CN107663244B - 一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取及测定硒多糖的方法 - Google Patents

一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取及测定硒多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取及测定硒多糖的方法;具体包括以下步骤，以20L生物罐发酵培养的富硒荷叶离褶伞菌丝体为原料，优化菌丝体中硒多糖的提取工艺并通过红外光谱对水溶性硒多糖的结构进行分析。通过单因素试验和Box‑Behnken试验设计方法得到硒多糖的最佳提取工艺条件：提取时间为50min、提取温度83℃、料液比1:130g/mL、提取次数2次。测得硒多糖提取率为44.62%，较预测值增加0.02%，此时多糖中硒含量达到31.9μg/g。提取率高。将纯化后的硒多糖进行红外光谱分析，富硒未改变水溶性硒多糖的主体结构，但吡喃环的吸收峰发生了改变，说明在荷叶离褶伞菌丝体富硒培养过程中,硒参与了硒多糖的合成。为荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖的开发利用提供理论依据。

Description

一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取及测定硒多糖的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及荷叶离褶伞菌丝体具体涉及一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取及测定硒多糖的方法。
背景技术
荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes (Fr.) Singer)是一种营养价值和药用价值都很高的菌类。且荷叶离褶伞菌丝体具有一定的富硒能力，在富硒的发酵过程中，硒的加入可有效提高菌丝体的干重。硒元素是生命活动的必需元素，与人类的健康密切相关，研究发现，贫血、大骨节病、糖尿病、癌症等疾病都与人体内缺乏硒元素有关。从地理条件分析，我国是一个缺硒大国，粮食等天然食物中硒含量较低，尤其是华北、东北、西北地区属于严重硒匮乏地区，开发高效的富硒食品具有重要的意义。多糖和硒结合成为硒多糖，是一种多糖有机硒化合物，其生物药理活性普遍高于多糖和硒，更容易被机体吸收和利用。硒多糖具有多种生理功能，可抗衰老、防治癌症，治疗多种免疫缺损疾病，诱导干扰素的产生，促进蛋白质和核酸的生物合成等多方面的生物活性。天然硒多糖分布于许多动植物和微生物体内，尤其是存在于植物体内已经得到证实。然而，对硒多糖的全部功能和生化特性尚未完全清楚，在硒多糖的分子生物学研究、构效关系以及作用机制等方面的直接证据和实验更是不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从富硒后的荷叶离褶伞菌丝体中有效提取硒多糖的方法，同时也提供了一种准确测定富硒荷叶离褶伞菌丝体中硒含量的方法。
本发明采用如下技术方案：一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取硒多糖的方法，具体包括以下步骤；
步骤（1）对20L生物罐发酵的富硒荷叶离褶伞菌丝体，放入真空干燥箱中进行干燥，磨粉过100目筛制成样品；
步骤（2）精密称取该样品0.5000g，在提取时间15-75min，提取温度为50-90℃，料液比1:40-200的条件下进行超声提取1-4次，
步骤（3）提取后在3000r/min的转速下离心15min，合并上清液进行减压浓缩成≤50mL的浓缩液；
步骤（4）在浓缩液加入3倍体积95%乙醇，4℃冰箱中静置过夜，得硒多糖沉淀，硒多糖沉淀经乙醇反复洗涤后，用Sevage试剂除去蛋白质，最后将上清液定容至50mL备用；
步骤（5）采用蒽酮比色法测定硒多糖的含量，并计算硒多糖提取率、及硒多糖中硒含量。
