CN104968404B - 多步分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从进料混合物回收多不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，包括：(a)在第一色谱分离步骤中，使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述进料混合物，以获得中间产物；以及(b)在第二色谱分离步骤中，使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述中间产物，以获得所述PUFA产物，其中，所述第二有机溶剂与所述第一有机溶剂不同，并且具有与所述第一有机溶剂的极性指数相差介于0.1和2.0之间的极性指数，其中，所述PUFA产物不是α‑亚麻酸(ALA)，γ‑亚麻酸(GLA)，亚油酸，ALA甘油单酯、二酯或三酯，GLA甘油单酯、二酯或三酯，亚麻酸甘油单酯、二酯或三酯，ALA C1～C4烷基酯，GLA C1～C4烷基酯或者亚油酸C1～C4烷基酯，或者它们的混合物。

Description

多步分离方法
技术领域
本发明涉及纯化多不饱和脂肪酸(PUFA)及其衍生物的改进的色谱分离方法。特别是，本发明涉及采用混合溶剂系统的改进的色谱分离方法。
背景技术
脂肪酸(特别是PUFA)及其衍生物是生物学上重要分子的前体，它们在调节诸如血小板聚集、炎症和免疫反应等生物学功能中起着重要作用。因此，PUFA及其衍生物可在治疗上可用于治疗广泛的病理病症，这病理病症包括CNS病症、包括糖尿病性神经病变的神经病变、心血管疾病、包括炎性皮肤疾病的全身免疫系统和炎症病症。
在诸如蔬菜油和海洋油等天然进料中发现PUFA。然而，这些PUFA经常以饱和脂肪酸和许多其他杂质的共混物存在于这些油中。因此，在营养性应用或药物性应用之前，应该对PUFA进行所需纯化。
不幸的是，PUFA极易被破坏。因此，当在氧存在下加热时，它们易于发生异构化反应、过氧化反应和低聚反应。因此，难以通过PUFA产物的分离和纯化来制备纯脂肪酸。即使在真空条件下蒸馏也可能导致不可接受的产物降解。
色谱分离技术为本领域技术人员所众所周知。涉及固定床系统和模拟或真实的移动床系统的色谱分离技术均为本领域技术人员所熟悉。
在常规的固定床色谱系统中，其组分待分离的混合物渗透通过容器。该容器一般是圆柱形的，并且通常被称为柱。该柱含有对流体表现出高渗透率的多孔材料的填料(一般称为固定相)。混合物中各组分的渗透速度取决于该组分的物理性质，从而使得组分选择性地依次从柱中出来。因此，一些组分趋向于牢固地固定到固定相，并且因此将缓慢地渗出，然而其他组分趋向于薄弱地固定并更快速地从柱中出来。已经提出许多不同的固定床色谱系统，并且这些固定床色谱系统均被用于分析目的和工业生产目的。
模拟和真实的移动床色谱是本领域技术人员所熟悉的已知技术。操作原理涉及液体洗脱剂相和固体吸附剂相的逆流移动。该操作允许溶剂的最小用量，从而使得该方法经济可行。已经发现这种分离技术在不同领域中的若干应用，这些领域包括碳氢化合物、工业化学品、油、糖和API。
因此，模拟移动床系统由串联连接在一起的含有吸附剂的若干独立的柱组成。洗脱剂沿第一方向通过这些柱。在系统中原料和洗脱剂的注入点和已分离组分的收集点依靠一系列阀门而周期性地切换。整体效应将模拟含有固体吸附剂的移动床的单个柱的操作，固体吸附剂沿洗脱剂流向的逆流方向移动。因此，如常规的固定床系统中的，模拟移动床系统由含有洗脱剂从中通过的固体吸附剂的固定床的柱组成；但在模拟移动床系统中，该操作达到模拟连续逆流移动床的程度。
参照图1，示出了典型的模拟移动床色谱设备。通过考虑被分成多段(section)(更精确地说，从柱的底部到顶部被分成四个重叠的子区域I、II、III和IV)的含有固定相S的竖直的色谱柱来解释模拟或真实移动床色谱分离方法的概念。借助于泵P在底部的IE处引入洗脱剂。在子区域II和子区域III之间的IA+B处引入待分离的组分A和B的混合物。在子区域I和子区域II之间的SB处收集主要含有B的提取物，并且在子区域III和子区域IV之间的SA处收集主要含有A的提余物。
在模拟移动床系统的情况下，通过引入点和收集点相对于固体相的移动来引起固定相S的模拟向下移动。在真实移动床系统的情况下，通过多个色谱柱相对于引入点和收集点的移动来引起固定相S的模拟向下移动。在图1中，洗脱剂向上流动，并且混合物A+B注入到子区域II和子区域III之间。组分将根据它们与固定相的色谱相互作用(例如在多孔介质上的吸附)而移动。对固定相表现出较强的亲和力的组分B(运动较慢的组分)将会较慢地被洗脱剂夹带并且将会由延迟地跟随着洗脱剂。对固定相表现出较弱的亲和力的组分A(运动较快的组分)将会容易地被洗脱剂夹带。如果恰当地估计和控制参数的合适设置(特别是在每个子区域中的流速)，那么将在子区域III和子区域IV之间收集对固定相展示较弱亲合性的组分A作为提余物，并且在子区域I和子区域II之间收集对固定相展示较强亲合性的组分B作为提取物。
因此，应当理解的是，示意性示出在图1中的常规的移动床系统仅限于二元分级。
在下列若干专利中描述了用于模拟移动床色谱的方法和装置，这些专利包括：US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148和FR-A-2651149，通过引用将这些专利的全文并入本文中。该主题还在Ganetsos和Barker编辑的“Preparative and Production Scale Chromatography”，Marcel Dekker Inc,New York,1993中得以充分论述，通过引用将其全文并入本文中。
真实移动床系统在操作上类似于模拟移动床系统。然而，不是借助于阀门系统来变换进料混合物和洗脱剂的注入点以及被分离的组分的收集点，而是使一系列吸附单元(即，柱)相对于进料点和排出点进行物理移动。再者，操作达到模拟连续的逆流的移动床的程度。
在以下若干专利中描述了真实移动床色谱的方法和装置，这些专利包括：US6979402、US5069883和US4764276，通过引用将这些专利并入本文中。
PUFA产物的纯化特别有挑战性。因此，用于制备PUFA产物的许多合适的原料是极其复杂的混合物，该极其复杂的混合物含有大量在色谱设备中具有非常相似的保留时间的不同组分。因此，非常难以将某些PUFA与这些原料分离。然而，特别是对于药物应用和营养食品应用来讲，需要高纯度的PUFA产物。因此，当需要高纯度PUFA产物时，历史上已经使用了蒸馏。然而，如上所讨论，使用蒸馏作为用于难以处理的PUFA的分离技术具有显著的缺点。
已公布的国际专利申请WO-A-2011/080503，其全部内容通过引用而被并入本文，公开了一种从进料混合物有效地且以非常高纯度的方式回收PUFA产物的SMB分离方法。然而，已经发现，难以在不使用大体积的含水醇溶剂的情况下从进料混合物有效地移出C18脂肪酸，特别是α-亚麻酸(ALA)和/或γ-亚麻酸(GLA)。因为许多药物和食用油的规格需要这些脂肪酸的含量低，所以有效地除去C18脂肪酸是有利的。例如，在日本使用的某些油规格需要小于1wt％的ALA含量。
于是，需要一种可以从进料混合物高效地回收PUFA产物，同时最小化所得产物中存在的C18脂肪酸(例如ALA和/或GLA)的色谱分离方法。
发明内容
现已惊奇地发现，可以通过使用混合溶剂体系由可商购的原料(诸如鱼油)有效地纯化具有低含量的C18脂肪酸的PUFA产物(例如ALA和/或GLA)。
因此，本发明提供了一种从进料混合物回收多不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，包括：
(a)在第一色谱分离步骤中，使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述进料混合物，以获得中间产物；以及
(b)在第二色谱分离步骤中，使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述中间产物，以获得所述PUFA产物，
其中，所述第二有机溶剂与所述第一有机溶剂不同，并且具有与所述第一有机溶剂的极性指数相差介于0.1和2.0之间的极性指数，
其中，所述PUFA产物不是α-亚麻酸(ALA)，γ-亚麻酸(GLA)，亚油酸，ALA甘油单酯、二酯或三酯，GLA甘油单酯、二酯或三酯，亚油酸甘油单酯、二酯或三酯，ALA C1～C4烷基酯、GLA C1～C4烷基酯或者亚油酸C1～C4烷基酯，或者它们的混合物。
还提供了一种由本发明的方法获得的PUFA产物。
还提供了一种包含能由本发明的方法获得的PUFA产物的组合物。
附图说明
图1示出用于分离二元混合物的模拟或真实的移动床方法的基本原理。
图2示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
图3示出将DHA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
图4示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
图5示出将DHA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
图6示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
图7示出将DHA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
图8示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
图9示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
图10示出可以执行包括两种模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤的三种方式。
图11示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质(即，极性较大的杂质和极性较小的杂质)分开的色谱分离步骤。
图12示出由使用甲醇作为第一有机溶剂的本发明的方法的第一分离步骤所产生的中间产物的GC-FAMES迹线(trace)。
图13示出由使用乙腈作为第二有机溶剂的本发明的方法的第二分离步骤所产生的PUFA产物的GC-FAMES迹线。
图14示出由使用乙腈作为第一有机溶剂的本发明的方法的第一分离步骤所产生的中间产物的GC-FAMES迹线。
图15示出由使用甲醇作为第二有机溶剂的本发明的方法的第二分离步骤所产生的PUFA产物的GC-FAMES迹线。
图16示出含有55wt％EPA乙酯的常规进料混合物的GC-FAMES迹线。
具体实施方式
在本发明最一般的意义上，本发明提供了一种从进料混合物回收多不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，包括：
(a)在第一色谱分离步骤中，使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述进料混合物，以获得中间产物；以及
(b)在第二色谱分离步骤中，使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述中间产物，以获得所述PUFA产物，
其中，所述第二有机溶剂与所述第一有机溶剂不同，并且具有与所述第一有机溶剂的极性指数相差介于0.1和2.0之间的极性指数。
如本文所用的，术语“PUFA产物”是指包含通常具有营养或药物重要性的一种或多种多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或其衍生物的产物。通常，PUFA产物是单种PUFA或其衍生物。或者，PUFA产物是两种或更多种PUFA或其衍生物的混合物。
术语“多不饱和脂肪酸”(PUFA)是指含有多于一个双键的脂肪酸。这种PUFA为本领域技术人员所周知。如本文所用的，PUFA衍生物是甘油单酯、二酯或三酯，酯，磷脂，酰胺，内酯或盐的形式的PUFA。优选甘油单酯、二酯和三酯以及酯。更优选甘油三酯和酯。进一步更优选酯。酯通常为烷基酯，优选C1～C6的烷基酯，更优选C1～C4的烷基酯。酯的实例包括甲酯和乙酯。最优选乙酯。
通常，PUFA产物是至少一种ω-3或ω-6PUFA或者其衍生物，优选至少一种ω-3PUFA或者其衍生物。
ω-3PUFA的实例包括二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。优选EPA、DPA和DHA。最优选EPA和DHA。
ω-6PUFA的实例包括二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)、二十二碳二烯酸、肾上腺酸以及二十二碳五(ω-6)烯酸。优选ARA和DGLA。
优选地，PUFA产物是EPA、DHA、它们的衍生物或它们的混合物。典型的衍生物包括EPA和DHA的甘油单酯、二酯和三酯；以及EPA和DHA的酯，优选烷基酯，诸如C1～C4烷基酯。
更优选地，PUFA产物是EPA、DHA或它们的衍生物。典型的衍生物包括EPA和DHA的甘油单酯、二酯和三酯；以及EPA和DHA的酯，优选烷基酯，诸如C1～C4烷基酯。
更优选地，PUFA产物是二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、EPA甘油三酯、DHA甘油三酯、EPA乙酯或者DHA乙酯。
特别优选地，PUFA产物是EPA、DHA、EPA乙酯或DHA乙酯。
在一个实施方式中，PUFA产物是EPA和/或EPA乙酯(EE)。
在另一个实施方式中，PUFA产物是DHA和/或DHA乙酯(EE)。
在又一个实施方式中，PUFA产物是EPA和DHA和/或EPA EE和DHA EE的混合物。
在最优选的实施方式中，第二分离步骤中获得的PUFA产物是EPA或EPA衍生物，例如EPA乙酯；并且所获得的纯度大于90wt％，优选大于95wt％，更优选大于97wt％，更加优选大于98wt％，仍更优选大于98.4wt％。优选地，第二步骤中获得的PUFA产物是EPA或EPA衍生物，例如EPA乙酯，并且所获得的纯度介于98wt％和99.5wt％之间。
通常，除了所述PUFA产物，在本发明的色谱分离方法中收集另外的次要PUFA产物。优选地，PUFA产物是EPA或其衍生物，并且另外的次要PUFA产物是DHA或其衍生物。
在本发明的进一步的实施方式中，该方法配置为收集PUFA产物，该PUFA产物是EPA和DHA或它们的衍生物的浓缩混合物。因此，使用含有EPA、DHA、比EPA和DHA极性更大的组分以及比EPA和DHA极性更小的组分的进料混合物。
通常，PUFA产物含有小于1wt％的α-亚麻酸(ALA)、ALA甘油单酯、二酯和三酯以及ALA C1～C4烷基酯杂质。更通常，PUFA产物含有小于1wt％的杂质，该杂质是ALA及其衍生物。典型的ALA衍生物是如上面关于PUFA衍生物所定义的。
通常，PUFA产物含有小于1wt％的γ-亚麻酸(GLA)，GLA甘油单酯、二酯和三酯以及GLA C1～C4烷基酯杂质。更通常，PUFA产物含有小于1wt％的杂质，该杂质是GLA及其衍生物。典型的GLA衍生物如上文关于PUFA衍生物所定义的。
