CZ303173B6

CZ303173B6 - Deriváty indolu zvyšující sekreci rustového hormonu

Info

Publication number: CZ303173B6
Application number: CZ20024095A
Authority: CZ
Inventors: Martinez@Jean; Fehrentz@Jean-Alain; Guerlavais@Vincent
Original assignee: Zentaris Ag
Priority date: 2000-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2012-05-16
Also published as: ES2288724T3; HUP0302026A2; DE60112753D1; BG110771A; DK1289951T3; DK1344773T3; TWI305529B; DE60128494T2; CA2407659A1; ATE302181T1; CN1232507C; EP1289951A1; JP2004503536A; EP1289951B1; HK1054224A1; CZ305279B6; HUP0302026A3; IL153067A; CY1107710T1; ES2292900T3

Abstract

Predkládané rešení se týká derivátu indolu vzorce I, který je použitelný pro zvýšení hladiny rustového hormonu v plazme u savcu i pro lécení deficience sekrece rustového hormonu, zpomaleného rustu u detí a metabolických poruch souvisejících s deficiencí sekrece rustového hormonu.

Description

Deriváty indolu zvyšující sekreci růstového hormonu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká derivátů indolu, které jsou použitelné pro zvyšování hladiny růstového hormonu v plazmě při podávání savci.

i o Dosavadní stav techniky (a) Popis dosavadního stavu

Růstový hormon (GH) neboli somatotropin, který je sekretovaný hypofyzou, tvoří skupinu hor15 monů, jejichž biologické účinky jsou základem růstu mladého organismu do výšky, ale také udržování jeho integrity v dospělosti. Růstový hormon působí přímo nebo nepřímo na periferní orgány stimulací syntézy růstových faktorů (růstový faktor-I podobný inzulínu, IGF—I) nebo jejich receptorů (epidermální růstový faktor, EGF). Přímé působení růstového hormonu patří k typu označovanému jako anti inzulínový, který působí ve prospěch lipolýzy na úrovni adipóz20 nich tkání. Působením růstového hormonu na syntézu a sekreci IGF-I (somatomedin C) stimuluje růstový hormon růst chrupavky a kostí (strukturní růst), syntézu proteinů a proliferaci řady periferních orgánů, včetně svalů a kůže. Svými biologickými účinky se růstový hormon v dospělém organismu účastní při udržování stavu proteinového anabolismu a hraje primární úlohu při ději regenerace tkání po úrazu.

Snižování sekrece růstového hormonu s věkem prokázané u lidí a zvířat zvyšuje metabolický posun směrem ke katabolismu, který zahajuje nebo který se účastní stárnutí organismu. Úbytek svalové hmoty, akumulace adipózních tkání, dem ineral izace kostí, ztráta schopnosti regenerace tkáně po úrazu, což jsou děje pozorované u starších Udí, korelují s poklesem sekrece růstového hormonu.

Růstový hormon je tedy fyziologický anabolický prostředek absolutně nezbytný pro růst dětí do výšky, který navíc řídí metabolismus proteinů u dospělých.

Sekrece růstového hormonu (growth hormone, GH) je regulována dvěma peptidy hypothalamu: hormonem uvolňujícím růstový hormon (GH-releasing hormone, GHRH), který působí stimulačně na uvolňování růstového hormonu, a somatostatinem, který má inhibiční vliv. V posledních letech zjistilo několik autorů, že sekrece růstového hormonu může být také stimulována syntetickými oligopeptidy označovanými jako peptidy uvolňující růstový hormon (GH-releasing pepti40 des, GHRP), jako je hexarelin a různé analogy hexarelinu (Ghigo a další, European Journal of Endocrinology, 136,445 - 460, 1997). Tyto sloučeniny působí mechanismem, který je odlišný od mechanismu působení GHRH (C. Y. Bowers, „Xenobiotic Growth Hormone Secretagogues“, ed. B. Bercu a R. F. Walker, str. 9 - 28, Springer-Verlag, New York 1996) a interakcí se specifickými receptory lokalizovanými v hypothalamu a hypofyze ((a) G. Muccioli a další, Journal of

Endocrinology, 157, 99 - 106, 1998; (b) G. Muccioli, „Tissue Distribution of GHRP Receptors in Humans“, Abstracts IV European Congress of Endocrinology, Sevilla, Španělsko, 1998). V poslední době se ukázalo, že receptory pro GHRP jsou přítomny nejen v hypothalamo-hypoíyzámím systému, ale i v různých lidských tkáních, které obecně nesouvisejí s uvolňováním růstového hormonu (G. Muccioli a další, viz výše (a)).

GHRP ajejich antagonisté se popisují například v následujících publikacích: C. Y. Bowers, výše,

R. Deghenghi, „Growth Hormone Releasing Peptides“, tamtéž, 1996, str. 85 - 102; R. Deghenghi a další, „Smáli Peptides as Potent Releasers of Growth Hormone“, J. Ped. End. Metab., 8, str.

311-313, 1996; R. Deghenghi, „The Development of Impervious Peptides as Growth Hormone

Secretagogues“, Acta Paediatr. dod., 423, str. 85 - 87, 1997; K. Veeraraganavan a další, „Growth

- 1 CZ 303173 B6

Hormone Releasing Peptides (GHRP) Binding to Porcine Anterior Pituitary and Hypothalamic Membranes“, Life Sci., 50, str. 1149 - 1155, 1992; a T. C. Somers a další, „Low Molecuiar Weight Peptidomimetic Growth Hormone Secretagogues, WO 96/15148 (23. květen 1996).

Lidský růstový hormon se již přibližně deset let vyrábí metodami genetického inženýrství. Až donedávna se růstový hormon většinou používal v souvislosti s opožděným růstem dětí a nyní se studují využití růstového hormonu u dospělých. Farmakologické účinky růstového hormonu, peptidů uvolňujících růstový hormon a látek zvyšujících sekreci růstového hormonu je možno roztřídit do následujících tří hlavních kategorií.

(b) Růst dětí

Bylo ukázáno, že léčení rekombinantním lidským růstovým hormonem stimuluje růst u dětí s trpasličím vzrůstem hypoíyzámího původu, různými typy ledvinové nedostatečnosti. Turnérovým syndromem a malou postavou. Rekombinantní lidský růstový hormon se současně komerčně dodává v Evropě a ve Spojených státech pro léčení opožděného růstu dětí způsobeného deficiencí růstového hormonu a pro léčení dětské ledvinové nedostatečnosti různých typů. Další možná využití se v současnosti klinicky testují.

(c) Dlouhodobé léčení dospělých a starších osob

Pokles sekrece růstového hormonu způsobuje změnu složení lidského těla v průběhu stárnutí. Předběžné studie léčení rekombinantním lidským růstovým hormonem v trvání jednoho roku v populaci starších pacientů uvádějí zvýšení svalové hmotnosti a tloušťky kůže, snížení hmotnosti tuku a mírné zvýšení hustoty kostí. Co se týče osteoporózy, poslední studie ukazují, že rekombinantní lidský růstový hormon nezvyšuje mineralizaci kostí, ale mohl by zabraňovat demineralizaci kostí u žen po menopauze. V současnosti se provádějí další studie, které by prokázaly tuto teorii.

(d) Krátkodobé léčení dospělých a starších pacientů

V předklinických a klinických studiích bylo ukázáno, že růstový hormon stimuluje anabolismus proteinů a léčení v případě popálenin, AIDS a rakoviny, hojení ran a kostí.

Růstový hormon, peptidy uvolňující růstový hormon a látky podporující sekreci růstového hormonu mohou také nalézt použití ve veterinárním a humánním lékařství. Růstový hormon, peptidy uvolňující růstový hormon a látky podporující sekreci růstového hormonu svalových tkání namísto tukových tkání, a zvyšují produkci mléka u krav, a to bez jakýchkoli nežádoucích vedlejších účinků, které by ohrožovaly zdraví zvířat, a bez jakýchkoli zbytkových množství v produkovaném mase nebo mléce. Ve Spojených státech se v současnosti komerčně používá hovězí somatotropin (BST).

Většina v současnosti probíhajících klinických studií byla prováděna s použitím rekombinantního růstového hormonu. Peptidy uvolňující růstový hormon a látky podporující jeho sekreci jsou považovány za produkty druhé generace, které mají v blízké budoucnosti ve většině případů nahradit použití růstového hormonu. Použití peptidů uvolňujících růstový hormon a látek podporujících sekreci růstového hormonu přináší tedy proti použití samotného růstového hormonu řadu výhod.

