CN102892412A - 辅酶Q10 (CoQ10)的静脉内制剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了适于肠胃外施用特定疏水活性剂如辅酶Q10的制剂。还公开了其制备方法和使用该制剂治疗肿瘤疾病的方法。制剂包含水性溶液、分散形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂及分散稳定剂和调理素作用缩减剂中的至少一种，其中活性剂的胶体状纳米分散体分散成平均尺寸小于200nm的纳米分散体颗粒。制备肠胃外制剂的方法包括通过(1)将疏水活性剂加入65℃的水浴中并混合以形成疏水活性剂/水混合物；(2)向疏水活性剂/水混合物中加入分散稳定剂并在65℃下混合以形成疏水活性剂/水/稳定剂混合物；(3)加入调理素作用缩减剂以形成疏水活性剂/水/稳定剂/缩减剂混合物；(4)预热微射流均质机到65℃；和(5)通过在65℃的微射流均质机中混合疏水活性剂/水/稳定剂/缩减剂混合物进行加工以致形成平均粒径小于200nm的疏水活性剂胶体状纳米分散体而利用高压匀质化来分散疏水活性剂。本文还提供通过向受试者施用本文描述的制剂治疗肿瘤疾病的方法从而治疗或预防肿瘤疾病发生。

Description

辅酶Q10 (CoQ10)的静脉内制剂及其使用方法

相关申请

本申请要求2010年3月12日提交的标题为“辅酶Q10(CoQ10)的静脉内制剂及其使用方法”的第61/313,632号临时申请和2010年9月21日提交的标题为“辅酶Q10(CoQ10)的静脉内制剂及其使用方法”的第61/385,107号临时申请的优先权。各上述申请的全部内容通过引用并入本文。

发明背景

癌症目前是发达国家中导致死亡的首要原因之一。虽然最近的研究已极大地增加了我们对许多肿瘤发生的分子机制的理解并且已提供了许多用于治疗癌症的新途径，但用于大多数恶性肿瘤的标准治疗仍然是全切除术(grossresection)、化学疗法和放射疗法。虽然不断获得成功，但此类疗法的每一种可引起许多不希望的副作用。例如，手术可导致疼痛、对健康组织的外伤性损伤和结瘢。放射疗法和化学疗法可能会导致恶心、免疫抑制、胃溃疡和继发性肿瘤发生。仍需要治疗包括癌症在内的疾病的改进方法和能够递送生物活性剂以帮助治疗疾病和其他病症的组合物。

在给住院患者施用的用于包括癌症的病症的所有药物中，有大约60％的药物是以注射剂的形式来给予的。现在静脉内制剂具有作为药物媒介的主要地位。因为它的可靠性、准确性、便利性、避免口服施用药物的胃刺激可能性以及连续和间断的药物治疗的重要性，静脉内注射剂在药物施用中有了更大的应用。在过去的十年间，提供静脉内施用的技术有了稳定的改进，且这类静脉注射剂的使用也在逐年增加。

国际专利申请公开No.WO/2009/126764(2009年4月9日提交)公开了用辅酶CoQ10治疗癌症。该申请的全部内容通过引用并入本文。

CoQ10具有10个类异戊二烯单元的长侧链，其导致此药物极度地亲脂和几乎不溶于水。经口施用的CoQ10的生物利用度一般极低和易变，且被发现与该制剂的溶解速度有关。由于低的经口生物利用度和其固有的高可变性，静脉内施用系统尤其在癌症患者的护理中得到了特别的关注。由于其亲脂性，CoQ10需要被引入用于静脉内施用的载体中，从而其药代动力学受到载体体系的影响。

辅酶Q10，本文中也称为CoQ10、泛醌或泛癸利酮，是一种普遍的营养补充剂，且可在营养品店、保健食品店、药店等处作为通过泛醇(CoQ10的还原形式)的抗氧化特性帮助保护免疫系统的维生素样补充剂以胶囊形式找到。CoQ10在人体的大多数组织和其他哺乳类动物的组织中发现且集中在线粒体中。CoQ10非常亲脂，且对于其大部分而言，不溶于水。该不溶性与如下CoQ10的结构中所示的烃性质的50个碳原子的类异戊二烯侧链有关。

