JP6056064B2

JP6056064B2 - 卵殻膜成分を含むインスリン抵抗性改善剤ならびにそれを用いた組成物

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Application number: JP2013247189A
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Inventors: 順子跡見; 美穂清水; 長谷部　由紀夫; 由紀夫長谷部
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Description

本発明は、卵殻膜成分、たとえば可溶性卵殻膜成分（卵殻膜加水分解物等）または卵殻膜含有粉末もしくは微粉末を含有するインスリン抵抗性改善剤およびその応用に関する。

卵殻膜（以下「ＥＳＭ」ということがある）は、鶏卵などの鳥類の卵の卵殻の内側にある膜で、抗菌性および抗微生物活性を有し、発生中の胚を感染から保護している。卵殻膜は、Ｉ型、Ｖ型およびＸ型コラーゲン、グルコサミン、デスモシンおよびヒアルロン酸を主成分とした強靭な繊維性のタンパク質等よりなる網目状の構造を有している。これらのタンパク質は、システインを含むものが多く、酸、アルカリ、プロテアーゼに対し比較的安定で、水に不溶である。そのため、鶏卵卵殻膜は、食品産業における副産物としてほとんどが利用されずに廃棄されていたが、皮膚の再生を促進する働きや、特に胎児性コラーゲンとも称されるIII型コラーゲンの生成を促進させる作用を有することが知られており、生体に対する有効性が注目され始めている。

皮膚のコラーゲンは、加齢により減少することが知られている。本発明者らは、人工ポリマーに結合したアルカリ加水分解卵殻膜（以下「ＡＳＥＳＭ」ということがある)上に培養したヒト皮膚線維芽細胞では、真皮に近い状態の条件（細胞がまばらに存在する条件）で、III型コラーゲン（type III collagen）、デコリン（decorin）、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（matrix metalloproteinase-2；以下「ＭＭＰ２」）が、同条件のコラーゲンコートおよび細胞培養ディッシュ上で培養した場合に比較して、有意に高いことを報告した(非特許文献１：Ohto-Fujita et al, 2011)。

糖尿病は、一生つきあわなければならない慢性疾患で、膵臓がインスリンをほとんど作れないために若年性に発症する１型と、肥満、ストレス、喫煙、運動不足などが引き金となって発症する後天的に罹患する２型糖尿病とがある。国際糖尿病連合のまとめ（http://www.idf.org/diabetesatlas/）によると、成人（２０〜７９歳）における世界の糖尿病人口は、２０１２年時点で約３億７，１００万人とみられ、糖尿病有病率は約８．３％に上る。今後も増え続け、２０３０年には約５億５，２００万人、約９．９％に達する。世界の糖尿病人口ランキングで、日本は７１０万人で世界第９位、うち糖尿病の診断を受けていない人が３５１万人いると推定されている（１位中国、２位インド、３位米国、４位ブラジル、５位ロシア、６位メキシコ、７位インドネシア、８位エジプト）。アジア人は、少しの肥満や運動不足で糖尿病を発症してしまう倹約遺伝子をもつため、発症リスクが高いと報告されている（非特許文献２：Diabetes Care, February 2011 vol.
34 no. 2 353-357）。

糖尿病は無症状で進行する場合が多く、気付かないうちに病状がすすんでしまっている場合が多い。したがって、食事・運動だけでなく予防的に働くサプリメントの登場が望まれる。糖尿病が進行すると、免疫機能の低下により感染しやすくなる、白内障が進行しやすくなる、皮膚症状として傷が治りにくくなるなどの他、合併症として糖尿病性神経障害、網膜症、腎障害をともない、ＱＯＬが低下する。糖尿病は心臓病や脳血管障害発症の危険因子でもあり、死因の間接的要因になっている。１９７１年から１９８０年のデータで、糖尿病患者は、日本人一般の平均寿命と比べ、男性で約１０年、女性では約１５年の寿命の短縮が認められた（非特許文献３：Sakamoto N, et al., Tohoku J Exp Med 141(Suppl) : 631, 1983）。

高血糖は、生体のタンパク質を非酵素的に糖化し、タンパク質本来の機能を損うことによって障害が発生する。この糖化による影響は、例えば血管の主要構成成分であるコラーゲンや水晶体蛋白クリスタリンなど寿命の長いタンパク質ほど大きな影響を受ける（非特許文献４：Ulrich P, Cerami
A. Recent Prog Horm Res.
2001;56:1-21. Review.）。例えば白内障は老化によって引き起こされるが、血糖が高い状況ではこの老化現象がより高度に進行することになる。同様のメカニズムにより動脈硬化や微小血管障害も進行する。また、糖化反応により生じたフリーラジカル等により酸化ストレスも増大する。

核内受容体であるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）は、チアゾリン系（ＴＺＤ）糖尿病改善薬が２型糖尿病患者のインスリン抵抗性を改善する際に、メディエーターとして機能している（非特許文献５：Saltiel AR, Olefsky
JM, 1996）。したがって、ＰＰＡＲγ発現は、インスリン感受性を改善し、糖尿病治療効果をもたらす。生活習慣病予防および改善に寄与するＰＰＡＲγ−レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）核内受容体による脂肪細胞ミトコンドリア脱共役タンパク質ＵＣＰ−１遺伝子の転写の促進には、コアクチベーターＰＧＣ−１αが必要である（非特許文献６：Puigserver P, et al.,
1998;非特許文献７：Puigserver P, Spiegelman BM, 2003)）。脂肪細胞におけるＵＣＰ発現は、生活習慣病予防および改善に寄与する。ＰＧＣ１α発現は、ミトコンドリア生合成を促進し、抗肥満効果・寿命延長効果をもたらすが、上流シグナルとしてＳｉｒｔ１が関わっていると考えられる（非特許文献８：Qiu X., et
al., 2010b)）。２型糖尿病の進行に伴い、血中に炎症性サイトカインが増加することが知られており（非特許文献９：Wellen KE, Hotamisligil
GS. J Clin Invest. 2005 May;115(5):1111-9. Review.）、ＩＬ−１ｂｅｔａとＩＬ−６の組み合わせ（非特許文献１０：Spranger J, Kroke A, Mohlig
M, Hoffmann K, Bergmann MM, Ristow M, Boeing H,
Pfeiffer AF. Diabetes. 2003 Mar;52(3):812-7.）、また最近のメタ解析でもＩＬ−６とＣＲＰが２型糖尿病の発症と深く関係していることが報告されている（非特許文献１１：Wang X, Bao
W, Liu J, Ouyang YY, Wang D, Rong S, Xiao X, Shan ZL, Zhang Y, Yao P, Liu LG.
Diabetes Care. 2013 Jan;36(1):166-75. doi: 10.2337/dc12-0702. Review.）