Proto je zapotřebí vyvinout další sloučeniny, které při podávání savci působí jako látky podporuj ící sekreci růstového hormonu.

-2CZ 303173 B6

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká nové sloučeniny, která působí stimulačně na sekreci růstového hormonu, a jejího použití v léčivu pro zvýšení hladiny růstového hormonu v plazmě u savce jejím podáváním. Vynález se také týká farmaceutických prostředků pro léčení nedostatečné sekrece růstového hormonu, podporu hojení ran, zotavení z chirurgického zákroku nebo zneschopftující nemoci podáváním v terapeuticky účinném množství savci.

Podrobný popis výhodných provedení

V popisu se používají následující zkratky: D je dextro enantiomer, GH je růstový hormon, Boc je /erc-buty loxy karbony i, Z je benzyloxykarbonyl, N-Me je JV-methyl, Pip je 4-aminopiperidtn-4karboxylát, Inip je isonipekotyl, tj. piperidin-4-karboxylát, Aib je α-aminoisobutyryl, Nal je βnaftylalanin, Mrp je 2-methyl-Trp, a Ala, Lys, Phe, Trp, His, Thr, Cys, Tyr, Leu, Gly, Ser, Pro,

Glu, Arg, Val a Gin jsou aminokyseliny alanin, lysin, fenylalanin, tryptofan, histidin, threonin, cystein, tyrosin, leucin, glycin, serin, prolin, kyselina glutamová, arginin, valin a glutamin.

IBCF je isobutylchloroformiát, NMM je /V-methylmorfolin, DME je dimethylether, BOP je benzotriazol-I-yloxy-tris(dimethylamino)fosfonium hexafluorfosfát, DMF je dimethylformamid,

DMAP je 4-dimethylaminopyridin, BTIB je bis(trifluoracetoxy)jodbenzen, DIEA je ΛζΑ-diisopropy Iethy lamin, TFA je kyselina trifluoroctová, DMSO je dimethylsulfoxid, DCU je dicyklohexylmočovina, Fmoc je fluorenyImethyloxykarbonyl a ACN je acetonitril.

Navíc g Trp je skupina vzorce a gMrp skupina vzorce

H kde * znamená atom uhlíku, který, pokud jde o chirální atom uhlíku, má konfiguraci R nebo S.

Sloučeninou podle vynálezu je

H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO:

-3CZ 303173 B6

Podle předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že sloučenina podle vynálezu je použitelná pro zvýšení hladiny růstového hormonu v plazmě u savce. Sloučenina podle předkládaného vynálezu je dále použitelná pro léčení defic ience sekrece růstového hormonu, zpomalení růstu u dětí a metabolických poruch souvisejících s deficiencí sekrece růstového hormonu, zvláště u starších osob.

V případě potřeby mohou být také použity farmaceuticky přijatelné soli této sloučeniny. Mezi tyto soli patří organické nebo anorganické adiční soli, jako je hydrochlorid, hydrobromid, fosfát, sulfát, acetát, sukcinát, askorbát, tartrát, glukonát, benzoát, malát, fumarát, stearát nebo pamoát.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou použitelné pro zvyšování hladiny růstového hormonu v plazmě u savce, stejně jako pro léčení deficience sekrece růstového hormonu, zpomalení růstu dětí a metabolických poruch souvisejících s deficiencí sekrece růstového hormonu, zvláště u starších osob. Tyto farmaceutické prostředky mohou obsahovat sloučeninu podle předkládaného vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, popřípadě ve směsi s nosičem, pomocnou látkou, vehikulem, ředivem, matricí nebo povlakem způsobujícím prodloužené uvolňování. Příklady těchto nosičů, pomocných látek, vehikul, řediv je možno nalézt v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou obsahovat další látky zvyšující sekreci růstového hormonu. Příklady vhodných dalších látek podporujících sekreci růstového hormonu jsou látky Ghrelin (srovnej M. Kojima a další, Nátuře, 402 (1999), 656 - 660), GHRP-1, GHRP-2 a GHRP-6.

Gh re I in: G ly-Ser-Ser(<3-rc—oktanoy I )-Phe-Leu-Ser-Pro-G lu-H i s-G ln-Arg-Val-G 1 n-G InArg-Ly s-G lu-Ser-Lys-Ly s-Pro-Pro-A la-Ly s-Leu-G ln-Pro-Arg

GHRP-1: Ala-His-D-p-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂

GHRP-2: D-Ala-D-P-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂

GHRP-6: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂

Sloučenina podle předkládaného vynálezu může být formulována odborníkem v oboru za poskytnutí farmaceutických prostředků, které jsou vhodné pro parenterální, bukální, rektální, vaginální, transdermální, pulmonámí nebo orální způsoby podávání.

Typ formulace nebo farmaceutického prostředku s obsahem sloučeniny může být zvolen na základě požadovaného způsobu podávání. Jestliže mají být sloučeniny podány rychle, je výhodná nosní nebo intravenózní cesta.

Farmaceutické prostředky mohou být podávány savcům včetně člověka v terapeuticky účinné dávce, kterou může odborník v oboru snadno určit, a která se bude lišit podle druhu, věku, pohlaví a hmotnosti léčeného pacienta nebo subjektu stejně jako podle způsobu podávání. Přesnou úroveň je možno snadno zjistit empiricky.

-4CZ 303173 B6

Příklady provedení vynálezu

Následující příklad 1 ilustruje účinnost sloučeniny podle předkládaného vynálezu používané při léčení. Ostatní příklady jsou srovnávací.

Příklad 1

H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO io

Úplná syntéza (procenta představují výtěžky získané při následující syntéze):

% %

13% ! 60% %

70% %

Z-D—Trp-NH₂

Z-D-Trp-OH

I 1) tBCF, NMM, DME, 0 “C 4 2) NH₄OH

Z-D-Trp-NH₂ | 1) H₂, Pd/C, DMF, H₂O, HCI 4 2) BOP, NMM, DMF, Boc-D-Trp-OH

Boc-D-T rp-D-T rp-NH₂ | t-Boc₂O, DMAP kat. bezvodý CH₃CN

Boc-D- (N'Boc)Trp-D- (N'Boc)Trp-NH_a| 1) BTIB, pyridin, DMF/H_aO I 2) 4,5-trichlorfenylformÍát, DIEA, DMF

Boc-D- (N'Boc)Trp-D-(N'Boc)Trp-CHO | 1) TFA/anisol/thioanisol (8/1/1), 0 °C 1 2) BOP, NMM, DMF, Boc-Aib-OH

Boc-Aib-D-T rp-D-gT rp-CHO | 1) TFA/anisol/thioanisol (8/1/1), 0 °C 1 2) čištění preparativní HPLC

H-Aib-D-T rp-D-gT rp-CHO

Z-D-Trp-OH (8,9 g; 26 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v DME (25 ml) a umístěn v ledové lázni pri teplotě 0 °C. Postupně byly přidány NMM (3,5 ml; 1,2 ekv.), IBCF (4,1 ml; 1,2 ekv.) a 28% roztok amoniaku (8,9 ml; 5 ekv.). Směs byla zředěna vodou (100 ml) a produkt Z-D-Trp-NH₂ se vysrážel. Byl zfiltrován ve vakuu za získání 8,5 8g bílé pevné látky.

Výtěžek = 98 %.

-5CZ 303173 B6

C|t)H₁₉N3O3, 337 g.mol

Rf= 0,46 {chloroform/methanol/kyselina octová(180/10/5)}.

'H NMR (250 MHz, DMSO-d⁶): δ 2,9 (dd, IH, H_p, J_pp- = 14,5 Hz; J_Pa = 9,8 Hz); 3,1 (dd, IH, H_p, J_p,_p = 14,5 Hz; J_p„ - 4,3 Hz); 4,2 (sextet, IH, H_a); 4,95 (s, 2H, CH₂ (Z)); 6,9-7,4 (m, 1 IH),

7,5 (s, 1 Η, H²); 7,65 (d, 1H, J = 7,7 Hz); 10,8 (s, 1H, N'H).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 338 [M+H]⁺, 360 [M+Na]⁺. 675 [2M+H]⁺, 697 [2M+Na]⁺.

Boc-D-T rp-D-T rp-N H₂

Z-D-Trp-NH₂ (3 g; 8,9 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v DMF (100 ml). K míchané směsi byly přidány 36% HCI (845 μΐ; 1,1 ekv.), voda (2 ml) a palladium na aktivním uhlí (95 mg, 0,1 ekv.). Tento roztok byl probubláván vodíkem 24 hod. Když byla reakce ukončena, palladium bylo zfíltrováno přes celit. Rozpouštědlo bylo odstraněno za získání HCI, H-D-Trp-NH₂ jako bezbarvého oleje.

