CN106478842A

CN106478842A - 一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法

Info

Publication number: CN106478842A
Application number: CN201610953551.9A
Authority: CN
Inventors: 陈士恩; 赫欣睿; 武中庸
Original assignee: Northwest Minzu University
Current assignee: Northwest Minzu University
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2017-03-08

Abstract

本发明属于生物制品技术领域，特别是一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法。包括原料预处理、超声波辅助碱盐提取、木瓜蛋白酶酶解、吸附、脱蛋白、醇沉、真空干燥等步骤。本发明用于制备硫酸软骨素，纯度可达90％以上，且在原有的硫酸软骨素制备工艺的基础上提高了对软骨粉的利用率以及硫酸软骨素纯度，原料和用料均采用符合清真要求的产品，所制的硫酸软骨素可应用于清真产品中，适合大量推广应用。本发明在原有传统的硫酸软骨素提取工艺上加以改进，在碱盐提取步骤采用超声波辅助大大减少提取时间，缩短了硫酸软骨素生产周期，提高提取效率；并且流程中增加一道醇沉步骤，使硫酸软骨素纯度得到提升，提高产品质量，扩大经济效益。本发明中原料采用牦牛骨，酶解时采用木瓜蛋白酶，可用于清真产品的开发，填补市场空白。

Description

一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，特别是一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是来自动物喉骨、鼻软骨、气管等富含软骨组织的一类重要酸性高分子黏性多糖。根据其化学结构的不同可将其分为硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E等不同类型。不同动物体内所存在的硫酸软骨素类型不同，猪、牛、羊的喉鼻骨和关节骨中主要含有硫酸软骨素A，鲨鱼、乌贼等海洋动物的软骨中主要含有硫酸软骨素C。通常情况下，硫酸软骨素是白色或者微黄色的，是无臭、略带咸味的粉末状态，有较强的吸湿性，并且CS在水中容易溶解，但在甲醇、乙醚、丙酮和冰醋酸这些有机溶剂中不溶。硫酸软骨素的水溶液是一种粘稠状的液体，在一些特定条件（强酸、强碱和高温环境）下容易发生降解反应，分解为分子量较小的低聚糖，使溶液的粘度变小。硫酸软骨素发生化学反应变成盐后，对热的稳定性会增强，即使温度到达80℃也不易被破坏。

硫酸软骨素在酸性、碱性及酶解条件下会生成不饱和糖类物质，包括低分子硫酸软骨素和硫酸软骨素的寡糖或双糖均与β-消除反应有关。一般用530nm处的可见光吸光度值来表示硫酸软骨素在酸性、碱性和中性条件下的降解程度，吸光度值越大表示降解的程度越大，从而反映出硫酸软骨素在不同条件下的稳定性。硫酸软骨素易与钠离子、钾离子、钙离子、镁离子等阳离子相结合。硫酸软骨素的内部结构中含有的半缩醛基具有还原性，可以把碱性酒石酸铜溶液里面的Cu²⁺还原成Cu₂O。硫酸软骨素在中性、低温的环境下比较稳定，但在高温、强酸条件下比较容易发生降解反应，分子量降低。

硫酸软骨素具有多种重要生物活性。例如：具有抗炎、抗癌、抗HIV、降血脂、抗凝血活性的功效；能有效预防关节炎、减轻打鼾；还可以改善食物风味、口感、光泽及保湿性等。鉴于其潜在的医药价值，2010年《中华人民共和国药典》将硫酸软骨素列为防治心血管疾病和关节病的最佳药物。同时硫酸软骨素作为膳食补充剂和保湿剂，广泛应用于食品和化妆品领域。

