JPS5851936A - シリカゲルの再生法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシリカゲルの再生法に関し、さらに詳細には補
酵素Ｑの精製に使用されたシリカゲルの再生法に係わる
。補酵素Ｑは、生体内では電子伝達系に関与し、心不全
などの疾病の治療薬として使用されている。この補酵素
Ｑは合成醗酵および天然物からの抽出などの方法により
ことを必要とされている。そのため工業的に優れた精製
方法が要求される。そのための精製方法としては、吸着
剤としてシリカゲルを使用するカラムクロマトグラフィ
が行なわれているが。

カラムクロマトグラフィにおける吸着剤のシリカゲルか
らの補酵素Ｑと不純物との分離性の点から、シリカゲル
の再生が不十分であるので。

再使用することは困難であった。このようなことからシ
リカゲルを使用するカラムクロマトグラフィは作業性の
点およびシリカゲルの使用量の点で工業的な精製方法と
して問題があった。

本発明者らはシリカゲルカラムクロマトグラフィにおい
て、シリカゲルの再生方法を種々検討した結果、吸着、
溶出に次いで溶剤でシリカゲルを洗浄し、さらに再生に
おいてシリカゲルをカラム中で乾燥することによりシリ
カゲルに吸着されていた不純物、水分および洗浄で用い
た溶剤を取り除くことが可能であり、この方法によって
得られた再生シリカゲルを使用したカラムクロマトグラ
フィは補酵素Ｑと不純物との分離がよく、シリカゲルの
反覆使用が可能となり、シリカゲルの使用量をへらすこ
とができる。

また、この再生方法はカラム容器に充填されたま＼のシ
リカゲルに適用されるのでシリカゲルの充填、取り出し
などの作業を省略することができることが判明し１本発
明を完成した。

すなわち９本発明はシリカゲルを吸着剤として補酵素Ｑ
を精製し、吸着、溶出および洗浄したのちのカラム中の
シリカゲルの再生法において、洗浄後のシリカゲルに溶
剤を接触させ（以下、第１回溶剤処理と記す）または接
触させないで、ついでカラム中の溶剤を排出せしめたの
ちシリカゲルを乾燥し、さらに溶剤を接触させる（以下
、第２回溶剤処理と記す）ことを特徴とするシリカゲル
の再生法である。

本発明において精製される出発物質は１合成。

醗酵および天然物からの抽出などの方法ζこより補酵素
を製造する際に混入されたたとえば各種の脂質などの不
純物を含んでいる粗補酵素Ｑである。本発明における補
酵素Ｑは補酵素Ｑ１〜Ｑ　ｎのいずれでもよく、その２
種以上の混合物でもよい。

本発明に使用されるシリカゲルには特に制限はないが、
実用上、たとえばワコーゲル　Ｃ−２００およびワコー
ゲル　Ｃ−３００（両者とも和光紬薬製）、シリカゲル
　アー）（Ａｒｔ）７７３４およびシリカゲル　アート
　９３８５（両者ともメルク社製）ならびにシリカゲル
ＫＴ−１０６３およびシリカゲル　４Ｂ（両者ともフジ
ゲル社製）などの市販品が好適に使用される。

シリカゲルによる吸着、溶出および洗浄は常法によって
行なわれる。溶出処理で使用する展開溶媒は、実用上１
通常はたとえばベンゼンおよびトルエンなどの単一溶剤
またはｎ−へキサン、ｎ−ペンタン、ｎ−へブタン、イ
ソオクタン、シクロヘキサンおよび石油エーテルなどの
ｍ極性溶剤と、クロロホルム、エチルエーテル。

イソプロピルエーテル、ベンゼン、酢酸エチル。

アセトン、メタノールおよびエタノールなどの極性溶剤
とを混合して極性を調節した混合溶剤が用いられる。

展開を行なった後のシリカゲルに吸着されている不純物
を除去するためのシリカゲルの洗浄は、たとえば実用上
、クロロホルム、エチルエーテル、イソプロピルエーテ
ル、ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノールおよ
びエタノールをそれぞれ単独でまたはこれらの混合物を
使用して行なわれる。なお洗浄に使用される溶剤は、溶
出処理に使用された展開溶媒よりも極性が大きくなけれ
ばならない。洗浄に用いる溶剤量は特に制限はなく、シ
リカゲルに吸着され劃 ている不純物を脱離するに必要な溶畏量であればよいが
、一般にはシリカゲル１にｔあたり約２〜ｔｓｇが好ま
しい。

