CZ305279B6

CZ305279B6 - Deriváty tryptofanu zvyšující sekreci růstového hormonu

Info

Publication number: CZ305279B6
Application number: CZ2011-585A
Authority: CZ
Inventors: Jean Martinez; Jean-Alain Fehrentz; Vincent Guerlavais
Original assignee: Zentaris Ag
Priority date: 2000-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2015-07-15
Also published as: CY1107793T1; BR0111591A; EP1289951B1; HU229233B1; DE60112753T2; AU6606601A; CY1107710T1; DE60130025T2; PT1344773E; WO2001096300A1; FR19C1044I2; ES2288724T3; HUP0302026A3; ATE362472T1; NO20025893D0; BG110708A; CZ20024095A3; IL153067A0; HUP0302026A2; JP4932132B2

Abstract

Předkládané řešení se týká derivátů tryptofanu vzorce I, které jsou použitelné pro zvýšení hladiny růstového hormonu v plazmě u savců i pro léčení deficience sekrece růstového hormonu, zpomaleného růstu u dětí a metabolických poruch souvisejících s deficiencí sekrece růstového hormonu.

Description

Deriváty tryptofanu zvyšující sekreci růstového hormonu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká derivátů tryptofanu, které jsou použitelné pro zvyšování hladiny růstového hormonu v plazmě při podávání savci.

Dosavadní stav techniky (a) Popis dosavadního stavu

Růstový hormon (GH) neboli somatotropin, který je sekretovaný hypofýzou, tvoří skupinu hormonů, jejichž biologické účinky jsou základem růstu mladého organismu do výšky, ale také udržování jeho integrity v dospělosti. Růstový hormon působí přímo nebo nepřímo na periferní orgány stimulací syntézy růstových faktorů (růstový faktor-I podobný inzulínu, IGF—I) nebo jejich receptorů (epidermální růstový faktor, EGF). Přímé působení růstového hormonu patří k typu označovanému jako antiinzulinový, který působí ve prospěch lipolýzy na úrovni adipózních tkání. Působením růstového hormonu na syntézu a sekreci IGF-I (somatomedin C) stimuluje růstový hormon růst chrupavky a kostí (strukturní růst), syntézu proteinů a proliferace řady periferních orgánů, včetně svalů a kůže. Svými biologickými účinky se růstový hormon v dospělém organismu účastní při udržování stavu proteinového anabolismu a hraje primární úlohu při ději regenerace tkání po úrazu.

Snižování sekrece růstového hormonu s věkem prokázané u lidí a zvířat zvyšuje metabolický posun směrem ke ketabolismu, který zahajuje, nebo který se účastní stárnutí organismu. Úbytek svalové hmoty, akumulace adipózních tkání, demineralizace kostí, ztráta schopnosti regenerace tkáně po úraze, což jsou děje pozorované u starších lidí, korelují s poklesem sekrece růstového hormonu.

Růstový hormon je tedy fyziologický anabolický prostředek absolutně nezbytný pro růst dětí do výšky, který navíc řídí metabolismus proteinů u dospělých.

Sekrece růstového hormonu (growth hormone, GH) je regulována dvěma peptidy hypothalamu: hormonem uvolňujícím růstový hormon (GH-releasing hormone, GHRH), který působí stimulačně na uvolňování růstového hormonu, a somatostatinem, který má inhibiční vliv. V posledních letech zjistilo několik autorů, že sekrece růstového hormonu může být také stimulována syntetickými oligopeptidy označovanými jako peptidy uvolňující růstový hormon (GH-releasing peptides, GHRP) jako je hexarelin a různé analogy hexarelinu (Ghigo a další, European Journal of Endocrinology, 136, 445 - 460, 1997). Tyto sloučeniny působí mechanismem, který je odlišný od mechanismu působení GHRH (C. Y. Bowers, „Xenobiotic Growth Hormone Secretagogues“, ed. B. Bercu a R. F. Walker, str. 9 - 28, Springer-Verlag, New York 1996) a interakcí se specifickými receptory lokalizovanými v hypothalamu a hypoíýze ((a) G. Muccioli a další, Journal of Endrocrinology, 157, 99 - 106, 1998; (b) G. Muccioli, „Tissue Distribution of GHRP Receptors in Humans“, Abstracts IV European Congress of Endocrinology, Sevilla, Španělsko, 1998). V poslední době se ukázalo, že receptory pro GHRP jsou přítomny nejen v hypothalamo-hypofyzámím systému, ale i v různých lidských tkáních, které obecně nesouvisejí s uvolňováním růstového hormonu (G. Muccioli a další, viz výše (a)).

GHRP ajejich antagonisté se popisují například v následujících publikacích: C. Y. Bowers, výše, R. Deghenghi, „Growth Hormone Releasing Peptides“, tamtéž, 1996, str. 85 - 102; R. Deghenghi a další, Smáli Peptides as Potent Releasers of Growth Hormone“, J. Ped. End. Metab., 8, str. 311 - 313, 1996; R. Deghenghi, „The Development of Impervious Peptides as Growth Hormone Secretagogues“, Acta Paediatr. dod., 423, str. 85 - 87, 1997; K. Veeraraganavan a další, „Growth

- 1 CZ 305279 B6

Hormone Releasing Peptides (GHRP) Binding to Porcine Anterior Pituitary and Hypothalamic Membranes“, Life Sci., 50, str. 1149 - 1155, 1992; A. A. Patchett et al., „Design and biological activities of L—163, 191 (MK-0677): A patent, orally active growth hormone secretagogue“, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 92, Pg. 7001-7005, 1995; R. Deghenghi et al., „Impervious peptides as growth hormone secretagogues“, Pept. Sci: Present Future Proč. Int. Pept. Symp. lst (1999), Editor: Y. Shimonishi; M. Chen et al., „Indolyl group containing compounds and the use thereof to promote the release of growth hormone(s)“, WO 95/14666 a T. C. Somers a další, „Low Molecular Weight Peptidomimetic Growth Hormone Secretagogues, WO 96/15148 (23. květen 1996).

