DE69128791T2

DE69128791T2 - Modifizierte antikörper mit kontrollierter clearance-zeit

Info

Publication number: DE69128791T2
Application number: DE69128791T
Authority: DE
Inventors: Alan L. La Canada Ca 91011 Epstein; Leslie A. Diamond Bar Ca 91765 Khawli
Original assignee: Techniclone Inc
Current assignee: Techniclone Inc
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-08-28
Publication date: 1998-05-28
Anticipated expiration: 2011-08-29
Also published as: CA2090700A1; JP2004210793A; AU8754191A; JPH06500563A; WO1992004052A1; JP3549525B2; JP3936339B2; DE69128791D1; EP0783894A1; CA2090700C; EP0550663B1; AU649079B2; US5194594A; EP0550663A1; ATE162403T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Antikörper. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die durch chemische Konjugation mit einem heterobifunktionellen Reagenz modifiziert worden sind, und die Verwendung dieser modifizierten MAbs zur Diagnose und Therapie von Krebs und anderen Krankheiten bei Säugern.
In der Verwendung von Antikörpern, insbesondere monoclonalen Antikörpern ("MAbs"), liegt die Fähigkeit zu einer äußerst nützlichen Verfahrensweise bei der Diagnose und Behandlung von Krebs. Eine wichtige Eigenschaft von MAbs ist ihre Spezifität für einzelne Antigene.
Es sind für Tumorzell-Antigene spezifische MAbs hergestellt worden. Es hat sich auch gezeigt, daß MAbs wirksam an Zusatzsubstanzen wie Raclionudide gekoppelt werden können. Solche radioaktivmarkierten MAbs eignen sich zur Bereitstellung klinischer Daten, wie zur Tumor-Sichtbarmachung nach einer immunszintigraphie, die auch als γ-Kamera-Sichtbarmachung oder Radioimmun-Sichbarmachung bekannt ist. Bei einer Immunszintigraphie läßt man die MAbs an ein spezifisches Gewebe oder Tumortypen binden, die das von den MAbs erkannte Antigen besitzen. Die Radionudide werden dann durch die Verwendung geeigneter Techniken, wie durch die Verwendung einer Germanium-Kamera, sichtbar gemacht. Es ist die einzigartige Spezifität von MAbs, die ihre Anwendung bei der Immunszintigraphie von Tumoren und anderen Gewebetypen ermöglicht.
Die Verwendung von MAbs bei einer Immunszintigraphie ist jedoch aufgrund des hohen Maßes an Hintergrundsignalen und der geringen Bindungskapazität der MAbs an ihre Antigene beschränkt. Experimentelle untersuchungen deuten darauf hin, daß die biologische Verteilung von radioaktivmarkierten MAbs von vielen Faktoren abhängt, zu denen die Spezifität und Clearance-Zeit des Antikörpers gehören. Zur wirksamen Diagnose eines Tumors mittels Immunszintigraphie sollte ein Antikörper ausgewählt werden, der an ein Antigen bindet, das an der Tumorzelloberfläche dicht und homogen auftritt. Eine effektive Diagnose mittels Immunszintigraphie erfordert auch, daß der gewählte Antikörper effektiv an das Tumor-Antigen binden sollte. MAbs, die an entsprechende Antigene binden, bieten jedoch oft nicht die erforderliche hohe Bindungsaffinität. Außerdem kann selbst die Verwendung von MAbs, die im Vergleich zu anderen MAbs mit hoher Affinität binden, ein hohes Ausmaß an unspezifischer Bindung hervorrufen, was bei Verwendung in einer Immunszintigraphie zu einem hohen Maß an Hintergrundsignalen führt. Deshalb ist ein Verfahren zur Verbesserung der Effektivität der MAb-Bindung erforderlich, um die Immunszintigraphie als diagnostisches Werkzeug zu verbessern.
Außerdem kann die cytotoxische Wirkung von MAbs durch Kupplung an Radionudide, Arzneimittel oder Toxine deutlich erhöht werden. Die einzigartige Spezifität von MAbs hat Hoffnungen auf die Entwicklung einer Immuntherapie geweckt. Bei einer Immuntherapie werden biologisch aktive Mittel unter Verwendung von MAbs an bestimmte unerwünschte Zelltypen wie Tumorzellen abgegeben, wobei die unerwünschten Zelltypen geschädigt werden, ohne daß andere Zellen des Individuums geschädigt werden. Immuntherapien erfordern jedoch Antikörper mit äußerst hoher Spezifität, um die Schädigung von gesundem Gewebe zu vermeiden. Ein Verfahren zur Erhöhung der MAb-Spezifität wäre daher höchst nützlich, um das Ziel einer risikolosen wirksamen Immuntherapie zu erreichen.
Viele MAbs verbleiben nach Einführung in ein Individuum mehrere Tage im Blutkreislauf. Das ist aus mindestens zwei Gründen unerwünscht. Ein Grund ist, daß im Blutkreislauf befindliche MAbs bei einer Immunszintigraphie ein hohes Maß an Hintergrundsignalen erzeugen. Ein zweiter Grund ist, daß im Blutkreislauf befindliche MAbs, die an Radionuclide oder andere potentiell cytotoxische Mittel gekoppelt sind, in dem Individuum nach längerer Exposition unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen können. Deshalb ist ein Verfahren zur Verringerung der Clearance-Zeit von MAbs erforderlich. Eine zu große Verringerung würde natürlich zu MAbs führen, die ausgeschieden werden, bevor eine wirksame Verwendung der MAbs erfolgen könnte. Deshalb besteht ein besonderer Bedarf an einem Verfahren zur Verringerung der Clearance-Zeit von MAbs, ohne daß die Aufnahme von MAbs durch einen Tumor oder ein anderes Zielgewebe beeinträchtigt wird.
Ein Faktor, der bei der Bestimmung sowohl der Spezifität als auch der Clearance-Zeit eines Antikörpers wichtig ist, ist die Form des Antikörpers. Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft ein "intaktes" Antikörper- Molekül ein nicht-modifiziertes Antikörper-Molekül, das zwei schwere Ketten und zwei leichte Ketten umfaßt. Das intakte, ganze Antiköper-Molekül ist auf der Reaktanten-Seite der chemischen Gleichung von Figur 1 zu sehen. Wie in Figur 1 ersichtlich, wird das intakte Molekül in die Fc- und Fab-Domänen geteilt. F(ab')&sub2;, die bivalente Form des Fab-Fragments, kann durch Spaltung der Fc-Domäne mit einer Protease hergestellt werden.
Die zwei schweren Ketten (in Figur 1 als "H" bezeichnet) werden durch eine oder mehrere Disulfidbrücken zusammengehalten. In intakten Molekülen werden diese Disulfidbrücken normalerweise vor Reduktionsmitteln geschützt. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß die Entfernung der Fc-Domäne eine leichte Reduktion der Disulfidbrücken ermöglicht. F(ab'), die monovalente Form, kann daher durch die Wirkung eines schonenden Reduktionsmittels aus F(ab')&sub2; hergestellt werden. Parham, P., On the Fragmentation of Monoclonal Iggl, Igg2a, und Igg2b from BALB/c Mice, J. Immunol. 131(1983), 2895, wobei die Offenbarung dieser Veröffentlichung durch Bezugnahme in d e n vorliegenden Text aufgenommen ist, beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von F(ab') und F(ab')&sub2;. Eine schematische Darstellung der Veränderungen, von denen man glaubt, daß sie bei diesem Verfahren auftreten, ist in der chemischen Gleichung von Figur 1 gezeigt.
Es hat sich herausgestellt, daß Fc für einen Großteil der unspezifischen Bindung von Antikörper-Molekülen verantwortlich ist. Man glaubt auch, daß das Molekulargewicht der Fragmente unter dem Schwellenwert der glomerulären Filtration liegt und daher eine schnelle Ausscheidung der Fragmente erlaubt. Eine Verfahrensweise zur Erhöhung der Clearance-Zeit von Antikörpern zur Verwendung bei einer Radiosichtbarmachung hat daher darin bestanden, einen intakten Antikörper in verschiedene Fragmente wie Fab und seine divalente Form (F(ab') 2 aufzuspalten. Wie erwartet, werden diese Fragmente so schnell aus dem Körper ausgeschieden, daß ihr Nutzen verringert wird. Im Vergleich zu einem intakten Antikörper können diese Fragmente außerdem zu einer verringerten Aufnahme durch einen Tumor oder anderes Zielgewebe führen. Obwohl die Verwendung dieser Fragmente bei einer Immunszintigraphie gegenüber intakten MAbs eine bessere Clearance und höhere Zielgewebe/Hintergrund-Verhältnisse bieten kann, hat sich herausgestellt, daß die absolute Konzentration von MAbs im Zielgewebe, das das Antigen enthält, an das die MAbs binden, bei intakten MAbs bis zu dreimal größer oder noch größer ist als bei einem dieser beiden Fragmente.
Außerdem werden beide Fragment-Typen aus dem Blutstrom sehr schnell entfernt. Dementsprechend ist bei Verwendung dieser Fragmente die Zeit der Wirksamkeit für diagnotische oder therapeutische Verfahren sehr kurz.
Heterobifunktionelle Reagenzien sind Reagenzien, die zwei Gruppen besitzen, die an unterschiedlichen Reaktionen beteiligt sein können. Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) ist beispielsweise insofern heterobifunktionell, als sich seine N-Hydroxysuccinimidester-Gruppe mit Amino-Gruppen umsetzt und sich die 2-Pyridyldisulfid-Struktur mit aliphatischen Thiolen umsetzt.
In EP-A-0 384 624 sind Antikörperkonjugate beschrieben, bei denen monoclonale Antikörper mit einem brückenbildenden Mittel modifiziert werden und anschließend eine Markierung als Mittel zur Sichtbarmachung von Geweben eingeführt wird.
In EP-A-0 350 230 ist eine Zusammensetzung beschrieben, die sich zur Diagnose oder Behandlung von Krankheiten proliferativer Zellen verwenden läßt. Sie wird unter Verwendung von SPDP oder Iminothiolan durch Konjugation einer biologisch aktiven Einheit oder einer nachweisbaren Markierung an einen MAb hergestellt, der für ein Krebsgewebe spezifisch ist.
In Canc. Res. 47 (1987), 5.5924-5931, ist die Verwendung neuer Kupplungsmittel zur Synthese von Immuntoxinen beschrieben, die Disulfidbrücken enthalten, die in vivo eine verbesserte Stabilität aufweisen.
In Canc. Immunol. Immunother., 31(1990), S.278-284, ist ein Konjugat eines mit SPDP und 2-Iminothiolan an OKT3 vernetzten, gegen Melanome gerichteten monoclonalen Antikörpers beschrieben, das in Plasma eine kurze Halbwertszeit besitzt.