通常，PUFA产物含有小于1wt％的C18脂肪酸杂质，C18脂肪酸甘油单酯、二酯和三酯杂质以及C18脂肪酸烷基酯杂质。更通常，PUFA产物含有小于1wt％的杂质，该杂质是C18脂肪酸及其衍生物。典型的C18脂肪酸衍生物是如上文关于PUFA衍生物所定义的。如本文所使用的，C18脂肪酸是具有直烃链或支烃链的C18脂肪族单羧酸。典型的C18脂肪酸包括：硬脂酸(C18:0)，油酸(C18:1n9)、异油酸(C18:1n7)、亚油酸(C18:2n6)、γ-亚麻酸/GLA(C18:3n6)、α-亚麻酸/ALA(C18:3n3)和十八碳四烯酸/SDA(C18:4n3)。
为了避免疑惑，在这些实施方式中，所有指定杂质的最大量为1wt％。
如上所述，PUFA产物中上述杂质的量通常小于1wt％。优选地，上述杂质的量小于0.5wt％，更优选小于0.25wt％，更加优选小于0.1wt％，仍更优选小于0.05wt％，仍更优选小于0.01wt％，仍更优选小于0.001wt％，仍更优选小于0.0001wt％，仍更优选小于0.00001wt％。
在某些优选的实施方式中，PUFA产物基本上不含有上述杂质。
PUFA产物不是ALA，GLA，亚油酸，ALA甘油单酯、二酯或三酯，GLA甘油单酯、二酯或三酯，亚油酸甘油单酯、二酯或三酯，ALA C1～C4烷基酯，GLA C1～C4烷基酯或者亚油酸C1～C4烷基酯，或者它们的混合物。通常，PUFA产物不是ALA、GLA、亚油酸，或者它们的衍生物或混合物。典型的ALA、GLA和亚油酸衍生物是如上文关于PUFA衍生物所定义的。
通常，PUFA产物不是C18PUFA，C18PUFA甘油单酯、二酯或三酯，或者C18PUFA烷基酯。因而，本发明提供了一种从进料混合物回收多不饱和脂肪酸(PUFA)产物的色谱分离方法，包括：
(a)在第一色谱分离步骤中，使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述进料混合物，以获得中间产物；以及
(b)在第二色谱分离步骤中，使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述中间产物，以获得所述PUFA产物，
其中，所述第二有机溶剂与所述第一有机溶剂不同，并且具有与所述第一有机溶剂的极性指数相差介于0.1和2.0之间的极性指数，
其中，所述PUFA产物不是C18PUFA，C18PUFA甘油单酯、二酯或三酯，或者C18PUFA烷基酯。
更通常，PUFA产物不是C18PUFA或C18PUFA衍生物。典型的C18PUFA包括亚油酸(C18:2n6)、GLA(C18:3n6)和ALA(C18:3n3)。
适用于通过本发明的方法分离的进料混合物可以由天然来源和合成来源获得，该天然来源包括植物油和动物油和脂肪，该合成来源包括从经基因修饰的植物、动物和包括酵母的微生物获得的油。实例包括鱼油、藻油和微藻油以及植物油，例如琉璃苣油，蓝蓟油和月见草油。在一个实施方式中，进料混合物是鱼油。在另一个实施方式中，进料混合物是藻油。当期望的PUFA产物是EPA和/或DHA时，藻油特别合适。当期望的PUFA产物是EPA时，经基因修饰的酵母特别合适。
在特别优选的实施方式中，进料混合物是鱼油或鱼油衍生的原料。已经有利地发现，当使用鱼油或鱼油衍生的原料时，通过本发明的方法能够以大于90％的纯度，优选为大于95％的纯度，更优选为大于97％的纯度，甚至更优选为大于98％的纯度，更加优选为大于98.4％的纯度，例如介于98％和99.5％之间的纯度生产EPA或EPA乙酯PUFA产物。
在通过本发明的方法分离之前，进料混合物可以经历化学处理。例如，它可以经历甘油酯酯交换或甘油酯水解，在某些情况下，接着经历选择性过程，诸如结晶、分子蒸馏、尿素分离、硝酸银或其他金属盐溶液的萃取、碘内酯化反应或超临界流体分离。或者，进料混合物可以直接使用而没有初始处理步骤。
进料混合物通常含有PUFA产物以及至少一种极性较大的组分和至少一种极性较小的组分。极性较小的组分与PUFA产物相比对本发明的方法中使用的吸附剂具有更强的附着力。在操作期间，这种极性较小的组分通常优先于液体洗脱剂相而随着固体吸附剂相移动。极性较大的组分与PUFA产物相比对本发明的方法中使用的吸附剂具有更弱的附着力。在操作期间，这种极性较大的组分通常优先于固体吸附剂相而随着液体洗脱剂相移动。一般而言，极性较大的组分将分离进入提余物流，而极性较小的组分将分离进入提取物流。
进料混合物通常含有PUFA产物和如上定义的至少一种C18脂肪酸杂质。因而，更通常，进料混合物包含PUFA产物和至少一种C18脂肪酸和/或其衍生物。典型的C18脂肪酸衍生物是如上面关于PUFA衍生物所定义的。优选地，进料混合物含有PUFA产物和至少一种C18脂肪酸杂质，该C18脂肪酸杂质选自：硬脂酸(C18:0)，油酸(C18:1n9)、异油酸(C18:1n7)、亚油酸(C18:2n6)、γ-亚麻酸/GLA(C18:3n6)、α-亚麻酸(C18:3n3)和十八碳四烯酸/SDA(C18:4n3)，以及它们的衍生物。
优选地，进料混合物包含(i)所述PUFA产物，和/或所述PUFA产物的甘油单酯、二酯或三酯，和/或所述PUFA产物的C1～C4烷基酯，以及
(ii)ALA和/或ALA的甘油单酯、二酯或三酯，和/或ALA的C1～C4烷基酯。
优选地，进料混合物包含(i)所述PUFA产物，和/或所述PUFA产物的甘油单酯、二酯或三酯，和/或所述PUFA产物的C1～C4烷基酯，以及
(ii)GLA和/或GLA的甘油单酯、二酯或三酯，和/或GLA的C1～C4烷基酯。
更优选地，进料混合物包含(i)所述PUFA产物，和/或所述PUFA产物的甘油单酯、二酯或三酯，和/或所述PUFA产物的C1～C4烷基酯，以及
(ii)ALA和/或GLA，和/或ALA的甘油单酯、二酯或三酯，和/或GLA的甘油单酯、二酯或三酯，和/或ALA的C1～C4烷基酯，和/或GLA的C1～C4烷基酯。
在PUFA产物含有小于1wt％的上文列举的C18脂肪酸杂质的实施方式中，进料混合物通常含有所列举的C18脂肪酸杂质。因而，本发明的特别优点是可以通过本发明的方法将进料混合物中存在的C18脂肪酸杂质的量降低到低水平。例如，当PUFA产物含有小于1wt％的ALA，ALA甘油单酯、二酯和三酯以及ALA C1～C4烷基酯时，进料混合物通常含有ALA，ALA甘油单酯、二酯和三酯和/或ALA C1～C4烷基酯。当PUFA产物含有小于1wt％的GLA，GLA甘油单酯、二酯和三酯以及GLA C1～C4烷基酯时，进料混合物通常含有GLA，GLA甘油单酯、二酯和三酯和/或GLA C1～C4烷基酯。当PUFA产物含有小于1wt％的C18脂肪酸，C18脂肪酸甘油单酯、二酯和三酯以及C18脂肪酸烷基酯时，进料混合物通常含有C18脂肪酸，C18脂肪酸甘油单酯、二酯和三酯和/或C18脂肪酸烷基酯。
极性较大和极性较小的组分的实例包括(1)存在于天然油(例如，海洋油或植物油)中的其他组分，(2)贮藏、精炼和预先浓缩步骤期间形成的副产物，以及(3)来自预先浓缩或纯化步骤期间利用的溶剂或试剂的污染物。
(1)的实例包括其他不需要的PUFA；饱和脂肪酸；固醇，例如胆固醇；维生素；以及环境致污物，诸如多氯联苯(PCB)、多环芳烃(PAH)杀虫剂、有机氯杀虫剂、二噁英和重金属。PCB、PAH、二噁英和有机氯杀虫剂都是高度非极性的组分。
(2)的实例包括来自PUFA产物的同分异构体以及氧化或分解产物，例如，脂肪酸及其衍生物的自氧化聚合产物。
(3)的实例包括尿素，其可以加入用于从进料混合物中去除饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸。
优选地，进料混合物是含PUFA的海洋油(例如，鱼油)，更优选的是包含EPA和/或DHA的海洋油(例如，鱼油)。
通过本发明的方法制备浓缩的EPA(EE)的典型的进料混合物包含50～75％的EPA(EE)、0～10％的DHA(EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。
通过本发明的方法制备浓缩EPA(EE)的优选的进料混合物包括：55％的EPA(EE)、5％的DHA(EE)以及包括其他必要的ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸的其他组分。DHA(EE)比EPA(EE)极性更小。
通过本发明的方法制备浓缩的DHA(EE)的典型的进料混合物包含50～75％的DHA(EE)、0～10％的EPA(EE)以及包括其他必要的ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸的其他组分。
通过本发明的方法制备浓缩DHA(EE)的优选的进料混合物包括：75％的DHA(EE)、7％的EPA(EE)以及包括其他必要的ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸的其他组分。EPA(EE)比DHA(EE)极性更大。
通过本发明的方法制备EPA(EE)和DHA(EE)的浓缩混合物的典型的进料混合物包括：大于33％的EPA(EE)和大于22％的DHA(EE)。
本发明的方法涉及至少两个色谱分离步骤，其中，在每个步骤中使用水和不同有机溶剂的混合物作为洗脱剂。分别使用水与第一有机溶剂和第二有机溶剂的混合物来执行第一分离步骤和第二分离步骤。
通常，洗脱剂均不处于超临界状态。通常，两种洗脱剂都为液体。
第一有机溶剂和第二有机溶剂通常选自醇、醚、酯、酮和腈。优选醇和腈。
醇溶剂为本领域技术人员所众所周知。醇通常为短链醇。醇的化学式通常为ROH，其中，R是直链或支链的C1～C6烷基。该C1～C6烷基优选为未取代的。醇的实例包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。优选甲醇和乙醇。更优选甲醇。
醚溶剂为本领域技术人员所众所周知。醚通常为短链醚。醚通常具有化学式R-O-R’，其中R和R’相同或不同，并且代表直链或支链的C1～C6烷基。该C1～C6烷基优选为未取代的。优选的醚包括二乙醚、二异丙醚和甲基叔丁基醚(MTBE)。
酯溶剂为本领域技术人员所众所周知。酯通常为短链酯。酯通常具有化学式R-(C＝O)-O-R’，其中R和R’相同或不同，并且代表直链或支链的C1～C6烷基。优选的酯包括乙酸甲酯和乙酸乙酯。
酮溶剂为本领域技术人员所众所周知。酮通常为短链酮。酮通常具有化学式R-(C＝O)-R’，其中R和R’相同或不同，并且代表直链或支链的C1～C6烷基。该C1～C6烷基优选为未取代的。优选的酮包括丙酮、甲乙酮和甲基异丁基酮(MIBK)。
腈溶剂为本领域技术人员所众所周知。腈通常为短链腈。腈通常具有化学式R-CN，其中，R代表直链或支链的C1～C6烷基。该C1～C6烷基优选为未取代的。优选的腈包括乙腈。
第二有机溶剂与第一有机溶剂不同。
溶剂的极性指数(P’)是溶剂极性如何的已知计量标准。极性指数数值越大表示溶剂的极性较高。通常通过测量溶剂与各种测试溶质的相互作用的能力来确定极性指数。更通常，溶剂的极性指数(P’)是如Burdick和Jackson的溶剂指南(AlliedSignal,1997)所定义，其全部内容通过引入而并入本文。参考根据它们的不同极性对溶剂进行分级的数值指数，Burdick和Jackson对溶剂进行分级。Burdick和Jackson指数基于溶剂的结构。
按照Burdick和Jackson，各种常用溶剂的极性指数(P’)列于下表。
溶剂 极性指数(P’)
戊烷 0.0
1,1,2-三氯三氟乙烷 0.0
环戊烷 0.1
庚烷 0.1
己烷 0.1
异辛烷 0.1
石油醚 0.1
环己烷 0.2
正丁基氯 1.0
甲苯 2.4
甲基叔丁基醚 2.5
邻二甲苯 2.5
氯苯 2.7
邻二氯苯 2.7
乙醚 2.8
二氯甲烷 3.1
二氯乙烷 3.5
正丁醇 3.9
异丙醇 3.9
乙酸正丁酯 4.0
异丁醇 4.0
甲基异戊酮 4.0
正丙醇 4.0
四氢呋喃 4.0
氯仿 4.1
甲基异丁酮 4.2
乙酸乙酯 4.4
甲基正丙基酮 4.5
甲基乙基酮 4.7
1,4-二噁烷 4.8
丙酮 5.1
甲醇 5.1
乙醇 5.2
吡啶 5.3
2-甲氧基乙醇 5.5
乙腈 5.8
碳酸丙二酯 6.1
N,N-二甲基甲酰胺 6.4
二甲基乙酰胺 6.5
N-甲基吡咯烷酮 6.7
二甲基亚砜 7.2
水 10.2
第二有机溶剂具有与第一有机溶剂的极性指数相差介于0.1和2.0之间的极性指数。因而，当第一有机溶剂的极性指数为P1，第二有机溶剂的极性指数为P2时，|P1-P2|是0.1～2.0。
通常，第二有机溶剂的极性指数与第一有机溶剂的极性指数相差至少0.2，优选至少0.3，更优选至少0.4，更加优选至少0.5，并且还更优选至少0.6。
通常，第二有机溶剂的极性指数与第一有机溶剂的极性指数相差至多1.8，优选至多1.5，更优选至多1.3，更加优选至多1.0，并且仍更优选至多0.8。
优选地，第二有机溶剂的极性指数与第一有机溶剂的极性指数相差介于0.2和1.8之间，更优选介于0.3和1.5之间，更加优选介于0.4和1.3之间，仍更优选介于0.5和1.0之间，并且最优选介于0.6和0.8之间。
通常，第一有机溶剂和第二有机溶剂与水混溶。更通常，第一有机溶剂和第二有机溶剂具有3.9或更大的极性指数。优选地，第一有机溶剂和第二有机溶剂选自四氢呋喃、异丙醇、正丙醇、甲醇、乙醇、乙腈、1,4-二噁烷、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。
通常，第一有机溶剂与水的比例为以体积份计99.9:0.1～75:25，优选为以体积份计99.5:0.5～80:20。如果第一有机溶剂是甲醇，则甲醇与水的比例通常为以体积份计99.9:0.1～85:15，优选为以体积份计99.5:0.5～88:12。如果第一有机溶剂是乙腈，则乙腈与水的比例通常为以体积份计99:1～75:25，优选为以体积份计96:4～80:20。
通常，第二有机溶剂与水的比例为以体积份计99.9:0.1～75:25，优选为以体积份计93:7～85:15。如果第二有机溶剂是甲醇，则甲醇与水的比例通常为以体积份计95:5～85:15，优选为以体积份计93:7～90:10。如果第二有机溶剂是乙腈，则乙腈与水的比例通常为以体积份计90:10～80:20，优选为以体积份计88:12～85:15。
通常，第一有机溶剂和第二有机溶剂中的一个是乙腈。
通常，第一有机溶剂和第二有机溶剂中的一个是甲醇。
优选地，第一有机溶剂和第二有机溶剂选自乙腈和甲醇。因而，优选的是，(i)第一有机溶剂是甲醇而第二有机溶剂是乙腈，或者(ii)第一有机溶剂是乙腈而第二有机溶剂是甲醇。
更优选地，第一有机溶剂是甲醇而所述第二有机溶剂是乙腈，并且，(a)甲醇与水的比例为以体积份计99.9:0.1～85:15，优选为99.5:0.5～88:12，和/或(b)乙腈与水的比例为以体积份计90:10～80:20，优选为以体积份计88:12～85:15。在某些实施方式中，优选的是，(a)甲醇与水的比例为以体积份计91:9～93:7，和/或(b)乙腈与水的比例为体积份计86:14～88:12。
或者，第一有机溶剂是乙腈而所述第二有机溶剂是甲醇，并且，(a)乙腈与水的比例为以体积份计99:1～75:25，优选为以体积份计96:4～80:20，和/或(b)甲醇与水的比例为以体积份计95:5～85:15，优选为以体积份计93:7～90:10。在某些实施方式中，优选的是，(a)乙腈与水的比例为以体积份计86:14～88:12，和/或(b)甲醇与水的比例为体积份计87:13～89:11。