本発明において、第１回溶剤処理は省略することができ
るが、再生シリカゲルの分離能を高めるためには行なう
ことが好祉しい。

本発明の第１回溶剤処理および第１回溶剤処５− 理のそれぞれでつぎの溶剤が使用される。すなわち溶出
での展開溶媒として混合溶剤を使用したとき１こはｎ−
ヘキサン、ｎ−ペンタンＩｎ−ヘフタン、イソオクタン
、シクロへ一？４Ｊ−７．石油エーテルなどの無極性溶
剤が使用される。また展開溶媒としてベンゼンおよびト
ルエンナトの単一溶剤を用いた場合は、その展開溶媒と
同じ溶剤が使用される。

第１回溶剤処理に必要な溶剤量は特に制限はないが、実
用上、一般には、シリカゲル１９あたり約３０１を以下
が好ましい、また第１回溶剤処理は室温乃至常温以上で
かつ溶剤の沸点以下で行なう。またこの温度範囲内で加
温することを妨げない。なお第１回溶剤処理において、
溶媒がシリカゲル粒子の間隙を円滑に流れるように加圧
することが好ましく、実用上２に一以下の加圧とされる
。

洗浄または第１回溶剤処理に引続いてカラム中の溶剤は
カラム外に排出せしめられる。この溶剤を排出せしめる
には重力により自然に排出６− せしめてもよく、また加圧もしくは吸引により強制的に
排出せしめてもよい。排出時間を短縮しおよび／または
乾燥での負荷を軽減するためには強制的に排出せしめる
ことが好ましい。また、この洗浄は不活性ガスの雰囲気
で行なうことが好ましい。実用的には加圧された不活性
ガスで押出すことが好ましく、このときの圧力は通常は
２にシメ以下とされる。

カラム中の溶剤を排出せしめた後に、シリカゲルに付着
した溶剤および水ならびにシリカゲル粒子の間隙に残存
する溶剤および水を冥質的完全に除去するために、シリ
カゲルを乾燥する。

この乾燥条件には特に制限はない、すなわち。

乾燥温度はシリカゲルが変質しない程度の温度であれば
よく、常温乃至室温でもよく、また加温してもよい。実
用上１通常、常温乃至室温〜１００℃程度とされる。ま
た圧力にも特に制限はないが、ノアラム容器が耐えつる
圧力であればよく、減圧、常圧および加圧のいずれでも
よい。

前記のような不活性ガスを通しつ−カラム下部より吸引
しつ＼乾燥することが好ましい。加温下で乾燥するとき
にはカラム容器外から加熱してもよく、または加熱され
た不活性ガスを通してもよい。

第２回溶剤処理で使用される溶剤の種類については前記
したが、第１回溶剤処理で使用された溶剤と同じ溶剤が
使用することが好ましい。

第２回溶剤処理に使用される溶剤の量には特に制限はな
いが、実用上シリカゲルＩ　Ｋｇあたり約２〜１０１が
好ましく、この処理での溶剤の流入は加圧下で行なうこ
とが好ましい。このときの圧力は５にν黴以下が好まし
い−またこのときの温度は室温乃至常温でよい。このよ
うにしφ　てカラム中のシリカゲルからは不純物および
水に回復する。このように本発明で再生されたシリカゲ
ルは、そのま＼吸着に再使用できる。

補酵素Ｑの精製に使用されたシリカゲルは。

従来は再生が不十分で再使用が不可能とされていたが１
本発明によってシリカゲルの吸着分離能を回復させ、再
使用を可能とし、シリカゲルの交換を不要とし、またシ
リカゲルの使用量を節減でき、従ってコスト的１ども、
操作上からも改善され１本発明は工業的に大きな意義が
ある。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例　１ メタノールを含有する合成培地で、メタノール資化性細
菌のプロタミノバクタ−ルバーＮＣＩＢ　　２８７９を
、２８℃で空気を通気し。

