JPH03167294A - エイコサペンタエン酸化合物の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、不飽和脂肪酸化合物とカチオン交換きれた１
１ｍ性粘土鉱物との親和力の差によって、高度不飽和脂
肪酸化合物を分離精製する方法に関する。

［従来の技術］ エイコサペンタエンＭ（Ｃ２ｏ，５、以下、ＥＰＡと略
記する）は、一般に魚油等の中に含まれる高度不飽和脂
肪酸の一種であり、プロスタグランジンの前駆体として
重要な物質であることから、従来は栄養素として食品等
に添加した形で利用ざれている。しかし、近年、ＥＰＡ
が閉塞性動脈硬化等の種々の病気に効果があることが判
明するに至り、医薬品としての需要が非常に高まってき
ている。

医薬品としてＥＰＡを用いるためには、ＥＰＡを含む脂
肪酸混合物から少なくとも純度９０％以上のＥＰＡを分
離精製する必要がある。

従来、脂肪酸混合物から高度不飽和脂肪酸化合物を分離
精製する方法は、１）分子蒸留、２）尿素付加、３）液
体クロマトグラフィー、４）超臨界ガス抽出、５）ゼオ
ライト法が知られている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、これら従来の分離精製方法は、いずれの
場合も純度、回収率、コスト面等に解決すべき問題点が
あり、工業的規模で高純度の高度不飽和脂肪酸化合物を
、単純な工程で、安価に得ることは困難である。

また、従来のＥＰＡは魚油等を原料としているため、ア
ラキドン酸やＥＰＡ以外の他の高度不飽和脂肪酸との分
離精製が困難であり、また魚臭さが抜けない等の問題点
を含んでいる。

一方、本発明者らが先に提案した微生物の産生ずる脂肪
酸混合物（ヨーロッパ特許出願番号８７３１１３７２．
４号）は、魚油等に比ヘルとＥＰＡを高濃度で含有して
いるものの精製には多段階を要するといった問題点があ
り、医薬品等に用いるものとしては十分ではない。

本発明者らは、高濃度のＥＰＡ化合物、即ちＥＰＡ及び
／又はそのエステルを効率よく分離精製する方法を鋭意
研究した結果、黴生物が産生ずる脂肪酸混合物から、特
定の粘土鉱物を用いて吸脱着操作を行なうことによって
、高濃度のＥＰＡ化合物が容易に得られることを見出し
本発明を完成した。

［課題を解決するための手段］ すなわち、本発明は、微生物が産生ずる脂肪酸混合物か
ら、膨潤性粘土鉱物の層間イオンがナトリウムイオン以
外の他のカチオンで実質的に置換されてなる粘土鉱物を
用いてＥＰＡ化合物を分離精製する方法である。

以下、本発明の構成について説明する。

本発明の方法は、１）微生物から得られた脂肪酸混合物
を粘土鉱物に接触させ、ＥＰＡ混合物を吸着させる工程
、２）ＥＰＡ混合物を粘土鉱物から説着させる工程から
なる。

本発明で用いる脂肪酸混合物とは、脂肪酸類の混合物、
所望により脂肪酸をエステル化した脂肪酸エステル類の
混合物若しくは脂肪酸類と脂肪酸エステル類との混合物
を意味するものである。一般に脂肪酸類のみの混合物を
用いるよりも脂肪酸エステル類の混合物を用いる法が分
離が容易且つ効率的である。

本発明で使用出来るＥＰＡ産生能を有する微生物は、Ｅ
ＰＡ含有量さえ高いものであれば特に属、種あるいは株
などを限定するものではないが、通常は、シュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アルテロモナス（Ａ
ｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シーワネラ（Ｓｈｅｗａｎ
ｅ　１　１ａ）属またはビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属な
どに分類される、ＥＰＡ産生能を有する微生物を用いる
。これらの微生物については、本発明者らがＥＰＡ生産
用微生物として先に提案したヨーロッパ特許出願番号８
７３１１３７２．４号にその性質について詳細に記載さ
れている。

本発明の実施にあたっては、上記ＥＰＡ産生能を有する
微生物を常法により例えば培地で培養して国体を得、こ
れを遠心分離法などで集め、微生物菌体を得る。この際
の培地としては次の第１表に示す組成の培地を調製した
。