高度疏水的CoQ10在水性溶液中基本上不溶。为使CoQ10用于肠胃外施用，它必须包含在与例如静脉内注射相容的稳定制剂中。在水性介质中制备CoQ10的静脉内制剂的一种方法需要包含一种或多种表面活性剂和允许产生CoQ10微粒于水性介质中的分散体的其他实体。这种方法有许多相关的难题。主要的难题与CoQ10在低于约50℃的温度下为固体的事实有关。CoQ10的固体颗粒在水性介质中的分散涉及到制备稳定性最长达两年以用于临床应用的安全制剂的困难。已经对这种固体颗粒分散体进行了研究，但是在静置时，包含CoQ10的颗粒会落到容器的底部，且通过搅拌或振摇使其重分散不符合医学应用的要求。成功的制剂应该有最长约两年的化学和物理稳定性，并提供用于临床使用的精确剂量。第二个主要的困难是获得在静脉内施用时不会在血流中产生颗粒分离或者沉积的制剂。这样的分离危害血流并潜在地是威胁生命的。

在专利文献中可找到许多以提高CoQ10的生物利用度为目的的不同制剂。在1981年2月4日的EP23349中，Taki和Takahira公开了通过共施用长链脂肪酸和单酸甘油酯提高口服施用的CoQ10的淋巴吸收。不同的专利如1986年8月14日的WO8604503A1、1988年8月4日的JP 63188623A2、1987年3月26日的JP 620667019A2、1984年8月25日的JP 59148735A2和1981年2月6日的JP 56012309公开了通过施用含有CoQ10的油性(表面活性剂)溶液的胶囊增加肠吸收。1993年1月13日的EP 522433A1、1988年5月5日的WO 8803019A1、1984年8月25日的JP 59148718A2描述了CoQ10在胶束溶液中的增溶。Ueno等人(Acta Pharm.Nord.，1(1989)99-104)报道了在与环糊精的复合物中包含CoQ10提高了经口生物利用度。1981年8月31日的JP 56109590A2公开了类似的制剂。另外，如在例如1992年7月15日的EP494654A2中Yano等所描述的，将CoQ10合并到乳液中被报道增强肠吸收。于2001年3月6日授权的美国专利No.6,197,349和于2001年3月27日授权的No.6,207,178描述了无定形物理状态的CoQ10颗粒，特别是超冷熔体。

对于肠胃外的，特别是静脉内施用，CoQ10必须合并到载体媒介中，因为，由于CoQ10的亲脂性，不可能制造出具有治疗浓度的CoQ10的水溶液。Groke和Polzer(1987年1月22日的DE 3524788A1)、Sugio等(1987年6月4日的JP 62123113A2)以及Mizushima等(1985年10月9日的JP 60199814A2)公开了用于静脉内施用泛癸利酮的卵磷脂稳定的大豆油乳液。1988年12月27日的JP 63319046A2描述了由多糖包被的大豆油乳液媒介。但是，由于CoQ10在植物油中相对差的溶解度，可被包含在乳液中的CoQ10浓度是有限的。

1983年1月12日的EP 69399A2公开了含泛癸利酮的鸡蛋卵磷脂和胆固醇的脂质体制剂。例如在1983年11月23日的EP 94692A1、1985年1月7日的JP 60001124A2和1988年12月21日的JP 63313727A2描述了多糖改性的脂质体。

但是，由于药物生物分布受载体的生物分布、其RES活性和药物从载体媒介的释放的影响，将药物并入到载体系统中的缺点可能是该物质的药代动力学会产生不希望的变化或显著的变异性。Bogentoft等(Folkers K.，Littaru G.P.，Yamagami T.编辑，《辅酶Q的生物医学和临床特征(Biomedical and ClinicalAspects of Coenzyme Q)》，第六卷，Elsevier 1991年，第215到224页)观察到，当分别以混合的胶束体系或乳液媒介静脉内施用时泛癸利酮在RES器官中蓄积。生物活性物质在载体中的溶解度通常过低而不能在可接受的制剂体积中获得治疗剂量。另外，载体颗粒本身的毒性副作用已在文献中特别地对于肠胃外脂质乳液进行了讨论(见Hajri T.等，Biochem.Biophys.Acta 1047(1990)121-130；Connelly P.W.等，Biochim.Biophys.Acta 666(1981)80-89；Aviram M.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.155(1988)709-713；Singh M.等，J.Parenter.Sci.Technol.40(1986)34-40；Cotter R.等，Am J.Clin.Nutr.41(1985)994-1001；Untracht S.，Biochim.Biophys.Acta711(1982)176-192)。