かつ機械攪拌しながら培養し、培養終了後、遠心分離機
で集菌し、スプレードライヤーで乾燥して、１８ＫＰの
乾燥菌体を得た。

乾燥菌体　１８Ｋｐに６０．１１のアセトンを加え。

６０℃で１時間攪拌抽出を行ない菌体をＦ別した。この
操作を６回反復し、３回分の抽出液を合わせて減圧濃縮
、乾固し、これに１０００ｄのｎ−ヘキサンを加えて溶
解し、不溶な不純物９− を除去した。これに２８　ｗｔ％のアンモニア水を５％
含むメタノール溶液　２００１１／を加え、２０分間攪
拌したのち静置し、ｎ−ヘキサン層とアンモニア・メタ
ノール層を分離させ、アンモニア・メタノール層を除去
した。その後、ヘキサン層に５　ｖｏ１％の水を含むメ
タノール溶液２００１を加え２０分間攪拌したのち静置
し。

ｎ−へキサン層と水・メタノール層を分離させ水・メタ
ノール層を除去した。ｎ−へキサン層を減圧濃縮および
乾固し、これを１５０ｄのアセトンに溶解し、不溶物を
除去した。この液にメタノール　１５０ゴを加え、−１
０℃のディープフリーザーに入れ一昼夜装置し、結晶を
析出させ、Ｆ別し、補強素Ｑ＋ｏを含む粗結晶（純ンに
懸濁させたワコーゲル　Ｃ−３００を５０ｙ充填し、ｎ
−ヘキサンに溶解した前記の粗結晶　５ｙをカラム上部
にチャージし、アセトン含有率１　ｖｏ１％のアセトン
とｎ−ヘキサンとの１０− 混合物を流速２００　ｌｌ／ｂｒで流下したところ。

流下開始から約２．６時間後に補酵素Ｑ、。を含む流出
液がカラムから流出しはじめた。純補酵３１ｉｉＱ＋ｏ
含有区分として５００１を分取し、これから溶媒を除去
して３．５５ＩＩの純補酵素Ｑ１゜を得た。これは粗結
晶中の補酵素Ｑ、。の約８９％に相当する。

このシリカゲルカラムにアセトン：ｎ−ヘキサンの１＝
１混合溶剤（ｖｏｌ　）を５００ｍ１流して洗浄して、
不純物を取り除いた。その後、ｎ−ヘキサンを５００−
流し室温で第１回溶剤処理し、ついでカラムに０．５に
ν宛の窒素ガスを６０分間通過させてカラム中の溶剤を
排出せしめた。その後カラムを８０℃に加温しながら真
空乾燥を１日間行なった。その後２　Ｋｙ７／ｌ、ｉで
加圧したｎ−へキサンを３［ＩＤＭ！流し、室温で第２
回溶剤処理し、カラムのシリカゲルの再生を行なった。

再生されたシリカゲルが充填されているカラムに、ｎ−
へキサンに溶解した前記の粗結晶２ｙをカラム上部にチ
ャージし、アセトン含有率１　ｖｏｊ？％のアセトンと
ｎ−ヘキサンとの混合液を流速２００　ｌｌ／ｈｒで流
下させた。純補酵素Ｑ　＋ｏ含有区分として５００１を
分取し、これから溶剤を除去して３．５８ｙの純補酵素
Ｑ＋ｏを得た。これは粗結晶中の補＃素Ｑ、。の約９０
％に相当する。

実施例　２ 第１回溶剤処理を省略したほかは、実施例１と同様に行
なった。この再生シリカゲルカラムを再使用したときの
純補酵素Ｑ１゜得量は３．５１ｙであった。これは粗結
晶中の補酵素Ｑ　ｔｏの８８％に相当する。

比較例　１ 吸着溶出後のシリカゲルカラムに７セトン：ヘキサンの
１＝１混合溶剤（ｖｏｌ　）を３００−流して洗浄し、
不純物を取り除いた後にカラムニヘキサン　５００ｄ流
し、カラムの再生ヲ行なったほかは実施例１と同様に行
なった、この再生シリカゲルカラムを再使用したときの
純補酵素Ｑ　１０の得量は２，２Ｉｌであった。これは
粗結晶の補酵素Ｑ、。の５５％に相当する。

実施例　３ インデカレノールと２．６−シメトキシー５−メチルハ
イドロキノンとを反応させて得られた補酵素Ｑ　Ｉｌ＋
を含む反応生成液　５０Ｍに抽剤としてアセトニトリル
　２！　５００ｍ／を添加し。

