JP2008524285A

JP2008524285A - 純又は富化コエンザイムｑ１０を製造するための方法

Info

Publication number: JP2008524285A
Application number: JP2007547306A
Authority: JP
Inventors: バール，フォルカー; シャイン，カリン; ウェターリッチ，フランク
Original assignee: ザイムス，エルエルシー
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-17
Publication date: 2008-07-10
Also published as: AU2005321611A1; WO2006069658A1; DE102004063006A1; US20110137084A1; EP1828091A1; CN101111465A; CA2601332A1

Abstract

本発明は、式（Ｉ）
［化１］

のコエンザイムＱ_１０と式（ＩＩ）
［化２］

の化合物とを含む混合物を分離することによって式（I)の純又は富化コエンザイムＱ_１０を製造する方法に関する。

Description

説明
発明の技術分野
本発明は、コエンザイムＱ_１０及びコエンザイムＱ_１０の構造異性体を含む物質混合物を分離することによって、純又は富化コエンザイムＱ_１０を製造する方法に関する。

式（Ｉ）

のコエンザイムＱ_１０（ユビキノン）は、ヒト呼吸鎖の重要な成分であり、最近食品栄養補助剤又は治療薬として重要性が増してきている。

コエンザイムＱ_１０への全合成アプローチでは、この分子の大きさのために、収斂的合成法が追求されることが多い。従って、この分子の芳香族又はキノイドの核とポリイソプレノイド側鎖とは、通常、初めに互いに別々に作られ、その後の合成段階で互いにカップリングされる。

先行技術
このカップリング反応を、根岸（Ｎｅｇｉｓｈｉ)らによって「ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ」２００２年，４巻，２号，２６１−２６４頁に記載された方法によって行い得る、又はコエンザイムＱ_６若しくはＱ_７を合成するために、リプシュッツ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ）らによって「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１９９９年，１２１，１１６６４−１１６７３頁に記載された方法による、式（ＩＩＩ）

のビニルアランと好適なキノン、例えば、式（ＩＶ）

（式中、Ｘは、脱離基であり、例えば、ハロゲン、特に塩素などである）
のタイプの１つとのニッケル触媒作用によるカップリングによって行い得る。

ここで使用される式（ＩＩＩ）のビニルアランは、言い換えると、好適な触媒、例えば、ジルコン触媒又はチタン触媒の存在下、式（Ｖ）

の末端アルキンとトリメチルアルミニウムとのカルボアルミネーションによって到達できる。

発明の目的
国際公開第２００５／０５６８１２号パンフレットには、ユビキノン、特に好適なキノンをそれぞれのユビキノン側鎖のアルキン誘導体に遷移金属触媒作用によりカップリングさせることによるコエンザイムＱ_１０を製造するための改善された方法が開示されている。さらに、この出願人は、ユビキノン又はユビキノン誘導体と、構造異性体側鎖を有する異性体化合物との混合物を開示している。

この方法で行われるカルボアルミネーションは、式（ＩＩＩ）の所望のカルボアルミネーション生成物をもっぱらもたらすのではなく、また、式（ＶＩ）

の位置異性体ビニルアランをもたらすことが明らかとなった。

式（Ｖ）又は式（ＶＩ）の位置異性体ビニルアラニンの混合物から、後述のＮｉ触媒作用によりカップリングすることによって、式（Ｉ）のコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）

の化合物の混合物が得られる。

本発明は、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物の混合物がさらなる利用、特にヒトに対する食品栄養補助剤又は治療薬としての利用に好適になるよう処理されることを可能とする方法を開発する目的に基づくものである。

発明の説明及び好ましい実施形態
この目的は、式（Ｉ）

のコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）

の化合物を含む物質混合物を分離することによって式（Ｉ）の純又は富化コエンザイムＱ_１０を製造するための方法を提供することによる本発明によって達成された。

上記のこの混合物は、式（ＩＩＩ）及び式（ＶＩ）の異性体ビニルアランの混合物と好適なカップリング相手、例えば、式（ＩＶ）

（式中、Ｘは、例えば、ハロゲン、好ましくは塩素若しくは臭素、特には塩素若しくはＯＲ基などの脱離基を表し、ここで、Ｒは、ハロゲン、１〜約６個の炭素原子をもつ分枝若しくは非分枝のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ヘキシル、シクロヘキシルなどを表し、又はＯＲ基の酸素原子と一緒に、メチルスルホニル、トリフルオロメチルスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなどのスルホニルを示す）
のキノンなどとのＮｉ触媒作用によるカップリングによって得られ得る。

