneimittel in Zellenkulturexperimenten ist nur 5- bis 10-fach. Vermutlich ist das auch in vivo der Fall. Arzneimittel für die klinische Anwendungen erfordern es, daß dieser Unterschied größer ist, und zwar mindestens 100-fach und vorzugsweise 500- bis 1000-fach. Beispiele für solche Proarzneimittel sind Anthracycline, bei denen die endständige Aminogruppe als Amid mit einer D-Aminosäure derivatisiert ist, und Stickstoffsenfe auf der Basis von p-Phenylendiamin mit halogen-substituierten Alkanamidogruppen. Beispielsweise können Peptidyl-Proarzneimittel und Adriamycin und dessen Analogen, die an der essentiellen Aminogruppe (d. h. R') derivatisiert sind
verwendet werden, da sie nachfolgend als aktive Arzneimittel durch die oben erwähnten oder ähnliche Enzyme freigesetzt werden können, wodurch das Gebiet dieses Bereichs von Anthracyclin-Arzneimitteln eröffnet wird.
Es können auch andere Antikörper/Enzym-Konjugate mit einem entsprechenden Proarzneimittel verwendet werden. Als Enzym kann Endoproteinase Lys-C von Lysobacterenzymogenen (erhältlich von Boehringer Mannheim) verwendet werden, welche Peptide spezifisch an der Carboxylgruppe des Lysylrestes hydrolysiert. Dieses Enzym besitzt ein Molekulargewicht von 37 500 und ein pH-Optimum von 7,7, wodurch es sich dazu eignet, einen Stickstoffsenf aus einem lysylreichen Peptidyl-Proarzneimittel freizusetzen. Clostripain (E C 3.4.22.8) aus Clostridium histolyticurn ist eine hochspezifische Endoprotease (erhältlich von Boehringer Mannheim), welche Peptide vorzugsweise an der Carboxylstelle von L-Arginin spaltet. Clostripain spaltet auch Arginin/ Prolin-Peptidbindungen, die normalerweise durch Proteasen nicht angegriffen werden. Sein Molekulargewicht von 50 000 und sein pH-Optimum von 7,6 macht es zu einem geeigneten Kandidaten für die Konjugation mit einem Antikörper, um Stickstoff in Partnerschaft mit einem Senf aus einem arginyl-prolyl-modifizierten Stickstoffsenf in Freiheit zu setzen.
Es ist auch möglich, ein Enzym zu verwenden, welches ein toxisches Nucleosid aus einem assoziierten Nucleotid freisetzt.
Das erfindungsgemäße Zweikomponentensystem kann durch aufeinanderfolgende Verabreichung angewendet werden, wobei die erste Komponente, nämlich das Antikörperfragment/Enzym- Konjugat, zuerst und dann das Proarzneimittel verabreicht wird. Um eine maximale Konzentration des Konjugats an der Stelle der gewünschten Behandlung sicherzustellen, ist es normalerweise erwünscht, einen Abstand bei der Verabreichung der beiden Komponenten von mindestens 4 h einzuhalten. Das genaue Regime wird durch verschiedene Faktoren beeinflußt, wie z. B. die Natur des zu treffenden Tumors und die Natur des Proarzneimittels, aber im allgemeinen liegt eine ausreichende Konzentration des Konjugats an der Stelle der gewünschten Behandlung innerhalb von 24 h und häufig innerhalb von 12 oder sogar 8 h vor, so daß das Proarzneimittel dann zu diesem Zeitpunkt verabreicht werden kann.
Die beiden Komponenten werden normalerweise parenteral verabreicht, weshalb die Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt Formulierungen des Konjugats und Formulierungen des Proarzneimittels umfaßt, wobei die Formulierungen sich für parenterale Verabreichung eignen. Die Verabreichung erfolgt normalerweise intravenös und solche Formulierungen werden zweckmäßig als isotonische Kochsalzlösungen für Injektion formuliert.
Zum Zwecke der Demonstrierung des Nutzeffekts der Erfindung haben wir mit einem Modellsystem gearbeitet, bei welchem ein monoclonaler Antikörper W14A, der sich gegen menschliches chorionisches Gonadotrophin (HCG) richtet, und F(ab')&sub2;- Fragmente des gleichen Antikörpers (2,4) verwendet werden, die von Damon Biotech Ltd., Kirkton Campus, Livingston, EH54, 7BT, Schottland, erhältlich sind.
Bei unseren Versuchen haben wir das Enzym Carboxypeptidase G2, ein Folat abbauendes Enzym, das aus Pseudomonas (3) isoliert wurde, verwendet, da es sich hierbei um ein Enzym handelt, von dem bekannt ist, daß es Glutamatreste von Folaten, Methotrexat und von Stickstoffsenfen, die sich von p-Aminobenzoesäure ableiten, entfernen kann. Die Konjugate, die zwischen Carboxypeptidase G2 und den F(ab')&sub2;-Fragmenten des monoclonalen Antikörpers (W14A) unter Verwendung der oben erwähnten Reagenzien erzeugt worden sind, haben die enzymatische und immunologische Aktivität beibehalten. Das Konjugat zwischen Carboxypeptidase G2 und den F(ab')&sub2;- Fragmenten des monoclonalen Antikörpers (W14A), der gegen HCG gerichtet ist, ist eine neue Verbindung und stellt einen weiteren Teil der Erfindung dar.
Das Proarzneimittel (p-N-Bis-(2-chloroethyl)-aminobenzoylglutaminsäure) und das aktive Arzneimittel (Benzoesäuresenf), welche durchgehend in den Beispielen verwendet wurden, wurden durch die oben beschriebenen allgemeinen Verfahren für die Herstellung der (2-Chloroethyl)-(2-mesylethyl)-Verbindung erzeugt, wobei jedoch das Mesylchlorid durch Thionylchlorid ersetzt wurde. Wie bereits erwähnt, ist jedoch wegen des relativ kleinen Unterschieds in der Toxizität zwischen dem Arzneimittel und dem Proarzneimittel dieses betreffende Proarzneimittel für die Verwendung beim Menschen nicht vorgesehen.
Beispiel 1 ist ein Vergleich zwischen einem Konjugat aus dem ganzen W14A und seinen F(ab')&sub2;-Fragmenten, welche an CPG2 gebunden sind.
Die Versuche von Beispiel i zeigen die überlegenen Eigenschaften des fragmentierten Konjugats gegenüber dem Konjugat mit intaktem W14A. Die weiteren Beispiele betreffen nur die Verwendung des fragmentierten Konjugats.

