MX2012000979A - Composición enzimática para la digestión de embriones de pollo. - Google Patents
Composición enzimática para la digestión de embriones de pollo.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición enzimática para la digestión de embriones de pollos destinados a la preparación de células que se utilizan para la producción de virus; la presente invención también se refiere a un método para producir un virus tipo silvestre, uno atenuado y/o uno recombinante que comprende un paso de preparación de células a partir de embriones de pollos utilizando una composición enzimática de la invención; la presente invención se refiere a un virus purificado tipo silvestre, atenuado y/o recombinante obtenido y a una composición farmacéutica, preferiblemente una vacuna, que comprende dicho virus para el tratamiento y/o la prevención de un cáncer, enfermedad infecciosa y/o trastorno autoinmune, y usos del mismo.
Description
COMPOSICIÓN ENZIMÁTICA PARA LA DIGESTIÓN DE EMBRIONES DE
POLLO
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención pertenece al campo de producción de virus. En particular, la invención se refiere a una composición enzimática para la digestión de embriones de pollo destinados a la preparación de células que se usan para la producción de virus.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La mayoría de las vacunas virales tales como virus atenuados o recombinantes se fabrican a partir de células de pollo primarias o secundarias tales como por ejemplo fibroblastos de embrión de pollo (CEF5), células renales de embrión de pollo (CEKC5) o células hepáticas de embrión de pollo (CELCs). Las CEFs primarias se usan notablemente para la producción de vacunas de virus de encefalitis japonesa (fabricadas por v.gr., Pasteur Merieux), vacunas de virus de fiebre amarilla (fabricadas por v.gr., Arilvax), vacunas de virus de la influenza (fabricadas por v.gr., Medeva Pharmaceuticals), vacunas de virus de sarampión y viruela (fabricadas por v.gr., Merck) y vacunas de virus de vaccinia Ankara modificadas (MVA).
Se han desarrollado varios métodos para generar preparaciones de células de tejidos primarios. Estos métodos implican el uso de disociación mecánica, disociación enzimática o una combinación de ambas. La disociación mecánica consiste por ejemplo de raspar los embriones con un escalpelo, triturar los embriones o cortar físicamente los embriones separándolos. La disociación mecánica excesiva a menudo implica producir una cantidad significativa de muerte celular y daño celular. Más aún, la naturaleza manual de ciertos protocolos de disociación mecánica (v.gr., trituración, que se hace manualmente) a menudo hace difícil comparar valores medidos (tales como viabilidad de las células) de diferentes fuentes ya que la eficiencia de disociación varía entre los individuos. De hecho, la naturaleza manual de este procedimiento puede contribuir a diferencias en los atributos físicos (v.gr., concentración de células, viabilidad de las células, distribución del tamaño de las células) entre dos muestras de otra manera idénticas. En un intento para evitar las consecuencias negativas de la disociación mecánica, se usó tripsina de páncreas de bovino. Infortunadamente, la tripsina de páncreas de bovino puede contener agentes patógenos tales como virus. Por lo tanto, hay un riesgo potencial de que estos agentes patógenos sean transmitidos a los animales o humanos para ser tratados o vacunados con la vacuna. Uno de los muchos problemas potenciales importantes asociados con la tripsina de páncreas de bovino comúnmente usada es la posibilidad de transmitir el agente que causa la encefalitis espongiforme de bovinos (BSE) a los animales o humanos que entran en contacto con los productos producidos del cultivo de células. Como consecuencia, se ha desarrollado la tripsina recombinante para la producción de vacunas a partir de células primarias o secundarias.
La solicitud de patente internacional WO 2004/022729 describe un método para la amplificación de un poxvirus en CEFs primarias, en donde dichas CEFs se obtienen de embriones de pollo tratados con una solución precalentada (37°C) de tripsina-EDTA durante 15 minutos en presencia de medio libre de suero a temperatura ambiente.
La solicitud de patente internacional WO 2006/116803 describe un método pera producir células madre de embriones de mamífero en donde los embriones pueden ser sumergidos en una solución precalentada de tripsina por entre 5 y 60 minutos dependiendo del tamaño de los embriones.
Un problema importante para la producción de vacunas a partir de células de pollo primarias es la provisión de una cantidad suficiente de embriones. A fin de reducir el número de embriones requeridos, las composiciones enzimáticas que conducen a la obtención de preparaciones de células que consisten en un número máximo de células extraídas por embrión son necesarias. La presente invención provee dichas composiciones. La presente invención provee muy particularmente composiciones enzimáticas para la digestión de embriones de pollo que conducen a la obtención de preparaciones de células que consisten en más de 500 106 células extraídas por embrión. Las composiciones enzimáticas de la invención además pueden digerir embriones de pollo que no han sido previamente disecados.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
Como se usa a lo largo de la solicitud entera, "un" y "una" se usan en el sentido que significan "por lo menos uno", "por lo menos un primer", "uno o más" o "una pluralidad" de los componentes o pasos mencionados, a menos que el contexto determine claramente otra cosa.
Como se usa a lo largo de la solicitud entera, "y/o" siempre que se use aquí incluye el significado de "y", "o" y "todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término".
Como se usa a lo largo de la solicitud entera, "que comprende" y
"comprende" significan que los productos, composiciones y métodos incluyen los componentes o pasos mencionados, pero no excluyen otros. "Que consiste esencialmente de", cuando se usa para definir productos, composiciones y métodos, significará excluir otros componentes o pasos de cualquier importancia esencial. Por lo tanto, una composición que consiste esencialmente de los componentes mencionados no excluiría contaminantes traza y vehículos farmacéuticamente aceptables. "Que consiste de" significará excluir más que elementos traza de otros componentes o pasos.
Como se usa a lo largo de toda la solicitud, "aproximadamente" o "alrededor de" como se usa aquí significa dentro de 20%, preferiblemente dentro de 10%, y muy preferiblemente dentro de 5% de un valor o intervalo dado.
La presente invención se refiere a una composición enzimática para la digestión de embriones de pollo destinados a la preparación de células, seleccionadas del grupo una modalidad especial, dichas células se pueden usar para la producción de virus.
La presente invención se refiere muy particularmente al uso de una composición enzimática para la digestión de embriones de pollo que conducen a la obtención de una preparación de células de pollo.
La composición enzimática de la invención sorprendentemente conduce a la obtención de una preparación de células de pollo que consiste de más de 500 106 células extraídas por embrión. A este respecto, la presente invención se refiere muy particularmente a una composición enzimática para la digestión de embriones de pollo que conduce a la obtención de una preparación de células de pollo que consiste de más de 500 106 células extraídas por embrión.
La composición enzimática de la invención comprende por lo menos 2 enzimas. Las enzimas comprendidas en la composición de la invención se seleccionan del grupo que consiste de tripsina, quimotripsina, tripsinógeno, quimotripsinógeno, dispasa, colagenasa, acutasa, termolisina, pronasa, hialuronidasa, elastasa, papaína, neuraminidasa y pancreatina. Las enzimas comprendidas en la composición de la invención preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste de tripsina, dispasa, colagenasa y acutasa. A este respecto, la presente invención se refiere muy particularmente a una composición enzimática para la digestión de embriones de pollo, en donde dicha composición enzimática comprende por lo menos 2 enzimas seleccionadas del grupo que consiste de tripsina, dispasa, colagenasa y acutasa.
De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la composición enzimática de la invención se selecciona del grupo que consiste de:
- tripsina, dispasa y colagenasa;
- tripsina, dispasa y acutasa;
- tripsina, dispasa, colagenasa y acutasa;
- tripsina y dispasa; y
- dispasa y acutasa.
De conformidad con una modalidad especial de la invención, la composición enzimática de la invención se selecciona del grupo que consiste de:
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, y 10 mL/embrión de colagenasa 20 mg/mL;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, y 10 mL/embrión de colagenasa 20 mg/mL;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, 10 mL/embrión de colagenasa 20 mg/mL, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, y 5 mL/embrión de colagenasa 20 mg/mL;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, 10 mL/embrión de colagenasa 20 mg/mL, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964; - tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, and 5 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, and
10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, and 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL;
- 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL, y acutasa 10 mL/embrión; y
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 5 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, y 15 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL.
De conformidad con una modalidad más especial de la invención, la composición enzimática de la invención se selecciona del grupo que consiste de:
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , y 10 mL/embrión de colagenasa III 20 mg/mL de Gibco Invitrogen Cat No. 17102;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , y 10 mL/embrión de coiagenasa III 20 mg/mL de Gibco Invitrogen Cat No. 17102;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase™ de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , 10 mL/embrión de coiagenasa III 20 mg/mL de Gibco Invitrogen Cat No. 17102, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de AccutaseTM de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase™ de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , y 5 mL/embrión de coiagenasa III 20 mg/mL de Gibco Invitrogen Cat No. 17102; - tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , 10 mL/embrión de colagenasa III 20 mglmL de Gibco Invitrogen Cat No. 17102, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase™ de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase™ de Sigma Cat. No. A-6964;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mL/embrión de
TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, y 5 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 ;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 2563-029, y 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 ;
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, y 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 ;
- 10 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. No. 17105-041 , y acutasa 10 mL/embrión; y
- tripsina añadida a una concentración equivalente a 5 mL/embrión de TrypLE™ seleccionado de Invitrogen Cat. No. 2563-029, y 15 mL/embrión de dispasa 10 mg/mL de Invitrogen Cat. Neuroimage 17105(-041 ):
De conformidad con la invención, la composición enzimática es libre de productos animales. Como se usa a lo largo de la solicitud entera, «productos animales» se refiere a cualquier compuesto o colección de compuestos que se produjeron en ó por una célula animal en un organismo vivo. A este respecto, las enzimas comprendidas en la composición de la invención son enzimas recombinantes.