さらに、この混合物は、例えば、脱離化合物の、前の合成段階からの副生成物を含み得る。特に、例えば、ソラネソール誘導体のプロパルギル化による、式（Ｖ）のアルキンの製造において生じる、例えば、式（ＶＩＩ）

の化合物などの脱離生成物などの副生成物又は不純物を含み得る。

さらに、本発明により分離される物質混合物は、また、式（Ｖ）の化合物のカルボアルミネーション又はそれから得られる式（ＩＩＩ）及び式（ＶＩ）のビニルアランのカップリングにおいて使用される、例えば、反応剤若しくは触媒、例えば、Ｚｒ、Ｔｉ若しくはＮｉの塩又は他にホスフィンなどを含み得る。

本発明による方法によってコエンザイムＱ_１０を単離するための出発物質としての好ましい混合物は、式（ＩＩ）の化合物若しくは任意の不純物に加えて、コエンザイムＱ_１０が、重量で主成分として、好ましくは３０重量％を超えて、特に４０重量％を超えて存在するものである。出発物質としての好ましい混合物は、言い換えれば約５０重量％、好ましくは約８０を超える重量％、特に約９０〜約９９重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の異性体化合物で構成されるものである。

コエンザイムＱ_１０を単離するための出発物質として好適なこの混合物において、コエンザイムＱ_１０の、式（ＩＩ）のその異性体に対するモル比は、有利には約８５対１５〜約９９．７対０．３まで、好ましくは約８５対１５〜９９．５対０．５まで、特に好ましくは約９０対１０〜約９９．５対０．５まで、極めて特に好ましくは約９５対約５〜約９９．５対０．５までである。

本発明による分離は、好ましくは、コエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の化合物を含む溶液からコエンザイムＱ_１０を選択的に結晶化させることによって行い得る。ここで、用語「選択的」とは、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の２つの化合物の１つが、使われた混合物に比べてより富化した形態で得られる結晶化物で存在すること、すなわち、粗生成物中のこれらの化合物のモル比が、結晶化物中の２つの化合物の１つにプラスになるようにシフトされることを意味する。この場合、結晶化物において式（Ｉ）のコエンザイムＱ_１０の選択的結晶化又は富化が好ましい。

この選択的結晶化を行うための好ましい溶媒は、アルコール、特に、１〜約１０個の炭素原子をもつもの、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ヘキサノールエチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオールなどである。

さらに好ましい溶媒は、カルボニル化合物、例えば、アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトン、酢酸エチルエステル又はシクロヘキサノンなどである。

更に好ましい溶媒としては、環状又は非環状エーテル、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル又はジグリムなどが挙げられる。

また、本発明による分離を行うためのさらに好適な溶媒としては、ハロゲン化した溶媒、例えば、ジクロロメタン若しくはジクロロエタンなどや、芳香族溶媒であって、トルエン若しくはキシレンなどが挙げられる。

さらには、好適な溶媒として、また、炭化水素、例えば、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどが挙げられる。

本発明の範囲において好ましいさらなる溶媒は、アセトニトリル及び水である。

また、これらの溶媒は、混合物の形態、特にこれらの溶媒の２成分又は３成分の混合物の形態で使用され得る。本発明の範囲において、エタノール又はエタノールを含む溶媒混合物が溶媒として好ましい。これらの溶媒混合物の中でも、重量で主成分としてエタノールを含むものが好ましく、特に約７０容量％よりも多いエタノールからなるもの、好ましくは約８０〜約１００容量％のエタノールからなるものである。本発明の範囲において特に好ましい溶媒は、純、すなわち少なくとも約９５容量％のエタノールである。

さらに、本発明による好ましい溶媒混合物は、エタノール及び／又はアセトン、並びに水を含むものである。

選択される溶媒又は溶媒混合物に依存して、溶媒中で使用される物質混合物の濃度は広い範囲内で変化させ得る。コエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の化合物を含む、全溶液を基準として、約１〜約５０重量％、好ましくは約１〜約３５重量％、特に好ましくは約１〜約１０重量％のこれらの物質混合物からなるこのような溶液が、本発明による好ましい結晶化による分離方法によってコエンザイムＱ_１０を単離するために有利に使用される。