ベブトン　　　　　　　　　　１．０％酵母エキス　　
　　　　　　　０．５％海水　　　　　　　　　　　　
　１ｌ ｐＨ７．０ この微生物により生産された脂肪酸混合物をエステル化
するのに用いられるアルコールとしては、メタノール、
エタノール、プロパノール、ブタノール等の低級アルコ
ール、グリコール、グリセリン等の多価アルコール等が
挙げられる。脂肪酸混合物とアルコールは、触媒の存在
下、通常の方法によりエステル化する。

本発明で用いられるＩＩ　ａｌ性粘土鉱物は、スメクタ
イト属に属する層状ケイ酸塩鉱物であり、モンモリ口ナ
イト、パイデライト、ノントロナイト、サボナイト、及
びヘクトライト等であり、天然又は合成品のいずれでも
よい。具体的には、クニビア、スメクトン（クニミネ工
業）、ビーガム（バンダービルト社）、ラボナイト（ラ
ボルテ社、フッ素四ケイ素雲母（トビーエ業）等が使用
できる。本発明の実施にあたっては、これらの膨潤性粘
土鉱物の一種または二種以上が任意に選ばれる。

吸着剤として、比表面積の大きい程吸着容量が大きく、
溶質分子を強く保持することができるので適している。

このような意味から、合成品であるＩ１潤性粘土鉱物が
適しており、例えば合成サボナイトであるスメクトンや
合成へクトライトであるラボナイトが特に好ましい。

膨潤性粘土鉱物は粉末表面やその眉間で各種極性分子と
特殊な相互作用を有する性質があり、そのため溶質分子
に対する選択性が従来の吸着剤とは異なっている。

本発明における吸着工程は、脂肪酸混合物と粘土鉱物が
接触する方法ならばどんな工程でもよいが、１）有機溶
媒に分散させた粘土鉱物に脂肪酸混合物を接触させる方
法、２）カラムに充填した粘土鉱物に脂肪酸混合物を接
触させる方法等が利用できる。特に高純度のＥＰＡ化合
物を得たい場合にはカラムを用いる方法が好ましい。

本発明に用いる粘土鉱物の形状は、球形、破砕型のどち
らでもよいが、上記２）のカラムに充填して用いる場合
には球形の方が効率・純度の観点から望ましい。

球形の粘土鉱物を得る簡便な方法としては、噴霧乾燥法
によるのがよい。

すなわち、膨潤性粘土鉱物を水性溶媒中に分散してゲル
化し、しかる後に該分散液を噴霧乾燥する方法である。

噴霧乾燥に際しては、ディスクタイプや加圧ノズル式、
２流体ノズル式などの一般的噴霧乾燥法が適用できる。

いずれの場合も噴霧時の入口空気温度は、粘土鉱物が３
００６Ｃ位までは熱的に充分安定であることから、１５
０〜３００°Ｃ程度の広い温度範囲が設定できる。また
、排気温度はノズルからの噴霧流量などによって規定さ
れるが、概ね１００００前後で良い。こうして得られる
粘土鉱物の粒子径は２〜２０ｕｍである。これらは必要
に応じて通常の乾式分級法により分級して利用される。

これらの膨潤性粘土鉱物の眉間には、通常ナトリウムイ
オンやリチウムイオンなどのカチオンが存在し、膨潤性
粘土鉱物全体を電気的に中和しているが、これらのカチ
オンは交換性であり、容易に他のカチオンと置き変わる
ことができる。このカチオン交換容量は膨潤性粘土鉱物
の種類によっても異なるが、粘土鉱物１００ｇ当り大凡
６０〜１５０ミリ当量である。さらに眉間のナトリウム
イオンが他の金属カチオンや有機カチオンに置き変わっ
た粘土鉱物は水膨潤性が無くなり、水と接触してもゲル
とはならず粉末として存在している。膨潤性粘土鉱物そ
のままでは、水に接すると膨潤し吸着剤として適当では
なく、また不飽和脂肪酸の識別能も高くない。本発明に
用いる粘土鉱物は、この粘土鉱物の眉間イオンを他の金
属カチオンに変え、水膨潤性を無くして吸着剤として用
いるものである。

ナトリウム以外の金属カチオンとしては、銀、白金、パ
ラジウム、アルミニウム、鉄、ルテニウム、ニッケル、
コバルトなどが用いられ、好ましくは、銀、白金、パラ
ジウムである。