BEISPIEL 1

Vergleich zwischen Konjugaten mit intaktem Antikörper und F(ab')&sub2;-Konjugaten

Intaktes W14A und F(ab')&sub2;-Fragment wurden mit CPG2, das mit 131 oder ¹²&sup5;J markiert war, unter Verwendung der Kupplungsreagentien N-Maleimidobenzoyl-succinimidester (MBS) und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) konjugiert, wobei Thioetherbindungen (6) bzw. Disulfidbindungen (7) gebildet wurden. Die Ausbeuten der Kupplungsreaktionen bezüglich des Antikörpers waren ungefähr 27% für SPDP und 40% für MBS im Anschluß an die Trennung von ungekuppeltem Antikörper und CPG2, was durch Gelfiltration auf Ultragel AcA34 bestimmt wurde (8).
W14A/¹³¹J-CPG2-Konjugate wurden unter Verwendung von CPG2 einer spezifischen Aktivität von 960 uCi/mg hergestellt.
Die spezifische Radioaktivität des MBS-gebundenen W14A/CPG2- Konjugats war 0,24 uCi/ug, während diejenige des SPDP-gebundenen W14A/CPG2-Konjugats 0,21 uCi/ug war.
F(ab')&sub2;/¹³¹J-CPG2-Konjugate wurden unter Verwendung von CPG2 einer spezifischen Aktivität von 1048 uCi/mg hergestellt. Die spezifische Radioaktivität des MBS-gebundenen F(ab')&sub2;/ CPG2-Konjugats war 0,36 uCi/ug, während diejenige des SPDP- gebundenen F (ab')&sub2;/CPG2-Konjugats 0,34 uCi/ug war.
Für Bildstudien wurden intakte W14A/¹³¹J-CPG2-Konjugate i.v. oder i.p. in nackte Ratten injiziert, die CC3-Choriocarcinoma-Xenografte trugen (9). F (ab')&sub2;/¹³¹J-CPG2-Konjugate wurden nur auf der i.v. Route verabfolgt. Die Tiere wurden unter Verwendung einer Nuclear Enterprises LFOV-gamma- Kamera abgetastet.
Zur Messung der quantitativen Gewebeverteilung wurden Gruppen von vier nackten Mäusen verwendet, die CC3-Xenografte trugen. Die Konjugate wurden mit CPG2, das mit ¹²&sup5;J markiert war, hergestellt und i.v. injiziert, wobei die Tiere jeweils annähernd 2 uCi/45 ug erhielten. Gruppen von Tieren wurden in Intervallen von 24 h getötet, um Gewebeproben zu sammeln, die in 6M KOH aufgelöst und auf einem LKB-Modell 80 000 "Compugamma"-Zähler ausgezählt wurden.