結晶化による、本発明による好ましい分離方法は、約−２０℃〜約８０℃、好ましくは約０℃〜約６０℃、特には約０℃〜約４０℃の範囲の温度で行うことができる。

結晶化条件の選択に依存して、好適な結晶核、例えば好ましく結晶化されるべき化合物の結晶を用いて結晶化溶液に結晶種を入れることが有利であり得る。

本発明による方法を行うために、分離されるべき物質混合物の溶液を選択される溶媒又は溶媒混合物中で、場合によって攪拌しながら、例えば、選択される溶媒又は溶媒混合物に応じて、約４０℃〜約６０℃の温度に加熱し、次いでゆっくり、すなわち約０．５時間〜約２０時間かけて、コエンザイムＱ_１０の選択的結晶化が始まる温度（約０〜２０℃）まで冷却する手順が有利である。必要に応じて、温度を更に下げることによって結晶化を完了させることができる。

これに対する代替又は追加として、好適な溶媒又は溶媒混合物中で分離される物質混合物の上記した溶液を提供し、さらに溶媒又は溶媒混合物を添加することによって本発明による好ましい選択的結晶化の誘因とすることもまた可能である。この場合、とりわけ結晶化温度及び添加の方法の双方は、変えられ得る。

本発明による方法によって、純又は富化した形態、すなわち出発物質混合物のコエンザイムＱ_１０の純度又は含有量に応じて、少なくとも７０重量％、好ましくは約８０〜約１００重量％、特には約９０〜約９９．５重量％、特に好ましくは約９５〜約９９．５重量％及び最も好ましくは約９８〜９９．５重量％の含有量を有するコエンザイムＱ_１０を提供することが可能である。

さらに、本発明による分離方法は、また、式（Ｉ）のコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の化合物を含む物質混合物の溶融物から結晶化によって行い得る。少なくとも実質的に溶媒が存在しないこのタイプの溶融結晶化は、それ自体当業者に知られており、例えば、ジー・エフ・アルケンバウト（Ｇ．Ｆ．Ａｒｋｅｎｂｏｕｔ）著，「溶融結晶化技術（ＭｅｌｔＣｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，ランカスター／ＰＡ（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ／ＰＡ），テクノミック出版社（ＴｅｃｈｎｏｍｉｃＰｕｂｌ．Ｃｏ．），１９９５年に包括的に記載されている。この場合、懸濁結晶化又は層での結晶化の静的及び動的方法の双方が本発明により行い得る。

本発明による方法の出発物質又は生成物として述べられる、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物の混合物の分析は、側鎖の５０個の炭素原子のいくつかの配置のみが異なり、これらの分子の化学的及び物理的な大きな類似性ゆえに、装置に対する大きな出費をもってのみ可能である。コエンザイムＱ_１０を含む同様の物質混合物の分析に好適な方法は、「ＵＳＰ２７，公式モノグラフ（ＯｆｆｉｃｉａｌＭｏｎｏｇｒａｐｈｓ）」２，０３９頁、及び「欧州薬局方５．０」２，６５７頁に記載されている。

本発明による方法のさらなる実施形態は、コエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の化合物を含む物質混合物をクロマトグラフィーの方法、好ましくは実験規模で、特に順相及び逆相クロマトグラフィーが考慮されている方法によって分離することによる純又は富化コエンザイムＱ_１０の製造に関する。この場合、順相クロマトグラフィーとしての方法が本発明により好ましいと考えられるべきである。

実験規模での分離は、分析用の分離と対照的に、得られた画分がさらなる転換又は使用に利用できるように、好適な方法で収集されて単離されるものとして理解されるべきである。この場合、分離が、物質の量が製造規模までを通して約１ｇを超える範囲で実施され得る点で特に興味深い。純又は富化コエンザイムＱ_１０を製造するための本発明による方法は、従って、一般に、この実施形態に関するのみならず、純又は富化形態で、好ましくは実験規模又は工業規模でこの物質を単離する方法であり、それゆえに、最小物質量が分離されるが単離されない分析的方法からは区別される。

粗生成物のクロマトグラフィーによる精製又は物質混合物を分離するための方法は当業者に知られており、「精密化学品及び医薬剤の分取クロマトグラフィー（ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｇｅｎｔｓ）」，ヘンネル・シュミット−タウブ（ＨｅｎｎｅｒＳｃｈｍｉｄｔ−Ｔａｕｂ）編，ウィリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ），２００５年に包括的に記載されている。