La tripsina es una serina proteasa producida en el páncreas de muchos vertebrados. La tripsina cataliza una digestión hidrolítica de péptidos en el grupo carboxilo de los aminoácidos básicos arginina y lisina. Ya se han descrito muchas tripsinas recombinantes tales como, v.gr., tripsina recombinante de Pichia pastoris (Roche Applied Science, Septiembre 2003) y algunas de ellas están comercialmente disponibles tales como, v.gr., TrypLE™ Select (Invitrogen, Cat. No. v.gr. 12563-01 1 ; 12563-029) o TrypZean (Sigma, Cat. No. v.gr. T-3449). La tripsina recombinante preferida usada de conformidad con la invención es TrypLE™ Select (Invitrogen, Cat. No. 12563-029) como se describe en los ejemplos.
La dispasa es una proteasa neutra producida a partir de la bacteria Bacillus polymyxa (Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase, STENN K.S., LINK R., MOELLMANN G., MADRI J., KUKLINSKA E., J. Invest Dermatol 1989 Aug;93(2):287-90). Muchas dispasas recombinantes ya se han descrito tales como, v.gr., dispasa recombinante I, dispasa recombinante II (Roche Applied Science, agosto de 2004) o BD Dispase (BD Biosciences), y algunas de ellas están comercialmente disponibles tales como, v.gr., Dispase (Invitrogen, Cat. No. v.gr. 17105-041 ), Dispase I (Sigma, Cat. No. v.gr. D4818) o Dispase (StemCell Technologies, Cat. No. v.gr. 07913; 07923). La dispasa recombinante preferida usada de conformidad con la invención es Dispase (Invitrogen, Cat. No. 17105-041) como se describe en los ejemplos.
La colagenasa es una proteasa producida a partir de la bacteria
Clostridium histolyticum que rompe los enlaces peptídicos en colágeno ((Isolation and characterization of proteinase and collagenase from Cl. Histolyticum, MANDL I., MACLENNAN J.D., HOWES E.L., J Clin Invest. 1953 Dec;32(12):1323-9). Muchas colagenasas ya se han descrito tales como, v.gr., colagenasa recombinante III (Collagenase III: A superior enzyme for complete disaggregation and improved viability of normal and malignant human breast tissue, SPEIRS V., WHITE M.C. and GREEN A.R., In vitro Cell.. Dev. B/al. -Animal, 32:72-74, Febrero de 1996), y algunas colagenasas recombinantes están comercialmente disponibles tales como, v.gr., Collagenase type I (Sigma, Cat. No. v.gr. C0130; C1639), Collagenase type II (Sigma, Cat. No. v.gr. C0130; C1764; C6885), Collagenase type III (v.gr. Gibco Invitrogen, Cat. No. v.gr. 17102; Sigma, Cat. No. v.gr. C0255), Collagenase type IV (Sigma, Cat. No. v.gr. C1889), Collagenase type V (Sigma, Cat. No. v.gr. C2014;
C9263), Collagenase type VII (Sigma, Cat. No. v.gr. C0773; C2399) o Collagenase type XI (Sigma, Cat. No. v.gr. C4785; C7657). La colagenasa recombinante preferida usada de conformidad con la invención es colagenasa III (Gibco Invitrogen Cat. No. 17102) como se describe en los ejemplos.
La acutasa es una proteasa de origen de crustáceos. Las acutasas recombinantes están comercialmente disponibles tales como, v.gr., Accutase (PAA, Cat. No. v.gr. L1 1-007), Accutase (Thermo, Cat. No. v.gr. 21-201-O100V), Accutase (Interchim, Cat. No. v.gr. UPN68081 ), Accutase (Sigma, Cat. No. v.gr. A6964), Accutase (eBioscience, Cat. No. v.gr. 00-4555) o Accutase (Millipore, Cat. No. v.gr. SCROO5). La acutasa recombinante preferida usada de conformidad con la invención es Accutase (Sigma, Cat. No. A6964) como se describe en los ejemplos.
Las "células" preparadas por digestión de embriones de pollo con las composiciones enzimáticas de la invención incluyen pero no se limitan a fibroblastos, células renales, células hepáticas, células cardiacas, células musculares, células epiteliales, células sanguíneas y células endoteliales.
De conformidad con una modalidad especial de la invención, la composición enzimática de la invención se usa para la digestión de embriones de pollo que conduce a la obtención de una preparación de células de pollo que consiste de células de pollo aisladas. De conformidad con la invención, dichas células de pollo aisladas son fibroblastos de embrión de pollo (CEFs), células renales de embrión de pollo (CEKCs) o células hepáticas de embrión de pollo (CELCs), y preferiblemente fibroblastos de embrión de pollo (CEFs).
De conformidad con otra modalidad especial de la invención, la composición enzimática de la invención se usa para la digestión de embriones de pollo que conduce a la obtención de una preparación de células de pollo que consiste de una mezcla de células de pollo. De conformidad con la invención, dicha mezcla de células de pollo comprende CEFs, CEKCs, CELCs, células cardiacas, células musculares, células epiteliales, células sanguíneas y/o células endoteliales.
Las células son preferiblemente extraídas de huevos libres de patógenos específicos (SPF). Los huevos SPF están comercialmente disponibles, v.gr., de Charles River Laboratories (Wilmington, MA, E.U.A.). Dichos huevos son preferiblemente de más de 9 días de edad, muy preferiblemente entre 10 y 14 días de edad y muy preferiblemente aún son 12 días de edad. Antes de la extracción de los embriones, los huevos son preferiblemente desinfectados. Muchos métodos y productos dedicados a la desinfección de huevos están disponibles en la técnica anterior. La incubación en una solución de formol (v.gr., 2% de formol durante, v.gr., 1 minuto) seguido por un enjuague en etanol (v.gr., 70% de etanol) es particularmente preferido. Después, los huevos se abren, los embriones se extraen, y las cabezas y pies se cortan.
Los embriones, no disecados, son después directamente digeridos por la composición enzimática de la invención. De conformidad con la invención, la desagregación celular se obtiene bajo las siguientes condiciones:
o una temperatura de incubación comprendida entre 35°C y 39°C, preferiblemente entre 36°C y 37°C, muy preferiblemente de 36°C, 36.5°C o 37°C, y muy preferiblemente aún de 37°C; y
o una duración de incubación comprendida entre 1 y 3 horas, y preferiblemente de 2 horas.
Las composiciones enzimáticas de la invención son sorprendentemente capaces de digerir embriones de pollo que no han sido disecados previamente.
De conformidad con modalidad específica de la invención, las enzimas de la composición enzimática también se pueden añadir a los embriones en tiempos diferentes. Por ejemplo, para una composición enzimática que comprende tripsina, dispasa y colagenasa, los embriones primero pueden ser digeridos en presencia de dispasa y colagenasa y luego, después de un intervalo de tiempo, digeridos en presencia de tripsina. Como otro ejemplo, para una composición enzimática que comprende tripsina, dispasa y acutasa, los embriones primero pueden ser digeridos en presencia de tripsina, luego, después de un intervalo de tiempo, digeridos en presencia de dispasa, y finalmente después de un intervalo de tiempo (que puede ser el mismo o diferente del intervalo de tiempo anterior) digeridos en presencia de acutasa. De conformidad con la invención, dicho intervalo de tiempo está comprendido entre 15 minutos y 90 minutos, preferiblemente entre 20 y 80 minutos, muy preferiblemente entre 30 y 60 minutos, y es muy preferiblemente 30 minutos, 35 minutos, 40 minutos, 45 minutos, 50
minutos, 55 minutos o 60 minutos, y es muy preferiblemente aún 60 minutos.
La mezcla obtenida es después filtrada (v.gr., usando un tamiz hecho de inox comercialmente disponible, v.gr., de Fischer Bioblock, Cat No. A37532) para remover los tejidos no digeridos. Las células (v.gr. CEFs; CEKCs; CELCs) entonces son recolectadas por centrifugación (v.gr. 2300 rpm, 15 minutos). Dicha centrifugación también permite remover las enzimas (es decir, las enzimas estarán en el sobrenadante). El método y las condiciones como se describe en el ejemplo 1 son preferiblemente usados.
De conformidad con la invención, las células primarias obtenidas también se pueden usar ya sea directamente o después de un pasaje de células adicional como células secundarias.
Las células (es decir., primarias o secundarias) son después cultivadas en un medio de cultivo de células apropiado. Los medios de cultivo de células media usados de conformidad con la invención son preferiblemente libres de producto animal. Muchos medios libres de producto animal ya se han descrito y algunos de ellos están comercialmente disponibles tales como, por ejemplo, 293 SFM II; 293-F Cells, SFM Adapted; 293-H Cells, SFM Adapted; 293fectin™ Transfección Reagent ;CD 293 AGT™ CD 293 Médium; FreeStyle™ 293 Expression System; FreeStyle™ 293 Médium; FreeStyle™ 293-F Cells, SFM Adapted; VP-SFM; VP-SFM AGT™ Adenovirus Expression Médium (AEM) Growth Médium for PER.C6® Cells; CD 293 AGT™ CD 293 Médium ; COS-7L Cells, SFM Adapted; EPISERF® Médium; OptiPro™ SFM (todos disponibles de Invitrogen). Las células son preferiblemente cultivadas entre 1 y 5 días, muy preferiblemente entre 1 y 2 días y muy preferiblemente aún durante 2 días antes de la infección. Las células son preferiblemente cultivadas a una temperatura comprendida entre 30 y 37°C.
La presente invención también se refiere a un método para producir un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación de células de embriones de pollo usando una composición enzimática como se describió anteriormente.