In National Library of Medline, Database Medline, Nr.88060540 (Kozumi et al.) ist eine Immunszintigraphie unter Verwendung eines MAb-SPDP-DDO-&sup6;&sup7;Ga- Konjugats beschrieben.
In National Library of Medline, Database Medline, Nr.89048210 (Brown et al.) ist die potenetielle diagnostische und therapeutische Verwendung eines Konjugates beschrieben, das unter Verwendung des Vernetzungsmittels Succinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat aus Metallothionein und einem murinen gegen ein Karzinom gerichteten monoclonalen Antikörper hergestellt wurde.
Orlandi et al., Change in Binding Reactivity of an Anti-Tumor Monoclonal Antibody After the Introduction of 2-Pyridyl Disuiphide Groups, Hybridoma 5 (1986), 1-8, berichtet, daß nach chemischer Konjugation mit dem heterobifunktionellen Reagenz SPDP eine Erhöhung der in vitro-Bindung von MAbs erreicht werden konnte, die gegen menschliches Ovarialcarcinom produziert worden waren.
Die von Orlandi et al. verwendeten konjugierten MAbs besaßen durchschnittlich 11 PDP-Gruppen pro Molekül. Orlandi et al. stellten fest, daß sich die in vitro-Bindungsaktivität der modifizierten MAbs in einem solchen Maße erhöht, daß sich durch nicht-modifizierte MAbs nicht nachgewiesene Moleküle nachweisen lassen. Diese Forscher beschrieben keine Untersuchungen zur Verwendung der konjugierten MAbs in vivo. Außerdem glaubten die Forscher, daß Moleküle mit einer sehr geringen Anzahl von Antigen-Stellen durch die konjugierten MAbs nachgewiesen wurden. Entsprechend besaßen durch PDP modifizierte MAbs im Vergleich zu den nicht-modifizierten Gegenstücken eine stark verminderte Spezifität für Zielzellen.
Trotz der vorstehend erwähnten Fortschritte bleibt daher ein Bedarf an modifizierten Antikörper-Fragmenten, die gegenüber Tumor-Antigenen eine größere spezifische Aktivität zeigen, die eine Anreicherung einer größeren absoluten Antikörper-Konzentration in einem Tumor ermöglichen und die auch eine relativ schnelle Clearance-Zeit aus dem Blutpool besitzen, wobei die Clearance-Zeit jedoch nicht so schnell ist, daß die therapeutische oder diagnostische Wirksamkeit vermindert wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Veränderungen, von denen man glaubt, daß sie bei einem Verfahren zur Herstellung von F(ab')- und F(ab')&sub2;-Fragmente auftreten.
Figur 2 zeigt die Ganzkörper-Retention verschiedener Präparate radioaktiv markierter Lym-1-MAbs bei athymischen Nacktmäusen.
Figur 3 zeigt die biologische Verteilung des Lym-1- und modifizierten Lym- 1-MAb in menschliches Lymphom enthaltenden Nacktmäusen sieben Tage nach Injektion in Prozent inuzierter Dosis/Gramm.
Figur 4 zeigt die biologische Verteilung des Lym-1- und modifizierten Lym-1-MAb in menschliches Lymphom enthaltenden Nacktmäusen sieben Tage nach Injektion als Tumor/Organ-Verhältnis.
Figur 5 zeigt die biologische Verteilung des Lym-1 F(ab')&sub2;-MAb und modifizierten Lym-1-MAb in menschliches Lymphom enthaltenden Nacktmäusen fünf Tage nach Injektion in Prozent injizierter Dosis/Gramm.
Figur 6 zeigt die biologische Verteilung des Lym-1 F(ab')Z-MAb und modifizierten Lym-1-MAb in menschliches Lymphom enthaltenden Nacktmäusen fünf Tage nach Injektion als Tumor/Organ-Verhältnis.
Figur 7 zeigt ein Bild, das am 7. Tage nach Injektion von ¹³¹J-markiertem intaktem Lym-1 erhalten wurde.
Figur 8 zeigt ein Bild, das am 7. Tage nach Injektion von ¹³¹J-markiertem modifiziertem Lym-1 erhalten wurde.
Figur 9 zeigt ein Bild, das am 7. Tage nach Injektion von ¹³¹J-markiertem modifiziertem Lym-1 erhalten wurde.
Figur 10 zeigt ein Bild, das am 5. Tage nach Injektion von ¹³¹J-markiertem modifiziertem Lym-1 erhalten wurde.
Figur 11 zeigt die Ganzkörper-Retention verschiedener Präparate radioaktivmarkierter monoclonaler B72.3-Antikörpern bei thymuslosen Nacktmäusen.
Figur 12 zeigt die biologische Verteilung des MAb B72.3 und modifizierten MAb B72.3 in L5174T-Dickdarmkarzinom enthaltenden Nacktmäusen vier Tage nach Injektion in Prozent injizierter Dosis/Gramm.
Figur 13 zeigt die biologische Verteilung des MAb B72.3 und modifizierten B72.3 in 15174T-Dickdarmkarzinom enthaltenden Nacktmäusen vier Tage nach Injektion als Tumor/Organ-Verhältnis.
Figur 14 zeigt ein Bild, das am 1. Tag nach Injektion von ¹³¹J-markiertem modifiziertem B72.3 erhalten wurde.
Figur 15 zeigt ein Bild, das am 4. Tag nach Injektion von ¹³¹J-markiertem modifiziertem B72.3 erhalten wurde.
Figur 16 zeigt die Ganzkörper-Retention verschiedener Präparate radioaktivmarkierter TNT-1-MAbs bei thymuslosen Nacktmäusen.
Die vorliegende Erfindung stellt Antikörper bereit, die mit einem heterobifunktionellen Reagenz chemisch modifiziert wurden und in vivo eine Clearance-Rate besitzen, die zwischen den Clearance-Raten von F(ab')&sub2;- Fragmenten und intakten Antikörpern des gleichen Typs liegt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das heterobifunktionelle Reagenz SPDP, und die Antikörper sind monoclonale Antikörper, menschliche Antikörper, gentechnisch hergestellte Antikörper, chimäre Antikörper, synthetisierte Antikörper oder polyclonale Antikörper.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Sichtbarmachung eines spezifischen Gewebes in einem Säuger bereit, umfassend die Gewinnung eines gegen das spezifische Gewebe gerichteten Antikörpers, die Modifikation des Antikörpers durch Konjugation mit einem heterobifunktionellen Reagenz, die Einführung einer Markierung an den Antikörper, die Einführung des Antikörpers in den Säuger und die Herstellung eines Bildes, das die Markierung auf dem Antikörper zeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper durch Konjugation mit durchschnittlich einer PDP-Gruppe pro Antikörper-Molekül modifiziert und mit einem Radionuclid markiert, das Gamma-Strahlung emittiert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Behandlung eines Krankheitszustandes in einem Säuger bereit, umfassend die Gewinnung eines Antikörpers, der für das kranke Gewebe in dem Säuger spezifisch ist, die Modifikation des Antikörpers mittels chemischer Konjugation mit einem heterobifunktionellen Reagenz und einem Radionuclid sowie die Verabreichung des Antikörpers an den Säuger. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper durch chemische Konjugation mit durchschnittlich einer PDP-Gruppe pro Antikörper-Molekül modifiziert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel zur Venvendung in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit. Die Zusammensetzungen umfassen einen modifizierten Antikörper in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten oder in einer pharmazeutisch verträglichen Base.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, daß die Modifikation von Antikörpern einschließlich MAbs, menschlichen Antikörpern, gentechnisch hergestellten Antikörpern, chimären Antikörpern, synthetisierten Antikörpern und polyclonalen Antikörpern durch Konjugation mit einem heterobifunktionellen Reagenz wie SPDP zu einer überraschenderweise erhöhten Anreicherung modifizierter Antikörper in Zielzellen führt, die das Antigen enthalten, an das die Antikörper binden. Man geht davon aus, daß andere heterobifunktionelle Reagenzien einschließlich Sulfosuccinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl- 1,3'-dithiopropionat (SASD), Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl 1,3'- dithiopropionat (SAND), Sulfosuccinimidyl-(4-azidophenyldithio)propionat (Sulfo-SADP) und 2-Aminothiolan-HCl (Traut-Reagenz) ähnliche Ergebnisse liefern, wenn sie mit Antikörpern erfindungsgemäß konjugiert werden, wie in der vorliegenden Erfindung anhand der Konjugation von Antikörpern mit SPDP veranschaulicht wird.
Man geht davon aus, daß sich die erhöhte Areicherung der modifizierten Antikörper auf eine verstärkte spezifische Bindungskapazität zurückführen läßt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, daß sich bei Konjugation mit durchschnittlich nur einer PDP-Gruppe pro Antikörper- Molekül die Spezifität des Moleküls für seine Zielzellen im Vergleich zu nichtmodifizierten Antikörpern erheblich erhöht.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch festgestellt, daß eine Modifikation von IGG durch Konjugation mit durchschnittlich einer PDP- Gruppe vorteilhafterweise auch die Clearance aus normalem Gewebe erhöht. Ohne an eine bestimmte Erklärung für diese Wirkung gebunden zu sein, glauben die Erfinder der vorliegenden Erfindung, daß dies darauf beruht, daß eine Modifikation mit SPDP zur Fragmentation des Antikörpers in eine Form führt, die ein Molekulargewicht unter dem Schwellenwert der glomerulären Filtration besitzt und deshalb eine schnelle Ausscheidung der Fragmente ermöglicht. Es ist auch möglich, daß eine Fragmentation des Antikörpers in die monovalente Antikörper-Form erfolgt. Ganz gleich, wie die genaue Form der erhaltenen Fragmente ist, die Ausscheidung dieser Fragmente erfolgt vorteilhafterweise nicht so schnell, daß die diagnostische oder therapeutische Wirksamkeit der modifizierten Antikörper verringert wird.
Die erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper besitzen im Vergleich zu Antikörper-Fragmenten wie F(ab') oder F(ab')&sub2; eine überraschendenveise erhöhte diagnostische und therapeutische Wirksamkeit.
Das folgende Beispiel zeigt ein exemplarisches Verfahren zur Einführung von durchschnittlich einer PDP-Gruppe an einen monoclonalen Antikörper.

