CN114213674B - 一种提高蛋壳膜溶解率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高蛋壳膜溶解率的方法，涉及蛋壳膜溶解领域。该方法包括以下步骤：(1)将蛋壳膜粉碎成蛋壳膜粉，之后在溶解液1中进行溶解，分离出未溶解固体，记为固体1；所述溶解液1为氯化钠水溶液；(2)所述固体1在溶解液2中进行溶解，分离出未溶解固体，记为固体2；所述溶解液2为DTT和Tris‑HCl混合溶液；(3)所述固体2在溶解液3中进行溶解；所述溶解液3为3‑疏基丙酸和乙酸的混合溶液。本发明依次用氯化钠溶液、DTT和3‑巯基丙酸对蛋壳膜进行溶解，使蛋壳膜的溶解率得到提高。

Description

一种提高蛋壳膜溶解率的方法
技术领域
本发明涉及蛋壳膜溶解领域，特别是涉及一种提高蛋壳膜溶解率的方法。
背景技术
蛋壳膜是指位于蛋壳矿化层底部并包裹在蛋清外侧防止其外渗的一层网状纤维膜，包含90％蛋白质、3％脂质、2％糖类和水分、少量钙、镁等矿物质。蛋壳膜中已经报道的蛋白质有472种，主要包括胶原蛋白(大部分为I、V、X型)、角蛋白、复合蛋白如OC-17(ovocleidin-17)、溶解酵素(lysozyme)、卟啉蛋白(porphyrin)等。目前蛋壳膜的溶解率仅50％左右，蛋壳膜的溶解对于探究蛋壳膜的结构和组成，及蛋壳膜的进一步开发利用、研究蛋壳形成等有重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高蛋壳膜溶解率的方法，以解决上述现有技术存在的问题，使蛋壳膜的溶解率得到提高。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种提高蛋壳膜溶解率的方法，包括以下步骤：
(1)将蛋壳膜粉碎成蛋壳膜粉，之后在溶解液1中进行溶解，分离出未溶解固体，记为固体1；所述溶解液1为氯化钠水溶液；
(2)所述固体1在溶解液2中进行溶解，分离出未溶解固体，记为固体2；所述溶解液2为DTT和Tris-HCl混合溶液；
(3)所述固体2在溶解液3中进行溶解；所述溶解液3为3-疏基丙酸和乙酸的混合溶液。
进一步地，在步骤(1)中，所述氯化钠水溶液的浓度为1mol/L。
进一步地，在步骤(1)中，所述蛋壳膜粉与所述溶解液1的质量体积比为1g：80mL。
进一步地，在步骤(1)中，溶解温度为4℃。
进一步地，在步骤(2)中，所述溶解液2为50mM Tris-HCl和10mM DTT按照体积比6：1配制。
进一步地，在步骤(2)中，所述固体1与所述溶解液2的质量体积比为1g：120mL。
进一步地，在步骤(2)中，溶解温度为25℃。
进一步地，在步骤(3)中，所述溶解液3为1.25mol/L 3-疏基丙酸和10wt％乙酸按照体积比5:1配制。
进一步地，在步骤(3)中，所述固体2与所述溶解液3的质量体积比为1g：300mL。
进一步地，在步骤(3)中，溶解温度为80℃。
本发明公开了以下技术效果：
本发明先利用氯化钠溶液对蛋壳膜可溶于水的蛋白质进行溶解，且氯化钠是中性溶剂，不会对蛋壳膜结构和蛋白质造成破坏；然后利用DTT对蛋壳膜内难以溶解的二硫键进行小程度的分离使得部分蛋白质解离出来，使用Tris-HCl来调节pH使得DTT的还原性最大化利用，并且DTT的还原性比较强，可以使得一部分比较难容的蛋白质得到溶解；最后利用3-巯基丙酸进行溶解，它具有较强的的还原性，利用乙酸调节pH使得3-巯基丙酸还原性达到最强，较大程度的还原蛋壳膜内的二硫键，把一些蛋壳膜内极难溶的的蛋白质溶解。利用本发明的方法，可以将蛋壳膜的溶解率提升至65％以上，提高了生产效率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
第一步：
(1)取鸡蛋的蛋壳膜，在液氮下用研钵弄成粉末，晾干后得到蛋壳膜粉，称重记为M(315mg)。
(2)4℃下，将步骤(1)得到的蛋壳膜粉放入烧杯中，加入溶解液1(即1mol/L的NaCl溶液)，蛋壳膜粉与溶解液1的质量体积比为1g：80mL，搅拌一小时(此步骤是对蛋壳膜可溶于水的蛋白质进行溶解，把一些比较简单的蛋白质提取出来，使用氯化钠溶液是因为蛋白质在氯化钠溶液的溶解度高于水，且氯化钠是中性溶剂，不会对蛋壳膜结构和蛋白质造成破坏)，得到混合物。
(3)混合物在2号Whatman滤纸上过滤，过滤出的固体1用于下一步处理，滤液用(MWCO)3.5kDa与水进行6次透析，分离出NaCl，再经浓缩、冷冻干燥，得到蛋壳膜溶解物1，质量计为M1(7.91mg)。
第二步：
(1)配制溶解液2：先配制10mM DTT，10mM DTT的配制方法为：称取1.54g DTT置于15mL塑料离心管中，加入800mL的10mM NaAc(pH5.2)，充分混合溶解之后定容至1000mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，置于－20℃保存。然后将50mM Tris-HCl和10mM DTT按照体积比6：1混合均匀，即得到溶解液2。