El método para producir un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación de células de embrión de pollo usando una composición enzimática de la invención, también puede comprender un paso de infección de dichas células con un virus. El paso de infección de células con un virus es bien conocido por un experto en la técnica. Como se usa a lo largo de la solicitud entera, "infección" se refiere a la transferencia del ácido nucleico viral a una célula, en donde el ácido nucleico viral es replicado, las proteínas virales son sintetizadas, o nuevas partículas virales son ensambladas. El experto en la técnica puede seleccionar las células más apropiadas para la producción de un virus específico. Por ejemplo, en la modalidad específica en donde el virus que se ha de producir es un poxvirus, las células usadas son preferiblemente CEFs. El paso de infección de células con un virus se lleva a cabo en un medio de cultivo de células apropiado que puede ser el mismo o diferente del medio de cultivo de células usado para la preparación de dichas células. Los medios de cultivo de células media usados de conformidad con la invención son
preferiblemente libres de producto animal. Muchos medios libres de producto animal ya se han descrito y algunos de ellos están comercialmente disponibles como se describió anteriormente. El medio de cultivo de células preferido usado para el paso de infección es el medio de cultivo de células, medio basal de Eagle (Invitrogen). El medio de cultivo de células es preferiblemente sembrado con entre 0.5 a 1.5 y muy preferiblemente entre 1.1 y 1.3 y muy preferiblemente aún aproximadamente 1.2 embrión/L de medio de cultivo de células. En la modalidad específica en donde se produce el virus es MVA, el MVA se siembra en el recipiente de cultivo de células a una MCI que está preferiblemente comprendida entre 0.001 y 0.1 , muy preferiblemente entre 0.03 y 0.07 y muy preferiblemente aún aproximadamente 0.05.
El método para producir un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación de células de embrión de pollo usando una composición enzimática de la invención, también puede comprender un paso de cultivo de las células infectadas. El paso de cultivo de las células infectadas hasta que se produce el virus del progenie es bien conocido por el experto en la técnica. Ese paso puede comprender el crecimiento que se adhiere as las superficies, crecimiento en suspensión en presencia o no de (micro)portadores, o combinaciones de los mismos. El cultivo se puede hacer por ejemplo en cajas, botellas rodantes o en biorreactores, usando sistemas discontinuos, discontinuos con alimentación, continuos, fibras huecas, y similares. Para lograr producción de virus a gran escala a través de cultivo de células es preferido en la técnica tener células capaces de crecer en suspensión en presencia o no de (micro)portadores, y es preferido tener células capaces de ser cultivadas en medio libre de producto animal. Los medios de cultivo de células media usados de conformidad con la invención son preferiblemente libres de producto animal. Muchos medios libres de producto animal ya se han descrito y algunos de ellos están comercialmente disponibles como se describió anteriormente. El paso de cultivar las células infectadas se realiza en un medio de cultivo de células apropiado que puede ser el mismo o diferente del medio de cultivo de células usado para la preparación de dichas células y del medio de cultivo de células usado para la infección de dichas células con un virus. El medio de cultivo de células preferido usado para el cultivo de células infectadas es el medio basal de Eagle (Invitrogen). Las células infectadas son preferiblemente cultivadas entre 1 y 6 días, muy preferiblemente entre 2 y 4 días y muy preferiblemente aún 3 días. Las células infectadas son preferiblemente cultivadas a una temperatura comprendida entre 30°C y 37°C.
El método para producir a virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación de células de embriones de pollo usando una composición enzimática de la invención, también puede comprender un paso de recuperar los virus producidos del sobrenadante y/o de las células. Cuando los virus son recuperados de las células (es decir., de las células únicamente, o de las células y del sobrenadante), el paso de recuperar los virus producidos puede ser precedido por un paso que permite la alteración de la membrana celular. Este paso
conduce a la liberación de los virus de las células. La alteración de la membrana celular puede ser inducida por varias técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. Estas técnicas comprenden pero no se limitan a congelamiento/descongelamiento, lisis hipotónica, sonicación (al usar un sonicador) y microfluidización (al usar un microfluidizador). Los sonicadores están comercialmente disponibles de v.gr. Heraeus PSP, Biologics, Misonix o GlenMills. Los sonicadores preferidos usados de conformidad con la presente invención son SONITUBE 20 kHz tipo SM 20-120-3 y SONITUBE 35 kHz tipo SM 35-400-3 (Heraeus PSP). Los microfluidizadores están comercialmente disponibles de v.gr. Microfluidics Corporation. La membrana de células de empaque también puede ser alterada al usar una prensa SLM Aminco French. La membrana de células de empaque también puede ser alterada al usar un homogeneizador de alta velocidad. Los homogeneizadores de alta velocidad están comercialmente disponibles de, v.gr., Silverson Machines o Ika-Labotechnik. El homogeneizador de alta velocidad preferido usado de conformidad con la presente invención es un SILVERSON L4R (Silverson Machines).
El método para producir un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación de células de embriones de pollo usando una composición enzimática de la invención, también puede comprender uno o más pasos de purificación de los virus recuperados. El paso(s) de purificación pueden ser por ejemplo pero no se limitan a:
o Una clarificación que permita bajo condiciones adecuadas el retiro de los residuos celulares. Dicha clarificación se puede realizar, v.gr., por filtración de profundidad. La filtración de profundidad incluye pero no se limita al uso de uno o más productos comercialmente disponibles tales como filtros Sartopure® de Sartorius (v.gr. Sartopure® PP2), filtros de profundidad de la serie AP de CUNO Incorporated (v.gr. APO1 ), filtros de profundidad de la serie CP de CUNO Incorporated (v.gr. CP1 O, CP3O, CP5O, CP6O, CP7O, CP9O), filtros de profundidad de la serie HP de CUNO Incorporated (v.gr. HP1 O, HP3O, HP5O, HP6O, HP7O, HP9O), filtros de profundidad de la serie Calif. de CUNO Incorporated (v.gr. CAIO, CA3O, CA5O, CA6O, CA7O, CA9O), filtros de profundidad de la serie SP de CUNO Incorporated (v.gr. SP1 O, SP3O, SP5O, 5P60, SP7O, SP9O), filtros Delipid y Delipid Plus de CUNO, filtros de profundidad de la serie CE de Millipore Corporación (v.gr. CE15, CE2O, CE25, CE30, CE35, CE4O, CE45, CE5O, CE7O, CE75), filtros de profundidad de la serie DE de Millipore Corporación (v.gr. DE25, DE3O, DE35, DE4O, DE45, DE5O, DE55, DE560, DE65, DE7O, DE75), filtros HC de Millipore Corporación (v.gr. AIHC, BIHC, COHC), filtros PolyNet™ de CUNO (v.gr. PolyNet™ PB P050, P100, P200, P300, P400, P500, P700), filtros Clarigard y Polygard de Millipore, filtros Life Assure de CUNO, filtros de profundidad de ManCel Associates (v.gr. PR 12 UP, PR12, PR 5 UP); y filtros de PALL o SeitzSchenk Incorporated. Para mejorar la capacidad de clarificación de las unidades de filtración de profundidad disponibles, puede ser útil acoplar dos o más unidades con tamaños de poro cada vez menores. En esta modalidad, la
mezcla que ha de ser clarificada pasa a través de la primera unidad de filtración en donde los contaminantes más grandes son retenidos y subsecuentemente pasa a través de la segunda unidad de filtración. Con respecto a esto, de conformidad con una modalidad preferida de la invención, la clarificación se lleva a cabo por filtración de profundidad, preferiblemente sobre filtros que tienen un tamaño de poro de 8 pm acoplados a filtros que tienen un tamaño de poro de 5 pm. Los filtros preferidos que tienen un tamaño de poro de pm y 5 pm usados de conformidad con la presente invención son filtros Sartopure comercialmente disponibles de Sartorius (Sartopure® PP2). De conformidad con la invención, la filtración de profundidad es preferiblemente se realizó a una velocidad de flujo de 1 L/minuto.
o Una concentración que se puede realizar, v.gr., por microfiltración o ultrafiltración. La microfiltración es un procedimiento de membrana impulsado por presión que concentra y purifica moléculas grandes. De manera más específica, una solución se hace pasar a través de filtros cuyo tamaño de poro se ha escogido para rechazar los virus en el retenido y se permite que moléculas pequeñas (v.gr., proteínas) pasen a través de los filtros al permeado. La microfiltración reduce el volumen de la solución de extracción. Con respecto a esto, la microfiltración por lo tanto se lleva a cabo usando filtros que tienen un tamaño de poro menor que 0.2 pm, preferiblemente un tamaño de poro comprendido entre 0.01 y 0.15 pm, muy preferiblemente entre 0.09 y 0.15 pm, y muy preferiblemente aún un tamaño de poro de 0.1 pm. Los filtros usados de conformidad con la invención son preferiblemente filtros comercialmente disponibles para autoclave tales como por ejemplo módulos de microfiltración de Prostak (Millipore) en donde los módulos de microfiltración de Prostak PSWAG021 , PSWAG041 y SK2PI2E1 son preferidos.
o Una diafiltración que es una mejora de microfiltración (como se describió anteriormente) e implica diluir la fracción que comprende los virus con una solución para efectuar una reducción en la concentración de las impurezas en dicha fracción. La dilución de la fracción que comprende los virus permite lavar más de las impurezas e dicha fracción. Cabe entender que la diafiltración se puede llevar a cabo en un modo discontinuo, un modo semi-continuo o un modo continuo. La diafiltración se puede usar ventajosamente para cambiar el regulador de pH en el cual está comprendido el virus. Por ejemplo, puede ser útil intercambiar el regulador de pH usado en el procedimiento de purificación contra un regulador de pH farmacéuticamente aceptable. De conformidad con la invención, la microfiltración se lleva a cabo usando filtros que tienen un tamaño de poro menor que 0.2 pm, preferiblemente un tamaño de poro comprendido entre 0.01 y 0.15 pm, muy preferiblemente entre 0.09 y 0.15 pm, y muy preferiblemente aún un tamaño de poro de 0.1 pm. Los filtros usados de conformidad con la invención son preferiblemente filtros comercialmente disponibles para autoclave tales como por ejemplo módulos de microfiltración de Prostak (Millipore) en donde los módulos de microfiltración de Prostak PSWAG021 , PSWAG041 y SK2P12E1 son preferidos.