本发明通过步骤（5）测出的硒多糖提取率，得出四个单因素试验，提取温度、提取时间、料液比和提取次数对硒多糖提取的影响，初步优化提取工艺；再通过响应面分析法建立各因素与响应值之间的数学模型，借助Design Expert 8软件处理数据，并进行多元回归分析，得到四个单因素与硒多糖提取率的回归模型：
Y=-334.64364+1.42204A+5.95762B+1.25132C+12.91923D+8.48614×10-3AB-1.94563×10-4AC+0.033333AD+1.50053×10-3BC+0.062313BD-0.021828CD-0.02648A2-0.040372B2-5.15448×10-3C2-3.55101D2
，式中Y为硒多糖提取率，A、B、C和D为上述4个变量的编码值；分析各因素交会作用对荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖提取率的影响，最终得出最佳提取时间、提取温度、料液比、提取次数。
从上述得出从富硒荷叶离褶伞菌丝体中高效提取硒多糖的优选条件为：提取时间为50min、提取温度83℃、料液比1:130g/mL、提取次数2次，硒多糖提取率达到44.62%，多糖中硒含量达到31.9μg/g。
上述步骤（1）中所述的富硒荷叶离褶伞菌丝体其富硒过程具体通过以下步骤得到：
步骤A.称取黄豆100g，浸泡过夜后打浆，煮沸5min，冷却至40℃
加入5%蛋白酶，恒温水浴8h后用300目筛过滤，滤液备用；
步骤B.称取玉米面600g，按1:10加入65℃热水，后加入5%的淀
粉酶，恒温水浴至水解液遇碘液无色为止，用300目筛过滤，滤液备用;
步骤C.把步骤A得到的黄豆酶解液和步骤B得到的玉米淀粉酶解
液的滤液混合，加入葡萄糖200g，定容至20L发酵罐中，121℃灭菌40min，快速冷却至22℃，接入10%的荷叶离褶伞种子培养液，通入无菌空气，使罐内压强为0.02MPa的条件下培养，在发酵的第3d加入灭菌的Na2SeO3溶液，使其在发酵罐中浓度为4μg/mL，发酵的第8d终止发酵，过滤，得到的菌丝体用清水清洗后在冷冻干燥机中冻干，即为富硒的荷叶离褶伞菌丝体。
未富硒荷叶离褶伞菌丝体制备：在发酵过程中不加入灭菌的Na2SeO3溶液，其他过程同上述富硒菌丝体的制备。
本发明步骤（4）中所述的Sevage试剂除去蛋白质具体为：量取乙醇反复洗涤后的硒多糖沉淀VmL，向其加入1/5V体积的氯仿和1/20V体积的正丁醇，振荡20min，在3000r/min的转速下离心15min，合并上清液并测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无白色沉淀为止，即得到了除去蛋白质的硒多糖。
本发明从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取出硒多糖，然后测定硒多糖中硒含量的方法，具体包括以下步骤；
精确称取0.1000g硒标准品（硒粉）溶解于2mL浓HNO3中，低温下（≤100℃）加热溶解至蒸干，用1:1盐酸溶解，定容至1L，使用时稀释至1.0μg/mL。
步骤A.硒标准曲线：准确吸取上述硒标准溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0mL和8.0mL，分别置于125mL分液漏斗中，加水定容至25mL，分别加入5% EDTA-Na2溶液1mL，用1:1 HCl调节溶液至pH2~3，再加入0.5% 3,3'-二氨基联苯胺溶液4mL（现用现配），摇匀，置暗处20min后，用10%NaOH溶液调节至中性，加入10mL甲苯振荡2min，静置分层，弃水层，甲苯层用比色皿于420nm处测其吸光值（以相应试剂为空白），硒含量（μg）为横坐标，以吸光值（OD值）为纵坐标，
绘制得标准曲线如图2所示，得回归方程Y=0.0151X-0.0014，相关系数R2=0.9934，具有较好的相关性；
步骤B.称取0.0500g硒多糖样品溶于2mL浓HNO3，在电热炉中加热（控制温度160～180℃）消化，至样品完全溶解，溶液呈澄清，停止加热并冷却至70℃，加入1:1HCl，定容4mL后备用。
