CN105330720A - 一种制备马昔瑞林的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备马昔瑞林的方法，更具体地，涉及一种固相合成马昔瑞林的方法。

Description

一种制备马昔瑞林的方法
技术领域
本发明涉及一种制备马昔瑞林的方法，更具体地，涉及一种固相合成马昔瑞林的方法。
背景技术
马昔瑞林(macimorelin)是一种新型合成小分子，是胃促生长素受体激动剂。马昔瑞林具有口服活性，可以刺激生长激素(GH)的分泌。马昔瑞林由阿斯利康公司研发，已向FDA递交了新药申请(IND)。III期试验数据证实该化合物可能成为第一个获批的口服产品，其通过诱发生长激素释放从而评价成人生长激素缺乏，准确度与现有的静脉和肌内检查方式相仿。FDA已授予该药在AGHD治疗领域的罕见药资格。
马昔瑞林的结构式：
US2009305300A1及US2002165343A1记载了用液相合成法制备马昔瑞林。该方法的缺点是，每一步反应完成后，需要的化合物和副产物都以混合物形式存在，需要被纯化后再进行下一步合成。因此操作较繁琐，收率较低。
因此，需要一种操作上简便且收率较高的制备马昔瑞林的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备马昔瑞林的方法，该方法通过固相合成法进行。所述方法可以简化液相合成法的操作步骤，提高反应收率。
因此，本发明提供一种制备马昔瑞林的方法，该方法包括以下步骤：
A采用固相多肽合成方法，将Sieber树脂脱除Fmoc，得到H2N-Sieber树脂，然后与Fmoc-D-Trp(Boc)-OH偶联，重复脱除Fmoc步骤和偶联步骤，依次偶联Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH，得到线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂；
B将步骤A中得到的线性肽树脂裂解，得到侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-NH2；
C将步骤B中得到的全保护肽的酰胺基还原成氨基，得到侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-H；
D将步骤C中得到的全保护肽的氨基进行酰化，得到侧链全保护马昔瑞林肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-CHO；
E脱除步骤D中得到的全保护马昔瑞林肽中氮上的Boc保护基，得到马昔瑞林H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO。
本发明的方法与现有技术的液相合成法相比，避免了大量的纯化步骤，提高了反应收率。
具体实施方式
本发明中的宽泛的、优选的、更优选的和最优选的定义和范围可以相互组合。
术语解释
本文中，术语“固相多肽合成方法”是指多肽合成领域已知的Fmoc固相合成方法，例如记载于FmocSolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach,W.C.Chan,PeterD.White著，March2,2000(ISBN-10:0199637245),英国OxfordUniversityPress。
本文中，“替代度”是指单位量的树脂负载的物质(例如苯甲酸或氨基酸等)的数量，单位为“mmol/g”。
本文中，本发明中“肽”是指类似地通过多肽合成中的固相合成方法得到的偶联产物。
本文中，“适量”表示所修饰的物质的用量对反应而言不是关键的，只要能达到所需目的即可，无需限于一个具体范围，而且还可以一次添加或分多次添加，本领域技术人员可以根据经验结合实际情况进行选择，例如通过检测反应终点来控制用量。
本文中，“适当时间”表示所修饰的时间对反应而言不是关键的，只要能达到所需目的即可，无需限于一个具体范围，本领域技术人员可以根据经验结合实际情况进行选择，例如通过检测反应终点来控制时间。
对本发明中所用缩写及其含义说明如下：
表1.文中缩写的含义
本发明提供一种制备马昔瑞林的方法，该方法包括以下步骤：
A采用固相多肽合成方法，将Sieber树脂脱除Fmoc，得到H2N-Sieber树脂，然后与Fmoc-D-Trp(Boc)-OH偶联，重复脱除Fmoc步骤和偶联步骤，依次偶联Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH，得到线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂；
B将步骤A中得到的线性肽树脂裂解，得到侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-NH2；
C将步骤B中得到的全保护肽的酰胺基还原成氨基，得到侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-H；
D将步骤C中得到的全保护肽的氨基进行酰化，得到侧链全保护马昔瑞林肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-CHO；
E脱除步骤D中得到的全保护马昔瑞林肽中氮上的Boc保护基，得到马昔瑞林H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO。
步骤A
在一个具体的实施方案中，在本发明步骤A中，固相合成方法包括将Sieber树脂脱除Fmoc，然后用溶剂洗涤，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；将适量的游离氨基酸和偶联剂溶解于溶剂中，然后一起加入到固相反应柱中进行偶联反应，直至用检测方法检测到反应终止为止；重复脱除Fmoc步骤和偶联步骤。
在一个具体的实施方案中，本发明步骤A中Sieber树脂的树脂替代度为0.3-1.0mmolg，优选0.6-0.8mmol/g。
在一个具体的实施方案中，本发明步骤A中脱除Fmoc的试剂可为本领域已知的可实现该目的的任何试剂，优选有机碱溶液，更优选体积浓度为5-50％，进一步优选体积浓度10-30％，更进一步优选体积浓度20％的哌啶的DMF溶液(DBLK)，其用量不受限制，适量即可。脱保护反应的压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；反应温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
在一个具体的实施方案中，基于树脂上所负载的氨基的摩尔量计，参与偶联的游离氨基酸Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH每次的用量为2-20当量，优选3-10当量，更优选4-7当量。