Do 10 ml DMF byly postupně přidány HCI, H-D-Trp-NH₂ (8,9 mmol; 1 ekv.), Boc-D-Trp-OH (2,98 g; 9,8 mmol; 1,1 ekv.), NMM (2,26 ml; 2,1 ekv.) a BOP (4,33 g; 1,1 ekv.). Po 1 hod byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným roztokem hydrogens Íránu draselného (200 ml, ÍM) a nasyceným vodným chloridem sodným (lOOml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, za získání 4,35 g Boc-D-Trp-D-Trp-N H₂ jako bílé pevné látky.

Výtěžek = 85%.

C77H31N5O4, 489 g.mol \

Rf= 0,48 {chloroform/methanol/kyselinaoctová (85/10/5)}.

'H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,28 (s, 9H, Boc); 2,75-3,36 (m, 4H, 2(CH₂)_P; 4,14 (m, IH, CH_a); 4,52 (m, IH, CH_a); 6,83 - 7,84 (m, 14H, 2 indoly (10H), NH₂, NH (urethan) a NH (amid)); 10,82 (d, 1H, J = 2 Hz, N'H); 10,85 (d, IH, J = 2 Hz, N‘H).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 490 [M+H]⁺, 512 [M+Na]⁺, 979 [2M+H]⁺. Boc-D-ÍNOocjTrp-D-ÍNHoc) Trp-NH₂

Boc-D-Trp-D-Trp-N H₂ (3 g; 6,13 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v acetonitrilu (25 ml). Do tohoto roztoku byly postupně přidány di-tezc-butyldikarbonát (3,4 g; 2,5 ekv.) a 4-dimethylaminopyridin (150 mg; 0,2 ekv.). Po 1 hod byla směs zředěna ethylacetátem (lOOml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným hydrogensíranem draselným (200 ml, 1M) a nasyceným vodným chloridem sodným (200 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografíí na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/hexan { 5/5} za získání 2,53 g Boc-D-(N'Boc)Trp-D-(N'Boc)Trp-NH2 jako bílé pevné látky.

Výtěžek = 60 %.

C37H47N5O8, 689 g.mol ^l.

Rf = 0,23 {ethylacetát/hexan (5/5)).

-6CZ 303173 B6 'H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,25 (s, 9H, Boc); 1,58 (s, 9H, Boc); 1,61 (s, 9H, Boc); 2,75 3,4 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,2 (m, IH, CH_a); 4,6 (m, IH, CH_a); 7,06- 8 (m, 14H, 2 indoly (1 OH), NH (urethan), NH a NH₂ (amidy)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 690 [M+H]⁺. 712 [M+Na]⁺. 1379 [2M+H]⁺, 1401 [2M+Na]\

Boc-D-CN'Boc)Trp-D-g(N'Boc)Trp-H

Boc-D-(N^,Boc)Trp-D-(N^lBoc)Trp-NH₂ (3 g; 4,3 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn ve směsi DMF/voda (18 ml/7 ml). Potom byly přidány pyridin (772 μΐ; 2,2 ekv.) a bis(trifluoracetoxy)jodbenzen (2,1 g; 1,1 ekv.). Po l hod byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným hydrogensíranem draselným (200 ml, ÍM) a vodným nasyceným chloridem sodným (200 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Boc-D-(N’Boc)TrpD-g(N'Boc)Trp-H byl použit ihned pro další formylační reakci.

Rf = 0,14 (ethylacetát/hexan (7/3)}.

CkH^NjO,, 661 g.mol·¹.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,29 (s, 9H, Boc); 1,61 (s, 18H, 2 Boc); 2,13 (s, 2H, NH, (amin)); 3,1 - 2,8 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,2 (m, IH, CH„); 4,85 (m, IH, CH„); 6,9 - 8 (m, 12H, 2 indoly (10H), NH (urethan), NH (amid)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 662 [M+H]⁺, 684 [M+Na]’.

Boc-D-ÍNOocyTrp-D-gíNiBocyrrp-CHO

Boc-D-^OocjTrp-D-gíNOocjTrp-H (4,3 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v DMF (20 ml). Potom byly přidány N, N-d i i sopropy lethy lamin (815 μΐ; 1,1 ekv.) a 2,4,5-trichlorfenylformiát (1,08 g;

1,1 ekv.). Po 30 min byla směs zředěna ethylacetátem (lOOml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným hydrogensíranem draselným (200 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (200 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/hexan {5/5} za získání 2,07 g Boc-D-(N'Boc)TrpD-g(N'Boc)Trp-CHO jako bílé pevné látky.

Výtěžek =70%.

C„H₄,N₅O₈, 689 g.mo|-'.

Rf = 0,27 (ethylacetát/hexan (5/5)}.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,28 (s, 9H, Boc); 1,6 (s, 9H, Boc); 1,61 (s, 9H, Boc); 2,75 3,1 (m, 4H, 2(CH₂)p); 4,25 (m, IH, (CH)a_AAB); 5,39 (m, 0,4H, (CH)cť_B); 5,72 (m, 0,6H, (CH)a\); 6,95 - 8,55 (m, 14H, 2 indoly (10H), NH (urethan), 2 NH (amidy), CHO (formyl)). Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 690 [M+H]⁺, 712 [M+Na]⁺, 1379 [2M+H]\ Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO

-7CZ 303Í73 B6

Boc-D-TN^ocjTrp-D-gíN^ocjTrp-CHO (1,98 g; 2,9 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (16 ml), anisolu (2 ml) a thioanisolu (2 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl H-D-Trp-D-gTrpCHO byla odfiltrována.

TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-CHO (2,9 mmol; 1 ekv.), Boc-Aib-OH (700 mg; 1 ekv.), NMM (2,4 ml; 4,2 ekv.) a BOP (1,53 g; 1,2 ekv.) byly postupně přidány do 10 ml DMF. Po 1 hod byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), vodným hydrogensíranem draselným (200 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (200 ml). Organická vrstva byia sušena nad síranem sodným, zfíltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografii na silikagelu s elucí ethylacetátem za získání 1,16 g Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO jako bílé pevné látky.

Výtěžek = 70 %.

C,_lH₃₈N₆O₅, 574 g.mor^l.

Rf= 0,26 {chloroform/methanol/kyselina octová (180/10/5)}.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,21 (s, 6H, 2CH₃(Aib)); 1,31 (s, 9H, Boc); 2,98 - 3,12 (m, 4H, 2(CH₂)_p); 4,47 (m, IH, CH)a_A&B); 5,2 (m, 0,4H, (CH)ď_B); 5,7 (tn, 0,6H, (CH)a'_A); 6,95 - 8,37 (m, 15H, 2 indoly (10H), 3 NH (amidy), 1 NH (urethan), CHO (formyl)); 10,89 (m, 2H, 2 N'H (indoly)).

Hmotnostní spektroskopie (elektrorozprašování), m/z 575 [M+H]⁺, 597 [M+Na]⁺, 1149 [2M+H]⁺, 1171 [2M+Na]⁺.

H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO

Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO (1 g; 1,7 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min pri 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl H-Aib~D-Trp-D-gTrp-CHO byla odfiltrována.

Produkt, TFA sůl H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO, byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, C18, 40 x 100 mm, 5 gm, 100 A).

Výtěžek-52%.

C,₆H,„N₆O,,474 g.mol~'.

'HNMR (400 MHz, DMSO-d⁶) + 'H/'H korelace: δ 1,21 (s, 3H, CH, (Aib)); 1,43 (s, 3H, CH, (Aib)); 2,97 (m, 2H, (CH₂)_P); 3,1 (m, 2H, (CH₂)_B); 4,62 (m, IH, (CHa_AM); 5,32 (q, 0,4H, (CH)<x'_a); 5,71 (q, 0,6H, (CH)a'_A); 7,3 (m, 4H, H, a H₆ (2 indoly); 7,06 - 7,2 (4d, 2H, H_2A a H_2B(2 indoly)); 7,3 (m, 2H, H. nebo H, (2 indoly)); 7,6 - 7,8 (4d, 2H, H_4A a H_4B neb H,_A a H_7B); 7,97 (s, 3H, NH₂ (Aib) a CHO (formyl)); 8,2 (d, 0,4H, NHia (diamino)); 8,3 (m, IH, NHaíb); 8,5 (d, 0,6H, NH|_A (diamino)); 8,69 (d, 0,6H, NH_2A (diamino)); 8,96 (d, 0,4H, NH_2B (diamino)); 10, 8 (s, 0,6H, N'H,_a (indol)); 10,82 (s, 0,4H, N'H,_b (indol)); 10,86 (s, 0,6H, N'H_2a (indol)); 10,91 (s, 0,4H,N'H_2B (indol)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 475 [M+H]*. 949 [2M+H]⁺.