ERGEBNISSE

Konjugate, die nur in CPG2-Teil markiert waren, wurden verwendet, damit jeder bestimmte Lokalisierungseffekt unzweideutig der Lokalisierung von Konjugat und nicht von ungekuppeltem Antikörper, der schwierig vollständig aus Konjugatpräparaten zu entfernen ist, zugeordnet werden konnte (8). Die Zirkulationshalbwertszeit von nativem CPG2 ist sehr kurz, ungefähr 3 h in Mäusen und 1 h in Ratten, so daß freies Enzym rasch geklärt wird. Das Enzym sammelt sich anscheinend nicht in einem wesentlichen Ausmaß in irgendeinem Gewebe an (5).

(i) W14A/CPG2-Konjugate

Die nach 24 h und nach 48 h erhaltenen gamma-Kamera-Bilder sind in den Fig. 1a bzw. 1b dargestellt. Im Falle von Tieren, die i.v. mit MBS- und SPDP-gebundenen Konjugaten injiziert worden waren, wurde die Tumorstelle klar definiert, was bestätigt, daß eine Lokalisierung stattgefunden hat. Es bestand jedoch auch eine beträchtliche hepatische Aufnahme. Wie erwartet, wurde natives Enzym rasch aus der Zirkulation geklärt, und es wurde keine Tumoraufnahme oder hepatische Aufnahme beobachtet.
Die SPDP-gebundenen Konjugate wurden aus dem Tumor rascher als das MBS-gebundene Material geklärt, vermutlich weil die Disulfidbindung weniger stabil ist. Frühere Berichte lassen vermuten, daß die Disulfidbindungen in vivo labil sind (10, 11), weshalb dieses Bindungsverfahren anscheinend für die vorliegende Anwendung ungeeignet ist.
Tiere, die i.p. mit Konjugaten injiziert worden waren, zeigten keine Tumoraufnahme, wobei das SPDP-gebundene Konjugat nach 48 h geklärt war und das MBS-gebundene Konjugat in der Leber und im Blut festgehalten wurde. Pharmakokinetische Studien (unveröffentlichte Daten) ergaben, daß eine i.p. Injektion eine langsame Freisetzung von Konjugat in die Zirkulation ergibt, wobei die Spitzenwerte nur 30% einer vergleichbaren i.v. Dosis betragen.

(ii) F(ab')&sub2;/CPG2-Konjugate

Die 24 h und 72 h nach i.v. Injektion erhaltenen gamma- Kamera-Bilder sind in den Fig. 2a und 2b gezeigt. Das MBS-gebundene Konjugat zeigte ein scharfes Tumorbild bei wenig oder gar keiner Aufnahme in die Leber. Das SPDP-gebundene Konjugat zeigte eine gewisse Aufnahme durch die Leber nach 24 h, aber dieses Material war nach 72 h geklärt. Es fand wesentlich weniger Tumoraufnahme statt, und diese Ergebnisse bestätigen die Ungeeignetheit von SPDP-gebundenen Konjugaten für Tumorbilder.