目前，硫酸软骨素的提取方法多为中性盐法、碱法、酶法、碱盐法、超声波法、乙酸抽提法、酶催化法、发酵法等。常用的硫酸软骨素纯化方法主要有机溶剂沉淀法、季铵盐化合物沉淀法、超滤膜过滤法、色谱法、电泳法等。但每种方法都有其优缺点。中性盐法提取率低且浪费原材料，经济效益低；碱法提取率较高，但生产周期较长，且污染环境；酶法产率和纯度较高，生产周期较短，污染较小，是一种较理想的提取方法；超声波法提取率较低且杂质去除较难，这限制了生产上的应用；乙酸抽提法操作简便，生产周期短且成本低，但是目前国内还未采用大规模生产；发酵法操作方便且安全，但菌株培养困难而且容易发生突变。现有技术中使用频次较高的提取工艺流程为软骨粉→碱提→酶解→吸附、脱蛋白→醇沉淀→干燥→硫酸软骨素。上述提取工艺方法中对软骨粉的利用率不完全，导致部分的流失；同时普遍缺乏高效率的提纯步骤，导致硫酸软骨素纯度较低，质量不理想。而且上述硫酸软骨素制备产品只针对普通大众群体，并不能作为清真制品使用。

我国是世界上领先的畜牧大国，因此硫酸软骨素原料的来源更加广泛，价格也更加实惠，比其他国家具有很大的优势。但是眼下我国在软骨加工与应用方面还很薄弱。具体表现在生产加工工艺不成熟、销路不畅通等方面。例如许多CS生产商仍然采用浓稀碱法和稀碱稀盐法等传统工艺，造成产量较低，而一些企业的精制工艺通常包含除杂、脱色等过程，工艺控制太过繁琐，因而导致质量不稳定，其后果仍然是收率低下。同时，碱、盐等副产物容易造成环境污染。所以，发展一种操作简单、提取率较高的硫酸软骨素提取方法具有重要意义。

发明内容

本发明克服现有制备方法中软骨粉利用率较低的问题，提供一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，增加分离纯化步骤提高硫酸软骨素纯度及质量，可制得符合清真生产标准的产品。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：

A、原料预处理

将牦牛软肋、月牙骨等软骨投入恒温蒸煮锅中, 加水淹没过软骨于恒温80℃蒸煮4～6h，蒸煮后的软骨捞出用水冲洗干净，切成1～2cm³小块，然后将软骨小块放入烘箱，恒温60℃烘干6～8h至恒重，再粉碎为200目制得牦牛软骨粉粒；

B、超声波辅助碱盐提取

每克牦牛软骨粉粒中加入5-9ml质量浓度2-10％的NaOH溶液，上述溶液中逐渐加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺离子摩尔浓度升至2-4mol/L，置于超声波清洗器中超声处理1.5-3.5h，双层200目纱布滤除残渣，滤液备用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步骤B中滤液滴加浓度2mol/L的HCL溶液调节pH值至6.4-7.2，上述溶液加入木瓜蛋白酶，使木瓜蛋白酶质量浓度为40-200μg/ml ，于30-50℃水解0.5-2.5h，水解后将水浴升高至85℃灭酶；

D、吸附、脱蛋白

灭酶滤液中加入2～3g活性炭粉末进行吸附，吸附过程中间歇搅拌4h，于4℃下静置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入无水乙醇使乙醇质量浓度升至70％，室温下静置8～10h后，转速5000r/min下离心处理5min后回收固体物质，固体物质用无水乙醇洗涤脱水两次；

F、真空干燥

固体物质在恒温60℃、真空度0.07Mpa下真空干燥至恒温，研磨粉碎成400～550目粉末制得硫酸软骨素成品。

所述步骤B中每克牦牛软骨粉粒中加入6.5ml质量浓度8％的NaOH溶液，上述溶液中逐渐加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺离子摩尔浓度升至2.5mol/L，置于超声波清洗器中超声处理2.7h，双层200目纱布滤除残渣，滤液备用。

所述步骤C中滤液滴加浓度2mol/L的HCL溶液调节pH值至6.8，上述溶液每850ml中加入1g木瓜蛋白酶，于恒温37蛋水解1.5h，水解后将水浴升高至85℃灭酶。

所述步骤A中蒸煮过程中去除残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织。

本发明的有益效果为：

本发明用于制备硫酸软骨素，纯度可达90％以上，且在原有的硫酸软骨素制备工艺的基础上提高了对软骨粉的利用率以及硫酸软骨素纯度，原料和用料均采用符合清真要求的产品，所制的硫酸软骨素可应用于清真产品中，适合大量推广应用。

