CN115850535B

CN115850535B - 一种蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法

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Publication number: CN115850535B
Application number: CN202310041266.XA
Authority: CN
Inventors: 刘美玉; 刘恒洋; 连海平; 尹玉鑫; 宋绍琦; 郭晓徐
Original assignee: Hebei University of Engineering
Current assignee: Hebei University of Engineering
Priority date: 2023-01-13
Filing date: 2023-01-13
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2043-01-13
Also published as: CN115850535A

Abstract

本发明公开了一种蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法，属于生化药剂技术领域。本发明公开的蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法包括以下步骤：将混合试剂加入到超微粉碎蛋壳膜中，水浴提取；提取液经离心得到所述硫酸软骨素；所述混合试剂为碱试剂和盐试剂，碱试剂和盐试剂的碱盐比为(3～7)mL∶1mL；所述混合试剂与超微粉碎蛋壳膜的料液比为1g∶(13～17)mL。本发明公开的蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法，首先对蛋壳膜进行超微粉碎，之后利用碱试剂和盐试剂对蛋壳膜中的硫酸软骨素进行提取，有效的提高了硫酸软骨素的提取率，提取率可达89.85％。

Description

一种蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法

技术领域

本发明属于生化药剂技术领域，具体涉及一种蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，禽蛋产品在世界范围内的消费量不断增多，大量废弃蛋壳随之产出，从而造成了极大的环境污染和资源浪费。蛋壳中含有大量的可利用资源，其中含有的钙类物质、活性肽、蛋白质等成分，具有很高的利用价值。近年来，对于废弃鸡蛋壳的研究逐渐加深，人们逐渐重视对此资源的开发与利用，这项研究的开展，不仅能改善日益严重的环境问题，而且变废为宝，提高了鸡蛋的附加价值，也推动了鸡蛋壳深加工产业的发展，可谓一举两得。

硫酸软骨素呈白色粉末，无臭，有吸湿性，遇水有粘黏性，是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，广泛存在于动物组织、细胞表面与细胞基质之间。硫酸软骨素的用途广泛，可作为膳食保护剂，起到保护关节等软骨组织的效果，可以很好的缓解关节不适等症状。同时硫酸软骨素具有抗凝血、镇静、抗肿瘤、抗氧化、调节血脂等功能，因此硫酸软骨素被广泛应用于食品、医疗、化妆品等行业中。近年来对于硫酸软骨素的需求量不断增加，以硫酸软骨素作为研究对象的产品具有广阔的前景。

目前硫酸软骨素可以从动物软骨组织提取，通过高温蒸煮，使动物结缔组织破坏，再通过碱解法或酶解法提取硫酸软骨素。鸡蛋壳膜中含有一定量的硫酸软骨素，相比于从动物软骨组织中提取，从废弃蛋壳膜中提取硫酸软骨素可充分利用蛋壳资源，变废为宝，而蛋壳膜获取方式简单，且原材料丰富，也能直接的增加硫酸软骨素的产量。目前从蛋壳中提取硫酸软骨素的方法很多，常见的方法有碱提取法、碱酶法、碱盐法。这些工艺提取的硫酸软骨素，在提取率上相差不大。刘涛等通过碱盐法从蛋壳膜中提取硫酸软骨素，提取率为74％(刘涛,张铁鹏,栾欣悦,刘贺,刘宁.响应面法优化蛋壳膜硫酸软骨素提取工艺[J].包装工程,2019,40(17):48-55.)；刘宁等通过酶提取法硫酸软骨素，利用木瓜蛋白酶水解蛋壳质的性质，将硫酸软骨素从糖蛋白中分离出来，进行硫酸软骨素的提取，该工艺的提取率为75.31％，略高于碱盐法提取率(刘宁，栾欣悦，刘涛，等.木瓜蛋白酶提取蛋壳膜中硫酸软骨素的研究[J].农产品加工,2015(13):1-4+7.)；刘国庆等人利用稀碱法处理蛋壳膜，并通过双酶法进行提取，采用胰蛋白酶和胃蛋白酶相结合的提取工艺，该工艺下硫酸软骨素的提取率为76％(刘国庆，凌庆枝，孙军飞.蛋壳膜硫酸软骨素的提取工艺及其优化[J].食品科学,2007(09):283-286.)。对比其提取工艺，碱盐法提取硫酸软骨素，工艺相对简单，提取成本低，但提取率较低，因此，如何提高碱盐法的提取率，实现批量生产，成为本领域亟需解决的技术问题。