(2)将第一步过滤出的固体1转移到溶解液2中，固体1与溶解液2的质量体积比为1g：120mL，室温(25℃)搅拌19小时。此步骤中DTT(即二硫苏糖醇)是还原性物质，可以对蛋壳膜内难以溶解的二硫键进行小程度的分离使得部分蛋白质解离出来，使用Tris-HCl来调节pH使得DTT的还原性最大化利用，并且DTT的还原性比较强，可以使得一部分比较难容的蛋白质得到溶解。
(2)悬浮液用滤纸过滤(2号Whatman滤纸)收集蛋壳膜，滤液离心(3500r，4℃，20min)除去细膜颗粒，剩余上清液用(MWCO)3.5kDa与水进行6次透析，截留液浓缩后冷冻干燥，得到蛋壳膜溶解物2，质量计为M2(11.72mg)。过滤出的固体和离心分离出的细膜颗粒合并，作为固体2，用于下一步处理。
第三步：
(1)配制溶解液3：先配制1.25mol/L 3-疏基丙酸和10wt％乙酸，其中1.25mol/L3-疏基丙酸的配制方法为：取14.26g 3-巯基丙酸粉末置于烧杯中，加入适量水充分混合溶解后定容至100mL，4℃保存。10％乙酸的配制方法为：10g乙酸和90mL水混合搅拌溶解得到10％的乙酸。然后将1.25mol/L 3-疏基丙酸和10％乙酸按照体积比5：1混合均匀，即得溶解液3。
(2)将第二步得到的固体2转移到溶解液3中，固体2与溶解液3的质量体积比为1g：300mL，在80℃条件下溶解20.5h。此步骤使用的是3-巯基丙酸，它具有较强的的还原性，利用乙酸调节pH使得3-巯基丙酸还原性达到最强，比较大程度的还原蛋壳膜内的二硫键，把一些蛋壳膜内极难溶的的蛋白质溶解。
(3)悬浮液用滤纸过滤(2号Whatman滤纸)过滤，蛋壳膜澄清滤液上清用(MWCO)3.5kDa与水进行6次透析，并冷冻干燥，得到蛋壳膜溶解物3，质量记为M3(186.72mg)。
蛋壳膜的溶解率按照下列公式计算：A＝(M1+M2+M3)/M×100％。
本实施例的蛋壳膜的溶解率为65.51％。
对比例1
同实施例1，区别在于，第三步，使用100mM TCEP-HCl和0.17M乙酸进行溶解，100mMTCEP-HCl、0.17M乙酸体积比分别为4:1和5:1。溶解结果见表1。
表1
Figure BDA0003468328640000041
实验例1
同实施例1，区别在于，在第二步，溶解液2分别为50mM Tris-HCl和10mM DTT按照体积比8：1、7：1、6：2和6：3配制。分别统计第二步得到的蛋壳膜溶解物2的质量，结果见表2。从表2可以看出，当溶解液2为50mM Tris-HCl和10mM DTT按照体积比6：1配制时，DTT的还原性得到最大化利用，使得一部分比较难容的蛋白质得到溶解。
表2
Figure BDA0003468328640000042
Figure BDA0003468328640000051
实验例2
同实施例1，区别在于，在第三步，溶解液3分别为1.25mol/L 3-疏基丙酸和10wt％乙酸按照7：1、6：1、5：2和5：3配制。分别统计第三步得到的蛋壳膜溶解物3的质量，结果见表3。从表3可以看出，当溶解液3为1.25mol/L 3-疏基丙酸和10wt％乙酸按照体积比5：1配制时，使得3-巯基丙酸还原性达到最强，比较大程度的还原蛋壳膜内的二硫键，把一些蛋壳膜内极难溶的蛋白质溶解。
表3
1.25mol/L3-疏基丙酸和10wt％乙酸体积比 蛋壳膜溶解物3的质量，mg
7:1 130.27
6:1 123.74
5:1 186.72
5:2 167.14
5:3 129.28
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种提高蛋壳膜溶解率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将蛋壳膜粉碎成蛋壳膜粉，之后在溶解液1中在4℃条件下进行溶解，分离出未溶解固体，记为固体1；所述溶解液1为氯化钠水溶液；
（2）所述固体1在溶解液2中在25℃条件下进行溶解，分离出未溶解固体，记为固体2；所述溶解液2为DTT和Tris-HCl混合溶液；
（3）所述固体2在溶解液3中在80℃条件下进行溶解；所述溶解液3为3-疏基丙酸和乙酸的混合溶液；
在步骤（1）中，所述氯化钠水溶液的浓度为1mol/L；所述蛋壳膜粉与所述溶解液1的质量体积比为1g：80mL；
在步骤（2）中，所述溶解液2为50mM Tris-HCl和10mM DTT按照体积比6：1配制；所述固体1与所述溶解液2的质量体积比为1g：120mL；
在步骤（3）中，所述溶解液3为1.25mol/L 3-疏基丙酸和10wt%乙酸按照体积比5:1配制；所述固体2与所述溶解液3的质量体积比为1g：300mL。
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