1、本发明在原有传统的硫酸软骨素提取工艺上加以改进，在碱盐提取步骤采用超声波辅助大大减少提取时间，缩短了硫酸软骨素生产周期，提高提取效率；并且流程中增加一道醇沉步骤，使硫酸软骨素纯度得到提升，提高产品质量，扩大经济效益。

2、本发明中原料采用牦牛骨，酶解时采用木瓜蛋白酶，可用于清真产品的开发，填补市场空白。

附图说明

图1为D-葡萄糖醛酸标准曲线

图2为碱液浓度对牦牛软骨CS含量的影响

图3为Na⁺浓度对牦牛软骨CS含量的影响

图4为料液比对牦牛软骨CS含量的影响

图5为提取温度对牦牛软骨CS含量的影响

图6为超声时间对牦牛软骨CS含量的影响

图7为料液比与超声时间响应曲面图

图8为碱液浓度与超声时间响应曲面图

图9为碱液浓度与料液比响应曲面图

图10为酶解反应温度对CS百分含量的影响

图11为酶反应浓度对CS百分含量的影响

图12为酶解液pH值对牦牛软骨CS百分含量的影响

图13为酶解反应时间对牦牛软骨CS百分含量的影响

图14为加酶量与酶解温度响应面图

图15为酶解温度与pH响应面图

图16为加酶量与pH响应面图

图17为本发明的制备方法流程图。

具体实施方式

一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：

A、原料预处理

将牦牛软肋、月牙骨等软骨投入恒温蒸煮锅中, 加水淹没过软骨于恒温80淹蒸煮4～6h，蒸煮过程中去除残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织蒸煮后的软骨捞出用水冲洗干净，切成1～2cm³小块，然后将软骨小块放入烘箱，恒温60，烘干6～8h至恒重，再粉碎为200目制得牦牛软骨粉粒；

B、超声波辅助碱盐提取

C、木瓜蛋白酶酶解

步骤B中滤液滴加浓度2mol/L的HCL溶液调节pH值至6.4-7.2，上述溶液加入木瓜蛋白酶，使木瓜蛋白酶质量浓度为40-200入木瓜蛋白酶，于30-500水解0.5-2.5h，水解后将水浴升高至85解灭酶；

D、吸附、脱蛋白

灭酶滤液中加入2～3g活性炭粉末进行吸附，吸附过程中间歇搅拌4h，于4于下静置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

F、真空干燥

固体物质在恒温60物、真空度0.07Mpa下真空干燥至恒温，研磨粉碎成400～550目粉末制得硫酸软骨素成品。

优选的所述步骤B中每克牦牛软骨粉粒中加入6.5ml质量浓度8％的NaOH溶液，上述溶液中逐渐加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺离子摩尔浓度升至2.5mol/L，置于超声波清洗器中超声处理2.7h，双层200目纱布滤除残渣，滤液备用。

优选的所述步骤C中滤液滴加浓度2mol/L的HCL溶液调节pH值至6.8，上述溶液每850ml中加入1g木瓜蛋白酶，于恒温37蛋水解1.5h，水解后将水浴升高至85解灭酶。

实施例1

一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：

A、原料预处理

将牦牛软肋、月牙骨等软骨投入恒温蒸煮锅中, 加水淹没过软骨于恒温80淹蒸煮4h，蒸煮过程中去除残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织蒸煮后的软骨捞出用水冲洗干净，切成1～2cm³小块，然后将软骨小块放入烘箱，恒温60，烘干6h至恒重，再粉碎为200目制得牦牛软骨粉粒；

B、超声波辅助碱盐提取

每克牦牛软骨粉粒中加入5ml质量浓度2％的NaOH溶液，上述溶液中逐渐加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺离子摩尔浓度升至2mol/L，置于超声波清洗器中超声处理1.5h，双层200目纱布滤除残渣，滤液备用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步骤B中滤液滴加浓度2mol/L的HCL溶液调节pH值至6.4，上述溶液加入木瓜蛋白酶，使木瓜蛋白酶质量浓度为40述溶液加入木，于30述水解0.5h，水解后将水浴升高至85解灭酶；