３０℃で１０分間抽出を行なって抽出液を得。

この抽出液を戸別した。この操作を５回くりかえして得
られた抽出液を合せて減圧霞縮し、乾固して固形物を得
た。この固形物にメチルエチルケト７２００ｍ１を加え
２０℃にて攪拌溶解して濾過し、このＦ液を一１０℃の
フリーザへ入れ２時間放置し、液が一１０℃になったこ
とを確認した後、純度９９．４％の粉末補酵素Ｑ１゜０
．５■を添加し、さらに５日間放置して結晶を析出させ
た。析出した結晶を戸別し、これを１３− 真空乾燥したところ、補酵素Ｑ　１ｏを含む粗結晶（純
度７１．０％）　２０ｙを得た。

径２６　ｍｍ　、長さ３００朋のカラム容器にｎ−ヘフ
タン１こ懸濁させたシリカゲル　７−）７７６４を５０
ｙ充填し、ｎ−へブタンに溶解した前記の粗結晶　５ｙ
をカラム上部にチャージし。

酢酸エチル含有率５　ｖｏ＃％の酢酸エチルとｎ−へブ
タンとの混合液を流速１８０　％＋／／ｂｒで流下した
ところ、流下開始から約２．１時間後に補＃素Ｑ　Ｉｏ
を含む流出液がカラムから流出しはじめた。純補酵素Ｑ
　１ａ金含有分として４００ｉ＋７を分取しにれから溶
剤を除去して３．２７＆の純補酵素Ｑ１゜を得た。これ
は粗結晶中の補酵素Ｑ　１ｏの約９２％に相当する。

このシリカゲルに、酢酸エチルを２００−流して洗浄し
、不純物を取り除いた後に０．５に川の窒素ガスを６０
分間通過させてカラム中の溶剤を排出させた。ついでカ
ラムを８５℃に加温しながら真空乾燥を１日間行なった
。その後２にν爾で加圧したｎ−へブタンを４００　ｔ
ｎｌ流し。

１４− 常温で第２回溶剤処理し、カラムのシリカゲルの再生を
行なった。

再生されたシリカゲルが充填されているカラムに、ｎ−
へブタンに溶解した前記の粗結晶５、！／をカラムの上
部にチャージし、酢酸エチル含有率５　ｖｏ／Ｉ％の酢
酸エチルとｎ−へブタンとの混合液を流速１１３０　Ｒ
ｅ／ｈｒで流下させた。純補酵素Ｑ、。含有区分として
４００　ｍｌを分取し。

これから溶剤を除去して５ｊ５ｙの純補酵素Ｑ　ｌｏを
得た。これは粗結晶中の補酵素Ｑ、、の約９２％に相当
する。

実施例　４ 吸着、溶出後のシリカゲルの酢酸エチルの洗浄に続いて
ヘプタンを３００ｍノ流し第１回溶剤処理したほかは実
施例３と同様に行なった。この再生シリカゲルカラムを
使用したときの純補比較例　２ 吸着、溶出後のシリカゲルカラムに、酢酸エチルを２０
０　ｍｌ流して洗浄し、不純物を取り除いた後、カラム
にｎ−へブタン　１５００ｄ流し、カラムの再生を行な
ったほかは実施例３と同様に行なった。この再生シリカ
ゲルカラムを実施例　５ 酢酸エチルによる洗浄に引きつゾいて、カラム中の溶剤
をカラム下部の弁を開放したま＼１日放置して重力によ
り自然に排出させたほかは。

実施例３と同様にして行なって、実施例６と実質的に同
一な結果を得た。

実施例　６ 第１回溶剤処理において１／のｎ−ヘキサンを使用し、
かつ５０℃で行なったほかは実施例１と同様にして行な
った。３．６５Ｊｌの純補酵素Ｑ　ｌｏが得られた。こ
れは粗結晶中の補酵素Ｑ、。

の９２％に相当する。

なお、前記の実施例、比較例で、特にことわらない限り
は、各処理とも常温で行なっている。

特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社 代表者長野和吉 １７−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. シリカゲルを吸着剤として補酵素Ｑを精製し、吸着、溶
   出および洗浄したのちのカラム中のシリカゲルの再生法
   において、洗浄後のシリカゲルに溶剤を接触させ・また
   は接触させないで、ついでカラム中の溶剤を排出せしめ
   たのちシリカゲルを乾燥し、さらに溶剤を接触させるこ
   とを特徴とするシリカゲルの再生法