CN105392363B - 样品的固定和稳定化 - Google Patents

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Abstract

可以使用深共熔溶剂(DES)使诸如细胞、组织、活组织检查和血液等生物样品中的生物分子(例如RNA、DNA和蛋白质)稳定化。可以使用DES混合物来将诸如组织块、癌活组织检查和全血等生物样品中的细胞形态固定和保持。本发明描述了使用DES混合物稳定和保存生物分子、全细胞、组织、血液和生物样品的方法。

Description

样品的固定和稳定化
技术领域
本发明涉及生物分子特别是RNA的稳定化，包括用于稳定RNA的方法、用于稳定RNA的组合物和试剂盒和含有经稳定化RNA的组合物。还涉及细胞、组织、血液、外泌体和其他生物样品的固定和稳定化。
背景技术
从生物样品提取完整生物分子是许多实验室和临床诊断步骤的关键部分。诸如核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质的不稳定性是公知的，并且其完整性取决于许多参数，例如样品在从其最初环境取出之前的物理条件，样品是如何快速地从其来源取出，样品冷却速率、样品贮存温度和生物分子纯化方法。众所周知的是，生物样品纯化之前和期间对生物样品进行处理可以引起样品分析物的完好性和完整性方面的非常重要的变化。例如众所周知的是，尤其是RNA是极其易变的分子，如果不正确地处理，其在数分钟内会完全不可逆地受损。虽然RNA可能是较为易变的生物分子之一，包括翻译后修饰在内的蛋白质、脂质、对于代谢分析而言关键的小于2000道尔顿的小分子和DNA也进行实质性的降解过程。
虽然内源性细胞酶是大多数降解性过程的原因，分析物总是倾向于在贮存或处理的过程中同时水解，并且该过程很大地取决于诸如温度、含水量、pH、光和稳定性等贮存条件以及分析物分子的分子量，而且还可以取决于所用试剂的品质。
成功贮存的最常见的简单方法之一是降低生物样品的温度。通常将样品贮存在低于室温(20℃～24℃)的温度；蛋白质溶液贮存在4℃或-20℃，核酸在干冰或液氮中贮存在-20℃或-80℃的冰箱中。可以添加诸如叠氮化钠等抗微生物剂以控制微生物生长。
众所周知的是，RNA对于被酶降解、自发性水解、二价金属阳离子催化的水解、碱敏感性和FFPE(福尔马林固定的石蜡包埋的)样品中的交联特别敏感。诸如铅、镁和锰等许多金属溶液对RNA极具破坏性，并且确实不仅对于核酶而且对于诸如DNA酶I、绿豆核酸酶和S1核酸酶等核酸酶活性是关键的。铁(2+)已经作为芬顿反应的一部分参与核苷碱基的氧化，产生翻译上受损的rRNA和mRNA(Honda等人，(2005)J.Biol.Chem.280,20978-20986)，例如将鸟嘌呤转变为8-氧-鸟嘌呤。已经综述了金属离子在磷酸二酯键的酶促和非酶促切割中的其他可能的催化作用(Yarus,M.(1993)FASEB J.7,31-39)。实际上经常将诸如EDTA和EGTA等螯合剂添加至RNA或RNA裂解液以用于通过除去金属离子来减少RNA降解的目的。核糖核酸酶(RNA酶)是一大组与包括微生物、人类皮肤、灰尘以及细胞和组织的内含物等许多来源相关的普遍存在的酶。在冷冻-解冻过程中他们也易于从细胞内囊泡释放。已知包括胰腺在内的一些组织特别富含RNA酶A。RNA酶A是已知最稳定的酶之一，在例如离液盐(chaotropic salt)变性后容易恢复其酶促活性，使得其极其难以破坏。需要高浓度的离液剂(例如胍(4M～6M))来破坏RNA酶活性(Thompson.J.和Gillespie.D.Anal Biochem.(1987)163:281-91)。
存在数种方法来抑制RNA酶活性，例如使用：(i)核糖核酸酶肽抑制剂(“RNasin”)，其是一种昂贵的试剂，仅以少量获得，并且对RNA酶A、B和C具有特异性；(ii)诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇等还原剂，其破坏RNA酶中的二硫键，但是该效果是有限的和临时的并且具毒性和不稳定；(iii)诸如蛋白酶K等消化RNA酶的蛋白酶，但是蛋白酶在试剂盒中的转运及其通常缓慢的作用使得分析物生物分子降解；(iv)将温度降低至低于酶的活性温度；常见的是将组织和细胞样品贮存在-80℃或在液氮中；(v)抗-RNA酶抗体；(vi)使用诸如丙酮等溶剂或诸如硫酸铵等亲液盐(kosmotropic salt)将包含RNA酶、DNA和RNA的细胞蛋白沉淀，硫酸铵的一种市售制品称为RNAlaterTM(Sigma-Aldrich，美国；LifeTechnologies，美国；Qiagen,德国)；(vii)使全血中的核酸稳定化的洗涤剂，例如见于PAXgeneTM DNA和RNA提取试剂盒(PreAnalytix,德国)中的洗涤剂；(viii)离液盐；(ix)醇，例如见于PAXgeneTM组织稳定剂(PreAnalytix,德国)中的醇。RNA Isolation and Analysis,Jones编(1994)第2章中提出了各种此类离液混合物。
样品贮存的主要目标是将对分析物生物分子的任何改变最小化(所述改变可以是由于预分析步骤和样品纯化而引入)，从而使分析结果尽可能近地与生物分子的原始体内复杂性和多样性相似，由此提高检验精度、敏感性和特异性。虽然存在可用于减少预分析变化的各种方法和产品，其都有各种缺点，使得其使用存在问题或者是次优的。有效地稳定一类生物分子的方法通常对于稳定其他是无效的，对于每种生物分子分析物技术人员必须选择特定的试剂和方法。例如，PAXgeneTM体系(PreAnalytix)(美国专利6,602,718和6,617,170)可用于核酸，而不是蛋白质，并且需要冗长的纯化步骤以及多种洗涤缓冲液，同时蛋白酶抑制剂的混合物有助于防止蛋白质降解而不是核酸。PAXgeneTM组织稳定试剂盒需要对组织进行两个单独的处理，并且包括有毒和易燃的化学品。组织的RNAlaterTM处理减少了其在免疫组织化学、组织学的有用性，并且增加了组织硬度，而且没有完全保护RNA，虽然其已经被采纳为RNA保护的金标准品。
在提取样品的时间或地点纯化RNA不总是可行的，所述样品例如来自医院手术室的活组织检验或来自医生办公室的血液样品。在这些情况下，在提取RNA之前样品必须非常仔细地贮存，RNA的提取可能短至30分钟进行，但是更常见的是仅仅在通过医院病理实验室处理后数小时或数天发生。通常对预分析步骤的时间和温度的记录较差，导致对样品品质的认知模糊。结果，需要针对每种组织和RNA的最终用途开发单独的样品贮存条件。如已提及，这通常包括使用专用的稳定液(例如RNAlater或PAXgene)或者立即将样品冷冻在液氮中。至少在PAXgene稳定剂的情况下，稳定剂的不完全去除会在纯化过程中对RNA产率产生负面影响(PAXgene Blood RNA Kit Handbook,2005年6月)。
组织贮存可以通过使用固定剂的组织固化实现。“固定(fixation)”是指增加机械强度、硬化、防腐和增加诸如新鲜细胞、活组织检查或组织等受处理组织样品的稳定性，并且将样品保持在与处天然状态的原位的原始新鲜样品尽可能相似的状态。固定经常用于病理学、组织学、组织化学、细胞化学、解剖学研究和研究细胞，并且通常先于例如贮存、包埋、染色、免疫组织化学和/或免疫细胞化学等另外的步骤。固定方法理想地抑制诸如核酸酶和蛋白酶等酶，停止微生物在样品上的生长，并保持总体组织形态以及细胞超微结构如高尔基体、细胞核、内质网、线粒体、溶酶体和胞质膜。作为一个实例，保持正确的细胞形态对于病理学家诊断患者中癌的存在、类型和等级而言是重要的，但是为了正确地这样做，必须也能够将样品正确地染色或用抗体标记以用于免疫组织化学。通常样品用1％～5％的福尔马林(甲醛)、多聚甲醛或戊二醛的缓冲水溶液在室温处理1～24小时，以使蛋白质与其他细胞成分交联，然后在组织切片后，用苏木精和曙红染色剂(H&E)染色。虽然也可使用戊二醛，其向组织的渗透速率慢于甲醛(当相对于组织体积添加18～20体积时，其以约1mm/小时渗透)。虽然RNA也可以此方式保存，但是通常在福尔马林固定过程中或固定后变得高度降解，使得基因表达高度成问题和失真。一个具体问题在于，RNA分析物与诸如蛋白质等其他生物分子交联，因此随后在分析之前需要将它们释放，该方法通常非常苛刻且需要长期处于升高的温度，这导致显著的RNA降解。固定的另一问题在于将诸如RNA和蛋白质等可溶性分析物保持在细胞中，因此他们可以通过例如原位杂交或免疫组织化学而完整化。特别地，福尔马林固定的另一问题在于细胞蛋白质的共价修饰导致抗原性免疫识别的损失，这使得免疫组织化学技术难以或不可能依赖于抗体。作为一个另外实例，福尔马林固定的组织例行地包埋在石蜡中，以使组织块被薄切片并进行显微镜检查(FFPE)。其他常见组织固定法包括使用甲醇、乙醇或丙酮，其导致蛋白质沉淀而不是交联。特别需要在固定组织、保持良好的RNA品质的同时能够进行免疫组织化学染色的方法。众所周知的是，常用的固定剂例如甲醛、多聚甲醛、戊二醛和甲醇是高度有毒的潜在致癌原，同时乙醇和丙酮是高度易燃的。理想的固定剂应该作用于广泛的包括神经、淋巴和脂肪在内的各种组织，保存大片组织，并且与免疫组织化学、组织化学和原位杂交以及其他专门性技术相容。其还应该与自动化组织固定方法相容。关于详细策略的综述已经由Bancroft(2008)‘Theory and Practice ofHistological Techniques’和Stanta(2011)‘Guidelines for Molecular Analysis inArchive Tissues’公开，而将组织固定和染色的代表性实例可见于Ross和Pawlina(2011)‘Histology A Text and Atlas’。
发明内容
在一个方面，本发明提供深共熔溶剂抑制生物分子的降解的应用。
已经令人惊奇地发现，可以使用深共熔溶剂(DES)使生物样品中的如RNA、DNA和蛋白质等生物分子稳定化。还已经发现，可以使用DES混合物来固定和保持诸如组织块、癌活组织检查和全血等生物样品中的细胞形态。本发明描述了用于使用DES混合物稳定和保持生物分子、全细胞、组织和生物样品。样品或组织可以包含实体组织或非实体组织。
发明人已经令人惊奇地发现，许多DES混合物能够稳定和保持RNA、诸如蛋白质和DNA等其他生物分子、细胞和组织结构。使用在诸如氯化胆碱(6M)或尿素(5M)等水性溶液中的单独的个体DES组分不提供RNA稳定化或细胞固定，仅当所述组分组合在DES(如氯化胆碱:尿素)中时，他们才进行保持和稳定化(表1)。发明人已经发现，仅举例而言，氯化胆碱与三氟乙酰胺的混合物对于稳定细胞中的RNA同时保持细胞形态特别有效。发明人还发现氯化胆碱与山梨糖醇的混合物对于稳定全组织中的RNA特别有效。不过，DES组分的极其大量的其他组合和比例也可用于实践本发明。
已经报道了通过天然离子液体和天然DES分离混合物中的组分(WO2011/155829)，但是DES对稳定生物分子或细胞的效果尚未报道。实际上在US2009/0117628A1中已经指出，可以在DES中进行酶促反应，并且各种酶反应在各种DES中具有活性，表明核酸酶和蛋白酶以及其他分解代谢酶会同样地具有活性。令人惊奇地是发明人发现，RNA和其他生物分子在DES混合物中得到稳定，并且细胞形态被固定，证明细胞骨架也被固定。
DES是当组合在一起时具有共熔点的两种以上组分的混合物，共熔点是固化或凝固的温度(Fp)。组合组分的共熔点通常大大低于任一个或者以任何其他比例混合的个体组分，并且在单一温度发生而且个体组分不会在固化时发生分离。DES的性质已经描述于以下文献中：A.P.Abbott,G.Capper,D.L.Davies,R.K.Rasheed,V.Tambyrajah,Chem.Commun.7(2003)70–71.；A.P.Abbott,D.Boothby,G.Capper,D.L.Davies,R.K.Rasheed,J.Am.Chem.Soc.126(2004)9142–9147；[7]G.Imperato,E.Eibler,J.Niedermaier,B.Konig,Chem.Commun.9(2005)1170–1172.；S.Gore,S.Baskaran,B.Koenig,GreenChem.13(2011)1009–1013.；J.T.Gorke,F.Srienc,R.J.Kazlauskas,Chem.Commun.10(2008)1235–1237.；A.P.Abbott,J.Collins,I.Dalrymple,R.C.Harris,R.Mistry,F.Qiu,J.Scheirer,W.R.Wise,Aust.J.Chem.62(2009)341–347.；Y.H.Choi,J.van Spronsen,Y.Dai,M.Verberne,F.Hollmann,I.W.C.E.Arends,G.J.Witkamp,R.Verpoorte,PlantPhysiol.156(2011)1701–1705；且在Zhang Q,De Oliveira Vigier K,Royer S,F.Chem Soc Rev.2012Nov 7；41(21):7108-46中进行了综述。
工业上DES已经用于电化学电镀、采矿应用和钻探润滑剂(US2009/0247432)、工业酶应用(US2009/0117628A1)、制备无机化合物(D.Freudenmann,S.Wolf,M.Wolff和C.Feldmann,Angew.Chem.,Int.Ed.,(2011),50,11050–11060)或有机化合物(S.Gore,S.Baskaran和B.Koenig,Green Chem.,(2011),13,1009–1013)、生物提取(WO 2011/155829)、在电化学中作为电解质用于染料敏化的太阳能电池和金属电抛光(H.-R.Jhong,D.Shan-Hill,C.-C.Wan,Y.-Y.Wang和T.-C.Wei,Electrochem.Commun.,(2009),11,209–211)、电沉积(E.Gomez,P.Cojocaru,L.Magagnin和E.Valles,J.ElectroanalyticalChem.,(2011),658,18–24)、生物柴油的纯化(K.Shahbaz,F.S.Mjalli,M.A.Hashim和I.M.AlNashef,Energy Fuels,(2011),25,2671–2678)、药物的增溶(H.G.Morrison,C.C.Sun和S.Neervannan,Int.J.Pharm.,(2009),378,136–139)、金属氧化物的增溶(A.P.Abbott,D.Boothby,G.Capper,D.L.Davies和R.K.Rasheed,J.Am.Chem.Soc.,(2004),126,9142–9147)和CO2的增溶(X.Li,M.Hou,B.Han,X.Wang和L.Zou,J.Chem.Eng.Data,(2008),53,548–550)。Van Spronsen等人在WO2011/155829中提出将天然来源的DES(例如氨基酸、糖和羧酸的各种组合)用于提取，但是没有提到他们在稳定或固定细胞和组织方面的应用。所描述的DES用于提取目的而不是稳定和固定。
DES不被认为是离子液体，原因在于：(i)他们不完全由离子物质组成，和(ii)他们也可由非离子物质获得，(iii)他们是混合物而不是化合物。与传统离子液体相比，源自例如氯化胆碱的DES具有数个优点，例如：(1)低成本，(2)对水是化学惰性的，(3)容易通过简单混合两种以上组分制备，(4)大多数是生物降解性和非毒性的，(5)即使加热时也是低挥发性的，和(6)不易燃。所有DES都在低于150℃是液体，许多在室温～70℃是液体，少数突出的实例在0℃为液体。
DES往往通过将卤化季铵盐与诸如ZnCl2等金属盐或诸如尿素等氢键供体混合而获得，所述金属盐或氢键供体具有与季铵盐的卤素阴离子形成络合物的能力。不过已经发现例外，例如，在甜菜碱:三氟乙酰胺等DES中不存在卤素阴离子。如本文所用，除非另外规定，术语“甜菜碱(betaine)”是指N,N,N-三甲基甘氨酸。
本文讨论的深共熔溶剂可以包括具有季铵基团的组分。
具有季铵基团的组分可以是进一步包含羧酸根基团的两性离子组分。优选的两性离子组分是甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸)。
作为选择，包含季铵基团的组分可以是具有合适的抗衡离子的盐的形式。抗衡离子合适地是卤素离子，优选是氯离子、溴离子或碘离子，最优选氯离子。其他合适的抗衡离子包括硝酸根和四氟硼酸根等。当所述组分为盐的形式时，抗衡离子优选不包含羧酸根基团。
在另一方面，本发明提供使含RNA样品中的RNA稳定化的方法，所述方法包括使所述样品与含DES的混合物接触以形成稳定的含RNA组合物。
在另一方面，本发明提供使含DNA样品中的DNA稳定化的方法，所述方法包括使所述样品与含DES的混合物接触以形成稳定的含DNA组合物。
在另一方面，本发明提供使含肽样品中的蛋白质(包括磷蛋白)稳定化的方法，所述方法包括使所述样品与含DES的混合物接触以形成稳定的含蛋白质组合物。
在另一方面，本发明提供固定细胞的天然形态和固定细菌、真菌、动物或植物样品(例如大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、拟南芥、水稻、小麦、玉米、烟草和/或马铃薯)中的RNA、DNA和/蛋白质的方法。
在另一方面，本发明提供固定和稳定含细胞样品中的细胞的天然形态的方法，所述样品例如器官、组织，活组织检查、循环肿瘤细胞(CTC)、血液样品、血浆样品、血清样品、组织培养细胞、唾液、尿、脑脊液、医学样品、卵、胚胎、或成体组织、或者FFPE样品，所述方法包括使所述含细胞样品与含DES的混合物接触以形成细胞结构和形态的固定物和稳定物，其与细胞计数、CTC检测、免疫组织化学、组织化学、染色和着色、流式细胞术、质谱法、原位杂交、激光捕获显微切片和对例如RNA、DNA和/或蛋白质等的分子分析相容。
在另一方面，本发明提供固定和稳定含细胞样品中的细胞的天然形态的方法，由此可以通过使用着色剂、抗体或适体确定蛋白含量和蛋白细胞定位，所述方法包括使所述含细胞样品与含DES的混合物接触以形成细胞结构和形态的固定物和稳定物，同时或随后使所述样品与着色剂、抗体或适体接触。
在另一方面，本发明提供用于固定和稳定含细胞样品中的细胞天然形态的方法，由此可以通过使用经标记或未标记的探针确定RNA含量和其细胞定位，所述探针例如寡核苷酸、引物、PNA、LNA、DNA、bDNA或RNA序列、天然或合成互补核酸序列，所述方法包括使含细胞样品与含DES的混合物接触以形成细胞结构和形态的固定物或稳定物，并且同时或随后使所述样品与天然或合成杂交序列接触以用于分子分析。
在另一方面，本发明提供用于使生物样品中的RNA、DNA和/或蛋白质稳定化的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个含DES混合物的容器。所述试剂盒还包含用于使所述样品与DES混合物接触的说明书，由此所述生物样品中的RNA、DNA和/或蛋白质针对降解而稳定。
在另一方面，本发明提供用于使生物样品中的细胞结构稳定化的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个含DES混合物的容器。所述试剂盒还包含用于使所述样品与DES混合物接触的说明书，由此所述DES混合物充当细胞结构的固定剂和/或稳定剂，所述细胞结构用于显微镜和/或组织学研究，例如染色和着色、ISH和/或IHC。
在另一方面，本发明提供用于固定生物样品中的细胞和组织结构与形态的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个含DES固定和/或稳定性混合物的容器，并且可选地是其中所述容器是可渗透的，并且最大高度为10mm，所述样品浸入该容器并且被固定和/或稳定化。可渗透容器的壁可以是滤网(sieve)或格栅，或者设置有狭缝，该狭缝允许DES混合物进入和接近细胞或组织样品，和/或随后接触液体石蜡。
在另一方面，本发明提供DES混合物与添加剂的组合的充当生物分子的固定剂和稳定剂的应用，所述生物分子包括RNA、DNA和/或蛋白质。
在另一方面，本发明提供经稳定化的含RNA组合物，所述组合物包含RNA和DES混合物。
在另一方面，本发明提供经稳定化的含DNA组合物，所述组合物包含DNA和DES混合物。