准确移取上述备用溶液0.5mL，定容至25mL后，取出4mL定容至25mL，并转入125mL分液漏斗中，加水定容至25mL，分别加入5% EDTA-Na2溶液1mL，用1:1 HCl调节溶液至pH2~3，再加入0.5% 3,3'-二氨基联苯胺溶液4mL，摇匀，置暗处20min后，用10%NaOH溶液调节至中性，加入10mL甲苯振荡2min，静置分层，弃水层，甲苯层用比色皿于420nm处测其吸光值，以相应试剂为空白。根据样品溶液测得的吸光值，结合步骤B硒标准曲线计算相应的硒含量。
根据硒标准曲线计算，得出荷叶离褶伞菌丝体中富硒量达到114.2μg/g，说明荷叶离褶伞菌丝体中是富含硒的。由于硒含量测定方法操作复杂，花费时间长，综合考虑后，以硒多糖提取率的变化来说明荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖提取的变化。
本发明步骤（5）采用蒽酮比色法测定硒多糖的含量，具体通过以下步骤测定：
步骤A.将葡萄糖放置50~80℃的烘箱中烘至8~10h，取出后精确称取0.0100g，加蒸馏水定容至100mL，配制为0.1mg/mL备用。
步骤B.葡萄糖标准曲线：取7支15mL洗净并干燥的具塞试管，分别加入葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL和1.2mL，加蒸馏水至2.0mL，再精密加入硫酸蒽酮溶液（蒽酮0.1g，80%硫酸溶液100mL，溶解摇匀）6.0mL后摇匀，沸水浴15min，取出后放入冰浴冷却15min，以相应试剂或蒸馏水为空白，在625nm波长处测定吸光度，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以吸光值（OD值）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=4.69X-0.0081，相关系数R2=0.9992，符合精度要求，如图1所示。
步骤C.取15mL洗净并干燥的具塞试管，精密量取样品溶液2.0mL加入，再精密加入硫酸蒽酮溶液6.0mL后摇匀，沸水浴15min，取出后放入冰浴冷却15min，以相应试剂或蒸馏水为空白，在625nm波长处测定吸光度，代入线性回归方程求出供试样品溶液中硒多糖含量，再计算富硒荷叶离褶伞菌丝体样品的硒多糖提取率:
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中：Y为供试样品溶液中标准曲线中查得硒多糖的质量（mg）；
N为稀释倍数；
V为定容体积（50 mL）；
M为试验样品质量（g）；
V S为样品测定液的体积（2 mL）。
一、本发明提取硒多糖条件的优化试验：
1.提取时间对硒多糖提取的影响：
精密称取样品富硒荷叶离褶伞菌丝体样品0.5000g，在提取时间分别为15、30、45、60min和75min，提取温度为60℃，料液比1:60的条件下超声提取1次。提取后在3000r/min的转速下离心15min，将清液减压浓缩后（≤50mL），加入3倍体积95%乙醇，4℃冰箱中静置过夜，得硒多糖沉淀，沉淀经乙醇反复洗涤，用Sevage试剂除去蛋白质，最后将上清液定容至50mL。采用蒽酮比色法测定硒多糖的含量，并计算硒多糖提取率。
结果表明：随着时间的延长，硒多糖的提取率逐渐增加，45min时硒多糖提取率达到最大值10.97%，之后随着提取时间的延长，硒多糖提取率又有所减少，见图3。由此说明硒多糖的提取过程与时间密切相关，超声时间较短则产物溶解不充分，时间过长又出现大分子硒多糖在超声波的强剪切作用下降解的现象，而导致硒多糖损失。从节约能源、减少生产周期考虑，提取时间在45min左右为宜。
2.提取温度对硒多糖提取的影响：
精密称取样品富硒荷叶离褶伞菌丝体样品0.5000g，在提取温度分别为50、60、70、80℃和90℃，提取时间为45min，料液比1:60条件下超声提取1次。提取后同1.3.3测定硒多糖的含量，并计算硒多糖提取率。
结果表明：在50~80℃温度范围内，随着提取温度的升高，硒多糖提取率逐渐增加，80℃后随着提取温度的升高，硒多糖的提取率反而下降，见图4。由此说明不同原料多糖提取的最佳温度不同，但其多糖的提取的变化趋势相同。这是由于在升温和超声作用下，当液体所受到的负压足够大时，媒质分子间的平均距离超过极限距离后，就会破坏液体结构的完整性，造成空穴。综合考虑，提取温度选择80℃较适宜。