卵殻膜は、以下のサイトカイン類を標的として作用し、抗炎症作用を発揮することが報告されている：ＩＬ−１１、ＩＬ−１ａｌｐｈａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＮＦκＢ、ＩＬ−７、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＭＩＰ−１ｂｅｔａ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３ｂｅｔａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦａｌｐｈａ及びＶＥＧＦ（特許文献１）。

しかし、卵殻膜成分の作用メカニズムや生活習慣病関連タンパク質の効率的な作用増強方法は十分にわかっていなかった。また、複数の生活習慣病関連遺伝子を、皮膚および全身で同時に発現制御して身心の健康に寄与する物質は、これまでに知られていない。

米国特許公開公報ＵＳ２００７０１７８１７０Ａ１

Ohto-Fujita et al, Cell Tissue Res. 2011 July; 345(1): 177−190 DiabetesCare, February 2011 vol. 34 no. 2 353-357 SakamotoN, et al: The features of causes of death in Japanese diabetics during theperiod 1971-1980. Tohoku J Exp Med 141(Suppl) : 631, 1983 UlrichP, Cerami A. Protein glycation,diabetes, and aging. Recent Prog HormRes. 2001;56:1-21. Review. Saltiel AR, OlefskyJM. Thiazolidinediones in the treatment of insulin resistance and type II diabetes.Diabetes. 1996;45:1661-1669.PMid:20150512. Puigserver P, Wu Z, Park CW, GravesR, Wright M, Spiegelman BM. A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptivethermogenesis. Cell. 1998;92:829-839. Puigserver P, Spiegelman BM. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha (PGC-1 alpha): transcriptional coactivator and metabolic regulator. Endocr Rev. 2003 Feb;24(1):78-90. Review. PubMed PMID: 12588810. Qiu X., Brown K. V., Moran Y., Chen D. (2010b). Sirtuin regulation in calorie restriction. Biochim. Biophys. Acta 1804, 1576-1583. doi: 10.1016/j.bbapap.2009.09.015. WellenKE, Hotamisligil GS. Inflammation, stress, anddiabetes. J Clin Invest. 2005 May;115(5):1111-9.Review. SprangerJ, Kroke A, Mohlig M,Hoffmann K, Bergmann MM, Ristow M, Boeing H, PfeifferAF. Inflammatory cytokines and the risk to develop type 2 diabetes: results ofthe prospective population-based European Prospective Investigation into Cancerand Nutrition (EPIC)-Potsdam Study. Diabetes. 2003 Mar;52(3):812-7. Wang X,Bao W, Liu J, Ouyang YY, Wang D, RongS, Xiao X, Shan ZL, Zhang Y, Yao P, Liu LG. Inflammatory markers and risk oftype 2 diabetes: a systematic review and meta-analysis. Diabetes Care.2013 Jan;36(1):166-75. doi: 10.2337/dc12-0702. Review.

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、安全性が高く、日常的に簡便な方法で利用でき、細胞に働きかけるインスリン抵抗性改善剤、特に複数の生活習慣病関連遺伝子の同時活性化剤、およびこれを用いた、単一素材で複合的な効果をもち生体を良好な状態に維持および／または改善することのできる医薬および／または化粧品組成物、食品（サプリメント）、食品添加物などの応用を提供することを課題とする。

本発明者らは、卵殻膜成分が皮膚などの細胞に働きかけて各種生活習慣病関連遺伝子を活性化することを見出し、本発明を完成した。

したがって、上記課題は以下の本発明により達成される。すなわち、本発明のインスリン抵抗性改善剤は、卵殻膜成分、特に卵殻膜含有粉末または可溶性卵殻膜成分（たとえば卵殻膜の加水分解物）を含有することを特徴とする。

本発明のインスリン抵抗性改善剤の一実施形態は、使用される卵殻膜含有粉末が微粉末であって、卵殻膜含有微粉末の体積平均粒子径が６μｍ以下であること、および／または体積最大粒子径が２０μｍ以下であることが好ましい。

本発明のインスリン抵抗性改善剤の一実施形態は、ＰＰＡＲγ、ＵＣＰ、ＰＧＣ１αのうちの１以上の遺伝子の発現調節剤である。

本発明のインスリン抵抗性改善剤の一実施形態は、経口組成物用、外用組成物用、食品（サプリメント）、食品添加物用、再生医療用（幹細胞、ｉＰＳ細胞など）、基盤材料用のうちの少なくともいずれか１つの用途で利用されることが好ましい。

本発明の医薬または化粧品組成物などの身体に対して使用する組成物は、本発明のインスリン抵抗性改善剤とともに賦形剤を含有することが好ましい。その場合、生活習慣病予防または改善用の外用組成物または生活習慣病予防または改善用の経口組成物とするのが好ましい。卵殻膜成分は、外用組成物においては可溶性卵殻膜成分、経口用組成物においては卵殻膜含有粉末であることが好ましい。本発明の医薬組成物の一実施形態としては、錠剤が好ましい。

本発明の経口用組成物の他の実施形態は、卵殻膜成分を５〜４０％の割合で含有することが好ましい。外用組成物の実施形態では、可溶性卵殻膜成分を１〜８０％の割合で含有することができ、１〜４０％の割合で含有することが好ましい。

本発明の食品添加物は、本発明のインスリン抵抗性改善剤からなる、またはそれを含有することを特徴とする。また、本発明の食品は、この食品添加物が添加されることを特徴とする。

本発明によれば、可溶性卵殻膜または卵殻膜含有粉末等の卵殻膜成分を含有するインスリン抵抗性改善剤、およびその応用を提供することができる。本発明のインスリン抵抗性改善剤によれば、生活習慣病関連遺伝子発現を調節し適度に活性化するための、副作用の危険性がないまたは非常に低い、極めて安全な手段が提供される。本発明のインスリン抵抗性改善剤は、通常は廃棄されている鶏卵卵殻膜を有効に利用し、煩雑な工程を必要とせずに製造することができるため、高い収率で簡便に製造することができ、経済的および環境保護の観点からも有利である。

また、本発明のインスリン抵抗性改善剤は、適用対象や目的に応じて適当な組成物とすることにより、機能性食品、予防薬・治療薬等の医薬品などとして広く応用されることができる。これらの態様の組成物は、塗布または摂取等の方法で日常的に容易に利用することができ、簡便に安全に皮膚の水分量・弾力性などの機械的・物理的・化学的特性を向上させることができる。本発明のインスリン抵抗性改善剤は、複数の生活習慣病関連遺伝子を、皮膚を含む全身で同時に活性化ないし制御することができるので、（１）適度な生活習慣病関連遺伝子発現促進に基づく、全身の活性化による健康維持・改善、（２）「なんとなく不調」というようなホメオスタシス範囲からのわずかな逸脱の改善、（３）ターゲット細胞／組織の疾病の直接的な改善、（４）コンディショニング効果を利用した医療現場での各種治療との併用による疾病の早期回復、抗がん剤等の薬物の副作用予防、（５）複数の身体的な不備を同時に改善するバッファー機能、（６）スポーツなどによる身体疲労による怪我の予防および回復促進等の効果を奏することができる。さらに、本発明のインスリン抵抗性改善剤は、刺激性がなく、様々な形態で種々の成分と併用することができるので、さらなる全身効果を得るために他の栄養（食品）、美容成分と併用したり、特定の効果に特化した組成物に応用したりすることができる。