Analogická syntéza byla provedena pro následující sloučeniny:

-8CZ 303173 B6

Příklad 2

H-Aib-lT-Mrp-D-gMrp-CHO 5 C₂₈H₃₄N₆O₃, 502 g.mol 'H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶) + 'Η/’Η korelace: δ 1,19 (s, 2H, (CH₃)_1A (Aib)); 1,23 (s, IH, (CH₃)_1B (Aib)); 1,41 (s, 2H, (CH₃)_1A (Aib)); 1,44 (s, 2H, (CH^b (Aib)); 2,33 - 2,35 (4s, 6H,

2CH₃ (indoly)); 2,93 (m, 2H, (CH₂)_P); 3,02 (m, 2H, (CH₂)_P); 4,65 (m, 0,6H, (CH)a_A); 4,71 (m, ío 0,4H, (CH)a_B); 5,2 (m, 0,4H, (CH)a _p); 5,6 (m, 0,6H, (CH)cx'_A); 6,95 (m, 4H, H₅ a H₆ (2 indoly)); 7,19 (m, 2H, H₄ nebo H₇ (2 indoly)); 7,6 (m, 2H, H₄ nebo H₇ (2 indoly)); 7,9 (s, 1H,

CHO (formyl)); 7,95 (s, 2H, NH₂ (Aib)); 8,05 (d, 0,4H, NH_iB (diamino)); 8,3 (m, IH, NH_a&b);

8,35 (m, 0,6H, NH_)A (diamino)); 8,4 (d, 0,6H, NH_2A (diamino)); 8,75 (d, 0,4H, NH_2B (diamino));

10,69 (s, 0,6H, N^lH1A (indol)); 10,71 (s, 0,4H, N^lH,B (indol)); 10,80 ($, 0,6H, N'H_2a (indol)); 15 10,92 (s, 0,4H, N'H₂b (indol)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 503,1 [M+H]⁺.

Příklad 3

N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO

Boc-N-Me-Aib-OH (327 mg; 1,5 mmol; 2,6 ekv.) byl rozpuštěn v methylenchloridu (10 ml) a ochlazen na 0 °C. Potom byl přidán dicyklohexylkarbodiimid (156 mg; 0,75 mmol; 1,3 ekv.). Směs, po zfiltrování DCU, byla přidána k roztoku obsahujícímu TFA, H-D-Trp-D-gTrp-CHO (0,58 mmol; 1 ekv.) a triethylamin (267 μΐ; 3,3 ekv.) v methylenchloridu (5 ml). Reakční směs byla pomalu zahřáta na teplotu laboratoře a reakce byla ukončena po 24 hod. Směs byla zředěna ethylacetátem (25 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (50 ml), vodným hydrogensíranem draselným (50 ml, ÍM), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Zbytek byl Čištěn bleskovou ehromatografií na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/methanol {9/1} za získání 180 mg (53 %) Boc-N-Me—Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO jako bílé pěny.

Boc-N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO (180 mg; 0,3 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0°C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl smíchán s etherem a vysrážená TFA sůl N-Me-Aib-D-Trp-DgTrp-CHO byla zfiltrována.

Produkt, TFA sůl N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO (39 mg; 15%), byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, Cl8, 40 x 100 mm, 5 μηη, 100 A).

C₂₇H₃₂N₆O₃₎ 488 g.mol'.

*H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,19 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,42 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 2,26 (s, 3H, NCH₃); 3,12 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,66 (m, IH, (CH)«); 5,32 a 5,7 (m, IH, (CH)_a); 6,9 - 7,8 (m, 10H, 2 indoly); 8 )m, IH, CHO (formyl)); 8,2 - 9 (m, 4H, 3 NH (amidy) a NH (amin)); 10,87 (m, 2H, 2 N’H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 489,29 [M+H]⁺.

-9CZ 303173 B6

Příklad 4

H-Aíb-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃

Boc-EH^fBocjTrp-D-gíN^oc^rp-H (0,72 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn v DMF (20 ml). Potom byly přidány N, ΛΜ i isopropy lethy lamin (259 ml; 2,1 ekv.) a acetanhydrid (749 ml;

1,1 ekv.). Po 1 hod byla směs zředěna ethylacetátem (100 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (100 ml), vodným hydrogensíranem draselným (100 ml, IM), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/hexan za získání 370 mg (73 %) Boc-D(N'Boc)Trp-D-g(N'Boc)Trp—C(O)CH₃ jako bílé pevné látky.

Boc-D-íNBocjTrp-D-gCsfBocyTrp-CíOjCH} (350 mg; 0,5 mmol; 1 ekv.) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl H-DTrp-D-gTrp-C(O)CH₃ byla zfiltrována.

Do 10 ml DMF byly postupně přidány TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (0,5 mmol; 1 ekv.), Boc-Aib-OH (121 mg; 0,59 mmol; 1,2 ekv.), NMM (230 μΐ; 4,2 ekv.) a BOP (265 mg; 1,2 ekv.). Po 1 hod byla směs zředěna ethylacetátem (25 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (50 ml), vodným hydrogensíranem draselným (50 ml, IM), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií na silikagelu s elucí ethylacetátem za získání 249 mg (85 %) Boc-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃jako bílé pěny.

Boc-Aíb-D“Trp-D-gTrp-C(0)CH₃ (240 mg; 0,42 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl H-Aib-D-Trp-D-gTrpC(O)CH₃ byla zfiltrována.

Produkt, TFA sůl H-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (80 mg; 23 %), byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, C18,40 x 100 mm, 5 mm, 100 A).

C27H32N6O₃, 488 g.mol '.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,22 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,44 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,8 (s, 3H, C(O)CH₃); 3,06 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,6 (m, IH, (CH)_a); 5,6 (m, IH, (CH)_a); 6,9 - 7,8 (m, 10H, 2 indoly); 7,99 (s, 2H, NH₂ (Aib)); 8,2 - 8,6 (m, 3H, 3 NH (amidy)); 10,83 (s, 2H, 2 N'H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 489,32 [M+H]⁺.

Příklad 5

N-Me-A ib-D—T rp—D—gT rp—C(O)C H₃

Boc-N-Me-Aib-OH (1,09 g; 5,04 mmol; 4 ekv.) byl rozpuštěn v methylenchloridu (10 ml) a ochlazen na 0 °C. Potom by přidán dicyklohexylkarbodiimid (520 mg; 2,52 mmol; 2 ekv.). Směs, po zťiltrování DCU, byla přidána k roztoku obsahujícímu TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃(940 mg; 1,26 mmol; 1 ekv.) a triethylamin (580 ml; 3,3 ekv.) v methylenchloridu (5 ml). Reakční směs byla pomalu ohřátá na tepotu laboratoře a reakce byla ukončena po 24 hod. Směs byla zředěna ethylacetátem (50 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem drasel-10CZ 303173 B6 ným (100 ml), vodným hydrogen síranem draselným (100 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (100 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu. Zbytek byl čištěn bleskovou chromatografii na silikagelu s elucí směsí ethylacetát/methanol {9/1} za získání 530 mg (70 %) Boc-N-Me-Aib-D-Trp-D5 gTrp-C(O)CH₃ jako bílé pěny.

Boc-N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (530 mg; 0,88 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min pri 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu a zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl N-Me-Aib-D-Trp-Dio gTrp-C(O)CH₃ byla zfiltrována.

Produkt, TFA sůl N-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (220 mg; 30 %), byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, Cl8, 40 x 100 mm, 5 mm, 100 A).

C₂₆H₃₄N₆O₃, 502 g.moL¹.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶); δ 1,17 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,4 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,78 (s, 3H, C(O)CH₃); 2,23 (s, 3H, NCH₃); 3,15 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,7 (m, IH, (CH)_a); 5,55 (m, IH, (CH)_a);

6,9 - 7,9 (m, 10H, 2 indoly); 8,2 - 8,8 (s, 4H, NH (amin) a 3 NH (amidy)); 10,8 (s, 2H, 2 N*H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 503,19 [M+H]⁺.