(iii) Quantitative Gewebeverteilung des Antikörper/Enzym- Konjugats

Die Gewebeverteilung von MBS-gebundenen W14A/ und F(ab')&sub2;/ CPG2-Konjugaten in Tumor, Blut und Leber sind in Tabelle 1 aufgeführt. TABELLE 1 Hauptsächlich Gewebeaufnahme von W14A und seinem F(ab')&sub2;-Fragment im Vergleich mit W14A/CPG2- und F(ab')&sub2;/CPG2-Konjugaten Tumor Blut Leber
Die Werte sind als Prozentsätze der injizierten Dosis je Gramm Gewebe ausgedrückt und mit intakten W14A- und F(ab')&sub2;-Fragment-Vergleichsproben verglichen. Die Resultate können wie folgt zusammengefaßt werden:
Die Werte für F(ab')&sub2;/CPG2 im Blut waren
- vergleichbar mit denjenigen,. die für W14A/CPG2-Konjugat gefunden wurden
- ungefähr 50% der Werte von intaktem W14A
- ungefähr 3-fach höher als diejenigen von nativen F(ab')&sub2;- Fragmenten.
Die Tumoraufnahme von F(ab')&sub2;/CPG2 war
- vergleichbar mit derjenigen, die mit nativem W14A erhalten wurde
- 3-fach höher als die Werte, die mit W14A/CPG2-Konjugat oder freiem F(ab')&sub2; erhalten wurden.
Die Leberaufnahme von F(ab')&sub2;/CPG2 war
- niedriger als diejenigen von nativem W14A
- ähnlich den Werten, die mit intaktem W14A/CPG2-Konjugat oder F(ab')&sub2;-Fragmenten erhalten wurden.
Die Aufnahmewerte von F(ab')&sub2;-Konjugaten in Lunge, Milz, Niere, Dickdarm und Muskeln folgten einem ähnlichen Schema wie bei der Leber, wobei die Werte bei nativen F(ab')&sub2;- Fragmenten und W14A/CPG2-Konjugat ähnlich waren.
Dies demonstriert die Vorteile, die durch die Verwendung von F(ab')&sub2;/CPG2-Konjugaten gegenüber den W14A/CPG2-Konjugat erhalten werden, da das Verhältnis des Fragment-Konjugats im Tumor im Vergleich zum Blut 3-fach höher liegt als beim W14A-Konjugat, obwohl der Untergrundwert des Fragment- Konjugats in anderen Organen demjenigen von W14A/CPG2 ähnlich ist.

BEISPIEL 2

in vitro-Cytotoxizität von Proarzneimittel und Arzneimittel

Dieses Beispiel zeigt, daß die Toxizitätsbeziehung zwischen einer cytotoxischen Verbindung und ihrem weniger toxischem Proarzneimittel.
Die 50%ige Wachstumsinhibierungsdosis (ID50) für MAWI- Zellen (colorectaler Krebs) in vitro (5 · 10&sup4; Zellen/ml) war 25 uM beim aktiven Arzneimittel (Benzoesäuresenf). Die maximale Inhibierung, die mit dem Proarzneimittel erreicht werden konnte, war 7% bei einer Konzentration von 400 uM.
Der ID50-Wert für das Proarzneimittel auf MAWI-Zellen mit Carboxypeptidase G2 (CPG2), die in dem Medium mit einer Konzentration von 6 Einheiten vorlag, war 30 uM (d. h. sehr ähnlich demjenigen für das aktive Arzneimittel).
Bei LS174-Zellen (colorectaler Krebs) war der ID50-Wert für das aktive Arzneimittel 30 uM und auch für das Proarzneimittel in Gegenwart von CPG2 in einer Konzentration von 6 Einheiten. Das Proarzneimittel alleine inhibierte bei 400 uM das Wachstum um 15% im Vergleich zu den unbehandelten Vergleichskulturen.

BEISPIEL 3

in vivo-Verteilung von Proarzneimittel und aktivem Arzneimittel im Plasma nach 24 und 48 h nach der Verabreichung eines Antikörper/Enzym-Konjugats