Lidský růstový hormon se již přibližně deset let vyrábí metodami genetického inženýrství. Až donedávna se růstový hormon většinou používal v souvislosti s opožděným růstem dětí a nyní se studují využití růstového hormonu u dospělých. Farmakologické účinky růstového hormonu, peptidů uvolňujících růstový hormon a látek zvyšujících sekreci růstového hormonu je možno roztřídit do následujících tří hlavních kategorií.

(b) Růst dětí

Bylo ukázáno, že léčení rekombinantním lidským růstovým hormonem stimuluje růst u dětí s trpasličím vzrůstem hypofyzámího původu, různými typy ledvinové nedostatečnosti. Turnérovým syndromem a malou postavou. Rekombinantní lidský růstový hormon se současně komerčně dodává v Evropě a ve Spojených státech pro léčení opožděného růstu dětí způsobeného deficiencí růstového hormonu a pro léčení dětské ledvinové nedostatečnosti různých typů. Další možná využití se v současnosti klinicky testují.

(c) Dlouhodobé léčení dospělých a starších osob

Pokles sekrece růstového hormonu způsobuje změnu složení lidského těla v průběhu stárnutí. Předběžné studie léčení rekombinantním lidským růstovým hormonem v trvání jednoho roku v populaci starších pacientů uvádějí zvýšení svalové hmotnosti a tloušťky kůže, snížení hmotnosti tuku a mírné zvýšení hustoty kostí. Co se týče osteoporózy, poslední studie ukazují, že rekombinantní lidský růstový hormon nezvyšuje mineralizaci kostí, ale mohl by zabraňovat demineralizaci kostí u žen po menopauze. V současnosti se provádějí další studie, které by prokázaly tuto teorii.

(d) Krátkodobé léčení dospělých a starších pacientů

V předklinických a klinických studiích bylo ukázáno, že růstový hormon stimuluje anabolismus proteinů a léčení v případě popálenin, AIDS a rakoviny, hojení ran a kostí.

Růstový hormon, peptidy uvolňující růstový hormon a látky podporující sekreci růstového hormonu mohou také nalézt použití ve veterinárním a humánním lékařství. Růstový hormon, peptidy uvolňující růstový hormon a látky podporující sekreci růstového hormonu stimulují růst vepřů v období výkrmu tím, že podporují ukládání svalových tkání namísto tukových tkání, a zvyšují produkci mléka u krav, a to bez jakýchkoli nežádoucích vedlejších účinků, které by ohrožovaly zdraví zvířat, a bez jakýchkoli zbytkových množství v produkovaném mase nebo mléce. Ve Spojených státech se v současnosti komerčně používá hovězí somatotropin (BST).

Většina v současnosti probíhajících klinických studií byla prováděna s použitím rekombinantního růstového hormonu. Peptidy uvolňující růstový hormon a látky podporující jeho sekreci jsou považovány za produkty druhé generace, které mají v blízké budoucnosti ve většině případů nahradit použití růstového hormonu. Použití peptidů uvolňujících růstový hormon a látek podporujících sekreci růstového hormonu přináší tedy proti použití samotného růstového hormonu řadu výhod.

-2CZ 305279 B6

Proto je zapotřebí vyvinout další sloučeniny, které při podávání savci působí jako látky podporující sekreci růstového hormonu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká nových sloučenin, které působí stimulačně na sekreci růstového hormonu (jako sekretagogy), a jejich použití jako léčiva pro zvýšení růstového hormonu v plazmě u savce podáváním jedné nebo více sloučenin podle vynálezu. Vynález se také týká způsobu léčení nedostatečné sekrece růstového hormonu, podpory hojení ran, zotavení z chirurgického zákroku nebo zneschopňující nemoci podáváním jedné z těchto sloučenin v terapeuticky účinném množství savci.

Podrobný popis výhodných provedení

V popisu se používají následující zkratky: D je dextro enantiomer, GH je růstový hormon, Boc je terc-butyloxykarbonyl, Z je benzyloxykarbonyl, N-Me je N-methyl, Píp je 4-aminopiperidin-4karboxylát, Inip je isonipekotyl, tj. piperidin-4-karboxylát, Aib je α-aminoisobutyryl, Nal je βnaftylalanin, Mrp je 2-methyl-Trp, a Ala, Lys, Phe, Trp, His, Thr, Cys, Tyr, Leu, Gly, Ser, Pro, Glu, Arg, Val a Gin jsou aminokyseliny alanin, lysin, fenylalanin, tryptofan, histidin, threonin, cystein, tyrosin, leucin, glycin, serin, prolin, kyselina glutamová, arginin, valin a glutamin. Navíc gTrp je skupina vzorce a gMrp skupina vzorce

kde * znamená atom uhlíku, který pokud jde o chirální atom uhlíku, má konfiguraci R nebo S.

Předmětem vynálezu jsou deriváty tryptofanu obecného vzorce I

(I),

-3 CZ 305279 B6 kde * je atom uhlíku, který v případě chirálního atomu uhlíku má konfiguraci R nebo S, jedna ze skupin R¹ znamená atom vodíku a R³ je skupina vzorce 11

OD.

R² je skupina vzorce IV:

R¹¹ O

RiaÁvjJk h₃c ch₃ (jy)

R⁴ znamená atom vodíku nebo přímou nebo rozvětvenou skupinu Ci-C4-alkyl, R⁵ znamená atom vodíku, přímou nebo rozvětvenou skupinu C|-C4-alkyl, skupinu (CH₂)_n-aryl, kde aryl je fenyl nebo naftyl, (CH₂)_n-heterocyklickou skupinu, kde heterocyklická skupina je isonipekotyl, 4—piperidinyl nebo 3-pyrrolyl, (CH₂)_n-cykloalkylovou skupinu, kde cykloalkylová skupina je cyklohexyl, nebo aminovou skupinu, R⁶ a R⁷ jsou nezávisle atom vodíku nebo přímá nebo rozvětvená Ci-C4-alkylová skupina, R¹¹ a R¹² jsou nezávisle atom vodíku nebo přímá nebo rozvětvená C]-C4-alkylová skupina, m je 0 a n je 1 nebo 2.