发明内容

为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案∶

一种蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法，包括以下步骤∶将混合试剂加入到超微粉碎蛋壳膜中，水浴提取；提取液经离心得到所述硫酸软骨素。

进一步地，所述混合试剂为碱试剂和盐试剂；其中碱试剂为体积分数2％的氢氧化钠溶液；盐试剂为体积分数2％的氯化钠溶液；碱试剂和盐试剂的碱盐比为(3～7)mL∶1mL。

更进一步地，所述碱试剂和盐试剂的碱盐比为6mL∶1mL。

进一步地，所述混合试剂与超微粉碎蛋壳膜的料液比为1g∶(13～17)mL。

更进一步地，所述混合试剂与超微粉碎蛋壳膜的料液比为1g∶15.5mL。

进一步地，所述超微粉碎蛋壳膜的制备方法为：

(1)将鸡蛋壳置于水中浸泡，之后撕去附着在鸡蛋壳内壁的蛋壳膜，收集备用；

(2)将步骤(1)收集的蛋壳膜经干燥，粉碎、过筛，球磨，得到所述超微粉碎蛋壳膜。

更进一步地，步骤(1)中，所述浸泡的时间为2h。

更进一步地，步骤(2)中，所述干燥的温度为50℃，时间为2h；所述粉碎的时间为30s；所述过筛为过60目筛；所述球磨的球料比为7∶1，转速为500×g，球磨时间为180min。

进一步地，所述水浴提取的温度为30～70℃，时间为2～10h。

进一步地，所述水浴提取的温度为59℃，时间为7.3h。

更进一步地，所述离心的转速为4000×g，时间为10min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明公开的蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法，首先对蛋白膜进行超微粉碎，之后利用碱试剂和盐试剂对蛋壳膜中的硫酸软骨素进行提取，有效地提高了硫酸软骨素的提取率，提取率可达89.85％；

(2)本发明利用单因素实验以及响应面实验对提取工艺条件进行优化，得到蛋壳膜中提取硫酸软骨素的最佳工艺条件为蛋壳膜与混合试剂料液比为1∶15.5，提取温度为59℃，碱盐比为6∶1，提取时间为7.3h。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1～5得到的硫酸软骨素提取液的提取率；

图2为本发明实施例3和实施例6～9得到的硫酸软骨素提取液的提取率；

图3为本发明实施例8和实施例10～13得到的硫酸软骨素提取液的提取率；

图4为本发明实施例12和实施例14～17得到的硫酸软骨素提取液的提取率；

图5为料液比与提取温度两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图；

图6为料液比与碱盐比两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图；

图7为料液比与提取时间两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图；

图8为提取温度与碱盐比两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图；

图9为提取温度与提取时间两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图；

图10为碱盐比与提取时间两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。

另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中，新鲜鸡蛋壳收集于河北省邯郸市美食林工业园；

以下实施例中所用化学试剂均为分析纯；

以下实施例中所用电子天平购自上海精密科学仪器有限公司；所用分样筛购自浙江上虞市道墟张兴纱筛厂；所述高速粉碎机为摇摆式中药粉碎机，购自新昌县德科机械有限公司；所述鼓风干燥箱为电热鼓风干燥箱，购自上海博珍仪器设备制造厂；所述离心机为高速冷冻离心机，购自广东佛衡仪器有限公司；所用立式方型球磨机购自湖南创未来机电设备制造有限公司；

以下实施例中，所述超微粉碎蛋壳膜的制备方法为：

1)将新鲜鸡蛋壳置于蒸馏水中浸泡2h，之后手工撕去附着在鸡蛋壳内壁的蛋壳膜，收集备用；

2)将步骤1)收集的蛋壳膜置于鼓风干燥箱中，于50℃下干燥2h；

3)将步骤2)干燥后的蛋壳膜置于高速粉碎机中粉碎30s，过60目分样筛；

4)将步骤3)粉碎、过筛后的蛋壳膜用稀盐酸(稀盐酸浓度为0.5mol/L)处理除去其中残留的蛋壳，过滤，并用清水洗涤筛上的蛋壳膜，晾干，再置于立式方型球磨机中球磨，得到超微粉碎蛋壳膜；其中球料比为7∶1，球磨转速为500×g，时间为180min。