BEISPIEL 1

Modifikation von Lym-1 mit SPDP

Lym-1 (IgG&sub2;a), der monoclonale Antikörper gegen B-Zell-Lymphom, wurde gewonnen, wie in Epstein, A. L et al., Two New Monoclonal Antibodies, Lym-1 and Lym-2, Reactive with Human B-lymphocytes and Derived Tumors, with Immunodiagnostic and Immunoreactive Potential, Cancer Res. 47 (1987), 830- 840, beschrieben. Wie in Carlson, J. et al., Protein Thiolation and Reversible Protein-Protein Conj ugation: N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, A New Heterobifunctional Reagent, Biochem. J. 173 (1978), 723-737, beschrieben, wurden die Lym-1-MAbs unter Verwendung von SPDP funktionalisiert, einem heterobifunktionellen Reagenz, das mit freien Amino-Gruppen auf Antikörpern reagiert. 20 µl einer Lösung aus 3 mg SPDP in 1 ml Ethanol und 40 µl N,N-Dimethylformamid wurden in ein 5 ml-Teströhrchen gegeben, das 1 ml Lym-1 (10 mg/ml) in PBS, pH 7,2, enthielt. Dieses Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei unter Verwendung eines auf Normalgeschwindigkeit eingestellten Vibrationsschüttel-Apparates ständig gemischt wurde. Nach der Inkubation wurde die Lösung des funktionalisierten Lym-1 gereinigt, indem man sie durch eine mit PBS äquilibrierte PD-10-Säule hindurchlaufen ließ.
Es wurde bestimmt, daß das Ausmaß der Lym-1-Funktionalisierung mit SPDP durchschnittlich eine PDP-Gruppe pro Molekül betrug, indem die Freisetzung von Pyridin-2-thion bei 343 nm nach Reduktion eines Aliquots der Lym-1- Lösung mit einem molaren Überschuß von 7 mg Dithioerythrit in einer Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, gemessen wurde, wie in Grassetti, D. R. und Murray, J. F., Determination of Sulfhydryl Groups with 2,2'- or 4,4'-dithiodipyridine, Arch. Biochem. Biophys. 119 (1967), 41-49, beschrieben.
Der modifizierte Antikörper von Beispiel 1 wurde mittels schneller Protein- Flüssigkeitschromatographie (FPLC) analysiert, um zu zeigen, daß die Antikörper im wesentlichen intakt geblieben waren. Diese Analyse ist in Beispiel 2 gezeigt.

BEISPIEL 2

Analyse von modifiziertem Lym-1 mittels schneller Protein- Flüssigkeitschromatographie (FPLC)

Die Analyse des modifizierten Antikörpers aus Beispiel 1 erfolgte mittels schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC), wobei das Gerät mit einem UV-Spektrophotometer mit einer auf 280 nm eingestellten Wellenlänge ausgerüstet war. Auf einer Superose -12-Säule (Pharmacia) wurde mit PBS, pH 7,2, als Lösungsmittelsystem eine Größenausschluß-chromatographie durchgeführt, wobei die Elution bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 1 ml/min erfolgte. Modifizierter Lym-1 trat bei einer Retentionszeit von 690 Sekunden auf, was mit der Retentionszeit von nichtmarkiertem intaktem Lym-1 identisch ist.
Beispiel 2 zeigt daher, daß die SPDP-modifizierten Antikörper bei der FPLC fast das gleiche Verhalten zeigten wie die nichtmodifizierten Antikörper. Diese Daten zeigen, daß die Modifikation wahrscheinlich nicht zu einer Aufspaltung der intäkten Moleküle in vitro führte.
Zur weiteren Untersuchung der modifizierten MAbs in in vivo-Tests wurden die modifizierten MAbs radioaktiv markiert. Die radioaktive Markierung ist in Beispiel 3 gezeigt.

BEISPIEL 3

Direkte Radioiodierung von modifiziertem Lym-1

Unter Verwendung des modifizierten Chloramin-T-Verfahrens von Mills, S. L et al., ¹²³I Radiolabelling of Monoclonal antibodies for In Vivo Procedures, Hybridoma 5 (1986), 265-275, wurde eine Charge PDP-modifizierter Lym-1 und intakter Lym-1 mit ¹²&sup5;J jodiert und eine andere Charge mit ¹³¹J jodiert. Kurz zusammengefaßt, wurden in ein 100 µg monoclonalen Antikörper in 100 µl PBS enthaltendes 5 ml-Teströhrchen das entsprechende Jod-Isotop, je nach Charge ¹²&sup5;J oder ¹³¹J, und 10 µl 43 mM wäßrige Chloramin-T-Lösung zugegeben. Die Reaktion wurde nach 3 Minuten mit 20 µl 120 mM Natriumbisulfit-Lösung gelöscht. Die radioaktivmarkierten Antikörper wurden unter Verwendung einer Sephadex -G-25-Säule gereinigt. Diese Säule bestand aus einer serologischen Plastikpipette (8 mm x 200 mm), die am Ende mit Baumwolle verstopft war (VO = 4,5 ml, Vt = 12 ml). Jedes Reaktionsgemisch wurde auf eine Säule gegeben und mit PBS, pH 7,2, eluiert. Bei den 1 ml-Aliquote enthaltenden einzelnen Röhrchen wurden die Zählimpulse bestimmt und die radioaktivmarkierten Antikörper wurden in Röhrchen 6 gewonnen, wobei die Ausbeute 85% - 90% betrug. Diese radioaktivmarkierten Antikörper wurden im Kühlschrank aufbewahrt und Mäusen innerhalb eines Zeitraums von 4 Stunden nach Markierung verabreicht.
Die radioaktivmarkierten MAbs aus Beispiel 3 wurden zur Bestimmung der Reinheit der markierten MAbs einer Instant-Dünnschichtchromatographie (ITLC) unterworfen. Diese Analyse ist in Beispiel 4 gezeigt.

