KR101514988B1

KR101514988B1 - 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물을 포함하는 기능성 화장품 조성물

Info

Publication number: KR101514988B1
Application number: KR1020130049057A
Authority: KR
Inventors: 문영섭; 안용석; 문창훈; 고창익
Original assignee: (주)청룡수산
Priority date: 2013-05-01
Filing date: 2013-05-01
Publication date: 2015-04-24
Also published as: WO2014178501A1; KR20140130597A

Abstract

본 발명은 틸라피아(Tilapia Mossambica) 비늘의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 상기 성분을 유효성분으로 포함하는 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 갖는 기능성 화장품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물은 항산화 활성, 주름 개선 및 미백에 우수한 효과를 나타내며, 천연 재료로서 인체에 무해하여 기능성 화장품 조성물의 용도로서 사용하기에 적합하다.

Description

틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물을 포함하는 기능성 화장품 조성물{A COSMETIC COMPOSITION COMPRISING ENZYMATIC EXTRACTS FROM TILAPIA MOSSAMBICA}

본 발명은 틸라피아(Tilapia Mossambica) 비늘의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 상기 성분을 유효성분으로 포함하는 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 갖는 기능성 화장품 조성물에 관한 것이다.

화장품이란 크림, 로션 등 화장하는데 쓰이는 모든 물건을 지칭하는 것으로서 약사법에서 정해진 화장품은 "인체를 청결 또는 미화하기 위하여 도찰(塗擦), 살포 기타 이와 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 적은 것을 말한다."라고 정의되어 있으며, 그와 동시에 제조, 판매, 그에 따르는 광고 등 모든 면에 규제를 받는 상품이다.

최근 피부에 대한 관심이 높아짐에 따라 다양한 기능을 갖는 기능성 화장품에 대한 연구가 계속되고 있다. 피부에 수분을 공급하기 위한 화장품, 모공의 크기를 줄이기 위한 화장품, 피부 각질을 제거하기 위한 화장품, 주름을 완화시키기 위한 화장품, 미백기능을 갖는 화장품 등 다양한 기능을 가진 화장품들이 출시되고 있으며, 앞으로도 이와 같은 기능성 화장품의 수요는 계속 증가할 것으로 예측된다.

한편, 대부분의 어류 가공시 어류 가공부산물이 어체 중의 약 75% 정도로 발생하게 되고, 그 중 어류 뼈나 껍질이 약 30% 정도를 차지하고 있다. 따라서, 어류 가공시 발생되는 가공부산물을 이용하여 젤라틴이나 콜라겐과 같은 새로운 유용한 성분들을 분리하는 기술 개발은 매우 중요하다고 할 수 있다.

이전 연구에서 Kim et al.(1993)은 틸라피아로부터 유용한 젤라틴을 추출하여 산업화에 성공하였으며, 틸라피아의 비늘로부터 콜라겐을 추출하여 식품 및 의약품용으로 일부 생산 판매하고 있다. 또한, 단백질 가수분해효소를 이용한 식품 단백질로부터 펩티드의 제조는 어류 껍질 젤라틴 가수분해물 제조 등에 응용되어 생리활성을 가지는 유용 성분으로 전환시키는 것으로 알려져 있다.

하지만, 아직까지 틸라피아 비늘을 이용하여 생리활성을 연구한 결과는 없으며, 틸라피아 비늘 유래의 가수분해물 제조에 대한 연구도 부족한 실정이다. 이와 같은 점에서, 가공부산물인 틸라피아 비늘을 이용하여 유용 성분을 추출하고 이를 기능성 화장품의 소재로서 사용하고자 하는 것은 매우 유용한 것이라 할 수 있다.

KR

10-2005-0120127

A

본 발명에서 해결하려는 과제는 틸라피아 비늘로부터 추출된 효소적 가수분해물을 포함하는 기능성 화장품 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 틸라피아(Tilapia mossambica) 비늘 추출물의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.

상기 효소적 가수분해물은 (S1) 틸라피아 비늘을 수세 후 원적외선으로 건조시키는 단계; (S2) 건조된 틸라피아 비늘을 열수 추출하는 단계; (S3) 열수 추출된 틸라피아 비늘을 효소적 가수분해시키는 단계; (S4) 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물을 활성탄 여과시키는 단계; (S5) 활성탄 여과물을 0.4~0.5μm의 여과막으로 여과시키는 단계; (S6) 0.4~0.5μm의 여과막에 의한 여과물을 이온교환수지막으로 여과시키는 단계; (S7) 이온교환수지막 여과물을 한외여과막으로 분획하는 단계; 및 (S8) 분획물을 농축 후 동결건조 및 분쇄하는 단계를 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

상기 효소적 가수분해는 α-키모트립신(α-chymotrypsin), 알칼라아제(alcalase), 코지자임(Kojozyme), 프로타멕스(Protamex) 및 트립신(Trypsin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 화장품 조성물은 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 나타내는 것이 바람직하다.

본 발명의 유효성분인 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물은 항산화 활성, 주름 개선 및 미백에 우수한 효과를 나타내며, 천연 재료로서 인체에 무해하여 기능성 화장품 조성물의 용도로서 사용하기에 적합하다.