o Una cromatografía que usa un adsorbente de intercambio de cationes o aniones, y preferiblemente un adsorbente de intercambio de aniones. De conformidad con la invención, los grupos funcionales del adsorbente de intercambio de aniones puede ser un grupo amino primario, secundario, terciario o cuaternario tal como por ejemplo dimetilaminoetilo (DMAE), dietilaminoetilo (DEAE), trimetilaminoetilo (TMAE), trietilaminoetilo (TEAE), el grupo -R- CH(OH)-CH-2-N+-(CH3)3 (también denominado grupo Q; véase resinas Streamline®, Pharmacia) u otros grupos tales como por ejemplo polietilenimina (PEI) que ya tiene o que tendrá una carga positiva formal dentro del intervalo de pH de 7.0 a 9.0. Los grupos funcionales preferidos del adsorbente de intercambio de aniones se seleccionan del grupo que consiste de dimetilaminoetilo (DMAE), dietilaminoetilo (DEAE), trimetilaminoetilo (TMAE) y trietilaminoetilo (TEAE), y son muy preferiblemente trimetilaminoetilo (TMAE). El adsorbente de intercambio de aniones puede consistir en, pero no se limita a, v.gr., una matriz formada por esferas o una membrana.
- De conformidad con una modalidad preferida de la invención, el adsorbente de intercambio de aniones consiste en una matriz formada por esferas. La matriz puede ser, v.gr., agarosa, polímero hidrofílico, celulosa, dextrano o sílice. Las cadenas (v.gr., cadenas de dextrano) son acopladas a la matriz. Los grupos funcionales, como se describió anteriormente, se unen a las cadenas a través de enlaces químicamente estables (v.gr., enlaces de éter). Los grupos funcionales preferidos de la matriz formada por esferas son trimetilaminoetilo (TMAE). Los adsorbentes de intercambio de aniones que consisten en matriz formada por esferas usados de conformidad con la invención son preferiblemente para autoclavee tales como, por ejemplo, UNOsphere® Q (BioRad), UNOsphere® S (BioRad), STREAMLINE™ Q Sepharose® XL (Amersham Biosciences), STREAMLINE™ SP Sepharose® XL (Amersham Biosciences) o BioSepra® Q hyperZ (Pall Corporation). El adsorbente de intercambio de aniones para autoclave preferido que consiste en una matriz formada por esferas de conformidad con la presente invención es UNOsphere® Q (BioRad). UNOsphere® Q (BioRad) consiste en esferas poliméricas esféricas hidrofílicas que tienen un diámetro de 120 pm y que portan grupos funcionales de trimetilaminoetilo (TMAE).
- De conformidad con otra modalidad preferida de la invención, el adsorbente de intercambio de aniones consiste en una membrana. Grupos funcionales de la membrana puede ser como se describió anteriormente. Los grupos funcionales preferidos de la membrana son trimetilaminoetilo (TMAE). De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la membrana usada tiene un tamaño de poro menor que el tamaño del virus. Con respecto a esto, cuando el virus es un poxvirus (que tiene un tamaño de 200 nm), la membrana tiene un tamaño de poro comprendido entre 1 y 5 pm, y preferiblemente un tamaño de poro de 3 pm. Los adsorbentes de intercambio de aniones que consisten en membranas usadas de conformidad con la invención son preferiblemente para autoclave tales como, por ejemplo, Sartobind® 75 Q
(Sartorius).
o Una filtración en gel: De conformidad con la invención, la muestra que contiene el virus se trata en un soporte sólido que comprende esferas que tienen un diámetro comprendido entre 3 y 160 pm, ventajosamente entre 80 y 160 pm, preferiblemente entre 40 y 105 pm, muy preferiblemente entre 25 y 75 pm, muy preferiblemente entre 20 y 80 pm, y muy preferiblemente aún entre 20 y 60 pm. De conformidad con la invención, dicho soporte tiene una porosidad cerrada al diámetro del virus (v.gr. 200-300 nm para poxvirus) por lo que el último no penetra en las esferas. Por otra parte, las moléculas que son menores en tamaño penetran en las esferas y la migración de las mismas es más lenta. Los soportes usados para filtración en gel se pueden basar, v.gr., en agarosa, dextrano, acrilamida, sílice, copolímeros de etilenglicol/metacrilato, o mezclas de los mismos tales como, por ejemplo, mezclas de agarosa y dextrano. De conformidad con la invención, los soportes son preferiblemente usados sin grupos funcionales. Los soportes de cromatografía de filtración en gel están comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo:
- Soportes de cromatografía de filtración en gel de etilenglicol/metacrilato (v.gr. Toyopearl® HW 55, Toyopearl® . HW 65 y Toyopearl® HW 75, que tienen un diámetro de esfera que comprende entre 20 y 60 pm, Tosohaas);
- Soportes de cromatografía de filtración en gel de alil dextrano/metilen bisacrilamida (v.gr. Sephacryl™ S300 HR que tiene un diámetro de esfera que comprende entre 25 y 75 pm; Sephacryl™ S400 HR que tiene un diámetro de esfera que comprende entre 25 y 75 pm; Sephacryl™ S500 HR que tiene un diámetro de esfera que comprende entre 25 y 75 pm; Sephacryl™ S1000 SF que tiene un diámetro de esfera que comprende entre 40 y 105 pm, todos de Pharmacia);
- Soportes de cromatografía de filtración en gel de N- acrilaminohidroxipropanodiol (v.gr., Trisacryl que tiene un diámetro de esfera que comprende entre 80 y 160 pm, Biosepra);
- Soportes de cromatografía de filtración en gel de agarosa (v.gr. Macro-Prep SE que tiene un diámetro de esfera que comprende entre 20 and 80 pm, Bio-Rad).
Soportes de cromatografía de filtración en gel de etilenglicol/metacrilato (v.gr. Toyopearl® HW 55, Toyopearl® HW 65 y Toyopearl® HW 75, que tienen un diámetro de esfera que comprende entre 20 y 60 pm, Tosohaas) son preferidos.
El método para producir un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación de células de embriones de pollo usando una composición enzimática de la invención, también pueden comprender un paso de incubación en presencia de una o más nucleasas. El paso de incubación en presencia de una o más nucleasas (es decir., endonucleasa o exonucleasas) se lleva a cabo a fin de degradar los ácido nucleicos (v.gr., ADN; ARN) presentes en solución. Las nucleasas preferiblemente usadas de conformidad con la presente invención son endonucleasas. Las endonucleasas se pueden clasificar con base en sus sustratos como sigue: desoxirribonucleasas (ADNasas) que degradan ADN; ribonucleasas (ARNasas) que degradan ARN; y endonucleasas que degradan ADN y ARN. Las endonucleasas ADNasas incluyen pero no se limitan a ADNasa I, ADNasa II y endodesoxirribonucleasa IV. Las endonucleasas ARNasas incluyen pero no se limitan a ARNasa I, ARNasa III, ARNsa E, ARNAsa F y ARNAsa P. Las endonucleasas que degradan ADN y ARN incluyen pero no se limitan a Benzonase®. En una modalidad preferida de la invención, el paso de incubar los virus producidos se lleva a cabo en presencia de Benzonase®. Benzonase® degrada el ácido nucleico (v.gr., ADN; ARN) al hidrolizar enlaces de fosfodiéster internos entre nucleótidos específicos. Bajo digestión completa, todos los ácido nucleicos libres (v.gr., ADN; ARN) presentes en solución son reducidos a oligonucleótidos terminados en 5'-monofosfato que son 3 a 8 bases de longitud. Benzonaze® no tiene actividad proteolítica. Benzonaze® usado de conformidad con la presente invención es preferiblemente farmacéuticamente aceptable. Benzonaze® preferiblemente farmacéuticamente está comercialmente disponible (v.gr., Eurogentec bajo la referencia ME-0280-10; Merck bajo la referencia v.gr. 1.01653.0001). De conformidad con la invención, la concentración de nucleasa(s) usada está en un intervalo de 5 a 100 U/ml, preferiblemente en el intervalo de 5 a 50 U/ml, y muy preferiblemente 10 U/ml.
El método para producir un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante de conformidad con la invención es adecuado para un proceso de fabricación a escala industrial aséptico para asegurar un acatamiento completo con requerimientos reguladores con respecto a esterilidad de vacunas.
Como se usa a lo largo de la solicitud entera, "virus" incluye pero no se limita a poxvirus, adenovirus, virus asociado a adenovirus, retrovirus, virus de herpes, alfavirus, virus espumoso, virus de la influenza (tales como, v.gr., virus de la influenza), flavivirus (tales como, v.gr., virus de fiebre amarilla, virus de encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de encefalitis por garrapatas o virus de nilo occidental), virus del sarampión, virus de la rubéola, alfavirus (tales como, v.gr., virus de Ross River, virus de chikungunya), virus de la hepatitis, rinovirus, reovirus (tales como, v.gr., fiebre de garrapatas de Colorado) o virus espumoso.
