JPS609796B2 - 補酵素qの製造法 - Google Patents

補酵素qの製造法

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JPS609796B2
JPS609796B2 JP4517677A JP4517677A JPS609796B2 JP S609796 B2 JPS609796 B2 JP S609796B2 JP 4517677 A JP4517677 A JP 4517677A JP 4517677 A JP4517677 A JP 4517677A JP S609796 B2 JPS609796 B2 JP S609796B2
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coenzyme
synthetic resin
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acetone
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隆夫 鈴木
英夫 福島
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は還元型補酵素Qを多孔性合成樹脂で処理し、次
いで処理した還元型補酵素Qを酸化してから再び多孔‘
性合成樹脂で処理するとを特徴とする補酵素Qの製造法
に関する。
補酵素Qは生体内では電子伝達系に関与し、各種疾病に
対して優れた薬理効果を示す物質である。
粗製の補酵素Qは合成、発酵あるいは天然物より得られ
るが、高純度の補酵素Qに精製することは、それ自体が
非常に不安定な化合物である上に、各々類似した爽雑物
を含むために極めて困難であった。従釆、補酵素Qの精
製方法としてはシリカゲル、アルミナ、フロリジルなど
の無機物を用いたクロマトグラフィーが知られている。
この無機吸着剤を用いたクロマトグラフィ‐−は類似し
た爽雑物を含む目的物に対しては効果の大きい精製手段
ではあるが、工業的には無機吸着剤は比重が大きいため
に操作上困難な点が多く、また反復使用の点でも問題が
ある。またポリエチレン粉末を吸着剤とする方法も知ら
れていたが、それらは表面積が小さく工業的精製手段と
はなり得なかった。本発明者らは商業的に実施し得る高
純度の補酵素Qを製造する方法につき種々検討した結果
、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は還元型補酵素Qを多孔性合成樹脂を用
いて処理し、次いで処理した還元型補酵素Qを酸化後再
び多孔性合成樹脂を用いて処理する補酵素Qの製造法で
ある。
本発明方法に使用する多孔性合成樹脂としては、樹脂の
単位表面積が大きいほど好適であるが、通常100〆/
タ以上、好ましくは400〆/タ以上のものである。
多孔性合成樹脂の孔径は処理する化合物の分子の大きさ
の約3倍以上、通常50A以上が好適であり、且つ平均
孔径が大きいほど好ましい結果が得られる。本発明に用
いられる多孔性合成樹脂としては例えばスチレンージビ
ニルベンゼン共重合体〔アンバーライトXAD一2(ロ
ーム・アンド・ハース社製)、アンバーライトXAD−
4(ローム・アンド・ハース社製)、ハィボーラスポリ
マーHP(三菱化成工業株式会社製)〕のような非極性
合成樹脂、ポリアクリルェステル〔アンバーライトXA
D−7(ローム・アンド・ハース社製)、アンバーライ
トXAD一8(ローム・アンド・ハース社製)〕、スル
ホキシド〔アンバーライトXAD−9(ローム・アンド
・ハース社製)〕、アミド(Amide)〔アンバーラ
イトXAD−11(ローム8アンド・ハース社製)〕の
ような極性合成樹脂が挙げられる。
本発明方法をさらに詳しく説明すると合成、発酵および
天然物から抽出したものをそのままあるいは必要に応じ
て一般的な還元剤例えば〜ハイドロサルフアィソーダ、
水素化棚素ナトリウム等を添加して常法により還元型補
酵素Qとなしてから、前記多孔性合成樹脂を通常の溶媒
によるクロマトグラフィーの担体として使用し「流出液
中の還元型補酵素Q区分を濃縮する。
次に得られた還元型補酵素Qを常法の穏和な酸化剤で処