在另一方面，本发明提供经稳定化的含蛋白质组合物，所述组合物包含蛋白质和DES混合物。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为细胞结构和/或组织的组织学和/或形态学的稳定剂以及RNA、DNA和/或蛋白质的稳定剂的应用。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为细胞结构和/或组织的组织学和/或形态学的稳定剂在随后包埋到石蜡和切片机切片以及可选的染色、原位杂交和/或免疫组织化学中的应用。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为细胞结构和/或组织的组织学和/或形态学的稳定剂在随后冷冻冰冻切片(frozen cryostat sectioning)以及可选的染色、原位杂交和/或免疫组织化学中的应用。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为细胞结构和/或组织的组织学和形态学的稳定剂在随后激光捕获显微切割(LCM)以及可选的回收蛋白质、DNA和RNA中的应用。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为用于后续诊断分析的血浆、血清和血液(其包括循环肿瘤细胞和/或血液白细胞和/或全血)中的生物分子和/或细胞的稳定剂的应用，所述诊断分析包括细胞捕获、计数和/或分型、染色和/或着色、质谱、原位杂交和/或免疫组织化学。可选地，可以进行蛋白质、DNA和RNA的回收。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为外泌体、其他类型的囊泡、微囊泡、亚细胞体和颗粒(例如，胶束；脂质体；内体；细胞碎片；细胞膜；细胞核；如胞吞室、高尔基、内质网和/或线粒体等细胞质成分)的稳定剂的应用。其还涉及对源自血液、血清、血浆、尿、脑脊液和其他体液的外泌体内含有的RNA、DNA和/或蛋白质的稳定化，以便用于贮存、运输和处理从而用于诊断测试，例如提取、分析和/或鉴定外泌体或其他细胞外微囊泡内含有的miRNA或mRNA。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为预纯化颗粒和分子的稳定剂的应用，所述预纯化颗粒和分子例如病毒颗粒、噬菌体、RNA、DNA、诸如酶和抗体等蛋白质、脂质和脂肪和/或碳水化合物。此处将预纯化定义为样品由大于80％的目标颗粒或分子组成。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为用于后续病原体诊断分析(包括细菌和/或病毒诊断)的血浆、血清、血沉棕黄层和/或血液中的生物分子、细菌、真菌和/或其他病原体(例如，利什曼原虫属(Leishmania)、锥虫属(Trypanosoma)和/或疟原虫属(Plasmodium))的稳定剂的应用。
在另一方面，本发明提供DES混合物作为用于后续病毒诊断分析的诸如痰、拭液、血浆、血清、血沉棕黄层和/或血液等生物样品中的病毒、病毒颗粒、病毒核酸和/或蛋白质(例如流感病毒、HPV、HIV、HBV、HCV、口蹄疫病毒、流感病毒、SARS和/或西尼罗河病毒)的稳定剂的的应用。
在另一方面，本发明提供适用于细胞或组织固定和/或适用于抑制生物分子的降解的设备，所述设备包括：由第一深共熔溶剂形成的第一深共熔溶剂层；和在所述第一深共熔溶剂层中的用于接收包含所述生物分子的样品的凹槽(recess)，其中所述第一深共熔溶剂是固体或凝胶。所述设备可以还包含由第二深共熔溶剂形成的第二深共熔溶剂层，其中所述第二深共熔溶剂层包封所述凹槽；并且其中所述第二深共熔溶剂是固体或凝胶。
所述第一深共熔溶剂和/或第二深共熔溶剂是如本文所定义的深共熔溶剂，并优选包含选自3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-二氟-2-苯基乙酰胺、尿素和硫脲的组分。
所述第一深共熔溶剂和/或第二深共熔溶剂还可以包含选自氯化胆碱、碘化丁酰胆碱和N,N,N-三甲基甘氨酸的组分。
本发明的适用于细胞或组织固定和/或适用于抑制生物分子的降解的设备包含由第一深共熔溶剂形成的第一深共熔溶剂层。所述第一深共熔溶剂是固体或凝胶。合适的是，选择深共熔溶剂的组分以使深共熔溶剂在期望的使用条件(例如约25℃的温度和约1个大气压的压力)下是固体。作为选择或另外地，所述深共熔溶剂可以与在期望使用条件下为固体或凝胶的基质材料共混。
具体而言，用作第一深共熔溶剂的优选深共熔溶剂包括：氯化胆碱:3,3,3-三氟丙酰胺(可选的是摩尔比为约1:2)；氯化胆碱:2,2-二氟-2-苯基乙酰胺(可选的是摩尔比为约1:1)；氯化胆碱:海藻糖(可选的是摩尔比为约1:1)；碘化丁酰胆碱:尿素(可选的是摩尔比为约1:2)。
如果所述设备包含第二深共熔溶剂，所述第一深共熔溶剂和第二深共熔溶剂可以相同或不同。优选的是，第二深共熔溶剂选自：氯化胆碱:3,3,3-三氟丙酰胺(可选的是摩尔比为约1:2)；氯化胆碱:2,2-二氟-2-苯基乙酰胺(可选的是摩尔比为约1:1)；氯化胆碱:海藻糖(可选的是摩尔比为约1:1)；碘化丁酰胆碱:尿素(可选的是摩尔比为约1:2)。
在另一方面，本发明提供其中深共熔溶剂是本文所定义的深共熔溶剂的试剂盒。
本发明不特别限制在任何类型的生物分子的稳定化，但是通常较为显著的是RNA的品质和完整性的改善，因为RNA是细胞中最脆弱的分子之一，这归因于其长度和对环境攻击的化学敏感性。通常凭经验而言，可以认为如果细胞rRNA分子是完好的则mRNA、DNA、蛋白质、脂质、碳水化合物和小代谢物也会是完好的，但是如果rRNA被降解，则取决于各生物分子的具体化学敏感性，其他生物分子可能也被降解或者可能不被降解。存在一些例外，例如如果组织或细胞特别富含诸如RNA酶、DNA酶、脂酶、酯酶、蛋白酶或磷酸酶等特定酶，其会引起一类特定生物分子的特异性降解或修饰。
所提及的RNA可以发现于样品、源自样品或与样品结合，所述样品例如为病毒、细胞、循环肿瘤细胞、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、血清、血浆、血液、外泌体、诸如FFPE块或切片等其他微泡保存的样品、活组织检查、固体或液体的组织或其他生物样品。也可以是含核苷或核苷酸的分子，例如cAMP、ATP、GTP、脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的单体、二聚体和寡聚体、脱氧核糖寡核苷酸和核糖寡核苷酸、质粒DNA、基因组DNA、线粒体DNA、RNA(诸如微RNA(miRNA)、piRNA、siRNA、tRNA、类病毒、循环RNA、循环单链或双链的非编码RNA、hnRNA、mRNA、rRNA(如5S、5.8S、16S、18S、23S和28S rRNA物质)以及源自例如HCV、西尼罗河病病毒、口蹄疫病毒、流感病毒、SARS或HIV RNA的病毒RNA和/或细胞外RNA(exRNA))。
其也可以是源自合成有机步骤(如寡聚物合成仪)的分子、RNA和DNA的混合物、RNA和DNA的嵌合物、如体外RNA转录等酶促反应的产物、扩增的RNA(aRNA)、核酶、适体、PCR扩增、滚环扩增(RCA)或连接酶链反应(LCR)、内部对照标准物或对照RNA。
会受益于本发明的RNA分析法包括mRNA模板的体外或体内蛋白质翻译、RNA依赖性RNA聚合、DNA依赖性RNA聚合、RNA剪接分析、RNA折叠分析、适体和核酶生产、光密度(OD)测定、RNA:蛋白质相互作用研究、RNA电泳和沉降(包括分子量标准物)、RNA生物缀合、RNA连接、RNA折叠研究、RNA足迹分析、RNANMR结构研究、RNA寡核苷酸合成、RNA原位、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、RNA测序、逆转录(RT)、RT-PCR、RT-qPCR、核酸酶保护分析、杂交技术(例如包括RNA印迹)bDNA和微阵列(包括探针制备)、荧光核酸标记、NASBA、RNAi、miRNA技术(例如提取和定量)以及要求对RNA进行品质控制和/或定量或定性测定的那些方法。
不稳定性是指RNA的分子量的改变或RNA的化学结构的改变，此类不稳定性与分析物分子的处理、贮存、运输和/或实际分析相关。生物分子不稳定性经常取决于天然存在的代谢酶、特别是RNA酶的活性，RNA酶可以显著改变RNA的分子量或涉及分子量小得多的原始分析物分子的变体。此类RNA酶的来源可以为生物样品自身，例如他们可以在样品处理后逐渐地释放，或者由于对组织进行不良处理而大量释放，例如对其进行了冷冻-解冻，该过程通常导致含有蛋白酶和核酸酶的细胞内囊泡的破裂，所述蛋白酶和核酸酶随后流入细胞质从而导致分析物的非常高速率的降解。作为选择，降解性酶可以来自样品环境的外部污染，例如微生物污染或样品的腐败。分析物不稳定性通常与分析过程的敏感性或性能降低相关，无论分析物是蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质还是代谢物。
“降解”是指作为生物分子和/或分析物不稳定性的后果所发生的物理或化学变化。作为与核酸相关的降解的一些实例，降解可以是指核苷碱基的脱氨基(例如胞嘧啶转化为尿嘧啶)、诸如鸟嘌呤等核苷碱基的氧化、甲基-胞嘧啶的甲基的失去、例如脱嘌呤过程中一个或多个核苷碱基的失去、磷酸二酯键的切割(导致链切割)以及从大体积的核酸分子失去一个或多个核苷酸。其不仅仅指分子的二级结构或三级结构的变化。
“完整性”是指分子的完整度，因此与降解相反。
“实质上降解”是指所含的至少一半分析物分子被切割或者分子量减少5％以上的样品。确定降解的方法是公知的，并且取决于分析物分子(参见Sambrook等,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)，Cold Spring Harbor UniversityPress,NY)。分子量以及因此核酸的降解程度的确定通常使用变性或天然凝胶电泳进行，并且可以包括使用经标记的杂交探针进行的DNA或RNA印迹。RNA定量可以包括使用RNA芯片和Agilent Bioanalyser 2100TM系统进行分析并计算“RNA完整数”(RIN)。核酸降解也可以使用例如LightcyclerTM(Roche)和合适的扩增探针通过用于DNA的Q-PCR和用于RNA的RT-qPCR方便地定量。在使用寡dT引物进行逆转录后，计算(通常是β-肌动蛋白的)mRNA的3’/5’末端的RT-qPCR扩增比，也常用于评估RNA降解。其他方法包括细胞或组织的全部mRNA含量的RNAseq，或者使用 进行分析之后比较表示mRNA的3’至5’位点的寡核苷酸的相对杂交信号。长度小于100个核苷酸的较小单链或双链核酸(例如寡核苷酸和miRNA)，通过质谱法(例如MALDI-TOF MS)最准确地定量，该技术的额外优点是还能够确定不显著改变分析物的分子量的降解事件(例如核苷碱基的脱嘌呤或脱氨基)。大多数miRNA分析通过专用RT-qPCR进行。虽然用于确定RNA的降解程度的方法精密，显然一些mRNA序列比其他序列对降解要更敏感的多，并且由于18和28S rRNA对降解相对稳定，他们仅仅是mRNA降解程度的不良替代标志物。如上所解释的，准确地分析mRNA降解目前使用RT-qPCR最好地进行。对于评价作为RNA纯化的结果的RNA降解方法的详细描述，请参见Muyal等,(2009)Diag.Path.4:9。
RNA或DNA的“纯样品”是指其中OD260/280比为1.7以上的核酸水溶液。
虽然通常而言不稳定性和降解与被研究分子(“分析物”)的总分子量减少相关，与之相反地，其也可以与贮存过程中逐渐聚集的复合物的分子量增加相关。后者的一个实例是在全组织贮存过程中蛋白质复合或聚集至核酸上，或者将样品例如用福尔马林固定的石蜡包埋组织(”FFPE”)处理过程中分子的化学交联。
“稳定”是指与对照相比分析物分子的降解量总体减少的状况。所述对照可以是不应用本发明所用的条件，例如不使用任何稳定剂(图11)贮存，但是RNA的降解速率通常过高以致于不能作为有用的比较，因此较佳的对照是根据制造商说明使用的市售RNAlater(货号76106,Qiagen,德国)。对照可以是一块切除的组织(例如生物活组织)、血液或血清样品，或者是在RNAlater中于例如4℃、20℃或37℃贮存1～16小时或1～45天的贮存的一块组织。
组织破坏是指大组织样品分成颗粒的过程，所述颗粒足够小以能够随后通过添加离液剂溶液(chaotrope solution)被裂解。破坏将样品分成块，所述块小至足以能够充分地释放分析物以用于随后的RNA提取和纯化。
可以进行“RNA酶失活”步骤以使RNA酶充分地失活，并允许随后用DES混合物稳定化而不会显著地降解RNA。对于使RNA酶失活，本领域已知许多方法，例如用诸如胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶或蛋白酶K等蛋白酶酶促降解；用β-巯基乙醇(Chirgwin等，"Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched inRibonuclease,"Biochemistry,18:5294-5299,1979)、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、谷胱甘肽或TCEP来减少二硫键；添加RNasin蛋白(Life Technologies,美国)、RNAsecureTM(LifeTechnologies,美国)；用诸如盐酸胍、异硫氰酸胍(Chomczynski和Sacchi,"Single StepMethod of RNA Isolation by Acid Guanidine Isothiocyanate-Phenol-ChloroformExtraction,"Anal.Biochem.,162:156-159,1987；Sambrook等，"Molecular Cloning,ALaboratory Manual,"pp.7.16-7.52,1989)、尿素、甲酰胺、甲醛或碘乙酸钠等离液剂处理；用诸如Tween-20、Triton X-100、NP-40、SLS或SDS、EDTA、EGTA、柠檬酸钠处理；热或酸变性；用氧钒核糖核苷复合物(Berger和Birkenmeier,1979)抑制或用戊二醛交联。如本文一个实施例中所提出，在DES混合物处理之前，首先处理组织样品以使RNA酶活性减少至其未处理活性的至少50％、75％或更优选100％。处理前的残留RNA酶活性可以使用RNaseAlertTM试剂盒(Life Technologies,美国)监测。用于使组织中的RNA酶失活的方法在美国专利第6,777,210号和美国专利申请公开第2009/0286304号中提出。
举例而言，但并非限制，DES通过将一种或多种组分与一种或多种也能形成DES的其他组分混合或者混合和加热而制造，所述一种或多种组分可以选自下述组：硝酸胆碱、四氟硼酸胆碱、氢氧化胆碱、酒石酸氢胆碱、柠檬酸二氢胆碱、对甲苯磺酸胆碱、碳酸氢胆碱、氯化胆碱、溴化胆碱、碘化胆碱、氟化胆碱、氯化氯代胆碱、溴化溴代胆碱、碘化碘代胆碱、氢氧化乙酰胆碱、酒石酸氢乙酰胆碱、柠檬酸二氢乙酰胆碱、对甲苯磺酸乙酰胆碱、碳酸氢乙酰胆碱、氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、碘化乙酰胆碱、氟化乙酰胆碱、氯化氯乙酰胆碱、溴化溴乙酰胆碱、碘化碘乙酰胆碱、氢氧化丁酰胆碱、酒石酸氢丁酰胆碱、柠檬酸二氢丁酰胆碱、对甲苯磺酸丁酰胆碱、碳酸氢丁酰胆碱、氯化丁酰胆碱、溴化丁酰胆碱、碘化丁酰胆碱、氟化丁酰胆碱、氯化氯丁酰胆碱、溴化溴丁酰胆碱、碘化碘丁酰胆碱、氯化乙酰硫代胆碱、L-肉毒碱、D-肉毒碱、甜菜碱、肌氨酸、N-氧化三甲基胺、盐酸甜菜碱、十六烷基甜菜碱、十六烷基三甲基氟化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、月桂基甜菜碱、N,N-二亚甲基乙醇氯化铵、N,N-二乙基乙醇氯化铵、氯化β-甲基胆碱、氯化磷酸胆碱、柠檬酸胆碱、氯化苯甲酰胆碱、月桂基磺基甜菜碱、苯甲基三甲基氯化铵、甲基三苯基氯化鏻、甲基三苯基溴化鏻、甲基三苯基碘化鏻、甲基三苯基氟化鏻、N,N-二亚乙基乙醇氯化铵、乙基氯化铵、四甲基氯化铵、四甲基溴化铵、四甲基碘化铵、四甲基氟化铵、四乙基氯化铵、四乙基溴化铵、四乙基碘化铵、四乙基氟化铵、四丁基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基碘化铵、四丁基氟化铵、(2-氯乙基)三甲基氯化铵、氯化铽(III)、氯化锌(Ⅱ)、溴化锌(Ⅱ)、氯化锆(III)、氯化铁(III)、氯化锡(Ⅱ)、氯化铜(II)、氯化镁(Ⅱ)；所述一种或多种其他组分包括例如(但并非限制)选自下述组的化学品：尿素、甲酰胺、硫脲、1-甲基脲、1,1-二甲基脲、1,3-二甲基脲、碳酰肼、四甲基脲、1,3-双(羟基甲基)脲、苯甲酰胺、吉拉尔特试剂(Girards Reagent)T、乳酰胺、乙酰胺、氟乙酰胺、二氟乙酰胺、三氟乙酰胺、氯氟乙酰胺、氯二氟乙酰胺、氯乙酰胺、二氯乙酰胺、二氯氟乙酰胺、三氯乙酰胺、溴乙酰胺、二溴乙酰胺、三溴乙酰胺、溴氟乙酰胺、溴二氟乙酰胺、溴氯氟乙酰胺、碘乙酰胺、二碘乙酰胺、三碘乙酰胺、2-甲基-2,2-二氟乙酰胺、2-甲基-2-氟乙酰胺、2,2-二甲基-2-氟乙酰胺、2-乙基-2,2-二氟乙酰胺、2-乙基-2-氟乙酰胺、2,2-二乙基-2-氟乙酰胺、2-丙基-2,2-二氟乙酰胺、2-丙基-2-氟乙酰胺、2,2-丙基-2-氟乙酰胺、2-氟丙酰胺、3-氟丙酰胺、2,2-二氟丙酰胺、2,3-二氟丙酰胺、3,3-二氟丙酰胺、3,3,3-三氟丙酰胺、2-氟-3,3,3-三氟丙酰胺、2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、五氟丙酰胺、六氟丁酰胺、三甲基乙酰胺、1-(三氟乙酰基)咪唑、N,O-双(三氟乙酰基)羟胺、双三氟乙酰胺、N-甲基-氟乙酰胺、N-甲基-二氟乙酰胺、N-甲基-三氟乙酰胺、N-甲基-氯氟乙酰胺、N-甲基-氯二氟乙酰胺、N-甲基-氯乙酰胺、N-甲基-二氯乙酰胺、D N-甲基-二氯氟乙酰胺、N-甲基-三氯乙酰胺、N-甲基-溴乙酰胺、N-甲基-二溴乙酰胺、N-甲基-三溴乙酰胺、N-甲基-溴氟乙酰胺、N-甲基-溴二氟乙酰胺、N-甲基-溴氯氟乙酰胺、N-甲基-碘乙酰胺、N-甲基-二碘乙酰胺、N-甲基-三碘乙酰胺、N-甲基-2-甲基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-甲基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-二甲基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-乙基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-乙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-二乙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-丙基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-丙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-丙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-氟丙酰胺、N-甲基-3-氟丙酰胺、N-甲基-2,2-二氟丙酰胺、N-甲基-2,3-二氟丙酰胺、N-甲基-3,3-二氟丙酰胺、N-甲基-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-氟-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2,2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2,2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-五氟丙酰胺、N-甲基-六氟丁酰胺、N,N-二甲基-2,2,2-三氟乙酰胺、N-乙基-2,2,2-三氟乙酰胺、N,N-二乙基-2,2,2-三氟乙酰胺、N-(羟基甲基)三氟乙酰胺、三氟乙酸乙酯、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、β-巯基乙醇、青霉胺、硫普罗宁(Tiopronin)、丙烯酰胺、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、甲醛、戊二醛、牛磺酸、乌头酸、己二酸、苯甲酸、柠檬酸、丙二酸、苹果酸、DL-马来酸、草酸、苯乙酸、苯丙酸、琥珀酸、乙酰丙酸、酒石酸、没食子酸、对甲苯磺酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、乙二醇、三乙二醇、甘油、间苯二酚、苯酚、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇、1,12-十二烷二醇、间甲酚、咪唑、1-甲基咪唑、4-甲基咪唑、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、N-苯甲基吡咯烷酮、2-咪唑啉酮、四氢-2-嘧啶酮、胍、盐酸胍、异氰酸胍、硫酸胍、乙酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、柠檬酸氢二铵、甲酸铵、碘化铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、氨基磺酸铵、硫酸铵、酒石酸氢二铵、异硫氰酸铵、苯甲酸铵、溴化铵、氟化铵、硫酸氢铵、三氟乙酸铵、硫代硫酸铵、阿东糖醇(Adonitol)、核糖醇、鼠李糖、海藻糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖醇、山梨糖、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘露糖醇、阿拉伯糖、半乳糖、棉子糖、肌醇、赤藓糖醇或木糖。