En una modalidad preferida de la invención, el virus es un poxvirus. Los poxvirus son virus con envoltura complejos que tienen un diámetro que comprende entre 200 y 300 nm que los distingue principalmente
por su morfología inusual, su genoma de ADN grande y su sitio de replicación citoplásmico. De conformidad con la invención, los poxvirus pueden ser indiferentemente virus inmaduros (IV), virus maduros intracelulares (IMV), virus con envoltura intracelulares (1 EV), virus con envoltura asociados a células (CEV) o virus con envoltura extracelulares (EEV) (SMITH et al. (2002), J.Gen. Virol., 83, 291 5-2931 ). Los poxvirus, como se usan en la presente invención, se refieren preferiblemente a poxvirus de la subfamilia Chordopoxviruses (poxvirus de vertebrados) (Fields Virology/eds. : FIELDS, B. , N. , KNIPE, D. M., HOWLEY, P. M.; 3a ed/ISBN 0-7817-0253-4; Capítulo 83). Los Chordopoxvirus incluyen pero no se limitan a poxvirus del género de Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Lepripoxvirus, Suipoxvirus, Molluscipoxvirus o Yatapoxvirus. Los Chordopoxvirus de conformidad con la invención son Orthopoxvirus. Los Orthopoxvirus incluyen pero se limitan a virus de viruela, virus de Vaccinia (W) tales como por ejemplo las cepas de virus de Vaccinia Elstree, Western Reserve, Wyeth, NYVAC, NYCBOH, Paris, Copenhagen (GOEBLE et al. (1990); número de acceso de Genbank M35027.1), o sus derivados tales como por ejemplo un virus de Vaccinia Ankara modificado (MVA) en particular MVA 575 (ECACC V00120707) y MVA-BN (ECACC V00083008). El genoma de varios miembros de poxvirus, incluyendo la cepa del virus de Vaccinia Copenhagen (W) (GOEBEL et al., 1990, Virol. 179, 247-266 y 517-563; JOHNSON et al., 1993, Virol. 196, 381-401) y la cepa del virus de Vaccinia Ankara modificado (MVA) (ANTOINE et al., 1998, Virol. 244, 365-396), han sido mapeados y
secuenciados. W tiene un genoma de ADN de doble cadena de aproximadamente 192 kb que codifica para aproximadamente 200 proteínas de las cuales aproximadamente 100 están implicadas en ensamble de virus. El MVA es una cepa de virus de Vaccinia altamente atenuado generado por más de 500 pasajes seriales de la cepa de Ankara del virus de Vaccinia en fibroblastos de embrión de pollo (MAYR et al., 1975, Infection 3, 6-16). El virus de MVA fue depositado ante el Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Depósito Nacional de Cultivos de Microorganismos o CNCM) bajo el depósito N602 1-721. La determinación de la secuencia completa del genoma de MVA y la comparación con el genoma W de Copenhagen permite la identificación precisa de las alteraciones que ocurrieron en el genoma viral y la definición de siete deleciones (l a VII) y numerosas mutaciones que conducen a ORFs (marcos de lectura abierta), fragmentados (ANTOINE et al., 1998, Virology 244, 365-396).
En una modalidad preferida de la invención, el virus es un poxvirus y preferiblemente un Orthopoxvirus.
En una modalidad particular de la invención, el Orthopoxvirus es un virus de Vaccinia (W). Los W preferido de conformidad con la invención son W como se describe por ejemplo en las solicitudes de patente PCT/EP2008/009720 o PCT/EP2008/00972 1 describen respectivamente W que comprende, gen(es) 14L y/o F4L defectuosos y W que comprende un gen F2L defectuoso.
En otra modalidad particular de la invención, el Orthopoxvirus es un Virus de Vaccinia modificado Ankara (MVA). Los MVA preferido de conformidad con la presente invención son MVA como se depositó ante el Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Depósito Nacional de Cultivos de Microorganismos o CNCM) bajo los depósitos N602 1-721 , MVA 575 (ECACC V00120707) y MVA-BN (ECACC V00083008).
En una modalidad preferida, la invención se refiere a un método para producir un poxvirus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante' que comprende un paso de preparación de células de embrión usando una composición enzimática como se describió anteriormente y paos adicionales como se describe en la solicitud de patente WO 07/147528 incorporada aquí por referencia. Con respecto a esto, la invención por lo tanto se refiere a un método para producir un poxvirus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende los pasos de:
a) preparar células a partir de embriones usando una composición enzimática como se describió anteriormente; b) infectar dicho cultivo de células (como se describe en la solicitud de patente WO 07/147528 incorporada aquí por referencia);
c) cultivar dichas células infectadas durante un período apropiado (como se describe en la solicitud de patente WO 07/147528 incorporada aquí por referencia);
d) recuperar las partículas de poxvirus producidas a partir del sobrenadante de cultivo y/o las células de empaque (como se describe en la solicitud de patente WO 07/147528 incorporada aquí por referencia)
e) clarificar la mezcla obtenida por filtración de profundidad, preferiblemente sobre filtros que tienen un tamaño de poro de 8 pm acoplados a filtros que tienen un tamaño de poro e 5 pm (como se describe en la solicitud de patente WO 07/147528 incorporada aquí por referencia);
f) concentrar la mezcla obtenida por microfiltración, preferiblemente sobre filtros que tienen un tamaño de poro comprendido entre 0.01 y 0.15 pm, y preferiblemente sobre filtros que tienen un tamaño de poro de 0.1 pm (como se describe en la solicitud de patente WO 07/147528 incorporada aquí por referencia) ; y
g) diafiltrar la mezcla obtenida, preferiblemente sobre filtros que tienen un tamaño de poro comprendido entre 0.01 y 0.15 pm, y preferiblemente sobre filtros que tienen un tamaño de poro de 0.1 pm (como se describe en la solicitud de patente WO 07/147528 incorporada aquí por referencia).
En otra modalidad preferida, la invención se refiere a a método para producir un Orthopoxvirus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación of células a partir de embriones
usando una composición enzimática como se describió anteriormente y pasos adicionales, como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia. Con respecto a esto, la invención por lo tanto se refiere a un método para producir un Orthopoxvirus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende los pasos de:
a) preparar células a partir de embriones usando una composición enzimática como se describió anteriormente; b) infectar las células con un Orthopoxvirus (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
c) cultivar las células infectadas hasta que Orthopoxvirus de progenie se produzca (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
d) incubar en presencia de una o más nucleasas (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
e) recuperar los Orthopoxvirus del sobrenadante de cultivo y/o las células (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia); f) añadir sales monovalentes (v.gr. NaCI; KCI) a los Qrthopoxvirus recuperados en el paso e) bajo condiciones adecuadas para inhibir la actividad de nucleasa(s) y para evitar la adsorción de dichos Orthopoxvirus al adsorbente de intercambio de aniones en el paso g) (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
g) poner en contacto la mezcla obtenida en el paso f) con un adsorbente de intercambio de aniones (v.gr., una matriz formada por esferas o una membrana que tiene grupos funcionales que son grupo amino primario, secundario, terciario o cuaternario tal como por ejemplo dimetilaminoetilo (DMAE), dietilaminoetilo (DEAE), trimetilaminoetilo (TMAE), trietilaminoetilo (TEAE), el grupo — R-CH(OH)-CH2-N-+- (CH ta (también nombrado grupo Q; véase resinas de Streamline®, Pharmacia) u otros grupos tales como por ejemplo polietilenoimina (PEI) que ya tienen o tendrán una carga positiva formal dentro del intervalo de pH de 7.0 a 9.0) bajo condiciones adecuadas para permitir la captura de ácidos nucleicos (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
h) clarificar la mezcla obtenida en el paso g) bajo condiciones estables para permitir el retiro de los residuos celulares (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
i) lavar el adsorbente de intercambio de aniones con una solución que comprende sales monovalentes (v.gr. NaCI; KCI) bajo condiciones estables para recuperar los Orthopoxvirus restantes en el flujo a través de (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
j) concentrar el flujo pasante obtenido en el paso h) y el flujo pasante obtenido en el paso i) (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
k) diafiltrar la fracción que comprende los Orthopoxvirus obtenido en el paso j) (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia); y opcionalmente
I) un paso de filtración en gel seguido por un paso de diafiltración (como se describe en el método A de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia).