D、吸附、脱蛋白

灭酶滤液中加入2g活性炭粉末进行吸附，吸附过程中间歇搅拌4h，于4于下静置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入无水乙醇使乙醇质量浓度升至70％，室温下静置8h后，转速5000r/min下离心处理5min后回收固体物质，固体物质用无水乙醇洗涤脱水两次；

F、真空干燥

实施例2

一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：

A、原料预处理

将牦牛软肋、月牙骨等软骨投入恒温蒸煮锅中, 加水淹没过软骨于恒温80淹蒸煮6h，蒸煮过程中去除残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织蒸煮后的软骨捞出用水冲洗干净，切成1～2cm³小块，然后将软骨小块放入烘箱，恒温60，烘干8h至恒重，再粉碎为200目制得牦牛软骨粉粒；

B、超声波辅助碱盐提取

每克牦牛软骨粉粒中加入9ml质量浓度10％的NaOH溶液，上述溶液中逐渐加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺离子摩尔浓度升至4mol/L，置于超声波清洗器中超声处理3.5h，双层200目纱布滤除残渣，滤液备用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步骤B中滤液滴加浓度2mol/L的HCL溶液调节pH值至7.2，上述溶液加入木瓜蛋白酶，使木瓜蛋白酶质量浓度为200溶液加入木瓜，于500水解2.5h，水解后将水浴升高至85解灭酶；

D、吸附、脱蛋白

灭酶滤液中加入3g活性炭粉末进行吸附，吸附过程中间歇搅拌4h，于4于下静置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入无水乙醇使乙醇质量浓度升至70％，室温下静置10h后，转速5000r/min下离心处理5min后回收固体物质，固体物质用无水乙醇洗涤脱水两次；

F、真空干燥

实施例3

一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：

A、原料预处理

将牦牛软肋、月牙骨等软骨投入恒温蒸煮锅中, 加水淹没过软骨于恒温80淹蒸煮5h，蒸煮过程中去除残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织蒸煮后的软骨捞出用水冲洗干净，切成1～2cm³小块，然后将软骨小块放入烘箱，恒温60，烘干7h至恒重，再粉碎为200目制得牦牛软骨粉粒；

B、超声波辅助碱盐提取

每克牦牛软骨粉粒中加入6.5ml质量浓度8％的NaOH溶液，上述溶液中逐渐加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺离子摩尔浓度升至2.5mol/L，置于超声波清洗器中超声处理2.7h，双层200目纱布滤除残渣，滤液备用；

C、木瓜蛋白酶酶解

步骤C中滤液滴加浓度2mol/L的HCL溶液调节pH值至6.8，上述溶液每850ml中加入1g木瓜蛋白酶，于恒温37蛋水解1.5h，水解后将水浴升高至85解灭酶；

D、吸附、脱蛋白

灭酶滤液中加入g活性炭粉末进行吸附，吸附过程中间歇搅拌4h，于4于下静置自然澄清，抽取上清液；

E、醇沉

上清液中加入无水乙醇使乙醇质量浓度升至70％，室温下静置9h后，转速5000r/min下离心处理5min后回收固体物质，固体物质用无水乙醇洗涤脱水两次；

F、真空干燥

值得说明的是，为更清楚的说明和解释本实施例，本实施例采用实验的方法进行阐述。

硫酸软骨素制备方法，包括如下步骤：

1 实验方法

1.1原料处理

牦牛软骨于沸水中煮3-4h，捞起后去除残留脂肪、肌肉及其他结缔组织，用自来水冲洗干净后烘干，用粉碎机慢慢粉碎，放置4℃冰箱里保存备用。

1.2 牦牛软骨CS制备工艺流程

牦牛软骨粉→超声波辅助碱盐提取→纱布过滤→滤液→调节pH→木瓜蛋白酶酶解→灭酶→活性炭脱色→离心去蛋白→上清液→乙醇沉淀→乙醇洗条脱水→干燥→CS成品

1.3 牦牛硫酸软骨素含量测定

本试验用硫酸-咔唑法测定牦牛硫酸软骨素的含量。

1.3.1 试剂的配制

①D-葡萄糖醛酸标准溶液。D-葡萄糖醛酸采用经105℃干燥至恒重，作为D-葡萄糖醛酸标准品，精确称取0.0100g标准品，用蒸馏水溶解定容于100mL容量瓶中，作为母液备用。②供试品溶液。准确称取硫酸软骨素样品0.0200g，用蒸馏水溶解定容于100 mL容量瓶中，待测。③咔唑试剂。准确称取咔唑0.1250g用无水乙醇溶解定容于100 mL 棕色容量瓶中，4℃冰箱保存。④硼砂－浓硫酸试剂。称取四硼酸钠9.5342g，用浓硫酸溶解定容于1000 mL 棕色容量瓶中，在4℃冰箱保存。

