CN105671018A - 使用了酶的蛋壳膜的溶解方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题是提供一种蛋壳膜溶解方法，其能够解决利用酸和/或碱的处理、利用蛋白质分解酶的现有处理方法所具有的问题中的至少一个，即，(1)需要粉末化、超声波处理、沸腾处理之类的前处理；(2)需要长时间的处理；(3)分解率低(约20％)。通过将蛋白质分解酶和还原剂联用，将蛋壳膜有效率地溶解。

Description

使用了酶的蛋壳膜的溶解方法

本申请为专利申请201180040001.3(申请日：2011年8月12日，发明创造名称：使用了酶的蛋壳膜的溶解方法)的分案申请。

技术领域

本发明涉及使用了酶的蛋壳膜的溶解方法。详细地说，涉及使用了蛋白质分解酶的蛋壳膜溶解方法及其用途。本申请基于2010年8月31日申请的日本专利申请第2010－195076号主张优先权，该专利申请的全部内容通过参照的方式援用于此。

背景技术

鸡肉和鸡蛋在日本国内的消耗量巨大，据称一年分别达到220万吨、250万吨。在全世界的消耗量中，鸡肉约为8300万吨，鸡蛋约为5600万吨。另一方面，还大量排出非食用部分的羽毛和蛋壳膜。羽毛和蛋壳膜的90％以上由蛋白质构成，羽毛的主要成分是角蛋白，蛋壳膜的主要成分是胶原蛋白样蛋白质。已知均大量含有半胱氨酸(约10％)、其分解物具有抗氧化作用等多种生理功能。

蛋壳膜在鸡蛋中包裹卵细胞(蛋黄)和蛋白，并与蛋壳一起将蛋黄和蛋白与外界物理性地隔离，保护鸡蛋免受有害的紫外线、氧和干燥。另外，还有防御病原菌、病毒等外来生物的感染的重要作用。此外，蛋壳膜中含有抗菌物质和溶菌酶、β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶等抗菌酶。进而，据称蛋壳膜中含有其它特殊的蛋白质，其功能性备受关注。

已知使用了蛋壳膜的各种功能物。例如，已知在烫发剂中为了保护毛发外皮层而加入蛋壳膜(日本特开2000－128744)，为了治疗创伤而在护创膏中加入蛋壳膜分解物(日本特开2003－225298)等。

现状是大部分蛋壳膜未被利用而被废弃处理。作为其理由，可举出由于是难分解性而难以处理，没有有效率的溶解方法。目前主流的蛋壳膜处理技术是基于酸和碱处理的技术，但伴有茶褐色的着色、氨基酸分解所导致的发生异臭的问题。此外，还存在因过度反应导致的有用成分低收率化的问题。作为替代技术，研究了利用蛋白质分解酶(蛋白酶)进行的处理(例如参照专利文献1～4)，但存在如下问题：(1)需要粉末化、超声波处理、沸腾处理之类的前处理；(2)需要长时间的处理；(3)分解率低(约20％)。酶反应由于在比较温和的条件下进行，所以能够期待有效成分的高收率化，但由于上述问题而没有确立实用的技术。

专利文献

专利文献1：日本特开2008－118887号公报

专利文献2：日本特开2008－061514号公报

专利文献3：日本特开平09－040564号公报

专利文献4：日本特开2008－007419号公报

发明内容

因此，本发明的课题在于提供一种能够解决以往的处理方法(利用酸、碱进行的处理，利用蛋白质分解酶进行的处理)所存在的上述问题中的至少一个问题的蛋壳膜溶解方法及其用途等。

本发明人为了解决上述课题而反复进行了深入研究。其结果发现通过将蛋白质分解酶(蛋白酶)和还原剂联用、特别是在还原剂共存的条件下使蛋白质分解酶发生作用，能够使蛋壳膜极其有效率地溶解。令人惊讶的是，显示出还能够达到对于利用了酶的以往方法而言难以达到的完全溶解，并且在采用了酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的任一种的情况下，尽管在温和的pH条件下，也看到良好的溶解。经过进一步研究，成功地确定对溶解有效的各种条件。另一方面，研究了通过本方法得到的蛋壳膜溶解物的特性，结果确认了有用物质的存在，明确了该溶解物的利用价值高。主要基于以上成果，完成了以下本发明。

[1]一种蛋壳膜溶解方法，其特征在于，将蛋白质分解酶和还原剂联用。

[2]如[1]所述的蛋壳膜溶解方法，包括在还原剂共存的条件下使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜的工序。

[3]如[1]所述的蛋壳膜溶解方法，包括以下的工序(1)和(2)：

(1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序；

(2)向所述溶剂添加还原剂和蛋白质分解酶，使之反应的工序。

[4]如[3]所述的蛋壳膜溶解方法，其中，工序(2)的反应溶液的pH为4.5～9.5。

[5]如[3]或[4]所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂的浓度为5mM～1M。

[6]如[3]～[5]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，继续所述工序(2)的反应，直至确认不到固态物。

[7]如[3]～[6]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，还包括以下的工序(3)：

(3)将工序(2)后的溶液过滤，除去固态物的工序。

[8]如[1]～[7]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶为碱性蛋白酶或中性蛋白酶。

[9]如[1]～[7]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、金属内肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸内肽酶中的一种以上的酶。

[10]如[1]～[7]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶(bacillolysin)、茎菠萝蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶以及胰蛋白酶中的一种以上的酶。

[11]如[1]～[7]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自BIOSORK、PROLEATHERFG－F、PAPAINW40、PROTEASEN、BROMELAINF、UMAMIZYMEG、THERMOASEY100、ProteAX、PROTEASES、SUMIZYMELP500、DESKINC、PROTINNY10、PROTINPC10、SUMIZYMEMP、PROTINAY以及蛋白酶K中的一种以上的酶。

[12]如[1]～[11]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂是选自亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、L－半胱氨酸、N－乙酰基－L－半胱氨酸、2－巯基乙醇、谷胱甘肽以及DTT中的一种以上的还原剂。

[13]如[1]～[11]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂为亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。

[14]如[1]所述的蛋壳膜溶解方法，包括以下的工序(1)和(2’)：

(1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序；

(2’)向所述溶剂添加还原剂而使之反应后，除去还原剂，接着添加蛋白质分解酶，使之反应的工序。

[15]一种蛋壳膜溶解剂，是将蛋白质分解酶和还原剂组合而成的。

[16]如[15]所述的蛋壳膜溶解剂，其特征在于，含有蛋白质分解酶和还原剂。

[17]如[15]所述的蛋壳膜溶解剂，其特征在于，是由含有蛋白质分解酶的第1构成组分、以及含有还原剂的第2构成组分构成的试剂盒。

[18]一种蛋壳膜溶解物，是通过[1]～[13]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法得到的。

[19]如[18]所述的蛋壳膜溶解物，其中，含有选自溶菌酶、β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素以及硫酸皮肤素中的一种以上的成分。

[20]如[18]所述的蛋壳膜溶解物，其中，显示选自抗氧化活性和血管紧张素转化酶抑制活性中的一种以上的活性。

[21]一种蛋壳膜溶解物，是通过[14]所述的蛋壳膜溶解方法得到的。

[22]如[21]所述的蛋壳膜溶解物，其中，含有赖氨酰氧化酶。

[23]如[18]～[22]中任一项所述的蛋壳膜溶解物，其中，是蛋壳膜的完全溶解物。

[24]一种组合物，含有[18]～[23]中任一项所述的蛋壳膜溶解物。

[25]如[24]所述的组合物，其中，是医药品、准医药品(quasidrug)、食品或化妆品。

[26]一种蛋壳膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i)和(ii)：

(i)采用[1]～[13]中任一项所述的方法的溶解工序；

(ii)将在所述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序。

[27]如[26]所述的蛋壳膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii)中被纯化的成分是选自溶菌酶和β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶中的酶、或者选自透明质酸、硫酸软骨素和硫酸皮肤素中的酸性粘多糖。

[28]通过[27]所述的方法得到的溶菌酶、β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素或硫酸皮肤素。

[29]一种蛋壳膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i’)和(ii)：

(i’)利用[14]所述的方法的溶解工序；

(ii)将在所述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序。

[30]如[29]所述的蛋壳膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii)中被纯化的成分为赖氨酰氧化酶。

[31]通过[30]所述的方法得到的赖氨酰氧化酶。

[32]通过[26]或[29]所述的蛋壳膜有用成分的提取方法得到的蛋壳膜提取物。

附图说明

[图1]单独使用酶制剂(BIOSORK)将蛋壳膜分解的结果。

[图2]将酶制剂(BIOSORK)和还原剂(DTT)联用而将蛋壳膜分解的结果。

[图3]表示进行了试验的还原剂的种类和有无蛋壳膜溶解(分解)的表。

[图4]表示将酶制剂(BIOSORK)和还原剂(亚硫酸钠)联用时的pH条件与溶解程度的关系的图表。

[图5]利用SDS-PAGE测得的蛋壳膜溶解物的分析结果。

[图6]表示蛋壳膜溶解中的还原剂浓度依赖性的图表。左侧是使用了BIOSORK时的结果，右侧是使用了PROLEATHERFG－F时的结果。

[图7]使用了亚硫酸钠和BIOSORK时的蛋壳膜的溶解。

[图8]使用了亚硫酸钠和PROLEATHERFG－F时的蛋壳膜的溶解。

[图9]表示蛋壳膜浓度与溶解时间的关系的图。左侧表示反应前后的蛋壳膜的状态。右侧是将在各蛋壳膜量下完全溶解所需要的时间进行标绘而得的图表。

[图10]将胃蛋白酶和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图11]将SUMIZYMELP500和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图12]将DESKINC和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图13]将PROTINNY10和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图14]将PROTINPC10和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图15]将胰蛋白酶和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图16]将SUMIZYMEMP和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图17]将PROTINAY和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图18]将蛋白酶K和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。