図１は、マウスにおいて経口投与されたトリチウム標識卵殻膜含有粉末消化吸収産物の血中放射能濃度を時間経過にしたがって示す図である。図２は、卵殻膜がコアクチベーターＰＧＣ−１に作用し、生活習慣病の改善及び予防に寄与するメカニズムを説明する図である（Knutti D, Kralli A. PGC-1, a versatile coactivator. Trends Endocrinol Metab. 2001 Oct;12(8):360-5. Review. PubMed PMID:11551810.を元に改変）。

（インスリン抵抗性改善剤）
本発明のインスリン抵抗性改善剤は、卵殻膜成分を有効成分とする。卵殻膜成分としては、卵殻膜そのもの、卵殻膜の加工物、抽出物等のいずれであってもよく、たとえば卵殻膜含有粉末または可溶性卵殻膜成分（加水分解物等）を利用することができる。

本発明に使用される卵殻膜成分を構成する卵殻膜は、陸生の卵生動物すべての卵、特に鳥類の卵の卵殻の内側にある膜（外卵殻膜および／または内卵殻膜および／または限界膜）であればいずれも使用できる。そのうちでも、特に、鶏卵の卵殻膜が、入手の容易性、コストなどの点から好ましく用いられる。

（本発明において使用される可溶性卵殻膜成分）
本発明に使用される卵殻膜成分は、卵殻膜の可溶性成分、たとえば卵殻膜の分解または抽出物であることができる。卵殻膜加水分解物は、公知の方法、たとえば卵殻膜をアルカリ性含水有機溶媒中で分解後、得られた分解液を中和、濾過することを特徴とする可溶化卵殻膜の製法（特公平６−２１０４７号公報）、卵殻膜をタンパク分解酵素で処理することを特徴とする水溶性卵殻膜の製造法（特公平７−１１０２１０号公報）、アルカリ性含水有機溶媒中で加水分解後に陰イオン交換樹脂で処理する方法（特許第５１７９８４７号公報）、米国特許第８２１１４７７号公報（発明の名称：Solubilized protein composition obtained from eggshell membrane）に記載のアルカリ加水分解法およびそれらの改変法にしたがって製造することができる。

アルカリ加水分解以外の方法として、可溶性卵殻膜は、たとえば、ピクリン酸−ペプシン処理法（Takahashi K, Shirai K, Kitamura M, Hattori M.
Soluble egg shell membrane protein as a regulating
material for collagen matrix reconstruction. Biosci Biotechnol Biochem. 1996 Aug;60(8):1299-302））、酸−ペプシン加水分解による方法（F. Yi, J. Yu, Z. X. Guo, L. X. Zhang, and Q.
Li, “Natural bioactive
material: a preparation of soluble eggshell membrane protein,” Macromolecular Bioscience, vol. 3, no. 5, pp. 234−237, 2003; F. Yi, Z. X. Guo, L. X. Zhang,
J. Yu, and Q. Li, “Soluble eggshell membrane protein:
preparation, characterization and biocompatibility,” Biomaterials, vol. 25, no. 19, pp. 4591−4599, 2004; Jun Jia, Geng
Liu, Jian Yu, and Yuanyuan Duan.
2012. Preparation and characterization of soluble eggshell membrane protein/PLGA electrospun nanofibers for guided tissue regeneration membrane. J. Nanomaterials
2012, Article 25 (January 2012), 1 pages. DOI=10.1155/2012/282736 http://dx.doi.org/10.1155/2012/282736））、Ｓ−Ｓ結合の還元およびトリプシン処理による方法（Kodali VK, Gannon
SA, Paramasivam S, Raje S, Polenova T, Thorpe C. A novel
disulfide-rich protein motif from avian eggshell membranes. PLoS One. 2011 Mar 30;6(3):e18187. doi: 10.1371/journal.pone.0018187）などに基づいて製造することができる。

卵殻膜の代わりに、後述する卵殻膜含有粉末を用いてこれらの方法により可溶性卵殻膜成分を製造してもよい。

卵殻膜分解物は、市販のものを利用することができる。たとえば、キューピー（Kewpie
Corporation, Tokyo, Japan)の卵殻膜加水分解物、商品名「ＥＭＰＲＯＴＥＩＮ‐Ｐ」を使用することができる。

（本発明において使用される卵殻膜含有粉末）
本発明において使用される卵殻膜含有粉末は、少なくとも卵殻膜を含む粉末であれば特に制限はないが、卵殻膜含有微粉末であって、体積平均粒子径が６μｍ以下であることが好ましい。また、本発明において使用される卵殻膜含有微粉末は、体積最大粒子径が２０μｍ以下であることが好ましい。なお、本願明細書において、粉末または微粉末の「体積平均粒子径」および「体積最大粒子径」は、レーザー回折式粒度分布測定機（ＬＭＳ−３０、株式会社セイシン企業製）を用いて測定した値を意味する。ここで、「体積平均粒子径」は、粒度分布における小粒径側からの累積値が５０％における粒子径を意味する。また、卵殻膜含有粉末または微粉末の粒子径の測定に際しては、卵殻膜含有粉末または微粉末を、界面活性剤を用いて水に分散させた測定試料を用いる。なお、「粉末」は粒子のサイズにかかわらずあらゆる粉体を指し、「微粉末」は粉末のうち最大粒子径および／または平均粒子径が概ね１００μｍより小さいものを指すが、厳密な区別を意図するものではない。

卵殻膜含有微粉末の体積平均粒子径が６μｍ以下、または、体積最大粒子径が２０μｍ以下となるように、卵殻膜含有微粉末の粒度分布を制御することにより、７０メッシュあるいは１５０メッシュで分級処理して得られた従来の卵殻膜粉末（最大粒子径で１００〜２００μｍの卵殻膜粉末）よりも更に消化吸収効率およびインスリン抵抗性改善の効率を向上させることができる。

このような効果が得られる理由は定かではないが、以下のように推定される。一般的に、粒径が小さくなるほど、粒子の単位体積当たりの表面積はより大きくなる。このため、粒子が消化液に対して可溶性または易溶性の物質のみから構成されるのであれば、粒径が小さくなるに従い消化吸収効率が改善され、その結果、インスリン抵抗性改善の効率が向上するものと期待される。

しかし、最大粒子径で１００〜２００μｍ前後、平均粒子径で数十〜百数十μｍオーダの従来の卵殻膜粉末では、これらの粒径域レベルで最大粒子径あるいは平均粒子径を変化させて、より細かく粉砕しても消化吸収効率およびインスリン抵抗性改善効率は殆ど改善しない。この理由は、卵殻膜は、繊維状のタンパク質を主成分とした強固な網目状の構造を有しており、これらの粒径域レベルで粉砕された卵殻膜粒子においては、未だに強固な網目構造が維持されているためであると考えられる。