本発明によるクロマトグラフィー分離方法は、標準圧又は高圧で行うことができる。本発明による分離は、好ましくは１バール（絶対圧、すなわち過剰の圧力なし）〜１００バール（絶対圧）、特に好ましくは約５バール（絶対圧）〜約８０バール(絶対圧）までの圧力で行うことができる。

このクロマトグラフィーは、約１５℃〜約８０℃の温度範囲で行い得、すなわちカラム及び溶媒が約１５℃〜約８０℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃、特に好ましくは室温、すなわち約２０℃〜約２５℃の温度範囲で有利に保たれる。

順相クロマトグラフィーによる本発明による分離を行うために、例えば、シリカゲル（ＳｉＯ_２）又は酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、好ましくはシリカゲルなどの固定相としての利用に好適な従来の材料が好適である。この場合、粒子の大きさは、選択される移動相、又はそれぞれの分離の問題もしくは広範囲で分離されるべき試料容量に応じて選択され得るが、一般に約５μｍ〜約２００μｍ、好ましくは約１５μｍ〜約１００μｍである。

本発明による分離方法の範囲において、好ましい分離材料は、例えば、シリカゲル６０もしくはシリカゲル１００（メルクＫＧａＡ社）（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ）の名称を有するもの、リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）（メルクＫＧａＡ社）（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ）、例えばリクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）Ｓｉ、リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）ＲＰ−２、リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）ＲＰ−８、リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）ＲＰ−１８、リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）ＣＮ、リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）Ｄｉｏｌ、リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）ＮＨ２［いずれの場合も（メルクＫＧａＡ社）（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ）］若しくはリクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｅｒ）（登録商標）（メルクＫＧａＡ社）（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ）、例えばリクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｅｒ）（登録商標）Ｓｉ、リクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｅｒ）（登録商標）ＣＮ、リクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｅｒ）（登録商標）ＮＨ２、リクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｅｒ）（登録商標）Ｄｉｏｌ（メルクＫＧａＡ社）（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ）及びリクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｅｒ）（登録商標）ＲＰ、並びに匹敵するものとして当業者に知られるさらなる材料である。本分離方法の範囲において、リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）Ｓｉ６０及びシリカゲル６０が特に好ましい。

順相クロマトグラフィーによる本発明による好ましい分離の範囲における移動相としては、式（Ｉ）若しくは式（ＩＩ）の分離されるべき異性体、又は場合によって、依然として存在するさらなる成分若しくは不純物が十分に溶解する有機溶媒若しくはさまざまな有機溶媒の混合物が好適である。好適な溶媒として例として挙げられるものとしては、本発明による結晶化を行うために上記に掲載された溶媒である。これらの中でも、炭化水素、例えば、石油エーテル、ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、好ましくはｎ−ヘプタンなど、及びカルボニル化合物、例えば、アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトン、酢酸エチルエステル若しくはシクロヘキサンノン、好ましくは酢酸エチルエステルなど、並びに環状若しくは非環状エーテル、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン若しくはメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどが好ましい。

これらの溶媒は、混合物の形態で使用される場合、任意の比率で互いに混合され得る。この場合、選択される混合比率は、分離の過程で一定に保たれる（定組成モードの操作）又は連続的若しくは徐々に変えられ得る（勾配モードの操作）。本発明による移動相としての好ましい溶媒混合物は、酢酸エチルエステル及び炭化水素、好ましくはｎ−ヘプタン若しくはｎ−ヘキサンからなる。定組成モードの操作において、これら溶媒混合物中の酢酸エチルエステルの割合は、好ましくは上限約１０容量％、特に好ましくは上限約５容量％、極めて特に好ましくは約０．５〜約５容量％である。

さらに、移動相のｐＨは、酸又は塩基を添加することによって変えられ得る。例えば、それぞれに使用される移動相のｐＨは、酸、例えばトリフルオロ酢酸を添加することによってｐＨ７未満に調整することができる。炭化水素、好ましくはｎ−ヘプタン若しくはｎ−ヘキサンと酢酸エチルエステルとの前述の溶媒混合物を使用する場合、トリフルオロ酢酸が、例えば、一般に上限約１容量％、好ましくは約０．０５〜約１容量％の量で一般に有利に添加される。