[图19]使用N－乙酰基－L－半胱氨酸作为还原剂时的蛋壳膜的溶解。

[图20]使用2－巯基乙醇作为还原剂时的蛋壳膜的溶解。

[图21]表示蛋壳膜溶解物中的硫酸化糖胺聚糖(GAG)含量的表。

[图22]表示蛋壳膜溶解物中的透明质酸含量的表。

[图23]表示蛋壳膜溶解物的赖氨酰氧化酶活性的图表。

[图24]表示蛋壳膜溶解物的溶菌活性的图表。

[图25]表示蛋壳膜溶解物的自由基清除活性的图表。

[图26]表示蛋壳膜溶解物的Cu²⁺还原活性的图表。

[图27]表示蛋壳膜溶解物的血管紧张素转化酶(ACE)抑制率的图表。

具体实施方式

1.蛋壳膜溶解方法

本发明的第一方面涉及蛋壳膜的溶解方法。根据本发明的方法，在避免因茶褐色的着色、氨基酸分解所导致的异臭发生的问题的同时，能够有效率地溶解蛋壳膜。此外，即使不进行前处理，也能够实现高的溶解(分解)率。

在本说明书中，所谓“蛋壳膜”是存在于鸡、鹌鹑、乌鸡、鸭、鹅、鸵鸟等鸟类的蛋的外壳内侧的膜。在本发明的溶解方法中，将蛋白质分解酶和还原剂联用而对蛋壳膜进行处理、溶解。供给处理的蛋壳膜的状态没有特别限定。例如，可以使用从外壳分离后，实施过干燥处理(日光干燥、热风干燥、真空干燥、抽吸干燥、冻干等)的蛋壳膜(干燥状态)、实施干燥处理前的蛋壳膜(湿润状态)、干燥处理后使其膨润而得的蛋壳膜(湿润状态)。此外，也可以为实施了破碎、粉碎等处理而得的蛋壳膜(例如粉末状)。另外，还可以使用在不与壳分离的状态下的蛋壳膜。

本发明中的“将蛋白质分解酶和还原剂联用”是指在利用还原剂的作用的同时使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜。只要形成能够利用这种还原剂的作用的环境，使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜的时机(时候)和使用还原剂的时机(时候)就没有受到特别限定。为了更有效率地溶解蛋壳膜，优选使还原剂的作用和蛋白质分解酶的作用得到同时发挥。典型的是，在还原剂共存的条件下使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜。在该方式中，例如，实施下面的工序(1)和(2)。

(1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序

(2)向上述溶剂中添加还原剂和蛋白质分解酶，使之反应的工序

就工序(1)中使用的溶剂而言，只要发生酶反应，就没有特别限定，但是为了容易进行pH调整以及所需的pH维持，优选使用缓冲液。在工序(2)中，还原剂和蛋白质分解酶的添加时机以及顺序没有特别限定，优选同时添加还原剂和蛋白质分解酶、或者在添加还原剂后添加蛋白质分解酶(优选迅速添加)，以使得联用效果充分地发挥。若利用前者的方法，则添加操作为1次，在操作性方面是有利的。

与上述方式不同，也可以使蛋白质分解酶作用于用还原剂处理后的蛋壳膜。在该方式的情况下，例如，实施下面的工序(1)和(2’)。应予说明，该方式特别适合于获得含有维持活性的赖氨酰氧化酶的蛋壳膜溶解物的目的。

(1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序

(2’)向上述溶剂中添加还原剂而使之反应后，除去还原剂，接着添加蛋白质分解酶，使之反应的工序

就本发明中使用的蛋白质分解酶而言，只要能够实现蛋壳膜的有效率的溶解，就没有特别限定。作为蛋白质分解酶，可以使用市售的酶制剂。若列举酶制剂的例子，则可以使用BIOSORK、NEWLASEF3－G、NEWLASEA、PROTEASEA“AMANO”G、PROTEASEN“AMANO”G、PROTEASES“AMANO”G、PAPAINW－40、BROMELAINF、PROTINNY10、PROTINPC10、PROTINAY、PROTINSD－NY10、PROTINSD－PC10F、THERMOASEPC10F、PROTINSD－AC10F、PROTINSD－AY10、PROLEATHERFG－F、PROTEASEP“AMANO”3G、PROTEASEM“AMANO”G、ProteAX(以上，天野酶公司)；MOLSINF(KIKKOMANFOODPRODUCTS公司)；SUMIZYMEAP、SUMIZYMELP、SUMIZYMELP500、SUMIZYMEFP、SUMIZYMELPL、SUMIZYMEMP(以上，新日本化学工业公司)；DENAPSIN2P、DENATYMEAP、BIOPRASEOP、BIOPRASEAL－15FG、BIOPRASE30G、BIOPRASEAPL－30、BIOPRASEOR－10G、BIOPRASE30L、BIOPRASEXL－416F、BIOPRASESP－20FG、BIOPRASESP－4FG、PROTEASECL－15(以上，NageseChemteX公司)；ORIENTASE20A、TETRASES、NUCLEICIN、ORIENTASE10NL、ORIENTASE90N、ORIENTASEONS、ORIENTASE22BF(以上，HBIEnzymes公司)；BREWERSCLAREX、VARIDASEAFP、VARIDASEFP60、BREWERSPROTEASE、ACCELERZYMENP50.000、DELVOLASE、VARIDASETSP200、BAKEZYMEPPU95.000、BAKEZYMEB500、COLLUPULINE、VARIDASEPAPAINSF、VARIDASEBROMELAIN(以上，DSMJapan)；PROTEASEYP－SS、PANTIDASENP－2、PANTIDASEP、AROASEAP－10、AROASENP－10、AROASENS、AROASEXA－10、PROTEASEAL(以上，YakultPharmaceuticalIndustry公司)；PROMOD223LP、PROTEX7L、PROTEX14L、AlkalineProteaseGL、PROTEX6L、PROTEX89L、PURAFECT、PURAFECTOX、PROPERASE、PROTEXOXG、PROTEX40L(以上，GenencorKyowa公司)、PTN、NEWTRASE、ESPERASE、SAVINASE、ALCALASE、CLEARLENSPRO、EVERLASE、KANNASE、POLARZYME、FLAVOURZYME、PROTAMEX、NOVOLAN(以上，NovozymesJapan)；PAPAINF.、TRYPSIN4.0T、COROLASEN、VERONL10、COROLASEL10、COROLASE7089、VERONW(以上，樋口商会)；ENZYLONNBS、ENZYLONSA、MAGNAXMT(以上，洛东化成工业公司)；KOKULASEP(Mitsubishi-KagakuFoods公司)；ACTINASEAS、ACTINASEAF(以上，KakenPharma公司)；GRINDAMYLPR59、GRINDAMYLPR43(以上，DaniscoJapan)；SOFTERGENM2(TaishoTechnosCo.,Ltd.)；蛋白酶K(和光纯药工业公司)；DESKINC(大和化成公司)等。

如后述的实施例所示，使用BIOSORK、PROLEATHERFG－F、PAPAINW40、PROTEASEN、BROMELAINF、UMAMIZYMEG、THERMOASEY100、ProteAX、PROTEASES时，能够在短时间内将蛋壳膜完全溶解。此外，使用SUMIZYMELP500、DESKINC、PROTINNY10、PROTINPC10、SUMIZYMEMP、PROTINAY及蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶时，也看到蛋壳膜的有效率的溶解。基于这些结果，在优选的方式中，采用从这些酶制剂或酶中选择的1种以上的酶制剂作为蛋白质分解酶。在此，在构成这些酶制剂的酶中，包括：最适pH范围为碱性且被分类为丝氨酸内肽酶的糜蛋白酶、最适pH范围为碱性且被分类为丝氨酸内肽酶的枯草杆菌蛋白酶、最适pH范围为中性且被分类为半胱氨酸内肽酶的木瓜蛋白酶、最适pH范围为中性且被分类为金属内肽酶的芽孢杆菌蛋白酶、最适pH范围为中性且被分类为半胱氨酸内肽酶的茎菠萝蛋白酶、最适pH范围为中性且被分类为氨基肽酶的亮氨酰氨基肽酶。此外，胃蛋白酶的最适pH范围为酸性且被分类为天冬氨酸内肽酶，胰蛋白酶的最适pH范围为中性且被分类为丝氨酸内肽酶。由这些事实可知，在本发明优选的一种方式中，使用选自丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、金属内肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸内肽酶中的一种以上的酶。更具体地说，使用选自糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、茎菠萝蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶以及胰蛋白酶中的一种以上的酶。另一方面，从许多碱性蛋白酶和中性蛋白酶实现了良好的溶解的事实出发(参照后述的实施例)，作为优选的一种方式，采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶。