도 1은 틸라피아 비늘 추출 공정도를 나타낸다.
도 2는 틸라피아 비늘을 다양한 효소로 처리하여 얻어진 효소적 가수분해물의 가수분해도를 측정한 결과이다.
도 3은 틸라피아 비늘을 열수 추출한 후, 다양한 효소로 처리하여 얻어진 효소적 가수분해물의 가수분해도를 측정한 결과이다.
도 4는 기질/효소 처리 농도별 틸라피아 비늘 α-키모트립신 가수분해물의 가수분해 정도를 측정한 결과이다.
도 5는 기질 농도별 틸라피아 비늘 α-키모트립신 가수분해물의 가수분해 정도를 측정한 결과이다.
도 6은 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물의 항산화 활성을 확인하기 위하여 DPPH radical scavenging activity를 측정한 결과로서, T1은 틸라피아 비늘의 α-키모트립신(α-chymotrypsin) 효소 가수분해물, P1은 < 5kDa의 한외 여과 분획물, P2는 < 10kDa 한외 여과 분획물 및 P3는 < 30 kDa 한외 여과 분획물을 나타낸다.
도 7은 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물의 항산화 활성을 확인하기 위하여 H₂O₂ radical scavenging activity를 측정한 결과이고, T1은 틸라피아 비늘의 α-키모트립신(α-chymotrypsin) 효소 가수분해물, P1은 < 5kDa의 한외 여과 분획물, P2는 < 10kDa 한외 여과 분획물 및 P3는 < 30 kDa 한외 여과 분획물을 나타낸다.
도 8은 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물의 주름개선 효과를 확인하기 위하여 Elastinase inhibition을 측정한 결과이고, T1은 틸라피아 비늘의 α-키모트립신(α-chymotrypsin) 효소 가수분해물, P1은 < 5kDa의 한외 여과 분획물, P2는 < 10kDa 한외 여과 분획물 및 P3는 < 30 kDa 한외 여과 분획물을 나타낸다.
도 9는 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물의 미백활성을 확인하기 위하여 tyrosinase inhibition을 측정한 결과이고, T1은 틸라피아 비늘의 α-키모트립신(α-chymotrypsin) 효소 가수분해물, P1은 < 5kDa의 한외 여과 분획물, P2는 < 10kDa 한외 여과 분획물 및 P3는 < 30 kDa 한외 여과 분획물을 나타낸다.
도 10a 내지 도 10h는 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 에센스, 영양크림, 바디로션, 린스, 샴푸, 바디클렌저, 로션, 스킨의 제조 공정을 각각 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 11e는 본 발명의 화정품 조성물을 포함하는 마스크팩의 제조 공정의 대표적인 단계를 사진으로 나타낸 것이다.
도 12 및 도 13은 본 발명의 에센스를 바른 시험군의 육안으로 평가된 변화의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14 내지 도 18은 본 발명의 에센스를 바른 시험군의 주름 파라미터 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 19 내지 도 23은 본 발명의 에센스를 바른 시험군의 전체적인 효능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 에센스를 바른 시험군의 사용성에 대한 만족도를 보여주는 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 틸라피아 비늘로부터 얻어진 효소적 가수분해물이 항산화 활성, 주름개선 효과 및 미백 활성을 가진다는 점을 확인하고, 이러한 활성을 가진 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물을 기능성 화장품 조성물의 용도로 개발하였다.

따라서, 본 발명은 틸라피아(Tilapia mossambica) 비늘 추출물의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.

틸라피아는 아프리카 동남부가 원산지인 민물고기로, 이집트에서 약 2천여 년 전부터 양식하여 왔다고 기록되어 있다. 과학적인 양식은 1924년 케냐에서 처음으로 실시되어 곧 아프리카 전역으로 확산되었으며, 1940년대에는 동양으로, 50년대에는 북미 등으로 이식되었다. 현재는 전세계 100여 개국에서 사육이 이루어지고 있으며 대한민국에는 1955년 5월에 태국에서 내수면연구소를 통해 도입되었다.

대한민국에 이식된 종은 Oreochromis niloticus와 Oreochromis mossambicus이며, 이들 종을 합쳐서 일반적으로 틸라피아라고 부른다. 붉은돔의 대체어로 이용되므로 지역에 따라 역돔, 민물돔이라고도 한다. 「한국어도보」에서는 태국에서 이식되었다 하여 '태래어(泰來漁)'라고 적고 있다.

1983년 Ethelwynn Trewavas에 의해 Tilapia, Sarotherodon, Oreochromis의 3속으로 분류되고 있으며, 전세계적으로 아종을 포함하여 총 100여 종이 알려져 있다. 환경 저항성이 강하며 성장이 빠르고 저급질의 사료로도 양식이 가능하여 해마다 생산량이 증가하고 있다.

서식수온의 한계는 14∼45℃의 범위에 대체로 모든 종류가 포함되고, 최적수온 범위는 24∼32℃이다. 일반적으로 어릴 때는 동물성 먹이를 주로 먹으며, 성장함에 따라 식성이 식물성이나 잡식성으로 변한다. 수온이 21℃ 이상 유지되면 계속 산란하며 수컷이 바닥에 산란장을 만들고 암컷을 유인하여 산란한다. 수정된 알은 암컷이 입 속에 넣어 부화시킨다.

본 발명의 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물은 (S1) 틸라피아 비늘을 수세 후 원적외선으로 건조시키는 단계; (S2) 건조된 틸라피아 비늘을 열수 추출하는 단계; (S3) 열수 추출된 틸라피아 비늘을 효소적 가수분해시키는 단계; (S4) 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물을 활성탄 여과시키는 단계; (S5) 활성탄 여과물을 0.4~0.5μm의 여과막으로 여과시키는 단계; (S6) 0.4~0.5μm의 여과막에 의한 여과물을 이온교환수지막으로 여과시키는 단계; (S7) 이온교환수지막 여과물을 한외여과막으로 분획하는 단계; 및 (S8) 분획물을 농축 후 동결건조 및 분쇄하는 단계를 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

틸라피아 비늘은 대한민국 전역에서 용이하게 입수할 수 있으며, 입수 후 담수로 세척하여 건조시킨 후 효소적 가수분해물을 얻는데 사용하는 것이 바람직하다. 상기 건조는 원적외선을 이용하는 것이 효과적이다.