Příklad 6

Pip-D-Trp-D-gTrp-CHO

K 5 ml DMF byly postupně přidány TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-CHO (230 mg; 0,31 mmol;

1 ekv.), Boc-(N⁴Boc)Pip-OH (130 mg; 0,38 mmol; 1,2 ekv.), NMM (145 μΐ; 4,2 ekv.) a BOP (167 mg; 0,3 8 mmol; 1,2 ekv.). Po 15 min byla reakce u konce. Směs byla zředěna ethylacetátem (25 ml) a promytá nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (50 ml), vodným hydrogensíranem draselným (50 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za získání Boc—(N⁴Boc)Pip-D-Trp-D-gTrp-CHO jako pěny.

Boc-(N⁴ Boc) Pip-D-Trp-D-gTrp-CHO (0,31 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min pri 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a TFA sůl H-PÍp-D-Trp-D-gTrp-CHO byla zfiltrována.

Produkt, TFA sůl H-Pip-D-Trp-D-gTrp-CHO (127 mg; 42 %), byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, C18,40 x 100 mm, 5 m, 100 A).

C₂₈Hj,N₇O₃, 515 g.mol'.

'HNMR (200 Mhz, DMSO-d‘): 8 1,81 (m, 2H, CH₂ (Píp)); 2,3 (m, 2H, CH₂ (Píp)); 3,1 (m, 8H, 2(CH₂)p a 2CH₂ (Pip)); 4,68 (m, IH, (CH)); 5,3 a 5,73 (2m, IH, (CH)_a); 6,9-7,7 (m, 10H, 2 indoly); 7,98 (2s, IH, CHO (formyl)); 8,2-9,2 (m, 6H, NH₂ a NH (Pip)) a 3 NH (amidy));

10,9 (m, 2H, 2 N'H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 516,37 [M+H]⁺; 538,27 [M+Na]*.

Příklad 7

Pip-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃

-11CZ 303173 B6

Do 5 ml DMF byly postupně přidány TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH3 (218 mg, 0,29 mmol; 1 ekv.), Boc-(N⁴Boc)Pip-OH (121 mg; 0,35 mmol; 1,2 ekv.), NMM (135 μί;

4,2 ekv.) a BOP (155 mg; 0,35 mmol; 1,2 ekv.). Po 15 min byla reakce u konce. Směs byla zre5 děna ethylacetátem (25 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhliěitanetn sodným (50 ml), vodným hydrogensíranem draselným (50 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno, za získání Boc-(N⁴Boc)Pip-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH3 jako pěny.

io Boc-(N⁴Boc)Pip-D-Trp~D-gTrp-C(O)CH3 (0,29 mmol) byl rozpuštěn ve směsi kyseliny trifluoroctové (8 ml), anisolu (1 ml) a thioanisolu (1 ml) 30 min při 0 °C. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážená TFA sůl H-Pip-D-Trp-D-gTrpC(O)CHi byla zfiltrována.

Produkt, TFA sůl H-Pip-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (135 mg; 47 %), byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, C18, 40 x 100 mm, 5 μιη, 100 A).

C₂,H₃₅N,O_3l 529 g.mor'.

'HNMR(200 MHz, DMSO-d⁶); δ 1,79 (m, 2H, CH₂ (Píp)); 1,81 (s, 3H, C(O)CH₃); 2,3 (m, 2H, CH, (Pip)); 3,1 (m, 8H, 2(CH₂)_P a 2 CH₂ (Pip)); 4,7 (m, IH, (CH)„); 5,6 (m, IH, (CH)_ď); 6,9 7,8 (m, 10H, 2 indoly); 8,2 - 9 (m, 6H, NH₂ a NH (Pip) a 3 NH (amidy)); 10,85 (m, 2H, N'H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 530,39 [M+H]⁺, 552,41 [M+Na]⁺.

Příklad 8

Isonipekotyl-D-Trp-D-gTrp-CHO

Do 5 ml DMF byl přidána TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-CHO (250 mg, 4,1 mmol; 1 ekv.), Fmocisonipekotát-OH (144 mg; 4,1 mmol; 1,2 ekv.), NMM (158 μΐ; 4,2 ekv.) a BOP (181 mg;

4,1 mmol; 1,2 ekv.). Po 15 min byla reakce u konce. Směs byla zředěna ethylacetátem (25 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (50 ml), vodným hydrogensíranem draselným (50 ml, 1M), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za získání Fmoc-ison ipekoty 1-D-Trp-D-gTrp-CHO jako pěny.

Fmoc-isonipekotyl-D-Trp-D-gTrp-CHO (4,1 mmol) byl rozpuštěn ve směsi DMF (8 ml) a piperidinu (2 ml) a ponechán stát 30 min. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vy srážený i son ipekoty 1-D-Trp-D-gTrp-CHO byl zfiltrován.

Produkt isonipekoty 1-D-Trp-D-gTrp-CHO (81 mg; 28%) byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, C18,40 x 100 mm, 5 pm, 100 A).

C₂₈H₃₂N₆O3, 500 g.mof¹.

'H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,65 (m, 4H, 2 CH₂ (Pip)); 2,4 (m, IH, CH (Pip)); 2,7 - 3,3 (m, 8H, 2 (CH₂)_p a 2 CH₂ (Pip)); 4,6 (m, IH, (CH)_a); 5,3 a 5,7 (2m, IH, (CH)_a); 6,9 - 7,7 (m,

10H, 2 indoly); 7,97 (2s, IH, CHO (formyl)); 8 - 8,8 (m, 4H, NH (Pip) a 3 NH (amidy)); 10,9 (m, 2H,N'H (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 501,36 [M+H].

-12CZ 303173 B6

Příklad 9 lsonipekotyl-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃

Do 5 ml DMF byly postupně přidány TFA sůl H-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (250 mg, 0,33 mmol; 1 ekv.), Fmoc-isonipekotát-OH (141 mg; 0,4 mmol; 1,2 ekv.), NMM (155 μΐ;

4,2 ekv.) a BOP (178 mg; 0,4 mmol; 1,2 ekv.). Po 15 min byla reakce u konce. Směs byla zředěna ethylacetátem (25 ml) a promyta nasyceným vodným hydrogenuhličítanem sodným (50 ml), vodným hydrogensíranem draselným (50 ml, ÍM), a nasyceným vodným chloridem sodným (50 io ml). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za získání Fmoc-isonipekotyl-D-Trp_D-gTrp-C(0)CH₃ jako pěny.

Fmoc-Ísonipekotyl-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (0,33 mmol) byl rozpuštěn ve směsi DMF (8 ml) a piperidinu (2 ml) a ponechán stát 30 min. Rozpouštědla byla odstraněna ve vakuu, zbytek byl míchán s etherem a vysrážený isonipekotyl-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ byl zfiltrován.

Produkt isonipekotyl-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃ (65 mg; 13 %) byl čištěn preparativní HPLC (Waters, delta pak, C18,40 x 100 mm, 5 pm, 100 A).

C₂₉H₃₄N₆O₃, 514 g.mor¹.

'H NMR (200 MHz, DMSO—d^Ď): δ 1,66 (m, 4H, 2 CH₂ (Pip)); 1,79 (s, 3H, C(O)CH₃); 2,7 - 3,3 (m, 8H, 2 CHhjp a 2 CH₂ (Píp)); 4,54 (m, IH, (CH)_a); 5,59 (m, IH, (CH)_a); 6,9 - 7,7 (m, 10H, 2 indoly); 8 - 8,6 (m, 4H, NH (Pip) a 3 NH (amidy)); 10,82 (m, 2H, (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 514,44 [M+H]⁺.