一方、体積平均粒子径が６μｍ以下または体積最大粒子径が２０μｍ以下の卵殻膜含有微粉末では、従来の卵殻膜粉末と比べて、消化吸収の効率、インスリン抵抗性改善の効率がそれぞれ大幅に向上する。このような消化吸収効率およびインスリン抵抗性改善の効率の向上は、単純に粒径が小さくなったことに起因するものでは無く、卵殻膜を微粉化する過程において、卵殻膜微粒子全体において、卵殻膜が本来有する繊維状の強固な網目状の構造が破壊され、卵殻膜微粒子全体が消化液に対してより溶解し易くなったためであると推測される。

したがって、本発明において卵殻膜成分として使用する粉末は、体積最大粒子径が２０μｍを超えるようにしたり、体積平均粒子径が６μｍを超えるようにしたり、体積最大粒子径が２０μｍを超えかつ体積平均粒子径が６μｍを超えるようにしたりしてもよいが、消化吸収効率およびインスリン抵抗性改善の効率をより一層改善する観点からは、体積平均粒子径が６μｍ以下および／または体積最大粒子径が２０μｍ以下の、卵殻膜含有微粉末であることがより好ましい。

本実施形態の卵殻膜含有粉末を含むインスリン抵抗性改善剤には、少なくとも、粉末化または微粉化された卵殻膜成分が含まれるが、この他に、粉末化または微粉化された卵殻カルシウム成分が含まれていてもよい。この場合、本実施形態の卵殻膜含有粉末は、卵殻膜成分のみを含む形態（第一形態）、あるいは、卵殻膜成分および卵殻カルシウムのみを含む形態（第二形態）のいずれかであることが特に好ましい。第一形態の卵殻膜含有粉末を含有するインスリン抵抗性改善剤の場合は、純粋に卵殻膜成分のみを含むため、医薬組成物、特に錠剤などの固体剤型の医薬組成物、食品添加物等、各種の用途に幅広く利用することができる。なお、第一形態の卵殻膜含有粉末および第二形態の卵殻膜含有粉末のいずれにおいても、製造過程等において混入する不純物成分が含まれることは許容される。また、本実施形態の卵殻膜含有粉末を含むインスリン抵抗性改善剤には、卵殻膜成分と卵殻カルシウム成分の他に、その他の栄養素などが含まれてもよい。

（本発明のインスリン抵抗性改善剤に使用される卵殻膜含有粉末または微粉末の製造方法）
本発明に使用される卵殻膜含有粉末の製造には、剥離された卵殻膜または卵殻に卵殻膜が付着した状態の原料を使用してもよく、当該原料と卵殻膜粉末とを併用することもできる。このような原料を粉末化する方法は公知のいずれのものでもよい。市販の卵殻膜粉末を卵殻膜含有粉末として用いてもよく、市販の卵殻膜粉末としては、たとえば、商品名「ＥＭパウダー３００」（キューピー株式会社製）を利用することができる。卵殻膜含有微粉末を製造する場合、市販の卵殻膜粉末、または、市販の卵殻膜粉末および卵殻カルシウムを利用して、これをさらに体積平均粒子径が６μｍ以下、および／または、体積最大粒子径が２０μｍ以下まで微粉砕してもよい。

本発明において使用される卵殻膜含有微粉末は、少なくとも、卵殻膜含有原料をガス中で相互に衝突させて微粉砕する微粉砕工程を経て、製造することができる。このような微粉砕工程では、いわゆるジェットミルが用いられる。このような粉砕方法は、従来の回転刃などの硬質の破砕部材を原料と衝突させて粉砕する粉砕方法と比べて、粉砕時に、破砕部材と原料との接触・衝突などに起因する摩擦熱が殆ど発生しないため、卵殻膜中に含まれるアミノ酸やタンパク質などの、熱により変性・劣化・分解しやすい成分へのダメージが少ない。すなわち、製造過程で、卵殻膜中の有効成分が失われにくくなる。これに加えて、原料を粉砕するために、破砕部材ではなく高圧ガスを使うため、粉砕装置由来の不純物が卵殻膜含有微粉末に混入することも無いので、有利である。

微粉砕工程では、ジェットミルにより、卵殻膜含有原料の体積平均粒子径が４０μｍ以下となるまで粉砕することが好ましく、２０μｍ以下となるまで粉砕することがより好ましく、１０μｍ以下となるまで粉砕することがさらに好ましい。また、この場合、体積最大粒子径は２０μｍ以下となるまで粉砕することが好ましい。一方、ジェットミルにより粉砕された卵殻膜含有原料の体積平均粒子径の下限は特に限定されないが、生産性等の実用上の観点からは４μｍ以上が好ましく、５μｍ以上がより好ましい。

ジェットミルにより粉砕された後の卵殻膜含有原料は、体積最大粒子径が２０μｍ以下、および／または、体積平均粒子径が６μｍ以下であれば、これをそのまま本発明の卵殻膜含有微粉末を含むインスリン抵抗性改善剤として利用できる。一方、粒度分布において粒径２０μｍを超える粗大粒子を含む場合、微粉砕工程を経た後に、目開き２０μｍ以下の篩で分級して粗大粒子を除去する分級工程をさらに実施してもよい。

また、本発明のインスリン抵抗性改善剤に使用される卵殻膜含有微粉末の製造方法では、必要に応じてその他の工程・プロセスを実施してもよい。たとえば、微粉砕工程が、第一の微粉砕処理と、第二の微粉砕処理とを含み、第一の微粉砕処理を終えた後の原料粉末を高圧蒸気で滅菌処理した後、第二の微粉砕処理を行ってもよい。卵殻膜含有原料がジェットミルにより粉砕されて微細化される過程においては、卵殻膜の抗菌性が低下しやすくなるが、上述したように滅菌処理を行うことで本実施形態の卵殻膜含有微粉末にカビや細菌の繁殖を防ぐのが容易となる。