理して桶酵素Qにしたものを再び前記多孔性合成樹脂に
よるクロマトグラフィーを行う。本発明方法によって得
られた補酵素Qのうち室温以上の融点を有するものは一
般的な精製手段である結晶化〜例えばアセトソ中で結晶
化して、結晶物にするとができる。なお、本発明に係る
還元型補酵素Qとしては、補酵素Qの還元物であるハイ
ドロキノン体の外、ハイドロキノン核の水酸基がアセチ
ル化されたハイドロキノンQモノエステル、ハイドロキ
ノン‘ジ・ェステル等が挙げられる。還元型補酵素Qが
補酵素Qモノ。
ェステルあるし、はジ・ェステルの場合は、補酵素Qの
単なる還元物の場合と同様に多孔性合成樹脂でクロマト
グラィーを行い、次いでケン化した後酸化工程に付せば
よい。本発明において使用される屍出・溶出溶媒として
はメタノール、エタノール、イソプロ/ぐノ−ル、n−
プロ/ぐノール、アセトン、メチルエチルケトン、イソ
プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、
メチルセロソルブ、酢酸エチル、ベンゼン、トルェン、
ヘキサン、石油ェーナル、石油ベンゼン、ィソベンタン
、四塩化炭素、クロロホルム、ジメチルホルムァミド、
水等の工業的に安価な極性または非犠牲の溶媒を単独で
あるいは種々の割合に混合した混合溶媒として使用する
ことができる。
溶媒を使用するに際し例えばスチレン・ジビニルベンゼ
ン共重合体のような非極‘性多孔性合成樹脂に対しては
メタノールのような極性溶媒を用いて、比較的非極・性
の爽雑物を吸着させ、次にメタノールにアセトンを加え
て、極性を弱めた混合溶媒で展開し、目的物質を溶出さ
せる。またアクリル酸ェステル重合体のような極性多孔
性合成樹脂に対しては逆にへキサンのような非樋性溶媒
により辰開熔出させる。溶出繰作が終了した樹脂は爽雑
物が全く吸着しない溶媒で洗浄すれば再使用が可能であ
る。洗浄溶媒はアセトン〜イソプロピルェーテル、ベン
ゼン等の比較的非極性有機溶媒が効果的である。本発明
において特に好ましい方法としては還元型楠酵素Qおよ
び橘酵素9のいずれかの場合でも多孔性合成樹脂として
非極性合成樹脂を用い、溶出溶媒として水「アルコール
類tケトン類、ジメチルスルホキシド〜N母鼠ージメチ
ルホルムアミドtアセトニトリルなどの極性溶媒を使用
して展開する方法が好適である。
この場合使用される極性溶媒としては一般には炭素数1
〜5のアルコール類「炭素数3〜6のケトン類を基本と
する混合溶媒「例えばメタノールと水「 メタノールと
アセトンしメタノールとnーヘキサン〜アセトンと水な
との組合せが工業的に有利である。またその他の種々の
組合せ〜又は単一溶媒の使用が可能なことは勿論である
。本発明方法は一般に次の順序によって実施される。
塔長径比1.0以上のカラムに水を満たし、自然沈降に
よって目的物の3倍(容積/重量)以上の多孔性合成樹
脂を充填する。
次に精製目的物質が溶出しない溶媒でカラムを置換した
のち、目的物をカラムの上部から流動させる。クロマト
グラフィーは一般の方法と同様に行うが、目的物の結晶
が析出する場合は必要に応じてカラムを加溢してもよい
。流出液は区分して採取し目的物質を含む溶出区分を濃
縮すれば目的物質が得られる。次にアセトン、ベンゼン
、エーテル、ェステル類などの溶出力の大きい溶剤によ
りカラムを洗浄し、吸着物質を除き、溶剤でカラムを置
換することにより再び精製クロマトグラフィーを実施す
ることができる。桶酵素Qのようなィソプレン骨格を有
する化合物は、多孔性合成樹脂との間に適度の親和力が
生じるため選択的に類似構造を有する爽雑物を容易に分
離することができる。
補酵素Q等の化合物と多孔性合成樹脂との親和力はィソ
プレン鎖にのみ由釆するものではなく、分子を構成して
いる置換基の極性、立体構造等によっても左右される。
従って、多孔性合成樹脂を使用することにより、従来の
吸着剤による精製方法則ち吸着剤と分子の活性点同志に
よる吸着、脱離の方式による精製では得られなかった大
きな選択性に加えて、本発明方法ではさらに還元型補酵
素Qと補酵素Qの性質の差を利用の各々の化合物の処理
において類似する 夕構造を有する爽雑物を分離するこ