Příklady 10-62

Podobným způsobem byly připraveny následující sloučeniny:

Příklad 10 H-Aib-D-Mrp-gMrp-CHO

Příklad 11 H-Aib-Trp-gTrp-CHO

Příklad 12 H-Aib-Trp-D-gTrp-CHO

Příklad 13 H-Aíb-(D)-Trp“gTrp~CHO

Příklad 14 A-Me-D-Trp-gTrp-CHO

Příklad 15 iV-Methylsulfonyl-D-Trp-gTrp-CHO Příklad 16 A-Fenylsulfonyl-D-Trp-gTrp-CHO Příklad 17 N-(3-Methylbutanoy l)-D-Trp-gTrp-CO“CH₃Příklad 18 /V-(3-Methy lbutanoy l)-D-Trp-gTrp-<HO Příklad 19 Aib-D-Trp-gTrp-CO-CHr-CH₃Příklad 20 Aib-D-Trp-gTrpCO-CH2-CH(CH₃><H3 Příklad 21 Aib-D-Trp-gTrp-CO-CHz-feny 1

-13CZ 303173 B6

Příklad 22 Aíb-D-Trp-gTrp-CO-piperidin-4-yl

Příklad 23 Aib-D-Trp-gTrp-COCH₂-pynOl-3-yl Příklad 24 Aih^D-Tr^gTrp-COCH₂-CH₂-cyklohexyl Příklad 25 N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CHr-CHj Příklad 26 N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-<O-CH₂-CH(CH3)-CH₃Příklad 27 N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CHz-fenyl Příklad 28 N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH^pyrrol-3-yl Příklad 29 N-Me-Aib-D-Trp-gTrp-CO-CHz-CH^yklohexyl Příklad 30 Aib-D-Trp-gTrp-CHO io

Příklad 31 2V-(3-amino-3-methylbutanoyl)-D-Trp-gTrp-CO-CH₃

Příklad 32 A-Acetyl-D-Trp-gTrp-CHO

Příklad 33 /V-Acetyl-D-Trp-gTrp™CO-CH₃

Příklad 34 V-Formyl-D-Trp-gTrp-CHO

Příklad 35 A-Formyl-D-Trp-gTrp-<O-CH₃

Příklad 36 A-( 1,1 -dimethyl-2-amino-2-ketoethy 1)-D-T rp-gT rp-CHO Příklad 37 /V-(2-amino-2-methylpropyl)-D-Trp-gTrp-CHO Příklad 38 7V-(2-amino-2-methylpropyl)-D-Trp-gTrp-CO-CH3 Příklad 39 A-Me-Aib-D-Trp-D-gTrp-isonipekotyl Příklad 40 7V-Me-Aib-D-Trp-N-Me-D-gTrp-C(O)CH₃Příklad 41 H-Aib~D-Tip-N-Me-D-gTrp-C(O)CH₃

Příklad 42

H-Aib-(D)-l-Nal-g-(D)-l-Nal~formyl

C₃₀H₃₂N₄O₃, 496 g.mof¹.

'H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,14 a 1,14 (2m, 6H, 2 CH₃ (Aib)); 3,17 - 3,55 (m, 4H, 2(CH₂)_P); 4,82 (m, IH, CH_a); 5,5 a 5,82 (2m, IH, CHa); 7,36 - 7,64 (m, 8H); 7,83 - 8 (m, 7H); 8,25-9,45 (m,5H).

Hmotnostní spektrometrie (FAB), m/z 497 [M+H]\

Analytická HPLC (Delta Pak 5μ C18 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr = 20,28 min, 99 %. Lyofilizovaná sloučenina.

-14CZ 303173 B6

Příklad 43

Η-Aib—(D)-2-Nal-g-(D)-2-Nal—formyl 5 C30H22N4O3,496 g.mol ’H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,18 a 1,36 (2m, 6H, 2 CH₃ (Aib)); 2,84 - 3,3 (m, 4H, 2 (CH₂)p); 4,7 (m, IH, CHa); 5,45 a 5,73 (2m, IH, CHct); 7,47-7,51 (m, 6H); 7,76 -8,06 (m, 11H); 8,36-9,11 (m,3H).

Hmotnostní spektrometrie (FAB), m/z 497 [M+H]⁺.

Analytická HPLC (Delta Pak 5μ C18 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr = 20,26 min, 95 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 44

H-Aib-(D)-1 -Nal-(D)-gTrp-formyl

C₂₈H3,N₅O3, 485 g.mor¹.

'HNMR(200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,15 a 1,42 (2m, 6H, 2 CH₃ (Aib)); 3,11 -3,3 a3,54-3,7 (m, 4H, 2 (CH₂)_P); 4,81 (m, IH, CH«); 5,4 a 5,74 (2m, IH, CH_a); 7,06 - 7,2 (m, 3H); 7,34 - 7,65 (m,

6H); 7,91 - 8,1 (m, 4H); 8,2 - 8,4 (m, IH); 8,55 - 9,5 (m, 3H); 10,95 (m, IH, N'H).

Hmotnostní spektrometrie (FAB), m/z 486 [M+H]⁺.

Analytická HPLC (Delta Pak 5μ C18 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, 30 gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr = 17,33 min, 92 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 45

H-Aib_(D)-2—Nal--(D)-gTrp-formyl

C28H31N5O3, 485 g.mol 'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,19 a 1,45 (2m, 6H, 2 CH₃ (Aib)); 2,93 - 3,3 (m, 4H, 2 40 (CH₂)_p); 4,71 (m, IH, CH_a); 5,35 a 5,7 (2m, IH, CH_a); 7,05 - 7,1 (m, 2H); 7,2 - 7,34 (m, 1H);

7,47 - 7,53 (m, 4H); 7,64 (m, IH); 7,78 - 8 (m, 8H); 8,48-9,37 (m, 2H); 10,88 - 11,04 (m, IH, N*H).

Hmotnostní spektrometrie (FAB), m/z 486 [M+H]⁺.

Analytická HPLC (Delta Pak 5μ Cl8 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr = 17,30 min, 95 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 46

H-Aib-(D)-Trp-g-(D)-1 -Nal-formyl

C₂,H₃,N₅O₃₍ 485 frmol *.

-15CZ 303173 Β6 ‘HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,23 a 1,41 (2m, 6H, 2 CH₃ (Aib)); 2,92 - 3,15 (m, 2H, (CH₂)_P); 3,4 - 3,6 (m, 2H, CH₂)_P); 4,63 (m, IH, CH_tt); 5,44 a 5,79 (2m, IH, CH*); 6,99-7,15 (m, 3H); 7,33 (m, IH); 7,45-8,1 (m, I IH); 8,34-9,37(m, 3H); 10,83 (m, IH).

Hmotnostní spektrometrie (FAB), m/z 486 [M+H]⁴.

Analytická HPLC (Symmetry shield 3,5μ C18 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 60 % ACN v 15 min, potom 60 až 100 % ACN ve 3 min), tr = 10,00 min, 99 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 47

H-A ib-D-T rp—g-D-2-Nal-formy 1

CmHjiNíO,, 485 g-mol¹.

'HNMR (200 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,22 a 1,43 (2m, 6H, 2 CH, (Aib)); 2,85 - 3,3 (m, 4H, 2 (CH₂)_p); 4,64 (m, IH, CH„); 5,37 a 5,72 (2m, IH, CH_ď); 6,97 - 7,13 (m, 3H); 7,32 (m, IH); 7,44 - 7,54 (m, 3H); 7,66 (d, 1H); 7,78 (m, 1H); 7,86 - 8,02 (m, 7H); 8,33 - 9,4 (m, 2H); 10,82 (m, ΙΗ,Ν'Η).

Hmotnostní spektrometrie (FAB), m/z 486 [M+H]⁺.

Analytická HPLC (Delta pak 5μ C18 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 25 min), tr - 9,00 min, 99 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 48

H-Aib-(D)-Trp-(D)-3-(^5>-gDht-formyl

C_2f,H3₂N₆O,, 476 g.mol'¹.

'HNMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,12 (s, 3H, CHj (Aib)); 1,32 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,73 (m, IH, CH₂); 2,01 (m, IH, CH₂); 2,9 (m, IH); 3,03 (tn, IH); 3,13 (m, 2H); 3,54 (m, IH); 4,47 (m, IH, CH„); 5,10 a 5,52 (2m, IH, CH„); 6,71 -8,83 (m, 16H, 5H (Tip), 4H (Dht), 3 NH (amidy), NH aNH₂ (aminy), formyl); 10,7 (m, IH, N'H).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 477,46 [M+H]⁺; 499,42 [M+Na⁺; 953,51 [2M+H]⁺.

Analytická HPLC (Delta pak 5μ C18 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr = 9,40 min, 98 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 49

H-Aib-<D)-3(/ř,5)Dht-(D)-gTrp-formyl C₂₆H,₂N₆O₃,476g.mor'.

-16CZ 303173 B6 ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,58 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,85 (m, 1H,CH₂; 2,2 (m, 1H,CH₂);

3,1 (d, 2H); 3,35 (m, 2H); 3,56 (m, IH); 3,7 (m, IH); 4,5 (m, IH, CH_a); 5,33 a 5,71 (2m, IH, CH_a ); 6,88 -8,91 (m, 16H, 5H (Trp), 4H (Dht), 3 NH (amidy), NH a NH₂ (aminy), formyl); 10,92 a 10,97 (2s, ΙΗ,Ν'Η).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), tn/z 477,33 [M+H]⁺; 499,42 [M+Na⁺]; 953,51 [2M+H]\

Analytická HPLC (Delta pak 5μ Cl8 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, io gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr - 10,35 min, 98 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 50

N(Me)-Aib-(D)-Trp-(D)-3(/?,S)“gDht-acetyl

C₂₈H₃₆N₆O₃, 504 g.mol“¹.