（インスリン抵抗性改善剤を含む組成物）
本発明の組成物は、本発明のインスリン抵抗性改善剤とともに、少なくとも一種の賦形剤を含有する。本発明のインスリン抵抗性改善剤は刺激性がないため、医薬または化粧品等の組成物とする場合、そのような組成物は、剤型に特に制限はなく、経口用または外用のあらゆる組成物とすることができる。点眼薬、点鼻薬、点耳薬、口腔薬（含嗽剤、噴霧剤）、坐薬（坐剤、軟膏剤、浣腸）等の外用組成物は、通常用いられる公知の成分を配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等のその使用目的に応じた各種剤型に調製することができる。好ましい組成物としては、たとえば、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、粉末等を挙げることができる。経口投与または摂取される用途では、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口用組成物とすることが好ましい。経口用組成物は、舌下薬（錠剤だけでなく、オブラートのようなシート、ペースト）やゼリー、微粉末を懸濁させたドリンク剤でもよい。口腔粘膜からの吸収は、活性成分が毛細血管から内頸静脈を経て直接心臓へ入るため、消化管腔内での分解、代謝、肝での代謝による初回通過効果を回避でき、全身に一気にまわるので好都合である。上記で例示したものを含む種々の剤型の医薬または化粧品等の組成物を製造するための各種成分および製造法は、医薬および化粧品等の製造にかかる分野で公知であり、当業者は必要に応じて適宜選択することができる。なお、ここで「医薬組成物」は、ヒト用に限定されず、ペットや家畜として飼育されている犬や猫などの哺乳動物用の医薬組成物を含む。また、「化粧品組成物」は、化粧品のみでなく、薬事法上の各種医薬部外品、薬用化粧品等を含む。

なお、本明細書および特許請求の範囲においては、特に断らない限り、「％」は組成物全体の重量または容量を１００％とした百分率であり、目的の成分が固体（粉末等）の場合は（W/V）または（W/W）、液体の場合は（V/V）であることを基本とする。

本発明のインスリン抵抗性改善用の医薬組成物の有効投与量は、治療もしくは予防すべき疾患または症状の種類や程度、投与対象の状態（年齢、性別、身体の状態等を含む）、剤型などによって異なる。

このような医薬組成物のヒト（体重６０ｋｇの成人）に対する経口投与量は、卵殻膜成分の量に換算して、好ましくは１日当たり１ｍｇ〜１００，０００ｍｇである。具体的には、たとえば本発明の経口医薬組成物の有効投与量は、１日当たり卵殻膜成分を合計で１８〜４８，０００ｍｇとすることができ、さらに好ましい値として、３５ｍｇ〜３,５００ｍｇとすることができる。

また、外用組成物の場合、適用する皮膚の面積や部位等によっても異なるが、卵殻膜成分の量に換算して１〜４００ｍｇ／ｍｌ（０．１〜４０％）程度の卵殻膜成分を含有する外用剤を、１日１〜数回塗布することができる。適用方法は塗布に制限されず、たとえば組成物が液体の形状であれば噴霧でもよく、フィルム状の形状であれば貼付といったように適宜選択することができる。

本発明のインスリン抵抗性改善剤は極めて安全性が高く副作用の心配がないので、他の成分を適切に選択して組成物とする限りにおいて、摂取量または適用量が上記の範囲を超えても問題はない。

（外用組成物）
局所適用剤とするには、その使用目的に応じて、本発明のインスリン抵抗性改善剤を通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能である。本発明の外用組成物には、本発明のインスリン抵抗性改善剤および賦形剤に加え、たとえば、美容上または医薬的な有効成分、芳香成分（香料など）、着色剤などを使用することができる。他の有効成分の例としては、たとえば、消炎剤、抗炎症剤、メラニン産生抑制剤、メラニン還元剤、脱色剤、メラニン排水促進剤、細胞賦活剤、抗酸化剤、酸化防止剤、角質溶解・剥離剤、皮脂抑制剤、保湿剤、エモリエント剤、皮脂分泌抑制・促進剤、紫外線吸収剤、制汗剤、血行促進剤、角質除去・柔軟剤、美白剤、抗アレルギー剤、ステロイドホルモン、免疫抑制剤、抗生物質などが挙げられる。

たとえば、本発明のインスリン抵抗性改善剤を、炭化水素（ワセリン等）、高級脂肪酸低級アルキルエステル（ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等）、動物性油脂（ラノリン等）、多価アルコール（グリセリン等）、界面活性剤（グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール等）、無機塩、ロウ、樹脂、水、保存料（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等）、ペプチド類（アセチルヘキサペプチド−３、パルミトイルペンタペプチド−４ (Matrixyl)等）、アセチル化ヒアルロン酸ナトリウム、カプリリルグリコール等の１以上の成分と混合することによって、生活習慣病予防または改善用あるいはインスリン抵抗性改善用の医薬組成物または化粧品を製造することができる。

本発明の外用組成物は、水性組成物とする場合は、保湿成分および／または増粘成分を含んでいることが好ましい。基剤保湿成分としては、たとえばグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１−３ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、ポリグルタミン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ポリ乳酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、糖類、メチルグルコシドなどが挙げられる。増粘成分としては、たとえばヒアルロン酸ナトリウム、デルマタン硫酸ナトリウム、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、キサンタンガム、コーンスターチ、トラカントゴム、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、キシラン、マンナン、ガラクタン、ペクチン、エクステンシン、アラビアゴム、プルラン、ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、粘土鉱物類などが挙げられる。また、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマーは、線維芽細胞に皮膚と近い環境を与えることができるので、好ましい。なお、基材保湿成分の１−３ブチレングリコールは、アレルギーとの関係では好ましくない場合があり、症状などに合わせ、適宜、外用組成物中に採用することが好ましい。

（経口用組成物）
本発明のインスリン抵抗性改善剤は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口用組成物とすることできる。種々の剤型の経口用組成物を製造するための各種成分および製造法は、医薬および化粧品等の製造にかかる分野で公知であり、当業者は必要に応じて適宜選択することができる。

本実施形態の経口用組成物は、賦形剤に加え、（１）健康増進剤（たとえばビタミン類、β-カロチン、ローヤルゼリーなど）、（２）併用することのできる各種の医療用成分（たとえば抗炎症剤など）、のうちの少なくも１種を含有することが好ましい。

本実施形態の経口用組成物中に含有させるビタミンの種類は特に制限されず、ヒトまたは哺乳動物が摂取可能なビタミンであればいずれでもよい。たとえば、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫなどの脂溶性ビタミン類、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＨ、ビタミンＬなどの水溶性ビタミン類などを挙げることができ、本実施形態の錠剤は、これらのビタミン類の１種または２種以上を含有することができる。β−カロチンおよびビタミン類の含有量は、ヒトなどの対象が摂取するのに適するそれぞれのビタミンの量に応じて適宜決めることができる。なお、経口用組成物中に含有させるビタミン剤は、「ビタミン・ミネラル、抗酸化サプリメントについて、食品から摂取すべきでサプリメントとして健常人は摂取すべきではない」というアメリカ心臓協会からの勧告によれば、含有させないのが好ましい。しかし、必要性などを勘案し、場合によっては、ビタミン剤を含有させてもよい。

本発明の経口用組成物は、卵殻膜を高濃度で均一に含有し、保存時、流通時、服用時などに変形・崩壊が生じず、取扱い性に優れ、かつ、経口で簡単に服用できる観点からは、錠剤とすることが特に好ましい。以下に、本発明のインスリン抵抗性改善剤を用いた医薬組成物の例として、錠剤について説明する。