应该意识到，本文公开的一些化合物可以是可电离的，即一些化合物可以是弱酸、弱碱或两性电解质。可解离化合物的游离形式的代表旨在涵盖相应的电离形式。例如，羧酸基团的代表涵盖相应的羧酸根基团。
应该注意，诸如氯化锌等某些化合物可以不仅与氯化胆碱还与尿素形成DES；氯化胆碱和氯化锌出现在上述同一组分组中，因此某些DES混合物可以由同一组内的化学品形成。
还应该注意，以上列表是非排他性的，并且除了DES组分之间常存在氢键外(但并非必须)，DES组分不特别限于任何类型的分子或性质。
根据本发明使用的深共熔溶剂优选基本上不含有机酸。具体而言，根据本发明使用的深共熔溶剂优选基本上不含选自以下的有机酸：苹果酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乌头酸、酒石酸、抗坏血酸、丙二酸、草酸、葡糖醛酸、神经氨酸和唾液酸。作为选择或另外地，式II和III中所示的R6、R7和R8经选择以使所得化合物不包含羧酸基团。在优选设定中，当R6是OH时，R7不是羰基。在另一优选设定中，当R7是–Z-C(O)R8时，R8不是OH。
根据本发明使用的深共熔溶剂优选基本上不含金属盐。在一个设定中，深共熔溶剂基本上不含除了锌或锆的盐之外的金属盐。深共熔溶剂优选基本上不含NaH2PO4、Na2HPO4、NaHSO3、Na2SO4、MgCl2、CaCl2、KCl、NaCl和KI。如果深共熔溶剂包含糖或糖醇，则深共熔溶剂特别优选不包含金属盐。
根据本发明使用的深共熔溶剂优选基本上不含选自以下的糖或糖醇：蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、阿拉伯糖、核糖、核酮糖、半乳糖、鼠李糖、棉子糖、木糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、赤藓醇和阿东糖醇。如果深共熔溶剂包含金属盐，则深共熔溶剂特别优选不包含糖或糖醇。
还应该注意，DES混合物中的DES组分没有特定的最大数目，例如可以将2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种组分以通常为整数(但并非必须)的摩尔比混合，以产生DES混合物，例如在双组分DES混合物中，组分1和组分2可以以下述比例混合：10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10(摩尔:摩尔)；或者例如在三组分DES混合物中，组分1、组分2和组分3可以以这些比例混合：10:1:1、9:1:1、8:1:2、7:1:3、6:1:4、5:1:5、4:1:6、3:1:7、2:1:8、1:1:9、1:2:8、1:3:7、1:4:6、1:5:5、1:6:4、1:7:3、1:8:2、1:9:1、1:10:1(摩尔:摩尔:摩尔)。
技术人员会理解，组分的其他混合比例也是可以的，例如20:1或者1:30(摩尔:摩尔)，并且对于特定目的，例如稳定RNA和/或固定细胞形态而言，产生共熔点的特定摩尔比不必是最优的期望的摩尔比。DES的稳定活性可以与DES混合物的氢键合性质相关。对于制造用于特定应用的有用DES混合物对组分的数目或者混合比例没有特别限制或限定。可以通过添加另外的组分，或者作为选择，通过添加下述的“添加剂”，来改变DES的其他物理性质，例如粘性或密度。一些DES混合物可以使用分数摩尔比制备，例如，ZnCl2:尿素以1:3.5(摩尔:摩尔)制备，并且同样地，对使用的组分1和组分2、或者组分1、组分2和组分3的摩尔比没有特别限定，包含在待用于诸如细胞固定等应用的DES混合物中的组分的最佳比例通过经验最精确地确定。仅举例而言，氯化胆碱/三氟乙酰胺可以以2:1、1.75:1、1.5:1、1.25:1、1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75或1:2(摩尔:摩尔)的比例或其其他的分数量混合，然后单独地测试以确定具有最佳RNA稳定化和/或细胞固定性质的比例。
诸如成本或毒性等其他因素也可以使技术人员减少特定组分的比例，并且用便宜的替代品部分地将其代替。仅举例而言，对于一些应用，氯化乙酰胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)DES混合物可以被较便宜的氯化胆碱代替，如氯化乙酰胆碱:氯化胆碱:尿素(1摩尔:1摩尔:4摩尔)。
对技术人员显而易见的是，例如，由于在用于制造DES的组分中污染的存在(例如水、氧化、吸收CO2、合成过程中污染副产物或组分之一的分解产物)，1:1(摩尔：摩尔)(仅举例而言)混合物的所需确切比例可以实际上意味着在组分1或者组分2的确切量上有+/-10％、但更优选5％、甚至更优选1％的差异。举例而言，5％的误差可能产生以下最终摩尔比：0.95:1、1:0.95、1.05:0.95或0.95:1.05(摩尔:摩尔)，该误差的影响通常仅凭经验确定，例如其对RNA品质的影响，如在实施例1中提出。通常为了除去包括水在内的污染物，可以进行公知的在乙醇中再结晶的步骤，然后充分抽真空和/或化学干燥。方法见‘Purification of Laboratory Chemicals’Butterworth-Heinemann(2012)中所述。
通常而言，但不是排除性的，通过将氢键受体与氢键供体混合来制备DES，所述氢键受体来自下述类别的化学品之一：(i)具有带正电阳离子的氮盐，例如伯氮、仲氮、叔氮或季氮，氮盐的一个实例是具有卤离子的氮盐，例如氯化胆碱；(ii)金属盐，例如过渡金属卤化物；所述氢键供体可以包括(iii)胺；(iv)羟基；(v)醛；(vi)酰胺或(vii)羧酸，因此可以包括例如糖、羧酸、脲(诸如三氟乙酰胺)和醇等氢键供体。
在一个设定中，深共熔溶剂是III型或IV型深共熔溶剂，其中如使用AgilentBioanalyser 2100所测定，大鼠肝脏样品与400mg深共熔溶剂在24℃温育20天，提取自10mg所述大鼠肝脏样品的RNA具有的RNA完整数(RNA integrity number)(RIN)为至少4.0。
RNA完整数可以使用RNA 6000 Nano总RNA试剂盒(货号5067-1511,AgilentTechnologies,美国)和Bioanalyser 2100仪器(货号G2939AA,Agilent Technologies,美国)测定。
如本文所用，术语“III型深共熔溶剂”是指具有至少第一组分和第二组分的深共熔溶剂，其中所述第一组分是季铵或鏻化合物，例如氯化胆碱或N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)，并且其中第二组分是氢键供体，例如尿素或三氟乙酰胺。IV型深共熔溶剂是包含至少第一组分和第二组分的深共熔溶剂，其中第一组分是金属盐，例如氯化锌，并且其中第二组分是氢键供体，例如尿素。
本领域技术人员熟悉从组织样品提取RNA的方法。适合的是，RNA可以使用RNeasy微型试剂盒(货号：74106,Qiagen,德国)根据制造商说明提取，虽然可以使用其他方法。
本发明提供深共熔溶剂作为病毒、细胞或组织固定剂来产生经固定的病毒、细胞或组织的应用。优选的是，对于生长于基体(substrate)上并与深共熔溶剂在24℃温育1小时的海拉细胞，在用水替换深共熔溶剂并在24℃温育1小时之后，所述海拉细胞中的至少75％仍然附着。
本领域技术人员熟悉用于确定保持附着在基体的细胞的数量的方法。例如，约2,000个海拉细胞可以生长在合适的基体上，例如盖玻片上。合适的盖玻片的一个实例是CellatticeTM：(微划线细胞培养盖玻片表面，货号：CLS5-25D-050 Nexcelom Bioscience,美国)。可以将基体放在组织培养板上，并在合适的缓冲液中(例如2ml DMEM/10％FBS)中生长过夜。在基体的规定区域中附着细胞的数量可以使用10×显微镜物镜手动计数。组织培养基可以使用例如移液管除去，并用400mg的深共熔溶剂替换。可以将组织培养物在室温温育1小时，以允许进行细胞固定，然后用2ml蒸馏水替换除去深共熔溶剂，在室温温育1小时，并对规定的栅格区域中的细胞数量手动计数。然后可以计算残留在规定区域中的附着细胞相对于最初数量的百分比。
在特别优选的设定中，大鼠肝脏样品在24℃与400mg深共熔溶剂温育20天，如使用Agilent Bioanalyser 2100所测定，提取自10mg上述大鼠肝脏样品的RNA具有的RNA完整数为至少4.0；并且对于生长于基体上并且在24℃与深共熔溶剂温育1小时的海拉细胞，在用水替换深共熔溶剂并在24℃温育1小时后，所述海拉细胞的至少75％保持附着在基质上。
可选地是，根据本发明使用的深共熔溶剂是III型深共熔溶剂，其中所述深共熔溶剂包含含有三氟甲基的化合物。含有三氟甲基的化合物在深共熔溶剂中的存在量可以为所述深共熔溶剂的至少5重量％。
在一个设定中，所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中第一组分是式I化合物：
其中：
R6是H或OH；
R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和
Z选自-CH2-、O和S；
R8是R11或OH；和
其中所述第二组分包含式II化合物或其盐：
其中：
A选自O、S和NH；
R1选自H、具有1～6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)aCH3和-C(R3)(R4)(R5)；
其中a是0或1～5的整数；
R2选自H和具有1～3个碳原子的直链烷基；
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；
R4和R5各自独立地是H或F；和
其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基和具有1～3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。
优选的是，在该设定中，A选自O、S和NH；R1选自H、-CH＝CH2、R9、-NH2、-NHCH3和-C(R3)(R4)(R5)；R2选自H和-CH3；R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；并且R4和R5各自独立地是H或F；并且R9和R10各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基、具有1～3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。可选地是，R7选自H、Br、羰基氧和
A可以是O或S。
R2可以是H。
R1可以选自H、R9、-CH＝CH2和-C(R3)(R4)(R5)。在该设定中优选的是，R1是R9，其中R9优选具有1个碳原子。
优选的是，所述第二组分是乙酰胺，或者2-氯乙酰胺。
在另一设定中，R9是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
所述第二组分优选是三氟乙酰胺、三氟硫代乙酰胺或N-甲基三氟乙酰胺。
在另一设定中，R9具有2个碳原子，优选的是R9是一氟乙基、二氟乙基或三氟乙基。
优选的是第二组分是2,2-二氟丙酰胺或3,3,3-三氟丙酰胺。在另一设定中，第二组分是甲酰胺或丙烯酰胺。
在又一设定中，R1是C(R3)(R4)(R5)，其中R4和R5优选是F。
R3可以是可选地具有取代基的6元芳香环，例如可选地具有取代基的苯基。优选的是，第一组分是2,2-二氟-2-苯基乙酰胺。作为选择，R3包含取代基，该取代基优选位于苯基的2位。
所述取代基优选是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。因此，在一个设定中，第二组分是2-(三氟甲基)苯基乙酰胺。
在又一设定中，R1选自-NH2和–NHCH3。优选的是，第二组分是尿素、硫脲或1,3-二甲基脲。
在又一设定中，A是NH。在该设定中，第二组分可以是胍，可选地是其中所述胍以氢异硫氰酸盐(hydroisothiocyanate salt)的形式存在。
在又一设定中，R7是H。在该设定中，第一组分优选包含胆碱。
在另一设定中，第一组分包含溴胆碱。
在另一设定中，第一组分是N,N,N-三甲基甘氨酸，可选地是第二组分选自三氟乙酰胺和尿素。
在另一设定中，R7是
在该设定中，Z可以是O或S，并且R8可以是R11，其中R11优选具有1个碳原子。
在该设定中，所述第一组分优选包含乙酰胆碱或乙酰基硫代胆碱。
作为选择，R11可以具有3个碳原子，其中，所述第一组分优选包含丁酰胆碱。
在又一设定中，Z可以是CH2。在该设定中，R8可以是OH。在该设定中，第二组分优选是肉毒碱。
所述第一组分可以包含抗衡离子，所述抗衡离子通常是卤素阴离子，但可以是另一阴离子，例如硝酸根(NO3 -)或四氟硼酸根(BF4 -)。所述卤素阴离子可以选自氟离子、氯离子、溴离子和碘离子，优选氯离子。在该设定中优选的是，第一组分是氯化胆碱，可选地是其中第二组分选自三氟乙酰胺、三氟硫代乙酰胺、3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-二氟-2-苯基乙酰胺、硫脲和尿素，优选三氟乙酰胺。
第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:3～2:1，优选1:1.5～1:2.5，更优选1:2。
在又一设定中，深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分是胆碱的卤化盐；并且其中第二组分是可选地具有取代基的咪唑，其中各取代基是具有1～3个碳原子的烷基。在该设定中，第一组分与第二组分的摩尔比优选是2.8:1～2:1。
所述胆碱的卤化盐优选是氯化胆碱，并且所述具有取代基的咪唑优选是甲基咪唑，例如N-甲基咪唑或4-甲基咪唑。也设想了具有苯甲基取代基的咪唑(例如1-苯甲基咪唑)的应用。作为选择，所述咪唑是未经取代的。
在又一设定中，所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中第一组分包含式III化合物：
其中：
R6是H或OH；
R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和
Z选自-CH2-、O和S；
其中R8选自OH、具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基和具有1～3个碳原子的一三氟烷基、二三氟烷基、或三氟烷基；和
其中所述第二组分是具有至少3个碳原子的糖或糖醇。
R7可选地选自H、Br、羰基氧和
所述糖醇可以选自甘油、苏糖醇、木糖醇、山梨糖醇和庚七醇(volemitol)，优选选自甘油、木糖醇和山梨糖醇，最优选是山梨糖醇。作为选择，所述糖可以是海藻糖。
在该设定中，第二组分可以包含胆碱，例如氯化胆碱。第一组分与所述第二组分的摩尔比可以为1:2～2:1，优选1:0.8～1:1.2。
在又一设定中，所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分是卤化锌(II)或卤化锆(IV)，并且其中所述第二组分是式IV化合物：
其中：
A选自O、S和NH；
R1选自H、具有1～6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)nCH3和-C(R3)(R4)(R5)；
其中n是0或1～5的整数；
R2选自H和具有1～3个碳原子的直链烷基；
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；
R4和R5各自独立地是H或F；和
其中R9选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基和具有1～3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基、或三氟烷基。
优选的卤化锌(II)是ZnCl2。优选的卤化锆(IV)是ZrCl4。第二组分优选是尿素。第一组分与第二组分的摩尔比可以是1:3～1:4。
第二组分优选是尿素。
在又一设定中，所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中第一组分是式V化合物：
其中：
Y-是Cl-或Br-；
X是N或P；
R12、R13、R14和R15各自独立地是具有1～16个碳原子的直链烷基、具有1～16个碳原子的直链醇基、苯甲基或苯基；
其中所述第二组分是式I化合物或其盐：
其中：
A选自O、S和NH；
R1选自H、-CH＝CH2、R9、-NH2、-NHCH3和-C(R3)(R4)(R5)；
R2选自H和-CH3；
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；并且
R4和R5各自独立地是H或F；
其中R9和R10各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基、具有1～3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。
Y-可以是Cl-。在替代性设定中，Y-可以是任何合适的抗衡离子，例如卤离子、硝酸根或四氟硼酸根。
X可以是N；在该设定中，式V化合物是季铵盐。
可选地是，R12、R13、R14和R15各自独立地是具有1～16个碳原子的直链烷基、苯甲基或苯基。
R12、R13、R14和R15各自独立地选自具有1～4个碳原子的直链烷基，并且优选各自是甲基。在该设定中第一组分优选是四甲基氯化铵。
作为选择，R12、R13、R14和R15各自是乙基。在该设定中，第一组分优选是四乙基氯化铵。
作为选择，R12、R13、R14和R15各自是丁基。在该设定中，第二组分是四丁基氯化铵或四丁基溴化铵。
作为选择，第一组分包含：
作为选择，第一组分包含：
在另一设定中X可以是P。
R12、R13、R14和R15的至少一个是苯基。在该设定中，所述第一组分优选包含甲基三苯基鏻，并且可以是甲基三苯基溴化鏻。
在另一设定中，A可以是O或S。
R1可以选自-NH2和–NHCH3，并且所述第二组分优选是尿素。作为选择，所述第二组分可以是三氟硫代乙酰胺。作为选择，所述第二组分可以是三氟乙酰胺。
第一组分与第二组分的摩尔比可以是1:1.5～1:2.5，优选1:1.8～1:2.2。
在又一设定中，深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含胆碱，并且其中所述第二组分是具有5～7个碳原子的烷基二醇。所述烷基二醇优选是己二醇。
在又一设定中，深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含胆碱，并且其中所述第二组分包含N-烷基吡咯烷酮，其中所述N-烷基具有1～5个碳原子。优选的是，N-烷基吡咯烷酮是N-甲基吡咯烷酮。优选的是，所述胆碱是氯化胆碱。在该设定中，第一组分与第二组分的摩尔比可以是1:2。
在另一设定中，深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含胆碱，并且其中所述第二组分包含β-巯基乙醇。在该设定中，所述胆碱可以是氯化胆碱，并且/或者第一组分与第二组分的摩尔比可以是约1:2。
在另一设定中，深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含胆碱，并且其中所述第二组分包含二硫苏糖醇。所述胆碱可以是氯化胆碱。第一组分与第二组分的摩尔比可以是约1:2。
DES混合物最简单地从商业化的化学原液制备，所述原液可获自化学试剂公司，例如Acros Organics(法国)、TCI(比利时)和Fluka(法国)等。通常而言，将正确量的各组分一起添加在聚丙烯试管中，短暂摇晃，通过标准手段加热至100℃，并且必要时对于难以溶解的组分或添加剂进行超声，这是极其有效的混合方法。注意对于吸湿性的诸如氯化胆碱等组分，可能需要对原液进行另外的真空干燥或重结晶。DES混合物的原液可以在真空下或者借助于诸如硅胶等干燥剂而保持干燥。通常在室温于密封管中贮存。
还已经发现，用诸如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)等DES混合物处理植物和动物组织，保持了叶、花、血液和组织的颜色，这可能通过与未处理样品或者用RNAlater、Formol或冷冻相比，减少了氧化。颜色保持可用于正确地鉴定试样和/或试验的组分。
已经发现在氯化胆碱和挥发性/有气味化学品(例如二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、β-巯基乙醇或苯酚)之间制备DES混合物，减少了挥发性以及进而减少呼吸此类化学品的令人不愉快或危险的效果。该效果可能是挥发性化学品与氯化胆碱之间的氢键合的结果。除了在组分之间需要有氢键键合之外，对于DES混合物中挥发性组分的组合没有特别限制。还存在减少诸如低分子量醇、其他有机化学品(例如包括DMSO和甲酰胺在内的溶剂)等其他挥发性组分的损失的手段。因此本发明还包括减少用于贮存或用于开放环境的组分的蒸发和/或挥发性的手段。其优点包括更好的卫生和安全性，减少有价值的试剂的蒸发损失，减少可燃性和更简单的处置。