CoQ10就该药物的药物制剂而言是有问题的物质。对于CoQ10药用IV制剂(其中有必要减小颗粒尺寸)，传统的方法没有得到成功。例如使用球磨机、锤磨机、喷磨机或低温粉碎机等不可能粉碎该物质，这是由于辅酶Q10的不易碎的性质和低熔点。

发明概要

本发明包括适用于静脉内施用于受试者以产生具有临床有效的辅酶Q10(本文中也称为CoQ10或Q10)血液水平的稳定和非毒性的CoQ10制剂。

本发明也包括用于制备适用于静脉内施用于受试者以产生临床有效的CoQ10血液水平的稳定和非毒性的CoQ10制剂的方法。

在本文所述的某些本发明非限制性的实施方案中，提供了适用于静脉内施用于受试者的治疗制剂。在某些实施方案中，治疗制剂包含水性溶液、被分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂及分散稳定剂和调理素作用缩减剂(opsonization reducer)中的至少一种。活性剂的胶体纳米分散体物质被分散成尺寸小于200纳米的纳米分散体颗粒。在某些实施方案中，分散稳定剂选自天然或者半合成的磷脂。例如，合适的稳定剂包括聚乙氧基化(也称为聚乙二醇化)的蓖麻油(Cremophor

EL)、聚乙氧基化的氢化蓖麻油(Cremophor

RH 40)、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(聚乙二醇化的维生素E，维生素E TPGS)、山梨聚糖脂肪酸酯(Spans

)、胆汁酸和胆汁酸盐或者二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)。在某些实施方案中，稳定剂为DMPC。

在某些实施方案中，调理素作用缩减剂选自poloxamine(聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物)和泊洛沙姆。合适的泊洛沙姆包括泊洛沙姆188。在某些实施方案中，调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188。

在一些实施方案中，疏水活性剂是辅酶Q10(即，CoQ10、泛癸利酮、泛醌等)。

在一些实施方案中，疏水活性剂是CoQ10。调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188和分散稳定剂是DMPC。

在某些实施方案中，胶体状纳米分散体是悬浮液；

在某些实施方案中，胶体状纳米分散体是乳液；

在一些实施方案中，胶体状纳米分散体的活性剂是晶体形式。

在一些实施方案中，胶体状纳米分散体的活性剂是超冷熔体形式。

还提供了其中制剂分别具有4％、3％和1.5％重量/体积比的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆的实施方案。在其它实施方案中，CoQ10、DMPC和泊洛沙姆的重量/体积比分别为8％、6％和3.0％。

在一些实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸在大约10纳米至大约200纳米之间。

在一些实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸在大约10纳米至大约100纳米之间。

在一些实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸在大约30纳米至大约80纳米之间。

在一些实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸在大约35纳米至大约40纳米之间。

在一些实施方案中，纳米分散颗粒的平均尺寸小于约45纳米。

在某些实施方案中，制剂包含水性溶液、分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂及分散稳定剂和调理素作用缩减剂中的至少一种。活性剂的胶体状纳米分散体分散成尺寸小于200纳米的脂质体。

在一些实施方案中，分散稳定剂形成为单层的脂质体。在其它实施方案中，脂质体是双层的复层脂质体，其具有该双层之间的水性空间和双层内的亲脂性空间。在其它实施方案中，疏水活性剂封闭在双层的亲脂性空间内。在其它实施方案中，复层脂质体还包括封闭在双层之间的水性空间中的亲水试剂。

在某些实施方案中，制剂包含水性溶液、分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂及DMPC和调理素作用缩减剂。在一些实施方案中，调理素作用缩减剂选自poloxamine和泊洛沙姆。在一些实施方案中，调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，疏水活性剂是辅酶Q10(CoQ10)。在一些实施方案中，疏水活性剂是辅酶Q10(CoQ10)和调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，制剂具有重量/体积比分别为4％、3％和1.5％的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。在其它实施方案中，制剂具有重量/体积比分别为8％、6％和3％的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。在一些实施方案中，胶体状纳米分散体是悬浮液。在其它实施方案中，胶体状纳米分散体是乳液。在一些实施方案中，胶体状纳米分散体的活性剂是晶体形式。在其它实施方案中，胶体状纳米分散体的活性剂是超冷熔体形式。