クロマトグラフィーは、不連続的に、すなわちバッチクロマトグラフィーとして行い得る又は他に連続的に行い得る。本発明による方法の好ましい実施形態の範囲において、好適な分離条件のもと、実験規模又は工業的規模での利用に特に有利である連続的分離は、また、例えば、「精密化学品及び医薬剤の分取クロマトグラフィー（ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｇｅｎｔｓ）」，ヘンネル・シュミット−タウブ（ＨｅｎｎｅｒＳｃｈｍｉｄｔ−Ｔａｕｂ）編，ウィリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ），２００５年、又はストルーべ（Ｓｔｒｕｂｅ）ら、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２（５），３０５〜３１９頁，１９９８年に記載されたように、いわゆる擬似移動相（ＳＭＢ）の条件のもとで行い得る。ＳＭＢクロマトグラフィーにおいて、移動相及び固定相は擬似逆流中で導かれる。有利な点は、溶媒及び固定相のより少ない使用並びに生成物の高純度及び回収率である。ＳＭＢクロマトグラフィーによるコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の異性体からなる混合物の分離の場合に、実際のクロマトグラフィーに先立って、シリカゲル上のろ過若しくは粗生成物の混合物からの抽出によってより極性の成分を取り除くことが有利である。

ＳＭＢクロマトグラフィーによる本発明により分離されるべき物質混合物は、移動相として選択される溶媒若しくは溶媒混合物において有利に溶液の形態で一般に使用される。ＳＭＢクロマトグラフィーとして分離されるべき出発物質混合物（仕込み）のこの溶液の濃度は、それぞれの溶媒若しくは溶媒混合物において約１０ｇ／ｌから出発物質の溶解限度までで選択することができる。約１００ｇ／ｌ〜約１２０ｇ／ｌ（物質混合物を基準として）が好ましい。

移動相は、一般に、約１００〜２，０００ｃｍ／時間、好ましくは約８００〜１，２００ｃｍ／時間の空管速度で、本発明によるＳＭＢクロマトグラフィーの過程においてカラムを通って一般に移動する。圧力は、約１バール（すなわち過剰の圧力なし）〜上限約１００バール、好ましくは３５〜６０バール（絶対圧力）であり得る。溶媒混合物は、酢酸エステルの上限５容量％の割合を有する、酢酸エチルエステル及びｎ−ヘプタン若しくはｎ−ヘキサンの混合物が好ましい。容量を基準として、酢酸エステルのｎ−ヘプタン若しくはｎ−ヘキサンに対する比が、９８対２であることが極めて特に好ましい。

異性体化合物（Ｉ）及び（ＩＩ）のクロマトグラフィー分離のための上述の方法は、また、本発明による方法の好ましい実施形態の過程において前述の結晶化方法と組み合わせ得る。したがって、例えば、式（Ｉ）の所望の異性体の上述したクロマトグラフィー分離又は富化に続けて、このように得られた富化生成物を上述の結晶化若しくは一連の結晶化に供することが有利であり得る。

この場合に、上流クロマトグラフィー分離又は富化は、また、例えば、異性体混合物が最初にさらに場合によって存在する不純物、反応剤若しくは副生成物が、部分的若しくは完全に除かれることができ、式（ＩＩ）の異性体の減少がすでに場合によって生じる、いわゆるフラッシュ・クロマトグラフィー若しくはカラムろ過の形態で行い得る。

例えば、事前精製と称される最初のクロマトグラフィー段階において、通常約６０〜約７０重量％の式（Ｉ）のコエンザイムＱ_１０の通常の含有量を有するコエンザイムＱ_１０の化学合成の粗生成物の混合物を使用することができる。約８０〜約９５重量％、多くは約８５〜９５重量％の式（Ｉ）のコエンザイムＱ_１０の含有量を有する物質混合物は、例えば、酢酸エステル及び炭化水素の混合物を用いたシリカゲル上の順相フラッシュ・クロマトグラフィーによって、一般にそれから得られる。次いで、この富化された生成物の混合物は、本発明によって行われる結晶化又は一連の結晶化によってさらに精製され得る。

本発明は、したがって、また、式（Ｉ）

のコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）

の化合物を含む物質混合物を分離することによって、式（Ｉ）の純又は富化コエンザイムＱ_１０を製造するための方法に関し、ここで分離のために、少なくとも１回のクロマトグラフィー及び少なくとも１回の結晶化が行われる。