BEISPIEL 4

Analyse von radioaktivmarkiertem modifiziertem Lym-1 mittels Instant-Dünnschichtchromatographie (ITLC)

Modifizierter Lym-1, der mit ¹³¹J markiert war, und modifizierter Lym-1, der mittels des Chloramin-T-Verfahrens von Beispiel 3 mit ¹²&sup5;J markiert worden war, wurde unter Verwendung eines analytischen ITLC-Systems analysiert, das aus Kieselgel-imprägnierten Glasfasern bestand. Streifen (2 x 20 cm) wurden vor Verwendung durch 15-minütiges Erhitzen bei 110ºC-1/2ºC aktiviert, mit 1 µl Probe betupft, an der Luft getrocknet und auf einer Länge von etwa 12 cm mit MeOH/H&sub2;O (80:20) eluiert, erneut an der Luft getrocknet, zur Hälfte durchgeschnitten, und dann wurden die Zählimpulse bestimmt, um die an Protein gebundene und nicht an Protein gebundene Radioaktivität zu bestimmen. Beide Formen der radioaktivmarkierten Lym-1-Antikörper besaßen einen Rf-Wert von 0 und zeigten eine radiochemische Reinheit von ≥ 99%. Eine Analyse von intaktem Lym-1, der in gleicher Weise wie in Beispiel 3 markiert worden war, zeigte die gleiche Reinheit.
Beispiel 4 zeigt daher, daß radioaktivmarkierte Antikörper hoher Reinheit gewonnen werden konnten. Die Immunreaktivitäten dieser radioaktivmarkierten MAbs wurden anhand ihrer Fähigkeit zur Bindung an Raji-Zellen getestet. Diese Analyse ist in Beispiel 5 gezeigt.

BEISPIEL 5

Analyse von radioaktivmarkiertem modifiziertem Lym-1 durch Bestimmung der Immunreaktivität

Die Immunreaktivitäten von radioaktivmarkiertem modifiziertem Lym-1 und intaktem Lym-1 in vitro wurden mittels eines herkömmlichen Vitaltests an 10&sup6; Raji-Zellen/Röhrchen unter Verwendung des Verfahrens von Epstein, A.L et al., vorstehend, bewertet. Kurz zusammengefaßt, wurden Raji-Zellen, die in 100 µl 1% Rinderserumalbumin in PBS resuspendiert waren, in einen Dreifachsatz von Teströhrchen pipettiert. 100 µl markierter Lym-1 wurden in jedes Teströhrchen gegeben (100100 CPM/Röhrchen) und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei unter Verwendung eines Vibrationsschüttlers ständig gemischt wurde. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit 1% Rinderserum in PBS gewaschen, indem die Röhrchen 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert wurden, der Überstand dekantiert wurde und die Zellen in 200 µl PBS resuspendiert wurden. Nach Beendigung des Waschens wurde gebundener Lym-1 durch Bestimmung der an die Zellen gebundenen Radioaktivität unter Verwendung eines Gamma-Zählers nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, daß die Bindungsaktivität von modifiziertem Lym-1 87% betrug, wahrend intakter Lym-1, der als Standard- Kontrolle diente, eine Bindungsaktivität von 80% besaß.
Beispiel 5 zeigt daher, daß modifizierter Lym-1 in vitro eine größere Immunreaktivität aufwies als nichtmodifizierter Lym-1. Um die Stabilität der in vivo-Aktivität der modifizierten Antikörper vorläufig zu bestimmen, wurden modifizierte MAbs hinsichtlich ihrer Stabilität in Serum analysiert, wie in Beispiel 6 gezeigt.

BEISPIEL 6

Analyse von radioaktivmarkiertem modifiziertem Lym-1 hinsichtlich Serumstabilität

Modifizierte und intakte monoclonale Lym-1-Antikörper, die mit ¹²&sup5;J direkt markiert waren, wurden jedem von mehreren Dreifachsätzen von frischem Maus-Serum bis zu einer Endkonzentration von 100 µl/ml zugegeben. Die Röhrchen wurden bei 37ºC - 1/2ºC in einem befeuchteten Wärmeschrank inkubiert, der bei 5% CO&sub2; in der Luft gehalten wurde. Zu bestimmten Zeitpunkten zwischen 0 und 8 Tagen wurde die Protein-gebundene Aktivität bestimmt, indem 100 µl-Aliquoten 900 µl 100%-ige Trichloressigsäure (TCA) zugegeben wurden. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden Protein-Präzipitate mittels Zentrifugation sedimentiert, und aus jedem Röhrchen wurden 500 µl Überstand entnommen, und in einem Gamma-Zähler wurde die Radioaktivität bestimmt. Die Daten wurden als durchschnittlicher Prozentsatz präzipitierter Zählimpulse minus der der Kontrollröhrchen angebenen. Die Ergebnisse zeigten, daß modifizierter ¹²&sup5;J-Lym-1 zu jedem Zeitpunkt nach der Inkubation genauso stabil war wie ¹²&sup5;J-markierter intakter Lym-1, der als Standardkontrolle diente. Die Ergebnisse zeigten weiter, daß nach einer 8-tägigen Inkubation bei 37ºC - 1/2ºC ≥ 92% der im modifizierten Lym-1 vorhandenen Aktivität mit TCA präzipitierbar war.
Beispiel 6 zeigt daher, daß die Aktivität der modifizierten Antikörper in Serum mindestens 8 Tage stabil blieb. Zur Beurteilung, ob die modifizierten MAbs nach Inkubation in Serum intakt blieben, wurde eine HPLC-Analyse von modifiziertem Lym-1 nach Inkubation durchgeführt, wie in Beispiel 7 gezeigt.

BEISPIEL 7

Analyse von modifiziertem Lym-1 mittels HPLC

HPLC-Analysen wurden an einem mit Größenausschluß-Säulen (SW 300) ausgestatteten Waters-System unter Venvendung von 0,1 M neutralem Phosphatpuffer als Elutionslösungsmittel bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt. Das Eluat wurde mit einem Radioisotopen-Detektor nachgewiesen. Das markierte modifizierte Lym-1-Produktgemisch von Beispiel 6 zeigte einen Hauptpeak einer Molekülart niedrigen Molekulargewichts bei einer Elutionszeit von 750 Sekunden und eine kleine Menge bei 690 Sekunden. Intakter Lym-1 ergab einen einzelnen Peak mit einer Retentionszeit von 690 Sekunden.
Beispiel 7 zeigt daher, daß die in Serum inkubierten modifizierten Lym-1- Proben bei HPLC-Analyse ein scheinbares Molekulargewicht besaßen, das geringer war als das von intaktem Lym-1. Im Gegensatz dazu zeigte Beispiel 2, daß nicht-inkubierter modifizierter Lym-1 eine Retentionszeit besaß, die identisch mit der von intaktem Lym-1 war. Bei FPLC-Analyse zeigte modifizierter Lym-1 daher einen offensichtlichen Molekulargewichts-verlust nach Inkubation in Serum.
Zur weiteren Bestätigung des offensichtlichen Molekulargewichtsverlustes von modifiziertem Lym-1 nach Inkubation in Serum wurde eine Polyacrylamidgel-Elektrophorese der Proben durchgeführt, wie in Beispiel 8 gezeigt.