層間カチオンの交換方法としては、水や有機溶媒に金属
イオンを溶解し、そこに粘土鉱物を分散させ撹拌する。

その後、粘土鉱物を分離し、洗浄し、しかる後に乾燥す
ればよい。

ここで用いる金属イオンの塩としては、これらの塩化物
、硝酸塩、硫酸塩など溶解性のものであればいずれでも
よい。有機溶媒としては、エタノール、メタノール又は
アセトン等の一般的なものが用いられる。

吸着剤製造時の膨潤性粘土鉱物の濃度は、特に制限はな
いが２０重量％以上になると、撹拌が困難となり、イオ
ン交換が行なわれ難くなる。分散液中の金属イオンの量
は、膨潤性粘土鉱物のカチオン交換容量以上であること
が望ましい。イオン交換反応を行なう際の分散液の温度
は、何度でもよく、通常室温で充分である。乾燥温度は
、粘土鉱物の分解温度以下であれば何度でもよい。

さらに、これらの粘土鉱物を焼成して用いても良い。焼
成温度、焼成時間は用いた粘土鉱物や分離しようとする
溶質分子に応じて選択されるが、球状粉末が互いに焼結
を起こす温度以下であることが必要である。層間イオン
が金属イオンの場合、焼成により耐溶剤性は増す。

このようにして得られた粘土鉱物の層間イオンがナトリ
ウム以外の他のカチオンで実質的に置換されていること
は、次のようにして確認できる。

即ち、原子吸光等を用いて元素分析すれば容易に交換し
た金属カチオンの量を確認できる。

吸着・脱着工程に用いられる有機溶剤としては、ｎ−ヘ
ブタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ベンタン
、シクロベンタン、ベンゼン、トルエンなど直鎖または
環状の非極性溶媒やアセトン、メチルケトン、ジエチル
ケトン等のケトン類、メタノール、エタノール、ブタノ
ール等の低級アルコール類、クロロホルム、臭化エチル
等のハロゲン化炭化水素、ジェチルエーテル、イソブロ
ビルエーテル等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル
等の酢酸エステル類などの極性溶媒を広く使用できる。

ＥＰＡ化合物の吸着・脱着工程においては、上記溶媒の
一種または二種以上が用いられる。

吸着・脱着工程に用いられる方法として、１）有機溶媒
に分散させた粘土鉱物に脂肪酸混合物を接触させる方法
の場合、脂肪酸混合物を粘土鉱物と接触させたあと、有
機溶媒を濾過分別し、さらに有機溶媒で数回、分散・撹
拌し不純物を説着する。粘土鉱物に対する有機溶媒の量
は特に制限はなく、有機溶媒の種類、組成によって適宜
変化させればよい。また、２）カラムに充填した粘土鉱
物に脂肪酸混合物を接触きせる場合、脂肪酸混合物と粘
土鉱物を接触させたあと、カラムに有８！溶媒を通液す
ることによって不純物を説着する。粘土鉱物に対する有
機溶媒の通液量は特に＃限はなく、有機溶媒の種類、組
成によって適宜変化させればよい。

用いる粘土鉱物の量は、精製する脂肪酸混合物の重量の
５〜５０倍でよく、純度、収率の面から、好ましくは１
０〜１２倍である。

粘土鉱物と脂肪酸混合物の接触温度は特に制限はなく、
０°Ｃ〜９０°Ｃ程度で良い。

次に、前述の有ｍ溶媒よりも極性の高い有機溶媒を粘土
鉱物に接触させることによってＥＰＡ化合物を説着させ
る。上記ｌ）の場合、先の有機溶媒を濾過分別した後、
より極性の高い有機溶媒を粘土鉱物に加え、撹拌し、濾
過分別し、これを数回繰返してＥＰＡ化合物を脱着させ
る。粘土鉱物に対する有機溶媒の量は特に制限はなく、
有機溶媒の種類、組成によって適宜変化させればよい。

上記２）の場合、より極性の高い有ａｔ溶媒をカラムに
通液することによってＥＰＡ化合物を脱着ざせる。粘土
鉱物に対する有機溶媒の通液量は特に制限はなく、有機
溶媒の種類、組成によって適宜変化させればよい。