'H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,42 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,63 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 2,72 (m, 20 3H, acetyl); 2,4 (m, 2H, CH₂); 2,5 (m, 3H,NCH₃); 3,2-3,5 (m, 4H); 3,85 (m, IH); 4,85 (m, IH,

CH_a); 5,76 (m, IH, CH_a); 7,04 -8,86 (m, 14H, 5H (Trp), 4H (Dht), 3 NH (amidy), 2 NH (aminy)); ll,02(2s, ΙΗ,Ν'Η).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 505,31 [M+H]⁺; 527,70 [M+Na⁺],

Analytická HPLC (Delta pak 5μ Cl8 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr = 10,20 min, 98 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad51

N(Me)-Aib-<D)-3(/í5)-Dht-(D)-gTrp-acetyl

C₂₈H₃₆N₆O3, 504g.mor'.

'HNMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,58 (s, 6H, 2 CH₃ (Aib)); 1,81 (s, 3H, acetyl); 1,98 (m, IH, CH₂); 2,24 (m, IH, CH₂); 2,54 (m, 3H, NCH₃); 3,08 (d, 2H); 3,31 (m, 2H); 3,4 (m, IH); 3,59 (m, IH); 3,71 (m, IH); 4,52 (m, IH, CH_a); 5,61 (m, IH, CH_a); 6,9-8,92 (m, 14H, 5H (Trp), 4H (Dht), 3 NH (amidy), 2 NH (aminy)); 10,83 (s, IH, N^lH).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 505,43 [M+H]⁺; 527,52 [M+Na⁺],

Analytická HPLC (Delta pak 5μ Cl8 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent; H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr - 11 min, 98 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 52

N(Me)r-Aib-(D)“Trp-(D)-gTrp-fonnyl 50 C ₂₈Η₃6Νύθ3, 502 g.mol 'H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,2 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,39 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 2,29 (m, 3H,

NCH₃); 2,99 - 3,33 (m, 4H, 2 CH₂)_P); 4,68 (m, IH, CH)_a); 5,3 - 5,69 (m, IH, (CH)_a); 6,97 - 17CZ 303173 B6

7,72 (tn, 10H, 2 indoly); 7,97 (2s, IH, formyl); 8,2 - 9,47 (m, 3H, 3 NH (amidy)); 10,85 (m, 2H, 2 NH (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 503,45 [M+H].

Analytická HPLC (Symmetry shield 3,5μ Cl8 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 15 min), tr = 6,63 min, 99 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 53

N(Me)₂-Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-acetyl

C₂9H₃₆N₆O₃, 516 g.mor'.

'H NMR (200 MHz, DMSO-d⁶): 8 1,22 (s, 3H, CH, (Aib)); 1,4 (s, 3H, CH, (Aib)); 1,8 (s, 3H, acetyl); 2,28 (d, 3H, NCH,); 2,96 - 3,22 (m, 4H, 2 (CH₂)p); 4,7 (m, IH, (CH)„); 5,60 (m, IH, (CH),); 6,98 - 7,75 (m, Ι0Η, 2 indoly); 8,2 - 9,47 (m, 3H, 3 NH (amidy)); 10,84 (m, 2H, 2 NH (indoly)).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 517,34 [M+H].

Analytická HPLC (Symmetry shield 3,5μ 08 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 15 min), tr = 7,07 min, 99 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 54

H-Acc³-( D)-T rp-(D)-gT rp-formy 1

C₂6H₂₈N₆O₃, 472 g.mor¹.

'HNMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,11 a 1,5 (2m, 4H, 2 CH3 (Acc³)); 2,91 - 3,12 (m, 4H, 2 (CH2)_p); 4,6 (m, IH, CH«); 5,3 - 5,7 (2m, IH, CH_a); 6,97 - 7,17 (m, 6H, indoly); 7,32 (m, 2H, indoly); 7,62 - 7,72 (m, 2H, indoly); 7,97 (2s, IH, formyl); 8,27 - 8,92 (m, 5H, 3 NH (amidy) a NH₂ (amin)); 10,80 - 10,90 (4s, 2H, 2 N*H).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 473,22 [M+H]⁺; 495,15 [M+Na]⁺; 945,47 [2M+Hf; 967,32 [2M+Na]⁺.

Analytická HPLC (Delta Pak 5μ 08 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent; H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr = 14,20 min, 98 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 55

H-Acc⁵-(D)-Trp-(D)-gTrp-formyl

C₂óH₂gN6O₃, 472 g.mor'.

'HNMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,51 a 2,31 (m, 8H, 4 CH₂ (Acc⁵)); 2,97 - 3,18 (m, 4H, 2 (CH₂)_P); 4,64 (m, 1H, CH_a); 5,31 a 5,69 (2m, IH, CH_a); 6,96 - 7,34 (m, 8H, indoly); 7,62 - 7,74 (m, 2H, indoly); 7,96 (m, 3H, formyl a NH₂ (amin)); 8,48 - 8,96 (m, 3H, 3 NH (amidy)); 10,80 10,90 (4s, 2H,2N'H).

-18CZ 303173 B6

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 501,31 [M+H]⁺; 523,42 [M+Na]⁺; 101,37 [2M+H]⁺.

Analytická HPLC (Delta Pak 5μ Cl8 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr = 15,35 min, 98 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 56 io

H-Acc^ó-(D)-T rp-( D)-gT rp-formy 1 C₂₆H₂₈N₆O₃, 472 g.mo|·'.

'H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 1,29 a 1,57 (m, 8H, 4 CH2 (Acc⁶)); 1,89 a 2,04 (2m, 2H, CH2 (Acc⁶)); 2,95 - 3,17 (m, 4H, 2 (CH₂)p); 4,61 (m, IH, CH«); 5,3 a 5,68 (2m, IH, CH«); 6,95 7,21 (m, 6H, indoly); 7,32 (m, 2H, indoly); 7,6 (m, 2H, indoly); 7,74 (m, 2H, indoly); 7,96 (m,3H, formyl a NH₂ (amin)); 8,18 -8,67 (m, 5H, 3 NH (amidy)); 10,77 - 10,89 (4s, 2H, 2N'H).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 515,11 [M+H]⁺.

Analytická HPLC (Delta Pak 5μ Cl8 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr - 15,9 min, 97 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 57

H-Dpg-{D)-Trp-(D)-gT rp-formy I

C₂₆H₂₈N₆O₃, 530g.mo|-'.

'HNMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 0 (m, IH, Dpg); 0,40 (m, 3H, Dpg); 0,70 (m, 4H, Dpg); 1,01

- 1,51 (m, 5H, Dpg); 1,76 (m, IH, Dpg); 2,82-2,95 (m, 4H, 2 (CH₂)_P); 4,59 (m, IH, CH„); 5,3 a

5,54 (2m, IH, CH_a ); 6,81 - 7,09 (m, 6H, indoly); 7,19 (m, 2H, indoly); 7,48 (m, IH, indoly); 7,6

- 7,68 (m, 5H, IH (indoly), formyl a NH₂ (amin)); 7,83 - 8,82 (m, 3H, 3 NH (amidy)); 10,69 a

10,76 (2m,2H,2N'H).

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 531,24 [M+í]⁺.

Analytická HPLC (Delta Pak 5μ C18 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 50 min), tr - 15,35 min, 98 %. Lyofilizovaná sloučenina.

Příklad 58

H-Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-C(O)NHCH₂CH3

C_mH_2SN₇O₃, 517 g.mor‘.

'HNMR (400 MHz, DMSO-d⁶): δ 0,94 (t, 3H, NHCHjCHj); 1,01 (s, 3H, CH₃ (Aib)); 1,08 (s,

3H, CH₃ (Aib)); 1,8 (sl, 2H, NH₂); 2,95 - 3,15 (m, 6H, 2 (CH₂)_P a NHCH₂CH₃); 4,43 (m, IH,

CH„); 5,39 (m, IH, CH„); 6,02 (m, IH); 6,22 (m, IH), 6,9 - 7,56 (m, 10H, indoly); 8 (m, IH);

8,31 (m, IH); 10,77 a 10,79 (2s, 2H, 2N'H).

-19CZ 303173 B6

Hmotnostní spektrometrie (elektrorozprašování), m/z 518,4 [M+H]⁺; 540,3 [M+Na]⁺.