とができるので高純度の橘酵素Qを得ることができる。
また本発明方法に使用される多孔性合成樹脂は無機剤着
剤、イオン交換樹脂などと異なり化学的に不活性である
ことから、溶出力の大きい溶剤例えばアセJトソなどに
より吸着物を港出させることにより容易にしかも完全に
元の状態に再生されるので工業的にきわめて有利である
。本発明は従来法と比較し次のごとく著しく優れた効果
を有するものである。
即ち分離選択性が極Zめて大きいこと、また多孔性合成
樹脂に対する爽雑物の吸着量が極めて大きく、かつ無機
吸着剤と異なり、吸着点がないため分解が起らず、多孔
性合成樹脂処理操作中における損失が全くなく、回収率
が著しく高いこと、多孔性合成樹脂を繰り返2し使用す
ることができること、無機物の吸着剤と炭化水素類、エ
ーテル類などの疎水性溶媒を用いる従来方法と異なり、
静電気等による火災の危険性の少ないより安全な溶媒の
選択が可能となったこと等経済性および実用性共に満足
し午曇るもので2ある。次に本発明の実施例を示すがこ
れらは精製法の一例であってこれに限定されるものでは
ない。
実施例 1ハィポーラスポリマーHP−20(比表面積
718.03で/夕、紬孔容積1.077の‘/夕、4
0メッシュ、三菱化成工業株式会社製)200の‘をガ
ラス製カラム(ぐ45肌×30仇協)に充填し、アセト
ン:メタノール(3:7)混合液にて逆洗した後静7畳
する。
これにイソデカプレノールと2・3−ジメトキシー35
−メチルーハィドロキノンとを三弗化ホウ素・エーテル
錆体触媒の存在下に縮合して得た203−ジメトキシ−
5−メチル−6−デカプレニルハィドロキノン(還元型
補酵素Q,o)を含む油脂状物30夕(純度48%)を
前記混合液30の‘・で燈搾乳濁4させて充填カラム中
を流動させる。次いで同一混合液で流出させる。流出液
は約10帆とづつ区分し、それぞれの区分液の極微小量
についてシリカゲル薄層クロマトグラフィーを行って2
・3ージメトキシー5ーメチル−6ーデカプレニルハイ
ドロキノンを含む区分を集合させ、溶媒を減圧濃縮によ
って留去する。得られた処理物をィソプロピルェーテル
400の‘に溶解させ、5%水酸化カリウム水20肌を
加え、室温で蝿拝下に30分間空気を導入して酸化する
。次いでイソプロピルェーテル層を水洗し、溶媒を乾燥
してから減圧留去すると補酵素Q,oを含む赤色油状物
が得られる。次に先に使用したと同じハィポーラスポリ
マ−HP−20を充填したカラムをアセトンで洗浄し、
アセトン洗液を除去した後、アセトン:メタノ−ル(1
:1)の混合溶剤で逆洗し、静暦する。
次にカラムを35qoに保温してから前記赤色油状物を
アセトン20の‘に乳濁させて充填カラム中を流動させ
る。同溶液で展開分割させたのち薄層クロマトグラフィ
ーを行って、補酵素ね,oを含む区分を濃縮し、補酵素
Q,。13.9夕(純度96%)を得る。
さらにアセトンで再結晶して補酵素Q,oll.1夕(
純度99.8%m.p.4900)を得た。実施例 2
ハイポーラスポリマーHP−20(40メッシュ、三菱
化成工業株式会社製)200のとを45側?のカラムに
充填しァセトン:メタノール(2:8)混合液で満たし
た。
次にソラネソールと2・3−ジメトキシ−5ーメチルー
ハイドロキノンとを塩化亜鉛触媒の存在下に縮合させて
得た2・3ージメトキシ−5ーメチル−6ーノナプレニ
ルハイドロキノン(還元型補酵素Q9)を含む油脂状物
30夕(純度46%)を前記混合液30の‘に添加して
損拝乳濁させてから充填カラム中を流動させる。次いで
同一混合液で流出させる。次に2・3ージメトキシ−5
ーメチルー6ーノナプレニルハイドロキノンを含む区分
を減圧濃縮して得た処理物をィソプロピルェーテル40
助けこ溶解させ二酸化鉛36夕を添加し4時間燈梓する
。酸化鉛を炉別したのち減圧濃縮すると補酵素Q9を含
む赤色油状物が得られる。次に先に使用したと同じ/・
ィポーラスポリマーHP−20を充填したカラムをアセ
トンで洗浄し、アセトン洗液を除去した後、アセトン:
メタノ−ル(4:6)の混合溶剤で逆洗し、静暦する。
次に前記赤色油状物を同溶剤20の【‘こ乳濁させて充
填カラム中を流動させる。同溶液で展開分割したのち補
酵素Q9を含む区分を濃縮すると補酵素Q13.3夕(