3.不同料液比对硒多糖提取的影响：
精密称取样品富硒荷叶离褶伞菌丝体样品 0.5000g ，在料液比（所述料液比是指的富硒荷叶离褶伞菌丝体样品和提取液蒸馏水的重量比）分别为1:40、1:80、1:120、1:160和1:200时向每个三角瓶中加入蒸馏水，提取时间为45min，温度80℃的恒温条件下超声提取1次。提取后同1.3.3测定硒多糖的含量，并计算硒多糖提取率。
结果表明：由图5所示，在料液比较低时，多糖的浸出量随料液比的增大而显著增加，并在料液比1:120时多糖提取率达到33.94%，但增大到一定程度后，多糖提取率基本不再变化。选择料液比1:120为宜。
4.提取次数对硒多糖提取的影响：
精密称取样品富硒荷叶离褶伞菌丝体样品0.5000g ，在提取次数分别为1、2、3、4次，提取时间为45min，料液比为1:120，80℃的恒温条件下提取，提取后同1.3.3测定硒多糖的含量，并计算硒多糖提取率。
结果见图6，随着提取次数的增加，硒多糖提取率几乎呈直线下降。提取1次时，大部分硒多糖已被提取；将滤渣再次提取时，有部分硒多糖被提取；提取第3、4次时，硒多糖提取率接近于零，从节省能耗与缩短生产周期考虑，提取次数选择2次为宜。
5.响应面试验方法：
在上述四个单因素试验基础上，选定影响因素并确定因素水平，用Box-Behnken中心组合原理。设计响应面试验表格。以硒多糖提取率为参考指标，来确定硒多糖提取的最佳提取工艺条件。选取对硒多糖提取影响的4个因素，即：提取时间、提取温度、料液比数和提取次数，分别以A、B、C 和D 表示。试验因素水平设计见表1。
表1 Box-Behnken 设计试验因素与水平
Figure 904614DEST_PATH_IMAGE002
二、响应面试验结果与分析
1.模型的建立及显著性检验与分析
根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，综合单因素影响试验结果，采用四因素三水平的响应面分析方法进行实验设计，分析因素与设计见表2，表中的数据经 Design-Expert 8统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表3。
用Design Expert 8程序软件对表2中的试验结果进行回归分析，对各因素回归拟合后，得到硒多糖提取率四因素间的元二次回归方程：
Y=-334.64364+1.42204A+5.95762B+1.25132C+12.91923D+8.48614×10-3AB-1.94563×10-4AC+0.033333AD+1.50053×10-3BC+0.062313BD-0.021828CD-0.02648A2-0.040372B2-5.15448×10-3C2-3.55101D2
对回归方程进行方差分析和显著性检验结果如表3所示。式中Y为硒多糖提取率，A、B、C和D为上述4个变量的编码值。回归项中P＜0.0001，说明所选择模型高度显著；失拟项P=0.9744＞0.05，即失拟项差异不显著，表明该二次回归模型能够较显著拟合试验；回归模型R2=0.9456，说明该模型能够解释94.56%的响应值变化，只有5.44%的变异不能用该模型解释。因此该模型是极其显著而且可靠的，能够对硒多糖提取进行预测。
表2 响应面分析实验方案与结果
Figure 493858DEST_PATH_IMAGE003
表3 响应面分析试验方差分析结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
注：*差异显著（P<0.05）；**差异极显著（P<0.01）
图7反映了各因素交互作用对富硒荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖提取率的影响，比较A-E六组图可知：料液比对硒多糖提取率的影响较大，曲线变化较陡；提取时间次之；提取温度对硒多糖提取率的影响最小，曲面变化比较平缓。
2.本发明最佳提取工艺的确定及验证试验：