BEISPIEL 8

Analyse von radioaktivmarkiertem modifiziertem Lym- 1 mittels SDS- Polvacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die gleichen Aliquote jedes inkubierten Serumgemisches aus Beispiel 6 wurden serienmäßig mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE kontrolliert. Für diese Untersuchung wurden Proben in 10%-igen Acrylamidgelen aufgetrennt, vorsichtig getrocknet und in üblicher Weise einem photographischen Film ausgesetzt, wie in Laemmli, U. K., Cleavage of Structural Proteins During Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature 227 (1970), 680-685, beschrieben. Diese Analyse zeigte, daß intakter ¹²&sup5;J-Lym-1 bei einem Mr-Wert von 200 000 sichtbar war, während modifizierter ¹²&sup5;J-Lym-1 bei einer distinkten Bande festgestellt wurde, die einem kleineren Mr-Wert von etwa 116 000 entsprach. Das vorliegende Beispiel zeigt daher, daß eine Inkubation der modifizierten Antikörper in Serum zu einem modifizierten scheinbaren Molekulargewicht in Acrylamidgelen führt, wodurch die Ergebnisse der HPLC- Analyse bestätigt werden.

BEISPIEL 9

Test auf Dejodierung von marklertem Lym-1 in Serum

Die gleichen Proben aus Beispiel 6 wurden auch einer 8-tägigen Untersuchung unterzogen, um festzustellen, ob aus radioaktivmarkiertem Lym- 1 Radioaktivität verloren gegangen war. Ein solcher Verlust kann als Beweis für eine Dejodierung in Serum interpretiert werden. Die Daten zeigten fast keinen Radioaktivitätsverlust über diese Zeitspanne, wodurch sich bestätigte, daß in diesen Immunkonjugaten eine sehr stabile Bindung von Jod erhalten worden war.
Die Beispiele 7 - 9 zeigen daher, daß die modifizierten Antikörper, obwohl sie nach Inkubation in Serum fast die volle Aktivität behielten, offensichtlich in Moleküle mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 116 000 gespalten wurden. Wie vorstehend dargelegt, ist es möglich, daß dieser Molekulargewichtsverlust auf eine Aufspaltung der Antikörper in ihre monovalente Form zurückzuführen ist. In jedem Fall kann man davon ausgehen, daß der Verlust des scheinbaren Molekulargewichts auf eine Aufspaltung der modifizierten Antikörper in Fragmente davon zurückzuführen ist.
Nach der Entdeckung der vorstehenden unerwarteten Veränderung im scheinbaren Molekulargewicht der modifizierten Antikörper bei Inkubation in Serum testeten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Stabilität der modifizierten MAbs in vivo. Sie führten diese in vivo-Tests durch, um die Gesamtkörper-Clearancezeit zu bestimmen. Ein Beispiel dieser Tests ist in Beispiel 10 gezeigt.

BEISPIEL 10

Gesamtkörper-Clearance

Es wurden Experimente durchgeführt, bei denen drei Gruppen von thymuslosen Nacktmäusen (n = 5) (a) ein intakter Antikörper, (b) F(ab') 2- Fragmente oder (c) ein modifizierter Lym-1-Antikörper, wobei die Antikörper oder Fragmente unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens mit ¹³¹J markiert worden waren, intraperitoneal injiziert wurden. Die Gesamtkörper- Aktivität wurde bei Injektion und serienmäßig danach mit einem Dosimeter bestimmt. Diese Untersuchung zeigte, daß die Gesamtkörper-Clearance von Radioaktivität je nach Antikörperpräparat schwankte. Die Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt.
Figur 2 zeigt, daß modifizierter Lym-1 mit einer biologischen Halbwertszeit (t1/2) von 20 Stunden vom Gesamtkörper schneller ausgeschieden wurde als intakter Lym-1 (t1/2 = 5 Tage). Die Clearance von F(ab')&sub2;-Fragmenten mit einer biologischen Halbwertszeit von 10 Stunden war jedoch zweimal schneller als die von modifiziertem Lym-1. Die Daten zeigten, daß modifizierter Lym-1 mit einer Rate ausgeschieden wurde, die zwischen der der schnell ausgeschiedenen F(ab')&sub2;-Fragmente und der des langsam ausgeschiedenen intakten Antikörpers lag.
Aus den Daten von Beispiel 10 ist daher ersichtlich, daß die modifizierten Antikörper vom Körper schneller ausgeschieden werden als die relativ lange verbleibenden intakten Antikörper, jedoch nicht so schnell wie die F(ab')&sub2;- Fragmente.
Ein ideales Mittel für die Immuntherapie würde im Blutstrom über Zeitspannen verbleiben, die ausreichend lang sind, um die gewünschte toxische Wirkung hervorzurufen, jedoch nicht so lang, daß ungewollte toxische Nebenwirkungen verursacht werden. Die Daten aus Beispiel 10 deuteten darauf hin, daß die modifizierten Antikörper bei Verwendung in einer Immuntherapie wahrscheinlich ideale Verweilzeiten zeigen würden.
Wie vorstehend diskutiert, würde ein Mittel zur Immuntherapie gegenüber seinen Zielzellen auch hochspezifisch sein. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung testeten daher in den folgenden Beispielen die Spezifität der modifizierten MAbs im Vergleich zu der der intakten MAbs als auch der der F(ab')&sub2;-Fragmente. Beispiel 11 zeigt die Verfahren, die in allen nachfolgenden Untersuchungen zur biologischen Verteilung verwendet wurden.

BEISPIEL 11

Untersuchungen zur biologischen Verteilung

Zwei Gruppen von sechs Wochen alten Nacktmäusen wurden Raji-Zellen (10&sup7;) subcutan in die Oberschenkeiregion injiziert. Man ließ die Tumore drei Wochen wachsen, bis ihr Durchmesser größer als 1 cm war. Unter Verwendung jeder Maus-Gruppe wurden die nachstehend beschriebenen Untersuchungen mit paarweisen Markierungen durchgeführt. In der ersten Gruppe (n= 6) wurde jeder Maus ein 0,2 ml-Inokulum intraperitoneal injiziert, das 10 µg modifizierten Lym-1, der mit ¹³¹J mit einer spezifischen Aktivität von 12 µCi/µg (120 µCi/Maus) markiert war, und 10 ijg intakter Lym-1 enthielt, der mit ¹²&sup5;J bei einer spezifischen Aktivität von 2,5 µCi/µg (25 µCi/Maus) markiert war. In der zweiten Gruppe (n = 4) erhielten die Mäuse ein 0,2 ml-Inokulum, das 10 µg modifizierten Lym-1, der mit ¹³¹J mit einer spezifischen Aktivität von 12 µCi/µg (120 µCi/Maus) markiert war, und 10 µg F(ab')&sub2;-Fragmente enthielt, die mit ¹²&sup5;J mit einer spezifischen Aktivität von 2,5 µCi/µg (25 µCi/Maus) markiert waren. Bei allen Experimenten wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation zu vorher gewählten Zeitpunkten nach der Injektion getötet und verschiedene Organe, Blut und der Tumor wurden entfernt und auf einer Analysewaage gewogen. Zur Ermittlung der ¹³¹J- und ¹²&sup5;J-Aktivität wurde dann die in den Proben enthaltene Radioaktivität in einem Gamma-Zähler bestimmt. Die ¹²&sup5;J- Zählimpulse wurden um den Übertritt (cross-over) aus dem ¹³¹J-Kanal geändert, indem 17% der ¹³¹J-Kanal-Zählimpulse subtrahiert wurden, eine Formel, die unter Verwendung eines 1282-Compugamma-Gamma-Zählers (LKB) experimentell bestimmt wurde. Die Daten wurden auch hinsichtlich des Strahlungszerfalls des ¹³¹J-Isotops entsprechend der Tage, an denen die Tiere getötet wurden, berichtigt. Für jede Maus wurden die Daten als CPM pro Gramm Tumor/CPM pro Gramm Organ, % Dosis/Gramm und % Dosis/Organ angegeben. Aus diesen Daten wurden der Durchschnitt und die Standardabweichung für jede Gruppe berechnet.
Unter Verwendung der Verfahren von Beispiel 11 vergleicht Beispiel 12 die biologische Verteilung der modifizierten MAbs gegenüber intakten MAbs.