每个色谱分离步骤通常涉及使进料混合物通过一个或多个色谱柱。因而，第一色谱分离步骤通常包括使进料混合物通过一个或多个含有水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂的色谱柱。通常，第二色谱分离步骤包括使中间产物通过一个或多个含有水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂的色谱柱。优选地，第一色谱分离步骤包括使进料混合物通过一个或多个含有水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂的色谱柱，并且第二色谱分离步骤包括使中间产物通过一个或多个含有作为水和第一有机溶剂的混合物洗脱剂的色谱柱。任何已知的色谱柱可以用于所要求保护的方法。
一个或多个色谱柱通常含有吸附剂。色谱分离技术领域中已知的常规吸附剂可以用于本发明的方法。当使用多于一个色谱柱时，每个色谱柱可以含有相同的或不同的吸附剂。通常，当使用多于一个色谱柱时，每个柱含有相同的吸附剂。这种通常使用的材料实例是聚合物珠粒，优选用DVB(二乙烯基苯)成网的聚苯乙烯；和硅胶，优选具有C8或C18烷烃的反相键合的硅胶，特别是C18烷烃的反相键合的硅胶。优选C18键合的反相硅胶。本发明的方法中使用的吸附剂优选是非极性的。
吸附剂固定相材料的形状可以是例如球形或非球形的珠粒，优选为基本上球形的珠粒。这种珠粒的直径通常为5～500微米，优选为10～500微米，更优选为15～500微米，更优选为40～500微米，更优选为100～500微米，更优选为250～500微米，更加优选为250～400微米，最优选为250～350微米。在一些实施方式中，可以使用的珠粒的直径为5～35微米，通常为10～30微米，优选为15～25微米。一些优选的粒径多少比过去的模拟和真实移动床方法中使用的珠粒的粒径更大。使用较大的颗粒能够使较低压力的洗脱剂用于该系统。依次地，这在设备的成本节约、效率和寿命方面上具有优势。已惊奇地发现，大粒径的吸附剂珠粒可以用于本发明的方法(具有它们的相关优势)，而在分辨率上没有任何损失。
使用的柱的尺寸没有特别受限制，并将在一定程度上取决于待纯化的进料混合物的体积。技术人员将能够易于确定适当大小的柱以应用。每个柱的直径通常为10～1000mm，优选为10～500mm，更优选为25～250mm，甚至更优选50～100mm，并最优选为70～80mm。每个柱的长度通常为10～300cm，优选为10～200cm，更优选为25～150cm，甚至更优选为70～110cm，并更优选为80～100cm。
任何已知的色谱设备均可以用于每个分离步骤的目的。每个分离步骤中使用的色谱柱数没有特别限制。
通常，在室温或高于室温的温度下执行本发明的方法。优选地，在高于室温的温度下执行该方法。可以在相同的温度或不同的温度下，优选在相同的温度下执行第一分离步骤和第二分离步骤。
通常，进料混合物通过的色谱柱中的至少一个的温度高于室温。更通常，所使用的所有色谱柱的温度高于室温。
因而，每个色谱分离步骤通常涉及使进料混合物通过一个或多个色谱柱，并且那些色谱柱中的至少一个的温度高于室温。更通常，所使用的所有色谱柱的温度高于室温。
如所将要理解的，如果至少一个色谱柱处于高于室温的温度下，则对分离方法重要的是柱的内部。因而，通常，色谱柱内的洗脱剂和吸附剂可以处于高于室温的温度下。当然，可以通过内部机构(例如通过加热洗脱剂和/或进料混合物)和/或外部机构(例如通过用任何已知常规机构加热色谱柱的外面)在至少一个色谱柱里面获取所需的温度。
通常，通过加热洗脱剂和/或进料混合物来获取高温。这具有内部加热柱的效果。
因此，进料混合物通过的色谱柱中的至少一个的温度也可被测量为洗脱剂的温度。因此，通常，第一色谱分离步骤和/或第二色谱分离步骤中使用的洗脱剂的温度高于室温。
或者，通过加热柱来获取色谱柱中的至少一个的所需温度。使用例如电加热罩、热水套或盘管(coil)或者通过热辐射灯来进行加热。通常，可以加热一个或多个色谱柱的内部和/或外部。
色谱柱中的至少一个的所需温度可以通过加热该柱和/或含水有机溶剂洗脱剂和/或进料混合物来实现。
通常，高于室温的温度大于30℃，优选大于35℃，更优选大于40℃，甚至更优选大于45℃，甚至更优选大于50℃，甚至更优选大于55℃，并且甚至更优选大于57℃。在某些实施方式中，56℃的温度是有利的。
通常，高于室温的温度为至多100℃，优选至多95℃，更优选至多90℃，甚至更优选至多85℃，甚至更优选至多80℃，甚至更优选至多75℃，并且甚至更优选至多70℃。
因此，典型的温度范围为30～100℃、35～95℃、40～90℃、45～85℃、50～80℃、55～75℃或者57～70℃。
优选的温度范围为40～70℃，优选为50～67℃，更优选56～65℃，并且甚至更优选57～63℃。
在某些实施方式中，可以使用单个色谱柱，优选单个固定色谱柱。通常使用已知的固定床色谱设备执行这种方式的分离。这种方式的分离可被称为“固定床”色谱。通常，第一色谱分离步骤和/或第二色谱分离步骤中的至少一个涉及至少一个，例如一个“固定床”色谱步骤。
在其他实施方式中，使用多于一个色谱柱。这可以涉及使进料混合物通过两个或更多个串联或并联布置的可相同或不同的色谱柱。在此实施方式中使用的柱数没有特别限制，但是通常不超过三十个柱。
使用多个色谱柱的一个具体实施方式是模拟或真实的移动床色谱。
模拟和真实的移动床色谱是本领域技术人员所熟知的。任何已知的模拟或真实移动床色谱设备均可以用于本发明的方法的目的，只要设备按照本发明的方法使用。如果依照本发明的方法进行配置，US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148、FR-A-2651149、US6979402、US5069883和US4764276中描述的这些设备都可以使用。也可以采用例如WO-A-2011/080503中公开的SMB方法。
可以使用固定床色谱设备或者如本文所讨论的一个或多个模拟或真实的移动床色谱设备来执行第一分离步骤和第二分离步骤。
通常，第一色谱分离步骤包括将进料混合物引入到固定床色谱设备中，而第二色谱分离步骤包括将中间产物引入到固定床色谱设备中。因而，通常，使用固定床色谱设备执行第一色谱分离步骤，并且使用固定床色谱设备执行第二色谱分离步骤。
或者，第一色谱分离步骤包括将进料混合物引入到固定床设备中，而第二色谱分离步骤包括将中间产物引入到模拟或真实的移动床色谱设备中。因而，通常，使用固定床设备执行第一色谱分离步骤，并且使用模拟或真实的移动床色谱设备执行第二色谱分离步骤。
或者，第一色谱分离步骤包括将进料混合物引入到模拟或真实的移动床色谱设备中，而第二色谱分离步骤包括将中间产物引入到固定床色谱设备中。因而，通常，使用模拟或真实的移动床色谱设备执行第一色谱分离步骤，并且使用固定床色谱设备执行第二色谱分离步骤。
或者，第一色谱分离步骤包括将进料混合物引入到模拟或真实的移动床色谱设备中，而第二色谱分离步骤包括将中间产物引入到模拟或真实的移动床色谱设备中。因而，通常，使用模拟或真实移动的床色谱设备执行第一色谱分离步骤，并且使用模拟或真实移动床色谱设备执行第二色谱分离步骤。
上述第一色谱分离步骤可以由单次色谱分离或者两次或更多次色谱分离组成，其前提是每次分离使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂。
上述第二色谱分离步骤可以由单次色谱分离或者两次或更多次色谱分离组成，其前提是每次分离使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂。
通常，第一色谱分离步骤和/或第二色谱分离步骤能够涉及使用例如图1中描绘的常规设备的单个SMB分离步骤的应用。这种方式的分离可被称为“单次通过”SMB。通常，第一色谱分离步骤和/或第二色谱分离步骤中的至少一个涉及至少一个，例如一个“单次通过”SMB步骤。
或者，第一色谱分离步骤和/或第二色谱分离步骤可以涉及多次SMB分离的应用。
在一个实施方式中，可以按照WO-A-2011/080503和PCT/GB2012/051591(通过引用将其全部并入本文)的描述来执行第一色谱分离步骤和/或第二色谱分离步骤。WO-A-2011/080503和PCT/GB2012/051591中指定的优选方法条件是此实施方式的优选方法条件，并且可以由WO-A-2011/080503和PCT/GB2012/051591而被并入。
WO-A-2011/080503和PCT/GB2012/051591中公开的方法涉及将输入流引入到具有多个连接的色谱柱的模拟或真实移动床色谱设备，这些色谱柱含有含水有机溶剂作为洗脱剂，其中，该设备具有包含至少第一区域和第二区域的多个区域，每个区域具有从所述多个连接的色谱柱中能够收集液体的提取物流和提余物流，并且其中，(a)从第一区域中的柱中收集含有PUFA产物和极性较大的组分的提余物流，并且将其引入到第二区域中的不相邻的柱中，和/或(b)从第二区域中的柱中收集含有PUFA产物和极性较小的组分的提取物流并且将其引入到第一区域中的不相邻的柱中，在每个区域中将所述PUFA产物与输入流的不同组分分离。这种方式的分离可被称为“二次通过”SMB方法。
在此“二次通过”SMB方法中，术语“区域”是指多个连接的色谱柱，该多个连接的色谱柱含有含水有机溶剂作为洗脱剂，并且具有注入流的一个或多个注入点，水和/或有机溶剂、从所述多个连接的色谱柱中能够收集液体的提余物取出流，以及从所述多个连接的色谱柱中能够收集液体的提取物取出流的一个或多个注入点。通常，每个区域仅具有输入流的一个注入点。在一个实施方式中，每个区域仅具有含水有机溶剂洗脱剂的一个注入点。在另一个实施方式中，每个区域具有水和/或有机溶剂的两个或更多个注入点。
在此“二次通过”SMB方法中，术语“输入流”是指在上述SMB方法用于第一色谱分离步骤时的进料混合物，并且是指在上述SMB方法用于第二色谱分离步骤时的中间产物。
在此“二次通过”SMB方法中，术语“含水有机溶剂”在上述SMB方法用于第一色谱分离步骤时是指水和第一有机溶剂的混合物，并且在上述SMB方法用于第二色谱分离步骤时是指水和第二有机溶剂的混合物。
术语“提余物”为本领域技术人员所众所周知。在真实和模拟的移动床色谱的上下文中，它是指与固体吸附剂相相比，随液体洗脱剂相移动更迅速的组分的流。因此，与输入流相比，提余物流通常富含极性较大的组分，并缺乏极性较小的组分。
术语“提取物”为本领域技术人员所众所周知。在真实和模拟的移动床色谱的上下文中，它是指与液体洗脱剂相相比随固体吸附剂相移动更迅速的组分的流。因此，与输入流相比，提取物流通常富含极性较小的组分，并缺乏极性较大的组分。
如本文所使用的，术语“不相邻的”是指在例如相同设备中，由一个或多个柱，优选3个或更多个柱，更优选5个或更多个柱，最优选约5个柱分开的柱。
“二次通过”SMB方法示于图11中。将包含PUFA产物(B)和极性较大的组分(C)和极性较小的组分(A)的输入流F引入到第一区域中的柱5的顶部。含水有机溶剂解吸剂引入到第一区域中的柱1的顶部。在第一区域中，从柱2的底部移出极性较小的组分(A)作为提取物流E1。从柱7的底部移出PUFA产物(B)和极性较大的组分(C)作为提余物流R1。然后在柱12的顶部将提余物流R1引入到第二区域。含水有机溶剂解吸剂被引入到第二区域中的柱9的顶部。在第二区域中，在柱14的底部处，移出极性较大的组分(C)作为提余物流R2。在柱10的底部处，收集PUFA产物(B)作为提取物流E2。
在此“二次通过”SMB方法中，含水有机溶剂通常被引入到第一区域中的柱1的顶部。
在此“二次通过”SMB方法中，含水有机溶剂通常被引入到第二区域中的柱9的顶部。
在此“二次通过”SMB方法中，输入流通常被引入到第一区域中的柱5的顶部。
在此“二次通过”SMB方法中，通常从第一区域中的柱7的底部收集第一提余物流并且将其引入到第二区域中的柱12的顶部。在引入到柱12之前，第一提余物流可以可选地收集到容器中。
在此“二次通过”SMB方法中，通常从第一区域中的柱2的底部移出第一提取物流。第一提取物流可以可选地收集到容器中，并且部分再次被引入到第一区域中的柱3的顶部。经由来自第一区域的提取物流所收集的液体循环回到第一区域中的速率是将液体从此容器泵送到柱3的顶部的速率。
在此“二次通过”SMB方法中，通常从第二区域中的柱14的底部移出第二提余物流。
在此“二次通过”SMB方法中，通常从第二区域中的柱10的底部收集第二提取物流。此第二提取物流通常含有PUFA产物。第二提取物流可以可选地收集到容器中，并且部分再次被引入到第二区域中的柱11的顶部。经由来自第二区域的提取物流所收集的液体循环回到第二区域中的速率是将液体从此容器泵送到柱11的顶部的速率。
在此“二次通过”SMB方法中，经由来自第一区域的提取物流所收集的液体循环回到第一区域的速率通常比经由来自第二区域的提取物流所收集的液体循环回到第二区域的速率更快。在此“二次通过”SMB方法中，洗脱剂通常在每个区域中基本上相同。
通常，第一色谱分离步骤和第二色谱分离步骤中的至少一个涉及至少一个，例如一个上述“二次通过”SMB方法过程。
在备选的实施方式中，可以按照国际专利申请PCT/GB2012/051596或PCT/GB2012/051597(通过引用将其全部并入本文)的描述来执行第一色谱分离步骤和/或第二色谱分离步骤。这些实施方式涉及：
(i)在具有含有含水有机溶剂作为洗脱剂的多个连接的色谱柱的模拟或真实的移动床色谱设备中，在第一SMB步骤中纯化输入流以获得第一产物；以及
(ii)在使用具有含有含水有机溶剂作为洗脱剂的多个连接的色谱柱的模拟或真实的移动床色谱设备中，在第二SMB步骤中纯化(i)中获得的第一产物以获得第二产物；
其中，
(a)在同一色谱设备上依次进行第一SMB步骤和第二SMB步骤，在第一SMB步骤和第二SMB步骤之间回收第一产物并且在第一SMB步骤和第二SMB步骤之间调节色谱设备中的方法条件，使得在每个SMB步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离；或者
(b)在单独的第一色谱设备和第二色谱设备上分别进行第一SMB步骤和第二SMB步骤，将从第一SMB步骤中所获得的第一产物引入到第二色谱柱中，并且在每个SMB步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。这种方式的分离可被称为“背对背(back-to-back)”SMB。
为了避免疑惑，如果第一色谱分离步骤是上述“背对背”SMB方法，则每个SMB步骤中的洗脱剂是水和第一有机溶剂的混合物。如果第二色谱分离步骤是“背对背”SMB方法，则每个SMB步骤中的洗脱剂是水和第二有机溶剂的混合物。
在此“背对背”SMB方法中，术语“模拟或真实的移动床色谱设备”通常是指多个连接的色谱柱，该多个连接的色谱柱含有含水有机溶剂作为洗脱剂，并且具有注入流的一个或多个注入点，水和/或有机溶剂、从所述多个连接的色谱柱中能够收集液体的提余物取出流，以及从所述多个连接的色谱柱中能够收集液体的提取物取出流的一个或多个注入点。
在此“背对背”SMB方法中使用的色谱设备具有含有含水有机溶剂作为洗脱剂的单列的串联连接的色谱柱。通常，每个色谱柱连接到设备中与该柱相邻的两个柱。因此，来自该列中的给定柱的输出连接到该列中的相邻的柱的输入，相对于该列中的洗脱剂的流动是下游。因此，洗脱剂可以绕着连接的色谱柱的列流动。通常，没有色谱柱连接到该设备中的不相邻的柱。
在此“背对背”SMB方法中，“输入流”是指在上述SMB方法用于第一色谱分离步骤时的进料混合物，并且是指在上述SMB方法用于第二色谱分离步骤时的中间产物。
在此“背对背”SMB方法中，“含水有机溶剂”在上述“背对背”SMB方法用于第一色谱分离步骤时是指水和第一有机溶剂的混合物，并且在上述“背对背”SMB方法用于第二色谱分离步骤时是指水和第二有机溶剂的混合物。第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中使用的有机溶剂相同。第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中使用的有机溶剂与水的比例可以相同或不同。