En otra modalidad preferida, la invención se refiere a a método para producir un Orthopoxvirus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación de células a partir de embriones usando una composición enzimática como se describió anteriormente y pasos adicionales como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia. Con respecto a esto, la
invención por lo tanto se refiere a un método para producir un Orthopoxvirus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende los pasos de:
a') preparar células a partir de embriones usando una composición enzimática como se describió anteriormente; b') infectar el cultivo de células con un Orthopoxvirus (como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
c') cultivar las células infectadas hasta que se produzca el Orthopoxvirus de progenie (como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
d') incubar en presencia de una o más nucleasas (como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
e') recuperar los Orthopoxvirus del sobrenadante de cultivo y/o las células de empaque (como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
f) incubar los Orthopoxvirus recuperados en el paso e') en presencia de:
1. uno o más agentes capaces de inhibir la actividad de nucleasa(s) (v.gr., agentes quelatadores tales como, v.gr., etilendiamino tetraacetato (EDTA); sales
monovalentes tales como, v.gr., NaCI o KCI), y opcionalmente
2. uno o más estabilizadores (v.gr., sacáridos tales como, v.gr., sacarosa o trehalosa ; aminoácidos; detergentes tales como Tween; sales tales como, v.gr., NaCI o KCI)
(como se describe en el método B de la solicitud de patente .9 incorporada aquí por referencia)
g') poner en contacto la mezcla obtenida en el paso f) con un adsorbente de intercambio de aniones (v.gr., una matriz formada por esferas o una membrana que tiene grupos funcionales que son grupos amino primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios tales como por ejemplo dimetilaminoetilo (DMAE), dietilaminoetilo (DEAE), trimetilaminoetilo (TMAE), trietilaminoetilo (TEAE), el grupo— R-CH(OH)-CH2-N+-(CH3)3 (también nombrado grupo Q; véase resinas Streamline®, Pharmacia) u otros grupos tales como por ejemplo polietilenimina (PEI) que ya tiene o tendrá una carga positiva formal dentro del intervalo de pH de 7.0 a 9.0) bajo condiciones adecuadas para permitir la captura de dichos Orthopoxvirus y ácidos nucleicos (como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
?') clarificar la mezcla obtenida en el paso g') bajo condiciones estables para permitir el retiro de los residuos celulares (como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia); i') eluir los Orthopoxvirus con una solución que comprende sales monovalentes;
j') concentrar la mezcla obtenida en al paso i') (como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia);
k') diafiltrar la fracción que comprende los Orthopoxvirus obtenida en el paso j') y opcionalmente
G) un paso de filtración en gel seguido por un paso de diafiltración (como se describe en el método B de la solicitud de patente EP09305422.9 incorporada aquí por referencia). En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un método para producir un Orthopoxvirus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende un paso de preparación de células a partir de embriones usando una composición enzimática como se describió anteriormente y pasos adicionales como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia. Con respecto a esto, la invención por lo tanto se refiere a a método, para producir un Orthopoxvirus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante que comprende los pasos de:
a") preparar células a partir de embriones usando una
composición enzimática como se describió anteriormente;
b") infectar el cultivo de células de empaque con un Orthopoxvirus (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
c") cultivar las células de empaque infectadas hasta que se produzca el Orthopoxvirus de progenie (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
d") incubar en presencia de una o más nucleasas (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
e") recuperar el Orthopoxvirus del sobrenadante de cultivo y/o las células de empaque (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
f) incubar el Orthopoxvirus recuperado en el paso e") en presencia de:
1. uno o más agentes capaces de inhibir la actividad de nucleasa(s), y opcionalmente
2. uno o más estabilizadores;
(como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
g") poner en contacto la mezcla obtenida en el paso f) con un adsorbente de intercambio de aniones (v.gr., una matriz formada por esferas o una membrana que tiene grupos funcionales que son grupo amino primario, secundario, terciario o cuaternario tal como por ejemplo dimetilaminoetilo (DMAE), dietilaminoetilo (DEAE), trimetilaminoetilo (TMAE), trietilaminoetilo (TEAE), el grupo— R- CH(OH)-CH-2-N+-(CH3)3. (también nombrado grupo Q; véase resinas Streamiine®, Pharmacia) u otros grupos tales como por ejemplo polietilenimina (PEI) que ya tiene o tendrá una carga positiva formal dentro del intervalo de pH de 7.0 a 9.0) bajo condiciones adecuadas para permitir la captura de dicho Orthopoxvirus y ácidos nucleicos (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
h") clarificar la mezcla obtenida en el paso g") bajo condiciones estables para permitir el retiro de los residuos celulares (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
i") eluir el Orthopoxvirus con una solución que comprende sales monovalentes (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
j") añadir sales monovalentes Orthopoxvirus eluido en el paso i") para evitar la adsorción de dicho Orthopoxvirus al adsorbente de intercambio de aniones en el paso k") (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
k") poner en contacto la mezcla obtenida en el paso j") con un adsorbente de intercambio de aniones (v.gr., una matriz formada por esferas o una membrana que tiene grupos funcionales que son grupos amino primarios,
secundarios, terciarios o cuaternarios tales como por ejemplo dimetilaminoetilo (DMAE), dietilaminoetilo (DEAE), trimetilaminoetilo (TMAE), trietilaminoetilo (TEAE), el grupo — R-CH(OH)-CH2-N+-(CH3)3 (también nombrado grupo Q; véase resinas Streamline®, Pharmacia) u otros grupos tales como por ejemplo polietilenimina (PEI) que ya tiene o tendrá una carga positiva formal dentro del intervalo de pH de 7.0 a 9.0) bajo condiciones adecuadas para permitir la captura de ácidos nucleicos(como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
I") lavar el adsorbente de intercambio de aniones con una solución que comprende sales monovalentes bajo condiciones estables para recuperar el Orthopoxvirus restante en el flujo pasante (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
m") concentrar el flujo pasante obtenido en el paso I") (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia);
n") diafiltrar la fracción que comprende el Orthopoxvirus obtenido en el paso m") (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia), y opcionalmente
o") un paso de filtración en gel seguido por un paso de diafiltración (como se describe en el método C de la solicitud de patente PCT/EP2010/056491 incorporada aquí por referencia).
Como se usa a lo largo de la solicitud entera, "virus atenuado" se refiere a cualquier virus que ha sido modificado por lo que su patogenicidad en el sujeto destinado es sustancialmente reducida. Preferiblemente, el virus es atenuado al punto que es no patogénico desde un punto de vista clínico, es decir, que sujetos expuestos al virus no presentan un nivel de patología incrementado estadísticamente significativo en relación con los sujetos de control.
Como se usa a lo largo de la solicitud entera, "virus recombinante" se refiere a un virus que comprende una secuencia exógena insertada en su genoma. Como se usa aquí, una secuencia exógena se refiere a un ácido nucleico que no está naturalmente presente en el virus progenitor.
En una modalidad, la secuencia exógena codifica una molécula que tiene una función directamente o indirectamente citotóxica. Por "directamente o indirectamente" citotóxica, se entiende que la molécula codificada por la secuencia exógena puede ser tóxica como tal (por ejemplo ricina, factor de necrosis tumoral (FNT), interleucina-2 (IL2), interferón-gamma (IFNy), ribonucleasa, desoxirribonucleasa, exotoxina A de Pseudomonas) o puede ser metabolizada para formar un producto tóxico, o puede actuar sobre algo más para formar un producto tóxico. La secuencia de ADNc de ricina se describe en Lamb et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270).
En una modalidad preferida de la invención, la secuencia exógena es un gen suicida. Un gen suicida codifica una proteína capaz de
convertir un profármaco relativamente no tóxico a un fármaco tóxico. Por ejemplo, la enzima citosina desaminasa convierte la 5-fluorocitosina (5-FC) a 5-fluorouracilo (5-FU) (Mullen et al (1922) PNAS 89, 33); la enzima timidina cinasa de herpes simple sensibiliza las células al tratamiento con el agente antiviral ganciclovir (GCV) o aciclovir (Moolten (1986) Cáncer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608). La citosina desaminasa de cualquier organismo, por ejemplo E. coil o Saccharomyces cerevisiae, se puede usar. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, el gen suicida codifica una proteína que tiene una actividad de citosina desaminasa, y muy preferiblemente proteína FCU1 o proteína FCU1-8 cubierta por las solicitudes de patente WO 99/54481 , WO 05/07857, PCT/EP2008/009720 y PCT/EP2008/00972 1 incorporadas aquí por referencia.
Con respecto a esto, los virus recombinantes preferidos producidos de conformidad con el método de la invención son:
o MVA-FCU1 (véase WO 99/54481) también llamado TG4023; o MVA-FCU1-8 (véase WO 05/07857); y
o W-FCU1 en donde dicho W comprende muy particularmente un gen I4L y/o F4L defectuoso, y un gen J2R defectuoso (véase PCT/EP2008/009720 y PCT/EP2008/009721).
Otros ejemplos de combinaciones de profármaco/enzima incluyen aquellas descritas por Bagshawe et al (WO 88/07378), a saber varios agentes alquilantes y la enzima CPG2 de Pseudomonas spp. , y aquellos descritos por Epenetos y Rowlinson-Busza (WO 91/1 1201), a saber
profármacos cianogénicos (por ejemplo, amigdalina) y beta-glucosidasas derivadas de plantas. Las enzimas que son útiles en esta modalidad de la invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato a fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato a fármacos libres; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido a fármacos libres; D alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas que digieren carbohidrato tales como beta-galactosidasa y neuraminidasa útil para convertir profármacos glicosilados a fármacos libres; beta-lactamasa útil para convertir profármacos derivados con beta- lactamas a fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicialina V amidasa o penicialina G amidasa, útil para convertir fármacos derivados a sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, a fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como abzimas, se pueden usar para convertir los profármacos de la invención a fármacos activos libres (Massey R. et al., Nature, 1987, 328, 457-458). De manera similar, los profármacos incluyen, pero no se limitan a, los profármacos antes listados, v.gr., profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-
aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen beta-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5- fluorouridina que pueden ser convertidos. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivados en una formas de profármaco para usarse en esta invención incluyen, pero no se limitan a etopósido, tenipósido, adriamicina, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, cis-platino y análogos de cis-platino, bleomicinas, esperamicinas (véase, por ejemplo US 4,675,187), 5-fluorouracilo, melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. En una modalidad adicional, el gen exógeno codifica una ribozima capaz de digerir ARN o ADN objetivo. El ARN o ADN objetivo que ha de ser digerido puede ser ARN o ADN que es esencial para la función de la célula y la digestión de los mismos da como resultado muerte celular o el ARN o ADN que ha de ser digerido puede ser ARN o ADN que codifica una proteína no deseable, por ejemplo un producto de oncogén, y la digestión de este ARN o ADN puede evitar que la célula se vuelva cancerosa.
En una modalidad adicional, el gen exógeno codifica un ARN antisentido. Por "ARN antisentido" se entiende una molécula de ARN que híbrida a, e interfiere con la expresión de una molécula de ARNm que codifica una proteína o a otra molécula de ARN dentro de la célula tal como pre-ARNm o ARNt o ARNr, o híbrida a, e interfiere con la expresión de un gen.
En otra modalidad de la invención, la secuencia exógena
reemplaza la función de un gen defectuoso en la célula objetivo. Hay varios miles de enfermedades genéticas heredadas de mamíferos, incluyendo humanos, que son causadas por genes defectuosos. Ejemplos de dichas enfermedades genéticas incluyen fibrosis cística, en donde se sabe que hay una mutación en el gen CFTR; distrofia muscular de Duchenne, en donde se sabe que una hay mutación en el gen de distrofina; enfermedad de células falciformes, en donde se sabe que hay una mutación en el gen HbA. Muchos tipos de cáncer son causados por genes defectuosos, especialmente protooncogenes, y genes supresores de tumor que han sufrido mutación. Ejemplos de protooncogenes son ras, src, bel, etc.; ejemplos de genes supresores de tumor son p53 y Rb.