双组分或更多组分的DES混合物的共熔点是其中组分1相对于其他组分的比例导致最低熔融温度的点。例如，氯化胆碱:尿素DES混合物的共熔点是(1摩尔:2摩尔)具有的凝固点(Fp)为12℃。从实际的标准点开始，这意味着DES在室温时可以作为液体操作，但是在冰箱里其缓慢地固化。其他DES混合物，特别是含有与甘油、乙二醇和三氟乙酰胺或苯乙酸混合的氯化胆碱的那些DES混合物，具有低得多的Fp，在低于0℃甚至-20℃仍是液体。虽然操作液体具有一些优点，如容易测定准确体积和混合，重要的是应该注意本发明绝不以任何方式限定至在任何其他特定温度的于室温为液体的DES混合物。加热和混合DES的组分提供用于使个体原子或分子与其他原子和分子建立氢键或其他相互作用的手段，因此产生DES混合物的特定性质。一旦这发生，无论DES混合物是液体、凝胶或固体，不会必然改变其例如稳定组织样品中的RNA的能力。组织样品与DES混合物之间的简单接触，即使在DES于室温为固体时也会发生，因此可以出现快速稳定。虽然传统上RNA稳定剂是液体，如RNAlater、AllProtect、PAXgene Tissue或福尔马林，本文所述的发明可以利用液体、凝胶或固体DESRNA稳定化和/或细胞固定性质。实际上使用固体形式的DES在处理组织样品时可能是有利的；DES的固体块可以通过将DES固体加热至高于其共熔点而形成，从而使其熔融，然后将其浇入合适的容器中以冷却或固化，或者经成型或切割以适合特定的容器，并且将组织样品置于固体DES表面上以引起稳定化。可以在固体DES表面中制造常规的孔、凹陷或槽以充当各样品的特定贮存位置，一个孔接收一种样品等，使用孔时有利的是，固体DES与样品之间的接触面积增加(图1A)，而在位于孔中的样品之上的另外的DES固体或液体的层会进一步增加可利用的DES的总量或与样品接触的表面积(图1B)。血液收集管示于(图1C)，其装有DES液体并具有可穿孔的帽，以便通过注射针头或血液收集试剂盒(PreAnalytix)使血液进入。举例而言，表1中列出了在室温为固体或液体的DES混合物。
本发明还包括添加剂与DES混合物的组合应用。添加剂的目的在于改善DES混合物的性质，例如RNA、DNA和/或蛋白质稳定化和/或细胞和组织固定或另一应用。各种添加剂对细胞形态的效果例如在表6中列出。添加剂的目的在于增强DES混合物用于特定应用的性质，例如RNA稳定化、贮存、运输和/或细胞或组织固定。仅举例而言，添加剂可以是：(i)辅助处理或染色或加工组织的着色剂或染料，例如H&E染料、考马斯蓝、亚甲基蓝、二甲苯蓝、结晶紫、品红、吖啶橙、DAPI、胭脂红、曙红、溴化乙锭、俾斯麦棕、赫司特(Hoechst)、孔雀石绿、甲基绿、中性蓝、尼罗蓝、四氧化锇、罗丹明或者番红；(ii)与DES混合物一起提高细胞质膜的渗透的洗涤剂、季铵盐或皂苷，例如SDS、十二烷基硫酸钠(SLS)、十六烷基四丁基溴化铵(CTAB)、四丁基溴化铵(TBAB)、脱氧胆酸钠、Brij-35、Brij-58、NP-40、Triton X-100、Triton X-114、Tween-20、Tween-80、辛基β葡糖苷、CHAPS、茄碱；(iii)抗微生物剂，例如抗生素或防腐剂，例如卡那霉素、链霉素或青霉素、硝酸钠、亚硝酸钠或苯甲酸钠；(iv)蛋白质沉淀剂如三氯乙酸、硫酸铵、磺基水杨酸，如氯化锌或硫酸锌等锌盐；(v)从DES混合物中除去过量的水的干燥剂，例如分子筛4A、硅胶、CaCl2或LiCl；(vi)探针、杂交互补核酸、肽、蛋白质、核酸或标记分子、内部对照、阻断序列或载体核酸，例如，(a)单链或双链RNA或DNA序列，(b)肽、酶或其他蛋白质如抗体，(c)用于检测分析物的分子，例如生物素、辣根过氧化物酶、亲和素、链亲和素、如荧光素等荧光标记分子、德克萨斯红、Alexa FluorTM标记的LNA；(d)Molecular BeaconTM、Scorpion探针TM；(vii)从样品除去氧并减少贮存期间对例如RNA或DNA核碱基的损伤性氧化效果的抗氧化剂，例如维生素C或谷胱甘肽；(viii)核糖核酸酶抑制剂，例如RNasin、SUPERase·INTM、RNaseOUTTM；或者蛋白酶抑制剂，例如苯甲基磺酰氟(PMSF)、二异丙基氟磷酸(DFP)、抑肽酶(aprotinin)或Pefabloc SCTM；(ix)以0.5mM～20mM使用的将pH稳定在5～8、优选6～7的缓冲剂，例如Tris-HCl、PIPES、MES、HEPES、MOPS、MOPSO、CAPS、CAPSO、BIPES、磷酸盐、咪唑；(x)以0.5mM～20mM使用的用于除去二价金属阳离子的螯合剂，例如BAPTA、EDTA、EGTA、柠檬酸、D-青霉胺；(xi)用来增强细胞、组织和器官活力的溶解氧(终浓度2％～20％)和/或CO2(终浓度0.01％～5％)、诸如氩气等非反应性气体(终浓度1％～20％)和/或缓冲剂、营养物(终浓度2％～20％)(例如葡萄糖和氨基酸)；和/或(xii)减小DES粘性的1％～20％(重量:重量)的醇，例如叔丁醇。
此处将“添加剂”定义为可以溶解在特定DES混合物中的任何物质，并且可以以大于、等于或小于DES混合物的总量(重量:重量)的量存在。仅举例而言，对于氯化胆碱:尿素:氯化锌(1摩尔:2摩尔:0.5摩尔)，ZnCl2是添加剂；或者对于氯化胆碱:三氟乙酰胺:尿素(1摩尔:2摩尔:0.1摩尔)，尿素是添加剂。还应该注意添加剂对DES混合物的凝固点不必具有任何特定效果或者与任何DES组分形成氢键，但是赋予DES混合物独特的性质。
添加至DES混合物的可能添加剂的非排除性列表是：对甲苯磺酸铵、对甲苯磺酸钠、硫酸铵、氯化铵、硫代硫酸盐、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、苯甲酸钠、十二烷基二甲基(3-磺丙基)氢氧化铵、二甲苯磺酸、刚果红、吉姆萨(Giemsa)、DAPI、溴化乙锭、马洛里氏染色、地衣红、醛一品红、四氧化锇、三氧化铬、铬酸、富尔根(Feulgen)、重铬酸盐、氯化汞、苏木精和曙红染色(H&E)、甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇、甲基三苯基溴化鏻、十六烷基四丁基溴化铵(CTAB)、四丁基溴化铵(TBAB)、脱氧胆酸钠、Brij-35、Brij-58、NP-40、TritonX-100、Triton X-114、吐温-20、吐温-80、辛基β葡糖苷、CHAPS、茄碱、卡那霉素、链霉素或青霉素、硝酸钠、亚硝酸钠或苯甲酸钠、单链或双链RNA或DNA序列、单链或双链RNA或DNA标记序列、适体、肽、酶、抗体、生物素、生物素标记的分子、辣根过氧化物酶、亲和素、链亲和素、GFP或其变体、荧光素酶、荧光素、若丹明、德克萨斯红、Alexa FluorTM、LNA、标记的LNA、Molecular BeaconTM、Scorpion探针TM、FISH探针、bDNA、PCR引物、寡(dT)、PNA、抗氧化剂、RNasin、SUPERase·INTM、RNaseOUTTM、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二异丙基氟磷酸(DFP)、抑肽酶或Pefabloc SCTM、Tris-盐酸、PIPES、MES、HEPES、MOPS、MOPSO、CAPS、CAPSO、BIPES、磷酸盐、咪唑BAPTA、EDTA、EGTA、柠檬酸、D-青霉胺、O2、CO2、N2、氩气、丙醇、叔丁醇、三氯乙酸、硫代水杨酸、水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、四甲基脲、咪唑、1-甲基咪唑、1-乙基咪唑、1-苄基咪唑、4-甲基咪唑、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、N-苄基吡咯烷酮、胍、盐酸胍、异硫氰酸胍、核糖醇、鼠李糖、海藻糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖醇、山梨糖、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘露糖醇、阿拉伯糖、半乳糖、棉子糖、肌醇、赤藓醇、木糖、醋酸锌、EDTA锌、磷酸锌、三氟乙酸锌、柠檬酸锌、PTSA锌、葡萄糖酸锌、氯化锌和/或硫酸锌。对DES混合物不溶的添加剂包括但不限于：石蜡、硅胶、硫酸钠或Molecular SievesTM、聚丙烯酰胺、气凝胶、聚丙烯酸和/或量子点。
已经发现向氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加乙醇或者诸如甲醇和异丙醇等其他醇对RNA的稳定性具有强负面影响(参见表2)。尚未理解为何特别是乙醇对RNA稳定性具有此类负面影响，但是三氟乙酰胺与氯化胆碱氢键合的改变可以作为部分解释。在任何情况下，优选的是避免使用相对于组分1(氯化胆碱)大于0.1的摩尔比的乙醇。但是，如果期望对已经用乙醇或另一醇中的DES混合物处理过的组织样品进行加工或贮存，可以使用吸收性纸从组织样品除去过量的DES混合物，在100％乙醇中洗涤2次，然后将组织长时间静置，这消除了对RNA稳定化的负面影响。作为选择，可以使用相同的方法来用第二DES混合物替换第一DES混合物，例如可以用氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或者可以用对于某些涉及RNA稳定化的应用优选的另一DES混合物替换氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合物。作为选择，一旦从DES混合物除去，可以将生物样品置于干燥环境中，例如含有分子筛、Drierite、干燥的糖(例如海藻糖、木糖醇或山梨糖醇)、(Biomatrica，美国)或氯化钙的密封容器以用于贮存目的。另一备选方案是将经处理的生物样品置于液体贮存基质中，例如醇(例如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇)、RNALater(Life Technologies，美国)、AllProtect(Qiagen,德国)、PAXgene组织、PAXgene Blood(PreAnalytix,德国)、GenTegraRNA(Integenx，美国)、Cell-Free RNA (Streck，美国)或CellSave Preservative(Veridex，美国)。作为另一选择，用DES混合物处理后的样品，可以转移至交联固定剂的溶液中，例如10倍体积的4％甲醛或戊二醛溶液，并且温育合适的时间，例如15分钟～24小时。虽然用交联剂处理样品会对RNA、DNA和蛋白质的品质具有负面影响，但该处理对于载玻片制品可以改善样品的刚性以及其在某些检验中的性能，所述检验例如利用对福尔马林处理过的蛋白质表位具有特异性的抗体的免疫组织化学。另一备选方案是用10倍体积的4％甲醛或戊二醛溶液预处理样品，并使其温育合适的时间，例如15分钟～24小时，然后除去样品，并将其添加至10倍体积的DES混合物(例如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔))15分钟～24小时。
优选的是，避免利用或存在水，以减少分析物水解的风险，特别是RNA、DNA和蛋白质水解。因此对于需要RNA、DNA或蛋白质稳定化的应用，DES混合物含有50％以下、更优选40％以下、还更优选30％以下、还更优选20％以下、还更优选10％以下、还更优选5％以下、最优选小于2％的水(重量百分比)。对于细胞结构和形态以及组织固定，DES混合物可以含有50％以下、更优选40％以下、更优选30％以下、更优选20％以下、更优选10％以下、最优选10％～5％的水(重量百分比)。
对于最优的RNA稳定化，已经发现优选向氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合物添加干燥剂。合适的干燥剂包括硅胶、聚丙烯酰胺、硫酸钠、DrieriteTM和分子筛。用于RNA稳定化的优选干燥剂是与DES混合物、优选氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合物一起以5％～50％重量:重量使用的分子筛4A型(粉末化或球团形式，例如4目～12目)。另外的优点在于已经发现分子筛减少氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合物中出现的结晶。
显然，可以制造许多类型的DES混合物，并且出于保存样品中的RNA的目的，具体的DES的选择可以通过DES的一个或多个以下优选特征来确定：(1)与RNA的相容性，优选的是当与样品混合时其应该具有的pH为pH 4.5～8.5，更优选pH 5～8，更优选pH 5.5～7.5，最优选pH 6～7；(2)与RNA纯化试剂和策略的相容性，例如其不应该干扰RNA和二氧化硅旋转柱如RNeasy(RNeasy Mini试剂盒,货号：74106,Qiagen,德国)之间的结合，或者改变RNA在含苯酚试剂如TRIzol(货号15596018，Life Technologies，美国))中的分配；(3)足够快地使组织样品中的RNA稳定化以实质上改变核糖核酸酶的活性和/或RNA对水解的可及性；作为选择，RNA在组织中足够快的稳定，从而使得在室温与DES混合物一起贮存18～24个小时的过程中，与来自相同类型的未经贮存的新鲜组织样品提取的RNA相比，RNA完整数(RIN)不减少超过2个RIN单位，更优选不超过1个RIN单位，还更优选不超过0.5个RIN单位，最优选小于0.1个RIN单位；(4)当组织占DES混合物的重量的至少10％、更优选20％、甚至更优选至少50％时(重量:重量)，具有稳定RNA的能力；(5)与新鲜组织相比，将RNA产率不减少超过20％；(6)提供DNA、蛋白质或者磷蛋白的磷酸基的稳定化；(7)是化学稳定的、非炎性的、对使用者和环境无毒的、可生物降解的、不与漂白剂或RNA纯化过程中使用的试剂反应而形成毒性化合物；(8)在室温具有至少6个月贮存期；(9)固定和稳定天然细胞形态和组织学，包括抗体表位、亚细胞机构和细胞器，同时稳定RNA和其他生物分子；(10)固定和稳定细胞，其方式使得随后允许组织学和免疫组织化学应用，例如利用抗体和染色(如Hoechst或H&E染色)的组织学和免疫组织化学应用；(11)稳定FFPE样品中的RNA以保护和增强在温度高于50℃时福尔马林交联的逆转，并使其熔融，由此容易从经固定样品除去石蜡；(12)固定和稳定全血中的循环肿瘤细胞，以允许其纯化、检测和分子分析。
样品中RNA的稳定可以是DES处理、或者DES处理与另一物理加工的组合的结果，例如核糖核酸酶的失活，由于水分子的置换所致的细胞蛋白质和核酸的沉淀，或者溶解的DES进入组织的细胞结构中并导致RNA稳定，或者这些的组合。DES所致的细胞和RNA中及其周围的氢键的修饰或改变可能是本发明提出的所观察到的生物分子和细胞稳定化的重要因素，但是DES混合物能够进行稳定化的确切机制仍是未知的。
含有分析物的样品或组织可以是：(i)液体，例如血液、血浆、血清、脑脊液(CSF)、痰、精液、支气管肺泡灌洗(BAL)、羊水、乳汁和尿液；(ii)固体，例如身体组织(肝、脾、脑、肌肉、心脏、食管、睾丸、卵巢、胸腺、肾、皮肤、肠、胰腺、肾上腺、肺、骨和骨髓)；(iii)用于医疗测试的临床，例如前列腺、乳腺或癌症样品、肿瘤或活组织检查，包括FFPE样品、循环肿瘤细胞、血液检查、临床拭子、干血、外来体、微泡；(iv)源自生物医学研究或基础生物学的动物组织(猴、大鼠、小鼠、斑马鱼、爪蟾、果蝇、线虫、酵母)，及其各发育阶段(卵、胚胎、幼虫、成虫)的动物组织；(v)用于药物开发目的的组织和组织培养物；(vi)病原性和非病原性微生物，例如真菌、古细菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，包括引起痢疾、白喉、破伤风、梅毒、鹦鹉病、退伍军人症、李斯特菌病和麻风病的大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、分枝杆菌、假单胞菌和细菌；(vii)在各种生物样品中发现的病原性或非病原性类病毒、噬菌体或病毒，所述样品例如细菌、植物、血液、人类组织、动物血液、血清、血浆和组织、以及临床样品；(viii)植物，例如水稻、玉米、高粱、棕榈、葡萄、西红柿、小麦、大麦、烟草、甘蔗和拟南芥的叶、花、花粉、种子、茎和根；(ix)固定的组织，例如FFPE组织和活组织检查，其经常需要用于提取高品质的核酸的专门的策略；(x)与有关的生物恐怖威胁相关的潜在病原性材料，例如炭疽热，其可能需要或可能不需要从发现地点运输到测试设备；(xi)极小的样品，例如来自激光捕获显微切片样品(LCM)的那些样品；(xii)食物样品，其例如可以含有食源性疾病；(xiii)土壤样品。应该注意的是样品可能不仅源自生物源样品，而且源自化学或酶促合成的样品，例如核酸类拷贝分子或扩增产物，例如体外转录RNA和PCR产物、寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸、PNA和LNA。对于可与本发明一起使用的样品类型没有特别限制。
本发明还用于RNA、DNA和蛋白质内部对照(IC)和标准物的稳定化，例如HIV或HCV诊断试剂盒(如AmplicorTM(Roche Molecular Diagnostics))中所包括的那些，或可以包括在此类诊断试剂盒中的载体RNA。对于此应用，RNA IC通常与试剂盒的剩余组分一起运输和贮存，通常是在可能导致降解的室温或4℃进行。RNA IC或载体RNA的稳定化改善了试剂盒性能并在运输和贮存期间保持其完整性。
有用的是，本发明可用于保存单链和/或双链RNA病毒，这些病毒包括：已经发现对人类健康具有显著影响的动物RNA病毒，例如诺瓦克病毒、轮状病毒、脊髓灰质炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、汉坦病毒、狂犬病病毒、流感病毒、黄热病病毒、冠状病毒、SARS、西尼罗河病毒、甲型肝炎病毒、病型肝炎病毒(HCV)和戊型肝炎病毒、登革热病毒、披膜病毒(toga)(如风疹病毒)、弹状病毒(如狂犬病病毒和VSV)、细小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒和鼻病毒)、粘病毒(如流感)、逆转录病毒(例如，HIV、HTLV)、布尼亚病毒、日冠状病毒和呼肠孤病毒，包括类病毒样病毒，例如丁型肝炎病毒；以及对农业生产均有显著影响的植物RNA病毒及类病毒，例如番茄丛矮病毒、大麦黄矮病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、烟草脆裂病毒、豇豆花叶病毒、线虫传多角体病毒、Almovirus、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、等轴不稳环斑病毒、椰子死亡类病毒(cadang-cadang viroid)和马铃薯纺锤块茎类病毒；上述病毒在用于诊断检测目的之前、期间或之后都易于降解。本发明还可用于使单链RNA噬菌体稳定化，例如包括肠杆菌噬菌体MS2在内的轻小噬菌体属(genus Levivirus)，和包括肠杆菌噬菌体Qβ在内的异轻小噬菌体属(genus Allolevivirus)，或使双链RNA噬菌体稳定化，例如，包括假单胞菌噬菌体Φ6在内的囊状噬菌体属或其他类型的噬菌体，例如用作用于诊断应用的内部RNA对照的那些噬菌体，例如用于Armored(Ambion)的那些噬菌体。本发明还可通过将DES与纯核酸混合，而用于对用于诊断试剂盒的内部对照(IC)RNA或DNA序列的稳定化。
本发明还可用于使样品稳定化以用于分析miRNA、siRNA和其他小的天然存在的RNA分子，例如snRNA、snoRNA、ncRNA、snoRNA、piRNA和rasiRNA。其还可用于涉及RNAi类型的合成RNA的研究、诊断和治疗。
有用的是，本发明可用于在胍和血液、血清、血浆细胞和/或其他医学上重要的样品类型(如细胞和组织)的混合物中保存病毒RNA，例如逆转录病毒，如HIV、轮状病毒、HCV和西尼罗河病毒。
已经发现，一些DES混合物、特别是氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)具有强抗微生物活性(实施例34)，由此使样品的操作和运输更为安全。其他应用包括稳定和固定可能已经被毒素、病毒、细菌和/或真菌故意污染的土壤和/或其他环境样品，以便于随后对RNA、DNA和/或蛋白质的运输和实验室分析。
因此本发明涉及改善RNA的贮存、保存、存档和运输、保护RNA免受降解、增加其稳定性并由此改善分析敏感性和检验品质的方法。