1.3.2 标准曲线的绘制

精准量取D-葡萄糖醛酸标准溶液母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL容量瓶中，然后用蒸馏水定容，得到浓度分别为10、20、30、40、50µg/mL的D-葡萄糖醛酸标准溶液。取6只试管置于冰浴中冷至4℃左右，分别加入硼砂硫酸液5ml，再分别取不同浓度的D-葡萄糖醛酸标准溶液各1mL以及空白式样蒸馏水1mL加入各试管中，混合均匀，此时用冰浴不断冷却。采用沸水浴加热10min，然后取出冷却到室温，可以置于冷水中冷却。再加入0.2mL咔唑试剂，混合均匀，放入沸水中加热15min，然后冷至室温。用空白式样在530nm波长处侧吸光度A调零，将吸光度A作为纵坐标，D-葡萄糖醛酸浓度c为横坐标作图，可绘出标准曲线。

1.3.3样品含量的测定

精确量取供试品溶液1.0mL，同样按上述方法操作，测定A530nm，根据绘制的标准曲线计算样品中D-葡萄糖醛酸浓度,然后根据换算公式求得牦牛硫酸软骨素的含量。

硫酸软骨素含量(%)＝葡萄糖醛酸含量/45.12%×100%

1.4超声波辅助碱盐提取条件的试验设计及其优化

1.4.1 单因素试验

将硫酸软骨素含量作为指标，对牦牛硫酸软骨素超声波辅助碱盐提取各项条件按照下表进行单因素试验。

表1. 超声波辅助碱盐提取因素水平编码表

1.4.2响应面法分析与优化

根据得到的单因素试验结果，采用Box-Benhnken中心设计和响应面分析优化牦牛软骨硫酸软骨素的超声波辅助碱盐提取工艺。

1.5木瓜蛋白酶酶解条件优化实验

1.5.1单因素试验

表2木瓜蛋白酶酶解因素水平编码表

1.5.2响应面法分析与优化

根据得到的单因素试验结果，采用Box-Benhnken中心设计和响应面分析优化牦牛软骨硫酸软骨素的木瓜蛋白酶酶解提取工艺。

2 结果与讨论

2.1硫酸-咔唑法测定牦牛软骨硫酸软骨素含量标准曲线

以横坐标是D-葡萄糖醛酸浓度C，纵坐标是吸光度A，绘制牦牛软骨中硫酸软骨素含量的标准曲线（图1）。

2.2牦牛软骨硫酸软骨素超声波辅助碱盐提取单因素试验

本次论文实验进行超声辅助碱盐提取的主要作用，目的是为了分解牦牛软骨的组织结构，从而可以将硫酸软骨素与其他各成分分开。改提取过程是提高CS含量的关键。其中影响提取效果的条件有碱液浓度、Na⁺浓度、料液比、提取温度、超声时间，本次试验就是以这些为因素条件，分析其对牦牛软骨硫酸软骨素含量的影响。

2.2.1 碱液浓度对牦牛软骨CS含量的影响

通过试验结果的计算，并分析作图(图2)可以发现，随着碱液浓度的逐渐升高，牦牛软骨CS含量首先是逐步升高达到最高点，当超过最适浓度时，CS含量就会逐渐下降。即当碱液浓度为6%时，牦牛软骨CS含量达到最高点；碱液浓度大于6%时，硫酸软骨素含量就会逐渐降低。这可能是由于随着碱液浓度的逐渐升高，处于糖链还原端的糖基在碱性条件下，逐渐生成间糖酸和异糖酸而脱落造成了碱对糖链反应过度(副反应)的现象，使得CS含量下降。因此，选择碱液浓度为6%时较佳。