상기 효소적 가수분해물은 틸라피아 비늘을 그대로 단백질 분해 효소로 처리하여 얻거나, 또는 틸라피아 비늘을 먼저 열수 추출하고, 열수추출물에 단백질 분해 효소를 처리하여 얻을 수 있다. 가수분해물의 수득율을 높이기 위하여는 열수 추출을 먼저 수행하는 것이 바람직하다. 열수 추출의 조건은 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 100℃에서 1~5시간, 더욱 바람직하게는 100℃에서 3시간 동안 추출한다.

본 발명에 사용될 수 있는 단백질 분해 효소는 예를 들어, α-키모트립신(α-chymotrypsin), 알칼라아제(alcalase), 코지자임(Kojizyme), 프로타멕스(protamex), 트립신(trypsin) 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 α-키모트립신 또는 알칼라아제이다. 가수분해 조건은 특별히 제한되지는 않으나, 각 효소의 최적 pH 및 온도에서 3~24시간 동안 가수분해 반응을 시킬 수 있다.

가수분해물은 활성탄을 사용하여 여과시키는데, 이는 가수분해 후에 생기는 이취와 특유의 색을 제거하기 위함이다. 활성탄을 사용하는 여과 방법은 공지의 것이라면 어떠한 것이라도 무방하다.

활성탄 여과 후에는 다시 직경 0.4~0.5μm의 여과막을 통하여 이물질 등을 제거하는 공정을 거치고, 가수분해물 내에 잔존할지도 모르는 중금속이나 기타 이물질들을 완전히 제거하기 위하여 이온교환수지막을 이용한 여과를 수행한다.

이와 같은 다단계의 여과 과정을 거친 가수분해물은 한외여과막을 사용하여 분자량에 따라 분획하는데, 5kDa, 10kDa 및 30kDa의 분자량을 갖는 분획물을 한외여과막을 통하여 얻는 것이 바람직하다. 항산화 활성, 주름개선, 미백 활성을 나타내는 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물의 분자량 분포는 5kDa 이하로부터 30kDa까지 다양한데, 본 발명의 화장품 조성물로 적합한 효소적 가수분해물의 분자량은 5kDa이하인 것이 가장 바람직하다.

위와 같은 공정을 거쳐 얻어진 분획물은 농축과정을 거쳐 건조되며, 이후 분쇄하여 사용될 때까지 보관한다.

본 발명의 화장품 조성물은 예를 들어, 에센스, 영양크림, 바디로션, 린스, 샴푸, 바디클렌저, 로션, 스킨, 마스크팩 등의 형태로 제조될 수 있으며, 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 형태로의 제조는 당업자에게 알려진 다양한 제조 공정에 따라 용이하게 수행될 수 있을 것이다.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[ 실시예 ]

1. 재료

틸라피아 비늘은 제주도 서귀포시에 위치한 (주)청룡수산에서 입수하였으며, 담수를 이용하여 수세 후 사용하였다.

2. 틸라피아 비늘의 일반 성분 측정

건조된 틸라피아 비늘의 수분, 조단백질, 조지방 및 회분을 측정하였다. AOAC 방법에 준하여 수분 함량은 0.002g 이하의 유의차를 항량으로 하여 105℃ 상압가열건조법으로 측정하였고, 조단백질 함량은 Micro Kjeldahl법으로 측정하였으며, 회분 함량은 건식법으로 측정하였다.

성분	측정값(%)
조단백질	97.06±0.1
수분	2.6±0.01
회분	0.3±0.01
기타	0.04±0.01

표 1에 제시된 바와 같이, 수분 함량은 2.6±0.01, 회분 함량은 0.3±0.01이고, 조단백질 함량은 97.06±0.1이었고, 나머지 성분이 0.04±0.01이었다. 틸리파아와 같은 민물 어종인 잉어의 비늘을 대상으로 성분 분석을 한 결과 비늘 100g 중 조단백질이 잉어는 78.88g임을 감안하면, 상기 결과는 같은 민물 어종인 틸라피아 비늘의 단백질 함량이 매우 높다는 것을 알 수 있다. 이것으로부터 틸라피아 비늘이 함유한 단백질의 높은 함량은 단백질 원료 산업에서 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있다.

3. 틸라피아 비늘로부터 효소적 가수분해물의 제조

건조된 틸라피아 비늘을 표 2에 제시된 것과 같이 5종의 단백질 가수분해효소를 이용하여 그 효소에 해당하는 적정 조건하에서 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물을 다음의 두가지 방법으로 제조하였다.

효소	pH	온도(℃)	기원
α-키모트립신 (α-chymotrypsin)	7.8	25	Bovine Pancreas
알칼라아제 (alcalase)	8.0	50	Bacillus licheniformis
코지자임 (kojizyme)	6.0	40	Bacillus sp.
프로타멕스 (protamex)	6.0	40	A. oryzae
트립신 (trypsin)	7.6	25	Procine Pancreas

첫 번째 방법으로는, 틸라피아 비늘을 열수 추출 없이 곧바로 효소를 이용하여 가수분해하였다. 즉, 틸라피아 비늘 10g을 증류수 100ml와 섞은 후, 각각의 효소를 첨가하여 각 효소별 최적 pH와 온도에서 시간 경과(3, 6, 12, 18, 24시간)에 따라 가수분해 하였다.