在一个具体的实施方案中，本发明步骤A中的偶联在适当的偶联剂的存在下进行，偶联剂为HOBT/DIC、HATU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA、PyAOP/HOAT/DIPEA、PyBOP/HOBT/DIPEA，优选HOBT/DIC。其中，基于偶联的游离氨基酸的摩尔量计，HOBT、DIC、HBTU、HATU、HOAT、PyAOP、DIPEA和PyBOP的量分别为1-5当量，优选1-3当量，更优选1-2当量。
在一个具体的实施方案中，本发明步骤A中的偶联反应在适当的溶剂中进行，所用的溶剂为常用于此目的的溶剂，例如，但不限于，DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等及其任意混合物，优选体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液，溶剂的用量不受限制，适量即可。
在一个具体的实施方案中，本发明步骤A中的反应在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1-4小时，优选2-4小时，更优选2-3小时；反应压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；反应温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
在一个具体的实施方案中，本发明步骤A中的反应优选将树脂在脱除保护基之前进行溶胀，脱除保护基之后用溶剂洗涤，所述洗涤和溶胀的步骤本领域技术人员可采用实现该目的的任何试剂进行，例如，但不限于，DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等及其任意混合物，优选DMF。所述反应中应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任意方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮，当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的氨基，即氨基氮上无保护基。
步骤B
在一个具体的实施方案中，本发明的步骤B是在裂解液的存在下进行，所述裂解液为TFA/DCM的混合溶液，TFA/DCM的体积比为TFA:DCM＝1-5：95-99，优选TFA:DCM＝1-3：97-99更优选TFA:DCM＝1-2：98-99。裂解液的用量为5-40mL/g树脂，优选20-30mL/g树脂，更优选20-25mL/g树脂，反应时间为1-4小时，优选2-4小时，更优选2-3小时。反应压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；反应温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
步骤C
在一个具体的实施方案中，本发明的步骤C是在双(三氟乙酰氧基)碘苯的存在下进行。其中，基于待还原的酰胺基的摩尔量计，双(三氟乙酰氧基)碘苯的用量为1-5当量，优选1-3当量，更优选1-2当量。在本发明的一个优选的实施方案中，步骤C是在双(三氟乙酰氧基)碘苯和吡啶的混合物的存在下进行。
步骤D
在一个具体的实施方案中，本发明的步骤D是在甲酸(2,4,5-三氯苯)酯的存在下进行，其中，基于待酰化的氨基的摩尔量计，甲酸(2,4,5-三氯苯)酯的用量为1-2当量，优选1-1.5当量。在本发明的一个优选的实施方案中，步骤D是在甲酸(2,4,5-三氯苯)酯和二异丙基乙胺的混合物的存在下进行。
步骤E
在一个具体的实施方案中，本发明的步骤E是在裂解液的存在下进行，所述裂解液为TFA/H2O的混合溶液，TFA/H2O的体积比为TFA:H2O＝90-99：1-10，优选TFA:H2O＝90-97：3-10，更优选TFA:H2O＝93-95：5-7。裂解液的用量为5-20mL/g树脂，优选8-15mL/g树脂，更优选10-12mL/g树脂，反应时间为1-4小时，优选2-3小时。反应压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；反应温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
在一个优选的实施方案中，本发明还包括马昔瑞林的纯化步骤。所述纯化步骤可采用本领域已知的任意多肽纯化技术进行，优选采用反相高压液相色谱法。进一步地，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.2％TFA/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，得到马昔瑞林精肽溶液，将精肽溶液以反相十八烷基硅烷为固定相，0.1％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得到醋酸马昔瑞林精肽。
以下参照实施例详细描述本发明，应理解，下述实施例仅意在说明，而不构成对本发明的限制。
实施例
本发明中所用的仪器和试剂是市售的，本领域技术人员可根据经验进行选择。
Sieber氨基树脂购自天津南开和成科技有限公司；氨基酸均购自吉尔生化。
Waters2695RP-HPLC购自Waters公司。
实施例1
线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂的制备
将7.4g(5mmol)替代度为0.68mmol/g的Sieber树脂和适量DMF加入反应柱，氮气鼓泡溶胀30分钟，用适量20％哌啶/DMF溶液反应适当时间，以脱除Fmoc基团，然后用适量DMF洗涤6次，经茚三酮检测反应完全后，将13.2g(20mmol)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、4.0g(24mmol)HOBT溶解于体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液中，然后加入3.3g(26mmol)DIC，将该混合物加入反应柱，室温下反应2小时，用茚三酮检测反应终点(如果显色，继续反应1小时；如果无色透明，终止反应)。重复以上步骤，依次偶联Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH。用适量DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂10.1g。
实施例2