本発明によれば、この分離方法を、最初の分離工程で得られた富化生成物の混合物が第２の分離工程に供給されるというように、次々に都合よく行われる。クロマトグラフィーは、好ましくは最初に事前精製として行われ、次いで、このように得られた富化若しくは事前精製された生成物の混合物を上述の結晶化に供する。必要に応じて、この分離工程はまた、数回、好ましくは、それぞれの分離工程を一度行うことによって満足する富化が得られない場合に次々と２回又は３回行うことができる。

個々の分離工程を繰り返し行う場合、これらをさまざまな分離方法の組み合わせの形態において行う又は同じ分離方法の繰り返しとして行うかどうかにかかわらず、個々の分離工程が行われる分離条件、例えば溶媒、固定分離相、又は圧力若しくは温度などの他のパラメータの選択は、個々の場合において変えられ得る又は一定に保たれ得る。

さらに、この混合物は、また、例えばアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用される場合、好ましくは式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の１個若しくは２個の化合物と選択的相互作用を形成する位置にある基、構造若しくは官能性を有する媒体と接触するようして、本発明による方法において分離又は富化され得る。

所望の結果を得るには、この好ましい分離方法を次々と、一般に２〜５回、好ましくは２〜３回繰り返して行うことが有利であり得る。

分離される式（Ｉ）と式（ＩＩ）の２つの構造異性体化合物が全部で５０個の炭素原子を含むポリイソプレノイド側鎖の炭素原子の２個の配置で異なるだけであるので、本発明による方法の効率性は驚くべきことである。それゆえ、当業者は、上記の方法におけるこの化合物の本発明による分離の可能性を考えたことはなかったであろう。

それゆえ、本発明による方法は、ヒト及び動物に対する使用若しくは投与に好適な、異性体−純コエンザイムＱ_１０若しくは異性体−富化コエンザイムＱ_１０を提供する可能性を切り開くものである。この種の物質は、別に、２つの構造的合成要素の遷移金属の触媒作用によるカップリングによる、導入部で記載した収斂的合成方法によっては到達できなかったであろう。

実施例
以下の実施例は、本発明を説明するために用いるものであり、決してそれらを限定するものではない。この物質混合物の分析のために、「ＵＳＰ２７」による上述の方法が使用された。

実施例１
カラムクロマトグラフィーにより精製された、９１．３対８．７の相対比で９１．２８重量％の、コエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成された混合物２．４３ｇをエタノール５０ｍｌに溶解し、この溶液を攪拌しながら５０℃まで加熱し、次いで、２時間以内で室温まで冷却した。次いで、この溶液を０℃に冷却し、生成した結晶をろ別し、冷却エタノールで再洗浄し、真空乾燥室中で４０℃で乾燥した。黄色の固形分２．０１ｇが得られ、その９８．８６重量％が、相対比９６．７対３．３のコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成された。

実施例２
実施例１で得られた生成物１．３２ｇをエタノール２５ｍｌに溶解し、この溶液を攪拌しながら５０℃まで加熱し、次いで、２時間以内で室温まで冷却した。次いで、この溶液を０℃まで冷却し、生成した結晶をろ別し、冷却エタノールで再洗浄し、真空乾燥室中で４０℃で乾燥した。黄色の固形分１．２８ｇが得られ、その９６．９重量％が、相対比９８．７対１．２のコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成された。

実施例３
５５．２重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の分離される化合物が相対比９８．８対１．２（ＨＰＬＣ表面％）で存在している、物質混合物４５．６ｇを圧力カラム（直径：８ｍｍ、長さ：５０ｃｍ、シリカゲル充填、０．０４〜０．０６３ｍｍ）上でクロマトグラフにかけた。ヘキサン及び酢酸エチルエステルの混合物を使用し、酢酸エステルの割合は、クロマトグラフィーの間に２容量％から４容量％に増加していた。溶媒を除去後、混合物２３．９ｇが得られ、その９４．８重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９９．１対０．９（ＨＰＬＣ表面％）であった。

このようにして得た混合物をエタノール３００ｍｌ中に６０℃で溶解した。次いで、この溶液を５Ｋ／時間の速度で１０℃まで冷却した。この場合、沈殿しているオレンジ色の固形分を吸引して分離し、エタノール４０ｍｌで洗浄し、真空乾燥室中で室温で乾燥した。固形分２１．５ｇが得られ、その９７．７重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９９．７対０．３（ＨＰＬＣ表面％）であった。