Výhodné provedení vynálezu jsou sloučeniny, kde R² je atom vodíku, R³ je skupina vzorce II a m je 0. Zvláště výhodné jsou sloučeniny, kde přímý nebo rozvětvený C|-C₄-alkyl je methyl, přímý nebo rozvětvený Ci-Cé-alkyl je methyl, ethyl nebo i—butyl, aryl je fenyl nebo naftyl, cykloalkyl je cyklohexyl a heterocyklická skupina je skupina 4-piperidinyl nebo 3-pyrrolyl.

Zvláště výhodné sloučeniny podle vynálezu zahrnují následující látky:

N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃:

-4CZ 305279 B6

N-Me-Aib-D-Trp-N-Me-D-gTrp-C(O)CH₃:

Podle předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné pro zvýšení hladiny růstového hormonu v plazmě u savce. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou dále použitelné pro léčení deficience sekrece růstového hormonu, zpomalení růstu u dětí a metabolických poruch souvisejících s deficiencí sekrece růstového hormonu, zvláště u starších osob.

V případě potřeby mohou být také použity farmaceuticky přijatelné soli těchto sloučenin. Mezi tyto soli patří organické nebo anorganické adiční soli, jako je hydrochlorid, hydrobromid, fosfát, sulfát, acetát, sukcinát, askorbát, tartrát, glukonát, benzoát, malát, fumarát, stearát nebo pamoát.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou použitelné pro zvyšování hladiny růstového hormonu v plazmě u savce, stejně jako pro léčení deficience sekrece růstového hormonu, zpomalení růstu dětí a metabolických poruch souvisejících s deficiencí sekrece růstového hormonu, zvláště u starších osob. Tyto farmaceutické prostředky mohou obsahovat sloučeninu podle předkládaného vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl nebo kombinace sloučenin podle předkládaného vynálezu, nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, popřípadě ve směsi s nosičem, pomocnou látkou, vehikulem, ředivem, matricí nebo povlakem způsobujícím prodloužené uvolňování. Příklady těchto nosičů, pomocných látek, vehikul řediv je možno nalézt v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou obsahovat další látky zvyšující sekreci růstového hormonu. Příklady vhodných dalších látek podporujících sekreci růstového hormonu jsou látky Ghrelin (srovnej M. Kojima a další, Nátuře, 402 (1999), 656 - 660), GHRP1, GHRP-2 a GHRP-6.

Ghrelin: Gly-Ser-Ser(O-n-oktanoyl)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-GlnArg-Val-GIn-GIn-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-AlaLys-Leu-GIn-Pro-Arg

GHRP-1: Ala-His-D-p-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂

GHRP-2: D-Ala-D-p-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂

GHRP-6: His-D-T rp-Ala-T rp-D-Phe-Lys-NH2

-5CZ 305279 B6

Kterákoli ze sloučenin podle překládaného vynálezu může být formulována odborníkem v oboru za poskytnutí farmaceutických prostředků, které jsou vhodné pro parenterální, bukální, rektální, vaginální, transdermální, pulmonární nebo orální způsoby podávání.

Typ formulace nebo farmaceutického prostředku s obsahem sloučeniny může být zvolen na základě požadovaného způsobu podávání. Jestliže mají být sloučeniny podány rychle, je výhodná nosní nebo intravenózní cesta.

Farmaceutické prostředky mohou být podávány savcům včetně člověka v terapeuticky účinné dávce, kterou může odborník v oboru snadno určit, a která se bude lišit podle druhu, věku, pohlaví a hmotnosti léčeného pacienta nebo subjektu stejně jako podle způsobu podávání. Přesnou úroveň je možno snadno zjistit empiricky.

Příklady uskutečnění vynálezu

Následující příklady ilustrují účinnost většiny výhodných sloučenin používaných při léčení podle předkládaného vynálezu, přičemž IBCF je isobutylchloroformát, NMM je N-methylmorfolin; DME je dimethylether, BOP je (benzotriazol_l-yloxy)tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorofosfát, DMF je dimethylformamid, DMAP je 4-dimethylaminopyridin, BTIB je (bis(trifluoracetoxy)jod)benzen, DIEA je Ν,Ν-diisopropylethylamin, TFA je kyselina trifluoroctová a DMSO je dimethylsulfoxid.

Příklad 1

H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO

Úplná syntéza (procenta představují výtěžky získané při následující syntéze):

% %

Z-D-Trp-OH | 1) IBCF, NMM, DME, 0 °C 4 2) NH₄OH

Z-D-Trp-NH₂ | 1) H₂, Pd/C, DMF, H₂O, HCI 4 2) BOP, NMM, DMF, Boc-D-Trp-OH

Boc-D-T rp-D-T rp-NH₂ | t-Boc₂O, DMAP kat. bezvodý CH₃CN

Boc-D- (N'Boc)Trp-D- (N'Boc)Trp-NH₂| 1) BTIB, pyridin, DMF/H₂O 4 2) 4,5-trichlorfenylformát, DIEA, DMF

Boc-D- (N'Boc)Trp-D-(N'Boc)Trp-CHO | 1) TFA/anisol/thioanisol (8/1/1), 0 °C 4 2) BOP, NMM, DMF, Boc-Aib-OH

Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO

-6CZ 305279 B6

I 1) TFA/anisol/thioanísol (8/1/1), 0 °C 52 % 4 2) čištěni preparativní HPLC

H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO

Z-D-Trp-NIT

Z-D-Trp-OH (8,9 g; 26 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v DME (25 ml) a umístěn v ledové lázni při teplotě 0 °C. Postupně byly přidány NMM (3,5 ml; 1,2 ekv.), IBCF (4,1 ml; 1,2 ekv.) a 28% roztok amoniaku (8,9 ml; 5 ekv.). Směs byla zředěna vodou (100 ml) a produkt Z-D-Trp-NH₂ se vysrážel. Byl zfiltrován ve vakuu za získání 8,58 g bílé pevné látky.

Výtěžek = 98 %.

C₁₉H_I9N₃O₃, 337 g-mol'.