本実施形態の錠剤に含まれる微粉末状の卵殻膜成分の含有量は特に制限されない。しかし、粒子への造粒および打錠が円滑に行われ、錠剤を経口で摂取（服用）した際のインスリン抵抗性改善効果がより優れたものになり、生体内で生成した活性酸素の低減または消去能が高くなるなどの観点から、錠剤の全質量に対して、卵殻膜成分を５〜４０質量％の割合で含有することが好ましく１０〜２５質量％の割合で含有することがより好ましい。

卵殻膜成分の含有量を５質量％以上とすることにより、多量の錠剤を摂取する必要がなくなる。一方、錠剤における卵殻膜の含有量を４０質量％以下とすることにより、粒子への造粒および打錠が容易となり、錠剤を製造しやすくなる。

本実施形態の錠剤には、錠剤を形成するために各種の添加剤として、賦形剤に加えて、たとえば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、その他の栄養素等を適宜添加することができる。

錠剤用の賦形剤としては、化工澱粉および乳糖の少なくとも１種が用いられることが好ましい。賦形剤の含有量は、賦形性の観点から卵殻膜成分の質量に対して０.５〜３質量倍であることが好ましく、１〜２.５質量倍であることがより好ましい。化工澱粉としては、焙焼デキストリン（白色デキストリン、黄色デキストリンなど）などのデキストリン類、酸化澱粉（次亜塩素酸酸化澱粉など）、低粘性変性澱粉（酸浸漬澱粉、酵素処理澱粉など）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。賦形剤として、化工澱粉（特に「ワキシａ」および「パインファイバー」）と乳糖を併用する場合は、化工澱粉：乳糖の使用割合（質量比）が、１：５〜５：１であることが好ましく、１：３〜３：１であることがより好ましい。

結合剤としては、公知の結合剤が適宜利用できるが、たとえば、デンプン糊、アラビアゴム糊、ヒドロキシプロピルセルロースなどを挙げることができる。

崩壊剤としては、公知の崩壊剤が適宜利用できるが、たとえば、セルロース類などを用いることができる。なお、デンプンは崩壊剤としての機能も有する。

滑沢剤としては、公知の滑沢剤が適宜利用できるが、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステルなどのワックス類やタルク、ビタミンＣなどを挙げることができる。

さらに、本実施形態の錠剤は、錠剤の硬度を高くし、錠剤の変形や傷つきを防止して、包装時、保存時、流通時などにおける錠剤の取り扱い性を向上し、摂取性を良好なものにするために、硬度向上剤として卵殻カルシウムを含有することが特に好ましい。卵殻カルシウムは、鶏卵などの鳥類の卵の殻を粉砕・乾燥してなる微粉末であり、本実施形態の錠剤においては、人が摂取可能な卵殻カルシウムであればいずれも使用できる。卵殻カルシウムとしては、たとえば、従来から市販されているキューピー株式会社製の商品名「カルホープ」、太陽化学株式会社製の卵殻カルシウムなどをそのまま用いることができる。錠剤中に含まれる卵殻カルシウムの含有量は、錠剤の全質量に対して、５〜２０質量％であることが好ましく、８〜１５質量％であることがより好ましい。

本実施形態の錠剤は、錠剤中に含まれる成分の変質や分解を防止し、また錠剤表面の耐傷つき性の向上などの目的で、コーティング皮膜で覆われていることが好ましい。コーティング皮膜は、錠剤のコーティング皮膜として従来から用いられているのと同様の皮膜形成材料から形成することができる。皮膜形成材料としては、特に限定されるものではないが、たとえば岐阜セラック株式会社製の商品名「セラック」（トラック３０）などを利用することができる。

また、本実施形態の錠剤は、経口での摂取をし易くするために、糖衣で覆われていることが好ましく、また、必要に応じて、着色してあってもよく、着色後に、艶だし処理を施してもよい。

本実施形態の錠剤の大きさは特に制限されず、適宜決めることができるが、一般には、直径が約７〜１０ｍｍ程度の円形や楕円形の錠剤とするのが、取り扱い性、服用のし易さなどの点から好ましい。

さらに、本実施形態の錠剤は、たとえば、錠剤１個の重さが約３５０〜６００ｍｇ程度であることが好ましく、錠剤１個中に卵殻膜成分が約１８〜２４０ｍｇの量で含まれることが好ましく、３５〜１５０ｍｇがより好ましい。たとえば、本実施形態の錠剤１個当たり、卵殻膜成分が約１８〜２４０ｍｇの割合で含有されると仮定する。この場合、成人では、当該錠剤を１日当たり１〜２００個（１日当たり卵殻膜成分を合計で１８〜４８，０００ｍｇ）摂取または投与することができる。

本実施形態の錠剤は、本実施形態の卵殻膜含有微粉末を少なくとも含む打錠用原料を用いて、公知の錠剤製造方法を適宜利用して製造することができる。具体的には、打錠用原料を用いて、打錠することで裸錠を形成する裸錠形成工程（打錠工程）を少なくとも経て本実施形態の錠剤を製造することができる。裸錠形成工程に加えて、造粒工程、保護コーティング工程、糖衣コーティング工程等の工程を行ってもよく、さらに着色、艶だし等を施してもよい。これにより得られる本実施形態の錠剤は、選別、計量、包装などを行うことによって出荷される。

（食品添加物）
本発明のインスリン抵抗性改善剤を、単独で、または他の食品添加物などの生理的に許容される各種成分と組み合わせて、菓子類、健康食品、保存食品、加工食品などの食品に添加するための食品添加物とすることができる。本発明の食品添加物は、生活習慣病関連遺伝子活性化またはインスリン抵抗性改善を目的として、当該技術分野で公知の方法により各種食品に添加して使用することができる。たとえば、卵殻膜の食品への適用については、粉末状に粉砕した卵殻膜を含む錠剤や菓子類などが提案されている（特許第３８６２６００号、特開２００９−１６５４２１号公報）。これらに記載された錠剤や菓子類において使用されている卵殻膜粉末として、本発明のインスリン抵抗性改善剤を含有する食品添加物を使用することができる。

なお、ここで、「食品」は、ヒト用に限定されず、ペットや家畜として飼育されている犬や猫などの哺乳動物用の餌料を含む。また、「食品」の概念には、通常の食品の他、飲料やいわゆるサプリメントや健康食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、特定保健用食品などが包含される。

以下に、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。

１．卵殻膜加水分解物を含む外用剤の製造
アルカリ加水分解卵殻膜（以下「ＡＳＥＳＭ」という）としては、キューピー（Kewpie
Corporation, Tokyo, Japan)から入手した商品名「ＥＭＰＲＯＴＥＩＮ‐Ｐ」を使用した。このＡＳＥＳＭについてサイズ排除クロマトグラフィ（ゲルろ過）により測定した相対分子量は、主要な部分が約１２〜１４ｋＤａであることが見出された（非特許文献１：Ohto-Fujita et al,
Cell Tissue Res. 2011 July; 345(1): 177−190）。