BEISPIEL 12

Untersuchung zur biologischen Verteilung von modifiziertem Lym-1 gegenüber intaktem Lym-1

Für diese Untersuchung wurde der intakte Lym-1-Antikörper mit dem modifizierten Lym-1-Antikörper unter Verwendung der Verfahren von Beispiel 11 verglichen. Intakter Lym-1 besaß 7 Tage nach Injektion eine Aktivität im Blut von 0,64% ID/g, wie in Tabelle I beschrieben. Am Ende der gleichen Zeitspanne besaß der Tumor eine Aktivität von 3,92% ID/g.
Wie in Tabelle 1 beschrieben, wurde modifizierter Lym-1 im Vergleich zu intaktem Lym-1 schneller aus dem Blut ausgeschieden und erzeugte am 7. Tag eine Aktivität im Blut von 0,14% ID/g. Am Ende der gleichen Zeitspanne erzeugte der Tumor 7,7% ID/g, was signifikant höher war als die entsprechenden Aktivitäten von intaktem Lym-1.
Die Ergebnisse der Antikörper-Reaktivitäten in mehreren Organen von Beispiel 12 sind in Tabelle I beschrieben und in Figur 3 (% Dosis/Gramm) sowie Figur 4 (Tumor/Organ) graphisch gezeigt. TABELLE 1 BIOLOGISCHE VERTEILUNG VON MODIFIZIERTEM UND INTAKTEM MONOCLONALEN LYM-1-ANTIKÖRPER IN RAJI-TUMOR ENTHALTENDEN NACKTMÄUSEN (N=6) 7 TAGE NACH INJEKTION
* Durchschnitt (Standardabweichung)
Aus Figur 3 ist ersichtlich, daß die modifizierten Antikörper im Tumor ein stärkeres Signal erzeugten als die intakten Antikörper. Außerdem reagierten die modifizierten Antikörper bei jedem getesteten Organ mit Ausnahme der Niere weniger stark als die intakten MAbs. Es ist nicht unerwartet, daß ein stärkeres Signal in der Niere zu finden ist, da man erwartet, daß die Antikörper durch dieses Organ schneller ausgeschieden werden. Aufgrund der in Beispiel 10 festgestellten, im Vergleich zu intakten MAbs schnelleren Clearance-Rate der modifizierten MAbs, würde man eine höhere Menge modifizierter MAbs in der Niere erwarten.
Unter Bezugnahme auf Figur 4, die die gleichen Daten wie Figur 3 in einer anderen Form zeigt, ist ersichtlich, daß die modifizierten MAbs in jedem getesteten Organ mit Ausnahme der Niere ein signifikant höheres Tumor/Organ-Verhältnis erzeugten als die intakten MAbs. Daher würde man erwarten, daß die modifizierten Antikörper bei Verwendung in einer Immunszintigraphie einen signifikant geringeren Hintergrund erzeugen. Außerdem würde man auch erwarten, daß die modifizierten Antikörper aufgrund ihrer höheren Affinität für einen Tumor als auch der geringeren Affinität für Nichtzielgeweben bei Venvendung in Immuntherapien wirksamer sind. Daher würde man erwarten, daß die modifizierten Antikörper bei Verwendung in Immuntherapien gegenüber Tumoren stärker toxisch und gegenüber Nichtzielgeweben weniger toxisch sind. Die immuntherapeutische Verwendung der erfindiungsgemäßen modifizierten Antikörper wird nachstehend genauer erklärt.
Als nächstes verglichen die Erfinder der vorliegenden Erfindung die biologische Verteilung der modifizierten MAbs mit der von F(ab')&sub2;-Fragmenten des ansonsten nicht-modifizierten Antikörpers. Beispiel 13 veranschaulicht diese Experimente.

BEISPIEL 13

Untersuchung zur biologischen Verteilung von modifiziertem Lym-1 im Vergleich zu F(ab')&sub2;-Fragmenten von Lym-1

Für diese Untersuchung wurden die F(ab')&sub2;-Fragmente mit modifizierten Lym-1 MAbs verglichen. Die Experimente wurden wie in Beispiel 11 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II beschrieben und in den Figuren 4 und 5 graphisch gezeigt. TABELLE II BIOLOGISCHE VERTEILUNG VON MODIFIZIERTEM UND INTAKTEM MONOCLONALEN LYM- 1 -ANTIKÖRPER IN RAJI-TUMOR ENTFIALTENDEN NACKTMAUSEN (N=4) 5 TAGE NACH INJEKTION
* Durchschnitt (Standardabweichung)
Tabelle II zeigt, daß modifizierter Lym-1 langsamer aus dem Blut ausgeschieden wurde als die F(ab')&sub2;-Fragmente. Modifizierter Lym-1 erzeugte 5 Tage nach der Injektion eine Aktivität im Blut von 0,09% ID/g, die höher war als die der Fragmente (0,05%). Figur 5 zeigt, daß die Aktivität am Tumor von modifiziertem Lym-1 etwa zweieinhalbmal höher war als die entsprechende Aktivität der F(ab')&sub2;-Fragmente. Die Aktivität von modifiziertem Lym-1 war bei all den verschiedenen getesteten Organen einschließlich der Niere höher als die der F(ab')&sub2;-Fragmente. Das stimmt mit der Theorie überein, daß schneller ausgeschiedene Antikörper sich in der Niere anreichern.
Außerdem zeigt Figur 6, daß die Tumor/Organ-Verhältnisse für modifizierten Lym-1 bei allen getesteten Organen höher waren als die der F(ab')&sub2;-Fragmente. Die Experimente der Beispiele 12 und 13 bestätigen daher, daß die erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper eine höhere Aktivität für ihren Zieltumor besitzen als intakte MAbs oder F(ab')&sub2;-Fragmente. Außerdem zeigen die Daten der Tumor/Organ-Verhältnisse dieser Experimente, daß die modifizierten Antikörper eine höhere Spezifität für Tumore besitzen als intakte MAbs oder F(ab')&sub2;-Fragmente.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung testeten daher die Fähigkeit der erfindungsgemäßen modifizierten MAbs, bessere Immunszintigraphie Ergebnisse zu liefern. Ein Beispiel dieser Tests ist in Beispiel 14 gezeigt.

BEISPIEL 14

Untersuchungen zur Sichtbarmachung von Lym- 1

Unter Verwendung eines Loch-Kollimators und einer Spectrum 91-Gamma- Kamera (Raytheon) wurden von Tumor enthaltenden Nacktmäusen Bilder angefertigt. Bildanalysen dieser Tiere lieferten eine Schätzung der Tumor/Ganzkörper-Verteilung des Antikörpers nach der Injektion. Sieben Tage nach der Injektion wurden die Tiere mit 2 mg Ketamin-HCl und 0,4 mg Xylazin, die als 0,2 ml-Impfung subcutan verabreicht wurden, narkotisiert. Von den ruhiggestellten Tieren in rückwärtiger Lage wurden dann mit der Kamera, die vorher so eingestellt war, daß 10 000 Zählimpulse erfaßt wurden, Bilder angefertigt. Es erfolgte keine Subtraktion des Hintergrundes. Photographische Bilder wurden unter Verwendung eines Polaroid-Pack-Films vom Typ 330 erhalten. In jedem Bild wurden zwei Bereiche definiert: (a) Bereich 1, ganzer Körper, (b) Bereich 2, Tumor. Die Figuren 6 - 8 zeigen Beispiele von Szintigraphien (auch als Szintigramme bekannt), die mittels dieser Experimente hergestellt wurden.
Die immunszintigraphische Sichtbarmachung mit intaktem Lym-1 wurde am 7. Tag nach Injektion versucht und war nicht zufriedenstellend, wie in Figur ersichtlich. Figur 6 zeigt, daß, obwohl der Tumor sichtbar gemacht wurde, auch der Rest des Tieres sichtbar gemacht wurde. Die Figuren 7 und 8 zeigen die Bilder von zwei verschiedenen Raji-Tumor enthaltenden Tieren, denen markierter modifizierter Lym-1 injiziert worden war, zur gleichen Zeit nach Injektion. Es ist ersichtlich, daß die beiden Figuren 7 und 8 eine Konzentration von markiertem modifiziertem Lym-1 am Tumor in einem Ausmaß zeigen, das viel höher ist als das von intaktem Lym-1 erzeugte Ausmaß am Tumor, die in Figur 6 zu sehen ist. Wichtiger ist, daß das durch modifiziertes Lym-1 erzeugte Verhältnis der Markierung am Tumor zum Hintergrund der ganzen Maus um ein Mehrfaches höher war als bei vollständigem Lym-1. In den Figuren 7 und 8 ist daher der Tumor klar abgegrenzt, wobei Hintergrund- Radioaktivität geringfügig oder überhaupt nicht auftritt.
Bei Verwendung von modifiziertem Lym-1 konnte der Tumor außerdem am 5. Tag nach der Injektion zufriedenstellend sichtbar gemacht werden. Figur 10 zeigt ein Bild, das am 5. Tag vom gleichen Tier aufgenommen wurde, das in Figur 9 am 7. Tag gezeigt ist. Wie zu sehen ist, war das Bild vom 5. Tag von Figur 10 dem Bild, das mit intaktem Lym-1 am 7. Tag (Figur 7) hergestellt wurde, deutlich überlegen. Die Ergebnisse waren für alle getesteten Tiere ähnlich.
Diese Untersuchung deutet darauf hin, daß modifizierte Antikörper- Fragmente eine größere spezifische Aktivität gegenüber Tumorantigenen zeigen, wodurch die Anreicherung einer höheren absoluten Antikörper- Konzentration im Tumor ermöglicht wird. Das wird durch die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse bestätigt, die zeigten, daß 7 Tage nach Injektion die absolute Konzentration modifizierter Lym-1-Fragmente etwa zweimal so groß war wie die Konzentration von intaktem Lym-1 und nach 5 Tagen etwa zweieinhalbmal so groß war wie die Konzentration von F(ab')&sub2;-Fragmenten.
Die viel schnellere Clearance der modifizierten Lym-1-Fragmente verringert auch signifikant die Zeit, die erforderlich ist, um hohe Tumor/Hintergrund-Verhältnisse zu erreichen, und führt daher in kürzerer Zeit zur besseren Sichtbarmachung als intakter Antikörper.
Um zu zeigen, daß die erfindungsgemäße Modifikation allgemein nützlich ist, um die Spezifität und Aktivität der Antikörper zu verbessern, modifizierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung weitere MAbs. Tests dieser verschiedenen modifizierten MAbs sind in den Beispielen 15 - 18 gezeigt.