借助Design Expert 8统计分析软件进行数据分析，得到最佳提取工艺条件：提取时间50.45min、提取温度83.3℃、料液比1:127.47g/mL、提取次数2.39次，理论上硒多糖提取率为44.60%。为了实际操作方便，调整其最佳提取工艺条件为提取时间50min、提取温度83℃、料液比1:130g/mL、提取次数2次。在此条件下，对荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖进行提取，通过3次平行试验，测得多糖提取率为44.62%，与预测的理论值相差甚少，再次验证了回归模型的正确性。并用3,3'-二氨基联苯胺分光光度法测定硒含量，由硒标准曲线计算得硒含量为31.9μg/g。说明该方程和实际的情况比较相符，实验结果充分验证了模型的正确性，说明富硒荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖的提取工艺优化结果是有效的。
三、本发明硒多糖的结构分析：
1.未富硒荷叶离褶伞菌丝体中多糖的提取：在富硒荷叶离褶伞菌丝体中，多糖提取的优化条件下，对未富硒荷叶离褶伞菌丝体中多糖进行提取。
2.荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖的结构分析：硒多糖的红外色谱检测：硒作为硒多糖的特征部分在硒多糖中的存在形式可能有Se-H和
Figure DEST_PATH_IMAGE005
两种，分别取1mg干燥纯化的富硒荷叶离褶伞菌丝体和未富硒荷叶离褶伞菌丝体的水溶性多糖纯化后，与100~200mg干燥的KBr粉末在研钵中轻轻研磨均匀，在红外灯下操作，经压片机压成薄片，于4000~400cm-1进行红外光谱分析。
结果表明：如图8和图9所示，富硒未改变水溶性多糖的主体结构，表现在二者具有同样的多糖特征峰：在3600~3200cm-1出现一种宽峰是O-H的伸缩振动，3000~2800cm-1的一组峰是糖类 CH3，CH2，CH 等C-H伸缩振动。1650～1550cm-1处有较强吸收峰，为C=O的伸缩振动及C=O的非对称伸缩振动，多糖中可能含有—COOH，是一种酸性多糖。由于800~900 cm-1的吸收峰不明显，故无法判断糖苷键类型，如图8所示。1400~1200cm-1的吸收峰是C-H的变角振动。890 cm-1是典型的吡喃葡聚糖和β-型糖苷键连接特征吸收峰，说明富硒荷叶离褶伞菌丝体多糖中有β-型葡聚糖构型，如图9所示。荷叶离褶伞菌丝体富硒后，吡喃环的吸收峰发生了改变，说明在富硒过程中，硒参与了多糖的合成，致使多糖的结构发生了改变。
本发明相对于现有技术的优点在于：
本发明通过富硒前后两种形态硒多糖的红外光谱结构分析可知，通过醇沉淀方法提取的可溶性多糖具有多糖的一般特征吸收峰, 且是β-糖苷键连接的吡喃多糖。从而表明本发明富硒未改变水溶性硒多糖的主体结构，但多糖的结构发生了改变。将纯化后的硒多糖进行红外光谱比较分析，确定其组成结构，为荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖的开发利用提供了理论依据。
本发明通过以20L生物培养罐发酵富硒的荷叶离褶伞菌丝体为原料，此原料在制备过程中，需要将Na2SeO3和培养基分别灭菌，在菌丝体发酵的第3d，加入灭菌后的Na2SeO3再共同发酵5d后终止发酵，过滤得到富硒的荷叶离褶伞菌丝体中硒含量高。通过四个单因素试验，优化提取温度、提取时间、料液比和提取次数对硒多糖提取的影响，再通过Box-Behnken中心组合原理设计四因素三水平的响应面试验，借助Design Expert 8软件处理数据，并进行多元回归分析，得到了本发明的四个单因素与硒多糖提取率的回归模型，通过响应面分析法建立了各因素与响应值之间的数学模型，可以较直观地看出不同因素之间的交互作用，有针对性地对其进行调整，可减少试验次数，提高效率。分析各因素交会作用对荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖提取率的影响，最终得出本发明的最佳提取工艺条件：调整提取时间为50min、提取温度83℃、料液比1:130g/mL、提取次数2次，测得硒多糖提取率为44.62%，此时硒多糖中硒含量达到31.9μg/g。本发明从富硒的荷叶离褶伞菌丝体中提取硒多糖的工艺方法提取速度快，省时省力，提取率高。