实施例1

蛋壳膜中硫酸软骨素的提取

1)取1g(精确到0.01g)超微粉碎蛋壳膜，将其置于锥形瓶中，之后向锥形瓶中加入13mL混合试剂(即料液比为1g∶13mL)，并用保鲜膜将瓶口封住，混合试剂为碱试剂与盐试剂的混合物，其中碱试剂为体积分数2％的氢氧化钠溶液；盐试剂为体积分数2％的氯化钠溶液，碱盐比为3mL∶1mL；

2)将步骤1)瓶口封住的锥形瓶置于50℃的水浴锅中水浴提取6h；

3)将步骤2)得到的提取液倒入50mL的离心管中，置于离心机中，设置离心机转速为4000×g，时间为10min，上清液即所述硫酸软骨素提取液；

4)向步骤3)得到的硫酸软骨素提取液中按照硫酸软骨素提取液∶无水乙醇的体积比为1∶30加入无水乙醇进行一次醇沉，收集沉淀物并加入与一次醇沉等量的无水乙醇进行二次醇沉，收集二次醇沉沉淀物脱水干燥，得到固体硫酸软骨素。

对实施例1得到的硫酸软骨素提取液进行硫酸软骨素提取率测定，测定方法为：

硫酸软骨素提取率测定方法

(1)多糖标准曲线的制作：用电子天平准确称取20mg的标准葡萄糖，将称取好的葡萄糖加入到蒸馏水中，装入到500mL的容量瓶中，用胶头滴管滴至刻度线，定容摇匀好备用；采用移液枪分别吸取0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL的标准溶液至试管中，并用蒸馏水补至2.0mL；依次向试管中加入1mL的苯酚溶液，以及5mL的浓硫酸；另做一个2mL的蒸馏水重复上述显色操作做空白对照试验，将上述制得结束试管进行摇匀，静置30min后，放入紫外分光光度仪中，在波长为490nm下测得吸光度；以多糖质量浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标绘制标准曲线；

(2)硫酸软骨素含量测定：采用移液枪定量吸取250μL实施例1得到的硫酸软骨素提取液，用蒸馏水补至2mL，向其加入1mL的苯酚，以及5mL的浓硫酸，并进行充分的摇匀，将其静置30min后，移至紫外分光光度仪中，在波长为490nm下测其吸光度，将所测得的吸光值，代入标准曲线中，通过换算便可得到硫酸软骨素的含量；

(3)硫酸软骨素提取率的计算

式中：W—硫酸软骨素的提取率；c—将待测样品代入吸光值中测得的多糖含量；v1—定容液体的体积；v2—测量时所取液体的体积；M—蛋壳膜中总糖含量。

为探讨料液比对蛋壳膜中硫酸软骨素提取率的影响，设置实施例2～5对料液比进行单因素试验，实施例2～5与实施例1的区别仅在于料液比依次为1g∶14mL，1g∶15mL，1g∶16mL，1g∶17mL；

实施例1～5得到的硫酸软骨素提取液提取率如图1所示，由图1可以发现，在料液比为1∶13到1∶15区间，随着料液比的上涨，硫酸软骨素的提取量也在不断升高；在料液比为1∶15时，硫酸软骨素的提取量达到最高点，此时的提取量为73.5％；这是因为随着料液比的增加，蛋壳膜中的水分不断增多，碱试剂与盐试剂对蛋壳膜的接触面积增大，从而加速了硫酸软骨素的提取；料液比为1∶15之后，硫酸软骨素的提取量趋势趋于平缓，并无显著的提升，分析其原因为∶1∶15的料液比基本可使蛋壳膜中的硫酸软骨素的提取进行反应完全，因此料液比为1∶15之后，再次提高料液比对硫酸软骨素的提取量影响不大，综合考虑选择最佳料液比为1∶15即可满足试验需要。

为探讨提取温度对蛋壳膜中硫酸软骨素提取率的影响，设置实施例6～9对提取温度进行单因素试验，实施例6～9与实施例3的区别仅在于提取温度依次为30℃，40℃，60℃，70℃；

实施例3和实施例6～9得到的硫酸软骨素提取液提取率如图2所示，由图2可以发现，随着提取温度从30℃升高到60℃，硫酸软骨素的提取率也在跟着温度的升高而增长，在提取温度为60℃时，此时硫酸软骨素的提取率达到最高，为74％。这是因为随着温度的提升，溶液中的反应速率也在加快。提取温度为60℃为最佳反应温度，此时的硫酸软骨素的提取率最高。60℃之后，再次升高温度，硫酸软骨素的提取率趋于平缓，并略有降低态势。这是由于过高的提取温度可能会导致蛋壳膜的性质发生变化，从而不利于硫酸软骨素的提取。综合考虑，控制提取温度为60℃作为蛋壳膜中提取硫酸软骨素的最适温度。