在此“背对背”SMB方法中，“第二产物”在上述SMB方法用于第一色谱分离步骤时是指中间产物，并且在上述SMB方法用于第二色谱分离步骤时是指PUFA产物。
通常，在此“背对背”SMB方法中，每个设备仅具有输入流的一个注入点。在一个实施方式中，每个设备仅具有含水有机溶剂洗脱剂的一个注入点。在另一个实施方式中，每个设备具有水和/或有机溶剂的两个或更多个注入点。
术语“提余物”为本领域技术人员所众所周知。在真实和模拟的移动床色谱的上下文中，它是指与固体吸附剂相相比随液体洗脱剂相移动更迅速的组分的流。因此，与进料流相比，提余物流通常富含极性较大的组分，并缺乏极性较小的组分。
术语“提取物”为本领域技术人员所众所周知。在真实和模拟的移动床色谱的上下文中，它是指与液体洗脱剂相相比随固体吸附剂相移动更迅速的组分的流。因此，与进料流相比，提取物流通常富含极性较小的组分，并缺乏极性较大的组分。
在此“背对背”SMB方法中，每个设备中使用的柱数没有特别限制。技术人员将能够易于确定适当的柱数以使用。柱数通常为4个或更多个，优选为6个或更多个，更优选为8个或更多个，例如4、5、6、7、8、9或10个柱。在优选的实施方式中，使用5个或6个柱，更优选6个柱。在另一个优选的实施方式中，使用7个或8个柱，更优选8个柱。通常，有不多于25个柱，优选不多于20个柱，更优选不多于15个柱。
在此“背对背”SMB方法中，第一分离步骤和第二分离步骤中使用的色谱设备通常含有相同的柱数。对于某些应用，它们可以具有不同的柱数。
在此“背对背”SMB方法中，第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱通常具有相同的尺寸，但对于某些应用，可以具有不同的尺寸。
柱的流速受限于一系列柱中的最大压力并且取决于柱的尺寸和固体相的粒径。本领域技术人员将能够易于建立每个柱尺寸的所需流速以确保充分解吸。直径较大的柱一般将需要较高的流速以保持穿过柱的线性流动。
在此“背对背”SMB方法中，对于上面所概述的典型的柱大小，通常，洗脱剂流入第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的流速为1～4.5L/min，优选为1.5～2.5L/min。通常，来自第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的提取物的流速为0.1～2.5L/min，优选为0.5～2.25L/min。在来自第一SMB分离步骤的提取物的一部分循环回到第一SMB分离步骤中使用的设备的实施方式中，循环的流速通常为0.7～1.4L/min，优选为约1L/min。通常，来自第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的提余物的流速为0.2～2.5L/min，优选为0.3～2.0L/min。在来自第一SMB分离步骤的提余物的一部分循环回到第一SMB分离步骤中使用的设备的实施方式中，循环的流速通常为0.3～1.0L/min，优选为约0.5L/min。通常，输入流引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的流速为5～150mL/min，优选为10～100mL/min，更优选为20～60mL/min。
在此“背对背”SMB方法中，对于上面所概述的典型的柱大小，通常，洗脱剂流入第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的流速为1～4L/min，优选为1.5～3.5L/min。通常，来自第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的提取物的流速为0.5～2L/min，优选为0.7～1.9L/min。在来自第二SMB分离步骤的提取物的一部分循环回到第二SMB分离步骤中使用的设备的实施方式中，循环的流速通常为0.6～1.4L/min，优选为0.7～1.1L/min，更优选为约0.9L/min。通常，来自第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的提余物的流速为0.5～2.5L/min，优选为0.7～1.8L/min，更优选为约1.4L/min。在来自第二SMB分离步骤的提余物的一部分循环回到第二SMB分离步骤中使用的设备的实施方式中，循环的流速通常为0.3～1.0L/min，优选为约0.5L/min。
如技术人员将理解的，经由各种提取物流和提余物流收集或移出液体的速率是指一段时间中移出的液体体积，通常为L/min。相似地，液体循环回到设备，通常回到设备中的相邻的柱的速率是指一段时间中循环的液体体积，通常为L/min。
在此“背对背”SMB方法中，优选真实的移动床色谱。
步进时间(step time)，即切换输入流和洗脱剂的注入点与所收集的馏分的各种取出点之间的时间，没有特别限制，并且将取决于所使用的柱数和尺寸以及通过设备的流速。技术人员将能够易于确定合适的步进时间以用于本发明的方法。上述步进时间通常为100～1000秒，优选为200～800秒，更优选为250～750秒。在一些实施方式中，合适的步进时间为100～400秒，优选为200～300秒，更有优选为约250秒。在其他实施方式中，合适的步进时间为600～900秒，优选为700～800秒，更优选为约750秒。
“背对背”SMB方法包括第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤。
这两个步骤可以易于在单个色谱设备上进行。因此，在一个实施方式中，(a)在同一色谱设备上依次进行第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤，在第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤之间回收第一产物，并且在第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤之间调节色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。此“背对背”SMB方法的优选实施方式如图10a所示。因此，第一SMB分离步骤(左手侧)在具有8个柱的SMB设备上进行。在第一分离SMB步骤和第二分离SMB步骤之间，第一产物回收到例如容器中，调节色谱设备中的方法条件，使得在每个SMB分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。然后，第二SMB分离步骤(右手侧)在具有8个柱的同一SMB设备上进行。
在实施方式(a)中，调节方法步骤通常是指整体上调节设备中的方法条件，即物理调节设备使得各条件不同。它不是指简单地将第一产物再次引入回到方法条件可能碰巧不同的相同设备的不同部分中。
或者，第一分离色谱设备和第二分离色谱设备可以用于第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤。因此，在另一个实施方式中，(b)第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤分别在单独的第一色谱设备和第二色谱设备上进行，由第一SMB分离步骤获得的第一产物被引入到第二色谱设备中，并且在每个SMB分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。
在实施方式(b)中，两个SMB分离步骤可以依次进行或同时进行。
因此，在两个SMB分离步骤依次进行的情况下的实施方式(b)中，第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤依次分别在单独的第一色谱设备和第二色谱设备上进行，在第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤之间回收第一产物，并且调节第一SMB色谱设备和第二SMB色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。此“背对背”SMB分离方法的优选实施方式如图10b所示。因此，第一SMB分离步骤(左手侧)在具有8个柱，一至八，的SMB设备上进行。在第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤之间，第一产物回收到例如容器中，然后引入到第二分离SMB设备中。第二SMB分离步骤(右手侧)在具有8个柱，九至十六，的第二分离SMB设备上进行。调节两个色谱设备中的方法条件，使得在每个SMB分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。
在两个SMB分离步骤同时进行的情况下的实施方式(b)中，第一分离步骤和第二SMB分离步骤同时在单独的第一色谱设备和第二色谱设备上进行，在第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤之间将第一产物引入到第二分离步骤中使用的色谱设备中，并且调节第一色谱设备和第二色谱设备中的方法条件，使得在每个SMB分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。此“背对背”SMB分离方法的优选实施方式如图10c所示。因此，第一SMB分离步骤(左手侧)在具有8个柱，一至八，的SMB设备上进行。然后，第一SMB分离步骤中获得的第一产物引入到第二SMB分离步骤中使用的第二分离色谱设备中。第一产物可以直接地或例如经由容器而间接地从第一SMB分离步骤送到第二SMB分离步骤。第二SMB分离步骤(右手侧)在具有8个柱，九至十六，的第二分离SMB设备上进行。调节两个色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。
在两个SMB分离步骤同时进行的情况下的实施方式(b)中，洗脱剂单独地在两个单独的色谱设备中循环。因此，除了在第二SMB分离步骤中纯化并引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的第一产物中可作为溶剂存在的洗脱剂，在两个单独的色谱设备之间不共用洗脱剂。在第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中使用的两个单独的色谱设备之间不共用色谱柱。
在此“背对背”SMB方法中，在第一SMB分离步骤中获得第一产物之后，在第二SMB分离步骤中纯化第一产物之前，可以部分地或全部地移出含水有机溶剂洗脱剂。或者，可以在第二SMB分离步骤中纯化第一产物，而不移出任何存在的溶剂。
如上所提及的，在此“背对背”SMB方法中，在每个SMB分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。在实施方式(a)中，在第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤之间调节两个SMB分离步骤中使用的单个SMB设备的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。在实施方式(b)中，设置第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中使用的两个单独的色谱设备中的方法条件，使得在每个分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。
因此，在此“背对背”SMB方法中，改变第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中的方法条件。改变的方法条件可以包括：例如，使用的柱的大小、使用的柱数、柱中使用的填料、SMB设备的步进时间、设备的温度、分离步骤中使用的洗脱剂的水与有机溶剂的比例，或设备中使用的流速，特别是经由提取物流或提余物流所收集的液体的循环速率。
优选地，在此“背对背”SMB方法中，可以改变的方法条件是SMB分离步骤中使用的洗脱剂的水与有机溶剂的比例和/或经由SMB分离步骤中的提取物流或提余物流所收集的液体的循环速率。这两个选项在下面进行更详细的讨论。
在此“背对背”SMB方法中，与输入流相比，第一SMB分离步骤中获得的第一产物通常富含PUFA产物。
在此“背对背”SMB方法中，第一SMB分离步骤中获得的第一产物然后引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备。
在此“背对背”SMB方法中，第一产物通常被收集为来自第一SMB分离方法中使用的色谱设备的提余物流或提取物流。
通常，在此“背对背”SMB方法中，第一产物被收集为第一SMB分离步骤中的提余物流，并且第二产物被收集为第二SMB分离步骤中的提取物流。因此，第一SMB分离步骤中收集的提余物流用作第二SMB分离步骤中的输入流。第一SMB分离步骤中收集的提余物流通常含有第二产物和极性较大的组分。
或者，在此“背对背”SMB方法中，第一产物被收集为第一SMB分离步骤中的提取物流，并且第二产物被收集为第二SMB分离步骤中的提余物流。因此，第一SMB分离步骤中收集的提取物流用作第二SMB分离步骤中的输入流。第一SMB分离步骤中收集的提取物流通常含有第二产物和极性较小的组分。
在此“背对背”SMB方法中，在每个SMB分离步骤中将PUFA产物与输入流的不同组分分离。通常，本发明的方法的每个SMB分离步骤中分离的组分具有不同的极性。
优选地，在此“背对背”SMB方法中，在第一SMB分离步骤中将PUFA产物与输入流的极性较小的组分分离，并且在第二SMB分离步骤中将PUFA产物与输入流的极性较大的组分分离。
通常，在此“背对背”SMB方法中，(a)来自第一SMB分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到第一SMB分离步骤中使用的设备中；和/或
(b)来自第一SMB分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到第一SMB分离步骤中使用的设备中；和/或
(c)来自第二SMB分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到第二SMB分离步骤中使用的设备中；和/或
(d)来自第二SMB分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到第二SMB分离步骤中使用的设备中。
优选地，在此“背对背”SMB方法中，(a)来自第一SMB分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到第一SMB分离步骤中使用的设备中；和
(b)来自第一SMB分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到第一SMB分离步骤中使用的设备中；和
(c)来自第二SMB分离步骤中使用的设备的提取物流的一部分循环回到第二SMB分离步骤中使用的设备中；和
(d)来自第二SMB分离步骤中使用的设备的提余物流的一部分循环回到第二SMB分离步骤中使用的设备中。
在此“背对背”SMB方法中的循环涉及将从第一SMB分离步骤或第二SMB分离步骤中使用的色谱设备取出的提取物流或提余物流的一部分进料回到该SMB步骤中使用的设备中，通常进料到相邻的柱中。此相邻的柱在系统中相对于洗脱剂的流向为下游的相邻的柱。