Rf = 0,46 {chloroform/methanol/kyselina octová (180/10/5)}.

'H NMR (250 MHz, DMSO-d⁶): δ 2,9 (dd, 1 Η, H_p, J_pp· = 14,5 Hz; J_pct = 9,8 Hz); 3,1 (dd, 1H, H_psJ_p-_p = 14,5 Hz; Ι_ρ·_α = 4,3 Hz); 4,2 (sextet, 1H, H_a); 4,95 (s, 2H, CH₂ (Z)); 6,9 až 7,4 (m, 11H); 7,5 (s, 1H, H²); 7,65 (d, 1H, J = 7,7 Hz); 10,8 (s, 1H, N‘H).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 338 [M+H]⁺, 360 [M+Na]⁺, 675 [2M+H]⁺, 697 [2M+Na]⁺.

Boc-D-Trp-D-Trp-NH₂

Z-D-Trp-NH₂ (3g; 8,9 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v DMF (100 ml). K míchané směsi byly přidány 36% HC1 (845 μΐ; 1,1 ekv.), voda (2 ml) a paladium na aktivním uhlí (95 mg, 0,1 ekv.). Tento roztok byl probubláván vodíkem 24 hod. Když byla reakce ukončena, paladium bylo zfiltrováno přes celit. Rozpouštědlo bylo odstraněno za získání HC1, H-D-Trp-NH₂ jako bezbarvého oleje.

Do 10 ml DMF byly postupně přidány HC1, H-D-Trp-NH₂ (8,9 mmol; 1 ekv.), Boc-D-Trp-OH (2,98 g; 9,8 mmol; 1,1 ekv.), NMM (2,26 ml; 2,1 ekv.) a BOP (4,33 g; 1,1 ekv.). Po 1 hod. byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným roztokem hydrogensíranu draselného (200 ml, 1M) a nasyceným vodným chloridem sodným (100 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, za získání 4,35 g Boc-D-Trp-D-Trp-NH₂ jako bílé pevné látky.

Výtěžek = 85 %.

C₂₇H₃₁N₅O₄, 489 g-mol¹.

Rf = 0,48 {chloroform/methanol/kyselina octová (85/10/5)}.

’H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,28 (s, 9H, Boc); 2,75 až 3,36 (m, 4H, 2(CH₂)_P; 4,14 (m, 1H, CH_a); 4,52 (m, 1H, CH_a); 6,83 až 7,84 (m, 14H, 2 indoly (10H), NH₂, NH (urethan) a NH (amid)); 10,82 (d, 1H, J = 2Hz, N'H); 10,85 (d, 1H, J = 2Hz, N'H).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 490 [M+H]⁺, 512 [M+Na]⁺, 979 [2M+H]⁺.

-7CZ 305279 B6

Boc-D-CNBocjTrp-D-CNBocjTrp-NHj

Boc-D-Trp-D-Trp-NH₂ (3 g; 6,13 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v acetonitrilu (25 ml). Do tohoto roztoku byly postupně přidány di-terc-butyldikarbonát (3,4 g; 2,5 ekv.) a 4-dimethylaminopyridin (150 mg; 0,2 ekv.). Po 1 hod. byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným hydrogensíranem draselným (200 ml, 1M) a nasyceným vodným chloridem sodným (200 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/hexan {5/5} za získání 2,53 g Boc-D-(N¹Boc)Trp-D-(N¹Boc)Trp-NI l2 jako bílé pevné látky.

Výtěžek = 60 %.

C₃7H₄₇N₅O₈, 689 g.mof¹.

Rf = 0,23 {ethylacetát/hexan (5/5)).

’H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,25 (s, 9H, Boc); 1,58 (s, 9H, Boc); 1,61 (s, 9H, Bpc); 2,75 až 3,4 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,2 (m, 1H, CH_a); 4,6 (m, 1H, CH_a); 7,06 až 8 (m, 14H, 2 indoly (10H), NH (urethan), NH a NH₂ (amidy)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 690 [M+H]⁺, 712 [M+Na]⁺, 1379 [2M+H]⁺, 1401 [2M+Na]⁺.

Boc-D-(NⁱBoc)Trp-D-g(NⁱBoc)Trp-H

Boc-D-(N^lB^oc)Trp-D-(N^lBoc)Trp-NH₂ (3 g; 4,3 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn ve směsi DMF/voda (18 ml/7 ml). Potom byly přidány pyridin (772 μΐ; 2,2 ekv.) a bis-(trifluoracetoxy)jodbenzen (2,1 g; 1,1 ekv.). Po 1 hod. byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným hydrogensíranem draselným (200 ml, 1M) a vodným chloridem sodným (200 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Boc-D-(N‘Boc)Trp-D(N'Boc)Trp-H byl použit ihned pro další formylační reakci.

Rf = 0,14 {ethylacetát/hexan (7/3)}.

C36H47N5O7, 661 g.mof'.

'H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,29 (s, 9H, Boc); 1,61 (s, 18H, 2 Boc); 2,13 (s, 2H, NH₂(amin)); 3,1 až 2,8 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,2 (m, 1H, CH_a); 4,85 (m, 1H, CH„); 6,9 až 8 (m, 12H, 2 indoly (10H), NH (urethan), NH (amid)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 662 [M+H]⁺, 684 [M+Na]⁺.

Boc-D-ÍNBocjTrp-D-gOÁBocjTrp-CHO

Boc-D-fNBocjTrp-D-gfNBocjTrp-H (4,3 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v DMF (20 ml). Potom byly přidány N,N-diisopropylethylamin (815 μΐ; 1,1 ekv.) a 2,4,5-trichlorfenylformát (1,08 g;

1,1 ekv.). Po 30 min byla směs zředěna ethylacetátem (100 mol) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným hydrogensíranem draselným (200 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (200 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfdtrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chro-8CZ 305279 B6 matografií na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/hexan {5/5} za získání 2,07 g Boc-D(N'Boc)Trp-D-g(N'Boc)Trp-CHO jako bílé pevné látky.

Výtěžek = 70 %.