为探讨碱盐比对蛋壳膜中硫酸软骨素提取率的影响，设置实施例10～13对碱盐比进行单因素试验，实施例10～13与实施例8的区别仅在于碱盐比依次为4mL∶1mL，5mL∶1mL，6mL∶1mL，7mL∶1mL；

实施例8和实施例10～13得到的硫酸软骨素提取液提取率如图3所示，由图3可以发现，随着碱盐比的升高，硫酸软骨素的提取率呈现先升高再降低的趋势。碱盐比从3∶1增加到6∶1，硫酸软骨素的提取率逐渐升高，在碱盐比为6∶1时硫酸软骨素提取率达到最高值为83.2％，这是因为适当的提高碱浓度会促进碱解的迅速进行，加速硫酸软骨素的提取。当碱盐比达到7∶1后，硫酸软骨素的提取率升高不显著，且有降低的趋势，这是由于过高的碱盐比的加入，会对蛋壳膜造成一定程度的破坏，导致蛋壳膜的性质发生变化，从而影响硫酸软骨素的提取。综合考虑，碱盐比6∶1为最佳碱盐比。

为探讨提取时间对蛋壳膜中硫酸软骨素提取率的影响，设置实施例14～17对提取时间进行单因素试验，实施例14～17与实施例12的区别仅在于提取时间依次为2h，4h，8h，10h；

实施例12和实施例14～17得到的硫酸软骨素提取液提取率如图4所示，由图4可以发现，随着提取时间的增加，硫酸软骨素的提取率呈现逐渐增长的趋势，提取时间从2h延长到8h的阶段，硫酸软骨素的提取率显著提高，在提取时间为8h时，此时的提取率基本达到最高，提取率为88％。分析其原因，适当的延长提取时间会使蛋壳膜中的硫酸软骨素碱解更为完全，因此硫酸软骨素的提升也是显著提升，8h基本上可以使其完全提取，此时延长反应时间对硫酸软骨素的提取率影响不大，且过长的提取时间有可能会造成微生物的污染，且造成试验时长的浪费，因此综合考虑，控制提取时间为8h为硫酸软骨素的最佳提取时长。

为进一步优化从蛋壳膜中提取硫酸软骨素的最佳工艺参数，根据单因素的试验结果，采用Design Expert 10设计四因素三水平的响应面试验，将料液比、提取温度、碱盐比、提取时间四个影响因素较大的因子，利用响应面试验优化最佳工艺参数，以硫酸软骨素的提取量作为参考指标进行分析，响应面分析因子水平编码如表1所示；

表1响应面分析因子水平编码

因素	A料液比	B提取温度(℃)	C碱盐比	D提取时间(h)
					-1	1:14	50	5:1	6
0	1:15	60	6:1	8
					1	1:16	70	7:1	10

响应面分析设计方案及结果如表2所示；

表2响应面试验设计及结果

对蛋壳膜中提取硫酸软骨素的数据进行多元回归拟合，结果表明，各因素与响应面的二次多项回归模型为：Y＝+88.85+5.44×A+0.042×B+0.78×C-1.35×D-0.41×AB-3.25×AC-0.025×AD-0.85×BC+0.063×BD-1.30×CD-7.69×A²-4.01×B²-6.26×C²-0.86×D²。对回归模型进行方差分析，结果如表3所示；

表3响应面试验结果方差分析

根据P值大小进行判断是否显著，当P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

由表3可知，蛋壳膜中提取硫酸软骨素的提取率为响应值时，该模型P<0.01，表示该二次项方程为极显著；失拟项P＝0.1454>0.05，模型失拟项不显著，失拟项不显著表示该二次项模型拟合较好，模型决定系数R²为0.9843，表示该二次项模型可以解释98.43％的试验数据，试验拟合较好，且误差较小，R²adj为0.9686，两者数值较高，且较为接近，表示模型有较好的使用性和通用性，该模型可以很好的反应响应值硫酸软骨素的提取量的变化，可采用该模型对蛋壳膜膜中提取硫酸骨素进行实际分析；通过变异CV可以反应出模型的可信度，变异系数的值越低，表示模型的可信度越高，该试验的变异系数为1.33％，表示该模型较为可信。各因素对蛋壳膜中提取硫酸软骨素的影响由高到低分别是：A>D>C>B，即料液比>提取时间>碱盐比>提取温度。