对于本领域技术人员显而易见的是，如实施例1中所提出，可以对各种DES通过将其以至少10:1(重量:重量)的比例添加至样品而测试其在本发明中的适合性。可以使用根据制造商说明书使用的RNAlater(10:1(体积:重量)的对照溶液(货号：76106,Qiagen,德国)，进行相对RNA稳定化的比较。在例如37℃温育1天以上之后，根据标准策略例如RNeasy(RNeasy Mini试剂盒,货号：74106,Qiagen,德国)提取RNA，并且通过凝胶电泳或通过使用RNA 6000 Nano总RNA试剂盒(货号：5067-1511,Agilent Technologies,美国)以及Bioanalyser 2100或其他合适的方法(如上述的RT-qPCR)来分析其完整性。可以通过OD260nm紫外光谱确定RNA产率，并通过公知的OD260/230和OD260/280比率确定纯度。Nanodrop ND2000(ThermoScientific Inc.,美国)是用于此类测定的合适的分光仪的一个实例。一旦鉴定出合适的DES混合物，可以通过进一步的此类测试确定其最佳量、纯度、污染水的量和用途。
通常用于优化的最重要的一个因素是DES混合物的各组分的相对摩尔比。首先，仅混合DES混合物的两种组分是最直接的手段来合适地鉴定或通过上述经验手段合适地鉴定产生所需效果的组分，所述效果例如RNA稳定化、产率、纯度和对于诸如RT-PCR或杂交等下游应用的适合性。但是对本领域技术人员显而易见的是，可能理想的是超过两种组分的共混物，以进一步增强DES混合物或为DES混合物添加新性质。显然存在非常大量的可以形成DES混合物的组分的潜在混合物，但是最容易首先以DES组分的简单化学计量摩尔比制备开始，例如仅举例而言，2:1、1:1或1:2摩尔比(摩尔:摩尔)的氯化胆碱和尿素。据认为双组分DES混合物的凝固点的降低至少部分地由可利用的氢键供体(例如氯化胆碱)和受体(例如尿素)之间的氢键决定。但是应该注意的是，DES混合物的优选组分及其对于诸如RNA保存或细胞固定等特定应用的最佳混合比并不必然地与所观察到的凝固点降低的程度相关。因此鉴定对于应用的最佳DES混合物必须通过经验确定，并因此可以包括试错测试。显然，鉴定用于大于两种组分的DES混合物的特定目的的最佳共混物可能要花费显著的努力。因此，起初为了快速地限定组分的合适摩尔比，如上所述可以使用化学计量比例。一旦已经鉴定出合适的摩尔比，可以进行进一步完善，包括固定一种组分的摩尔量，同时变化其他两种或多种组分的摩尔量。应该注意的是，各种DES组分的摩尔浓度是可变的，并且取决于各组分的密度、摩尔比和分子量。举例而言，氯化胆碱:尿素(1:2)混合物中的氯化胆碱浓度约为5M且尿素浓度是10M，而相比之下氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2)混合物中氯化胆碱浓度为3.6M且三氟乙酰胺浓度为7.2M。
如Timothy D.Veenstra,Richard D.Smith编写的Proteome Characterizationand Proteomics(2003)中所述，可以通过制备型或分析型2-D PAGE、质谱、合适的抗磷抗体和ELISA来确定蛋白质和磷蛋白的完整性。
从粘性DES液体混合物回收样品的方法包括将其固定或附着至回收器(retriever)，例如线、针、刷、棒(baton)、筛、插入物，将其捕获在两层可渗透膜之间或含有足够的DES的两个聚合物垫之间，以允许有效的DES稳定化和/或固定，或者使用能够在处理过程中抓持样品的成型塑料保持器。优选的是，组织样品携带的任何DES混合物容易溶解于例如RLT(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)等RNA裂解液中并且不影响RNA产率或者增加RNA产率、不引起样品从溶液沉淀出，并且如果其随RNA样品携带，其不影响或者增强敏感的下游应用，例如RT-qPCR。确定RNA产率和品质的变化的方法是公知的，并且包括分光光度法、采用Agilent Bioanalyser 2100定量的RNA 6000 Nano总RNA试剂盒(货号：5067-1511,Agilent Technologies，美国)和/或RT-qPCR。
使用DES混合物的本发明显示的结果特别令人意外，因为众所周知核酸酶对活性具有非常宽的要求，例如核糖核酸酶A是稳健的核酸酶，其在pH4～10、例如+4℃～60℃的可变温度、0～3M的钠浓度、至多400mM的胍离液剂浓度下具有活性，并且能够煮沸数分钟而存活(Raines(1998)Chem.Rev.98:1045-1065)。虽然非常难以使此类酶失活，用许多不同的DES混合物处理可以对核酸酶活性造成显著影响，因此改善RNA品质。一种解释是，DES组分与诸如核酸酶、特别是核糖核酸酶等酶形成氢键，置换这些酶周围的天然水分子并且导致变性和失活，并且/或者RNA在经变性的DES处理的核糖核蛋白复合物(例如核糖体)内得到保护。
对本领域技术人员显而易见的是，可以以许多方式进行测试具体DES对生物分子贮存的功效。首先，可以向设定量的预称重组织(例如20mg的冷冻-解冻大鼠肝)添加已知量的DES，并在37℃一起温育不同的时间量(例如5小时、10小时、20小时、40小时和60小时)，温育后回收组织，并通过纯化回收RNA或其他生物分子并分析完整性。可以例如通过RT-qPCR或Bioanalyser 2100(Agilent,美国)RIN分析确定RNA品质。
优选的是，DES混合物在制备后具有合理的贮存期，意味着其稳定活性在常温贮存至少6个月以上的过程中不会显著改变。
DES混合物与组织样品的搅拌、混合和温度对于最佳RNA稳定都是重要因素。DES混合物在组织样品周围的温和搅拌可帮助增加样品的稳定速率。混合或搅拌的手段包括使用Thermomixer(Eppendorf,德国)的混合功能、旋转轮或平台，例如LabRoller(LabNet,美国)。虽然使用DES混合物观察到的RNA的降解量是有限的，但是从样品被从其在整个动物的正常环境中取出到DES混合物开始减少或完全抑制核糖核酸酶活性之间的时滞过程中，样品会出现不可避免的一些降解。对于本发明，关键步骤是从向样品添加DES混合物到核糖核酸酶失活之间的时滞，并且显然核糖核酸酶在25℃～37℃比在4℃～16℃更具活性。优选地，将DES和容器预冷却并在关键的DES处理步骤期间保持这种降低的温度，但是对于诸如大鼠肝等具有平均水平的核糖核酸酶的组织而言(与诸如大鼠胰腺等含有较高水平的组织相比)这并不是关键。通过使用降低的温度(例如4℃)的DES混合物、容器和环境，可以在具有高核糖核酸酶活性的组织中改善RNA品质。
用于保存生物样品中的RNA的DES混合物的合适选择依赖于多种重叠的物理和化学性质。理想的是DES混合物应该能够：(1)快速有效地稳定包括生物样品中的RNA、DNA、蛋白质、翻译后修饰蛋白质(如磷蛋白)、碳水化合物、脂质和代谢物在内的生物分子；(2)当与生物样品一起以20:1(重量:重量)比、更优选15:1、还更优选10:1、还更优选8:1、还更优选6:1、还更优选4:1、还更优选3:1、还更优选2:1、最优选1:1添加时，最佳地用于稳定诸如RNA等生物分子；(3)在低于120℃、还更优选低于100℃、还更优选低于80℃、还更优选低于60℃、最优选在室温为液体；(4)其粘度不至于特别难以对其操作和/或将其从固体样品去除，并且在25℃具有的粘度小于100000cP、还更优选小于75000cP、还更优选小于50000cP、还更优选小于25000cP、还更优选小于10000cP、还更优选小于5000cP、还更优选小于2500cP、还更优选小于1000cP、还更优选小于750cP、还更优选小于500cP、还更优选小于250cP、还更优选小于100cP、还更优选小于75cP、还更优选小于50cP、还更优选小于25cP、还更优选小于10cP、最优选小于5cP；(5)具有与RNA和RNA纯化试剂的相容性，所述RNA纯化试剂例如盐酸胍、硫氰酸胍、裂解缓冲液RLT(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)硅胶旋转柱、磁性硅胶珠例如MagNA(Roche Applied Science，英国)、(LifeTechnologies，美国)；(6)与标准纯化相比，将RNA与例如RNeasy(Qiagen,德国)等硅胶柱的结合减少不超过20％，并且将OD260/280nm分光光度比值减少不超过0.2；和(7)即使与RNA纯化试剂组合对于使用者也是无毒和非炎性的；(8)生物降解；和(9)具有不挥发性。
作为DES用于从FFPE样品提取RNA的应用的一个实例，福尔马林固定公知会引起RNA和蛋白质之间的多重交联，使随后的RNA提取成问题并且使RNA的品质低。用于从FFPE样品的RNA中除去交联物的标准策略是对其加热，例如在80℃加热15至60分钟，但是这引起进一步的RNA降解(RNeasy FFPE试剂盒，货号73504,Qiagen,德国)。通过将DES与逆转交联所需的试剂组合，可以在关键的加热步骤期间保护RNA，从而产生更高品质的RNA样品。作为合适的DES的一个实例，可以使用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2)在80℃处理FFPE样品，从而从RNA除去石蜡和交联物。
作为DES在医疗领域的应用的一个实例是用于处理全血以使循环肿瘤细胞(CTC)稳定化。这些细胞源自肿瘤然后进入血流，其正越来越多地用于诊断、预后和治疗目的，并且还作为化疗药物的许多临床试验的终点。但是，对全血中的这些细胞的稳定化存在问题，因此患者血液的运送可能导致损失，或者难以正确地鉴定CTC和/或进行分子诊断分析。使用DES混合物来在体外使全血中的CTC稳定化，这克服了CTC保存的现有技术的许多缺点。仅举例而言，可以用至少6倍体积的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)处理全血中的CTC以固定细胞和保存RNA。随后可以收集CTC，并使用例如CellSieveTM(MD，美国)等许多不同方法中的任一种将其纯化。
仅出于例举的目的，并参照以下实施例和附图，更详细地描述本发明。
附图说明
图1A-1C显示了其中DES混合物置于带盖小瓶中的本发明的设备。
图2显示对根据本发明和现有技术提取的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图3显示在一定温度范围根据本发明对在DES中稳定化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图4显示根据本发明或现有技术对在组织中保存的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图5A和B显示根据本发明使用DES和现有技术对在小鼠组织样品中稳定化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图6显示根据本发明和现有技术对在可变量的组织中保存的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图7显示对从掺杂有海拉细胞的经DES稳定化的全血细胞纯化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图8显示对在提取之前在掺杂有海拉细胞的全血细胞中稳定18小时的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图9显示用胍或氯化胆碱:三氟乙酰胺使全血中的RNA稳定化。
图10显示根据本发明用氯化胆碱:三氟乙酰胺固定的海拉细胞的光学显微镜图像。
图11显示对在不存在任何稳定剂下在组织样品中降解的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图12显示根据本发明或现有技术稳定化的海拉细胞中的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图13显示对来自根据本发明或现有技术稳定化的小鼠肝脏的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
图14显示对来自经稳定化的海拉细胞的并且可选地在纯化之前进行了加工步骤的DNA和RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图15显示对在根据本发明或现有技术固定后测定其完整性的RNA和DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图16显示对来自根据本发明或现有技术处理的黑腹果蝇胚胎的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图17显示对来自根据本发明或现有技术稳定化的洋葱的幼叶(leaf shoot)的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
实施例
1.在动物组织样品中的RNA稳定化
向标准1.5ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)添加2mg～25mg大鼠肝样品，并在室温预温育20分钟，以将其稳定化和/或固定，然后样品可以在-80℃、-20℃、4℃、20℃、37℃、42℃或55℃在DES混合物中温育1小时至数周，然后用镊子回收组织样品，然后如下所述进行RNA纯化。
固定过程中使用真空系统，例如Nalgene手持真空泵(货号：6132-0020,ThermoScientific，英国)可以改善一些稠密、充有空气和/或成问题的组织的固定速率。
然后向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品，根据制造商说明(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)将组织匀质化。然后根据制造商说明立即将300μl部分的裂解液纯化，并洗脱到20μl～50μl水中。然后通过OD 260/280nm比较RNA的产率和纯度，并且通过使用寡dT cDNA引发和β-肌动蛋白PCR引物(QuantiTect SYBR GreenPCR试剂盒,货号：204141,Qiagen,德国)和LightCycler(Roche Applied Science,法国)进行RT-qPCR确定RNA完整性，或者通过使用RNA 6000 Nano总RNA试剂盒(货号：5067-1511,Agilent Technologies，美国)和Bioanalyser 2100仪器(货号：G2939AA,AgilentTechnologies，美国)获得RNA完整数(RIN)来确定RNA完整性。
其他类型的市售RNA纯化试剂盒可以代替RNeasy试剂盒，并且对所用的试剂盒类型没有特别限制。
肝样品可以被其它组织和细胞类型替换，例如肝、脾、脑、肌肉、心脏、食道、睾丸、卵巢、胸腺、肾、皮肤、肠、胰腺、肾上腺、肺、骨髓或细胞(例如COS-7、NIH/3T3、HeLa、293和CHO细胞)或者甚至液体样品，例如血清、血浆或血液。
图2.使用RNeasy试剂盒提取的300ng RNA样品的1％琼脂糖-EtBr凝胶电泳图像。对于泳道1-5的经氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)稳定化的或者泳道6-10的晶RNAlater(货号：76106,Qiagen,德国)稳定化的15mg大鼠肝，贮存5分钟(泳道1+6)、1天(泳道2+7)、3天(泳道3+8)、7天(泳道4+9)或21天(泳道5+10)。可以观察到在37℃贮存后，通过7天后的比较，与RNAlater相比，用氯化胆碱:尿素稳定的样品具有改善的RNA稳定性，氯化胆碱:尿素样品的RNA完整数为RIN＝8，而对于RNAlater稳定的样品的RNA完整数RIN＝5.10。
2.使用其他氯化胆碱类DES混合物在动物组织样品中的RNA稳定化
向标准1.5ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或氯化胆碱:山梨糖醇(1摩尔:1摩尔)添加2mg～25mg大鼠肝样品，并在室温预温育20分钟，以将其稳定化和/或固定，然后样品可以在-80℃、-20℃、4℃、20℃、37℃、42℃或55℃温育1小时～数周，然后用镊子回收组织样品，然后如以下实施例所述进行RNA纯化。
然后向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品，根据制造商说明书(RNeasy Mini试剂盒,货号：74106,Qiagen,德国)将组织匀质化。然后根据制造商说明立即将300μl部分的裂解液纯化，并洗脱到20-50μl水中。如实施例1和表1所述确定RNA产率和品质，并且对于两种DES混合物的RNA完整性与RNAlater相比都较优。
氯化胆碱的合适来源是货号：110295000,Acros Organics,法国；山梨糖醇是S0065,TCI,比利时；三氟乙酰胺是货号：T0598,TCI,比利时。
3.使用其他DES混合物在动物组织样品中的RNA稳定化
向2ml聚丙烯管中的400μl以下DES混合物添加5mg～15mg大鼠组织(冷冻组织原液)，20分钟固定步骤后，将样品在37℃温育18小时，然后使用RNeasy Micro试剂盒(货号：74004,Qiagen,德国)进行RNA提取/纯化。无论DES混合物在室温是固体还是液体，计算提取后的RNA产率和和RNA品质，等级为1～10(0表示无稳定化，10表示无降解，与从新鲜的大鼠肝组织样品提取后立即的RNA品质＝10相比)。结果示于以下表1(nd＝未确定，“饱和”的溶液不是DES)。
表1.使用双组分DES混合物在动物组织中的RNA稳定化
定量RNA品质等级如下：0(高度降解)～10(最高品质)。表1和2中的RNA分析如下进行：溴化乙锭染色，1％琼脂糖0.5×TAE凝胶电泳，然后目视分析在紫外线下拍摄的的照片以分析18S和28S rRNA条带的完整性。RNA品质评分为8以上的RNA样品具有的18S与28SrRNA溴化乙锭染色比为1:2；而RNA品质评分为5的RNA样品具有的18S与28S rRNA染色比为约1:1。
表2.加上添加剂的双组分DES混合物
定量RNA品质等级如下：0(高度降解)～10(最高品质)。表1和2中的RNA分析如下进行：溴化乙锭染色，1％琼脂糖0.5×TAE凝胶电泳，然后目视分析在紫外线下拍摄的的照片以分析18S和28S rRNA条带的完整性。RNA品质评分为8以上的RNA样品具有的18S与28SrRNA溴化乙锭染色比为1:2；而RNA品质评分为5的RNA样品具有的18S与28S rRNA染色比为约1:1。
4. DES与支撑基质的混合组合物
为了改善DES液体混合物从贮存样品(例如组织或活组织检查)的物理分离，将DES与各种支撑基质混合。基质材料不特别限定，但是其应该即使与DES混合时也保持结构强度，因此应该不会溶解或反应。优选的是支撑基质可以直接例如用条形码标记或者通过打印机或墨水笔标记有贮存有效期。
向3.2g PEG(MW8000)、琼脂糖、聚丙烯酸或3MM纤维素纤维(Whatmann,英国)添加10ml氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:1摩尔)，并在搅拌下于100℃加热30分钟，以将混合物匀质化，然后将混合物灌入合适的容器来冷却。
此类复合混合物的优点是比液体DES混合物更容易处理，并且减少被携带至提取步骤(例如RNA纯化)的DES。可以将复合物灌入、成型、成形、切割、分层或形成到任何数量的容器中，例如96、24或6孔板，1.5ml微量离心管，5ml、15ml或50ml管。
5.在不同温度下全组织中的RNA稳定化
向标准2ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或RNAlater添加10mg大鼠肝样品，并在室温预温育20分钟，以将其稳定化和/或固定，然后完整样品可以在-20℃、4℃、37℃、50℃或65℃在DES混合物中温育18小时，然后回收完整组织样品，并如下所述进行RNA纯化。
然后向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品，根据制造商说明(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)从胍匀质化的组织提取RNA。然后根据制造商说明使用300μl份的胍裂解液立即将RNA纯化，并洗脱到20～50μl水中。如实施例1所述确定RNA产率和品质，对于DES稳定混合物，RNA完整性在大于37℃并且在等于-20℃和4℃的所有温度都优于RNAlater。结果示于图3。泳道1、3、5、7、9为氯化胆碱:尿素(1:2)，泳道2、4、6、8、10为RNAlater。
对本领域技术人员显而易见的是氯化胆碱:尿素可以被其他DES混合物(例如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔))替代。
6.于24℃全组织中的RNA的长期稳定化
向在标准2ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或RNAlater添加10mg大鼠肝样品，并在室温预温育20分钟，以将其稳定和/或固定，然后完整样品可以在24℃在氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)中温育0～19天，然后回收完整组织样品，并如以下实施例中所述进行RNA纯化。