线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂的制备
将7.4g(5mmol)替代度为0.68mmol/g的Sieber树脂和适量DMF加入反应柱，氮气鼓泡溶胀30分钟，用适量20％哌啶/DMF溶液反应适当时间，以脱除Fmoc基团，然后用适量DMF洗涤6次，经茚三酮检测反应完全后，将13.2g(20mmol)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、4.0g(24mmol)HOBT、15.6g(30mmol)PyBOP溶解于体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液中，然后加入3.9g(30mmol)DIPEA，将该混合物加入反应柱，室温下反应2小时，用茚三酮检测反应终点(如果显色，继续反应1小时；如果无色透明，终止反应)。重复以上步骤，依次偶联Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH。用适量DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂10.2g。
实施例3
线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂的制备
将7.4g(5mmol)替代度为0.68mmol/g的Sieber树脂和适量DMF加入反应柱，氮气鼓泡溶胀30分钟，用适量20％哌啶/DMF溶液反应适当时间，以脱除Fmoc基团，然后用适量DMF洗涤6次，经茚三酮检测反应完全后，将13.2g(20mmol)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、4.0g(24mmol)HOAT、11.4g(30mmol)HATU溶解于体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液中，然后加入3.9g(30mmol)DIPEA，将该混合物加入反应柱，室温下反应2小时，用茚三酮检测反应终点(如果显色，继续反应1小时；如果无色透明，终止反应)。重复以上步骤，依次偶联Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH。用适量DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂10.1g。
实施例4
线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂的制备
将14.7g(5mmol)替代度为0.34mmol/g的Sieber树脂和适量DMF加入反应柱，氮气鼓泡溶胀30分钟，用适量20％哌啶/DMF溶液反应适当时间，以脱除Fmoc基团，然后用适量DMF洗涤6次，经茚三酮检测反应完全后，将13.2g(20mmol)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、4.0g(24mmol)HOBT溶解于体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液中，然后加入3.3g(26mmol)DIC，将该混合物加入反应柱，室温下反应2小时，用茚三酮检测反应终点(如果显色，继续反应1小时；如果无色透明，终止反应)。重复以上步骤，依次偶联Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH。用适量DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂17.5g。
实施例5
线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂的制备
将6.3g(5mmol)替代度为0.79mmol/g的Sieber树脂和适量DMF加入反应柱，氮气鼓泡溶胀30分钟，用适量20％哌啶/DMF溶液反应适当时间，以脱除Fmoc基团，然后用适量DMF洗涤6次，经茚三酮检测反应完全后，将13.2g(20mmol)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、4.0g(24mmol)HOBT溶解于体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液中，然后加入3.3g(26mmol)DIC，将该混合物加入反应柱，室温下反应2小时，用茚三酮检测反应终点(如果显色，继续反应1小时；如果无色透明，终止反应)。重复以上步骤，依次偶联Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH。用适量DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂9.0g。
实施例6
侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-NH2的制备
将实施例1中得到的10.1g肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂加入到500mL三口烧瓶中，加入121ml预先配制好的裂解液(TFA:DCM＝1：99)，室温搅拌1小时后过滤，收集滤液；再加入121ml裂解液(TFA:DCM＝1：99)室温搅拌1小时后过滤，收集滤液；树脂再用少量的DCM洗涤2次，合并滤液。加入适量的碱调节pH值至中性，滤液减压蒸干，并真空干燥，得到3.62g全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-NH2，收率93.4％，MS，m/z774.9[M]+，m/z797.9[M+Na]+。
实施例7
侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-H的制备
将3.1g(4mmol)实施例6中得到的全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-NH2用20mlDMF搅拌溶解，然后加入0.64ml(8mmol)吡啶和2.60g(6.0mmol)双(三氟乙酸氧基)碘苯。反应1小时后，用50ml乙酸乙酯稀释混合物，分别用100ml饱和碳酸氢钠水溶液和100ml饱和食盐水清洗上述混合物。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤并真空除去溶剂。得到2.40g全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-H，收率80.1％，MS，m/z746.9[M]+，m/z769.9[M+Na]+。