두 번째 방법으로는, 틸라피아 비늘 10g을 증류수 100ml와 혼합한 후, 100℃에서 3시간 동안 열수 추출한 후, 각각의 효소를 첨가하여 각 효소별 최적 pH와 온도에서 시간 경과(3, 6, 12, 18, 24시간)에 따라 가수분해하였다.

위에서 설명된 각각의 방법에 따라 제조된 가수분해물을 100℃에서 10분 동안 끓여 효소 반응을 정지시키고, pH를 중성으로 맞춘 후 원심분리(3500rpm, 10분)와 감압여과로 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액을 동결건조하여 시료로 이용하였다.

4. 틸라피아 비늘 유래 효소적 가수분해물의 가수분해도 측정

틸라피아 비늘 유래 효소적 가수분해물의 가수분해도를 TCA(trichloroacetic acid)법으로 측정하였다. 즉, 반응이 종료된 반응 혼합물을 원심분리(12000rpm, 15분)하여 상층액으로부터 2ml를 취하고, 여기에 20% TCA를 동량 첨가하여 원심분리(3500rpm, 10분)한 다음, 상층액의 일정량을 취하여 Lowry법으로 10% TCA 가용성 질소량을 측정하여 다음의 식으로부터 가수분해도를 계산하였다.

가수분해도(%)=(10% TCA 가용성 질소량/총질소량)×100

틸라피아 비늘의 열수추출 과정 없이 효소적 가수분해만을 수행한 경우, 3시간부터 12시간까지는 시간 의존적으로 모든 5종의 효소적 가수분해물의 가수분해도가 증가한 것을 확인하였고, 12시간 이후에는 거의 유사하거나 다소 감소하는 경향을 보였다(도 2).

한편, 틸라피아 비늘의 열수 처리 후, 효소적 가수분해로 제조된 가수분해물들은 효소만을 이용하여 제조한 가수분해물들에 비해 상당히 높은 가수분해도를 보였다. 또한, 열수 처리 후, 효소적 가수분해를 시도하였을 때, 그 가수분해도는 α-키모트립신을 제외하고 6시간까지 급격히 증가하다가 그 이후까지 가수분해도는 일정하게 유지되었다. 그러나, α-키모트립신에 의해 제조된 가수분해물은 12시간까지 지속적으로 가수분해도의 증가를 보였으며, 12시간 가수분해에서 약 55%의 높은 가수분해도를 보였다(도 3). 따라서, 틸라피아 비늘의 경우 열수 처리 후, α-키모트립신 효소를 처리하는 것이 가장 효율적으로 가수분해되었다는 것을 알 수 있다.

5. 틸라피아 비늘 유래 효소적 가수분해물의 최적 가수분해 조건

효소 가수분해물의 최적 가수분해 조건을 결정하기 위하여, α-키모트립신 효소적 가수분해물의 기질 대 효소비와 기질 농도에 따라 가수분해를 수행하였다.

기질 대 효소비는 10, 20, 50, 100, 200, 500(중량/중량)이었고, 기질인 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물 농도는 1%, 3%, 5%, 10%, 20%이었다.

가수분해는 위에서 제시된 방법과 동일하게 수행하였고, 모든 가수분해 조건의 검토를 위하여 가수분해물의 가수분해도를 측정하였다.

12시간째 α-키모트립신 가수분해물을 가지고 기질 대 효소비를 상기와 같이 하여 가수분해도를 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 틸라피아 비늘인 기질 대 효소의 비가 증가할수록, 즉 효소의 농도가 감소할수록 가수분해도는 감소하였다. 또한, 틸라피아 비늘 대 효소의 비율이 10부터 200까지 증가하면서 가수분해도가 약 65%에서 약 45%까지 급격히 감소하였고, 200부터 500까지는 거의 유사한 가수분해도를 나타내었다. 이러한 결과로부터 기질 대 효소비가 100인 경우 가수분해도에 대한 경제적인 효율성을 보인다는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 틸라피아 비늘의 α-키모트립신 가수분해물을 100(wt/wt)에서 기질 농도별로 측정한 결과는 도 5에 나타낸 바와 같이, 기질의 농도가 낮을수록 가수분해도가 다소 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

6. 틸라피아 비늘 유래 효소적 가수분해물의 여과

틸라피아 비늘의 α-키모트립신 가수분해물은 활성탄 여과막을 통하여 1차로 여과하고, 다음으로 0.45μm 직경의 여과막으로 2차 여과하였다. 다음으로, 이온교환수지막을 통하여 3차로 여과하여 최종적인 여과물을 얻었다.

7. 틸라피아 비늘 유래 효소적 가수분해물로부터 분자량별 분획물의 제조

분자량별 분획물을 제조하기 위하여, α-키모트립신으로 처리된 틸라피아 효소적 가수분해물의 여과물은 5kDa, 10kDa, 30kDa의 막을 사용하여 한외여과막 분리 시스템(ultrafiltration membrane)을 이용하여 5kDa 이하, 10kDa 이하, 30kDa 이하 분획물들을 각각 제조하였다.

8. 항산화 활성 측정

DPPH는 free radical의 안정된 모델로 반응 중 DPPH의 감소는 free radical의 소거반응이 진행됨을 알 수 있고, 지질과산화의 초기반응의 억제정도를 예측할 수 있다. 유해산소라 불려지는 활성산소는 세포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 지질과산화 반응을 일으켜 체내 과산화 지질을 축적함으로 인해 생체 기능이 저하되고 동시에 노화 및 성인병 질환을 유발하는 것으로 알려져 있으며 다양한 종류의 식물성분 및 추출물에 의한 항산화 작용이 보고되고 있다. 또한, H₂O₂ 역시 대표적인 활성산소로 H₂O₂의 감소정도로 항산화 반응의 정도를 측정할 수 있다.