En una modalidad adicional de la invención, la secuencia exógena codifica un antígeno asociado a tumor (TAA). TAA se refiere a una molécula que es detectada a una frecuencia o densidad más alta en células tumorales que en células no tumorales del mismo tipo de tejido. Ejemplos de TAA incluyen pero no se limitan a CEA, MART1 , MAGE1 , MAGE3, GP-100, MUC1 (véase WO 92/07000, WO 95/09241 y Rochlitz et al. J Gene Med. 2003 Aug;5(8):690-9 incorporada aquí por referencia), MUC2, oncogén ras de mutación puntual, p53 de mutación normal o puntual, p53 sobreexpresado, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, tirosinasa, TRP1 , TRP2, NY-ESO-1 , TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3- fkhr, ews-fli-1 , sobrevivientes y LRP. De conformidad con una modalidad más preferida, el TAA es MUCI.
En otra modalidad de la invención, el gen exógeno codifica un antígeno. Como se usa aquí, "antígeno" se refiere a un ligando que puede ser unido por un anticuerpo; un antígeno como tal no necesita ser inmunogénico. Preferiblemente, el antígeno se deriva de un virus tal como, por ejemplo, VIH-1 , (tal como gp 120 o gp 160), cualquier virus de inmunodeficiencia de felinos, virus de herpes humanos o animales, tales como gD o derivados de los mismos o proteína temprana inmediata tal como 1CP27 de HSV1 o HSV2, citomegalovirus (tales como gB o derivados de los mismos), virus de varicela zoster (tales como gpl, II o III), o de un virus de hepatitis tal como virus de hepatitis B (HBV), por ejemplo, antígeno de superficie B de hepatitis B o derivado del mismo, virus de hepatitis A (HAy), virus de hepatitis C (HCV; véase WO 04/11 1082; preferencialmente proteína de HCV no estructural de la cepa ja) de genotipo Ib, y hepatitis E virus (HEy), o de otros patógenos virales, tales como virus de sincicio respiratorio, virus de papiloma humano (HPV; véase WO 90/10459, WO 95/09241 , WO 98/04705, WO 99/03885 WO 07/121894 y WO 07/121894; proteína E6 y E7 de la cepa HPV16 son preferidos; véase también Liu et al. Proc Nati Acad Sci U S A. 2004 Oct 5; 101 Suppl 2:14567-71) o virus de la influenza, o derivados de patógenos bacterianos tales como Salmonella, Neisseria, Borrelia (por ejemplo, OspA o OspB o derivados de los mismos), o Chiamydia, o Bordetella, por ejemplo P.69, PT y FHA, o derivados de parásitos tales como Plasmodium o Toxoplasma. De conformidad con una modalidad más preferida, el antígeno se selecciona de HCV o HPV.
Con respecto a esto, el virus recombinante producido de conformidad con el método de la invención es MVA-HCV (véase WO 04/1 1 1082) también llamado TG4040.
El virus recombinante puede comprender más de una secuencia exogena y cada secuencia exogena puede codificar más de una molécula. Por ejemplo, puede ser útil para asociar en un mismo virus recombinante, una secuencia exogena que codifica, v.gr., un TAA (como se describió anteriormente) o un antígeno (como se describió anteriormente) con una secuencia exogena que codifica una citocina (v.gr., interleucina (IL como, por ejemplo, 1 L2); factor de necrosis tumoral (FNT); interferón-(IFN); factor estimulante de colonias (CSF)).
Con respecto a esto, los virus recombinantes preferidos producidos de conformidad con el método de la invención son:
o MVA-[MUCI-1 L2] (véase WO 92/07000 y WO 95/09241 ) también llamados TG4O1O; y
o MVA-[HPV-IL2] (véase WO 90/10459, WO 95/09241 , WO 98/04705, WO 99/03885, WO 07/121894 y WO 07/121894) también llamados TG4001.
Ventajosamente, el virus recombinante además comprende los elementos necesarios para la expresión de la secuencia exógena(s). Los elementos necesarios para la expresión que comprenden el conjunto de elementos que permiten la transcripción de una secuencia de nucleótido a ARN y la traducción de un ARNm a un polipéptido, en particular las
secuencias promotoras y/o secuencias reguladoras que son efectivas en la célula que ha de ser infectada por el virus recombinante de la invención, y opcionalmente las secuencias requeridas para permitir la excreción o la expresión en la superficie de las células para dicho polipéptido. Estos elementos pueden ser inducibles o constitutivos. Desde luego, el promotor está adaptado al virus recombinante seleccionado y a la célula hospedera. Se pueden mencionar, a manera de ejemplo, los promotores de virus de vaccinia p7.5K pH5R, pK1 L, p28, p11 o una combinación de dichos promotores. La literatura provee una gran cantidad de información relacionadas con dichas secuencias promotoras. Los elementos necesarios, además, pueden incluir elementos adicionales que mejoran la expresión de la secuencia exógena o su mantenimiento en la célula hospedera. Se pueden mencionar en particular las secuencias de intrón (WO 94/29471 ), secuencias de señal de secreción, secuencias de localización nuclear, sitios internos para el reinicio de traducción del tipo IRES, secuencias de poli A para terminación de transcripción.
La presente invención también se refiere a un virus de tipo silvestre purificado, atenuado y/o recombinante obtenido por el método como se describió anteriormente para usarse como composición farmacéutica, preferiblemente como una vacuna.
Como se usa aquí, una "composición farmacéutica" se refiere a una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo farmacéuticamente aceptable es preferiblemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una concentración iónica relativamente baja, tal como, por ejemplo, una solución de sacarosa. Más aún, dicho vehículo puede contener cualquier solvente, o líquido acuosos o parcialmente acuoso tal como agua estéril no pirogénica. El pH de la composición farmacéutica, además, es ajustada y regulada en su pH para cumplir con los requerimientos de uso in vivo. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir un diluyente, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable, así como agentes solubilizantes, estabilizantes y conservadores. Para administración inyectable, una formulación en solución acuosa, no acuosa o isotónica es preferida. Se puede proveer en una sola dosis o un dosis múltiples en forma líquida o seca (polvo, liofílizado y similares) que puede ser reconstituida en el tiempo de uso con un diluyente apropiado.
La presente invención también se refiere a un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante purificado obtenido por el método como se describió anteriormente para el tratamiento y/o la prevención de un cáncer, una enfermedad infecciosa y/o un trastorno autoinmune.
Como se usa aquí, "cáncer" se refiere, pero no se limita, a cáncer de pulmón (v.gr., carcinomas de pulmón de células pequeñas y de pulmón de células no pequeñas), cáncer bronquial, cáncer esofágico, cáncer de faringe, cáncer de cabeza y cuello (v.gr., cáncer de laringe, cáncer de labios, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales y cáncer de garganta), cáncer de cavidad oral (v.gr., cáncer de lengua), cáncer gástrico (v.gr., cáncer de estómago), cáncer de intestino, cáncer gastrointestinal, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer anal, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer del tracto urinario, cáncer de vejiga, cáncer de tiroides, cáncer de riñon, carcinoma, adenocarcinoma, cáncer de la piel (v.gr., melanoma), cáncer de ojo (v.gr. retinoblastoma), cáncer de cerebro (v.gr., glioma, meduloblastoma y astrocitoma cerebral), cáncer del sistema nervioso central, linfoma (v.gr. linfoma de células cutáneas, linfoma Burkitt, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin), cáncer de hueso, leucemia, cáncer de mama, cáncer del tracto genital, cáncer de cervical (v.gr., neoplasia intraepitelial cervical), cáncer de útero (v.gr., cáncer endomethal), cáncer de ovario, cáncer vaginal, cáncer vulvar, cáncer de próstata, cáncer testicular. "Los cánceres" también se refieren a tumores inducidos por virus, incluyendo, pero sin limitarse a carcinoma inducido por virus de papiloma, tumores inducidos por virus de herpes, linfoma de células B inducido por EBV, tumores inducidos por hepatitis, linfoma inducido por HTLV-1 y linfoma inducido por HTLV-2.
Como se usa aquí, "enfermedad infecciosa" se refiere a cualquier enfermedad que es causada por un organismo infeccioso. Organismos infecciosos incluyen, pero no se limitan a, virus (v.gr., virus de ARN de cadena sencilla, virus de ADN de cadena sencilla, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis A, B y C, virus de herpes simple (HSV), citomegalovirus (CMV), virus de sincicio respiratorio (RSV), virus de Epstein-Barr (EBV) o virus de papiloma humano (HPV)), parásitos (v.gr., patógenos de protozoarios y metazoarios tales como especies de
Plasmodia , especies de Leishmania, especies de Schistosoma o especies de Trypanosoma), bacterias (v.gr., Mycobacteria en particular, M. tuberculosis, Salmonella, Streptococci, E. colior Staphylococci), hongos (v.gr., especies de Candida o especies de Aspergillus), Pneumocystis carinii, y priones.