附图说明
图1.葡萄糖标准曲线；
图2. 硒标准曲线；
图3.提取时间对硒多糖提取率的影响图；
图4. 提取温度对硒多糖提取率的影响图；
图5. 料液比对硒多糖提取率的影响图；
图6. 提取次数对硒多糖提取率的影响图；
图7. 各因素交互作用对荷叶离褶伞菌丝体硒多糖提取率影响的响应面图 ；A:提取时间与提取温度; B.提取时间与料液比C.提取时间与提取次数;D.提取温度与料液比;E.提取温度与提取次数;F.料液比与提取次数；
图8.未富硒荷叶离褶伞菌丝体中水溶性多糖的IR图谱；
图9. 富硒荷叶离褶伞菌丝体中水溶性硒多糖的IR图谱。
具体实施方式
荷叶离褶伞 由甘肃省应用真菌工程实验室提供；硒粉（化学纯CP，国药集团化学试剂有限公司），蒽酮（分析纯，上海中泰化学试剂有限公司），3,3'-二氨基联苯胺（化学纯，国药集团化学试剂有限公司），95%乙醇，氯仿，正丁醇，葡萄糖，浓H2SO4，浓HCl，浓HNO3，甲苯，NaOH，EDTA-Na2试剂均为分析纯，水均为蒸馏水
仪器与设备：V-1200型可见光分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；TDL-50大容量低速离心机（金坛市亿能实验仪器场）；LGJ-18冷冻干燥机（北京松源华科技发展有限公司）； RE-2000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；B260恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；DHG-9423A电热恒温鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
实施例1
一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取硒多糖的方法，具体包括以下步骤；
步骤（1）对20L生物罐发酵的富硒荷叶离褶伞菌丝体，放入真空干燥箱中进行干燥，磨粉过100目筛制成样品；
步骤（2）精密称取该样品0.5000g，在提取时间15min，提取温度为50℃，料液比1:40的条件下进行超声提取1次；
步骤（3）提取后在3000r/min的转速下离心15min，合并上清液进行减压浓缩成≤50mL的浓缩液；
步骤（4）在浓缩液加入3倍体积95%乙醇，4℃冰箱中静置过夜，得硒多糖沉淀，硒多糖沉淀经乙醇反复洗涤后，用Sevage试剂除去蛋白质，最后将上清液定容至50mL备用；
步骤（5）采用蒽酮比色法测定硒多糖的含量，硒多糖提取率为7.01%，此时硒多糖中硒含量达到8.1μg/g。
实施例2
一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取硒多糖的方法，具体包括以下步骤；
步骤（1）对20L生物罐发酵的富硒荷叶离褶伞菌丝体，放入真空干燥箱中进行干燥，磨粉过100目筛制成样品；
步骤（2）精密称取该样品0.5000g，在提取时间50min，提取温度为83℃，料液比1:130的条件下进行超声提取2次；
步骤（3）提取后在3000r/min的转速下离心15min，合并上清液进行减压浓缩成≤50mL的浓缩液；
步骤（4）在浓缩液加入3倍体积95%乙醇，4℃冰箱中静置过夜，得硒多糖沉淀，硒多糖沉淀经乙醇反复洗涤后，用Sevage试剂除去蛋白质，最后将上清液定容至50mL备用；
步骤（5）采用蒽酮比色法测定硒多糖的含量，测得多糖提取率为44.62%，此时多糖中硒含量达到31.9μg/g。
实施例3
一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取硒多糖的方法，具体包括以下步骤；
步骤（1）对20L生物罐发酵的富硒荷叶离褶伞菌丝体，放入真空干燥箱中进行干燥，磨粉过100目筛制成样品；
步骤（2）精密称取该样品0.5000g，在提取时间75min，提取温度为90℃，料液比1:200的条件下进行超声提取4次；
步骤（3）提取后在3000r/min的转速下离心15min，合并上清液进行减压浓缩成≤50mL的浓缩液；