Nackte Mäuse, die einen menschlichen Choriocarcinom-Tumor (CC3) trugen, erhielten 29 Einheiten CPG2, das mit Anti- HCG (W14 Fab&sub2;) konjugiert war, und sie erhielten nach 24 oder 48 h Proarzneimittel (41 uM/kg). Vergleichsmäuse erhielten die gleiche Dosis Proarzneimittel, aber kein CPG2-W14(Fab&sub2;)-Konjugat.
In den Vergleichsmäusen fiel die Plasmakonzentration des Proarzneimittels von 5 uM 5 min nach der Injektion auf 0,8 uM nach 3 h. Das aktive Arzneimittel wurde nach 2 h feststellbar, wobei es 3 h nach der Injektion auf 15 uM stieg. Mäuse, die Proarzneimittel und CPG2-W14(Fab&sub2;) erhielten, hatten Proarzneimittelwerte von 2,8 uM 5 min nach der Injektion und 0,5 uM nach 60 min. Das aktive Arzneimittel wurde nach 5 min mit 200 uM und nach 3 h mit 2 uM festgestellt.
Ob nun CPG2-W14(Fab&sub2;) 24 h oder 48 h vorher verabreicht worden war, es bestand jeweils 5 min nach der Verabreichung des Proarzneimittels eine 10-fach höhere Konzentration des aktiven Arzneimittels im Plasma, als dies sogar nach 150 min in Vergleichstieren der Fall war, die kein CPG2-W14(Fab&sub2;) erhielten. Dies zeigt, daß die Umwandlung von Proarzneimittel in aktives Arzneimittel in vivo in Gegenwart des Antikörper/Enzym-Konjugats wirksam ablief.

BEISPIEL 4

Verteilung von Proarzneimittel und aktivem Arzneimittel in vivo (Plasma und Tumor)

Mäuse der Gruppe 1 erhielten Proarzneimittel mit 41 uM/kg und wurden ausgeblutet, und Gewebe wurden 5, 15, 30, 60, 120 und 240 min später entfernt.
Mäuse der Gruppe 2 erhielten aktives Arzneimittel mit einer äquivalenten Molarität (41 uM/kg), wurden aber sonst wie die Mäuse der Gruppe 1 behandelt.
Mäuse der Gruppe 3 erhielten 29 Einheiten CPG2-W14(Fab&sub2;)- Konjugat 48 h vor dem Proarzneimittel, wurden aber sonst wie die Mäuse der Gruppe 1 behandelt.
Plasma:
In der Gruppe 1 fiel die Spitzenkonzentration des Proarzneimittels von 30 uM in 120 min auf 2 uM. Das aktive Arzneimittel konnte erst nach 120 min festgestellt werden und stieg nach 240 min auf 40 uM.
In der Gruppe 3 war die Konzentration des aktiven Arzneimittels nach 5 min 100 uM, nach 30 min 150 uM und nach 240 min 60 uM.
Tumor:
In der Gruppe 1 war die Tumorkonzentration des Proarzneimittels nach 5 min 8 uM und fiel nach 240 min auf 0,4 uM Das aktive Arzneimittel konnte nach 240 min mit gerade 0,6 uM entdeckt werden.
In der Gruppe 2 war die Konzentration des aktiven Arzneimittels nach 30 min 35 uM und nach 240 min 18 uM.
In der Gruppe 3 variierten die Konzentrationen des aktiven Arzneimittels während der gesamten Studienzeit um 20 uM.
Zwar ist die Plasmakonzentration für die Gruppe 3 höher als die Tumorkonzentration, aber die Tumorwerte berücksichtigen nicht das Arzneimittel, welches covalent an DNA gebunden ist, welches nicht durch das verwendete Extraktionsverfahren freigesetzt wird.

BEISPIEL 5

Therapeutisches Experiment mit CC3-Tumor

Nackte Mäuse, welche einen menschlichen Choriocarcinoma- Tumor trugen, erhielten Kochsalzlösung (Gruppe A) oder ein Präparat des Proarzneimittels, und zwar 9 mg (Gruppe B) oder 22,5 mg (Gruppe C), 48, 60 und 72 h nach der Verabfolgung von 100 Einheiten CPG2-W14(Fab&sub2;). Tumorvolumina wurden durch Messung in 3 Ebenen und Berechnung erhalten (Fig. 3). Die Mäuse der Gruppe B zeigten eine Verzögerung im Einsetzen des Tumorwachstums, wobei die höheren Arzneimitteldosen eine vollständige Regression des Tumors erzeugten.