如后述的实施例所示，当采用BIOSORK、PROLEATHERFG－F和PAPAINW40时，能够在极短的时间内将蛋壳膜完全溶解。因此，特别优选采用这些酶制剂的1种以上、或者构成这些酶制剂的酶(即，糜蛋白酶(BIOSORK的成分)、枯草杆菌蛋白酶(PROLEATHERFG－F的成分)及木瓜蛋白酶(PAPAINW40的成分))的1种以上作为蛋白质分解酶。在最优选的方式中，采用在最短时间内看到蛋壳膜完全溶解的BIOSORK或作为其成分的糜蛋白酶作为蛋白质分解酶的至少一种。

本发明中使用的蛋白质分解酶也可以不是纯化品。例如，植物提取物、动物提取物、利用微生物的培养提取物、或者它们的部分纯化物等，只要能够实现蛋壳膜的有效率的溶解，也能够作为蛋白质分解酶使用。

作为还原剂，使用例如亚硫酸盐或亚硫酸氢盐。此处的盐例如是碱金属盐或碱土金属盐或者铵盐(具体地说，是钠盐、钾盐、单乙醇胺盐等)。更优选使用亚硫酸盐(例如亚硫酸钠)。

还可以使用硫醇类或膦类作为还原剂。硫醇类的例子是半胱氨酸及其衍生物(例如N-乙酰基半胱氨酸)、半胱胺及其衍生物(作为衍生物的例子，可举出C1-C4酰基衍生物，更具体地，可举出N-乙酰基半胱胺和N-丙酰基半胱胺等)、硫代乳酸及其酯(作为硫代乳酸的酯，例如有单硫代乳酸甘油酯等)、巯基乙醇酸及其酯(作为巯基乙醇酸的酯，例如可举出单巯基乙醇酸甘油酯或单巯基乙醇酸乙二醇酯等)和硫甘油以及它们的混合物。若示出硫醇类的具体例，则为N-巯基烷基酰胺类、N-(巯基烷基)ω-羟基烷基酰胺类、N-单-或N,N-二烷基巯基-4-丁基酰胺类、氨基巯基烷基酰胺类、以及烷基氨基巯基烷基酰胺类、2－巯基乙醇。作为N-巯基烷基酰胺类，例如可以使用N-(巯基-2-乙基)葡糖酰胺、β-巯基丙酸及其衍生物、硫代苹果酸、泛酰巯基乙胺。作为N-(巯基烷基)ω-羟基烷基酰胺类，例如可以使用日本特开平2－104515号中记载的化合物。作为N-单-或N,N-二烷基巯基-4-丁基酰胺类，例如可以使用日本特开平2－196711号中记载的化合物。作为氨基巯基烷基酰胺类，例如可以使用日本特开平3－170411号中记载的化合物。作为烷基氨基巯基烷基酰胺类，例如可以使用日本特开平5－279322号中记载的化合物。

作为膦类，例如可举出三(羟基甲基)膦、三(羟基丙基)膦、双(羟基甲基)(苯基)膦、烯丙基二苯基膦、苄基二苯基膦、双(3，4，5－三甲氧基苯基)氯化膦、双(3，4，5－三甲氧基苯基)膦、苄氧基(二异丙基氨基)甲基膦、双(二异丙基氨基)氯化膦、双(2－氰基乙基)膦、双(3，5－二叔丁基苯基)氯化膦、双(3，5－二叔丁基苯基)膦、双(二乙基氨基)甲基膦、双(二乙基氨基)氯化膦、双(二乙基氨基)苯基膦、双(3，5－二甲基－4－甲氧基苯基)氯化膦、双(3，5－二甲基－4－甲氧基苯基)膦、双(3，5－二甲基苯基)氯化膦、双(3，5－二甲基苯基)二乙基氨基膦、双(3，5－二甲基苯基)膦、双(3，5－二(三氟甲基)苯基)氯化膦、双(3，5－二(三氟甲基)苯基)膦、双(4－氟苯基)氯化膦、双(2－呋喃基)氯化膦、双(2－呋喃基)膦、双(羟基甲基)苯基膦、双(4－甲氧基苯基)苯基膦、双(3，5－二甲基苯基)膦、双(3，5－二叔丁基苯基)氯化膦、双(3，5－二叔丁基苯基)膦、双(3，5－二(三氟甲基)苯基)氯化膦、双(3，5－二(三氟甲基)苯基)膦、双(4－氟苯基)氯化膦、双(4－甲氧基苯基)氯化膦、双(4－甲氧基苯基)苯基膦、双(4－甲基苯基)氯化膦、双(4－甲基苯基)膦、双(4－三氟甲基苯基)氯化膦、双(4－三氟甲基苯基)膦、双(二乙基氨基)甲基膦、双(二乙基氨基)苯基膦、双(羟基甲基)苯基膦、双(邻甲苯基)氯化膦、双(邻甲苯基)膦、双(吡咯烷基)甲基膦、丁基二氯化膦、丁基二苯基膦、叔丁基二苯基膦、环己基(二乙基氨基)氯化膦、环己基(二甲基氨基)氯化膦、环己基二氯化膦、环己基二苯基膦、2－氯乙基二苯基膦、2－(二环己基膦基)联苯、2－二环己基膦基－2'－(N，N－二甲基氨基)联苯、二乙基氨基二乙基膦、二甲基氨基二氯化膦、(4－二甲基氨基苯基)二苯基膦、N－[(二苯基氧膦基)甲基]－N－甲基苯胺、邻－二苯基膦基苯甲酸、2－甲氧基(二氯膦基)苯、4－甲氧基苯基(二乙基氨基)氯化膦、4－甲氧基苯基(二甲基氨基)氯化膦、(2－甲氧基苯基)甲基苯基膦、2－甲氧基膦基苯、(5－甲基－2－异丙基环己基)二苯基膦、三苯基膦、二烯丙基苯基膦、二苄基膦、二丁基苯基膦、二丁基膦、二环己基氯化膦、二环己基苯基膦、二环己基膦、二乙基氯化膦、二乙基苯基膦、二乙基膦、二异丁基膦、二异丙基氯化膦、二异丙基膦、二甲基(苯基)膦、二甲基(三甲基甲硅烷基)膦、二甲基氯化膦、二苯基(邻甲苯基)膦、二苯基(对甲苯基)膦、二苯基(三甲基甲硅烷基)膦、二苯基氯化膦、二苯基膦、二苯基丙基膦、二苯基乙烯基膦、二叔丁基氯化膦、二叔丁基羟基膦、二叔丁基甲基膦、二叔丁基苯基膦、二叔丁基膦、二乙烯基苯基膦、乙基二氯化膦、乙基二苯基膦、异丙基二氯化膦、甲氧基二乙氧基膦、甲基二氯化膦、甲基二苯基膦、甲基苯基氯化膦、苯基膦、丙基二氯化膦、叔丁基双(三甲基甲硅烷基)膦、叔丁基二氯化膦、叔丁基二乙基膦、叔丁基二苯基膦、叔丁基膦、三(间甲苯基)膦、三(邻甲苯基)膦、三(对甲苯基)膦、三环己基膦、三环戊基膦、三乙基膦、三异丁基膦、三异丙基膦、三甲基膦、三正丁基膦、三正辛基膦、三丙基膦、三(1－萘基)膦、三(2，4，6－三甲基苯基)膦、三(2，6－二甲氧基苯基)膦、三(2－羰基乙基)膦、三(2－氰基乙基)膦、三(2－呋喃基)膦、三(2－甲氧基苯基)膦、三(2－三乙基)膦、三(3，5－二甲基－4－甲氧基)膦、三(3－氯苯基)膦、三(3－氟苯基)膦、三(3－甲氧基苯基)膦、三(3－甲氧基丙基)膦、三(4－氯苯基)膦、三(4－氟苯基)膦、三(4－甲氧基苯基)膦、三(4－吗啉基)膦、三(羟基甲基)膦、三(三甲基甲硅烷基)膦、三[3，5－双(三氟甲基)苯基]膦、三－叔丁基膦、2－氰基乙基二苯基膦、2－二环己基膦基－2’－甲基联苯、双(2，4，6－三甲基苯基)膦、2－(二叔丁基膦基)联苯等。

在优选的一种方式中，采用通过其使用而可看到良好溶解的还原剂(参照后述的实施例)，即亚硫酸盐(例如亚硫酸钠)、亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠)、L－半胱氨酸、L－半胱氨酸盐酸盐、N－乙酰基－L－半胱氨酸、2－巯基乙醇、谷胱甘肽(可以使用含有谷胱甘肽的酵母提取物)或DTT。应予说明，只要能获得本发明所需要的作用和效果，则也可以将2种以上的还原剂联用。

工序(2)的反应优选在弱酸性pH～弱碱pH条件下(具体是pH4.5～9.5)进行。更优选在中性pH条件下进行。此处的中性pH条件下是指pH为6.0～8.0。优选在pH调整为7.0～7.5的反应液中进行反应。