C37H47N5O8, 689 g.mol .

Rf=0,27 {ethylacetát/hexan (5/5)}.

’H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,28 (s, 9H, Boc); 1,6 (s, 9H, Boc); 1,61 (s, 9H, Boc); 2,75 až

3,1 (m, 4H, 2(CH2)p); 4,25 (m, IH, CHa_A&B); 5,39 (m, 0,4H, (CH)a'_B); 5,72 (m, 0,6H, (CH)a'_A); 6,95 až 8,55 (m, 14H, 2 indoly (10H), NH (urethan), 2 NH (amidy), CHO (formyl)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 690 [M+H]⁺, 712 [M+Na]⁺, 1379 [2M+H]⁺. Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO

Boc-D-(N¹Boc)Trp-D-g(N'Boc)Trp-CHO (1,98 g; 2,9 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (16 ml), anisolu (2 ml) a thioanisolu (2 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědlo byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl H-D-Trp-D-gTrpCHO byla odfdtrována.

TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-CHO (2,9 mmol; 1 ekv.), Boc-Aib-OH (700 mg; 1 ekv.), NMM (2,4 ml; 4,2 ekv.) a BOP (1,53 g; 1,2 ekv.) byly postupně přidány do 10 ml DMF. Po 1 hod. byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným hydrogensíranem draselným (200 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (200 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí ethylacetátem za získání 1,16 g Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO jako bílé pevné látky.

Výtěžek = 70 %.

C₃₁H₃₈N₆O₅, 574 g.mol¹.

Rf = 0,26 {chloroform/methanol/kyselina octová (180/10/5)}.

*H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,21 (s, 6H, 2CH₃(Aib)); 1,31 (s, 9H, Boc); 2,98 až 3,12 (m, 4H, 2(CH₂)_p); 4,47 (m, IH, (CH)a_A&B); 5,2 (m, 0,4H, (CH)a'_B); 5,7 (m, 0,6H, (CH)a'_A); 6,95 až 8,37 (m, 15H, 2 indoly (10H), 3 NH (amidy), 1 NH (urethan), CHO (formyl)); 10,89 (m, 2H, 2 ΝΉ (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 575 [M+H]⁺, 597 [M+Na]⁺, 1149 [2M+H]⁺, 1171 [2M+Na]⁺.

H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO

Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO (1 g; 1,7 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO byla odfiltrována.

Produkt, TFA sůl H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO, byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, Cl8, 40x 100 mm, 5 pm, 100 A).

Výtěžek = 52 %.

-9CZ 305279 B6

C₂₆H₃oN₆0₃, 474 g.mol¹.

'H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶) + 'H/'H korelace: δ 1,21 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,43 (s, 3H, CH₃(Alb)); 2,97 (m, 2H, (CH₂)_P); 3,1 (m, 2H, (CH₂>); 4,62 (m, 1H, (CH)a_A&B); 5,32 (q, 0,4H, (CH)oť_B); 5,71 (q, 0,6H, (CH)oť_A); 7,3 (m, 4H, H₅ a H₆ (2 indoly)); 7,06 až 7,2 (4d, 2H, H_2Aa H_2B (2 indoly)); 7,3 (m, 2H, H₄ nebo H₇ (2 indoly)); 7,6 až 7,8 (4d, 2H, H_4A a H_4B nebo H_7Aa H_7B); 7,97 (s, 3H, NH₂ (Aib) a CHO (formyl)); 8,2 (d, 0,4H, NH]_B (diamino)); 8,3 (m, 1H, NH_a&b); 8,5 (d, 0,6H, NH,_A (diamino)); 8,69 (d, 0,6H, NH_2A (diamino)); 8,96 (d, 0,4H, NH_2B(diamino)); 10,8 (s, 0,6H, N'H_1a (indol)); 10,82 (s, 0,4H, Ν’Ηΐβ (indol)); 10,86 (s, 0,6H, Ν'Η^ (indol)); 10,91 (s, 0,4H, Ν'^β (indol)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 475 [M+H]⁺, 949 [2M+H]⁺.

Analogická syntéza byla provedena pro následující sloučeniny:

Příklad 2

H-Aib-D-Mrp-D-gMrp-CHO

C₂₈H₃₄N₆O₃, 502 g.mol¹.

‘H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶) + 'H/'H korelace: δ 1,19 (s, 2H, (CH₃)_1A (Aib)); 1,23 (s, 1H, (CH₃)_1B (Aib)); 1,41 (s, 2H, (CH₃)_2A (Aib)); 1,44 (s, 2H, (CH₃)_2B (Aib)); 2,33 až 2,35 (4s, 6H, 2CH₃ (indoly)); 2,93 (m, 2H, (CH₂)_P); 3,02 (m, 2H, (CH₂)_p.); 4,65 (m, 0,6H, (CH)a_A); 4,71 (m, 0,4H, (CH)a_B); 5,2 (m, 0,4H, (CH)a'_B); 5,6 (m, 0,6H, (CH)a'_A); 6,95 (m, 4H, H₅ a H₆(2 indoly)); 7,19 (m, 2H, H₄ nebo H₇ (2 indoly)); 7,6 (m, 2H, H₄ nebo H₇ (2 indoly)); 7,9 (s, 1H, CHO (formyl)); 7,95 (s, 2H, NH₂ (Aib)); 8,05 (d, 0,4H, NH_1B (diamino)); 8,3 (m, 1H, NH_A&B); 8,35 (m, 0,6H, NH_iA (diamino)); 8,4 (d, 0,6H, NH_2A (diamino)); 8,75 (d, 0,4H, NH_2B (diamino)); 10,69 (s, 0,6H, N*H|_A (indol)); 10,71 (s, 0,4H, N’Hi_B (indol)); 10,80 (s, 0,6H, N’H_2a (indol)); 10,92 (s, 0,4H, N'H_2B (indol)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 503,1 [M+H]⁺.

V dalším textu budou používané zkratky, kde DCU je Ν,Ν-dicyklohexylmočovina, FMOC je 9fluorenylmethoxykarbonyl, ACN je acetonitril, Dht je dihydrotestosteron, Acc je 1-aminokylopropan-l-karboxylová kyselina a Dpg je dipropylenglykol.