BEISPIEL 6

p[(2-Mesylethyl)(2-chloroethyl)-amino]benzoyl-glutamid (Verbindung IV) wird durch das oben erläuterte Reaktionsschema hergestellt, und zwar ausgehend von p-Bis(2-Hydroxyethyl)amino-benzoyl-glutamid-ethylester, selbst hergestellt wird durch Umsetzung von p-Aminobenzoyl-glutamid-ethylester mit Ethylenoxid durch bekannte Verfahren. Die Bis-2- hydroxyethyl-Verbindung wird 10 min bei 80ºC in Pyridin auf Rückfluß gehalten, wobei eine 3 : 1-(molar)-Mesylchlorid/ Dihydroxy-Verbindung verwendet wird, um ein Reaktionsprodukt zu erzielen, das 17 bis 20 Gew.% des gewünschten Diethylesters der Verbindung IV-enthält. Die Massenspektrometrie des gereinigten Diethylesters zeigt ein Molekulargewicht von 506. Die Diethylester-Schutzgruppen werden dann entfernt, indem zunächst eine Behandlung mit wäßrigem Natriumhydroxid durchgeführt wird und hierauf das erhaltene Dinatriumsalz mit wäßriger Salzsäure behandelt wird, so daß ein Produkt entsteht, das die Verbindung IV enthält. Die Verbindung IV wird aus dem Reaktionsprodukt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie in 25% Acetonitril/Wasser, das 1% Essigsäure enthält, isoliert. Die Verbindung IV eluiert in 306 min. Das eluierte Produkt ist gemäß Dünnschichtchromatographie die reine Verbindung IV. Die Verbindung IV wurde für weitere Identifikationsprozesse in ihren Dimethylester umgewandelt, und die Massenspektrometrie ergab ein Molekulargewicht von 478.
Die entsprechende Bis(2-mesyloxyethyl)-Verbindung wurde durch ein ähnliches Verfahren hergestellt, wobei die Reaktion mit Mesylchlorid 20 min bei 2ºC in Pyridin ausgeführt wurde, wobei eine 3 : 1-(molar)-Mesylchlorid/Dihydroxy-Verbindung verwendet wurde.

REFERENZEN

1. Begent, R.H. J. (1985), Biochim. Bioohys. Acta, 780 : 151-166.
2. Searle, F., Adam, T. und Boden, J.A. (1986), Cancer Immunol., Immunother., 21 : 205-208.
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11. Trowbridge, I.S. und Domingo, D.L. (1981), Nature (Lond.), 294 : 171-173.

Claims

1. Zweikomponentensystem für die gemeinsame Anwendung, welches aus den folgenden Komponenten besteht:

(i) einer ersten Komponente, die aus einem Antikörperfragment besteht, welches zu einer Bindung mit einem tumorassoziierten Antigen fähig ist, wobei das Antikörperfragment mit einem Enzym verbunden ist, welches zur Umwandlung eines Proarzneimittels eines cytotoxischen Arzneimittels in das cytotoxische Arzneimittel fähig ist, und

(ii) einer zweiten Komponente, die ein Proarzneimittel eines cytotoxischen Arzneimittels ist und die unter dem Einfluß des Enzyms in das cytotoxische Arzneimittel umwandelbar ist.

2. System nach Anspruch 1, bei welchem der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.

3. System nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Antikörper der IgG-Klasse angehört.

4. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Antikörperfragment ein F(ab')&sub2;-Fragment ist.

5. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Enzym von nicht-mammalischem Ursprung ist.

6. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Enzym eine Carboxypeptidase ist.

7. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Proarzneimittel ein Amid ist, das durch Umsetzung einer disubstituierten Aminobenzoesäure-stickstoffsenf-Verbindung und einer Aminosäure erhältlich ist.

8. System nach Anspruch 7, bei welchem die Aminosäure aus Glutaminsäure besteht.

9. System nach einem der Ansprüche 7 oder 8, bei welchem die Stickstoffsenf-Verbindung p-Bis(2-chloroethyl)aminobenzoesäure ist.

10. System nach Anspruch 7 oder 8, bei welchem die Stickstoffsenf-Verbindung p-[(2-Chloroethyl)(2-mesylethyl)amino]benzoesäure oder p-Bis(2-mesylethyl)aminobenzoesäure ist.

11. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Verwendung in einem Verfahren zur Bekämpfung des Wachstums von neoplastischen Zellen in einem Wirt, bei welchem an den Wirt eine erste Komponente und später eine zweite Komponente verabreicht wird.

12. System nach Anspruch 11, bei welchem sowohl die erste Komponente als auch die zweite Komponente für eine intravenöse Verabreichung eingerichtet ist.