2.2.2 Na⁺浓度对牦牛软骨CS含量的影响

根据试验结果得图3，可看出，随着Na⁺浓度的上升牦牛软骨CS含量先升高后又大幅度降低。Na⁺浓度在2.5mol/L 时CS含量达到最高。所以2.5mol/L左右为较佳的Na⁺浓度的选择。高浓度的盐可使游离蛋白质完全沉淀，因此盐浓度不能过低，否则会使产品澄清度下降，蛋白质沉淀不完全，导致CS含量减少。但过高浓度的盐不仅会造成浪费，而且也会降低CS含量。

2.2.3 料液比对牦牛软骨CS含量的影响

根据试验结果可作图4，从图中可以看出，随着料液比的上升牦牛软骨CS含量先大幅度上升然后又大幅度下降。当料液比为1∶7时得CS含量最高，但当料液比高于1∶7时，CS含量大幅降低，所以料液比1∶7左右为较佳条件。本试验中是以10g牦牛软骨粉为原料，如果料液比过小，溶剂量就相对很少，致使溶液浓度过高，不利于多糖的浸出，所以在一定范围内，增大料液比可使原料与碱盐溶液充分反应，使降解更加彻底，提高CS含量，料液比也不能过高，否则会使碱液体积分数下降，也不利于硫酸软骨素的提取。

2.2.4 提取温度对牦牛软骨CS含量的影响

根据试验结果可作图5，从图中可以看出，随着温度的逐渐上升时，牦牛软骨CS含量也在逐渐升高，在温度达到40也时，CS含量达到最高，温度继续上升超过最适温度时，CS含量就会逐渐下降，当提取的温度为50就，溶液的颜色变为橙红色，说明硫酸软骨素此时开始分解，从而严重影响最终的CS含量。所以提取的温度为40。左右时为较佳的提取条件。

2.2.5 超声时间对牦牛软骨CS含量的影响

根据试验结果可作图6看出，随着超声时间的增长牦牛软骨CS含量先是大幅度升高，当超声时间为2.5小时时，CS含量达到最高，超声时间继续延长时，CS含量又逐渐下降。超声时间过长时硫酸软骨素由于长时间处于提取的环境中，导致硫酸软骨素发生降解从而影响最终CS含量。所以超声时间为2.5小时左右时为较佳的提取条件。

2.3 牦牛软骨硫酸软骨素超声波辅助碱盐提取的响应面分析与优化

利用Box-Benhnken中心设计的实验原理，根据单因素实验结果，设计以碱液浓度、料液比和超声这三个因素为自变量，用-1、0、+1来代表碱液浓度、料液比和超声时间这三个自变量因素的低、中、高水平，牦牛软骨硫酸软骨素的含量作为试验的响应值，设计L₁₇(3³)试验，取值见表3。17个试验点分为两个点，析因点和零点，其中自变量取值在A,B,C构成三维顶点为析因点，区域的中心点为零点，为估计试验误差，零点试验重复5次。并对每个试验点，进行了三次平行试验，得到的牦牛软骨CS含量进行计算，取平均值。

表3 响应面三因素三水平试验设计

2.3.1响应面方差分析

用Design-Expert(Response Surface Regression)程序对实验数据进行分析，方差分析表见3.3，并得出回归方程(1):

CS(%)=50.48+7.87A-0.93B+0.12C+1.26AB+0.25AC+2.97BC-1.74A²-7.34B²-5.98C²

由响应面方差分析表4可看出，模型的Prob>F(a)为<0.0001，表示此模型是极其显著的；模型的失拟项表明模型预测值与实际值间不拟合的概率，表4中模型失拟项的Prob>F(a)为0.1589 >0.05，证明模型失拟项不显著，模型选择合适，试验误差小，可用该模型对牦牛软骨硫酸软骨素提取进行分析和预测。

表4响应面方差分析

注:(a) Prob>F(a)的大小表示模型和各个不同考察因素的显著水平。(b)Prob>F(a)小于0.05表示模型或者各个不同因素具有显著影响，Prob>F值小于0.01表明影响非常显著。