工序(2)的反应的时间可以在例如10分钟～24小时的范围内任意设定。根据本发明的方法，由于进行有效率的溶解，所以能够在短时间内将蛋壳膜溶解。优选以能够实现蛋壳膜的完全溶解的方式设定反应时间。为了提高反应效率，也可以加以搅拌、振荡等。

对于温度条件也没有特别的制约，在对使用的蛋白质分解酶的作用没有抑制的范围下进行设定即可。若举出温度条件的例子，则为30℃～80℃。优选的温度条件为40℃～70℃。

就蛋白质分解酶的使用量(添加浓度)而言，只要能够进行蛋壳膜的有效率的溶解，就没有特别限定。最佳的使用量一般根据使用的酶的种类不同而异，但是例如，使用反应液中的蛋白水解酶的浓度成为0.01％(W/W)～20％(W/W)的量的酶。反应液中的蛋白质分解酶的浓度优选为0.1％(W/W)～20％(W/W)，更优选为0.1％(W/W)～10％(W/W)。

只要充分获得与蛋白质分解酶的联用效果，则还原剂的使用量也没有特别限定。最佳的使用量一般根据使用的还原剂的种类不同而异，但是例如，使用反应液中的还原剂的浓度成为5mM～1M的量的还原剂。反应液中的还原剂的浓度优选为10mM～500mM，更优选为50mM～500mM。

就最佳条件(pH、反应时间、温度、酶使用量、还原剂使用量等)而言，若参考本说明书的教导事项，则可以通过预实验来容易地确定。

应予说明，以上的各种条件也适合工序(2’)的反应。

如后述的实施例示出的实验结果所证明，利用本发明的方法时，尽管操作简便，但也能够实现蛋壳膜的完全溶解。“蛋壳膜的完全溶解”是指蛋壳膜被分解到至少通过目视确认不到固态物的程度。在本发明的方法中，“蛋壳膜的完全溶解”不是必需的，但在蛋壳膜中的有用成分能够不浪费地提取这点、不需要残渣的除去等这点等上，优选以实现“蛋壳膜的完全溶解”的方式设定条件。因此，在本发明的一种方式中，继续工序(2)(或(2’))的反应，直至确认不到固态物。与此相反，在本发明的另一方式中，以固体成分残存的状态结束工序(2)(或(2’))，然后，过滤溶液，除去固体成分(工序(3))。该方式在例如为了获取容易分解或失活的成分方面是有用的。

2.蛋壳膜溶解剂

本发明的第2方面涉及蛋壳膜溶解剂。本发明的蛋壳膜溶解剂的特征点在于：是将蛋白质分解酶和还原剂组合而成的。换言之，在本发明的蛋壳膜溶解剂中，将蛋白质分解酶和还原剂联用。典型的是，本发明的蛋壳膜溶解剂被以将蛋白质分解酶和还原剂混合而成的配合剂的形式提供。另一方面，例如，也可以以由含有蛋白质分解酶的组分(第1构成组分)以及含有还原剂的组分(第2构成组分)构成的试剂盒的形式提供本发明的蛋壳膜溶解剂。还可以将2种以上的蛋白质分解酶联用。同样地也可以将2种以上的还原剂联用。应予说明，对于蛋白质分解酶和还原剂，由于与本发明的蛋壳膜溶解方法的情况相同，所以省略重复的说明。

就本发明的蛋壳膜溶解剂而言，除了含有有效成分(蛋白质分解酶和/或还原剂)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

3.蛋壳膜溶解物及含有其的组合物

本发明的进一步的方面是提供通过本发明的蛋壳膜溶解方法得到的蛋壳膜溶解物。作为优选的一种方式，提供蛋壳膜的完全溶解物。根据本发明的蛋壳膜溶解方法，能够在温和的条件下将蛋壳膜溶解。因此，利用该方法得到的蛋壳膜溶解物大量含有在蛋壳膜中含有的有用成分(蛋白质(包括赖氨酰氧化酶、溶菌酶、β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶等酶、胶原蛋白)、糖蛋白、肽(包括胶原蛋白肽)、糖肽、氨基酸、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等酸性粘多糖等)。在一种方式中，利用本发明的方法得到的蛋壳膜溶解物含有选自溶菌酶、β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素以及硫酸皮肤素中的一种以上的成分。此外，利用本发明的方法得到的蛋壳膜溶解物通过显示抗氧化活性和/或显示血管紧张素转化酶抑制活性而能被赋予特征。另一方面，另外一种方式的蛋壳膜溶解物的特征点是含有赖氨酰氧化酶。含有赖氨酰氧化酶的该蛋壳膜溶解物典型的是采用包括上述工序(1)和(2’)的蛋壳膜溶解方法而得到。

本发明还提供含有蛋壳膜溶解物的组合物。本发明的组合物的用途没有特别限定，优选为医药品、准医药品、食品或化妆品。即，作为优选的方式，本发明提供含有蛋壳膜溶解物的医药组合物、准医药组合物、食品组合物以及化妆品组合物。作为本发明的医药组合物和准医药组合物的用途或效果的例子，可举出抗氧化、抗菌、抗炎症、创伤治疗、降血压、毛发生长、营养补充。

本发明的医药组合物和准医药组合物的制剂化可以依照常法来进行。进行制剂化时，可以含有制剂上容许的其它成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、镇痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羰甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羰甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为镇痛剂，可以使用苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

进行制剂化时的剂型也没有特别限定，例如可以以片剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、注射剂、外用剂以及栓剂等的形式提供本发明的医药组合物或准医药组合物。

本发明的医药组合物中含有为了获得所期待的治疗效果、预防效果所必需的量(即治疗上有效量)的有效成分。同样地，本发明的准医药组合物中含有为了获得所期待的治疗效果、预防效果所必需的量的有效成分。本发明的医药组合物或准医药组合物中含有的有效成分量一般根据剂型、形式不同而异，但是将有效成分量以能够达到所需的给药量的方式，在例如约0.1重量％～约95重量％的范围内进行设定。

本发明的医药组合物和准医药组合物根据其剂型、形式而通过经口或非经口(静脉内、动脉内、皮下、肌肉、或腹腔内注射、经皮、经鼻、经粘膜、涂布等)方式应用于对象。此处的“对象”没有特别限定，包括人以及人以外的哺乳动物(包括动物宠物、家畜、实验动物。具体为例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴子、牛、猪、山羊、绵羊、狗、猫、鸡、鹌鹑等)。在优选的一种方式中，应用对象是人。

本发明的医药组合物和准医药组合物的给药量、使用量以能获得所期待的效果的方式设定。在有效给药量的设定中，一般考虑应用对象的症状、年龄、性别、体重等。应予说明，只要是本领域技术人员，就能够考虑这些情况而设定适当的给药量。作为给药时间表，可以采用例如一天一次～数次、二天一次、或者三天一次等。在给药时间表的制作方面，可以考虑应用对象的症状、有效成分的效果持续时间等。

如上所述，本发明的一种方式是含有通过本发明的蛋壳膜溶解方法得到的蛋壳膜溶解物的食品组合物。作为本发明中的“食品组合物”的例子，可举出普通食品(谷类、蔬菜、食用肉、各种加工食品、点心类、牛奶、清凉饮用水、酒精饮料等)、营养补充食品(以抗氧化、抗菌、抗炎症、创伤治疗、降血压、防老化等为目的的补充物或营养饮料等)、食品添加物。在为营养补充食品或食品添加物时，可以以粉末、颗粒、片剂、糊、液体等形状提供。通过以食品组合物的形式提供由本发明的蛋壳膜溶解方法得到的蛋壳膜溶解物，能够日常摄取蛋壳膜溶解物，或者持续地摄取蛋壳膜溶解物。

蛋壳膜溶解物的添加量能够根据目的而任意地设定。例如，在对本发明的食品组合物期待有助于维持或增进健康或者治疗或预防特定的疾病、病症的效果时，优选含有足以发挥该效果的量的蛋壳膜溶解物。添加量可以考虑食品的种类、食品的消费者(性别、年龄、体重等)、对食品所期待的效果等来确定。

如上所述，本发明的一种方式是含有通过本发明的蛋壳膜溶解方法得到的蛋壳膜溶解物的化妆品组合物。本发明的化妆品组合物可以通过配合蛋壳膜溶解物与在化妆品中通常使用的成分、基材(例如，各种油脂、矿物油、凡士林、角鲨烷、羊毛脂、蜂蜡、改性醇、棕榈酸糊精、甘油、脂肪酸甘油酯、乙二醇、对羟基苯甲酸酯、樟脑、薄荷醇、各种维生素、氧化锌、氧化钛、苯甲酸、依地酸、洋甘菊油、角叉菜胶、甲壳质粉、壳聚糖、香料、着色料等)而得到。作为化妆品组合物的形式，可以例示脸或身体用的乳液、化妆水、膏、乳液(lotion)、精华液、油、美容涂敷剂(pack)、美容贴膜(sheet)、清洁剂等。化妆品组合物中的蛋壳膜溶解物的添加量没有特别限定。例如，可以以成为0.1重量％～60重量％的方式添加蛋壳膜溶解物。作为本发明的化妆品组合物的用途或效果的例子，可举出保湿、浸润、防止皮肤粗糙、美肌、防止皱纹、防止下垂、防止老化。