純度97%)が得られる。さらにアセトンで再結晶し桶
酵素QIO.9夕(純度99.9%、m.p.4500
)を得た。実施例 3 PseudomoMs 属 菌 〔 Pseudomo
naSdenitrifica船、NRRL B− 1
665(NoれhemRegonaI Researc
h Laboratory 、Peonrla、11l
ionis61604)〕を培養しし遠心分離により繋
菌して得た湿菌体ペーストを水酸化ナトリウムおよびピ
ロガロールの存在下に、ヘキサン:メタノーZル混合液
で加熱抽出する。
次にへキサン層を5%ハイドロサルフアィトソーダ水で
洗浄しもさらに水洗して葦硝で脱水後減圧濃縮する。次
いで濃縮物のアセトン可溶部を取り「アセトンを留去し
て得た203−ジメトキシー5−メチル−6−デカメプ
レニルハィドロキノン(還元型補酵素Q,o)を含む油
状物30夕(純度55%)を以下実施例1と同様に処理
し補酵素Q,。13.4夕(純度99。
7%m.p。
49℃)を得た。
実施例 4 2ハィポ
ーラスポリマーHP−40(比表面積7047で/外紬
孔容積0.687の上′多ち40メッシュも三菱化成工
業株式会社製)200私をガラス製円柱(ゐ45側×3
0仇肋)に流入し、アセトン;メタノール(3:7)混
合液にて逆洗し、静遣した。
次に充2填カラム上にィソデカプレノールと203ージ
メトキシー5−メチルーハイドロキノン−4ーモノアセ
テートとを三弗化ホウ素・エーテル錯体触媒により縮合
することによって製造した2・3−ジメトキシ−5ーメ
チル−6ーデカプレニルハイドロキノン−4ーモ/アセ
テート(還元型補酵素Q.oのェステル)を含む油脂状
物20夕(純度38%)を前記混合液20の【で欄拝乳
濁させてから仕込む。次いで同一混合液で流出させる。
流出液は約looの上づつ区分し「それぞれの区分液の
極微小量についてシリカゲル薄層クロマトグラフィーを
行って203ージメトキシー5−メチル−6ーデカプレ
ニルハイドロキゾンー4ーモノアセテートを含む区分を
集合させ「溶媒を減圧濃縮によって留去する。得られた
油状物9.0多をィソプロピルェーテル150私に溶解
し、これに10%苛性カリを含むメタノール10の‘を
加え30分間放置後も水30地を加えt室温で燈拝下に
30分間空気を導入して酸化する。次にィソプ。ピルェ
ーテル層を水洗し〜溶媒を減圧蟹去して得られた補酵素
Q.o含有物を再びハイポーラスポリマーHP−20を
200m‘充填したカラムで実施例1と同様に流出展開
し補酵素ね,oを含む区分を集合させ「溶媒を減圧留去
すると補酵素Q,。6.9夕(純度97%)を得る。
さらにアセトンで再結晶して補酵素Q,。5.8夕(純
度99.9%m.p。
49qo)を得た。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 還元型補酵素Qを多孔性合成樹脂で処理し、次いで
    処理した還元型補酵素Qを酸化した後、さらに多孔性合
    成樹脂で処理することを特徴とする補酵素Qの製造法。 2 多孔性合成樹脂が非極性多孔性合成樹脂である場合
    極性溶媒を使用してなる前記特許請求の範囲第1項記載
    の方法。3 多孔性合成樹脂が極性多孔性合成樹脂であ
    る場合非極性溶媒を使用してなる前記特許請求の範囲第
    1項記載の方法。
JP4517677A 1977-04-21 1977-04-21 補酵素qの製造法 Expired JPS609796B2 (ja)

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TWI237019B (en) 2001-07-13 2005-08-01 Kaneka Corp Method of producing reduced coenzyme Q10
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CN100344595C (zh) * 2003-01-10 2007-10-24 株式会社钟化 纯化还原型辅酶q10的方法

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