Analytická HPLC (Symmetry shield 3,5μ 08 100A, 1 ml/1 min, 214 nm, eluent: H₂O/ACN 0,1% TFA, gradient 0 až 100 % ACN v 15 min), tr= 7,12 min, 99 %. Lyofílizovaná sloučenina. Příklad 59 N-Me-Aib-(D)-Trp-(^D>-gTrp-C(O)NHCH2CH3

Příklad 60 H-Aib-(/?PMe-Trp-(D>-gTrp-formyl

Příklad 61 H-Aíb-(D)-Trp-(A’)-Me-gTrp-formyl

Příklad 62 H-Me-Aib-(D)-Trp~</?)-Me-gTrp-acetyl

Příklad 63 Vyhodnocení aktivity nových látek zvyšujících sekreci růstového hormonu při uvolňování růstového hormonu na krysích mláďatech

Pokusná zvířata

Byli používáni samci krys Spraguje Dawley stáří deseti dnů o hmotnosti přibližně 25 g. Mláďata byla získána pátý den po narození a byla umístěna za řízených podmínek (22 ± 2 °C, 65% vlhkost a umělé světlo od 06,00 do 20,00 hod). Podle libostí byla matkám k dispozici suchá dieta a voda. Postup experimentu

Jeden den před experimentem byla mláďata odebrána matkám a náhodně rozdělena do skupin vždy po osmi.

Mláďatům bylo subkutánně podáno 100 μΙ rozpouštědla (DMSO, konečné ředění 1 : 300 ve fyziologickém roztoku), hexarelinu (Tyr-Ala-His~D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂, použitý jako referenční léčivo) nebo nové sloučeniny (300 μί£^) a o 15 min později byla zvířata usmrcena dekapitací. Ihned byla odebrána a zcentrifugována krev. Vzorky plazmy byly uchovávány při -20 °C až do testu na zjištění koncentrací růstového hormonu v plazmě.

Koncentrace růstového hormonu v plazmě byly měřeny metodou RLA s použitím materiálů poskytnutých National Institute of Diabetes, Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) úřadu National Institute of Health USA.

Hodnoty byly vyjádřeny na základě standardu NIDDK-rat-GH-RP-2 (účinnost 21 U/mg) jako ng/ml plazmy.

Minimální detekovatelná hodnota růstového hormonu krysy byla přibližně 1,0 ng/ml a variabilita mezi jednotlivými testy byla přibližně 6 %,

Získané výsledky několika řad testů, při kterých byla zjišťována aktivita u krys in vivo, jsou uvedeny v tabulkách 1 až 10.

-20CZ 303173 B6

Tabulka 1

Přiklad	Struktura	GH ng/ml
1	H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO	158,8 ±39,4
13	H-Aib-D-Trp-gTrp-CHO	58 ± 6,3
Rozpouštědlo		15,0 ± 8,0
Hexarelin	Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	202 ± 32,7

Tabulka 2

Přiklad	Struktura	GH ng/ml
3	N-Me-Aib-D-T rp-D-gT rp-CHO	86,6 ± 12,6
4	H-Aib-D-Trp-D-gTrp-C(O)CH₃	104,7 ± 13,5
5	N-Me-Aib-D-T rp-D-gTrp-C(O)CH₃	175,5 ± 37,2
Rozpouštědlo		20,7 + 0,9
Hexarelin	T yr-Ala-His-D-Mrp-Ala-T rp-D-Phe-Lys-NH₂	134,5 ±27,2

Tabulka 3

Přiklad	Struktura	GH ng/ml
6	Pip-D-Trp-D-gTrp-CHO	109,7 ± 10,1
7	Pip-D*Trp-D-gTrp-C(O)CH₃	53,1 ± 6,6
8	Isonipekotyl-D-Trp-D-gTrp-CHO	94,2 + 8,6
9	lsonipekotyl-D-T rp-D-gT rp-C(O)CH₃	61,2 ± 10,8
19	Aib-D-Trp-gTrp-CO-CH₂-CH₃	79,8 ± 22,4
22	Aib-D-T rp-gT rp-CO-piperidin-4-yl	153,6 + 30,6
Rozpouštědlo		22,3 ± 5
Hexarelin	Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-OPhe<ys-NH₂	114,7 ±8,4

-21 CZ 303173 B6

Tabulka 4

-22CZ 303173 B6

Tabulka 7

Přiklad	Struktura	GH ng/ml
52	N(Me)₂-Aib-(D)-T rp-(D)-gT rp-formyl	121,43 ± 29
53	N (Me)₂-Aib-(D)-T rp-(D)-gT rp-acetyl	26,80 ± 5,64
Rozpouštědlo		7,89 ± 1,77
Hexarelin		172,5 ± 38,53

Tabulka 8

Přiklad	Struktura	GH ng/ml
60	H-Aib-(R)-Me-T rp-(D)-gT rp-formyl	21,02 + 3,43
61	H-Aib-(D)-Trp-(R)-Me-gTrp-formyl	52,28 ± 43,76
62	H-Me-Aib-(D)-T rp-(/?)-Me-gT rp-acetyl	171,78 ± 10,32
Rozpouštědlo		7,89 ± 1,77
Hexarelin		172,5 ±38,53

Tabulka 9

Příklad	Struktura	GH ng/ml
54	H-Acc³-(D)-T rp-(D)-gT rp-formyl	7,89 ± 3,20
55	H-Acc⁵-(D)-Trp-(D)-gT rp-formyl	11,46 ± 1,18
56	H-Acc^e-(D)-T rp-(D)-gT rp-formyl	8,49 ± 0,40
57	H-Dpg-(D)-Trp-(D)-gT rp-formyl	18,38 ±2,88
Rozpouštědlo		17,32 ± 1,70
Hexarelin		89,91 ± 3,04

-23*

Tabulka 10

Příklad	Struktura	GH ng/ml
58	H-Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-C(O)NHCH_aCH₃	376,48 ± 43,24
59	N-Me-Aib-(D)-Trp-(D)-gTrp-C(O)NHCH_aCH₃	179,53 ±24,65
Rozpouštědlo		7,89 ± 1,77
Hexarelin		172,5 ±38,53

Dále bylá zjišťována časová závislost koncentrace růstového hormonu po orálním podání psovi (1 mg/kg; per os) pro sloučeninu z příkladu 1 (H-Aib-D-Trp-D-gTrp-CHO). Byli použiti dobře vytrénovaní psi bígl obou pohlaví, >10 let, 10 až 15 kg hmotnosti. Zvířata byla krmena normální suchou stravou a vodou podle libosti a byla udržována v režimu 12 hod světla/12 hod tmy s počátkem v 7,00. Sloučenina byla podávána orálně psům, kteří hladověli od 16,00 předcházejícího dne. 20 min před podáním, v okamžiku podání a 15, 30, 60, 90, 120 a 180 min po podání byly odebírány vzorky krve. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11.

Tabulka 11

Příkl.	Jméno psa
1	DAKOTA	JORMA	RAZ DEQAN	FORREST LEE	MARKUS	TAYLOR	STŘEDNÍ HODNOTA	SEM

t (min)	Koncentrace GH (ng/ml)
-20	0,48	3,58	2,14	1,43	2,45	2,32	2,07	0,38
0	0,35	2,75	1,64	2,01	2,55	1,41	1,79	1,03
15	2,11	8,91	3,58	6,38	6,11	4,8	5,32	1,02
30	0,54	6,85	6,37	8,48	6,9	3,89	5,5	1,07
60	0,17	2,65	3,02	4,31	6,51	4,34	3,52	0,84
90	0,4	2,47	2,61	6,42	5,18	4,43	3,59	0,66
120	3,58	2,48	1,94	3,71	4,54	4,28	3,42	0,38
180	3,46	2,82	1,49	3,18	4,12	3,18	3,04	0,36

AUC	328,53	658,38	510,64	888,91	944,26	721,34	675,35	94,47

SEM = standardní odchylka AUC = oblast pod křivkou

Claims

5 1. Derivát indolu, kterým je
2. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje derivát indolu podle io nároku 1.
3. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že je v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

15
4. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že je v kombinaci s další látkou podporující sekreci růstového hormonu.
5. Použití derivátu indolu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro zvýšení hladiny růstového hormonu v plazmě u savce.
6. Použití derivátu indolu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení deficience sekrece růstového hormonu.
7. Použití derivátu indolu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení zpomalení růstu dítěte.
8. Použití derivátu indolu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení metabol ických poruch souvisejících s defíciencí sekrece růstového hormonu u subjektu.
9. Použití podle nároku 8, kde subjektem je subjekt vyššího věku.
10. Použití derivátu indolu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro podporu hojení ran, zotavování z chirurgického zákroku nebo zotavování ze zneschopňujících onemocnění.