７％（V/V）ブチレングリコール、１％（V/V）ペンチレングリコール、４％（V/V）グリセリン、０．２％（V/V）フェノキシエタノール水溶液を基剤として使用し、１０％（W/V）ＡＳＥＳＭを含有する溶液（ローション剤）を製造した。

２．へアレスマウス背部における生活習慣病関連遺伝子発現に対するＡＳＥＳＭ外用剤の効果
動物は、ヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１、６週齢、雄）を用いた（コントロール群：ｎ＝９、ＡＳＥＳＭ処理群：ｎ＝９）。ＡＳＥＳＭ処理群には、前記で製造した１０％（W/V）ＡＳＥＳＭ溶液を、外用で（局所的に）背部皮膚に、１０日間（４０μｌ／回×２）適用した。コントロール群には、ＡＳＥＳＭを含まない上記基剤溶液を同様に適用した。

定量的リアルタイムＰＣＲ（quantitative real-time polymerase chain
reaction）解析は、以下のように行った。各マウスから皮膚サンプルを採取し、液体窒素中で粉砕した。全皮膚組織のホモジナイズ後、商品名「ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ」を用いて総ＲＮＡを単離した。総ＲＮＡ（２００ng）を、商品名「Takara PrimeScript RTR reagent kit」を用いたｃＤＮＡ合成に適用した。リアルタイムＰＣＲ法は、商品名「SYBRR Premix Ex TaqTM II (Takara) on
Thermal Cycler Dice Real Time System」(Takara)を用いて行った。プライマーとして、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲδをコードする遺伝子を増幅するよう設計されたプライマーを用いた。内部標準として、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを同様に増幅した。ＰＣＲサイクルは以下のとおりとした：最初の変性を、９５℃で３０秒で行った後、４０サイクルの増幅（９５℃で５秒の変性、および６０℃で１分のアニーリングおよび伸長反応）。使用したプライマーを以下の表１にまとめて示す。

各遺伝子発現量を、コントロールにおける各遺伝子の発現量に対する比として算出した。結果を表２に示す。

これらの結果により、ＡＳＥＳＭ処理群の背部皮膚においては、細胞にＡＳＥＳＭが働きかけた結果、生活習慣病関連遺伝子であるＰＰＡＲγの発現が有意に促進されたことが示された。

３．卵殻膜含有微粉末の製造
卵殻膜含有粉末サンプルとして、キューピー株式会社の商品名「ＥＭパウダー３００」をジェットミルで粉砕したものを用いた。ジェットミルとしてはシングルトラックジェットミル（株式会社セイシン企業製、ＦＳ−４）を用いて、風量：１．２ｍ^３／ｍｉｎ、動力：１１ｋｗにて、体積最大粒子径が８００メッシュ（目開きで約２０μｍ）程度となるまで粉砕を実施した。レーザー回折式粒度分布測定機（株式会社セイシン企業製、ＬＭＳ−３０）を用いて粉砕後の粒径を測定したところ、体積最大粒子径は１９．６μｍ、体積平均粒子径は５．８μｍであった。

４．マウスにおける生活習慣病関連遺伝子発現に対する卵殻膜含有粉末摂取の効果
７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスを前日より絶食させたのち、卵殻膜微粉末と卵殻カルシウムのみを有効成分として含有する実験用サプリメント（「８φＣＲ２００ｍｇ」、上記で製造した卵殻膜含有微粉末（８００メッシュ）３７．５０％（７５．０ｍｇ）；卵殻カルシウム（キューピー株式会社）１１．７５％（２３．５ｍｇ）；乳糖（グランビアフーズ社）４３．７５％（８７．５ｍｇ）；トウモロコシ蛋白（小林香料株式会社）５．００％（１０．０ｍｇ）；菜種硬化油（川研ファインケミカルズ株式会社）２．００％（４．０ｍｇ））０．５ｍｇ、または対照として賦型剤のみを含むコントロール錠剤（「９φＣＲ２５０ｍｇ」、乳糖９３．００％（２３２．５ｍｇ）；トウモロコシ蛋白５．００％（１２．５ｍｇ）；菜種硬化油２．００％（５．０ｍｇ）） 0.5ｍｇ（錠剤を乳鉢で粉にしたもの）を、動物用薬物投与ゼリー（商品名ＭｅｄｉＧｅｌＳｕｃｒａｌｏｓｅ、日本エスエルシー株式会社）１００μＬに懸濁し、軽くエーテル麻酔したマウスにゾンデを使って胃に直接全量投与した（ｎ＝各３）。８時間後にマウスを解剖し、脂肪組織中の細胞でのＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２およびＰＧＣ１α遺伝子発現を、上記と同様にして定量的リアルタイムＰＣＲで評価した。

結果を表３に示す。

これらの結果により、卵殻膜含有粉末を経口摂取させた場合、脂肪細胞において生活習慣病関連遺伝子であるＵＣＰ、特にＵＣＰ−２、およびＰＧＣ１αの発現が有意に促進されたことが示された。

５．卵殻膜成分の体内動態
タンパク質などの含窒素化合物を炭酸リチウムと混合し中性子照射すると、Ｌｉ^６（ｎ，α）^３Ｈ反応で生成したトリチウムにより標識される。これを利用して、トリチウム標識された卵殻膜含有粉末をマウスに経口投与した場合の体内動態を以下のようにして調べた。

＜卵殻膜の標識＞
卵殻膜含有粉末０．３２ｇ（「ＥＭパウダー）、キューピー）と炭酸リチウム０．６５ｇを十分に混合し石英管に減圧封入後、日本原子力研究機構原子力科学研究所（ＪＲＲ４原子炉）で２０分間中性子照射した。照射試料を石英管から取り出し、水と混合して未反応の炭酸リチウムを溶解した。卵殻膜粉末は水に不溶であるので濾過して回収し、卵殻膜に未結合のトリチウムを除去するため、濾液の放射能が十分に減少するまで水で洗浄した。

＜実験動物＞
オリエンタル酵母より６週齢で購入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１週間程度の予備飼育（温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下）後、７週齢時に実験を行った。マウスをスギヤマゲンの代謝ケージ（メタボリカＭＭ）（８６．５ｃｍ^２×１４．５ｃｍ、スペース約２０００ｃｍ^３）内で１匹ずつ飼育し、固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母）と水道水を自由摂取させた。

＜投与方法＞
投与前１６時間絶食させたマウスに水で懸濁した標識卵殻膜含有粉末を、プラスチック製ディスポーザブルゾンデを用いて胃内に単回強制経口投与した。投与放射能は、約４．５ＭＢｑ／ｋｇ（１２２ｍＣｉ／ｋｇ）体重とし、投与量は２５０ｍｇ／ｋｇ体重とした。

＜放射能の測定＞
放射能の測定は、調製された放射能測定試料にシンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ，２２００ＣＡ）により行った。クエンチングの補正は外部標準線源比法により行った。