在一些实施方案中，制剂包含水性溶液、分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂和DMPC。活性剂的胶体状纳米分散体分散成平均尺寸小于200纳米的纳米分散体颗粒。在一些实施方案中，疏水活性剂是辅酶Q10(CoQ10)。在一些实施方案中，胶体状纳米分散体是悬浮液。在其它实施方案中，胶体状纳米分散体是乳液。在一些实施方案中，胶体状纳米分散体的活性剂是晶体形式。在其它实施方案中，胶体状纳米分散体的活性剂是超冷熔体形式。在一些实施方案中，制剂具有重量/体积比分别为4％和3％的CoQ10和DMPC。在其它实施方案中，制剂具有重量/体积比分别为8％和6％的CoQ10和DMPC。在一些实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸在大约10纳米至大约200纳米之间。在其它实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸在大约10纳米至大约100纳米之间。在其它实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸在大约30纳米至大约80纳米之间。在其它实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸在大约35纳米至大约40纳米之间。在其它实施方案中，纳米分散颗粒的平均尺寸小于约45纳米。

在某些实施方案中，制剂包含水性溶液、分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的CoQ10、选自聚乙二醇化的蓖麻油、Cremophor EL、CremophorRH40、聚乙二醇化的维生素E TPGS和二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)的分散稳定剂及选自泊洛沙姆和poloxamine的调理素作用缩减剂。CoQ10的胶体状纳米分散体分散成平均尺寸在约10纳米至约100纳米之间的纳米分散体颗粒。

在某些实施方案中，制剂包含水性溶液、分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。CoQ10的胶体状纳米分散体分散成平均尺寸在约30纳米至约80纳米之间的纳米分散体颗粒。

在某些实施方案中，提供了制备适用于静脉内施用的CoQ10纳米分散体的方法。在一些实施方案中，该方法包括通过(1)将疏水活性剂加入65℃的水浴中并混合以形成疏水活性剂/水混合物；(2)向疏水活性剂/水混合物中加入分散稳定剂并在65℃下混合以形成疏水活性剂/水/稳定剂混合物；(3)加入调理素作用缩减剂以形成疏水活性剂/水/稳定剂/缩减剂混合物；(4)预热微射流均质机到65℃；和(5)通过在65℃的微射流均质机中混合疏水活性剂/水/稳定剂/缩减剂混合物进行加工以形成平均粒径小于200纳米的疏水活性剂胶体状纳米分散体而利用高压匀质化来分散疏水活性剂。

在一些实施方案中，该方法进一步包括冻干胶体状纳米分散体以使CoQ10胶体状纳米分散体颗粒结晶的步骤。

在一些实施方案中，该方法进一步包括添加冻干保护剂的步骤。在一些实施方案中，冻干保护剂是营养糖。在一些实施方案中，营养糖选自乳糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神经氨酸、葡糖胺、半乳糖胺、N-甲基葡糖胺、甘露醇、山梨糖醇、精氨酸、甘氨酸和蔗糖。

在一些实施方案中，该方法包括选自聚乙二醇化蓖麻油、Cremophor EL、Cremophor RH40、聚乙二醇化维生素E、维生素E TPGS和二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)的分散稳定剂。在一些实施方案中，分散稳定剂是DMPC。在一些实施方案中，调理素作用缩减剂是选自泊洛沙姆和poloxamine。在一些实施方案中，调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188和分散稳定剂是DMPC。在一些实施方案中，疏水活性剂是CoQ10。在一些实施方案中，疏水活性剂是CoQ10，调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188和分散稳定剂是DMPC。在一些实施方案中，胶体状纳米分散体的CoQ10是超冷熔体的形式。在其它实施方案中，胶体状纳米分散体的CoQ10是晶体形式。

在一些实施方案中，由本方法得到的制剂包含水性溶液、分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂及分散稳定剂和调理素作用缩减剂中的至少一种。活性剂的胶体状纳米分散体分散成平均粒径小于200纳米的纳米分散体颗粒。在一些实施方案中，CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188的重量/体积比分别为4％、3％和1.5％。在其它实施方案中，CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188的重量/体积比分别为8％、6％和3％。在一些实施方案中，疏水活性剂胶体状纳米分散体的平均粒径在约10纳米至100纳米之间。在其它实施方案中，疏水活性剂胶体状纳米分散体的平均粒径在约35纳米至40纳米之间。在其它实施方案中，疏水活性剂胶体状纳米分散体的平均粒径小于45纳米。