2.3.2响应面交互作用分析与优化

通过对Design-Expert软件绘制响应面曲线图与等高线图(图7、8、9)来进行可视化的分析，用来进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点。

从各响应面图7、图8、图9中可以看出，碱液的浓度对牦牛软骨硫酸软骨素含量的影响作用比较明显，而各因素影响其含量的顺序为碱液浓度>料液比>超声时间。通过响应面的分析优化，得出硫酸软骨素含量最高的提取条件为：料液比为1g:6.44ml,碱液浓度为7.92%，超声碱盐提取时间为2.68h,牦牛软骨硫酸软骨素的含量预测值高达55.65%，在考虑到实际的情况有所限制，把其改善为料液比为1g：6.5ml,碱液浓度为8%，提取时间为2.7h，此条件下硫酸软骨素的产率为55.60%与预测值基本相符。

2.4酶解单因素实验结果与分析

2.4.1酶解反应温度对牦牛软骨CS含量的影响

将超声辅助碱盐提取的硫酸软骨素浸提液晃动摇匀，依次均匀分装到五个编号不同的锥形瓶中，均加入活化的木瓜蛋白酶使其浓度均保持为120U/mL，调节pH至6.8，分别于30别、35别、40别、45别、50别的水浴锅中进行1.5h酶解,结果如图10所示。从图中可以发现，当酶解反应的温度为40。时，牦牛软骨中葡萄糖醛酸的百分含量为18.85%，硫酸软骨素的百分含量为41.78%。当酶解反应温度过低或过高时，硫酸软骨素含量都会随之而降低，这是由于温度对木瓜蛋白酶的酶活性的影响比较大。温度过高酶失活，降解程度也跟着降低。因此，选择酶解温度为40酶时较佳。

2.4.2酶反应浓度对CS百分含量的影响

将超声辅助碱盐提取的牦牛软骨硫酸软骨素浸提液晃动摇匀，依次均匀分装到五个编号的锥形瓶中，经量取体积计算，各加入不同量的木瓜蛋白酶活化液，使酶解反应体系中酶浓度(U/mL)依次为40、80、120、160、200U/mL，调节pH至6.8，在温度为40温的水浴锅中进行1.5h酶解，结果如图11所示。从图中可以发现，在其他因素一定的情况下，硫酸软骨素的百分含量会随着酶反应浓度的增大而增加。当酶浓度为120U/mL，酶解物中牦牛硫酸软骨素百分含量达到最大值41.78%。当酶浓度超过120U/mL以上，硫酸软骨素含量反而降低。这是因为较低的酶浓度，不能使所有的反应物都能与酶物质相结合，致使蛋白质的水解程度不够彻底;而当酶反应浓度逐渐增大时，体系中底物就可以与酶分子充分相结合，此时硫酸软骨素多以蛋白多糖的形式存在，并得到充分的释放，牦牛软骨的硫酸软骨素百分含量升高。

2.4.3酶解液pH值对牦牛软骨CS的影响

将超声辅助碱盐提取后的硫酸软骨素浸提液晃动摇匀，依次均匀分装到已经编号的五个锥形瓶中，调节pH使其值分别为6.4、6.6、6.8、7.0、7.2，然后加入活化后的木瓜蛋白酶液使其酶反应浓度均为120U/mL，都在温度为40在的水浴锅中进行1.5h酶解，结果如图12所示。从图中可以看出，酶解反应体系中牦牛软骨硫酸软骨素的百分含量会随着pH值的升高而增加。当pH值为6.8时，牦牛软骨中硫酸软骨素百分含量达到最大值为41.78%；pH值超过6.8时，牦牛软骨硫酸软骨素含量就会逐渐减少。这是因为酶本身是一种蛋白质，且具有活性，pH值会影响其稳定性，进而影响酶与底物的结合以及酶催化底物转变为产物的效率，所以说，在酶解反应期间应注意pH值的调节，以保持pH值的恒定。