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 틸라피아 비늘 효소적 가수분해물 및 각 한외여과 분획물들은 우수한 DPPH radical 소거 기능이 있음을 확인할 수 있다.

9. 주름 개선 효과

피부의 진피 조직 속에는 콜라겐과 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하면서 피부의 탄력성을 유지시켜 주는데 나이, 자외선과 같은 내외적 스트레스로 인하여 탄력성, 윤택성이 감소하고, 과다 발현된 엘라스티나아제에 의하여 엘라스틴의 그물망 구조가 깨지게 되면 피부가 처지고 주름이 생기므로 피부노화가 발생하게 된다. 따라서, 피부노화의 주원인 중 하나인 엘라스틴의 분해효소인 엘라스티나아제의 활성을 저해시킴으로써 피부 노화를 억제할 수 있다.

틸라피아 비늘젤라틴 효소 가수분해물 및 4종의 한외 여과 분획물의 주름개선효과를 시험하기 위하여 Cannell 등의 방법을 이용하여 elastinase의 저해활성을 측정하였다. Elastinase 저해 활성 측정은 기질로서 elastinase substrate VIII를 사용하여 실온에서 15분간 반응시켜 p-nitoanilide의 생성량을 측정하였다. 0.2M tris-HCl(pH 8.0) buffer로 희석한 각 시험용액 160μl와 5mM elastinase substrate VIII(CALBIOCHEM) 용액 20μl 그리고 10μl/ml elastinase(sigma) 효소 20μl를 순서대로 넣은 후 25℃에서 15분 동안 반응시킨 후 ELISA reader(TECAN, AT/sunrise R/C, Switzerland)를 이용하여 410nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 틸라피아 비늘 효소적 가수분해물 및 각 한외여과 분획물들은 우수한 엘라스티나아제 저해 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

10. 미백 효과

틸라피아 비늘 알칼라아제 가수분해물 및 한외여과 분획물의 미백효과를 시험하기 위하여, Fuller 등의 방법을 이용하여 tyrosinase의 저해활성을 측정하였다. 0.1M 인산염완충액(pH 6.5) 220μl와 시료액 20μl 그리고 tyrosinase(sigma)(1500U/ml~2000U/ml)액 20μl를 순서대로 넣는다. 이 용액에 1.5mM trysine(sigma) 액 40μl를 넣고 37℃에서 10~15분 동안 반응시킨 후 ELISA reader(TECAN, AT/sunrise R/C, Switzerland)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH 6.5)을 사용하였다.

멜라닌 합성은 아미노산의 하나인 tyrosine을 기질로 하여 tyrosinase에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanin(DOPA)와 DOPA quinone 이후의 반응은 크게 적갈색이나 황색을 결정하는 pheomelanin과 흑갈색에서 갈색을 결정하는 eumelanin 생성의 2가지로 나뉘어지며, 멜라닌 생성의 주요 효소인 tyrosinase의 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시켜 미백효과를 기대할 수 있다.

이에 본 실험에서는 틸라피아 비늘 유래 젤라틴 가수분해물 및 이로부터 얻은 4종의 한외 여과 분획물의 tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 틸라피아 비늘 효소적 가수분해물 및 각 한외여과 분획물들은 우수한 티로시나아제 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

11. 틸라피아 비늘 가수분해물의 한외 여과 분획물(단백질펩타이드)의 독성검사

틸라피아 비늘 단백질 펩타이드의 독성검사를 바이오톡스텍 전문기관에 의뢰하였으며, 자세한 결과는 다음과 같다.

11-1. 틸라피아 비늘 효소가수분해물의 렛드를 이용한 단회 경구투여 독성시험

시험목적 : 암수 Sprague-Dawley 랫드를 이용하여 시험물질인 틸라피아비늘 효소 가수분해물을 단회 경구투여시 나타나는 독성반응을 관찰하고, 개략의 치사량을 구하기 위하여 실시하였다.

요약 및 결론 : 군구성은 시험물질 2,000 mg/kg의 용량 및 대조군 (주사용수)의 2군으로 하고, 암수 각각 5 마리씩 단회 경구투여 하였다. 투여 후 14일 동안, 일반증상의 관찰 및 체중측정을 실시하였고, 관찰기간 종료 시에 안락사시켜 부검하였다. 암수 2,000 mg/kg 투여군에서 사망례는 관찰되지 않았다. 또한, 일반증상, 체중 및 부검에서 시험물질 투여에 의한 영향은 인정되지 않았다. 본 시험의 조건 하에서 틸라피아비늘 효소 가수분해물을 랫드에 단회 경구투여한 결과, 개략의 치사량은 암수 각2,000 mg/kg을 상회하는 것으로 판단된다.

11-2. 틸라피아 비늘 효소가수분해물의 토끼를 이용한 피부자극시험

시험목적 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물을 토끼의 피부에 1회 처치한 후, 피부자극성의 유무 및 그 정도를 평가하기 위해 실시하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물의 피부자극시험을 16주령의 수컷 NZW 토끼 3마리를 사용해서 검토하였다. 토끼의 등부위에 좌우 각 2부위, 합 4부위의 투여부위를 설정하고, 그 중 2부위를 비찰과부위, 그 외 2부위를 찰과부위로 하였다. 시험물질원말 0.5 g을 각 1개의 비찰과 및 찰과부위의 투여부위에 적용하여 24시간 폐색첩포하였다. 투여 후 24, 48 및 72시간에 Draize의 피부반응 평가표에 따라서 피부반응을 평가하고, 투여 후 24 및 72시간에 대한 1차피부자극지수 (Primary Skin Irritation Index, P.I.I.)를 구하여 피부자극성을 판정하였다. 시험물질투여부위및 무처치대조부위의 비찰과 및 찰과부위에서 투여 후 24, 48 및 72시간에 홍반 및 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 시험물질의 1차피부자극지수 (P.I.I.)는 0이었다. 관찰기간 중, 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물은 토끼의 피부에 대해서 자극이 없는 것으로 판단된다.