除了上述以外，本发明的蛋壳膜溶解物还可以在金属离子的回收、保湿剂、吸水剂、抗菌剂、毛发生长剂等方面使用。

4.蛋壳膜有用成分的提取方法

本发明还提供应用了本发明的蛋壳膜溶解方法的蛋壳膜有用成分的提取方法。在本发明的蛋壳膜有用成分的提取方法中，进行以下的工序(i)和(ii)。

(i)基于本发明的蛋壳膜溶解方法的溶解工序

(ii)将上述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序

在工序(ii)中，适当组合过滤、离心处理、脱盐、硫酸铵沉淀等盐析、透析、各种色谱(离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱等)等来进行纯化。作为纯化目标的有用成分，可例示溶菌酶、赖氨酰氧化酶、β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶等酶、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等酸性粘多糖。也可以阶段性地纯化，获取2种以上的有用成分。

采用本发明的方法得到的蛋壳膜有用成分与蛋壳膜溶解物的情况相同，可以用作在医药品、食品、化妆品等中使用或添加的成分。

实施例

1.利用蛋白质分解酶的蛋壳膜溶解的研究

将鸡蛋打破后取出蛋液，然后将带蛋壳膜的蛋壳在4重量％的乙酸水溶液中浸渍5～10分钟左右，用手剥离蛋壳膜并取之。使用如下的蛋壳膜：将剥取的蛋壳膜进行水洗，并充分去除水分。

以蛋壳膜为基质，研究利用现有酶制剂能否将蛋壳膜溶解。使用市售的15种酶制剂(NEWLASEF3G、PROTEASEM、PROTEASEN、PROTEASEP3G、PROTEASES、BROMELAINF、PROLEATHERFG－F、肽酶R、UMAMIZYMEG、THERMOASEY100、ProteAX、PROTEASEA、PAPAINW40、PANCREATIN8AP、BIOSORK)，在各种pH条件下(pH4.0～13.0)进行反应。各pH范围的缓冲液如下所述。pH4.0、5.0使用100mM的NaOAc缓冲液，pH6.0使用100mM的MES-NaOH缓冲液，pH7.0使用100mM的HEPES-NaOH缓冲液，pH8.0使用100mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.0～12.0使用100mM的甘氨酸-NaOH缓冲液，pH13.0使用100mM的KCl-NaOH缓冲液。酶量为0.1％(w/v)，蛋壳膜量为1.0％(w/v)，反应温度为60℃，孵育72小时。图1表示使用BIOSORK作为试验酶制剂时的结果。如该结果所示，即使进行了72小时反应，在目视上也无法确认蛋壳膜的溶解(分解)。其它的14种酶制剂在目视上也未见溶解。

2.基于蛋白质分解酶和还原剂共存的蛋壳膜溶解的研究

由于单独使用酶制剂时未见蛋壳膜的溶解，所以研究了与还原剂组合所带来的效果。在本试验中，使用BIOSORK和PROLEATHERFG-F作为对象酶制剂。使用100mM的甘氨酸-NaOHpH9.0作为缓冲液，在添加了10mMDTT或未添加的条件下尝试溶解。酶量为0.1％(w/v)，蛋壳膜量为1.0％(w/v)，反应温度为60℃，进行孵育。图2表示使用BIOSORK作为试验酶制剂时的结果。如图2所示，单独使用DTT和单独使用酶制剂时未见蛋壳膜的溶解，但在DTT与酶制剂共存的条件下在1.5小时这样的短时间内就看到溶解。此外，使用PROLEATHERFG-F时也获得同样的结果，完全溶解所需的时间比BIOSORK长(约2小时)。认为是还原剂使构成蛋壳膜的蛋白质中存在的二硫键开裂，结果变得容易溶解。此外，认为由于溶解被作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的PMSF所抑制，所以该试验中的蛋壳膜的溶解是由蛋白酶所致的。

3.基于蛋白质分解酶和还原剂(食品添加物)共存的蛋壳膜溶解的研究

考虑安全性和成本，从食品添加物中探索能进行蛋壳膜的溶解的还原剂。首先，使用BIOSORK作为试验酶制剂，分别添加10种还原剂(亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、L－抗坏血酸、L－半胱氨酸盐酸盐、亚硝酸钠、硝酸钠、L－半胱氨酸、谷胱甘肽、DTT、硼氢化钠、HITHIONEXTRACTYH-8、HITHIONEXTRACTYH-15、HITHIONEXTRACTYH-D12)，尝试溶解。亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、L－抗坏血酸、亚硝酸钠、硝酸钠、DTT、硼氢化钠的试验浓度为1、10、100mM。L－半胱氨酸盐酸盐、L－半胱氨酸、谷胱甘肽的试验浓度为1、10、20、50mM。HITHIONEXTRACTYH-8、HITHIONEXTRACTYH-15、HITHIONEXTRACTYH-D12的试验浓度为1、5、10％(w/v)。缓冲液的pH条件分别在4.0～13.0下进行，并使用与前述相同的缓冲液。酶量为0.1％或0.5％(w/v)，蛋壳膜量为1.0％(w/v)，反应温度为60℃，孵育6小时或12小时。在亚硫酸钠存在的条件下基于pH变化的分解能力的比较中，亚硫酸钠的浓度为100mM，使用pH4.0～13.0的各缓冲液(100mM)进行试验。在使用了BIOSORK和PROLEATHERFG-F的试验中，pH4.0～5.5使用NaOAc缓冲液，pH5.5～6.5使用MES-NaOH缓冲液，pH6.5～7.5使用HEPES-NaOH缓冲液，pH7.5～9.0使用Tris-HCl缓冲液，pH9.0～12.5使用甘氨酸-NaOH缓冲液，pH12.5～13.0使用KCl-NaOH缓冲液。在使用了其它的13种酶制剂的试验中，使用NaOAc缓冲液(pH4.0、5.0)、MES-NaOH缓冲液(pH6.0)、HEPES-NaOH缓冲液(pH7.0)、Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.0)进行。酶量为0.1％(w/v)，蛋壳膜量为1.0％(w/v)，反应温度为60℃，进行孵育，测定完全溶解所需的时间。在分解模式的确认中，以BIOSORK和PROLEATHERFG-F为对象酶制剂，在各pH条件下以最终浓度成为1mM的方式向反应后的溶液中添加PMSF，从而使反应停止，将各样品提供给SDS-PAGE分析。图3表示试验还原剂的种类和添加所致的蛋壳膜溶解(分解)的有无。在食品添加物中，亚硫酸盐和亚硫酸氢盐在100mM的浓度条件下显示出显著的效果。使用亚硫酸钠时，在pH6.0～8.0下看到蛋壳膜被效率良好地溶解。使用L-半胱氨酸时，看到部分溶解。

接着，在亚硫酸钠存在的条件下，进行基于pH变化的分解能力的比较。图4表示使用BIOSORK时的结果，横轴表示反应pH，纵轴表示蛋壳膜完全溶解所需的时间。横轴的反应pH不是调整时的pH，而是表示实际反应时的pH。表1示出调整时的pH与反应时的pH的对应表。

[表1]

如图4所示，在亚硫酸钠存在的条件下，在pH6.0～8.0之间发生效率良好的溶解。以BIOSORK为代表并包括PROLEATHERFG-F在内的其它9种酶制剂也在pH7.0附近看到蛋壳膜的有效率的溶解。表2示出在各酶制剂的最适pH条件下按蛋壳膜溶解快慢的顺序排列而成的表。

[表2]

	产品名	所需时间*
			1	BIOSORK	1小时15分钟
2	PROLEATHER FG-F	2小时
			2	PAPAIN W40	2小时
4	PROTEASE N	3小时
			5	BROMELAIN F	4小时45分钟
6	UMAMIZYME G	5小时
			7	THERMOASE Y100	5小时30分钟
8	ProteAX	7小时15分钟
			8	PROTEASE S	7小时15分钟
10	PANCREATIN 8AP	＞12小时

*在最佳条件下的所需时间

已知亚硫酸钠的还原作用在pH7.0附近增高，本次的结果与该见解一致。另一方面，BIOSORK的最适pH为10.5～11.5，但在这些pH条件下未见溶解。因此，可以说蛋壳膜的溶解在很大程度上依赖于还原剂的效果。

关于看到蛋壳膜溶解的样品，通过添加PMSF而使BIOSORK或PROLEATHERFG-F失活后，提供给SDS-PAGE分析(图5)。溶解产物的分子量分布在3.5～25kDa，其大部分为6kDa附近。此外，在14kDa附近确认有浓的条带。

4.蛋壳膜溶解中的亚硫酸钠浓度依赖性

在蛋壳膜溶解中，进行最佳亚硫酸钠浓度的探索。在本试验中，使用BIOSORK和PROLEATHERFG-F作为对象酶制剂。使用50mM的Tris-HClpH7.0作为缓冲液，在添加了10～1000mM的亚硫酸钠或未添加的条件下尝试溶解。酶量为0.1％(w/v)，蛋壳膜量为1.0％(w/v)，反应温度为60℃，进行孵育，测定完全溶解所需的时间。如图6所示，对于BIOSORK、PROLEATHERFG-F均最佳的亚硫酸钠浓度为200mM。另一方面，还可确认在10～1000mM的宽广浓度条件下都能够溶解。应予说明，分别在图7和图8中示出使用BIOSORK和PROLEATHERFG-F时的蛋壳膜的溶解结果。