在此“背对背”SMB方法中，经由第一SMB分离步骤或第二SMB分离步骤中的提取物流或提余物流循环回到该SMB步骤中使用的色谱设备收集液体的速率是经由将该流收集的液体进料回到该SMB步骤中使用的设备中，通常回到相邻的柱中，即在系统中相对于洗脱剂流向的下游柱中的速率。
这可以参照图9看出。第一SMB分离步骤中的提取物流的循环速率是从第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部所收集的提取物进料到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部的速率，即液体流入第一SMB分离步骤中的色谱设备的柱3的顶部的流速。
在此“背对背”SMB方法中，第二SMB分离步骤中的提取物的循环速率是在第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部所收集的提取物进料到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部的速率，即液体流入第二SMB分离步骤中的色谱设备的柱3的顶部的流速。
在此“背对背”SMB方法中，通常通过将该SMB分离步骤中的该流所收集的液体进料到容器中并且然后将一定量的该液体从容器泵回到该SMB分离步骤中使用的设备中，通常到相邻的柱中来完成第一SMB分离步骤和/或第二SMB分离步骤中的提取物流和/或提余物流的循环。在这种情况下，在第一SMB分离步骤和/或第二SMB分离步骤中经由特定的提取物流或提余物流所收集的液体循环速率，通常循环回到相邻的柱中的速率是将液体从容器泵出返回到色谱设备中的速率，通常返回到相邻的柱中的速率。
正如技术人员将理解的是，在此“背对背”SMB方法中，经由洗脱剂流和输入流引入到色谱设备的液体的量与从该设备中移出并循环回到该设备中的液体的量平衡。
因此，在此参照图9的“背对背”SMB方法中，对于提取物流，洗脱剂(解吸剂)流入在第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的流速(D)等于在该SMB分离步骤中经由提取物流所收集的液体积聚到容器中的速率(E1和E2)加上将提取物循环回到该具体SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率(D-E1和D-E2)。
在此“背对背”SMB方法中，对于来自SMB分离步骤的提余物流，将提取物循环回到该具体SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率(D-E1和D-E2)加上原料引入到该具体SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率(F和R1)等于经由该具体SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体积聚到容器中的速率(R1和R2)加上提余物循环回到该具体SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率(D+F-E1-R1和D+R1-E2-R2)。
在此“背对背”SMB方法中，从来自色谱设备的具体提取物流或提余物流所收集的液体积聚到容器中的速率也可以被认为是从该色谱设备移出该提取物流或提余物流的净速率。
通常，在此“背对背”SMB方法中，调节经由第一SMB分离步骤中的提取物流和提余物流所收集的液体循环回到该分离步骤中使用的设备中的速率，使得在每个SMB分离步骤中PUFA产物可以与输入流的不同组分分离。
通常，在此“背对背”SMB方法中，调节经由第二SMB分离步骤中的提取物流和提余物流所收集的液体循环回到该SMB分离步骤中使用的设备中的速率，使得在每个SMB分离步骤中PUFA产物可以与输入流的不同组分分离。
优选地，在此“背对背”SMB方法中，调节经由每个SMB分离步骤中的提取物流和提余物流所收集的液体循环回到该SMB分离步骤中使用的设备中的速率，使得在每个SMB分离步骤中PUFA产物可以与输入流的不同组分分离。
通常，在此“背对背”SMB方法中，经由第一SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由第二SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率，和/或经由第一SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率不同于经由第二SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率。
改变经由第一SMB分离步骤或第二SMB分离步骤中的提取物流和/或提取物流所收集的液体循环回到该具体SMB分离步骤中使用的设备中的速率具有改变存在于提取物流和提余物流中的极性较大的组分和极性较小的组分的量的作用。因此，例如，较低的提取物循环速率导致该SMB分离步骤中的较少的极性较小的组分被携带至提余物流。较高的提取物循环速率导致该SMB分离步骤中的较多的极性较小的组分被携带至提余物流。
这个可以从例如图6中看出。经由第一SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到该SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率(D-E1)将影响在第一SMB分离步骤中的提余物流携带任何组分A的程度(R1)。
通常，在此“背对背”SMB方法中，经由第一SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由第二SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率更快。优选地，从第一SMB分离步骤中收集含有第二产物和极性较大的组分的提余物流并在第二SMB分离步骤中纯化，并且经由第一SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱装置中的速率比经由第二SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱装置中的速率更快。
或者，在此“背对背”SMB方法中，经由第一SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由第二SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率更慢。
通常，在此“背对背”SMB方法中，经由第一SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第一分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由第二SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率更快。优选地，从第一SMB分离步骤中收集含有第二产物和极性较小的组分的提取物流并在第二SMB分离步骤中纯化，并且经由第一SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱装置中的速率比经由第二SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱装置中的速率更快。
或者，在此“背对背”SMB方法中，经由第一SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由第二SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率更慢。
在此“背对背”SMB方法中，当调节循环速率使得在每个SMB分离步骤中PUFA产物可以与输入流的不同组分分离时，每个SMB分离步骤中使用的洗脱剂的水与有机溶剂的比例可以相同或不同。通常，每个分离步骤中使用的洗脱剂的水与有机溶剂的比例如上定义。
通常，在此“背对背”SMB方法中，每个SMB分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱剂具有不同的水与有机溶剂的比例。每个SMB分离步骤中使用的有机溶剂相同。优选地调节每个SMB分离步骤中使用的水与有机溶剂的比例，使得在每个SMB分离步骤中PUFA产物可以与输入流的不同组分分离。
在此“背对背”SMB方法中，每个SMB分离步骤中使用的洗脱剂的洗脱能力通常不同。优选地，第一SMB分离步骤中使用的洗脱剂的洗脱能力大于第二SMB分离步骤中使用的洗脱剂的洗脱能力。在实践中，这通过改变每个SMB分离步骤中使用的水和有机溶剂的相对量来实现。
取决于有机溶剂的选择，它们可以是比水更强的解吸剂。或者，它们可以是比水更弱的解吸剂。例如，乙腈和醇是比水更强的解吸剂。因此，当含水有机溶剂是含水的醇或乙腈时，第一SMB分离步骤中使用的洗脱剂中的醇或乙腈的量大于第二SMB分离步骤中使用的洗脱剂中的醇或乙腈的量。
通常，在此“背对背”SMB方法中，第一SMB分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例比第二SMB分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例更低。因此，第一SMB分离步骤中的洗脱剂比第二SMB分离步骤中的洗脱剂通常含有更多的有机溶剂。
将理解的是，上面所指的每个SMB分离步骤中的水和有机溶剂的比例是全部的色谱设备中的平均比例。
通常，在此“背对背”SMB方法中，通过将水和/或有机溶剂引入到SMB分离步骤中使用的色谱设备中的一个或多个柱中来控制在每个SMB分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例。因此，例如，为了在第一SMB分离步骤中获取比第二SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例更低的水与有机溶剂的比例，通常，与第二SMB分离步骤中相比，水更缓慢地引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
通常，在此“背对背”SMB方法中，在每个SMB分离步骤中使用的色谱设备中的不同的点处引入基本上纯的有机溶剂和基本上纯的水。这两个流的相对流速将确定色谱设备中的整体溶剂曲线(profile)。或者，在此“背对背”SMB方法中，在每个SMB分离步骤中使用的每个色谱设备中的不同的点处可引入不同的有机溶剂和水的混合物。那个将涉及有机溶剂和水的两种或更多种不同的混合物引入到具体SMB分离步骤中使用的色谱设备中，每种有机溶剂/水的混合物具有不同的有机溶剂/水的比例。此“背对背”SMB方法中的有机溶剂/水比例的相对流速和相对浓度将确定该SMB分离步骤中使用的色谱设备中的整体溶剂曲线。
优选地，在此“背对背”SMB方法中，(1)将含有第二产物与极性较大的组分的第一产物收集为第一SMB分离步骤中的提余物流，并且将第二产物收集为第二SMB分离步骤中的提取物流；或者
(2)将含有第二产物和极性较小的组分的第一产物收集为第一SMB分离步骤中的提取物流，并且将第二产物收集为第二SMB分离步骤中的提余物流。
选项(1)适合于从输入流中纯化EPA。
选项(1)示于图2。在第一SMB分离步骤中纯化包含第二产物(B)和极性较大的组分(C)和极性较小的组分(A)的输入流F。在第一SMB分离步骤中，移出极性较小的组分(A)作为提取物流E1。收集第二产物(B)和极性较大的组分(C)作为提余物流R1。提余物流R1是随后在第二SMB分离步骤中纯化的第一产物。在第二SMB分离步骤中，移出极性较大的组分(C)作为提余物流R2。收集第二产物(B)作为提取物流E2。
选项(1)更详细地示于图4。除了示出有机溶剂解吸剂(D)和水(W)引入到每个色谱设备的点，图4和图2相同。有机溶剂解吸剂(D)和水(W)一起组成洗脱剂。(D)相通常是基本上纯的有机溶剂；但在某些实施方式中，它可以是主要包含有机溶剂的有机溶剂/水的混合物。(W)相通常是基本上纯的水；但在某些实施方式中，它可以是主要包含水的有机溶剂/水的混合物，例如98％的水/2％的甲醇的混合物。
选项(1)的进一步图解示于图6。这里没有分离的水注入点，而代替地，在(D)处注入含水有机溶剂解吸剂。
在选项(1)中，通过改变每个色谱设备中的洗脱剂的解吸能力可以辅助分离为提余物流和提取物流。这个可以通过在每个色谱设备中的不同的点处引入洗脱剂的有机溶剂(或富含有机溶剂的)组分和水(或富含水的)组分来实现。因此，通常，相对于系统中洗脱剂的流向，在提取物输出点的上游处引入有机溶剂，并且在提取物输出点和引入原料到该区域的点之间引入水。这个示于图4。
通常，在选项(1)中，第一SMB分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱剂比第二SMB分离步骤中使用的洗脱剂含有更多的有机溶剂，即第一SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例比第二SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例更低。
在选项(1)中，可以通过改变经由第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中的提取物流和提余物流所收集的液体循环回到该SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率来辅助SMB分离。
通常，在选项(1)中，经由第一SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率比经由第二SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率更快。
在选项(1)中，相对于洗脱剂的流向，通常在将输入流引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游处移出第一SMB分离步骤中的第一提余物流。
在选项(1)中，相对于洗脱剂的流向，通常在将输入流引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游处移出第一SMB分离步骤中的第一提取物流。
在选项(1)中，相对于洗脱剂的流向，通常在将第一产物引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游处移出第二SMB分离步骤中的第二提余物流。
在选项(1)中，相对于洗脱剂的流向，通常在将第一产物引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游处收集第二SMB分离步骤中的第二提取物流。
通常，在选项(1)中，相对于洗脱剂的流向，在移出第一提取物流的点的上游处将有机溶剂或含水有机溶剂引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
通常，在选项(1)中，当将水引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中时，相对于洗脱剂的流向，在引入输入流的点的上游处但在移出第一提取物流的点的下游处将水引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