11-3. 틸라피아 비늘 효소가수분해물의 토끼를 이용한 안점막자극시험

시험목적 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물을 토끼의 안점막에 1회 처치한 후, 안자극성의 유무 및 그 정도를 평가하기 위해 실시하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물의 안자극시험을 16주령의 수컷 NZW 토끼 6마리를 사용해서 검토하였다. 비세안군은 토끼 3마리의 우안 결막낭 내에 시험물질원말 0.1 g을 투여하고, 투여 후 1, 24, 48 및 72시간에 각막, 홍채 및 결막등의 안구병변을 관찰하였다. 세안군은 추가로 3마리를 사용해서 비세안군과 동일하게 투여하고, 투여 30초 후에 세척한 후 세안효과를 확인하였다. Draize의 안구병변의 등급에 따라서 시험물질의 안점막자극을 평가하고, Guillot의 안점막자극 평가표를 참조해서 안점막자극의 정도를 분류하였다. 비세안군에서는, 시험물질 투여 후 1시간 이후에 결막발적 (평점 1) 및 결막부종 (평점 1)이 관찰되었으나, 투여 후 48시간에 모두 소실되었다. 비세안군의 I.A.O.I. (Index of Acute Ocular Irritation)는 4.0으로 최종평가는 무자극물로 분류되었다. 세안군에서는, 시험물질 투여 후 1시간에 결막발적 (평점 1) 및 결막부종 (평점 1)이 관찰되었으나, 투여후 24시간에 모두 소실되었다. 세안군의 I.A.O.I.는 4.0으로, 비세안군과 비교해서 자극정도는 차이가 없지만, 안자극성의 소실시간에서 차이가 있기 때문에 세안효과가 확인되었다. 관찰기간 중, 각군의 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물은 토끼의 안점막에 대해서 무자극물로 판단된다.

11-4. 틸라피아 비늘 효소 가수분해물의 기니픽을 이용한 피부감작성시험 (Maximization법)

시험목적 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물의 안전성 시험의 일환으로, 기니픽을 이용한 피부감작성시험 (Maximization법)을 실시하여 인체 피부에 대한 알레르기 유발가능성을 검토하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물의 피부감작성시험을 Hartley계 기니픽을 사용하여 Maximization법으로 검토하였다. 시험군은 시험물질군 (5마리), 음성대조군 (5마리) 및 양성대조군 (5마리)의 합 3군으로 하였다. 또한, 예비시험의 경피투여 부위에서 홍반, 부종등의 피부반응이 확인되지 않았기 때문에, 2차감작 24시간 전에 양성대조군을 제외한 각 군의 감작부위에 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)를 도포하였다. 시험물질군은 50% 시험물질을 피내투여해서 1차감작하고, 100% 시험물질을 48시간 폐색첩포하여 2차감작하였다. 100% 시험물질 및 주사용수로 24시간 폐색첩포하여 야기한 결과, 야기 패취제거 후 24 및 48시간에 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 음성대조군은 주사용수로 1차 및 2차감작하고, 100% 시험물질 및 주사용수로 야기한 결과, 야기 패취제거 후 24 및 48시간에 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 양성대조군은 0.1 및 1.0% 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)으로 각각 1차 및 2차감작하고, 0.1% CDNB 및 olive oil로 야기한 결과, 야기패취 제거 후 24 및 48시간에 0.1% CDNB의 야기부위에서 평점 3의 강한홍반 및 부종이 모든 동물에서 관찰되었다. Olive oil의 야기부위에서는 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 관찰기간 중, 각 군의 모든 동물의 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물은 피부감작성이 없는 물질로 판단된다.

11-5. 틸라피아 비늘 효소 가수분해물의 기니픽을 이용한 광독성시험

시험목적 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물의 안전성 시험의 일환으로, 기니픽의 피부를 이용해서 광독성 유발 가능성을 검토하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물의 피부에 대한 광독성 유무 및 그 정도를 Hartley계 기니픽을 이용해서 검토하였다. 시험군은 시험물질군 (5마리), 음성대조군 (5마리) 및 양성대조군 (5마리)의 합 3군으로 하였다. 시험물질군, 음성대조군 및 양성대조군의 제모한 기니픽의 등부 피부에 좌우 각 1부위, 합 2부위의 22 cm의 투여부위를 설정하였다. 시험물질군에는 90% 시험물질을, 음성대조군에는 주사용수를, 양성대조군에는 0.1% 8-Methoxypsoralen (8-MOP)을 0.05 mL씩 각 투여부위에 개방도포하였다. 도포 약 30분 후 좌측을 광조사부위, 우측을 비광조사부위로해서 최종에너지가 약 10 J/cm2이 되도록 UV-A를 조사하였다. 광조사 후 24, 48 및 72 시간에 피부반응을 평가하고, 광독성 유무를 판정하였다. 시험물질군의90% 시험물질의 투여부위에서 광조사 후 24, 48 및 72 시간에, 광조사 유무에 관계없이 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 음성대조군의 주사용수의 투여부위에서 모든 관찰시간에, 광조사 유무에 관계없이 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 양성대조군의0.1% 8-MOP의 투여부위에서는 모든 관찰시간에, 광조사부위에서 홍반 (평점 3) 및 부종 (평점 4)이 모든 동물에서 관찰되었으나, 비광조사부위에서는 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 관찰기간 중, 각 군의 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물은 광독성이 없는 물질로 판단된다.