5.蛋壳膜溶解中的酶浓度依赖性

在蛋壳膜溶解中，进行最佳酶浓度的探索。在本试验中，使用BIOSORK作为对象酶制剂。使用50mM的Tris-HClpH7.0作为缓冲液，在添加了200mM的亚硫酸钠的条件下尝试溶解。酶量为0.01、0.1、1.0％(w/v)，蛋壳膜量为10％(w/v)，反应温度为60℃，进行孵育，测定完全溶解所需的时间。此外，从本试验开始，在孵育中进行搅拌。如表3所示，使用BIOSORK时，在1.0％浓度下以45分钟完全溶解，在0.1％浓度下以60分钟完全溶解。另一方面，在0.01％浓度下未见溶解。尽管从本试验开始使蛋壳膜量为10％(w/v)，但溶解时间也比1％(w/v)时缩短。认为可能是搅拌的影响大。关于使用的酶量，可以说1.0％和0.1％并没有那么大的差异。考虑到成本时，认为在0.1％下使用更有效率。

[表3]

酶浓度	时间
		0。01％	24小时以上
0.1％	60分钟
		1.0％	45分钟

6.伴随着蛋壳膜量变化的溶解时间

使蛋壳膜的量变化，验证能够溶解多少量。在本试验中，使用BIOSORK作为对象酶制剂。使用50mM的Tris-HClpH7.0作为缓冲液，在添加了200mM的亚硫酸钠的条件下尝试溶解。酶量为0.1(w/v)，蛋壳膜量为10～50％(w/v)，反应温度为60℃，进行孵育，测定完全溶解所需的时间。此外，在本试验中，也在孵育中进行搅拌。如图9左所示，即使为10～50％的蛋壳膜量，也能完全溶解。另外，图9右表示伴随着蛋壳膜量的溶解时间的图表。横轴表示蛋壳膜量，纵轴表示溶解所需的时间，将在各蛋壳膜量下完全溶解所需的时间进行标绘。对于10～40％的蛋壳膜量而言，标绘在直线上，由此显示以相同的效率进行分解反应。

7.在还原剂共存的条件下能够溶解蛋壳膜的蛋白酶的探索

在15种市售酶制剂中，对于10种酶制剂，在还原剂、特别是亚硫酸钠共存的条件下看到蛋壳膜的溶解。这10种酶制剂中包括中性和碱性蛋白酶。在本实验中，为了证实酸性蛋白酶带来的蛋壳膜的分解能力，使用多种酸性蛋白酶来验证有无分解能力。此外，还平行地进行了使用了新的中性和碱性蛋白酶的实验。

以以下的酶制剂作为研究对象。

(1)酸性蛋白酶：SUMIZYMEAP(来源于黑曲霉(Aspergillusniger)的酸性蛋白酶、新日本化学)、胃蛋白酶(Sigma)

(2)中性蛋白酶：SUMIZYMEFP(来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)的中性蛋白酶，新日本化学)、SUMIZYMELP500(来源于米曲霉的中性蛋白酶，新日本化学)、SUMIZYMELPL(来源于米曲霉的中性蛋白酶，新日本化学)、DESKINC(来源不清楚，中性蛋白酶，大和化成)、PROTINNY10(来源于枯草杆菌(Bacillussubtilis)的中性蛋白酶，大和化成)、PROTINPC10(来源于枯草杆菌的中性蛋白酶，大和化成)、胰蛋白酶(Roche)

(3)碱性蛋白酶：SUMIZYMEMP(来源于曲霉属(Aspergillussp.)的碱性蛋白酶，新日本化学)、PROTINAY(来源于地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)的碱性蛋白酶，大和化成)、蛋白酶K(Roche)

作为添加的还原剂，使用亚硫酸钠(关东化学株式会社)，以最终浓度成为100mM的方式进行添加。作为缓冲液，在酸性pH条件(pH4.5或pH4.7)下使用100mM的NaOAc缓冲液，在中性pH条件(pH7.0或pH7.5)下使用100mM的Tris-HCl缓冲液，在碱性pH条件(pH9.0或pH8.7)下使用100mM的甘氨酸-NaOH缓冲液。以最终浓度为0.1％(w/v)的方式进行酶的添加。在50℃下进行24小时孵育，调查有无蛋壳膜的溶解。

用胃蛋白酶(图10)时，在还原剂共存的条件下在酸性pH条件下可看到显著的溶解。关于胃蛋白酶，虽然未达到完全溶解，但认为只要使添加的酶量增加，就能够完全溶解。关于中性蛋白酶，在SUMIZYMELP500(图11)、DESKINC(图12)、PROTINNY10(图13)、PROTINPC10(图14)、胰蛋白酶(图15)中，在还原剂共存的条件下看到蛋壳膜的溶解。关于碱性蛋白酶，在SUMIZYMEMP(图16)、PROTINAY(图17)、蛋白酶K(图18)中看到溶解。

由上述的结果可以证明：只要在还原剂共存的条件下，酸性蛋白酶也能够实现蛋壳膜的溶解。因此，可以说在与还原剂共存的条件下，用酸性、中性、碱性的任意蛋白酶均能够实现蛋壳膜的溶解。此外，作为在还原剂共存的条件下能够实现蛋壳膜的溶解的中性和碱性蛋白酶，新发现8种酶制剂。

8.新的还原剂候补的探索

如上所述，显示出添加还原剂对于利用蛋白酶的有效率的蛋壳膜溶解是有效的。至此为止，作为能够实现蛋壳膜的溶解的还原剂，确认有亚硫酸钠(关东化学株式会社)、亚硫酸氢钠(和光纯药工业)、L-半胱氨酸(SigmaAldrich)、DTT(和光纯药工业)这4种。以下，使用多种还原剂重新进行溶解试验。

在本试验中，使用BIOSORK和PROLEATHERFG-F作为对象酶制剂。添加的酶量为0.1％(w/v)。使用100mM的Tris-HClpH7.0和100mM的甘氨酸-NaOHpH9.0作为缓冲液。作为还原剂，试验了(1)N-乙酰基-L-半胱氨酸(和光纯药工业)、(2)2-巯基乙醇(和光纯药工业)、(3)巯基乙醇酸(和光纯药工业)、(4)巯基硫酸钠(和光纯药工业)、(5)巯基脲(和光纯药工业)这5种。以最终浓度为1、10、100mM的方式添加各还原剂，在50℃下孵育24小时，调查有无蛋壳膜的溶解。

试验的5种还原剂中，在添加N-乙酰基-L-半胱氨酸(图19)时以及添加2-巯基乙醇(图20)时，BIOSORK和PROLEATHERFG-F均看到蛋壳膜的溶解。关于N-乙酰基-L-半胱氨酸，仅达到部分溶解，但认为只要使添加的酶量增加，就能够实现完全溶解。使用2-巯基乙醇作为还原剂时，能够实现完全溶解。已知N-乙酰基-L-半胱氨酸和2-巯基乙醇均切断二硫键，由此启示蛋壳膜的溶解中二硫键的切断是重要且有效的。

9.蛋壳膜溶解物中的酸性粘多糖的鉴定

已知蛋壳膜中除了胶原蛋白样蛋白质以外，还存在硫酸皮肤素、硫酸软骨素之类的硫酸化糖胺聚糖(GAG)、以及透明质酸。这些酸性粘多糖被用于关节病的治疗、发挥保水性的化妆品中。因此，只要在采用本方法得到的蛋壳膜溶解物中能确认这些多糖类，就可以提高其利用价值。因此，在本实验中，使用此次得到的蛋壳膜溶解物，尝试进行硫酸化GAG和透明质酸的鉴定。

首先，制备蛋壳膜溶解物。通过在含有10％(w/v)的蛋壳膜的反应溶液(50mM的Tris-HClpH7.0、100mM的亚硫酸钠)中添加酶制剂来溶解蛋壳膜。作为酶制剂，使用蛋白酶K(Roche)、BIOSORK、PROLEATHERFG-F、PAPAINW40，以蛋白酶K的最终浓度为0.01％(w/v)、其它酶制剂的最终浓度为0.1％(w/v)的方式进行添加。添加酶制剂后，在50℃下边搅拌边孵育12小时，将蛋壳膜完全溶解。作为对照，制备不含蛋壳膜的样品(含有酶制剂和还原剂)。

使用各样品尝试硫酸化GAG的鉴定。作为检测硫酸化GAG的常规方法，可举出比色法(Farndale,etal.(1986)Biochim.Biophys.Acta.883,173-177.)和HPLC法(日本特开平4－135496号公报)，但从通用性、简便性、使用功效等出发，采用使用1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)的比色法。1,9-DMMB的吸收波长在未与硫酸化GAG反应的状态下为595nm，与此相对，与硫酸化GAG反应后变成525nm。因此，525nm的测定值越大，含有越多量的硫酸化GAG。使用已知浓度的硫酸软骨素(2.5、5、7.5、10、15、20μg/ml)作为标准样品来制作标准曲线，测定各样品的525nm的值，从而算出硫酸化GAG含量。测定次序是：将1mL的1,9-DMMB溶液(16mg1,9-DMMB(Biochemica)、3.0g甘氨酸、2.37gNaCl、95mL0.1NHCl、904mLH₂O)和40μL的样品混合，搅拌后，利用酶标仪(microplatereader)测定525nm的值。