実施例４
９４．６重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の分離される化合物が相対比９１．８対８．２（ＨＰＬＣ表面％）で存在している物質混合物１５．６ｇをエタノール８０ｍｌに懸濁させ、４５℃まで加熱した。次いで、さらにエタノール３００ｍｌを添加し、３０分攪拌後、５Ｋ／時間の速度で１０℃まで冷却した。１０℃で２時間攪拌後、固形分をろ別し、冷エタノール２０ｍｌで洗浄した。乾燥後、混合物１２．７ｇが得られ、その１００重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９７．６対２．４（ＨＰＬＣ表面％）であった。

このようにして得られた固形分をエタノール１９０ｍｌに取り、５５℃で溶解した。次いで４５℃で２時間攪拌し、５Ｋ／時間の速度で１０℃まで冷却した。１０℃で一夜攪拌後、固形分をろ別し、冷エタノール２０ｍｌで洗浄し、乾燥した。混合物１１．９ｇが得られ、その１００重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９９．１対０．９（ＨＰＬＣ表面％）であった。

次いで、このようにして得られた固形分を再度エタノール２００ｍｌに取り、前と同様に結晶化させた。混合物１１．２ｇが得られ、その１００重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の異性体で構成され、その相対比は９９．６対０．４（ＨＰＬＣ表面％）であった。

実施例５
相対比９７．９対２．１（ＨＰＬＣ表面％）である、式（Ｉ）のコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の化合物の混合物５１．７重量％を含む粗混合物２３．８ｇをシリカゲル２５０ｇで充填された吸引フィルター（４．５ｃｍ高さ）でろ過した。最初ｎ−ヘキサンを用いて溶離し、ろ過の過程で１０容量％までのジエチルエーテルをゆっくり添加した。混合物１２．３ｇが得られ、その８７．７重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９８．５対１．５（ＨＰＬＣ表面％）であった。

このようにして得られた固形分８．８ｇをエタノール２００ｍｌ中で５５℃まで加熱し、さらにエタノール１００ｍｌを添加した。この溶液を５Ｋ／時間の速度で１０℃まで冷却し、純コエンザイムＱ_１０２ｍｇを結晶種として４５℃で加えた。固形分を吸引分離し、エタノール２０ｍｌで洗浄した。固形分７．４ｇが得られ、９５．６重量％の、コエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９９．２対０．８（ＨＰＬＣ表面％）であった。

実施例６
相対比が９９．１対０．９で、６０．９重量％の、コエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）の異性体を含む物質混合物１０３．４ｇを溶媒流量１００〜１２０ｍｌ／分、圧力８〜１０バールでＭＰＬＣ（中圧液体クロマトグラフィー）によるクロマトグラフィーで分離した{カラム：直径１０ｃｍ、高さ（ｈ）＝４５ｃｍ、シリカゲル[リクロプレプ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）Ｓｉ６０１５〜２５μｍ、メルク社（Ｍｅｒｃｋ）］充填}。クロマトグラフィーを、純ヘキサンを用いて開始した。クロマトグラフィーの間、酢酸エチルエステルを６容量％の割合まで添加した（勾配モードの操作）。生成物５９．７ｇが得られ、その９７．５重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９９．３対０．７であった（ＨＰＬＣ表面％）。

このようにして得られた固形分４４ｇをエタノール５００ｍｌに６０℃で溶解した。次いで、１０Ｋ／時間の速度で１０℃まで冷却した。次いで、混濁した溶液にスパチュラ先端量のコエンザイムＱ_１０を用いて４０℃で結晶種を入れるとすぐに、固形分の形成が始まった。固形分を１０℃でろ別し、エタノール９５ｍｌで洗浄し、２０ミリバール、室温で乾燥した。固形分３９．７ｇが得られ、その９５．７重量％は、コエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９９．６対０．４（ＨＰＬＣ表面％）であった。

実施例７
７７．６重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比が９８対２（ＨＰＬＣ表面％）である物質混合物６０．３ｇを容量比９対１のエタノールとトルエンとの溶媒混合物１８０ｍｌに５０℃で溶解した。次いで、混合物を５Ｋ／時間の速度で１０℃まで冷却した。生成した固形分を１０℃で吸引分離し、冷（エタノール／トルエン）３０ｍｌで再洗浄した。乾燥後、混合物９．５ｇが得られ、その８４．９重量％が、コエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９７．９対２．１（ＨＰＬＣ表面％）であった。