在一个实施方案中，制剂在使用前用与血液等渗的标准医用肠胃外稀释剂来稀释。合适的肠胃外稀释剂的非限制性实施包括N盐水、5％葡萄糖、乳酸化林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。稀释的制剂，即输注液，可以经4小时或者更短的时间施用。输注液可以作为慢滴或通过计量泵送系统间断地或连续地施用。这种输注液可以在使用前用过滤器如1-5微米的过滤器在线过滤。在一些实施方案中，制剂制备成用来输注的无菌产品，其中灭菌通过过滤、热压、辐射或类似的方法实现。灭菌的各种方法是本领域中已知的。在一个实施方案中，制备制剂以使得其为无内毒素的。在一个实施方案中，制备制剂以使得其不含可能引起传染性海绵状脑病(BSE/TSE)的有机体。

本文也提供了用于治疗或者预防受试者中的肿瘤疾病的方法。在一些实施方案中，治疗或者预防受试者中的肿瘤疾病的方法包括向受试者静脉内施用如本文所述的治疗制剂从而实现肿瘤疾病的治疗或预防。在一些实施方案中，静脉内施用是通过经选择以在受试者中提供对于待治疗的肿瘤疾病的效力的剂量。在一些实施方案中，肿瘤疾病是侵袭性的或转移性的肿瘤疾病。在一些实施方案中，侵袭性的或转移性的肿瘤疾病选自胰腺癌、肝细胞癌、尤文氏肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑色素瘤、脑癌(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、雄激素依赖性前列腺癌、卵巢癌和非霍奇金氏淋巴瘤。在其它实施方案中，肿瘤疾病是非侵袭性肿瘤疾病。在一些实施方案中，非侵袭性肿瘤疾病选自非转移性乳腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、小细胞肺癌和急性淋巴细胞性白血病。

在治疗方法的一些实施方案中，该制剂包含约4％的辅酶Q10、约3％的DMPC和约1.5％的泊洛沙姆188。

在某些实施方案中，提供了用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者静脉内施用如本文所述的治疗制剂，从而肿瘤细胞的生长受到抑制。在一些实施方案中，静脉内施用是通过经选择以在受试者中提供抑制肿瘤细胞生长的效力的剂量。在一些实施方案中，制剂包含约4％的辅酶Q10、约3％的DMPC和约1.5％的泊洛沙姆188。

在一些实施方案中，肿瘤疾病是涉及Bcl-2蛋白家族的失调或与之相关的肿瘤性病症。

附图简要说明

本发明的各种实施方案将在以下参照附图进行描述，附图中：

图1描绘了CoQ10纳米颗粒的冻干样品，其如从左至右显示的标记为R、A、O和C型，其中R、O和C型各经受20轮的均质化处理，而A型经受40轮的均质化处理。

图2描绘了CoQ10纳米颗粒的冻干样品，其如从左至右显示的标记为G、Q、S和T型，其中G、Q、S和T型各经受20轮的均质化处理。

图3描绘了CoQ10纳米颗粒的冻干样品，其如从左至右显示的标记为U和V型，其中U和V型各经受20轮的均质化处理。

图4描绘了与得自CoQ10整体物质(bulk substance)的图谱叠加的A型冻干样品的XRDP图谱。

图5描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的C型冻干样品的XRDP图谱。

图6描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的G型冻干样品的XRDP图谱。

图7描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的O型冻干样品的XRDP图谱。

图8描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的Q型冻干样品的XRDP图谱。

图9描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的R型冻干样品的XRDP图谱。

图10描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的S型冻干样品的XRDP图谱。

图11描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的T型冻干样品的XRDP图谱。

图12描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的U型冻干样品的XRDP图谱。

图13描绘了与得自CoQ10整体物质的图谱叠加的V型冻干样品的XRDP图谱。

图14描绘了处理时间对于其中CoQ10为2.5g、DMPC为1.5g的胶体状纳米颗粒在46mL水中均质化的效应。

图15描绘了由本文公开的方法形成的脂质体，其中该脂质体是双层的复层脂质体。

图16描绘了由本文公开的方法形成的脂质体，其中该脂质体是双层的复层脂质体。

图17描绘了处理轮数对胶体纳米颗粒尺寸的效应，其中CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆的制剂比例为4∶1∶0、4∶2∶0和4∶3∶0。