通常，在选项(1)中，相对于洗脱剂的流向，在移出第二提取物流的点的上游处将有机溶剂或含水有机溶剂引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
通常，在选项(1)中，当将水引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中时，相对于洗脱剂的流向，在引入第一产物的点的上游处但在移出第二提取物流的点的下游处将水引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
选项(2)适合于纯化来自输入流的DHA。
选项(2)示于图3。在第一SMB分离步骤中纯化包含第二产物(B)和极性较大的组分(C)和极性较小的组分(A)的输入流F。在第一SMB分离步骤中，移出极性较大的组分(C)作为提余物流R1。收集第二产物(B)和极性较小的组分(A)作为提取物流E1。提取物流E1是随后在第二SMB分离步骤中纯化的第一产物。在第二SMB分离步骤中，移出极性较小的组分(A)作为提取物流E2。收集第二产物(B)作为提余物流R2。
选项(2)更详细地示于图5。除了示出有机溶剂解吸剂(D)和水(W)引入到每个色谱设备的点，图5和图3相同。如上,(D)相通常是基本上纯的有机溶剂；但在某些实施方式中，它可以是主要包含有机溶剂的有机溶剂/水的混合物。(W)相通常是基本上纯的水；但在某些实施方式中，它可以是主要包含水的有机溶剂/水的混合物，例如98％的水/2％的甲醇的混合物。
选项(2)的进一步图解示于图7。这里没有单独的水注入点，而代替地，在(D)处注入含水有机溶剂解吸剂。
通常，在选项(2)中，经由第一SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体再次引入至第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率比经由第二SMB分离步骤中的提余物流所收集的液体再次引入至第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率更快。
通常，在选项(2)中，第一SMB分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱剂比第二SMB分离步骤中使用的洗脱剂含有更少的有机溶剂，即第一SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例比第二SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例更高。
在选项(2)中，相对于洗脱剂的流向，通常在将输入流引入到第一分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游处移出第一SMB分离步骤中的第一提余物流。
在选项(2)中，相对于洗脱剂的流向，通常在将输入流引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游处移出第一SMB分离步骤中的第一提取物流。
在选项(2)中，相对于洗脱剂的流向，通常在将第一产物引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的点的下游处移出第二SMB分离步骤中的第二提余物流。
在选项(2)中，相对于洗脱剂的流向，通常在将第一产物引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的点的上游处收集第二SMB分离步骤中的第二提取物流。
通常，在选项(2)中，相对于洗脱剂的流向，在移出第一提取物流的点的上游处将有机溶剂或含水有机溶剂引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
通常，在选项(2)中，当水引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中时，相对于洗脱剂的流向，在引入输入流的点的上游处但在移出第一提取物流的点的下游处将水引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
通常，在选项(2)中，相对于洗脱剂的流向，在移出第二提取物流的点的上游处将有机溶剂或含水有机溶剂引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
通常，在选项(2)中，当水引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中时，相对于洗脱剂的流向，在引入第一产物的点的上游处但在移出第二提取物流的点的下游处将水引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中。
在此“背对背”SMB方法中，第一SMB分离步骤和第二SMB分离步骤中使用的每个模拟或真实的移动床色谱设备优选由八个色谱柱组成。这些被称为柱1～柱8。在每个设备中，八个柱串联设置，使得柱1的底部连接到柱2的顶部，柱2的底部连接到柱3的顶部…等等…并且柱8的底部连接到柱1顶部。这些连接可以可选地经由保持容器(holding container)，随着循环流进入下一个柱中。洗脱剂通过系统的流向为从柱1到柱2，到柱3，等等。吸附剂通过系统的有效流向为从柱8到柱7，到柱6，等等。
这个示于图8。将包含第二产物(B)和极性较大的组分(C)和极性较小的组分(A)的输入流F引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱5的顶部。有机溶剂解吸剂引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱1的顶部。水引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱4的顶部。在第一SMB分离步骤中，从柱2的底部移出极性较小的组分(A)作为提取物流E1。从柱7的底部移出第二产物(B)和极性较大的组分(C)作为提余物流R1。提余物流R1是第一产物，该第一产物随后在第二SMB分离步骤中，通过在柱5的顶部处引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中进行纯化。有机溶剂解吸剂引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱1的顶部。水引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱4的顶部。在第二SMB分离步骤中，在柱7的底部处，移出极性较大的组分(C)作为提余物流R2。在柱2的底部处，收集第二产物(B)作为提取物流E2。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常将有机溶剂引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱1的顶部。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常将水引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱4的顶部。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常将有机溶剂引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱1的顶部。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常将有机溶剂引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱4的顶部。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常将输入流引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱5的顶部。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常从第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱7的底部收集第一提余物流作为第一产物。然后在第二SMB分离步骤中纯化此第一产物并且通常将其引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱5的顶部。在第二SMB分离步骤中纯化之前，第一提余物流可以可选地收集到容器中。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常从第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部移出第一提取物流。第一提取物流可以可选地收集到容器中并且再次引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常从第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱7的底部移出第二提余物流。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，通常从第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部收集第二提取物流。此第二提取物流通常含有第二产物。第二提取物流可以可选地收集到容器中并且再次引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部。
在图8所示的“背对背”SMB方法中，所使用的洗脱剂通常定义如上。
通常，在此“背对背”SMB方法中，第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的水与有机溶剂的比例比第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的水与有机溶剂的比例更低。因此，第一SMB分离步骤中的洗脱剂比第二SMB分离步骤中使用的洗脱剂通常含有更多的有机溶剂。
在此“背对背”SMB方法中，第一SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例通常为以体积份计0.5:99.5～1.5:98.5。第二SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例通常为以体积份计2:98～6:94。
在此“背对背”SMB方法中，虽然图8的设备如图10a所示配置，但也可以使用图10b和10c所示的配置。
此“背对背”SMB方法也示于图9。将包含第二产物(B)和极性较大的组分(C)和极性较小的组分(A)的输入流F引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱5的顶部。含水有机溶剂解吸剂引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱1的顶部。在第一SMB分离步骤中，从柱2的底部移出极性较小的组分(A)作为提取物流E1。从柱7的底部移出第二产物(B)和极性较大的组分(C)作为提余物流R1。提余物流R1是第一产物，该第一产物在第二SMB分离步骤中通过引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱4的顶部进行纯化。含水有机溶剂解吸剂引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱1的顶部。在第二SMB分离步骤中，在柱7的底部处，移出极性较大的组分(C)作为提余物流R2。在柱2的底部处，收集第二产物(B)作为提取物流E2。
在图9所示的“背对背”SMB方法中，通常将含水有机溶剂引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱1的顶部。
在图9所示的“背对背”SMB方法中，通常将含水有机溶剂引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱9的顶部。
在图9所示的“背对背”SMB方法中，通常将输入流引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的柱5的顶部。
在图9所示的“背对背”SMB方法中，通常从第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱7的底部收集第一提余物流作为第一产物。然后在第二SMB分离步骤中纯化此第一产物并且通常将其引入到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱5的顶部。在第二SMB分离步骤中纯化之前，第一提余物流可以可选地收集到容器中。
在图9所示的“背对背”SMB方法中，通常从第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部移出第一提取物流。第一提取物流可以可选地收集到容器中，并且一部分再次引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部。经由第一SMB分离步骤中的提取物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率是将液体从此容器泵送到柱3的顶部的速率。
在图9所示的“背对背”SMB方法中，通常从第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱7的底部移出第二提余物流。
在图9所示的“背对背”SMB方法中，通常从第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱2的底部收集第二提取物流。此第二提取物流通常含有第二产物。第二提取物流可以可选地收集到容器中，并且一部分再次引入到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的柱3的顶部。经由来自第二SMB分离步骤的提取物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的速率是将液体从此容器泵送到柱3的顶部的速率。
在图9所示的“背对背”SMB方法中，所使用的洗脱剂定义如上。
通常，在此“背对背”SMB方法中，第一SMB分离步骤中使用的色谱设备中的水与有机溶剂的比例比第二SMB分离步骤中使用的色谱设备中的水与有机溶剂的比例更低。因此，第一SMB分离步骤中使用的洗脱剂比第二SMB分离步骤中使用的洗脱剂通常含有更多的有机溶剂。
在此“背对背”SMB方法中，第一SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例通常为以体积份计0.5:99.5～1.5:98.5。第二SMB分离步骤中的水与有机溶剂的比例通常为以体积份计2:98～6:94。
在此“背对背”SMB方法中，经由来自第一SMB分离步骤的提取物流所收集的液体循环回到第一SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率通常比经由来自第二SMB分离步骤的提取物流所收集的液体循环回到第二SMB分离步骤中使用的色谱设备的速率更快。在这种情况下，在每个SMB分离步骤中，含水有机溶剂洗脱剂通常基本上相同。