向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品，根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)从胍匀质化的组织提取RNA。然后根据制造商说明使用300μl部分的胍裂解液立即将RNA纯化，并洗脱到20μl水中。如实施例1所述确定RNA产率和品质，对于DES稳定混合物，RNA完整性在所有时间点优于RNAlater。结果示于图4。泳道1、3、5为氯化胆碱:尿素(1:2)，泳道2、4、6为RNAlater处理的样品。
7.从不同的组织类型纯化
向标准2ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或RNAlater添加10mg份的冷冻小鼠脑(泳道3和4)或肾样品(泳道1、2、5、6)，并在室温预温育20分钟，以将其稳定化和/或固定，然后完整样品可以在37℃在氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)中温育1至7天，然后回收完整组织样品，并如下文所述进行RNA纯化(图5A)。泳道1、3、5：用氯化胆碱:尿素(1:2)稳定化；泳道2、4、6：用RNAlater(Qiagen,法国)稳定化，进行24小时(泳道1-4)或7天(泳道5和6)。
作为选择，将10mg份的经预先冷冻的小鼠组织添加至400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺，在37℃温育18小时，然后进行RNA纯化(图5B)。泳道1、3、5、7、9、11、13、15：用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2)稳定化；泳道2、4、6、8、9、10、12、14、16：用RNAlater(Qiagen,德国)稳定化。
向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品，根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)从胍匀质化的组织提取RNA。然后根据制造商说明使用300μl份的胍裂解液立即将RNA纯化，并洗脱到20μl水中。如实施例1所述确定RNA产率和品质，对于DES稳定混合物，RNA完整性等于或优于RNAlater。
8.从不同量的组织纯化
向标准2ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或RNAlater添加15mg(泳道1和2)或25mg大鼠肝(泳道3和4)，并在室温预温育20分钟，以将其稳定和/或固定，然后完整样品可以在37℃在氯化胆碱：尿素中温育0至18小时，然后回收完整组织样品，并如下文所述进行RNA纯化。
向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品，根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)从胍匀质化的组织提取RNA。然后根据制造商说明使用300μl份的胍裂解液立即将RNA纯化，并洗脱到20μl水中。
如实施例1所述确定RNA产率和品质，对于DES稳定混合物，与RNAlater相比，RNA完整性在所有时间点优于RNAlater。结果示于图6。泳道1和5为氯化胆碱:尿素(1:2)，泳道2和4为RNAlater处理的样品。
发现含有氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)的DES混合物比氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)显著更有效地稳定新鲜组织中的RNA。但是，如果将组织首先在-20℃或-80℃冷冻，则氯化胆碱:尿素与氯化胆碱:三氟乙酰胺的有效性相等。尚未理解为何氯化胆碱:尿素对于稳定在新鲜组织中的RNA的有效性较差，但是已经发现向氯化胆碱:尿素(2摩尔:1摩尔)添加33mM ZnCl2或ZnSO4显著地降低在使用新鲜组织时发生的RNA的降解量。
通常，用诸如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)等DES将处理至少1小时、然后在-80℃冷却的诸如肝、肾和肌肉等组织，显著地比未经处理的组织更软，这允许活组织检查针刺穿。当样品不可完全解冻而仅取出一部分用于进一步分析时这特别有用。还应该注意的是，用氯化胆碱:三氟乙酰胺处理的组织特别是血液的颜色不会显著改变或褪色，而未经处理或经福尔马林处理的样品不论经冷冻或未经冷冻都迅速地失去其颜色强度；这种颜色的保持对于正确地分析活组织检查试样和在活组织检查试样中的细胞类型而言是重要的优点。
9.从DES稳定的掺杂有海拉细胞的全血中纯化RNA
向400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加掺杂有50μl的150,000个海拉细胞的50μl人类全血，通过轻微吹吸(pipetting)将其混合，使样品静置，以在室温稳定化20分钟，然后进行RNA提取。将50μl(泳道1)或100μl(泳道2)的该经稳定化DES-血液/细胞混合物与300μl的裂解缓冲液RLT(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)混合，以裂解细胞并提取RNA，如下进行纯化。
将胍血液裂解物在14,000g离心60秒，将上清液转移至含有300μl的70％乙醇的新试管，通过吹吸混合，然后转移至MinElute旋转柱(RNeasy Micro试剂盒，货号：74004,Qiagen,德国)。根据制造商说明，用700μl的缓冲液RW1将MinElute柱洗涤1次，然后用500μl的缓冲液RPE洗涤2次，离心60秒以将柱干燥，然后用20μl水洗脱。使用Nanodrop(ThermoScientific，美国)通过OD260nm吸光度确定RNA产率，并加载在1％琼脂糖、0.5×TAE凝胶中对其进行分析。
表3.源自掺杂了海拉细胞的血液样品的RNA的产率
样品体积 总RNA产率
1 50μl 200ng
2 100μl 2400ng
结果示于图7。值得注意的是，通过胍-血液裂解物后的二氧化硅MinElute旋转柱目视未被血红素污染。因此氯化胆碱:三氟乙酰胺-胍混合物似乎防止二氧化硅膜被非特异性污染。
10.使用氯化胆碱:三氟乙酰胺使掺杂有海拉细胞的全血中的RNA稳定化
向1000μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加掺杂有50μl的1,000,000个海拉细胞的200μl人类全血，通过轻微吹吸将其混合，试样在室温温育18小时，然后进行RNA提取。将100μl(图8；泳道1)、150μl(泳道2)、200μl(泳道3)或250μl(泳道4)的该经稳定DES-血液/细胞混合物与250μl的裂解缓冲液RLT(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)混合，以裂解细胞并提取RNA，如下进行纯化。
将胍血液裂解物在14,000g离心60秒，将上清液转移至含有300μl的70％乙醇的新试管，通过吹吸混合，然后转移至MinElute旋转柱(RNeasy MinElute,货号：74204,Qiagen,德国)。根据制造商说明，用700μl的缓冲液RW1将MinElute柱洗涤1次，然后用500μl的缓冲液RPE洗涤2次，离心60秒以将柱干燥，然后用20μl水洗脱。使用Nanodrop(Agilent，美国)确定RNA产率，并加载在1％琼脂糖、0.5×TAE凝胶中对其进行分析。OD 260/280nm数据证明RNA基本上不含污染蛋白，而RNA产率表明MinElute柱被RNA饱和，并且MinElute柱(RNeasyMini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)会提供更好的产率。
表4.血液样品贮存18小时后的RNA产率和品质
样品体积 OD 260/280nm 总RNA产率
1 100μl 2.03 640ng
2 150μl 2.03 1500ng
3 200μl 2.01 1120ng
4 250μl 2.09 600ng
在全血中过夜的RNA稳定还如下证明。将50,000个海拉细胞与50μl的新鲜人类全血混合，然后将细胞和血液加至400μl的缓冲液RLT(Qiagen,德国)或400μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，在24℃温育过夜，然后根据制造商说明纯化RNA(RNeasy Mini,Qiagen,德国)。RNA在全血中显著地受氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)保护免遭降解，但是当在缓冲液RLT中贮存过夜时降解。可以通过添加1:8以上、优选1:10的全血至氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，而以诸如白细胞或循环肿瘤细胞等细胞形式、或者诸如外来体或其他微泡形式等亚细胞形式、或者在病毒颗粒内来进行全血中RNA的贮存。作为选择，向氯化胆碱:三氟乙酰胺添加具有或不具有20％重量:重量分子筛4A的10mM ZnCl2或ZnSO4，以进一步改善RNA稳定性。
图9显示使用胍或氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)对全血中的RNA的稳定化。使样品在24℃在缓冲液RLT(Qiagen,德国)(泳道1)或400μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道2)中贮存过夜，总RNA在胍中显著降解，但在氯化胆碱:三氟乙酰胺并未如此。
11.使用真空血液抽取管的全血稳定化
向10ml聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)血液收集管添加7ml的无菌氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，用HemogardTM(Becton Dickinson，美国)或其他合适的塞封闭所述管，部分除去空气以形成真空。作为选择，除了7ml氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)之外血液收集管可以含有ZnSO4，以在稀释的血样样品中提供1mM、5mM、10mM、33mM、100mM或200mM的终浓度。作为血液抽取管(blood draw tube)装置的实例，参见图1C。使用血液收集组件(PreAnalytix,德国)将约2ml的全血抽入所述管，或者或经由装入常规的鲁尔锁紧接头(luer-lock)注射器和针，并转移2ml内容物至血液收集管。加入血液后，将管颠倒10次以将组分混合，然后在室温温育20分钟以固定和稳定血液白细胞中的RNA，所述血液白细胞例如T淋巴细胞和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞(例如PBMC)、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞(多形核细胞)、血小板和说明书中提及的任何细菌或病毒，包括HPV、HIV、HCV、HBV、流感病毒和SARS中涉及的冠状病毒。通常红细胞在该混合物中不会保持完好。还可以使用该方法稳定和固定其他细胞类型例如循环肿瘤细胞，这允许更好的捕获、分析和贮存CTC。
在血液收集管中贮存例如在37℃至多24小时、在室温至多3天、在4℃至多1个周或者在-20℃至多3个月后，如下从经氯化胆碱:三氟乙酰胺稳定的血液提取RNA。打开全血收集管，取出1ml经稳定的样品，将其与3ml裂解缓冲液RLT混合，在14,000g离心60秒，除去上清液，并添加至等体积的70％乙醇，然后加载至RNeasy MinElute(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)或RNeasy Midi旋转柱(RNeasy Midi试剂盒，货号：75142,Qiagen,德国)，然后用缓冲液RWI和RPE洗涤该旋转柱，并根据试剂盒制造商说明洗脱RNA。
12.测定DES混合物的细胞固定性质
向12孔组织培养板中的各孔添加在1ml DMEM/5％FBS中的20,000个新鲜的胰蛋白酶化的海拉细胞，然后通过在合适的组织培养温育器中在37℃温育至少6小时，使细胞附着至板表面。然后使用真空移液管取出组织培养基，并向各孔添加400μl的DES混合物，同时在20×光学显微镜下实时检查细胞的任何形态学变化。将组织培养板返回至37℃温育器90分钟，然后再进行显微镜检查。使用达尔伯克(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)作为非毒性对照，结果示于以下表中。通过标准台盼蓝染色评估细胞活力。
表5.各种固定剂和添加剂对细胞形态的影响
表6.具有或不具有添加剂的各种DES混合物对细胞形态的影响
对海拉细胞形态的影响，等级为+(最差)～+++++(最好)。
13.用含有DES混合物的三氟乙酰胺进行细胞固定
在24孔组织培养板中使海拉组织培养细胞生长在标准组织培养条件下至汇聚，取出1ml的DMEM/FBS培养基，并用0.2ml～1.0ml的(A)达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(DPBS)或(B)氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)替换，在50×标准光学显微镜下使细胞成像。代表性视场的细胞示于图10中，在DPBS或氯化胆碱:三氟乙酰胺处理的细胞之间未看到细胞形态的实质改变。作为证明经DES处理的细胞被固定的一个测试，除去DPBS或氯化胆碱:三氟乙酰胺并用2ml自来水洗涤细胞两次，发现在室温1小时后，仅经DPBS处理的细胞膨胀然后由于水的渗透压而破裂，而经氯化胆碱:三氟乙酰胺处理的细胞即使在室温浸入水中1个月后通过上述额处理仍然很大程度上保持不变。此外，作为细胞固定的证据，将它们用1mL的0.05％胰蛋白酶在室温处理1小时，发现与经DPBS处理的细胞不同，对细胞没有影响或没有可见的蛋白酶降解，他们保持完整。
氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)可以被氯化胆碱:三氟乙酰胺1:1、1:1.5、1:1:75、1:2.25、1:2.5、1:2.75或1:3(摩尔:摩尔)代替。作为选择，氯化胆碱:三氟乙酰胺可以被甜菜碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或氯化乙酰胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)代替。对于用于细胞固定的DES混合物没有特别限制，但是含有三氟乙酰胺的混合物特别对于细胞固定和RNA稳地化特别有用(参见表1)。
组织培养细胞和组织可以用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)在不同温度下固定，而不会发生细胞裂解或畸变。将400μl份的氯化胆碱:三氟乙酰胺在37℃、100℃或120℃预热，用预热的移液管头添加至24孔板中的海拉细胞。添加热氯化胆碱:三氟乙酰胺后对细胞立即进行显微镜观察显示，明显的是，他们的形态与在室温固定的细胞非常相似。热氯化胆碱:三氟乙酰胺的粘度显著低于在室温的粘度。
具体而言，如下确定和定量深共熔溶剂的细胞固定性质。使约2,000个海拉细胞生长在25mm CellatticeTM上。将Micro-Ruled Cell Culture Surface(微划线的细胞培养载玻片表面，货号：CLS5-25D-050Nexcelom Bioscience，美国)置于24孔组织培养板中，并在2ml的DMEM/10％FBS中生长过夜，使用10×显微镜物镜对网格的规定区域中的附着细胞的数量进行计数，然后使用抽吸移液管除去组织培养基，并用深共熔溶剂替换，在室温温育1小时使细胞固定，然后用抽吸移液管除去深共熔溶剂，用2ml蒸馏水替换，在室温温育1小时，对在与之前处理相同的网格规定区域中的细胞数量进行手动计数。计算残留在网格中的附着细胞相对于初始细胞数量的百分比，并且发现在用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)处理后至少75％的细胞附着。注意细胞不应该生长至汇聚，因为据发现大量的松散附着的将死细胞容易脱落，因此引起细胞计数的误差。对本领域技术人员显而易见的是，也可以使用该方法确定其他深共熔溶剂的细胞固定性质。
14.氯化胆碱:尿素中的盐混合物的溶解度
令人注目地发现，氯化锌(ZnCl2)能够溶于氯化胆碱:尿素(1:2)中以提供1:2:2(摩尔:摩尔:摩尔)的氯化胆碱:尿素:ZnCl2的DES混合物；异硫氰酸胍可以溶解于氯化胆碱:尿素中以提供1:2:5(摩尔:摩尔:摩尔)的氯化胆碱:尿素:异硫氰酸胍的DES混合物；以及乙酸铵可以溶解于氯化胆碱:尿素(1:2)中，以提供1:2:3(摩尔:摩尔:摩尔)的氯化胆碱:尿素:乙酸铵的DES混合物。
15.不存在稳定剂时的RNA降解
为了确定在不存在DES混合物或其他稳定剂时RNA的降解速率，50mg份额的大鼠肝在20℃温育(泳道1)0分钟、(泳道2)1分钟、(泳道3)2分钟、(泳道4)5分钟或(泳道5)20分钟。结果示于图10。
发现RNA在室温5分钟后明显降解，并且在20分钟后显著降解。这提供了评估组织中的RNA在其开始降解之前可以保持完整的最大时间量的方法，因此可以针对快速性和有效性对DES固定剂进行比较。例如来自具有相对低RNA降解速率的组织(例如肌肉)的样品的重量可以大于来自具有较高速率的组织(例如胰腺)。
16.动物组织样品中的DNA稳定化
向在标准1.5ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加2mg～25mg大鼠肝样品，并在室温预温育20分钟，以将其稳定和/或固定，然后样品可以在-80℃、-20℃、4℃、20℃、37℃、42℃或55℃温育1小时至数周，然后用镊子回收组织样品，然后如下所述进行RNA继而DNA纯化。
简言之，将样品在400μl裂解缓冲液RLT中机械裂解，根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)将RNA洗脱在至少40μl水中，然后将二氧化硅膜用100μl水洗涤，在10,000×g离心60秒，弃去流通液，然后添加100μl的10mM NaOH，在70℃温育15分钟，以破坏残留的RNA，然后在10,000×g离心60秒，收集含有DNA的流通液并使用1％琼脂糖凝胶进行分析。
还可以使用诸如(货号：12183018A,Life Technologies，美国)和DNeasy Mini试剂盒(DNeasy Mini试剂盒，货号：69504,Qiagen,德国)等市售DNA纯化试剂盒，对可用于DNA纯化的试剂盒类型或组织类型没有特别限制。
肝样品可以被其他组织和细胞类型代替，例如肝、脾、脑、肌肉、心脏、食管、睾丸、卵巢、胸腺、肾、皮肤、肠、胰腺、肾上腺、肺、骨髓或细胞(如COS-7、NIH/3T3、HeLa、293、和CHO细胞)，或者甚至是液体样品、如血清、血浆或血液。
据发现，与400μl RNAlater相比，从在室温在400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2)中固定和稳定的大鼠肝样品提取的DNA具有显著更完整的DNA，证明DES混合物的稳定比RNAlater(一种已经被推荐来保存DNA以及RNA的产品)更优。也可添加1mM～33mM ZnSO4来改善DNA稳定化。
结果示于图12中。在24℃将海拉细胞球团在氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道1和3)、RNAlater(泳道2和3)中稳定9天(泳道1和2)或15天(泳道3和4)。与氯化胆碱:三氟乙酰胺相比，在RNAlater稳定的样品中的DNA降解得显著更多。
17.动物组织样品中的蛋白质稳定化
向标准1.5ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)、10mM ZnSO4·7H2O和40mg分子筛4A中添加10mg经冷冻-解冻的小鼠肝，在24℃温育4天、7天或18天。在蛋白质提取之前，将对照小鼠肝样品在400μl的PBS中温育0分钟、36小时、6天或13天。
通过向肝样品添加10倍体积的1×样品缓冲液(125mM Tris-HCl pH 6.8,2％SDS,10％甘油,5％β-巯基乙醇,0.001％溴酚蓝)来提取蛋白质，用球团杵研磨30秒，然后立即在70℃加热样品10分钟，将管置于冰上5分钟，然后在10,000×g离心5分钟，接下来通过Bradford法(Bio-Rad,法国)进行蛋白质计量(protein dosing)。将30μg的各蛋白与Laemlli缓冲液混合，加载至标准SDS-7.5％丙烯酰胺凝胶，并在110V电泳3小时。然后将蛋白质转移至蛋白质印迹PVDF/ECL+膜，并在4℃于TBS(0.1％Tween-20,5％奶粉)中与1:500稀释度的一抗(抗-α-肌动蛋白)一起温育过夜，用TBS(0.1％Tween-20,5％奶粉)将膜洗涤三次，并在24℃与1:100稀释度的HRP标记的小鼠抗-IgG二抗一起温育60分钟，洗涤并用Supersignal West pico化学发光试剂盒(Pierce，法国)显影。