各样品中的透明质酸的鉴定使用市售的透明质酸测定试剂盒(生化学工业株式会社)来进行。本试剂盒的原理是利用了透明质酸结合性蛋白质(HABP)的抑制法，能够特异性地检测透明质酸。

图21示出利用各酶制剂进行了处理的蛋壳膜溶解物中的硫酸化GAG含量。该含量是每单位蛋壳膜质量中的含量，该蛋壳膜的质量使用酶制剂处理前测定的值。此外，各样品的含量是减去对照值而得的值。如图21所示，明确了通过本实验得到的蛋壳膜溶解物中含有硫酸化GAG(含量是每单位蛋壳膜重量中0.53～5.4％(w/w))。

图22示出蛋壳膜溶解物中的透明质酸含量。该含量也是每单位蛋壳膜重量中的含量，而且是减去对照值而得的值。如该结果所示，明确了各蛋壳膜溶解物中含有透明质酸(含量是每单位蛋壳膜重量中0.026～0.11％(w/w))。

如上所述，明确了通过本蛋壳膜溶解方法(蛋白酶和还原剂的联用)得到的蛋壳膜溶解物中存在硫酸化GAG、透明质酸之类的酸性粘多糖。如前所述，酸性粘多糖的利用价值高。因此，可以说该溶解物的利用价值非常高。

10.蛋壳膜溶解物中的赖氨酰氧化酶活性的鉴定

已知蛋壳膜中存在赖氨酰氧化酶(EC1.4.3.13)。该酶通过将蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基氧化性地脱氨基而生成醛(蒜素残基)，参与胶原蛋白、弹性蛋白等蛋白质的交联反应。该交联反应是对于表皮的弹性、伸展性等功能表达以及组织构建来说不可或缺的特异性过程。因此，只要能够从通过本方法得到的蛋壳膜溶解物中鉴定到赖氨酰氧化酶活性，就进一步提高其利用价值。因此，在本实验中，使用蛋壳膜溶解物来尝试赖氨酰氧化酶活性的检测。

首先，在将还原剂和蛋白酶联用的条件下制备蛋壳膜溶解物。通过在含有10％(w/v)的蛋壳膜的反应溶液(100mM的PBS缓冲液pH7.4、100mM的亚硫酸钠)中添加酶制剂来溶解蛋壳膜。作为酶制剂，使用蛋白酶K(Roche)、BIOSORK、PROLEATHERFG-F、PAPAINW40，以蛋白酶K的最终浓度为0.01％(w/v)、其它酶制剂的最终浓度为0.1％(w/v)的方式添加。添加酶制剂后，在50℃下边搅拌边孵育12小时，将蛋壳膜完全溶解。作为对照，制备不含蛋壳膜的样品(含有酶制剂和还原剂)。接着，向溶解物溶液中添加正丁基胺并使得最终浓度为10mM，在37℃下孵育60分钟。此时，只要赖氨酰氧化酶在溶解物中存在，则正丁基胺受到氧化反应而成为正丁基醛。该正丁基醛是使用Nash试剂(15％(w/v)乙酸铵、0.5％(w/w)乙酸、20％(w/w)乙酰基丙酮、Nash,etal.(1953)Biochem.J.55,416.)检测出的。具体地说，将Nash试剂和样品等量混合，在50℃下孵育30分钟，则反应液中的正丁基醛与Nash试剂反应而生成黄色的显色物质，所以能够在388nm下进行检测。也就是说，388nm的值越大，赖氨酰氧化酶的活性越高。使用孵育后的样品，利用酶标仪测定388nm的值。

接着，对蛋壳膜进行还原剂处理后，除去该还原剂，然后进行经蛋白酶处理的蛋壳膜溶解物的制备。首先，将约500mg的蛋壳膜添加到5mL的还原剂溶液(100mMPBS缓冲液pH7.4、100mM亚硫酸钠)中，在37℃下孵育1小时。然后，取出蛋壳膜，用50mL的蒸馏水清洗5次，最后用500mL的蒸馏水清洗，从而将亚硫酸钠除去。轻轻地除去清洗后的蛋壳膜的水分，添加含有0.1％(w/v)的BIOSORK的溶液(100mMPBS缓冲液pH7.4)5mL，在37℃下进行孵育。在各时间(0、1、2、3、4、6小时)回收200μL的样品，测定各样品的赖氨酰氧化酶活性。向各样品中添加100mM的正丁基胺(最终浓度10mM)20μL，在37℃下孵育45分钟。然后，添加220μL的Nash试剂，在50℃孵育30分钟后，用酶标仪测定388nm的值。

对于将还原剂和蛋白酶联用时的蛋壳膜溶解物而言，在任何样品中都无法确认赖氨酰氧化酶活性。赖氨酰氧化酶为氧化酶，有可能因还原剂而失活。特别地，认为通过蛋白酶分解而在溶液中游离的赖氨酰氧化酶可能很大地受到还原剂的影响。另一方面，对蛋壳膜进行了还原剂处理后，除去还原剂，接着进行了蛋白酶处理的蛋壳膜溶解物中可以确认赖氨酰氧化酶活性(图23)。另外，该活性伴随着蛋白酶处理的时间经过而增大。在对照中未检测出赖氨酰氧化酶活性，所以可以说该活性是来源于蛋壳膜的赖氨酰氧化酶的活性。使用未进行还原剂处理的蛋壳膜进行酶处理时，也确认有赖氨酰氧化酶活性，但其活性是进行了还原剂处理时的一半～三分之一左右。因此，可以说蛋壳膜的还原剂处理对于赖氨酰氧化酶的有效率的回收是有效的。

如上所述，经过(1)蛋壳膜的还原剂处理、(2)还原剂的除去、(3)蛋白酶处理这3个工序，能够有效率地回收赖氨酰氧化酶。

11.蛋壳膜溶解中的溶菌(抗菌)活性的鉴定

蛋壳膜中存在溶菌酶(EC3.2.1.17)、β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.96)等具有溶菌(抗菌)活性的酶。只要在通过本方法得到的蛋壳膜溶解物中存在这些酶，就能够扩大该溶解物的利用范围。在该实验中，使用蛋壳膜溶解物来验证有无溶菌活性。

首先，制备蛋壳膜溶解物。通过在含有10％(w/v)的蛋壳膜的反应溶液(100mM的PBS缓冲液pH7.0、100mM的亚硫酸钠)中添加酶制剂来溶解蛋壳膜。作为对象酶制剂，使用BIOSORK、PROLEATHERFG-F、PAPAINW40，以最终浓度成为0.5％(w/v)的方式添加。添加酶制剂后，在37℃下边搅拌边孵育12小时，将蛋壳膜完全溶解。作为对照，制备不含蛋壳膜的样品(含有酶制剂和还原剂)。

溶菌活性测定常用藤黄微球菌(Micrococcusluteus，和光纯药工业)作为底物试验菌。以最终浓度成为0.32mg/mL的方式用100mM的PBS缓冲液pH7.0悬浮该菌体粉末。将10μL的各蛋壳膜溶解物样品添加到微孔板(Nunc)，然后将240μL的上述菌体悬浮液添加到各样品中。添加后立刻测定450nm的值，然后开始37℃下的孵育，每10分钟测定450nm的值。伴随着溶菌，悬浮液的澄清度增加，所以450nm的值减少。也就是说，450nm的值减少得越快，溶菌活性越高。

如图24所示，用任意酶制剂进行了处理的蛋壳膜溶解物都看到溶菌活性。虽然程度不同，但是明确了其溶菌活性。由于在对照中全然未见溶菌活性，所以可以说该活性是来源于蛋壳膜的。

由以上的结果可知，通过本方法得到的蛋壳膜溶解物中存在具有溶菌活性的酶，认为该酶是溶菌酶或β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶中的任一者，或者这两种酶。

12.蛋壳膜溶解物的抗氧化能力

已知在癌、生活习惯病、身体老化中，活性氧、自由基、过氧化脂质等的氧化应激是主要原因。作为防止氧化应激的抗氧化物质，利用维生素C、维生素E、β-胡萝卜素等，另一方面，来源于蛋白质的抗氧化肽从其安全性方面出发也受到注目。特别地，像谷胱甘肽这样具有半胱氨酸残基的肽显示出高的抗氧化能力。构成蛋壳膜的氨基酸中约10％为半胱氨酸(胱氨酸)，所以可期待其溶解物具有高的抗氧化能力。在本实验中，对于通过本方法得到的蛋壳膜溶解物，为了探索其作为具有抗氧化能力的原材料的可能性，测定其抗氧化活性。

首先，制备蛋壳膜溶解物。通过在含有10％(w/v)的蛋壳膜的反应溶液(100mM的PBS缓冲液pH7.0、100mM的亚硫酸钠)中添加酶制剂，将蛋壳膜溶解。作为对象酶制剂，使用BIOSORK、PROLEATHERFG-F、PAPAINW40，以最终浓度成为0.5％(w/v)的方式进行添加。添加酶制剂后，在37℃下边搅拌边孵育12小时，将蛋壳膜完全溶解。作为对照，制备不含蛋壳膜的样品(含有酶制剂和还原剂)。