Como se usa aquí, "trastorno autoinmune" se refiere a dos tipos generales: 'Enfermedades autoinmunes sistémicas' (es decir., trastornos que dañan muchos órganos o tejidos), y 'enfermedades autoinmunes localizadas' (es decir., trastornos que dañan sólo a un órgano o tejido). Sin embargo, el efecto de las 'enfermedades autoinmunes localizadas', puede ser sistémico al afectar indirectamente otros órganos y sistemas del cuerpo Las 'enfermedades autoinmunes sistémicas' incluyen pero no se limitan a artritis reumatoide que puede afectar las articulaciones, y posiblemente pulmón y piel; lupus, incluyendo lupus eritematoso sistémico (SLE), que puede afectar la piel, articulaciones, ríñones, corazón, cerebro, glóbulos rojos, así como otros tejidos y órganos; escleroderma, que puede afectar la piel, intestino y pulmones; síndrome de Sjogren, que puede afectar las glándulas salivales, glándulas lacrimales y articulaciones; síndrome de Goodpasture, que puede afectar pulmones y ríñones; granulomatosis de Wegener, que puede afectar senos nasales, pulmones y ríñones; polimialgia reumática, que puede afectar grupos de músculos grandes, y arteritis temporal/arteritis de células gigantes, que puede afectar arterias de la cabeza y cuello. Las 'enfermedades autoinmunes localizadas' incluyen pero no se limitan a diabetes mellitus de tipo I, que afecta los islotes del páncreas; tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Graves, que afectan la tiroides; enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, y colitis ulcerativa, que afecta el tracto gastrointestinal; esclerosis múltiple (MS) y síndrome de Guillain-Barre, que afecta el sistema nervioso central; enfermedad de Addison, que afecta las glándulas suprarrenales; esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, y hepatitis autoinmune, que afecta el hígado; y fenómeno de Raynaud, que puede afectar los dedos de las manos, dedos de los pies, nariz, orejas.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica, preferiblemente una vacuna, que comprende un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante purificado obtenido por el método como se describió anteriormente. De conformidad con la invención, dicha composición farmacéutica está diseñada para el tratamiento y/o la prevención de un cáncer, una enfermedad infecciosa y/o un trastorno autoinmune.
La presente invención también se refiere al uso de un virus de tipo silvestre, atenuado y/o recombinante purificado obtenido por el método como se describió anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica, preferiblemente una vacuna, para el tratamiento y/o la prevención de un cáncer, una enfermedad infecciosa y/o un trastorno autoinmune.
La composición farmacéutica y en particular la vacuna se pueden fabricar convencionalmente para administración por la vía local, parenteral o digestiva. Las vías de administración pueden ser por ejemplo la vía intragástrica, subcutáneas, intracardiaca, intramuscular, intravenosa,
intraperitoneal, ¡ntratumoral, intranasal, intrapulmonar o intratraqueal. Para las últimas tres modalidades, la administración por aerosol o instilación es ventajosa. La administración se puede hacer como una sola dosis o repetirse una o varias veces después de un cierto intervalo de tiempo. La vía de administración y dosificación apropiadas varían como una función de varios parámetros, por ejemplo, del individuo, de la enfermedad que ha de ser tratada o del gen(s) de interés que ha de ser transferido. De conformidad con una primera posibilidad, la composición farmacéutica y en particular la vacuna se pueden administrar directamente in vivo (por ejemplo, por inyección intravenosa, en un tumor accesible o en su periferia, subcutáneamente para una vacunación terapéutica o profiláctica). También es posible adoptar el enfoque prometedor ex vivo que consiste en recolectar células del paciente (células madre de médula ósea, linfocitos de sangre periférica, células musculares y similares), transfectándolas o infectándolas in vitro de conformidad con técnicas de la técnica anterior y readministrarlas al paciente. Más aún, es posible contemplar, en donde es apropiado y sin apartarse del alcance de la presente invención, portar administraciones simultáneas o sucesivas, por diferentes vías, de los varios componentes contenidos en la composición farmacéutica y en particular en la vacuna.
Para ilustrar la invención, se proveen los siguientes ejemplos.
Los ejemplos no tienen la intención de limitar el alcance de la invención en ninguna forma.
EJEMPLOS
Preparación de CEFs.
Sesenta y seis huevos de SPF son incubados en durante 1 minuto en una solución de formol al 2%. Después de enjuagar con etanol al 70%, los huevos se abren, los embriones se extraen y las cabezas y pies se cortan.
Los embriones (no disecados) son después digeridos a 37°C durante 2 horas por una de la composiciones enzimáticas como se describe en el cuadro I (véase lo siguiente). La mezcla obtenida se filtra usando a tamiz hecho de inox (Fischer Bioblock, Gat No. A37532) para remover tejidos no digeridos y los CEFs son recolectados por centrifugación (2300 rpm, 15 minutos).
Los resultados obtenidos se ilustran en el cuadro 1 siguiente:
TrypLE Select (Invitrogen, Cat. No. 12563-029); Dispase (Invitrogen, Cat. No. 17105-041 ; 10 mg/mL en PBS) ; Collagenase III (Gibco Invitrogen, Cat No. 17102 ; 20 mg/mL en PBS) ; Accutase (Sigma, Cat. No. A-6964).
Producción de virus usando los CEFs preparados.
CEFs (preparados como se describió anteriormente con una composición enzimática que consiste en TrypLE™ Select (Invitrogen, Cat. No. 12563-029) 15 mL/embrión y Dispasa (Invitrogen, Cat. No. 17105-041 ; 10 mg/mL en PBS) 5 mL/embrión) son después cultivados durante 2 días en un medio de cultivo de células libre de suero en atmósfera húmeda a 37°C. El medio de cultivo de células libre de suero es después desechado y las células de CEFs son infectadas a MCI 0.05 con virus MVA (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) bajo el depósito N602 1-721 ) que expresan MUC1-IL-2. Los CEFs infectados son después incubados durante 3 días a 36.5°C. Los títulos infecciosos se determinaron mediante prueba de placa en células BHK21. En resumen, diluciones de muestras de MVA se inocularon en monocapas de células BHK21 preparadas en placas de 6 pozos. Después de 24 horas, las placas virales se tiñeron con reacción de inmunoperoxidasa con anticuerpos de conejo producidos contra virus de vaccinia y se contaron. La titulación se realizó por triplicado, en tres series independientes. El título viral obtenido fue: 6.3 10 Unidad formadora de placa (PFU) / mL
Todos los documentos (v.gr., patentes, solicitudes de patente, publicaciones) citados en la especificación anterior se incorporan aquí por referencia. Varias modificaciones y variaciones de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y esencia de la invención. Aunque se describió la invención en conexión con modalidades preferidas específicas, podrá entenderse que la invención reclamada no deberá estar indebidamente limitada a dichas modalidades específicas. De hecho, se pretende que varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvios para los expertos en la técnica estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Claims (21)
1. - El uso de tripsina, dispasa y colagenasa; o tripsina, dispasa y acutasa; o tripsina, dispasa, colagenasa y acutasa; o tripsina y dispasa; o dispasa y acutasa para preparar una composición enzimática para la digestión de embriones de pollo que conduce a la obtención de preparación de células de pollo.
2. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha composición enzimática es libre de producto animal y en donde dicha tripsina, dispasa, colagenasa y acutasa son tripsina, dispasa, colagenasa y acutasa recombinantes, respectivamente.
3. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha preparación de células de pollo consiste de más de 500.106 células extraídas por embrión.
4. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichos embriones de pollo no son disecados antes de la digestión.
5. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha composición enzimática se selecciona del grupo que consiste de: tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 100 mg/embrión de dispasa, y 200 mg/embrión de colagenasa; tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 100 mg/embrión de dispasa, y 200 mg/embrión de colagenasa; tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 100 mg/embrión de dispasa, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964; tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mLJembrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 100 mg/embrión de dispasa, 200 mg/embrión de colagenasa, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964; tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 100 mg/embrión de dispasa, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964; tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 100 mg/embrión de dispasa, y 100 mg/embrión de colagenasa; tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 100 mg/embrión de dispasa, 200 mg/embrión de colagenasa, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964; tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, 100 mg/embrión de dispasa, y acutasa añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de Accutase de Sigma Cat. No. A-6964; tripsina añadida a una concentración equivalente a 15 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, y 50 mg/embrión de dispasa; tripsina añadida a una concentración equivalente a 30 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, y 100 mg/embrión de dispasa; tripsina añadida a una concentración equivalente a 10 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, y 100 mg/embrión de dispasa; 100 mL/embrión de dispasa, y acutasa 10 mL/embrión; y tripsina añadida a una concentración equivalente a 5 mL/embrión de TrypLE seleccionado de Invitrogen Cat. No. 12563-029, y 150 mg/embrión de dispasa.
6. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha preparación de células de pollo consiste de células de pollo aisladas.
7. - El uso como se reclama en la reivindicación 6, en donde dichas células de pollo aisladas son fibroblastos de embrión de pollo (CEFs), embrión de células de riñon de pollo (CEKCs) o células de hígado de embrión de pollo (CELCs).
8. - El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde dichas células de pollo aisladas son fibroblastos de embrión de pollo (CEFs).
9.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha preparación de células de pollo consiste de una mezcla de células de pollo.
10. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde dicha mezcla de células de pollo comprende CEFs, CEKCs, CELCs, células cardiacas, células musculares, células epiteliales, células sanguíneas y/o células endoteliales.
1. - Un método para obtener una preparación de células de pollo al tratar los embriones de pollo con una composición enzimática, en donde dicho método comprende los pasos de: extraer embriones de huevos abiertos, cortar cabezas y pies, digerir directamente los embriones, sin paso de disección, mediante composición enzimática de las reivindicaciones 1 , 2 ó 5.
12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la digestión de dichos embriones de pollo se lleva a cabo bajo las siguientes condiciones: una temperatura de incubación comprendido entre 35°C y 39°C; y una duración de incubación comprendida entre 1 y 3 horas.
13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la temperatura de incubación está comprendida entre 36°C y 37°C.
14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la temperatura de incubación es 36°C, 36.5°C ó 37°C.
15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la temperatura de incubación es 37°C.
16. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado además porque la duración de incubación es 2 horas.
17. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado además porque dicho método es seguido por un paso de filtración.
18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho paso de filtración se lleva a cabo usando un tamiz hecho de inox.
19.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, caracterizado además porque dicho método es seguido por un paso de centrifugación.
20. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha preparación de células de pollo es para usarse en la producción de virus.
21. - El uso como se reclama en la reivindicación 20, en donde dicho virus es un poxvirus.
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