结果示于图13中。在24℃将小鼠肝在PBS(泳道2-4)或氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道5-7)中稳定0分钟(泳道1)、36小时(泳道2)、6天(泳道3)、13天(泳道4)、4天(泳道5)、7天(泳道6)或18天(泳道7)。与用氯化胆碱:三氟乙酰胺贮存相比，PBS贮存样品中的IgG和肌动蛋白蛋白质降解显著更多。
18.用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)进行细胞固定以用于免疫组织化学(IHC)
使海拉细胞在24孔组织培养板中的13mm玻璃盖玻片上生长至20％细胞密度，用真空移液管回收DMEM生长培养基，用卫生纸将边缘拭干；将盖玻片转移至12孔板，直接将600μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加到盖玻片上，在室温在摇晃的平台上静置60分钟，以便能够固定。然后从固定剂取出盖玻片和细胞，用真空移液管除去过量的固定剂，用卫生纸擦拭，并用2ml PBS洗涤4×5分钟。在摇晃的平台上用2ml的PBS/1％BSA将细胞封闭，然后添加合适稀释度(例如1:100)的一抗，并在4℃静置过夜。接着将细胞在3×2ml的PBS/1％BSA中各自洗涤5分钟，添加合适稀释度的二抗(例如1:1000的Alexafluor 488山羊抗小鼠IgG1(Life Technologies,英国))的一抗，并在黑暗中于室温温育30分钟。将细胞在3×2ml的PBS/1％BSA中洗涤然后在3×2ml的PBS中洗涤，然后在水中短暂冲洗，接着用Vectashield/DAPI(Vector Labs,英国)固定，并用合适的显微镜观察。
作为选择，可以在细胞固定之前进行将10mM ZnSO4、ZnCl2、5％(体积:体积)N-乙基吡咯烷酮、5-10％的水溶液(例如水、PBS或DMEM)、2.5％(体积:体积)1-苄基咪唑或者1％(体积:体积)四甲基脲添加至氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)中，以改善免疫组织化学结果。
19.用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)进行哺乳动物组织固定以用于染色或免疫组织化学(IHC)
将新解剖的小鼠组织碎块(例如肝、肾、肺、脑、平滑肌、骨骼肌或心肌、脾、胸腺、唾液腺、子宫、睾丸、皮肤、眼睛、舌、食道、胃、肠、胰腺、肾上腺、胆囊)添加至10倍体积的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，在4℃或室温温育至少1小时，以使发生渗透和组织固定。大于1小时的较长时间的温育也是相容的，例如4小时、8小时、15小时、24小时或72小时。还可以将组织样品冷冻并贮存在氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)中待用。组织固定所需时间会依赖于许多因素，包括组织类型、尺寸、密度、脂肪含量、形状、表面积和固定剂类型。对于特定组织确定用于固定所需的最小时间可以最简单地通过下述进行：将组织温育不同长度的时间，然后观察在切片机切片过程中组织如何表现；通过在通过切片机刀片的过程中的组织撕裂会检测出不充分的固定时间。合适的固定时间产生不仅用于切片机切片而且用于RNA稳定的可靠样品。
在氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)中固定后将组织在10倍体积的PBS中短暂冲洗，然后在70％乙醇中脱水45分钟、80％乙醇中脱水45分钟、在100％乙醇中脱水30分钟两次、在甲苯中脱水30分钟两次，接下来分别在65℃和100℃包埋在石蜡(熔点56℃～58℃)各1小时。使含有经固定组织的石蜡块冷却至室温，接着根据与用于甲醛固定组织相同的标准策略进行显微切片。详细的方法在Al-Mulla和Gohlmann(2011)Formalin-FixedParaffin-Embedded Tissues:Methods and Protocols (Methods in MolecularBiology)中提出。必要时甲苯可以被二甲苯或组织透明剂(Histosol)替代。
向氯化胆碱:三氟乙酰胺添加1mM～33mM、优选10mM～33mM的锌盐(例如氯化锌、硫酸锌或柠檬酸锌)改善组织被固定剂渗透和固定的速率，而另外存在的分子筛4A改善样品中的RNA稳定。
用苏木精和曙红进行的组织切片染色遵循标准的公知方法。
20.石蜡包埋后用氯化胆碱:三氟乙酰胺进行的海拉细胞RNA和DNA稳定化
将海拉细胞球团(1000000个细胞)添加至含有10mM ZnCl2的400mg氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，并在室温固定60分钟。将经固定细胞立即加工或者随后执行标准石蜡包埋策略；(i)浸入1ml的100％乙醇中30分钟，(ii)1ml甲苯浸渍15分钟，接着在55℃用1ml石蜡浸润(iii)15分钟或(iv)60分钟。随后纯化(RNeasy,Qiagen,德国)RNA和DNA，并确定RIN(Agilent Bioanalyser 2100)。海拉细胞RNA的RIN从不进行固定的9.6(泳道1，阳性对照)降低至经固定、脱水和石蜡包埋后的8.6(泳道6)，证明虽然在加工过程中确实发生一些RNA降解，但是总量是非常可接受的。还发现氯化胆碱:三氟乙酰胺固定与用甲醛处理的样品相比，产生低得多的RNA降解(数据未示出)。DNA样品的完整性目视不变化，证明在规定过程中DNA也得到稳定。结果示于图14中。
21.石蜡包埋后用氯化胆碱:三氟乙酰胺进行的小鼠肝和肾组织的RNA和DNA稳定化
10mg小鼠肝或肾碎块添加至含有10mM ZnSO4和分子筛4A(3％(重量:重量)的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，或者添加至400μl PBS，并在4℃或24℃温育64小时。然后如下处理组织样品：70％乙醇60分钟，80％乙醇60分钟，95％乙醇60分钟，100％乙醇30分钟两次，100％乙醇60分钟，甲苯中30分钟两次，100％甲苯中60分钟，55℃的石蜡中2小时，55℃的石蜡中5小时，然后-80℃将包埋在石蜡中的样品冷冻约2个周。然后通过如下纯化RNA和DNA：首先使用手术刀从石蜡块取出包埋组织，然后使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,德国)在400μl缓冲液RLT中直接裂解，使用RNA 6000 Nano总RNA试剂盒(AgilentBioanalyser 2100，美国)确定RIN。
结果示于图15中。发现对于肝(泳道1-4)和肾(泳道5-8)，在氯化胆碱:三氟乙酰胺、ZnSO4和分子筛处理(泳道1、2、5、6)后，与PBS(泳道3、4、7、8)相比，RNA完整性显著更好。作为实例，将RIN值示于图14，并且发现在24℃将氯化胆碱:三氟乙酰胺、ZnSO4和分子筛(泳道1)与PBS(泳道3)相比，RIN值从7.5降低至2.4，还发现在氯化胆碱:三氟乙酰胺、ZnSO4和分子筛处理后DNA品质也显著更好。
22.用氯化胆碱:三氟乙酰胺、硫酸锌和分子筛进行的海拉细胞RNA稳定化
对在添加或不添加水的贮存的生物样品中向氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加各种锌盐和分子筛的RNA稳定效果进行比较。使用1,000,000个海拉细胞的经新鲜离心的球团作为RNA来源，并且向各球团添加400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，然后如表中所示在存在或不存在33mM硫酸锌和33％(重量:重量)分子筛4A型时添加终浓度为10或15％(体积:体积)的水。将样品在37℃贮存18小时，然后使用二氧化硅旋转柱(Invitek,德国)进行RNA纯化和根据制造商说明使用Agilent Bioanalyser 2100确定RNA完整数(RIN)。虽然向海拉细胞球团/氯化胆碱:三氟乙酰胺添加水显著降低RNA完整性，但是如RIN数增加所表明，当存在水时添加硫酸锌或者更优选硫酸锌和分子筛4A型可以显著地减少RNA的降解量。当存在显著量的水(例如在稳定液中超过10％终浓度)时，例如使用较大组织样品、血液、血清、血浆或植物材料的情形，这是改善样品分析物品质的特别有用的手段。当需要长期贮存样品时，对于含有低于10％水的样品也可以获得一些改善。
已经发现1mM～33mM、优选10mM(终浓度)的硫酸锌比氯化锌或EDTA锌对于减少RNA降解略微更有效，但是比葡萄糖酸锌、乙酸锌或对甲苯磺酸锌显著更有效(表2)。
表7.从海拉细胞球团提取的RNA的RIN分数
DES混合物(摩尔:摩尔) 添加剂 RIN分数
1 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) - 8.4
2 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) 10％水 6.2
3 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) 10％水+33mM ZnSO4 7.3
4 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) 10％水+33mM ZnSO4+33％分子筛 8.2
5 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) 15％水 2.9
6 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) 15％水+33mM ZnSO4 5.3
23.使用氯化胆碱:三氟乙酰胺与有机添加剂进行的海拉细胞RNA稳定化
对在添加或不添加水的贮存生物样品中向氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加N-乙基吡咯烷酮或四甲基脲的RNA稳定效果进行比较。使用1,000,000个海拉细胞的经新鲜离心的球团作为RNA来源，并且如表中所示在存在或不存在2.5％、5％、10％或20％(体积:体积)N-乙基吡咯烷酮、5％或20％(体积：体积)四甲基脲时，向各球团添加400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)。将样品在24℃贮存20天，然后使用二氧化硅旋转柱(InviTrap Spin Universal RNA Mini试剂盒，货号：1060100200 Stratec Molecular,德国)进行RNA纯化和根据制造商说明使用Agilent Bioanalyser 2100确定RNA完整数(RIN)。发现与单独氯化胆碱:三氟乙酰胺相比，N-乙基吡咯烷酮和四甲基脲都改善长期贮存后海拉细胞球团的RNA品质。
表8使用N-乙基吡咯烷酮和四甲基脲的RNA产率和品质
定量RNA品质等级如下：0(高度降解)～10(最高品质)。表1和2中的RNA分析如下进行：溴化乙锭染色，1％琼脂糖0.5×TAE凝胶电泳，然后目视分析在紫外线下拍摄的的照片以分析18S和28S rRNA条带的完整性。RNA品质评分为8以上的RNA样品具有的18S与28SrRNA溴化乙锭染色比为1:2；而RNA品质评分为5的RNA样品具有的18S与28S rRNA染色比为约1:1。
24.使用各种季铵盐和氢键供体
室温(24℃)DES液体不能由以1摩尔:2摩尔的比例混合氯化胆碱与下述任一种而制备：脯氨酸、草酰胺、新戊酰胺、1-乙基-2-吡咯、4-甲酰基吗啉、乙酰基丙酮(Acetonylacetone)、碳酸亚乙酯、四甲基脲、N-乙基咪唑、1-苄基咪唑和/或1,3-二甲基-2-咪唑烷酮。以下铵盐也不能形成室温DES液体：磷酸铵和乙酸铵。硫酸铵和氯化铵能够部分地在100℃而不是在24℃与异硫氰酸胍、山梨糖醇和/或木糖醇以1摩尔:2摩尔的比例形成液体。
表9：使用各种季铵盐的双组分混合物
25.黑腹果蝇胚胎中的RNA的稳定化
在RNA纯化之前(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,Qiagen,德国)，将10mg黑腹果蝇胚胎(0-24小时)与400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道1-3)或RNAlater(泳道4-6)混合，并在37℃温育12小时(泳道1,4)、2天(泳道2,5)或45天(泳道3,6)。RNA品质示于图16中，经氯化胆碱:三氟乙酰胺稳定化的RNA比RNAlater显著更好。
26.洋葱幼叶中的RNA的稳定化
在RNA纯化之前(RNeasy Mini试剂盒，货号：74106,德国)，将10mg洋葱幼叶(leafshoot)与400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道1-3)或RNAlater(泳道4-6)混合，并在22℃温育18小时(泳道1,4)、3天(泳道2,5)或9天(泳道3,6)。RNA品质示于图17中，经氯化胆碱:三氟乙酰胺稳定化的RNA比RNAlater显著更好。
27. DES稳定后的原位杂交应用
使用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)和10mM ZnSO4在4℃和固定时间为1小时至24小时，如实施例21所述制备组织样品并将其石蜡包埋。然后如下处理组织样品：70％乙醇60分钟，80％乙醇60分钟，95％乙醇60分钟，100％乙醇30分钟两次，100％乙醇60分钟，甲苯中30分钟两次，100％甲苯中60分钟，55℃的石蜡中2小时，55℃的石蜡中5小时。切片机制备石蜡组织切片(3μm～12μm厚)后，在室温使用二甲苯除去石蜡10分钟，然后通过在100％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、25％乙醇和水中各自温育5分钟将组织切片水化。接着在室温将组织切片进行蛋白酶K(10μg/ml)处理5分钟，然后在PBS中冲洗和在含有500μl超纯50％甲酰胺、250μl的20×SSC、50μl 10μg/μl酵母t-RNA和20μl的50×邓哈特液(Denhardt’s solution)的1ml缓冲液中预杂交，然后用合适的显色或荧光标记的探针杂交。原位杂交的策略是公知的，并且由J.M.Bridger和K Morris(2010)在Fluorescence in situHybridization(FISH):Protocols and Applications(Methods in Molecular Biology)和Summersgill等，(2007)Nature Protoc.3:220-234中描述。
28.用于流式细胞术的细胞的制备
将约500,000个培养细胞例如海拉、MCF-7、NCI60、PC3、Vero、GH3、MC3T3、ZF4或IMR-90(如果生长在固体表面上则首先稍微胰蛋白酶化以使其脱离)与10mlEMEM/10％FBS混合，并以900×g(24℃)在15ml试管中离心10分钟。然后将细胞球团再悬浮于100μl DPBS缓冲液中，并立即与1ml氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合，并用10ml移液管温和地吹吸，以彻底混合。然后将细胞静置以在4℃或24℃固定1小时至24小时，接着添加14mlDPBS，通过温和的反转将试管内含物混合，并在900×g离心10分钟，并将细胞球团温和地再悬浮于100μl DPBS中，通过添加在染色缓冲液(100mM Tris,pH 7.4,150mM NaCl,1mMCaCl2,0.5mM MgCl2,0.1％Nonidet P-40)中的1ml DAPI(3μM)将细胞核染色15分钟(24℃)。然后将经染色和固定的细胞用于流式细胞术。发现经氯化胆碱:三氟乙酰胺固定的细胞是单分散的，并且可以根据其荧光分类成细胞周期的各种阶段。
29.生物样品的两步处理
向含有10mM ZnSO4和分子筛4A(3％(重量:重量)的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加10mg小鼠组织碎片，在24℃温育1小时，然后除去组织，用纸巾简单擦拭以除去过量的稳定剂，然后浸入例如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)、氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)、氯化胆碱:山梨糖醇(1摩尔:2摩尔)、氯化甜菜碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或4％多聚甲醛中，随后温育并贮存至少1小时，但优选过夜。作为选择，本申请提出的许多DES混合物中的任一种都可充当第一稳定或固定溶液，然后是第二稳定或固定溶液。作为另一个实例，可以首先用例如4％多聚甲醛在室温进行组织固定1小时，然后将组织转移至含有10mM ZnSO4和分子筛4A(3％(重量:重量)的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)。该两步法提供了如下的手段：通过该手段例如可将用于细胞形态的最佳稳定剂随后与用于RNA、DNA和蛋白质的最佳稳定剂组合。还提供借助其通过改变最终的稳定混合物而可以减少源自生物样品的水含量的手段。对本领域技术人员显而易见的是，存在许多第一和第二混合物的组合，并且必须至少部分地通过经验手段(例如H&E染色组织切片的品质和RNA品质)确定最合适的选择。还应该注意，使用的稳定和固定混合物可以是液体或固体。
30. DES混合物与胍和苯酚纯化试剂的相容性
有利地是，氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)完全可溶并且与异硫氰酸胍或盐酸胍类病毒、细胞和组织裂解缓冲液(例如见于下述RNA纯化试剂盒：RNeasy Mini,(Qiagen,德国)、PureLinkTM(Life Technologies，美国)、MagNA Pure LC RNA分离试剂盒III、高纯RNA组织试剂盒和RNA Micro Kit Amplicor HCV(Roche Applied Science，美国)、 Multi-8 Virus RAV(Macherey Nagel,德国)、TEMPUSTM血液RNA管(Applied Biosystems，美国)、SV RNA试剂盒和PureYieldTM试剂盒(Promega，美国)、ToTALLY RNATM试剂盒(Ambion，美国)、GenEluteTM哺乳动物总RNA纯化试剂盒(Sigma-Aldrich，美国)、PAXgeneTM血液RNA试剂盒(PreAnalytix,德国))以及和苯酚类纯化试剂(例如TRIzol(Life Technologies，美国))相容，这允许经氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)稳定化的样品直接与胍或苯酚纯化试剂混合而无需从氯化胆碱:三氟乙酰胺分离样品。在例如要分离已经被固定剂渗透的组织样品不实际时，或者当个体细胞(例如组织培养细胞、血液或CTC)与体积大得多的固定剂混合并且可能难以或不可能通过离心进行分离时，这可能特别有利。作为参照，RNAlater(Qiagen,德国)中的哺乳动物细胞不能通过离心成球团，或者不能通过将细胞和RNAlater与胍裂解缓冲液混合来纯化RNA，因为RNA产率显著下降。
作为实例，已经发现包含在氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)中的低至6％(样品5，表10)以下的缓冲液RLT的含RNA样品，在与1体积的70％乙醇混合时能够用于有效地将RNA结合至旋转柱膜(RNeasy mini,Qiagen,德国)，具有优良的产率和纯度，如表10中所示。通过裂解100mg在1ml缓冲液RLT中的肝而制备小鼠肝裂解物，然后将20μl份的裂解物添加至缓冲液RLT，接着添加至氯化胆碱:三氟乙酰胺，然后如表10所示与70％乙醇混合，并结合至Rneasy最小旋转柱。然后用50μl洗脱体积的水根据制造商说明(RNeasy mini,Qiagen,德国)将RNA纯化。使用Nanodrop ND-1000确定RNA产率和纯度。令人惊奇地发现，不仅氯化胆碱:三氟乙酰胺允许胍发挥离液活性来起到降解样品的作用，而且其对RNA结合至二氧化硅旋转柱膜没有任何影响，因此产率不受影响或略微增加。