在此“背对背”SMB方法中，虽然图9的设备如图10a所示配置，但也可以使用图10b和10c所示的配置。
通常，第一色谱分离步骤和第二色谱分离步骤中的至少一个涉及至少一个，例如一个上述“背对背”SMB方法过程。
通常，在每个色谱分离步骤中，将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
通常，在第一分离步骤和/或第二分离步骤中，将PUFA产物与上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种分离。通常，仅在第一分离步骤和/或第二分离步骤中的一个步骤中，将PUFA产物与上述C18脂肪酸杂质中的一种或多种分离。
更通常，在第一分离步骤和/或第二分离步骤中，将PUFA产物与ALA，ALA甘油单酯、二酯和三酯以及ALA C1～C4烷基酯分离。
更通常，在第一分离步骤和/或第二分离步骤中，将PUFA产物与GLA，GLA甘油单酯、二酯和三酯以及GLA C1～C4烷基酯分离。
优选地，在第一分离步骤和/或第二分离步骤中，将PUFA产物与C18脂肪酸，C18脂肪酸甘油单酯、二酯和三酯以及C18脂肪酸烷基酯分离。
通常，中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种；和/或第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种。
更通常，中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的杂质，该杂质选自ALA，ALA的甘油单酯、二酯和三酯以及ALA的C1～C4烷基酯；和/或第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的所述杂质。
更通常，中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的杂质，该杂质选自GLA，GLA的甘油单酯、二酯和三酯以及GLA的C1～C4烷基酯；和/或第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的所述杂质。
优选地，中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的C18脂肪酸或C18脂肪酸衍生物；或第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的C18脂肪酸或C18脂肪酸衍生物。在某些实施方式中，中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的C18脂肪酸或C18脂肪酸衍生物；并且第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的C18脂肪酸或C18脂肪酸衍生物。
较低的浓度通常指的是低出5wt％或更多，更通常10wt％或更多，优选20wt％或更多，更优选30wt％或更多，更加优选40wt％或更多，仍更优选50wt％或更多，仍更优选60wt％或更多，仍更优选70wt％或更多，仍更优选80wt％或更多，仍更优选90wt％或更多的量的浓度。因而，当中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种时，中间产物中C18脂肪酸杂质的浓度比进料混合物中C18脂肪酸杂质的浓度通常低出10wt％或更多，优选低出20wt％或更多等。当第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种时，PUFA产物中C18脂肪酸杂质的浓度比中间产物中C18脂肪酸杂质的浓度通常低出10wt％或更多，优选低出20wt％或更多等。
通常，第一有机溶剂是乙腈，并且中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种。或者，第二有机溶剂是乙腈，并且第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种。
优选地，PUFA产物是EPA乙酯，并且(i)第一有机溶剂是乙腈，并且中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种；或(ii)第二有机溶剂是乙腈，并且第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种。
更优选地，上述PUFA产物是EPA乙酯，并且(i)第一有机溶剂是乙腈，第二有机溶剂是甲醇，并且中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种；或(ii)第一有机溶剂是甲醇，第二有机溶剂是乙腈，并且第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种。
更优选地，PUFA产物是EPA乙酯，并且(i)第一有机溶剂是乙腈，第二有机溶剂是甲醇，并且第一色谱分离步骤包括将进料混合物引入到固定床设备中，而第二色谱分离步骤包括将中间产品引入到模拟或真实的移动床色谱设备中；或者
(ii)第一有机溶剂是甲醇，而第二有机溶剂是乙腈，第一色谱分离步骤包括将进料混合物引入到模拟或真实的移动床色谱设备中，而第二色谱分离步骤包括将中间产物引入到固定床色谱设备中。
更加优选地，上述PUFA产物是EPA乙酯，并且(i)第一有机溶剂是乙腈，第二有机溶剂是甲醇，中间产物具有与进料混合物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种，并且第一色谱分离步骤包括将进料混合物引入到固定床设备中，而第二色谱分离步骤包括将中间产品引入到模拟或真实的移动床色谱设备中；或者
(ii)第一有机溶剂是甲醇，第二有机溶剂是乙腈，第二分离步骤中产生的PUFA产物具有与中间产物相比浓度更低的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种，并且第一色谱分离步骤包括将进料混合物引入到模拟或真实的移动床色谱设备中，而第二色谱分离步骤包括将中间产物引入到固定床色谱设备中。
本发明还提供一种能由本发明的方法获得的如上限定的PUFA产物。
本发明还提供一种包含本发明的PUFA产物的组合物。
这些组合物通常含有作为PUFA产物的EPA或EPA乙酯。
上述PUFA产物在组合物中的含量通常大于90wt％，优选大于95wt％，更优选大于97wt％，更加优选大于98wt％，仍更优选大于98.4wt％。
优选地，该PUFA产物是EPA或EPA乙酯，并且在组合物中的含量大于90wt％，优选大于95wt％，更优选大于97wt％，更加优选大于98wt％，仍更优选大于98.4wt％的量，例如以介于98wt％和99.5wt％之间。
通常，PUFA产物含有小于1wt％的上面公开的C18脂肪酸杂质中的一种或多种。
通常，上述PUFA产物含有小于1wt％的α-亚麻酸(ALA)，ALA甘油单酯、二酯和三酯以及ALA C1～C4烷基酯杂质。更通常，该PUFA产物含有小于1wt％的杂质，该杂质是ALA及其衍生物。典型的ALA衍生物是如上面关于PUFA衍生物所定义的。
通常，PUFA产物含有小于1wt％的γ-亚麻酸(GLA)、GLA甘油单酯、二酯和三酯以及GLA C1～C4烷基酯杂质。更通常，PUFA产物含有小于1wt％的杂质，该杂质是GLA及其衍生物。典型的GLA衍生物是如上面关于PUFA衍生物所定义的。
通常，PUFA产物含有小于1wt％的C18脂肪酸杂质，C18脂肪酸甘油单酯、二酯和三酯以及C18脂肪酸烷基酯杂质。更通常，PUFA产物含有小于1wt％的杂质，该杂质是C18脂肪酸及其衍生物。为了避免疑惑，在此实施方式中，所有这些杂质的最大量为1wt％。典型的C18脂肪酸衍生物是如上面关于PUFA衍生物所定义的。如本文所使用的，C18脂肪酸是具有直烃链或支烃链的C18脂肪族单羧酸。典型的C18脂肪酸包括：硬脂酸(C18:0)，油酸(C18:1n9)、异油酸(C18:1n7)、亚油酸(C18:2n6)、γ-亚麻酸/GLA(C18:3n6)、α-亚麻酸/ALA(C18:3n3)和十八碳四烯酸/SDA(C18:4n3)。
如上所述，PUFA产物中上述杂质的量通常小于1wt％。优选地，上述杂质的量小于0.5wt％，更优选小于0.25wt％，更加优选小于0.1wt％，仍更优选小于0.05wt％，仍更优选小于0.01wt％，仍更优选小于0.001wt％，仍更优选小于0.0001wt％，仍更优选小于0.00001wt％。
在某些优选的实施方式中，PUFA产物基本上不含有上述杂质。
PUFA产物不是ALA，GLA，亚油酸，ALA甘油单酯、二酯或三酯、GLA甘油单酯、二酯或三酯，油酸甘油单酯、二酯或三酯，ALA C1～C4烷基酯，GLA C1～C4烷基酯或者油酸C1～C4烷基酯，或者它们的混合物。通常，PUFA产物不是ALA、GLA、亚油酸，或者它们的衍生物或混合物。典型的ALA、GLA和亚油酸衍生物是如上面关于PUFA衍生物所定义的。
通常，PUFA产物不是C18PUFA，C18PUFA甘油单酯、二酯或三酯，或者C18PUFA烷基酯。更通常，PUFA产物不是C18PUFA或C18PUFA衍生物。典型的C18PUFA包括亚油酸(C18:2n6)、GLA(C18:3n6)和ALA(C18:3n3)。
通常，组合物包含含量介于98wt％和99.5wt％之间的EPA或EPA乙酯作为PUFA产物，该组合物含有小于1wt％的ALA乙酯。
通常，组合物包含含量介于98wt％和99.5wt％之间的EPA或EPA乙酯作为PUFA产物，该组合物含有小于1wt％的GLA乙酯。
优选地，所述组合物包含含量介于98wt％和99.5wt％之间的EPA或EPA乙酯作为PUFA产物，该组合物含有小于1wt％的ALA，ALA甘油单酯、二酯和三酯以及ALA C1～C4烷基酯。
优选地，所述组合物包含含量介于98wt％和99.5wt％之间的EPA或EPA乙酯作为PUFA产物，该组合物含有小于1wt％的GLA，GLA甘油单酯、二酯或三酯以及GLA C1～C4烷基酯。
更优选地，所述组合物包含含量介于98wt％和99.5wt％之间的EPA乙酯作为PUFA产物，该组合物含有小于1wt％的ALA，ALA甘油单酯、二酯或三酯以及ALA C1～C4烷基酯。
更优选地，所述组合物包含含量介于98wt％和99.5wt％之间的EPA乙酯作为PUFA产物，该组合物含有小于1wt％的GLA，GLA甘油单酯、二酯或三酯以及GLA C1～C4烷基酯。
下列实施例解释本发明。
实施例
实施例1
第一色谱分离步骤
通过由串联连接的15个柱(直径：76.29mm，长度：914.40mm)组成的“单次通过”SMB设备，使用将键合C18硅胶(粒径300μm，颗粒孔隙度150埃)用作固定相并将含水甲醇(通常0.5％～10％水)用作洗脱剂的真实移动床色谱系统来使具有图16所示的脂肪酸谱的源自鱼油的原料(55wt％EPA乙酯(EE)，5wt％DHA EE)进行分离。
操作参数和流速如下。
(依照图8的典型流程方案)
步进时间：750s
循环时间：200min
进料混合物的进料速率(F1)：74ml/min
解吸剂的进料速率(D1)：6250ml/min
提取物的积累速率(E1)：1250ml/min
提取物的循环速率(D1-E1)：5000ml/min
提余物的积累速率(R1)：1688ml/min
循环时间：600s
由此方法产生的中间产物具有如图12中所示的GC-FAMES迹线。含有96.5％纯度的EPA EE。主要杂质是以0.9％存在的α-亚麻酸乙酯(ALA-C18:3n3)。ALA以0.65％存在于原料中。因此，可以看出使用甲醇/水作为流动相将ALA与EPA共洗脱。然而，甲醇/水非常有效地洗出了密切相关的组分二十二碳六烯酸乙酯(DHA-C22:6n3)。
第二色谱分离步骤
通过使用乙腈/水流动相混合物的固定床中的制备性HPLC，进一步纯化第一色谱分离步骤中产生的中间产物。使用以重量计的87:13的比例的乙腈/水。使用填充有C18键合硅胶(20μm粒径)的尺寸为600mm×900mm的HPLC柱，进料混合物注入体积为1400ml，且解吸剂的流速为2200ml/min。
通过GC FAMES分析产生的最终的PUFA产物，并且迹线示于图13中。可以看到，已完全除去ALA，并且EPA的纯度提高到98.5％。
可替代的第二色谱分离步骤
通过由串联连接的8个柱(直径：76.29mm，长度：914.40mm)组成的“单通”SMB设备，使用将键合C18硅胶(粒径300μm，孔隙度150埃)用作固定相并将含水乙腈(12％水)用作洗脱剂的真实移动床色谱系统来使第一色谱分离步骤中产生的中间产物分馏。
操作参数和流速如下。
(依照图8的典型流程方案)
步进时间：780s
进料混合物的进料速率(F1)：90ml/min
解吸剂的进料速率(D1)：6500ml/min
提取物的积累速率(E1)：1400ml/min
提取物的循环速率(D1-E1)：5100ml/min
提余物的积累速率(R1)：1690ml/min
循环时间：600s
实施例2
第一色谱分离步骤
使具有如图16中所示的脂肪酸谱的源自鱼油的原料(55wt％EPA EE，5wt％DHAEE)经历使用乙腈/水洗脱剂的制备性HPLC分离。所使用的流动相是87:13的乙腈:水。使用填充有C18键合硅胶(20μm粒径)的尺寸为600mm×900mm的HPLC柱，进料混合物的注入体积为600ml，且解吸剂流速为2200ml/min。通过GC FAME分析产生的中间产物，并且迹线示于图14中。
可以看出，从进料混合物中完全除去了α-亚麻酸乙酯(ALA-C18:3n3)。然而，由于高含量的二十二碳六烯酸乙酯(DHA-C22:6n3)的存在，主要得到纯度水平仅为92.5％的EPAEE。
可替代的第一色谱分离步骤
通过由串联连接的15个柱(直径：76.29mm，长度：914.40mm)组成的“单次通过”SMB设备，使用将键合C18硅胶(粒径300μm，颗粒孔隙度150埃)用作固定相，并将含水乙腈(通常4％～18％水)用作洗脱剂的真实移动床色谱系统来使具有图16所示的脂肪酸谱的源自鱼油的原料(55wt％EPA EE，5wt％DHA EE)分离。
操作参数和流速如下。
(依照图8的典型流程方案)
步进时间：600s
原料(F)的进料速率：105ml/min
解吸剂(D)的进料速率：4800ml/min
提取物速率：1250ml/min
提余物速率：1800ml/min
第二色谱分离步骤
使用将重量比为88:12的甲醇/水作为洗脱剂来使所产生的中间产物经历进一步的纯化。使用填充有C18键合硅胶(20μm粒径)的尺寸为600mm×900mm的HPLC柱，进料混合物的注入体积为1250ml且解吸剂流率为2200ml/min。
所产生的最终产物具有如图15中所示的GC-FAMES迹线。所产生的产物含有纯度为99％的EPA EE。
因而，可以看出，首先进行乙腈/水分离接着进行甲醇/水分离的结果基本上与首先进行甲醇/水分离接着进行乙腈/水分离的结果基本上相同。在每种情况下，结合涉及甲醇/水的步骤和涉及乙腈/水的另一步骤有利于制备具有低含量C18脂肪酸杂质(例如ALA)的纯度为～99％的高纯化的EPA(EE)浓缩物。
可替代的第二色谱分离步骤
通过由串联连接的8个柱(直径：76.29mm，长度：914.40mm)组成的“单次通过”SMB，使用将键合C18硅胶(粒径300μm，颗粒孔隙度150埃)用作固定相并将含水甲醇(7％水)用作洗脱剂的真实移动床色谱系统来使所产生的中间产物分离。