对于抗氧化能力的测定，对使用了测定自由基清除能力的DPPH(1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼)的须田郁夫的方法(《食品的功能性手册集》，16，农林水产技术会议，食品综合研究所编，1999)进行改变后进行。即，在微孔板中添加5μL的各样品，进而添加245μL的0.5mMDPPH-EtOH溶液后，在2分钟后在520nm下测定吸光度。通过使用1.0mMTrolox(抗氧化物质)作为标准试剂，从而以Trolox当量(μmolTrolox当量/100g)表示各样品的抗氧化活性。以100g表示的质量是蛋壳膜的质量，使用在溶解反应前测定的值。

接着，基于铜还原的抗氧化能力的测定使用抗氧化能力测定试剂盒“PAO”(日本老化控制研究所)进行。该铜还原能力试验是利用了铜离子的还原反应(Cu²⁺→Cu⁺)的抗氧化力试验。

通过上述两种方法得到的各蛋壳膜溶解物样品的抗氧化活性的值使用减去对照的值而得的值。

如图25所示，明确了用各酶制剂进行了处理的蛋壳膜溶解物具有自由基清除活性。其值对于BIOSORK溶解物、PROLEATHERFG-F溶解物、PAPAINW40溶解物分别为678.3、521.7、415.2μmolTrolox当量/100g。进而，如图26所示，也可以确认铜的还原活性。各样品的值对于BIOSORK溶解物、PROLEATHERFG-F溶解物、PAPAINW40溶解物分别为3617.1、2090.8、2816.8μmol/L，显示出较高的值。

如上所述，可以确认通过本方法得到的蛋壳膜溶解物具有较高的抗氧化能力。因此，可以说该溶解物作为具有抗氧化能力的功能性原材料是有用的。

13.蛋壳膜溶解物的ACE抑制活性

人的血压调节机构中血管紧张素转化酶(ACE)具有极其重要的作用。ACE是在作为血压调节机制之一的肾素-血管紧张素系中，从血管紧张素I生成具有升压作用的血管紧张素II等，与血压上升密切相关的酶。近年来，大量销售以预防高血压为目的的功能食品(特定保健用食品)等，具有ACE抑制作用的食品成分备受关注。因此，在本实验中，对于通过本方法得到的蛋壳膜溶解物，为了探索作为具有降压作用的原材料的可能性，测定其ACE抑制活性。

首先，制备蛋壳膜溶解物。在含有10％(w/v)的蛋壳膜的反应溶液(100mM的PBS缓冲液pH7.0、100mM的亚硫酸钠)中添加酶制剂，将蛋壳膜溶解。作为对象酶制剂，使用BIOSORK、PROLEATHERFG-F、PAPAINW40，以最终浓度成为0.5％(w/v)的方式进行添加。添加酶制剂后，在37℃下边搅拌边孵育12小时，将蛋壳膜完全溶解。作为对照，制备不含蛋壳膜的样品(含有酶制剂和还原剂)。

对得到的蛋壳膜溶解物进行100℃、5分钟的热处理(蛋白酶失活)后，用蒸馏水稀释25倍，使用ACE抑制活性测定试剂盒“ACEKit-WST”(和光纯药工业)来测定ACE抑制活性。本试剂盒通过酶法检测从3-羟基丁酰基甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(3HB-GGG)中切出来的3-羟基丁酸(3HB)、是简便且重现性高的ACE抑制活性测定试剂盒。通过本方法得到的各蛋壳膜溶解物样品的ACE抑制活性是减去对照的值而得的值。

如图27所示，明确了蛋壳膜溶解物具有较高的ACE抑制能力。其抑制率对于BIOSORK溶解物、PROLEATHERFG-F溶解物、PAPAINW40溶解物分别为72.4％、74.5％、63.6％。

由以上结果可知，通过本方法得到的蛋壳膜溶解物具有ACE抑制活性，所以可以说作为具有降压作用的材料而言利用价值高。

产业上的可利用性

根据本发明的方法，能够在温和的条件下有效率地溶解蛋壳膜。即，在能量成本、原料成本方面具有很大的优点。此外，利用本发明的方法得到的蛋壳膜溶解物能够用于例如医药领域、食品领域、化妆品(也包括护肤的概念)、金属离子的回收、保湿剂、吸水剂、抗菌剂、乳化剂、毛发生长剂等。除此之外，也设想为了赋予各种作用(抗菌作用、吸水/保湿作用、流变学调整作用、覆盖保护作用等)而使用本发明的蛋壳膜溶解物。还设想使高分子材料等中含有本发明的蛋壳膜溶解物，而使原材料的伸缩性提高。

本发明不受上述发明的实施方式以及实施例说明的任何限定。在不脱离专利请求保护的范围的记载的情况下，本领域技术人员能够容易想到的范围内的各种变型方式也都包括在本发明中。

对于在本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等的内容，通过援引的方式引用其全部内容。

Claims (32)

1.一种蛋壳膜溶解方法，其特征在于，将蛋白质分解酶和还原剂联用。

2.如权利要求1所述的蛋壳膜溶解方法，其中，包括在还原剂共存的条件下使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜的工序。

3.如权利要求1所述的蛋壳膜溶解方法，其中，包括以下工序(1)和(2)：

(1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序；

(2)向所述溶剂添加还原剂和蛋白质分解酶，使之反应的工序。

4.如权利要求3所述的蛋壳膜溶解方法，其中，工序(2)的反应溶液的pH为4.5～9.5。

5.如权利要求3或4所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂的浓度为5mM～1M。

6.如权利要求3～5中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，继续所述工序(2)的反应，直至确认不到固态物。

7.如权利要求3～6中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，还包括以下的工序(3)：

(3)将工序(2)后的溶液过滤、除去固态物的工序。

8.如权利要求1～7中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶为碱性蛋白酶或中性蛋白酶。

9.如权利要求1～7中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、金属内肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸内肽酶中的一种以上的酶。

10.如权利要求1～7中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、茎菠萝蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的一种以上的酶。

11.如权利要求1～7中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自BIOSORK、PROLEATHERFG－F、PAPAINW40、PROTEASEN、BROMELAINF、UMAMIZYMEG、THERMOASEY100、ProteAX、PROTEASES、SUMIZYMELP500、DESKINC、PROTINNY10、PROTINPC10、SUMIZYMEMP、PROTINAY以及蛋白酶K中的一种以上的酶。

12.如权利要求1～11中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂是选自亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、L－半胱氨酸、N－乙酰基－L－半胱氨酸、2－巯基乙醇、谷胱甘肽以及DTT中的一种以上的还原剂。

13.如权利要求1～11中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂为亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。

14.如权利要求1所述的蛋壳膜溶解方法，其中，包括以下的工序(1)和(2’)：

(1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序；

(2’)向所述溶剂添加还原剂而使之反应后，除去还原剂，接着添加蛋白质分解酶，使之反应的工序。

15.一种蛋壳膜溶解剂，是将蛋白质分解酶和还原剂组合而成的。

16.如权利要求15所述的蛋壳膜溶解剂，其特征在于，含有蛋白质分解酶和还原剂。

17.如权利要求15所述的蛋壳膜溶解剂，其特征在于，是由含有蛋白质分解酶的第1构成组分、以及含有还原剂的第2构成组分构成的试剂盒。

18.一种蛋壳膜溶解物，是通过权利要求1～13中任一项所述的蛋壳膜溶解方法得到的。

19.如权利要求18所述的蛋壳膜溶解物，其中，含有选自溶菌酶、β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素和硫酸皮肤素中的一种以上的成分。

20.如权利要求18所述的蛋壳膜溶解物，其中，显示选自抗氧化活性和血管紧张素转化酶抑制活性中的一种以上的活性。

21.一种蛋壳膜溶解物，是通过权利要求14所述的蛋壳膜溶解方法得到的。

22.如权利要求21所述的蛋壳膜溶解物，其中，含有赖氨酰氧化酶。

23.如权利要求18～22中任一项所述的蛋壳膜溶解物，其中，是蛋壳膜的完全溶解物。

24.一种组合物，含有权利要求18～23中任一项所述的蛋壳膜溶解物。

25.如权利要求24所述的组合物，其中，是医药品、准医药品、食品或化妆品。

26.一种蛋壳膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i)和(ii)：

(i)利用权利要求1～13中任一项所述的方法的溶解工序；

(ii)将在所述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序。

27.如权利要求26所述的蛋壳膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii)中被纯化的成分是选自溶菌酶和β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶中的酶，或者选自透明质酸、硫酸软骨素和硫酸皮肤素中的酸性粘多糖。

28.通过权利要求27所述的方法得到的溶菌酶、β－N－乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素或硫酸皮肤素。

29.一种蛋壳膜有用成分的提取方法，其特征在于，包括以下的工序(i’)和(ii)：

(i’)利用权利要求14所述的方法的溶解工序；

(ii)将在所述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序。

30.如权利要求29所述的蛋壳膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii)中被纯化的成分为赖氨酰氧化酶。

31.通过权利要求30所述的方法得到的赖氨酰氧化酶。

32.通过权利要求26或29所述的蛋壳膜有用成分的提取方法得到的蛋壳膜提取物。