此外，在添加至胍裂解物(20μl)时，氯化胆碱:三氟乙酰胺可以代替70％乙醇的关键的RNA结合功能，如表11所示，标准的制造商策略(RNeasy Mini,Qiagen,德国)需要添加1体积的70％乙醇至裂解物，以使RNA结合至二氧化硅膜。如果不添加70％乙醇至裂解物，则RNA不能结合至二氧化硅膜，但是如果样品含有氯化胆碱:三氟乙酰胺，则RNA可以在即使不存在乙醇时结合，这提供了减少步骤数的手段并且改善了例如Rneasy试剂盒的RNA纯化步骤，而无需使用炎性液体。应该注意的是，溶解于缓冲液RLT(1重量:1重量)中的氯化胆碱或者氯化胆碱:尿素都不具有该性质，而溶解于缓冲液RLT(1重量:1重量)中的仅三氟乙酰胺产生的RNA产率与溶解于缓冲液RLT(1重量:1重量)中的氯化胆碱:三氟乙酰胺相比仅为15％。还发现缓冲液RLT:(氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)的1:1混合物具有非常良好的海拉细胞裂解活性，并且可用作在不存在70％乙醇时的独立的裂解和二氧化硅膜集合缓冲液，使用该新型混合物的RNA产率比仅缓冲液RLT显著更好。
令人吃惊的是，据发现在200μl的缓冲液RLT:(氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)的1:1混合物中制备的海拉细胞裂解物，当在65℃加热10分钟然后添加1体积的70％乙醇并根据制造商说明结合至二氧化硅旋转柱(RNeasy Mini,Qiagen,德国)时，导致对小RNA(miRNA、tRNA和5S rRNA)的专门纯化。如果省略加热步骤，纯化出包括18和28S rRNA物质的总RNA，因此加热提供了从细胞裂解物选择性纯化小RNA的新方法。在裂解缓冲液中用尿素替代三氟乙酰胺然后加热，产生极其多的RNA降解，在不存在氯化胆碱:三氟乙酰胺时加热裂解物也是如此。
表10.来自胍/氯化胆碱:三氟乙酰胺混合物的RNA产率
表11.在不存在用于结合的乙醇时来自胍/氯化胆碱:三氟乙酰胺混合物的RNA产率
31.细菌中总RNA的稳定化
将300μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加至10mg的大肠杆菌DH5α，并在22℃温育18小时，然后除去DES液体并向球团加入400μl缓冲液RLT，或者向球团和DES液体直接添加400μl缓冲液RLT，将试管旋转20秒，然后短暂地超声以破坏细胞，并使用RNeasyMini试剂盒根据制造商说明(Qiagen,德国)继续RNA纯化。发现16和23S rRNA的完整性与从新鲜细菌球团提取的RNA相比不变。作为选择，可以将ZnSO4添加至氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)以提供1mM-33mM、优选33mM的终浓度，也可以可选地添加10％(重量:重量)的分子筛以改善稳定化。
32.多组分DES混合物
已经发现稳定RNA的DES混合物可以简单地通过将多于两种组分混合在一起而制备，例如以甜菜碱:氯化胆碱:三氟乙酰胺(0.5摩尔:0.5摩尔:2摩尔)代替甜菜碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)。作为选择，新型DES混合物可以从如下制备，例如氯化胆碱:尿素:三氟乙酰胺(1摩尔:1摩尔:1摩尔)，或甜菜碱:尿素:三氟乙酰胺(1摩尔:1摩尔:1摩尔)，或者甜菜碱:氯化胆碱:尿素:三氟乙酰胺(0.5摩尔:0.5摩尔:1摩尔:1摩尔)。基于单个DES混合物中的所有组分一起的相互作用和性质，这种三种以上组分的DES混合物可以具有令人感兴趣的新性质，例如降低的粘度、改善的贮存期、改善的核酸稳定性或细胞固定性质。
作为实例，向海拉细胞球团(500,000个细胞)添加各自含有10mM ZnSO4的400mg的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)、甜菜碱:氯化胆碱:三氟乙酰胺(0.5摩尔:0.5摩尔:2摩尔)或甜菜碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，在37℃温育过夜，然后使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,德国)进行RNA和DNA纯化，并确定RIN(Agilent Bioanalyser 2100，美国)。
对本领域技术人员显而易见的是，许多此类DES混合物是可行的，具有可变的组分和摩尔浓度，并且用于应用的最合适的混合物需要经经验确定。
表12.三种不同的DES混合物对在37℃温育过夜的海拉细胞的RNA、DNA产率和RNA完整数(RIN)的比较
33.用于细胞固定的DES水性混合物
已经发现氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)的水溶液能够固定组织培养细胞和组织。向氯化胆碱:三氟乙酰胺的溶液添加DMEM组织培养基(Life Technologies,法国)以产生终浓度为0％、6％、12％、21％或50％的DMEM，然后将400μl份的混合物添加至在24孔板中的海拉组织培养细胞，并用显微镜观察。已经发现，虽然所有混合物都能固定细胞而对细胞没有低毒性或高毒性作用，但是含有氯化胆碱:三氟乙酰胺的6％DMEM产生最佳品质的细胞形态，甚至优于纯氯化胆碱:三氟乙酰胺。应该注意的是，具有大于15％的水的氯化胆碱:三氟乙酰胺稀释液能够引起细胞膜形成微液滴然后从细胞丧失，其细胞质保持完整。DES的水性稀释液提供减少粘性和成本以及潜在改善细胞固定性质的简单手段，但是水的存在对RNA稳定性具有不利影响。对本领域技术人员显而易见的是，许多不同的水性溶液，例如水、PBS、DPBS、糖溶液或DMEM能够与不同的DES混合，并且对细胞固定和生物分子稳定性的影响可能必须通过经验测试。
34. DES混合物的抗细菌活性
在室温用90μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)水性稀释液处理1×109个大肠杆菌DH5a细胞的球团25分钟，以提供90％、9％或0.9％的终浓度，然后放置到将琼脂板上，在37℃温育过夜，以使集落生长。发现90％氯化胆碱:三氟乙酰胺而不是9％或0.9％的稀释液停止所有细菌生长和集落形成。因此氯化胆碱:三氟乙酰胺似乎具有强力的抗细菌活性，并且对本领域技术人员显而易见的是，较长的处理期或不同的DES混合物可以产生甚至更强的抗细菌效应。有利地是，可预期细菌生长会在贮存于氯化胆碱:三氟乙酰胺中的组织样品中受抑制，其腐败得到阻止。
35. DES液体的原位制备
虽然通常方便的是事先在其用于固定和稳定之前制备DES混合物，备选方案是与样品一起同时添加作为固体的DES的两种以上组分。例如，在一个试管中，向2g三氟乙酰胺固体添加1.28g氯化胆碱固体，然后添加50μl-100μl的全血或25mg的组织样品，使固体自由地混合，并在生物样品的存在下形成(1摩尔:2摩尔)的共熔混合物。作为选择，可以将两种固体作为两个预加载层添加至合适的容器中，例如血液收集管，但是通过当与样品接触时破裂或溶解的膜分隔开，由此使组分混合并仅在样品存在时形成DES液体。另一可能是在合适的密闭顶部容器(top vessel)中具有两个开放的室，每个室预加载有合适量的例如氯化胆碱以及三氟乙酰胺。摇晃或反转时两种组分可以自由混合并形成DES液体，必要时在样品存在时形成。
36.使用贴壁组织培养细胞进行的RNA稳定化
在24孔组织培养板中使人胚胎成纤维细胞(HEF)生长至80％汇聚(约200,000个细胞)，除去生长培养基，并用400μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或RNAlater替换，在37℃温育0小时、32小时或9天，然后进行RNA纯化和RIN分析(Agilent Bioanalyser)。表13显示，使用任一氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)，贴壁组织培养细胞RNA都得到极其良好的保存。
表13.对于提取自在37℃贮存的人胚胎成纤维细胞(HEF)贴壁细胞的RNA的RIN分数

Claims (89)

1.深共熔溶剂抑制生物分子的降解的应用，
其中，所述生物分子是RNA；
其中，所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，
其中所述第一组分是式I化合物：
其中：
R6是H或OH；
R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和
Z选自-CH2-、O和S；
R8是R11或OH；且
其中所述第二组分包含式II化合物或其盐：
其中：
A选自O、S和NH；
R1选自H、具有1～6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)nCH3和-C(R3)(R4)(R5)；
其中n是0或1～5的整数；
R2选自H和具有1～3个碳原子的直链烷基；
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；
R4和R5各自独立地是H或F；且
其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基以及具有1～3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物分子存在于样品或组织中。
3.如权利要求2所述的应用，其中，所述样品或组织包含实体组织。
4.如权利要求2所述的应用，其中，所述样品或组织包含血浆、血清或全血。
5.如权利要求4所述的应用，其中，所述全血包括循环肿瘤细胞。
6.深共熔溶剂作为病毒、细胞或组织固定剂来产生经固定的病毒、细胞或组织的应用，
其中，所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，
其中所述第一组分是式I化合物：
其中：
R6是H或OH；
R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和
Z选自-CH2-、O和S；
R8是R11或OH；且
其中所述第二组分包含式II化合物或其盐：
其中：
A选自O、S和NH；
R1选自H、具有1～6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)nCH3和-C(R3)(R4)(R5)；
其中n是0或1～5的整数；
R2选自H和具有1～3个碳原子的直链烷基；
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；
R4和R5各自独立地是H或F；且
其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基以及具有1～3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。
7.如权利要求6所述的应用，其中，所述组织是全血。
8.如权利要求7所述的应用，其中，所述全血包括循环肿瘤细胞。
9.如权利要求6所述的应用，其中，所述组织是实体组织。
10.如权利要求6～9中任一项所述的应用，其中，所述应用还包括处理所述经固定的细胞或组织，所述处理包括选自包埋、切片、染色、显微术、原位杂交、流式细胞术、免疫组织化学法和免疫细胞化学法中的一种或多种方法。
11.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中：
A选自O、S和NH；
R1选自H、-CH＝CH2、R9、-NH2、-NHCH3和-C(R3)(R4)(R5)；
R2选自H和-CH3；
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；
R4和R5各自独立地是H或F；并且
其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基、具有1～3个碳原子的一、二或三氟烷基。
12.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，A是O或S。
13.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，R2是H。
14.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，R1选自H、R9、-CH＝CH2和C(R3)(R4)(R5)。
15.如权利要求14所述的应用，其中，R1是R9。
16.如权利要求15所述的应用，其中，R9具有1个碳原子。
17.如权利要求16所述的应用，其中，所述第二组分是乙酰胺。
18.如权利要求16所述的应用，其中，所述第二组分是2-氯乙酰胺。
19.如权利要求16所述的应用，其中，R9是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
20.如权利要求19所述的应用，其中，所述第二组分是三氟乙酰胺。
21.如权利要求19所述的应用，其中，所述第二组分是三氟硫代乙酰胺。
22.如权利要求19所述的应用，其中，所述第二组分是N-甲基三氟乙酰胺。
23.如权利要求15所述的应用，其中，R9具有2个碳原子。
24.如权利要求23所述的应用，其中，R9是一氟乙基、二氟乙基或三氟乙基。
25.如权利要求24所述的应用，其中，所述第二组分是2,2-二氟丙酰胺。
26.如权利要求24所述的应用，其中，所述第二组分是3,3,3-三氟丙酰胺。
27.如权利要求14所述的应用，其中，所述第二组分是甲酰胺。
28.如权利要求14所述的应用，其中，所述第二组分是丙烯酰胺。
29.如权利要求14所述的应用，其中，R1是C(R3)(R4)(R5)。
30.如权利要求29所述的应用，其中，R4和R5是F。
31.如权利要求29或权利要求30所述的应用，其中，R3是可选地具有取代基的苯基，其中，当所述取代基存在时，所述取代基位于所述苯基的2位，并且是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
32.如权利要求31所述的应用，其中，所述第二组分是2,2-二氟-2-苯基乙酰胺。
33.如权利要求31所述的应用，其中，所述第二组分是2-(三氟甲基)苯基乙酰胺。
34.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，R1选自-NH2和–NHCH3。
35.如权利要求34所述的应用，其中，所述第二组分是尿素。
36.如权利要求34所述的应用，其中，所述第二组分是硫脲。
37.如权利要求34所述的应用，其中，所述第二组分是1,3-二甲基脲。
38.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，A是NH。
39.如权利要求38所述的应用，其中，所述第二组分是胍。
40.如权利要求39所述的应用，其中，所述胍以氢异硫氰酸盐的形式存在。
41.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，R7是H。
42.如权利要求41所述的应用，其中，所述第一组分包含胆碱。
43.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述第一组分包含溴化胆碱。
44.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述第一组分是N,N,N-三甲基甘氨酸。
45.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，R7是
46.如权利要求45所述的应用，其中，Z是O或S。
47.如权利要求45所述的应用，其中，R8是R11。
48.如权利要求47所述的应用，其中，R11具有1个碳原子。
49.如权利要求48所述的应用，其中，所述第一组分包含乙酰胆碱。
50.如权利要求48所述的应用，其中，所述第一组分包含乙酰基硫代胆碱。
51.如权利要求47所述的应用，其中，R11具有3个碳原子。
52.如权利要求51所述的应用，其中，所述第一组分包含丁酰胆碱。
53.如权利要求45所述的应用，其中，Z是CH2。
54.如权利要求53所述的应用，其中，R8是OH。
55.如权利要求54所述的应用，其中，所述第一组分是肉毒碱。
56.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述第一组分包含抗衡离子，所述抗衡离子是卤素阴离子。
57.如权利要求56所述的应用，其中，所述卤素阴离子选自氯离子、溴离子和碘离子。
58.如权利要求57所述的应用，其中，所述卤素阴离子是氯离子。
59.如权利要求58所述的应用，其中，所述第一组分是氯化胆碱。
60.如权利要求59所述的应用，其中，所述第二组分选自三氟硫代乙酰胺、3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-二氟-2-苯基乙酰胺、硫脲和尿素。
61.如权利要求60所述的应用，其中，所述第二组分是三氟硫代乙酰胺。
62.如权利要求44所述的应用，其中，所述第二组分选自三氟乙酰胺和尿素。
63.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:3～2:1。
64.如权利要求63所述的应用，其中，所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:1.5～1:2.5。
65.如权利要求64所述的应用，其中，所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:2。
66.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述深共熔溶剂的pH是5～7.5。
67.如权利要求66所述的应用，其中，所述深共熔溶剂的pH是6～7。
68.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述深共熔溶剂还包含选自着色剂、染料、洗涤剂、季铵盐、皂苷、抗微生物剂、干燥剂、探针、内部对照、抗氧化剂、核糖核酸酶抑制剂、缓冲剂、螯合剂、溶解的气体、醇和蛋白沉淀剂中的至少一种添加剂。
69.如权利要求所述68的应用，其中，所述至少一种添加剂选自硫酸锌、氯化锌、EDTA锌、硫酸铵、甲苯磺酸铵和山梨糖醇。
70.如权利要求69所述的应用，其中，所述至少一种添加剂是硫酸锌。
71.如权利要求68所述的应用，其中，所述至少一种添加剂以所述深共熔溶剂的0.01重量％～1重量％的量存在于所述深共熔溶剂中。
72.如权利要求71所述的应用，其中，所述至少一种添加剂以所述深共熔溶剂的0.01重量％～0.2重量％的量存在。
73.如权利要求68所述的应用，其中，所述至少一种添加剂以所述深共熔溶剂的0.5重量％～1.5重量％的量存在于所述深共熔溶剂中。
74.如权利要求73所述的应用，其中，所述至少一种添加剂以所述深共熔溶剂的0.8重量％～1.2重量％的量存在于所述深共熔溶剂中。
75.如权利要求73所述的应用，其中，所述至少一种添加剂是氯化锌。
76.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述深共熔溶剂还包含40体积％～60体积％的量的硅胶。
77.如权利要求69所述的应用，其中，所述深共熔溶剂还包含所述深共熔溶剂的2.5重量％～12.5重量％的量的山梨糖醇。
78.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述深共熔溶剂还包含N-烷基吡咯烷酮，其中所述N-烷基具有1～5个碳原子。
79.如权利要求78所述的应用，其中，其中所述N-烷基吡咯烷酮是N-甲基吡咯烷酮。
80.如权利要求78所述的应用，其中，其中所述N-烷基吡咯烷酮是N-乙基吡咯烷酮。
81.如权利要求78所述的应用，其中，所述N-烷基吡咯烷酮以所述深共熔溶剂的2重量％～20重量％的量存在于所述深共熔溶剂中。
82.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述深共熔溶剂还包含1-苯甲基咪唑。
83.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述深共熔溶剂还包含四甲基脲。
84.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述深共熔溶剂包含所述深共熔溶剂的至多50重量％的量的水。
85.如权利要求84所述的应用，其中，所述深共熔溶剂包含所述深共熔溶剂的5重量％～10重量％的量的水。
86.如权利要求68所述的应用，其中，所述第一组分是氯化胆碱。
87.如权利要求86所述的应用，其中，所述第二组分是尿素。
88.如权利要求80所述的应用，其中，所述第二组分是三氟乙酰胺。
89.如权利要求86所述的应用，其中，所述第一组分与第二组分的摩尔比为0.8:2～1.2:2。
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