操作参数和流速如下。
(依照图8的典型流程方案)
步进时间：960s
原料(F)的进料速率：45ml/min
解吸剂(D)的进料速率：3975ml/min
提取物速率：3655ml/min
提余物速率：2395ml/min
比较例1
在第一色谱分离步骤和第二色谱分离步骤中使用将键合C18硅胶(粒径300μm，颗粒孔隙度150埃)用作固定相并将含水甲醇用作洗脱剂的真实移动床色谱系统来在第一色谱分离步骤和第二色谱分离步骤中使具有如图16中所示的脂肪酸谱的源自鱼油的原料(55wt％EPA EE，5wt％DHA EE)分离。
在串联连接的一系列的8个柱(直径：76.29mm，长度：914.40mm)上进行第一分离步骤。
操作参数和流速如下。
(依照图8的典型流程方案)
进料混合物的进料速率(F1)：34ml/min
解吸剂的进料速率(D1)：14438ml/min
提取物的积累速率(E1)：9313ml/min
提取物的循环速率(D1-E1)：5125ml/min
提余物的积累速率(R1)：1688ml/min
循环时间：1200s
在串联连接的第二系列的7个柱(直径：76.29mm，长度：914.40mm)上进行第二分离步骤。
第二中间产物的进料速率(F3)：40ml/min
解吸剂的进料速率(D3)：6189ml/min
提取物的积累速率(E3)：1438ml/min
提取物的循环速率(D3-E3)：4750ml/min
提余物的积累速率(R3)：1438ml/min
循环时间：1080s
该比较例制备了具有优势较小的杂质谱的EPA浓缩物。可实现的纯度上限特别受C18:3组分(GLA和ALA)的存在所限制。

Claims (43)

1.一种从进料混合物回收多不饱和脂肪酸产物的色谱分离方法，包括：
(a)在第一色谱分离步骤中，使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述进料混合物，以获得中间产物；以及
(b)在第二色谱分离步骤中，使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化所述中间产物，以获得所述多不饱和脂肪酸产物，
其中，所述第二有机溶剂与所述第一有机溶剂不同，并且具有与所述第一有机溶剂的极性指数相差介于0.1和2.0之间的极性指数，
其中，所述多不饱和脂肪酸产物不是α-亚麻酸，γ-亚麻酸，亚油酸，α-亚麻酸甘油单酯、二酯或三酯，γ-亚麻酸甘油单酯、二酯或三酯，亚麻酸甘油单酯、二酯或三酯，α-亚麻酸C1～C4烷基酯，γ-亚麻酸C1～C4烷基酯或者亚油酸C1～C4烷基酯，或者它们的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物不是C18多不饱和脂肪酸，C18多不饱和脂肪酸甘油单酯、二酯或三酯，或者C18多不饱和脂肪酸烷基酯。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一有机溶剂和所述第二有机溶剂都具有3.9或更大的极性指数。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一有机溶剂和所述第二有机溶剂选自乙腈和甲醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一有机溶剂与水的比例为以体积份计99.9:0.1～75:25。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一有机溶剂与水的比例为以体积份计99.5:0.5～80:20。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二有机溶剂与水的比例为以体积份计99.9:0.1～75:25。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第二有机溶剂与水的比例为以 体积份计90:10～85:15。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一有机溶剂是甲醇而所述第二有机溶剂是乙腈，并且其中，(a)甲醇与水的比例为以体积份计99.9:0.1～85:15。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其中，所述第一有机溶剂是甲醇而所述第二有机溶剂是乙腈，并且其中，(b)乙腈与水的比例为以体积份计90:10～80:20。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，甲醇与水的比例为以体积份计99.9:0.5～88:13。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，乙腈与水的比例为以体积份计88:12～85:15。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一有机溶剂是乙腈而所述第二有机溶剂是甲醇，并且其中，(a)乙腈与水的比例为以体积份计99:1～75:25。
14.根据权利要求1或13所述的方法，其中，所述第一有机溶剂是乙腈而所述第二有机溶剂是甲醇，并且其中，(b)甲醇与水的比例为以体积份计95:5～85:15。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，乙腈与水的比例为以体积份计96:4～80:20。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，甲醇与水的比例为以体积份计93:7～90:10。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物是至少一种ω-3多不饱和脂肪酸或者至少一种ω-3多不饱和脂肪酸衍生物；
其中，所述多不饱和脂肪酸产物不是α-亚麻酸，γ-亚麻酸，亚油酸，α-亚麻酸甘油单酯、二酯或三酯，γ-亚麻酸甘油单酯、二酯或三酯，亚麻酸甘油单酯、二酯或三酯，α-亚麻酸C1～C4烷基酯，γ-亚麻酸C1～C4烷基酯或者亚油酸C1～C4烷基酯，或者它们的混合物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物是二十 碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸甘油三酯、二十二碳六烯酸甘油三酯、二十碳五烯酸乙酯或者二十二碳六烯酸乙酯。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物是二十碳五烯酸或者二十碳五烯酸乙酯。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二分离步骤中获得的多不饱和脂肪酸产物的纯度大于95wt％。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述第二分离步骤中获得的多不饱和脂肪酸产物的纯度大于97wt％。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述第二分离步骤中获得的多不饱和脂肪酸产物的纯度大于98wt％。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述第二分离步骤中获得的多不饱和脂肪酸产物的纯度大于98.4wt％。
24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于1wt％的α-亚麻酸，α-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及α-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.5wt％的α-亚麻酸，α-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及α-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.25wt％的α-亚麻酸，α-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及α-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.1wt％的α-亚麻酸，α-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及α-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
28.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.05wt％的α-亚麻酸，α-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及α-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
29.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.01wt％的α-亚麻酸，α-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及α-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
30.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于1wt％的γ-亚麻酸，γ-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及γ-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.5wt％的γ-亚麻酸，γ-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及γ-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
32.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.25wt％的γ-亚麻酸，γ-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及γ-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
33.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.1wt％的γ-亚麻酸，γ-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及γ-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
34.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.05wt％的γ-亚麻酸，γ-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及γ-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
35.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有小于0.01wt％的γ-亚麻酸，γ-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及γ-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
36.根据权利要求1所述的方法，其中，所述进料混合物包含：
(i)所述多不饱和脂肪酸产物，和/或所述多不饱和脂肪酸产物的甘油单酯、二酯或三酯，和/或所述多不饱和脂肪酸产物的C1～C4烷基酯，以及
(ii)α-亚麻酸和/或α-亚麻酸的甘油单酯、二酯或三酯，和/或α-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
37.根据权利要求1所述的方法，其中，所述进料混合物包含：
(i)所述多不饱和脂肪酸产物，和/或所述多不饱和脂肪酸产物的甘油单酯、 二酯或三酯，和/或所述多不饱和脂肪酸产物的C1～C4烷基酯，以及
(ii)γ-亚麻酸和/或γ-亚麻酸的甘油单酯、二酯或三酯，和/或γ-亚麻酸的C1～C4烷基酯。
38.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述第一色谱分离步骤包括将所述进料混合物引入到固定床色谱设备中，而所述第二色谱分离步骤包括将所述中间产物引入到固定床色谱设备中；
所述第一色谱分离步骤包括将所述进料混合物引入到固定床设备中，而所述第二色谱分离步骤包括将所述中间产物引入到模拟的或真实的移动床色谱设备中；
所述第一色谱分离步骤包括将所述进料混合物引入到模拟的或真实的移动床色谱设备中，而所述第二色谱分离步骤包括将所述中间产物引入到固定床色谱设备中；或者
所述第一色谱分离步骤包括将所述进料混合物引入到模拟的或真实的移动床色谱设备中，而所述第二色谱分离步骤包括将所述中间产物引入到模拟的或真实的移动床色谱设备中。
39.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)所述中间产物具有与所述进料混合物相比浓度更低的杂质，所述杂质选自α-亚麻酸，α-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及α-亚麻酸的C1～C4烷基酯；和/或(b)所述第二分离步骤中产生的多不饱和脂肪酸产物具有与所述中间产物相比浓度更低的所述杂质。
40.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)所述中间产物具有与所述进料混合物相比浓度更低的杂质，所述杂质选自γ-亚麻酸，γ-亚麻酸的甘油单酯、二酯和三酯，以及γ-亚麻酸的C1～C4烷基酯；和/或(b)所述第二分离步骤中产生的多不饱和脂肪酸产物具有与所述中间产物相比浓度更低的所述杂质。
41.一种由根据权利要求1至40中任一项所述的方法能获得的多不饱和脂肪酸产物，其中，所述多不饱和脂肪酸产物含有一定量的C18脂肪酸杂质、C18脂肪酸甘油单酯、二酯或三酯杂质和C18脂肪酸烷基酯杂质，且C18脂肪酸杂质、C18脂肪酸甘油单酯、二酯或三酯杂质和C18脂肪酸烷基酯杂质的量小于 0.25wt％。
42.一种包含由根据权利要求1至40中任一项所述的方法能获得的多不饱和脂肪酸产物的组合物，其中，所述组合物含有一定量的C18脂肪酸杂质、C18脂肪酸甘油单酯、二酯或三酯杂质和C18脂肪酸烷基酯杂质，且C18脂肪酸杂质、C18脂肪酸甘油单酯、二酯或三酯杂质和C18脂肪酸烷基酯杂质的量小于0.25wt％。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中，所述组合物包含作为多不饱和脂肪酸产物的以介于98wt％和99.5wt％之间的量存在的二十碳五烯酸乙酯。
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