步骤（4）在浓缩液加入3倍体积95%乙醇，4℃冰箱中静置过夜，得硒多糖沉淀，硒多糖沉淀经乙醇反复洗涤后，用Sevage试剂除去蛋白质，最后将上清液定容至50mL备用；
步骤（5）采用蒽酮比色法测定硒多糖的含量，硒多糖提取率为38.8%，此时多糖中硒含量达到30.6μg/g。

Claims (2)

1.一种从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取硒多糖的方法，其特征在于，具体包括以下步骤；
步骤(1)对20L生物罐发酵的富硒荷叶离褶伞菌丝体，放入真空干燥箱中进行干燥，磨粉过100目筛制成样品；
步骤(2)精密称取该样品0.5000g，采用蒸馏水作为提取液，在提取时间50min，提取温度为83℃，料液比1:130的条件下进行超声提取2次；
步骤(3)提取后在3000r/min的转速下离心15min，合并上清液进行减压浓缩成≤50mL的浓缩液；
步骤(4)在浓缩液加入3倍体积95％乙醇，4℃冰箱中静置过夜，得硒多糖沉淀，硒多糖沉淀经乙醇反复洗涤后，用Sevage试剂除去蛋白质，最后将上清液定容至50mL备用；所述Sevage试剂除去蛋白质具体为：量取乙醇洗涤后的硒多糖沉淀VmL，向其加入1/5V体积的氯仿和1/20V体积的正丁醇，振荡20min，在3000r/min的转速下离心15min，合并上清液并测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无白色沉淀为止；
步骤(5)采用蒽酮比色法测定硒多糖的含量，并计算硒多糖提取率、及硒多糖中硒含量；所述采用蒽酮比色法测定多糖的含量，具体通过以下步骤测定：
步骤A.将葡萄糖放置50～80℃的烘箱中烘至8～10h，取出后精确称取0.0100g，加蒸馏水定容至100mL，配制为0.1mg/mL备用；
步骤B.取7支15mL具塞试管，分别加入葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL和1.2mL，加蒸馏水至2.0mL，再精密加入硫酸蒽酮溶液6.0mL后摇匀，沸水浴15min，取出后放入冰浴冷却15min，以相应试剂或蒸馏水为空白，在625nm波长处测定吸光度，以葡萄糖含量mg为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
步骤C.取15mL的具塞试管，精密量取样品溶液2.0mL加入，再精密加入硫酸蒽酮溶液6.0mL后摇匀，沸水浴15min，取出后放入冰浴冷却15min，以相应试剂或蒸馏水为空白，在625nm波长处测定吸光度，代入线性回归方程求出供试样品溶液中硒多糖含量，再计算富硒荷叶离褶伞菌丝体样品的硒多糖提取率；
Figure FDF0000011067860000021
式中：Y，为供试样品溶液中标准曲线中查得硒多糖的质量mg；
N，为稀释倍数；
V，为定容体积50mL；
M，为试验样品质量g；
VS，为样品测定液的体积2mL。
2.如权利要求1所述的从富硒荷叶离褶伞菌丝体中提取硒多糖的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的富硒荷叶离褶伞菌丝体其富硒过程具体通过以下步骤得到：
步骤A.称取黄豆100g，浸泡过夜后打浆，煮沸5min，冷却至40℃加入5％蛋白酶，恒温水浴8h后用300目筛过滤，滤液备用；
步骤B.称取玉米面600g，按1:10加入65℃热水，后加入5％的淀粉酶，恒温水浴至水解液遇碘液无色为止，用300目筛过滤，滤液备用；
步骤C.把步骤A得到的黄豆酶解液和步骤B得到的玉米淀粉酶解液的滤液混合，加入葡萄糖200g，定容至20L发酵罐中，121℃灭菌40min，快速冷却至22℃，接入10％的荷叶离褶伞种子培养液，通入无菌空气，使罐内压强为0.02MPa的条件下培养，在发酵的第3d加入灭菌的Na2SeO3溶液，使其在发酵罐中浓度为4μg/mL，发酵的第8d终止发酵，过滤，得到的菌丝体用清水清洗后在冷冻干燥机中冻干，即为富硒荷叶离褶伞菌丝体。
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