BEISPIEL 15

Clearance-Rate des monoclonalen Antikörpers B72.3

B72.3 (IgG&sub1;), der monoclonale Antikörper gegen Dickdarmkarzinom, wurde erhalten, wie in Colcher, D. et al., A Spectrum of Monoclonal antibodies Reactive with Human Mammary Tumor Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. 78 (1981), 3199-3203. B72.3-MAbs wurden entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 durchschnittlich mit einer PDP-Gruppe pro Molekül funktionalisiert.
Die modifizierten B72.3-MAbs wurden mittels des Verfahrens von Beispiel 3 radioaktiv markiert. Die Gesamtkörper-Clearance-Zeiten wurden wie in Beispiel 10 bestimmt. Figur 11 zeigt die Ergebnisse dieser Gesamtkörper-Clearance Experimente. Die modifizierten Antikörper zeigten eine Abnahme bei der Gesamtkörper-Clearance-Halbwertszeit von etwa 6 Tagen für intakte MAbs auf etwa 2,5 Tage für die modifizierten Antikörper. Die Clearance-Halbwertszeit von F(ab')&sub2;-Fragmenten war wie für die Lym-1-Fragmente schneller als die der modifizierten Antikörper, wobei die Halbwertszeit etwa 12 Stunden betrug. Die Ergebnisse zeigten daher, daß sich modifizierter B72.3 ähnlich wie modifizierter Lym-1 verhielt mit einer Clearance-Halbwertszeit zwischen der der F(ab')&sub2;-Fragmente und der des intakten Antikörpers.

BEISPIEL 16

Biologische Verteilung von B72.3

Untersuchungen zur biologischen Verteilung unter Verwendung paarweiser Markierungen an zwei Gruppen von jeweils fünf Mäusen wurden bei thymuslosen Nacktmäusen durchgeführt, die das menschliche Dickdarmkarzinom L5174T trugen. Einer Gruppe wurde intakter ¹²&sup5;J- markierter B72.3 injiziert, während der anderen modifizierter ¹³¹J-markierter B72.3 injiziert wurde. Im Experiment wurde auch die biologische Verteilung im Tumor, in Blut und verschiedenen Organen verglichen. Die angewendeten Verfahren waren die gleichen wie in den Beispielen 11 - 13. Die Daten sind in Tabelle III beschrieben und in den Figuren 11 und 12 graphisch gezeigt. TABELLE III BIOLOGISCHE VERTEILUNG VON MODIFIZIERTEM UND INTAKTEM MONOCLONALEN ANTIKÖRPER B72.3 IN NACKTMÄUSEN (N = 5). DIE DAS MENSCHLICHEN DICKDARMKARZINOM L5174T TRUGEN. 4 TAGE NACH INJEKTION
* Durchschnitt (Standardabweichung)
Wie in Tabelle III zu sehen ist, erzeugte intakter B72.3-Antikörper 4 Tage nach Injektion eine Aktivität im Blut von 1,34% ID/g und eine Aktivität am Tumor von 4,04%, wie in Tabelle III gezeigt. Im Vergleich zu intaktem B72.3 erzeugte modifizierter B72.3 nach 4 Tagen eine geringere Aktivität im Blut (1,1% ID/g) und eine höhere Aktivität am Tumor (6,02% ID/g).
Wie in Figur 13 zu sehen ist, waren für modifizierten B72.3 alle Aktivitäten bei den verschiedenen Organen mit Ausnahme der Niere größer, wie für einen schneller ausgeschiedenen Antikörper zu erwarten war. Wie in Figur 14 gezeigt, war daher das Tumor/Organ-Verhältnis für modifizierten B72.3 signifikant höher als die entsprechenden Verhältnisse für intakten B72.3. Das Tumor/Organ-Verhältnis wurde selbst bei Nieren aufgrund der höheren Aktivität des modifizierten Antikörpers an der Tumorstelle verbessert.

BEISPIEL 17

Sichtbarmachung von B72.3 in Tumor enthaltenden Mäusen

Eine Bildanalyse von Mäusen, die den Tumor LS174T trugen und denen modifizierter B72.3 injiziert wurde, lieferte eine Schätzung der Verteilung des Antikörpers nach der Injektion im Tumor und ganzen Körper. Figur 14 zeigt eine Immunszintigraphie 1 Tag nach der Injektion. Das Bild definiert den Tumor klar, wobei die Hintergrund-Radioaktivität nur schwach ist. Figur 15 zeigt eine Immunszintigraphie 4 Tage nach der Injektion. Nach 4 Tagen war der Tumor deutlich zu sehen, wobei im Blutpool des Tieres nur eine geringe Radioaktivität verblieben war. Die Ergebnisse waren für alle Tiere ähnlich.
Es stellte sich daher heraus, daß modifizierter B72.3 sehr geeignet war, innerhalb einer kurzen Zeit nach Injektion Immunszintigraphien hoher qualität von Tumoren zu erhalten, die mit B72.3 reagieren.
TNT-1 ist ein monoclonaler IgG2a-Antikörper, der nekrotische Tumore als Ziel zur selektiven Bindung an menschlichen Krebs nutzt. Wie in Beispiel 18 gezeigt, modifizierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung wie in Beispiel 1 diesen Antikörper mit durchschnittlich einer PDP-Gruppe pro Molekül und analysierten die Gesamtkörper-Retentionszeit.