11-6. 틸라피아 비늘 효소 가수분해물의 기니픽을 이용한 광감작성시험 ( Adjuvant & Strip 법)

시험목적 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물의 피부에 대한 안전성 시험으로, 기니픽을 이용한 Adjuvant & Strip법을 실시하여 광감작성의 유발 가능성을 검토하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물의 광감작성을 Hartley계, 수컷 기니픽을 이용해서 Adjuvant & Strip법으로 검토하였다. 군구성은 시험물질군 (5마리), 음성대조군 (5마리) 및 양성대조군 (5마리)의 합 3군으로 하였다. 투여 0일에 감작부위 네 모서리에 주사용수-FCA 유화액을 피내주사한 후, 감작부위를 stripping 하였다. 시험물질군, 음성대조군 및 양성대조군의 감작부위에 각각 90% 시험물질, 주사용수 및 1.0% chlorpromazine (CP)을 0.1 mL씩 개방도포한 후, UV-A를 조사하였다. Stripping, 투여물질의 개방도포 및 UV-A 조사를 1일 1회, 5일간 연속해서 실시하였다. 야기는 투여 21일에 시험물질군 및 음성대조군에는 90% 시험물질 및 주사용수를, 양성대조군에는 0.1% CP 및 ethanol을 야기부위에 개방도포한 후, UV-A를 조사하여 야기하였다. 야기 광조사 후 24 및 48시간에 피부반응을 평가하였다. 시험물질군 및 음성대조군은 야기 광조사 후 24 및 48시간에, 90% 시험물질 및 주사용수의 야기부위에서 광조사 유무에관계없이 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 양성대조군은 모든 관찰시간에, 0.1% CP의 광조사부위에서 평점 3의 홍반 및 평점 3의 부종이 모든 동물에서 관찰되었다. 비광조사부위에서는 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. Ethanol의 야기부위에서는 광조사 유무에 관계없이 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 관찰기간 중, 각 군의 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 틸라피아비늘 효소 가수분해물은 광감작성이 없는 물질로 판단된다.

12. 통계 처리

본 실시예의 실험 및 분석 결과의 통계 처리는 SPSS program(SPSS Inc., Version 12.0)을 사용하여 One-way ANOVA-test를 실시하여 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955, P<0.05)로 평균간의 유의성을 검정하였다.

13. 화장품 제형

본 발명의 틸라피아 비늘 가수분해물 및 한외 여과 분획물을 포함하는 에센스, 영양크림, 바디로션, 린스, 샴푸, 바디클렌저, 로션, 스킨 및 마스크팩 형태의 화장품을 제조하였다. 구체적인 제조 공정은 도 10a 내지 도 10h 및 도 11a 내지 도 11e에 나타내었다.

14. 인체 적용 시험

14-1. 시험 목적

본 시험은 주름이 생성되기 시작하거나 이미 생성된 30세 이상의 여성을 대상으로 12주간 시험제품을 사용하게 하여 제품의 주름개선 효과 및 피부 안전성을 평가하기 위함이다.

14-2. 시험 제품

14-2-1. 시험군 및 대조군

시험군(A): 틸라피아 단백질 펩타이드 1% 함유

대조군(B): 틸라피아 단백질 펩타이드 미함유

14-2-2. 제품의 성상

에센스

14-2-3. 제품의 보관

실온 보관

14-2-4. 제품의 유효 성분

틸라피아 단백질 펩타이드 1%

14-2-5. 제품의 사용 방법

12주 동안 1일 2회(아침, 저녁), 세안 후 스킨 다음단계에서 제품 A와 B를 2번 펌핑하여 볼, 이마, 턱에 나눠놓은 후 부드럽게 펴 바르면서 흡수시켰다. 피험자는 block randomization을 통해 두 그룹으로 나누어 A그룹은 좌측에 시험군(제품 A), 우측에 대조군(제품 B)을 사용하게 하고, B그룹은 좌측에 대조군(제품 B), 우측에 시험군(제품 A)을 사용하게 하였다.

14-3. 시험 방법

14-3-1. 피험자 선정

본 시험은 30세 이상의 피험자 선정 기준에 부합하고 제외 기준에 부합하지 않는 여성 피험자 20명 이상을 대상으로 하였다.

피부 주름은 더마프로 피부과학연구소의 SOP에 따라 주름이 생성되기 시작 하거나 이미 생성된 피험자를 대상으로 시험의 목적과 방법, 기대 효능과 이상반응을 설명하여 참여의사를 보이는 자는 시험 참가 동의서를 작성하고 시험에 참여하도록 하였다.

14-3-2. 평가 방법

평가는 제품 사용 전, 제품 사용 4주, 8주, 12주 후 시점에서 눈꼬리 주름의 육안 평가와 Skin Visiometer® SV600(C+K, Germany)을 이용한 피부 주름 파라미터(R-value) 측정, VISIA®(Canfield, USA)를 이용한 사진 촬영 및 피험 자에 의한 설문평가 그리고 시험자의 관찰과 문진을 통해 피부주름 개선효과 및 피부 안전성을 평가하였다.