Příklad 3

N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-C HO

Boc-N-Me-Aib-OH (327 mg; 1,5 mmol; 2,6 ekv.) byl rozpuštěn v methylenchloridu (10 ml) a ochlazen na 0 °C. Potom byl přidán dicyklohexylkarbodiimid (156 mg; 0,75 mmol; 1,3 ekv.). Směs, po zfiltrování DCU, byla přidána k roztoku obsahujícímu TFA, H-D-Trp-D-gTrp-CHO (0,58 mmol; 1 ekv.) a triethylamin (267 μΐ; 3,3 ekv.) v methylenchloridu (5 ml). Reakční směs byla pomalu zahřáta na teplotu laboratoře a reakce byla ukončena po 24 hod. Směs byla zředěna ethylacetátem (25 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (50 ml), vodným hydrogensíranem draselným (50 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/methanol {9/1} za získání 180 mg (53 %) Boc-N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO jako bílé pěny.

- 10CZ 305279 B6

Boc-N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO (180 mg; 0,3 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl smíchán s etherem a vysrážená TFA sůl N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrpCHO byla zfiltrována.

Produkt, TFA sůl N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO (39 mg; 15 %) byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, Cl8, 40x 100 mm, 5 pm, 100 A).

C27H32N6O3, 488 g.mol '.

'H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶) δ 1,19 (s, 3 H, CH₃ (Aib)); 1,42 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 2,26 (s, 3H, NCH₃); 3,12 (m, 4H, 2(CH₂»; 4,66 (m, 1H, (CH)_a); 5,32 a 5,7 (m, 1H, (CH)_ď); 6,9 až 7,8 (m, 10H, 2 indoly); 8 (m, 1H, CHO (formyl)); 8,2 až 9 (m, 4H, 3 NH (amidy) a NH (amin)); 10,87 (m, 2H, 2 N*H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 489,29 [M+H]⁺.

Příklad 4

H-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃

Boc-D-^BocjTrp-D-g/NBocjTrp-H (0,72 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v DMF (20 ml). Potom byly přidány N,N-diisopropylethylamin (259 ml; 2,1 ekv.) a acetanhydrid (749 ml;

1,1 ekv.). Po 1 hod. byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (100 ml), vodným hydrogensíranem draselným (100 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/hexan za získání 370 mg (73 %) Boc-D-fNBocjTrp-Dg(N'Boc)Trp-C(O)CH₃ jako bílé pevné látky.

Boc-D-(N^,Boc)Trp-D-g(N^lBoc)Trp-C(O)CH₃ (350 mg; 0,5 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl H-DTrp-D-gTrp-C(O)CH₃ byla zfiltrována.

Do 10 ml DMF byly postupně přidány TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (0,5 mmol; 1 ekv.), Boc-Aib-OH (121 mg; 0,59 mmol; 1,2 ekv.), NMM (230 μΐ; 4,2 ekv.) a BOP (265 mg; 1,2 ekv.). Po 1 hod. byla směs zředěna ethylacetátem (25 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (50 ml), vodným hydrogensíranem draselným (50 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí ethylacetátem za získání 249 mg (85 %) Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃jako bílé pěny.

Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (249 mg; 0,42 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážené TFA sůl H-Aib-D-Trp-D-gTrpC(O)CH₃ byla zfiltrována.

Produkt, TFA sůl H-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (80 mg; 23 %), byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, Cl8, 40x 100 mm, 5 mm, 100 A).

C₂7H₃₂N₆O₃, 488 g.moF¹.

- 11 CZ 305279 B6 'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,22 (s, 3H, CH, (Aib)); 1,44 (s, 3H, CH, (Aib)); 1,8 (s, 3H, C(O)CH,); 3,06 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,6 (m, 1H, (CH)«); 5,6 (m, 1H, (CH)_ď); 6,9 až 7,8 (m, 10H, 2 indoly); 7,99 (s, 2H, NH₂ (Aib)); 8,2 až 8,6 (m, 3H, 3 NH (amidy)); 10,83 (s, 2H, 2 N'H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 489,32 [M+Hfy.

Příklad 5

N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH,

Boc-N-Me-Aib-OH (1,09 g; 5,04 mmol; 4 ekv.) byl rozpuštěn methylenchloridu (10 ml) a ochlazen na 0 °C. Potom byl přidán dicyklohexylkarbodiimid (520 mg; 2,52 mmol; 2 ekv.). Směs, po zfiltrování DCU, byla přidána k roztoku obsahujícímu TFA sůl H-D-Trp-D-gTrpC(O)CH₃ (940 mg; 1,26 mmol; 1 ekv.) a triethylamin (580 ml; 3,3 ekv.) v methylenchloridu (5 ml). Reakční směs byla pomalu ohřátá na teplotu laboratoře a reakce byla ukončena po 24 hod. Směs byla zředěna ethylacetátem (50 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem draselným (100 ml), vodným hydrogensíranem draselným (100 ml, 1M) a nasyceným vodným chloridem sodným (100 ml). Organická vrstva byla sušena síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/methanol {9/1} za získání 530 mg (70 %) Boc-N-Me-Aib-D-Trp-DgTrp-C(O)CH₃ jako bílé pěny.

Boc-N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (530 mg; 0,88 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu a zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl N-Me-Aib-D-Trp-DgTrp-C(O)CH₃ byla zfiltrována.

Produkt, TFA sůl N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (220 mg; 30 %), byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, Cl 8, 40x 100 mm, 5 mm, 100 A).

C₂₆H₃₄N₆O₃, 502 g.mol¹.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,17 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,4 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,78 (s, 3H, C(O)CH₃); 2,23 (s, 3H, NCH₃); 3,15 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,7 (m, 1H, (CH)_a); 5,55 (m, 1H, (CH)_ď); 6,9 až 7,9 (m, 10H, 2 indoly); 8,2 až 8,8 (s, 4H, NH (amin) a 3 NH (amidy)); 10,8 (s, 2H, 2 N'H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 503,19 [M+H]⁺.