BEISPIEL 18

Verwendung des monoclonalen Antikörpers TNT-1

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung gewannen TNT-1, wie in Epstein, A. L et al., A Novel Method for the Detection of Necrotic Lesions in Human Cancer, Cancer Res. 48 (1988), 5842-5848, beschrieben. Die TNT-1-MAbs wurden mittels des Verfahrens von Beispiel 3 radioaktiv markiert. Gesamtkörper- Clearance-Zeiten wurden wie in Beispiel 10 bestimmt. Figur 16 zeigt die Ergebnisse dieser Gesamtkörper-Clearance-Experimente. Die modifizierten TNT- 1-MAbs zeigten im Vergleich zu intaktem TNT-1 eine verringerte Gesamtkörper-Clearance-Halbwertszeit und im Vergleich zu F(ab')&sub2;- Fragmenten von TNT-1 eine erhöhte Clearance-Halbwertszeit.
Modifizierter TNT-1 verhielt sich daher ähnlich wie die anderen modifizierten Antikörper. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erwarten daher, daß der Nutzen der modifizierten TNT-1-MAbs dem der anderen getesteten modifizierten Antikörper entspricht.
Dementsprechend glauben die Erfinder der vorliegenden Erfindung, daß Modifikationen an einem beliebigen Antikörper unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren eine verbesserte Tumorsichtbarmachung bereitstellt. Um unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ein Bild eines beliebigen gewünschten Gewebetyps herzustellen, müssen zuerst Antikörper gegen diesen Gewebetyp gewonnen werden. Polyclonale Antikörper können in herkömmlicher Weise gewonnen werden, wie dem Fachmann bekannt ist. In einer anderen Ausführungsform können monoclonale Antikörper hergestellt werden, um die von diesen Antikörpern bereitgestellte erhöhte Spezifität zu erhalten, wie dem Fachmann auch bekannt ist. Die Antikörper werden dann mit einem heterobifunktionellen Reagenz chemisch konjugiert. Nach Konjugation wird ein geeignetes Radionuclid an die modfizierten Antikörper angelagert.
Zur Einführung einer Markierung in ein Individuum können die markierten Antikörper in Arzneimitteln enthalten sein, die pharmazeutisch verträgliche Excipienten, Träger oder Basen umfassen. Geeignete Excipienten, Träger oder Basen umfassen Kochsalzlösung, phophatgepufferte Kochsalzlösung, Glycerin, Calciumcarbonat und dergleichen. Diese Zusammensetzungen werden durch eines der verschiedensten Mittel eingeführt, wie lokale Injektion, intravenöse Injektion oder orale Verabreichung in Fällen, wo eine verminderte Signalstärke erforderlich ist oder wo eine Sichtbarmachung von Gewebe in der Mundhöhle gewünscht wird. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung jedoch durch systemische Injektion, um eine maximale Exposition des Zielgewebes gegen den Antikörper zu erreichen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung glauben, daß eine erfindungsgemäße Modifikation von Antikörpern durch Anlagerung von durchschnittlich einer PDP-Gruppe signifikant verbesserte Ergebnisse liefert, wenn diese modifizierten Antikörper in ein immuntherapeutisches Mittel eingebaut werden. Solche therapeutischen Mittel umfassen im allgemeinen einen für einen Tumor oder ein anderes erkranktes Gewebe spezifischen Antikörper, der mit einem oder mehreren biologisch aktiven Molekülen kombiniert ist. Geeignete biologisch aktive Moleküle im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind Radionudide.
Die Hoffnung auf eine wirksame Immuntherapie muß jedoch noch voll realisiert werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung glauben, daß die erhöhte Aktivität und Spezifität der erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper zu immuntherapeutischen Mitteln führen wird, die ausreichende Aktivität und Spezifität für ihre Zielgewebe besitzen, so daß die Mängel der bisherigen immuntherapeutische Mittel beseitigt werden. Wenn einem Individuum ein geeignetes immuntherapeutisches Mittel injiziert wird, können daher erkrankte Zielgewebe abgetötet werden, ohne die gesunden Gewebe des Individuums signifikant zu schädigen.
Bei der Verwendung dieser immuntherapeutischen Mittel müssen zuerst Antikörper gewonnen werden, die für bestimmte unerwünschte Gewebetypen spezifisch sind. Wenn die gewünschten Antikörper nicht erhältlich sind, können Antikörper in einem geeigneten Organismus produziert werden, indem dem Organismus Antigene injiziert werden und aus dem Säuger Serum gewonnen wird, wie dem Fachmann bekannt ist. In einer anderen, bevorzugten Ausführungsform können monoclonale Antikörper in einer Weise produziert werden, die dem Fachmann bekannt ist. Die Antikörper werden danach mit einem heterobifunktionellen Mittel chemisch konjugiert. Nach der Konjugation werden die erhaltenen modifizierten Antikörper durch Konjugation mit einem Radionuclid weiter modifiziert. Die Antikörper werden in Arzneimitteln kombiniert, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten oder eine pharmazeutisch verträgliche Base enthalten. Solche pharmazeutisc h verträglichen Träger, Excipienten oder Basen umfassen normale Kochsalzlösung zur systemischen Injektion, Glycerin, Calciumcarbonat. Die Zusammensetzungen sind dann zur Einführung in einen Patienten, z.B. einen Säuger, fertig.
Die Antikörper werden dann über einen beliebigen bekannten Verabreichungsweg in das Individuum eingeführt. Die Zusammensetzungen können beispielsweise durch systemische Injektion oder lokale Injektion in das geschädigte Gewebe eingeführt werden, sie können topisch auf ein äußerlich geschädigtes Gewebe aufgetragen werden und können in Fällen, wo eine verringerte Signalstärke erforderlich ist oder wo eine Therapie von Gewebe in der Mundhöhle gewünscht wird, oral eingenommen werden.
Die Dosierung des biologisch aktiven Mittels, das einen Antikörper enthält, hängt von der Empfindlichkeit des Zielgewebes gegenüber dem Toxin, der Menge eines geschädigten Gewebes, dem Verabreichungsweg, der Affinität des Antikörpers, Clearance-Raten und anderen Faktoren ab. Typische Dosierungen liegen jedoch im allgemeinen im Bereich von 1 µg/kg Gesamtkörpergewicht bis 1 mg/kg. Bei den meisten Anwendungen beträgt die Dosis vorzugsweise 5 µg/kg bis 200 µg/kg.

BEISPIEL 21

Arzneimittel, das gegen B-Zell-Lymphom im Menschen wirksam ist

10 mg/ml modifizierter radioaktivmarkierter Lym-1 aus Beispiel 18 Balancierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,9%)
Die radioaktivmarkierten modifizierten MAbs können in zusammensetzungen formuliert werden, die zur Sichtbarmachung ihrer spezifischen Antigene bei einer Immunszintigraphie wirksam sind. Im folgenden ist ein Beispiel einer solchen Zusammensetzung beschrieben.

BEISPIEL 22

Arzneimittel, das sich zur Dickdarmkarzinom-Immunszintigraphie einsetzen läßt

10 mg/ml modifizierter radioaktivmarkierter B72.3 aus Beispiel 15 Balancierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,9%)
Die vorangegangenen Beispiele und die genaue Beschreibung sind natürlich nur zur Veranschaulichung angegeben, Geist und Schutzumfang der vorliegenden Erfindung werden allein durch die angefügten Patentansprüche beschränkt.

Claims

1. Antikörper, an den ein heterobifunktionelles Reagenz eines bestimmten Typs an einer ersten Bindungsstelle gebunden ist, wobei im Durchschnitt ein heterobifunktionelles Reagenz pro Antikörpermolekül gebunden ist, und an den auch ein Radionuclid an einer zweiten Bindungsstelle gebunden ist, wobei die zweite Bindungsstelle auf dem Antikörper von der ersten Bindungsstelle verschieden ist und kein gebundenes heterobifunktionelles Reagenz des bestimmten Typs des heterobifunktionellen Reagenzes aufweist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, wobei der bestimmte Typ des heterobifunktionellen Reagenzes einer der folgenden ist: Sulfosuccinimidyl-2-(p-azidosalicylamido) ethyl-1,3'- dithiopropionat (SASD), Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o- nitrobenzamido) -ethyl-1,3'-dithiopropionat (SAND), Sulfosuccinimidyl- (4-azidophenyldithio)propionat (Sulfo- SADP) oder 2-Iminothiolan (Traut's Reagenz).

3. Antikörper nach Anspruch 1, wobei das heterobifunktionelle Reagenz Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP) ist.

4. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper einer der folgenden Typen von Antikörpern ist: ein monoclonaler Antikörper, ein menschlicher Antikörper, ein gentechnisch hergestellter Antikörper, ein chimärer Antikörper, ein synthetischer Antikörper oder ein polyclonaler Antikörper.

5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Antikörper einer der folgenden Antikörper ist: Lym-1, TNT-1 oder B72.3.

6. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Antikörper eine in vivo-Clearance-Rate aufweist, die zwischen der Clearance-Rate von F(ab')&sub2;-Fragmenten und vollständigen Antikörpern des gleichen Typs liegt.

7. Verfahren zur Verbesserung der Aktivität und Spezifität von Antikörpern und deren Ausstattung mit einer erhöhten in vivo-Clearance, umfassend die folgenden Schritte in beliebiger Reihenfolge:

Chemische Konjugation von im Durchschnitt einem heterobifunktionellen Wirkstoff eines bestimmten Typs an jeden der Antikörper an einer ersten Bindungsstelle; und Bindung eines Radionuclids an die Antikörper an einer zweiten Bindungsstelle, wobei die zweite Bindungsstelle eine von der ersten Bindungsstelle auf dem Antikörper verschiedene Bindungsstelle ist und kein gebundenes heterobifunktionelles Reagenz des bestimmten Typs aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der bestimmte Typ des heterobifunktionellen Reagenzes eine Pyridyldithiopropionat (PDP)-Gruppe umfaßt.

9. Zusammensetzung zur Sichtbarmachung eines spezifischen Gewebes in einem Säuger, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Radionuclid Gammastrahlung emittiert.

11. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung an Säuger vor einer Immunszintigraphie.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein Radionuclid einschließt, das ein gamma-emittierendes Radionuclid ist.

13. Verwendung einer effektiven für ein spezifisches Gewebe cytotoxischen Menge eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Immuntherapie in einem Säuger.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der Antikörper für ein erkranktes Gewebe in dem Säuger spezifisch ist.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das erkrankte Gewebe Krebs ist.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei der Antikörper chemisch mit im Durchschnitt einer Pyridyldithiopropionat (PDP)-Gruppe pro Antikörpermolekül konjugiert ist.

17. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Umsetzung des unmodifizierten Antikörpers mit dem heterabifunktionellen Reagenz und mit dem Radionuclid.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der unmodifizierte Antikörper zuerst mit dem heterobifunktionellen Reagenz und dann mit dem Radionuclid umgesetzt wird.