2.4.4酶解反应时间对CS百分含量的影响

将超声辅助碱盐提取的牦牛软骨硫酸软骨素浸提液晃动摇匀，依次均匀分装到五个已经编号的锥形瓶中，分别加入活化的木瓜蛋白酶液使其酶浓度均为120U/mL，调节pH值至6.8，于408条件下分别酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，结果如图13所示。从图中可以看出，牦牛软骨中硫酸软骨素的百分含量会随着酶解反应时间的增加而提高。当酶解反应时间为1.5h时，牦牛软骨中硫酸软骨素含量可达到最大值为41.78%。一旦酶解反应时间超过1.5h以后，整个反应体中系牦牛软骨硫酸软骨素百分含量逐渐降低。这表明酶解反应时间过长或者是过短都会对牦牛软骨CS含量都会造成明显的影响。

2.5牦牛软骨硫酸软骨素酶解提取的响应面分析与优化

利用Box-Benhnken中心设计的实验原理，根据单因素实验结果，设计以酶解温度、pH和加酶量这三个因素为自变量，用-1、0、+1来代表酶解温度、pH和加酶量这三个自变量因素的低、中、高水平，牦牛软骨硫酸软骨素的含量作为试验的响应值，设计L₁₇(3³)试验，取值见表5。

表5 响应面三因素三水平试验设计

2.5.1响应面方差分析

用Design-Expert(Response Surface Regression)程序对实验数据进行分析，方差分析表见6，并得出回归方程(1):

CS(%)=90.03-7.59A-0.90B-6.21C+2.18AB-1.24AC-3.15BC-4.83A²-9.36B²-8.60C²

由响应面方差分析表6可看出，模型的Prob>F(a)为<0.0001，表示此模型是极其显著的；模型的失拟项(Lack of Fit)表明模型预测值与实际值间不拟合的概率，表6中模型失拟项的Prob>F(a)为0.2269 >0.05，证明模型失拟项不显著，模型选择合适，试验误差小，可用该模型对牦牛软骨硫酸软骨素提取进行分析和预测。

表6响应面方差分析

2.5.2响应面交互作用分析与优化

通过对Design-Expert软件绘制响应面曲线图来进行可视化的分析，用来进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点。

从各响应面图14、图15、图16中可以看出，酶解温度对牦牛软骨硫酸软骨素含量的影响作用比较明显，而各因素影响其含量的顺序为酶解温度>加酶量>pH。通过响应面的分析优化，得出硫酸软骨素含量最高的提取条件为：酶解温度为37.32面的分析为6.89，加酶量为1︰829，牦牛软骨硫酸软骨素的含量预测值高达91.56%，在考虑到实际的情况有所限制，把其改善为酶解温度为37.00实，pH为6.9，加酶量为1︰830，此条件下硫酸软骨素的产率为91.25%与预测值基本相符。

综上，在超声料液比1g：6.5ml、8%碱液浓度、提取时间2.7h，酶解温度37.00提、pH为6.9、加酶量1︰830（120）条件下，硫酸软骨素的产率可达91.25%。

Claims

1.一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

A、原料预处理

将牦牛软肋、月牙骨等软骨投入恒温蒸煮锅中, 加水淹没过软骨于恒温80℃蒸煮4～6h，蒸煮后的软骨捞出用水冲洗干净，切成1～2cm³小块，然后将软骨小块放入烘箱，恒温60，烘干6～8h至恒重，再粉碎为200目制得牦牛软骨粉粒；

B、超声波辅助碱盐提取

C、木瓜蛋白酶酶解

D、吸附、脱蛋白

E、醇沉

F、真空干燥

2.根据权利要求1所述的一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，其特征在于所述步骤B中每克牦牛软骨粉粒中加入6.5ml质量浓度8％的NaOH溶液，上述溶液中逐渐加入NaCl粉末溶解使溶液中Na⁺离子摩尔浓度升至2.5mol/L，置于超声波清洗器中超声处理2.7h，双层200目纱布滤除残渣，滤液备用。

3.根据权利要求1或2所述的一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，其特征在于所述步骤C中滤液滴加浓度2mol/L的HCL溶液调节pH值至6.8，上述溶液每850ml中加入1g木瓜蛋白酶，于恒温37蛋水解1.5h，水解后将水浴升高至85解灭酶。

4.根据权利要求3所述的一种牦牛软骨硫酸软骨素的制备方法，其特征在于所述步骤A中蒸煮过程中去除残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织。