Příklady 10 až 62

Podobným způsobem byly připraveny následující sloučeniny:

Příklad 10	H-Aib-D-Mrp-gMrp-CHO
Příklad 11	H-Aib-Trp-gTrp-CHO
Příklad 12	H-Aib-Trp-D-gTrp-CHO

- 12CZ 305279 B6

Příklad 13	H-Aib-(D)-Trp-gTrp-CHO
Příklad 19	Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-CH₃
Příklad 20	Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-CH(CH₃)-CH₃
Příklad 21	Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-fenyl
Příklad 23	Aib-D-T rp-gTrp-CO-CH₂-pyrol-3-yl
Příklad 24	Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-CH₂-cyklohexy 1
Příklad 25	N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-CH₃
Příklad 26	N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-CH(CH₃)-CH₃
Příklad 27	N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-fenyl
Příklad 28	N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-pyrrol-3-yl
Příklad 29	N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-CH₂-cyklohexyl
Příklad 30	Aib-D-Trp-gTrp-CHO
Příklad 40	N-Me-Aib-D-Trp-N-Me-D-gTrp-C(O)CH₃
Příklad 41	H-Aib-D-Trp-N-Me-D-gTrp-C(O)CH₃
Příklad 52

N(Me)₂-Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-formy 1

C₂₈H₃₆N₆O₃, 502 g.mof¹.

‘HNMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,2 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,39 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 2,29 (m, 3H, NCH₃); 2,99 až 3,33 (m, 4H, 2 (CH₂)_p); 4,68 (m, 1H, CH)„); 5,3 a 5,69 (m, 1H, CHfy); 6,97 až 7,72 (m, 10H, 2 indoly); 7,97 (2s,lH, formyl); 8,2 - 9,47 (m, 3H, 3 NH (amidy)); 10,85 (m, 2H, 2 NH (indoly)).

- 13 CZ 305279 B6

Hmotnostní spektrometrie (elektrospray), m/z 503,45 [M+H]⁺.

Analytická HPLC (Symmetry shield 3,5μ Cl8 100A, 1 ml/min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 15 min), tr = 6,63 min, 99 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 53

N(Me)₂-Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-acety 1

C₂₉H₃₆N₆O₃, 516 g.mol¹.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,22 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,4 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,8 (s, 3H, acetyl); 2,28 (d, 3H, NCH₃); 2,96 až 3,22 (m, 4H, 2 (CH₂)_P); 4,7 (m, 1H, (CH)„); 5,60 (m, 1H, (CH)„·); 6,99 až 7,75 (m, 10H, 2 indoly); 8,2 až 9,47 (m, 3H, 3 NH (amidy)); 10,84 (m, 2H, 2 NH (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 517,34 [M+H]⁺.

Analytická HPLC (Symmetry shield 3,5μ 08 100A, 1 ml/min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 15 min), tr = 7,07 mm, 99 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 60 H-Aib-(R)-Me-Trp-(D)-gTrp-formyl

Příklad 61 H-Aib-(D)-Trp-(R)-Me-gTrp-formyl

Příklad 62 H-Me-Aib-(D)-Trp-(R)-Me-gTrp-acetyl

Příklad 63 Vyhodnocení aktivity nových látek zvyšujících sekreci růstového hormonu při uvolňování růstového hormonu na krysích mláďatech

Pokusná zvířata

Byli používáni samci krys Sprague Dawley stáří deseti dnů o hmotnosti přibližně 25 g. Mláďata byla získána pátý den po narození a byla umístěna za řízených podmínek (22 ± 2 °C, 65 % vlhkost a umělé světlo od 06,00 do 20,00 hod.). Podle libosti byla matkám k dispozici suchá dieta a voda.

Postup experimentu

Jeden den před experimentem byla mláďata odebrána matkám a náhodně rozdělena do skupin vždy po osmi.

Mláďatům bylo subkutánně podáno 100μ1 rozpouštědla (DMSO, konečné ředění 1 : 300 ve fyziologickém roztoku), hexarelinu (Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Fe-Lys-NH₂, použitý jako referenční léčivo) nebo nové sloučeniny (300 pg/kg) a o 15 min později byla zvířata usmrcena dekapitací. Ihned byla odebrána a zcentrifugována krev. Vzorky plazmy byly uchovávány při -20 °C až do testu na zjištění koncentrací růstového hormonu v plazmě.

- 14CZ 305279 B6

Koncentrace růstového hormonu v plazmě byly měřeny metodou RIA s použitím materiálů poskytnutých National Institute of Diabetes, Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) úřadu National Institute of Health, USA.

Hodnoty byly vyjádřeny na základě standardu NIDDK-rat-GH-RP-2 (účinnost 21 U/mg) jako ng/ml plazmy.

Minimální detekovatelná hodnota růstového hormonu krysy byla přibližně 1,0 ng/ml a variabilita mezi jednotlivými testy byla přibližně 6 %.

Získané výsledky několika řad testů, při kterých byla zjišťována aktivita u krys in vivo, jsou uvedeny v tabulkách 1 až 10.

Tabulka 1

Příklad	Struktura	GH ng/ml
1	H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO	158,8 ± 39,4
13	H-Aib-D-Trp-gTrp-CHO	58 ± 6,3
Rozpouštědlo		15,0 ± 8,0
Hexarelin	Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Fe-Lys-NH₂	202 ± 32,7

Tabulka 2

Příklad	Struktura	GH ng/ml
3	N-Me-Aib-D-T rp-D-gT rp-CHO	86,6 ± 12,6
4	H-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃	104,7 ± 13,5
5	N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃	175,5 ± 37,2
Rozpouštědlo		20,7 + 0,9
Hexarelin	Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Fe-Lys-NH2	134,5 ± 27,2