最後に、分画した溶液の溶媒を留去することにより、高
純度のＥＰＡ化合物を得ることができる。

精製に使用した粘土鉱物は、不純物を説着するのに用い
た有機溶媒で洗浄することにより、連続的に次のＥＰＡ
化合物の精製に供することができる。

Ｅ実施例］ 次に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれらにより限定されるものではない。なお、実施
例における％ぱ特記しないかぎり重量にもとすくもので
ある。

実施例１ ラボナイトＸＬＧ　（ラボルテ社製）３００ｇをイオン
交換水１０１に撹拌しながら分散させる。

得られたゲルをディスク回転数２　０　＋　０　０　Ｏ
　ｒ　ｐｍ１人口空気温度約２００’　Ｃ，排気温度約
１１０００で噴霧乾燥したところ、２〜２０μｍの球状
粉末が２７０ｇ得られた。

この球状粘土鉱物を乾式分級機ＴＡＲＢＯ　ＣＬＡＳＳ
ＩＦＩ｝ＩＥＲ　ＴＣ−１５８（日清エンジニアリング
社ｆ！！Ａ）を用いて分級し、５〜１０ｕｍの粒径の粉
末６０ｇを得た。

エタノール６Ｌに硝酸銀１０．２ｇを溶解し、上記球状
粘土鉱物６０ｇを分散し、４時間撹拌する。その後濾過
、エタノールで洗浄し、８０’　Ｃで乾燥し、次いで該
粉末６０ｇをバッカ一とボンブを用いて、内径２０ｍｍ
，長さ２５０ｍｍのステンレススチール製力ラムに平衡
スラリー法で充填し、充填力ラムを作成した。

一方、前記、ヨーロッパ特許（出願番号８７３１１３７
２．４号）に記載のＥＰＡ産生黴生物シーワネラ◆ビュ
ートリファシエンス（Ｓ　ｈ　ｅ　ｗａｎｅｌｌａ　　
ｐｕｔｒｅｆａｃｆｅｎｓ）ＳＣＲＣ−２８７４　（Ｆ
ＥＲＭＰ−９１５９）を表１に示した培地にて培養し、
得られた菌体よりクロロホルム／メタノール−２　：　
１　（ｖ／ｖ）にて抽出し、脂質画分を得た。このよう
にして得られた脂質画分は常法により加水分解を行ない
脂肪酸混合物を得た。

本カラムに液体クロマトグラフィー用ボンブを接続し、
移動相としてアセトン／ｎ−ヘキサン＝１．５／９８．
５を毎分２０ｍｌで流入し、常法で上記脂肪酸混合物を
エチルエステル化した微生物由来脂肪酸エチルエステル
混合物を５ｇ注入した後、アセトン／ｎ−ヘキサン＝１
．５／９８．５溶液を５００ｍｌ通液し、飽和脂肪酸エ
ステル等の不純物を脱着させた。

次に、アセトン４００ｍｌを毎分２０ｍｌで通液し、Ｅ
ＰＡエチルエステル１．０５ｇ，純度９６．４％のもの
が得られた。表２に、脂肪酸エチルエステル混合の組成
を、表３に、精製したＥＰＡエチルエステルの組成を示
した。

実施例２ エタノール６Ｌに硝酸銀１０．２ｇを溶解し、ラボナイ
トＸＬＧ６０ｇを分散し、４時間撹拌する。その後濾過
、エタノールで洗浄し、８００Ｃで乾燥した。

本粉体６０ｇをアセトン／ｎ−ヘキサン＝１．５／９８
．５　　１１に分散させ、次いで、実施例ｌで調製した
微生物由来脂肪酸エチルエステル混合物を５ｇ加え、１
時間撹拌した後、濾過し、濾液をロータリーエバボレー
ターを用い、６０’　Ｃで減圧乾燥し、ＥＰＡエチルエ
ステル０．８５ｇ１純度９１．２％のものが得られた。

表４に、精製したＥＰＡエチルエステルの組成を示した
。

（以下余白） 表２ ［発明の効果］ 本発明の方法に従えば、簡便な工程でかつ、脂肪酸混合
物に対し少量の吸着剤で、高純度のＥＰＡ化合物を得る
ことができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物が産生する脂肪酸混合物から、膨潤性粘土
   鉱物の層間イオンがナトリウムイオン以外の他のカチオ
   ンで実質的に置換されてなる粘土鉱物を用いてエイコサ
   ペンタエン酸化合物を分離精製する方法。