＜血液中放射能濃度測定＞
標識卵殻膜含有粉末投与後０．２５、０．５、１、２、４、６、９、１２、２４時間ならびに２、３、４、５、６日に尾静脈より血液５ｍｌを採取した。この試料に組織可溶化剤（Ｓｏｌｕｅｎｅ−３５０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）／イソプロピルアルコール（１：１））１ｍｌを加え、５０℃で３時間加温振盪した後、３０％過酸化水素水５００ｍｌを加えた。この試料にシンチレーター（Ｈｉｏｎｉｃｆｌｕｏｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）１０ｍｌを加え、放射能を測定した。

＜尿・糞中への放射能排泄＞
標識化合物投与後、マウスを代謝ケージ（メタボリカＭＭ、スギヤマゲン）に入れ、投与後１日ごとに６日間、尿・糞を分離して採取した。採取した糞の一部を精秤し、これに組織溶解剤２ｍｌを加え、３〜４時間、５０℃で加温し、その後、イソプロパノール１ｍｌを加え、５０℃で２時間加温した。この試料に３０％過酸化水素水を０．５ｍｌ加え、シンチレーター（ＨｉｏｎｉｃＦｌｕｏｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を１０ｍｌ加え、放射能を測定した。尿は、各画分の１ｍｌにシンチレーター（ウルチマゴールドＬＬＴ）５ｍｌを加え、放射能を測定した。

マウスへの卵殻膜経口投与後の血液中放射能濃度の結果を図２に示す。トリチウム標識した卵殻膜投与後の血中放射能濃度を時間経過に従って示した。投与後２４時間以内で血中の放射能濃度が最大になり、その後、３〜４日で元の放射能レベルに低下した。

糞・尿中放射能濃度の結果を表４に示す。糞・尿中の放射能は投与後３日後までで投与量全体の６１．５％であった。

＜全身の組織への放射能の移行＞
前記と同様にしてゾンデを用いて胃内に、５，５６８，０００dpmのトリチウム標識卵殻膜を３個体のマウスに投与した。投与後、２時間、６時間および１２時間後に、各個体から組織の一部または全部を摘出し、重量を測定した。各組織に２ｍｌの可溶化剤（Ｓｏｌｕｅｎｅ-３５０）を添加し、６０℃で３時間インキュベートした。この試料に３０％過酸化水素水を０．５ｍｌ加え、シンチレーター（ＨｉｏｎｉｃＦｌｕｏｒ）を１０ｍｌ加えて室温で１時間インキュベートした後、液体シンチレーションカウンターにより放射能を測定した。結果を、表５および図１に示す。

卵殻膜成分は、全身の各種組織、特に皮膚、腎臓、肝臓、精巣（雌では卵巣）、脳（たとえば海馬）に多く分布することが明らかになった。したがって、卵殻膜成分は、これらの組織において生活習慣病関連遺伝子発現促進作用を示すことが期待される。

６．医薬組成物（錠剤）の製造
（１）打錠用の顆粒の製造
上記で製造した卵殻膜含有微粉末（８００メッシュ）：２０．０質量部、日食株式会社製「ワキシａ」：１０．０質量部、松谷化学株式会社製「パインファイバー」：２０．０質量部、乳糖（メグレ社製）：２５．９質量部、卵殻カルシウム（キューピー株式会社製「カルホープ」）：１０質量部、β−カロチン：５．０質量部、ビタミンＢ：２０．０５質量部、ビタミンＥ：０．０５質量部およびナイアシン：２．０質量部を、Ｖ型混合機を用いて混合することにより、原料混合物を調製した。次いで、この原料混合物９３．０質量部に対して、エチルアルコール１５質量部を混合し、これにより得られた混合物を、湿式造粒装置を用いて造粒し、次いで温度５０℃で約１６時間乾燥して、打錠用の顆粒を製造した。

（２）打錠
次に、打錠用の顆粒１００質量部に対して、ビタミンＣを９質量部およびショ糖脂肪酸エステルを１質量部の割合で混合し、それにより得られた混合物を、打錠装置を使用して、１粒が２００ｍｇの裸錠を製造した。

（３）保護コーティング
次に、裸錠の表面に、コーティング装置を使用して、岐阜セラック株式会社製「セラック」の水溶液を塗布し、温度４０℃で２時間乾燥して、保護コーティングされた錠剤（保護コーティング錠）を得た。

（４）糖衣被覆
十分に乾燥させた保護コーティング錠の表面に、糖衣被覆装置を使用して、糖衣用ペーストＡ（グラニュー糖７０質量部、アラビアガム３質量部、ゼラチン４質量部、卵殻カルシウム３質量部および水６５質量部を混合したペースト）を被覆した後、温度約４０℃で約４
時間乾燥した。その後、糖衣用ペーストＡに水を加えて希釈した糖衣用ペーストＢを調製した。さらに、糖衣用ペーストＡでコーティング処理および乾燥処理された錠剤の表面に、糖衣被覆装置を使用して、糖衣用ペーストＢを、被覆した後、温度約４０℃で約４
時間乾燥した。これにより糖衣用ペーストでコーティングされた錠剤（糖衣コーティング錠）を得た。

（５）色付け
糖衣コーティング錠の表面に、三栄源社製「ＳＲレッドＫ３」を含む着色液を塗布した後、４０〜５０℃で４時間乾燥して、赤色に着色した錠剤（着色錠）を製造した。

（６）艶だし
着色錠の表面に、カルナウバロウを用いて、艶だしを行った。これにより得られた錠剤１個の質量は４００ｍｇであり、錠剤１個当たり卵殻膜成分を約４０ｍｇの割合で含有していた。

（７）選別−計量−包装
艶出し処理を行った錠剤を選別して不良品を除き、製品検査後に計量し、乾燥剤を同封した二重袋で包装した。なお、錠剤は、十分な硬度および形状保持性を有しており、選別、検査、包装時に変形したり、崩壊したりすることがなく、取り扱い性に優れていた。

以上、本発明の実施の形態や実施例を説明したが、本発明は、その要旨を逸脱しない限りで様々に変更することができる。

Claims

６μｍ以下の体積平均粒子径および／または２０μｍ以下の体積最大粒子径を有する卵殻膜含有微粉末を含有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤。
請求項１記載のインスリン抵抗性改善剤において、ＰＰＡＲγ、ＵＣＰおよびＰＧＣ１αのうちの１以上の遺伝子の発現を増強することを特徴とする、インスリン抵抗性改善剤。
請求項２記載のインスリン抵抗性改善剤において、ＰＰＡＲγ、ＵＣＰおよびＰＧＣ１αのうちの２以上の遺伝子の発現を増強することを特徴とする、インスリン抵抗性改善剤。
請求項１〜３のいずれか１に記載のインスリン抵抗性改善剤および賦形剤を含有する、生活習慣病予防または改善用の経口用組成物。
請求項１〜３のいずれか１に記載のインスリン抵抗性改善剤を含有する食品添加物。
請求項５に記載の食品添加物が添加された食品。