- 15CZ 305279 B6

Tabulka 3

Příklad	Struktura	GH ng/ml
6	Pip-D-T rp-D-gT rp-CHO	109,7 ± 10,1
7	Pip-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃	53,1 ± 6,6
8	Isonipekotyl-D-T rp-D-gT rp-CHO	94,2 ± 8,6
9	lsonipekotyl-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃	61,2 ± 10,8
19	Aib-D-T rp-gT rp-CO-CH₂-Ch₃	79,8 ± 22,4
22	Aib-D-T rp-gT rp-CO-piperidin-4-yl	153,6 + 30,6
Rozpouštědlo		22,3 ± 5
Hexarelin	Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Fe-Lys-NH₂	114,7 ± 8,4

Tabulka 4

Příklad	Struktura	GH ng/ml
39	N-Me-Aib-D-T rp-D-gT rp-isonipekotyl	97,1 ± 21,0
40	N-Me-Aib-D-Trp-N-Me-D-gTrp-C(O)CH₃	188,2 ± 28,5
41	H-Aib-D-Trp-N-Me-D-gTrp-C(O)CH₃	75,4 ± 15,0
Rozpouštědlo		10,55 ± 2,65
Hexarelin	Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Fe-Lys-NH₂	114,5 ± 12,9

Tabulka 7

Příklad	Struktura	GH ng/ml
52	N(Me)₂-Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-formyl	121,43 ± 29
53	N(Me)₂-Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-acetyl	26,80 ± 5,64
Rozpouštědlo		7,89 + 1,77
Hexarelin		172,5 ± 38,53

- 16CZ 305279 B6

Tabulka 8

Příklad	Struktura	GH ng/ml
60	H-Aib-(R)-Me-Trp-(D)-gTrp-formyl	21,02 ± 3,43
61	H-Aib-(D)-Trp-(R)-Me-gTrp-formyl	52,28 ± 43,76
62	H-Me-Aib-(D)-T rp-(R)-Me-gT rp-acetyl	171,78 ± 10,32
Rozpouštědlo		7,89 + 1,77
Hexarelin		172,5 ± 38,53

Dále byla zjišťována časová závislost koncentrace růstového hormonu po orálním podání psovi (1 mg/kg; per os) pro sloučeninu z příkladu 1 (H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO). Byli použiti dobře vytrénovaní psi bígl obou pohlaví, >10 let, 10 až 15 kg hmotnosti. Zvířata byla krmena normální suchou stravou a vodou podle libosti a byla udržována v režimu 12 hod. světla/12 hod. tmy s polo čátkem v 7,00. Sloučenina byla podávána orálně psům, kteří hladověli od 16,00 předcházejícího dne. 20 min před podáním, v okamžiku podání a 15, 30, 60, 90, 120 a 180 min po podání byly odebírány vzorky krve. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11.

Tabulka 11

Příkl.	Jméno psa
1	DAKOTA	JORMA	RAZ DEGAN	FORREST LEE	MARKUS	TAYLOR	MEAN VALUE	SEM
t (min)	Koncentrace GH (ng/ml)
-20	0,48	3,58	2,14	1,43	2,45	2,32	2,07	0,38
0	0,35	2,75	1,64	2,01	2,55	1,41	1,79	1,03
15	2,11	8,91	3,58	6,38	6,11	4,8	5,32	1,02
30	0,54	6,85	6,37	8,48	6,9	3,89	5,5	1,07
60	0,17	2,65	3,02	4,31	6,51	4,34	3,52	0,84
90	0,4	2,47	2,61	6,42	5,18	4,43	3,59	0,66
120	3,58	2,48	1,94	3,71	4,54	4,28	3,42	0,38
180	3,46	2,82	1,49	3,18	4,12	3,18	3,04	0,36

AUC	328,53	658,38	510,64	888,91	944,26	721,34	675,35	94,47

SEM = standardní odchylka 20 AUC = oblast pod křivkou

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Deriváty tryptofanu obecného vzorce I

N

H .5 kde * je atom uhlíku, který v případě chirálního atomu uhlíku má konfiguraci R nebo S, jedna ze skupin R¹ znamená atom vodíku a R³ je skupina vzorce II

R² je skupina vzorce IV:

Η₃Ο^Ζ Έη₃ (IV)

R⁴ znamená atom vodíku nebo přímou nebo rozvětvenou skupinu C|-C₄-alkyl, R⁵ znamená atom vodíku, přímou nebo rozvětvenou skupinu C,-C₄-alkyl, skupinu (CH₂)_n-aryl, kde aryl je fenyl nebo nafltyl, (CH₂)_n-heterocyklickou skupinu, kde heterocyklická skupina je isonipekotyl, 4-piperidinyl nebo 3-pyrrolyl, (CH₂)_n-cykloalkylovou skupinu, kde cykloalkylová skupina je cyklohexyl, nebo aminovou skupinu, R⁶ a R⁷ jsou nezávisle atom vodíku nebo přímá nebo rozvětvená C]-C4-alkylová skupina, R¹¹ a R¹² jsou nezávisle atom vodíku nebo přímá nebo rozvětvená Ci-C4-alkylová skupina, m je 0 a n je 1 nebo 2.
2. Deriváty tryptofanu obecného vzorce I podle nároku 1, kde přímý nebo rozvětvený Cj-C₄alkyl je methyl.
3. Derivát tryptofanu obecného vzorce I podle nároku 1, kterým je

- 18CZ 305279 B6
4. Derivát tryptofanu obecného vzorce I podle nároku 1, kterým je
5. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje derivát tryptofanu obecného vzorce I podle nároku 1.
6. Prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že je v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
7. Prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že je v kombinaci s další látkou podporující sekreci růstového hormonu.
8. Použití derivátu tryptofanu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro zvýšení hladiny růstového hormonu v plazmě u savce.
9. Použití derivátu tryptofanu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení deficience sekrece růstového hormonu.
10. Použití derivátu tryptofanu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení zpomalení růstu dítěte.
11. Použití derivátu tryptofanu obecného vzorce 1 podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení metabolických poruch souvisejících s deficiencí sekrece růstového hormonu u subjektu.

- 19CZ 305279 B6
12. Použití podle nároku 11, kde subjektem je subjekt vyššího věku.
13. Použití derivátu tryptofanu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro podporu 5 hojení ran, zotavování z chirurgického zákroku nebo zotavování ze zneschopňujících onemocnění.