14-4. 통계 분석

육안평가 자료 및 기기평가 자료는 SPSS® Package Program (IBM, USA)을 이용하여 유의성을 검증하였다. 동일 피험자에게서 반복 측정한 데이터에 존재하는 상호의존성(교호작용)을 고려하기 위해 반복측정 분산분석법 (Repeated Measures ANOVA)을 적용하였다.

각 시점별 군간 비교는 공분산분석(ANCOVA)을 이용하여 제품 사용 전 두 군간의 차이를 보정하여 확인하였고, 시점별 전후 비교는 RM ANOVA을 이용하여 확인하였다.

설문평가 분석시 효능평가는 두 군의 비모수적 평균값을 비교하기 위해 Mann-Whitney U-test를 이용하였고, 사용성 종합평가는 Chi-Square test를 이용하였다. 통계학적 유의수준은 p값을 0.05 미만으로 설정하였다.

14-5. 시험 결과

14-5-1. 피험자 피부 특성

본 시험은 제외기준 및 선정기준에 준하는 30세 이상의 여성 피험자 총 24명(평균 45.6±4.2세)이 시험 종료 시까지 전 과정을 성실히 수행하였다. 피험자의 피부 특성은 설문에 의해 조사되었으며, 분석 결과는 다음과 같다.

14-5-2. 평가 방법

14-5-2-1. 육안 평가

평가는 10단계(Grade 0~9)로 2명의 시험자가 제품 사용 전과 사용 4주, 8주, 12주 후 시점에서 눈꼬리 부위의 피부 주름 상태를 독립적으로 평가하였다(표 6, 7). '군간'과 '주간변화' 사이에 교호작용이 있는지를 검증하고자 RM ANOVA를 이용하여 분석하였다(표 8, 도 14, 15).

각 시점별 군간 차이는 ANCOVA를 이용하여 분석하였고, 각 시점별 전후 변화는 RM ANOVA를 이용하여 통계적 유의성을 확인하였다.

(1) 각 시점별 군간 비교

분석 결과, 제품 사용 후 모든 평가 시점에서 시험군과 대조군 사이에 유의한 차이는 없었다(표 9).

(2) 각 시점별 전후 변화 비교

분석 결과, 제품 사용 12주 후 시점에서 시험군의 피부 주름이 다소 감소하는 경향을 보였다(표 10).

14-5-2-2. 주름 파라미터 (R- value ) 분석

제품 사용 전과 사용 4주, 8주, 12주 후 시점에서 Skin Visiometer® SV600을 이용한 시험군과 대조군의 주름 파라미터 R-value (R1~R5)를 측정하여 피부 주름을 평가하였다(표 11).

'군간'과 '주간변화' 사이에 교호작용이 있는를 검증하고자 RM ANOVA를 이용하여 분석하였다(표 12, 도 16 내지 20).

5가지 주름 파라미터(R1~R5) 모두 Group*Week (군간*주간변화)의 교호작용은 유의하게 나타나지 않았지만 시점별(WEEK)로 유의한 차이가 있음을 알 수 있었다.

(1) 각 시점별 군간 비교

분석 결과, 제품 사용 12주 후 시점에서 파라미터 중 R1은 시험군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 나머지 파라미터(R2, R3, R4, R5)에서 군간 유의차는 없었다(표 13, 도 16 내지 20).

(2) 각 시점별 전후 변화 비교

분석 결과, 시험군의 경우 파라미터 중 R2는 제품 사용 4주, 12주 후 시점에서, R1, R3, R4, R5는 제품 사용 12주 후 시점에서 유의하게 감소하였으며, 대조군은 파라미터 중 R2, R5가 제품 사용 12주 후 시점에서 유의하게 감소하였다(p<0.05, 표 14, 도 16 내지 20).

14-5-2-3. 효능 및 사용성에 관한 설문 분석

제품 사용 후 각 시점에서 피험자들이 작성한 효능에 관한 설문과 제품 사용성 종합 설문에 관한 평가를 종합하였다.

(1) 효능에 관한 설문 평가

평가 결과, '촉촉해짐', '부드러움' 항목은 제품 사용 12주 후 시점에서 시험군과 대조군 모두 피험자의 79~88%가 긍정적으로 응답하였다. 모든 항목에서 군간 유의차는 없었다(표 15~19, 도 21 내지 25).

(2) 사용성에 관한 설문 평가

평가 결과, '색', '향', '흡수력', '만족도' 항목에서 시험군과 대조군 모두 58~88%의 피험자가 긍정적으로 응답하였다(표 20, 도 26).

14-5-3. 피부 안전성 평가

본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다(표 21).

Claims

다음의 단계들을 포함하는 화장품 조성물의 제조 방법:
(S1) 틸라피아(Tilapia mossambica) 비늘을 수세 후 원적외선으로 건조시키는 단계;
(S2) 건조된 틸라피아 비늘을 열수 추출하는 단계;
(S3) 열수 추출된 틸라피아 비늘을 α-키모트립신(α-chymotrypsin)으로 효소적 가수분해시키는 단계;
(S4) 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물을 활성탄 여과시키는 단계;
(S5) 활성탄 여과물을 0.4~0.5μm의 여과막으로 여과시키는 단계;
(S6) 0.4~0.5μm의 여과막에 의한 여과물을 이온교환수지막으로 여과시키는 단계;
(S7) 이온교환수지막 여과물을 한외여과막으로 여과하여 분자량 5kDa 미만의 분획물을 얻는 단계; 및
(S8) 분자량 5kDa 미만의 분획물을 농축 후 동결건조 및 분쇄하는 단계.
제 1항의 제조 방법에 의하여 제조되는 화장품 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 화장품 조성물은 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
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