実施例８
７１．７重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比が９２．１対７．９（ＨＰＬＣ表面％）である物質混合物３０ｇを容量比７対３のエタノール及びアセトンの溶媒混合物１８０ｍｌに５０℃で溶解した。次いで、この溶液を３０℃に冷却し、結晶種を入れた後、５Ｋ／時間で１０℃までさらに冷却した。生成した固形分を吸引分離し、エタノール／アセトン混合物３０ｍｌで再洗浄した。乾燥後、混合物２２．８ｇが得られ、その８０．３重量％がコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体で構成され、その相対比は９６．５対３．５（ＨＰＬＣ表面％）であった。

実施例９
比９４対６のコエンザイムＱ_１０及び式（ＩＩ）のその異性体を分離するために、溶媒の主成分としてｎ−ヘプタン及び次に述べる固定相を使用して以下を調べた：リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）ＲＰ−２、２５〜４０μｍ；リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）Ｓｉ６０、５〜２０μｍ；リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）Ｓｉ６０、１２μｍ；リクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）ＣＮ、２５〜４０μｍ；リクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ）（登録商法）１００ＣＮ、１０μｍ；リクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ）（登録商法）１００ＮＨ２、１５μｍ；リクロスフェア（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ）（登録商法）１００Ｄｉｏｌ、１０μｍ。

最良の分離性能が、固定相としてリクロプレップ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）（登録商標）Ｓｉ６０−カラムを用いて得られた。表１に、この系に使用された溶媒組成及び得られた分離結果を要約した。

最良の結果が、０．１％トリフルオロ酢酸を添加した溶媒ヘプタン／酢酸９８／２において得られた。厳密な分離条件を表２に示す；溶離液Ａ及びＢは、表３に示した勾配に従って混合した。

図面の簡単な説明
実施例９による不連続な分離についての典型的なクロマトグラフを示す。

Claims

式（Ｉ）

のコエンザイムＱ_１０と式（ＩＩ）

の化合物とを含む物質混合物を分離することによって、式（Ｉ）の純又は富化コエンザイムＱ_１０を製造するための方法。
分離のために、コエンザイムＱ_１０の選択的結晶化を、コエンザイムＱ_１０と式（ＩＩ）の化合物とを含む物質混合物の溶液又は溶融物から行う、請求項１に記載の方法。
前記結晶化を、溶媒としてエタノール及び／又はアセトンを含む前記物質混合物の溶液から行う、請求項２に記載の方法。
前記結晶化を７０〜１００容量％がエタノールからなる溶媒又は溶媒混合物から行う、請求項２又は３に記載の方法。
前記結晶化を−２０℃〜８０℃の範囲の温度で行う、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
全溶液を基準として、１〜３５重量％の前記物質混合物を含む溶液を使用する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
式（Ｉ）のコエンザイムＱ_１０と式（ＩＩ）の化合物とがモル比８５対１５〜９９．７対０．３で存在する物質混合物を使用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
クロマトグラフィーを分離のために行う、請求項１に記載の方法。
少なくとも１回のクロマトグラフィー及び少なくとも１回の結晶化を分離のために行う、請求項８に記載の方法。
クロマトグラフィーを実験規模で行う、請求項８又は９に記載の方法。
順相クロマトグラフィーを、固定相としてシリカゲルを使用して行う、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記クロマトグラフィーを１〜８０バールの圧力で行う、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
前記クロマトグラフィーを酢酸エチルエステル及びｎ−ヘプタン、又は酢酸エチルエステル及びｎ−ヘキサンの溶媒混合物であって、各々の場合における酢酸エチルエステルの割合が上限５容量％である前記溶媒混合物を用いて行う、請求項８〜１２に記載のいずれか一項に記載の方法。
上限５容量％の量のトリフルオロ酢酸を酢酸エチルエステル及びｎ−ヘキサン若しくはｎ−ヘプタンの溶媒混合物に添加する、請求項１３に記載の方法。
前記クロマトグラフィーを１５〜６０℃の温度範囲、好ましくは２０〜２５℃の温度範囲で行う、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
アフィニティークロマトグラフィーを分離のために行う、請求項１に記載の方法。