各因素交互作用的响应面3D图如图5～8所示，其中，图5为料液比与提取时间两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图；图6为提取温度与碱盐比两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图；图7为提取温度和提取时间两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图；图8为碱盐比和提取时间两因素交互作用的响应面3D图，其中(a)为响应面图，(b)等高线图。

由图5～8响应面3D图可直观描述回归模型：等高线图形越趋近于圆形表示两个自变量的交互作用越弱，登高线越趋近于椭圆形表示两个变量的交互作用越强。各个因素之间的交互作用对蛋壳膜中提取硫酸软骨素影响强弱排序为：AC>CD>BC>AB>BD>AD，即料液比与碱盐比之间的交互作用>碱盐比与提取时间之间的交互作用>提取温度与碱盐比之间的交互作用>料液比与提取温度之间的交互作用>提取温度与提取时间之间的交互作用>料液比与提取时间之间的交互作用。相对而言本实验中A(料液比)与C(碱盐比)交互作用曲面最为陡峭，表明在提取硫酸软骨素试验中，料液比的上涨对碱盐比的影响显著(P<0.01)。AC的交互影响达到极显著水平(P<0.01)，CD的交互影响达到显著水平(P<0.05)。

由回归模型预测和分析得出蛋壳膜中提取硫酸软骨素最佳工艺为：料液比为1:15.439，提取温度为58.12℃，碱盐比为5.823:1，提取时间为7.258h，此时的硫酸软骨素的提取率可达89.826％。

验证实验

粗蛋壳膜为1g时，选取料液比为1:15.5，提取温度为59℃，碱盐比为6:1，提取时间为7.3h,在此条件下，硫酸软骨素的提取率可达89.85％，理论值与实际值相差不大，拟合较好，相对误差<0.5％，该验证实验结果表明采用此响应面得到的工艺参数真实可信。

对比例1

同实施例11，区别在于，蛋壳膜状态为纯手撕蛋壳膜，其中纯手撕蛋壳膜的制备方法为将新鲜鸡蛋壳置于蒸馏水中浸泡2h，之后手工撕去附着在鸡蛋壳内壁的蛋壳膜，收集起来，放置鼓风干燥箱中50℃两小时，即纯手撕蛋壳膜。

对比例2

同实施例11，区别在于，蛋壳膜状态为普通粉碎蛋壳膜，其中普通粉碎蛋壳膜的制备方法为将干燥好的手撕蛋壳膜放置高速粉碎机中粉碎30s，过60目筛即得普通粉碎蛋壳膜。

对比例1～2制备得到的硫酸软骨素提取液进行提取率测试，测试结果如表4所示；

表4不同蛋壳膜对硫酸软骨素提取率的影响

由表4可以看出，在相同条件下，手撕蛋壳的硫酸软骨素提取率最低，普通粉碎提取率次之，超微粉碎蛋壳膜提取率最高，这是因为随着蛋壳膜粒径的减小，粒径的比表面积不断加大，碱试剂与蛋壳膜的接触面积也在增加，促进了硫酸软骨素与蛋白质之间的化学键断裂，使硫酸软骨素更好的释放，因此采用超微粉碎蛋壳膜进行硫酸软骨素的提取最佳。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将混合试剂加入到超微粉碎蛋壳膜中，水浴提取；提取液经离心得到所述硫酸软骨素；

所述混合试剂为碱试剂和盐试剂混合液；其中碱试剂为体积分数2％的氢氧化钠溶液；盐试剂为体积分数2％的氯化钠溶液；

所述碱试剂和盐试剂的碱盐比为6mL∶1mL；

所述混合试剂与超微粉碎蛋壳膜的料液比为1g∶15.5mL；

所述水浴提取的温度为59℃，时间为7.3h。

2.根据权利要求1所述的蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，所述超微粉碎蛋壳膜的制备方法为：

3.根据权利要求2所述的蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸泡的时间为2h；步骤(2)中，所述干燥的温度为50℃，时间为2h；所述粉碎的时间为30s；所述过筛为过60目筛；所述球磨的球料比为7∶1，转速为500×g，球磨时间为180min。

4.根据权利要求1所述的蛋壳膜中硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，所述离心的转速为4000×g，时间为10min。