实施例8
侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-CHO的制备
将2.40g(3.2mmol)实施例7中得到的全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-H溶于20mlDMF中。然后加入0.7ml(4.8mmol)N,N-二异丙基乙胺和1.08g(4.8mmol)甲酸(2,4,5-三氯苯)酯，反应1小时后，分别用100ml饱和碳酸氢钠水溶液和100ml饱和食盐水清洗。用无水硫酸钠干燥有机层，过滤并真空除去溶剂。得到1.98g全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-CHO，收率80.3％，MS，m/z774.7[M]+，m/z797.7[M+Na]+
实施例9
马昔瑞林粗肽H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO的制备
将1.98g(2.5mmol)实施例8中得到的全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-CHO加入到50m1三口烧瓶中，加入20mL预先配置好的裂解液(TFA:H2O＝95:5)，室温反应2小时。反应结束后，反应液加入到200mL冰乙醚中析出白色沉淀，离心，洗涤，干燥称重，得到1.21g马昔瑞林H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO，收率101.8％，HPLC纯度60.7％，MS，m/z474.8[M]+，m/z497.8[M+Na]+。
实施例10
纯化马昔瑞林粗肽得到马昔瑞林精肽
将实施例9所得的1.21g马昔瑞林粗肽用30ml去离子水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，以0.2％TFA/乙腈为流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5％的精肽溶液，将精肽溶液采用Waters2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，浓缩，冻干，得到醋酸马昔瑞林精肽0.50g，HPLC纯度99.6％，总收率26.3％，MS，m/z474.9[M]+。
虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。

Claims (10)

1.一种制备马昔瑞林的方法，该方法包括以下步骤：
A采用固相多肽合成方法，将Sieber树脂脱除Fmoc，得到H2N-Sieber树脂，然后与Fmoc-D-Trp(Boc)-OH偶联，重复脱除Fmoc步骤和偶联步骤，依次偶联Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH，得到线性肽树脂Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-Sieber树脂；
B将步骤A中得到的线性肽树脂裂解，得到侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-Trp(Boc)-NH2；
C将步骤B中得到的全保护肽的酰胺基还原成氨基，得到侧链全保护肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-H；
D将步骤C中得到的全保护肽的氨基进行酰化，得到侧链全保护马昔瑞林肽Boc-Aib-D-Trp(Boc)-D-gTrp(Boc)-CHO；
E脱除步骤D中得到的全保护马昔瑞林肽中氮上的Boc保护基，得到马昔瑞林H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO。
2.权利要求1的方法，其中在步骤A中，Sieber树脂的树脂替代度为0.3-1.0mmol/g，优选0.6-0.8mmol/g。
3.权利要求1的方法，其中在步骤A中，脱除Fmoc的试剂为有机碱的溶液，优选体积浓度为5-50％，更优选体积浓度10-30％的哌啶的DMF溶液。
4.权利要求1的方法，其中在步骤A中，基于树脂上所负载的氨基的摩尔量计，参与偶联的游离氨基酸Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Boc-Aib-OH每次的用量为2-20当量，优选3-10当量，更优选4-7当量。
5.权利要求1的方法，其中在步骤A中，所用的偶联剂为HOBT/DIC、HATU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA、PYAOP/HOAT/DIPEA、PYBOP/HOBT/DIPEA，优选HOBT/DIC，其中，基于偶联的游离氨基酸的摩尔量计，HOBT、DIC、HBTU、HATU、HOAT、PyAOP、DIPEA和PyBOP的量分别为1-5当量，优选1-3当量，更优选1-2当量。
6.权利要求1的方法，其中在步骤A中，偶联反应在适当的溶剂中进行，所述溶剂选自DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇、乙醚及其任意混合物，优选体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液。
7.权利要求1的方法，其中步骤B在裂解液的存在下进行，所述裂解液为TFA/DCM的混合溶液，TFA/DCM的体积比为TFA:DCM＝1-5：95-99，优选TFA:DCM＝1-3：97-99，更优选TFA:DCM＝1-2：98-99，裂解液的用量为5-40mL/g树脂，优选20-30mL/g树脂，更优选20-25mL/g树脂。
8.权利要求1的方法，其中步骤C在双(三氟乙酰氧基)碘苯的存在下进行，其中基于待还原的酰胺基的摩尔量计，双(三氟乙酰氧基)碘苯的用量为1-5当量，优选1-3当量，更优选1-2当量。
9.权利要求1的方法，其中步骤E在裂解液的存在下进行，所述裂解液为TFA/H2O的混合溶液，TFA/H2O的体积比为TFA:H2O＝90-99：1-10，优选TFA:H2O＝90-97：3-10，更优选TFA:H2O＝93-95：5-7，裂解液的用量为5-20mL/g树脂，优选8-15mL/g树脂，更优选10-12mL/g树脂。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中还包括马昔瑞林的纯化步骤，所述纯化步骤采用反相高压液相色谱法。
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