图18描绘了处理轮数对胶体纳米颗粒尺寸的效应，其中CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆的制剂比例为4∶1∶1、4∶2∶1和4∶3∶1。

图19描绘了处理轮数对胶体纳米颗粒尺寸的效应，其中CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆的制剂比例为4∶3∶0.5、4∶3∶1和4∶3∶1.5。

图20描绘了处理轮数对胶体纳米颗粒的尺寸的效应，其中CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆的制剂比例为4∶2∶0.5、4∶2∶1和4∶2∶1.5。

图21以图形的形式描绘了基于制剂1(其不包含泊洛沙姆)的施用，随时间(min)的CoQ10平均血浆浓度。

图22以图形的形式描绘了基于制剂II(其包含泊洛沙姆)的施用，随时间(min)的CoQ10平均血浆浓度。

图23以图形的形式描绘了与单独化疗和与化疗结合相比，CoQ10纳米颗粒的IV制剂以4∶3∶1.5的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188比率治疗恶性绿色瘤的肝克隆的效力。

图24以图形的形式描绘了与单独化疗和与化疗结合相比，CoQ10纳米颗粒的IV制剂以4∶3∶1.5的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188比率治疗恶性绿色瘤的肺克隆的效力。

图25使用以OCR作为读出装置的图形形式描绘了两种CoQ10IV制剂对于HepG2细胞的效应。制剂I是4∶3∶0的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188和制剂II是4∶3∶1.5的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188。

图26使用以OCR作为读出装置的图形形式描绘了两种CoQ10IV制剂对于MCF-7细胞的效应。制剂I是4∶3∶0的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188和制剂II是4∶3∶1.5的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188。

图27使用以OCR作为读出装置的图形形式描绘了两种CoQ10IV制剂对于PC-3细胞的效应。制剂I是4∶3∶0的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188和制剂II是4∶3∶1.5的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188。

图28使用以OCR作为读出装置的图形形式描绘了两种CoQ10IV制剂对于PaCa2细胞的效应。制剂I是4∶3∶0的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188和制剂II是4∶3∶1.5的CoQ10∶DMPC∶泊洛沙姆188。

图29描绘了用以测定处理后24小时凝胶1中的半胱天冬酶水平的蛋白质印迹。

图30描绘了用以测定处理后24小时凝胶1中的肌动蛋白水平的蛋白质印迹。

图31描绘了用以测定处理后24小时凝胶2中的半胱天冬酶水平的蛋白质印迹。

图32描绘了用以测定处理后24小时凝胶2中的肌动蛋白水平的蛋白质印迹。

图33描绘了在PC3中观察到的标准化的半胱天冬酶3蛋白质水平。

图34描绘了在PaCa2中观察到的标准化的半胱天冬酶3蛋白质水平。

图35描绘了在HepG2细胞中观察到的未标准化的半胱天冬酶3蛋白质水平。

图36描绘了在HDfa细胞中观察到的标准化的半胱天冬酶3蛋白质水平。

图37描绘了在MiaPACA2研究中未处理的NSG小鼠的结果。

图38描绘了在MiaPACA2研究中未处理的NSG小鼠的结果。

图39描绘了在MiaPACA2研究中用赋形剂对照处理的NSG小鼠的结果。

图40描绘了在MiaPACA2研究中经约4小时通过静脉内输注施用0.5mg/kg的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂处理的NSG小鼠的结果。

图41描绘了在MiaPACA2研究中经约4小时通过静脉内输注施用5mg/kg的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂处理的NSG小鼠的结果。

图42描绘了在MiaPACA2研究中经约4小时通过静脉内输注施用10mg/kg的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂处理的NSG小鼠的结果。

图43描绘了在MiaPACA2研究中经约4小时通过静脉内输注施用25mg/kg的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂处理的NSG小鼠的结果。

图44描绘了在MiaPACA2研究中经约4小时通过静脉内输注施用50mg/kg的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂处理的NSG小鼠的结果。

图45描绘了用单一阿霉素疗法治疗的小鼠的存活率结果。

图46描绘了用阿霉素和4∶3∶1.5CoQ10IV制剂联合疗法治疗的小鼠的存活率结果。

图47描绘了相对于用于雄性和雌性大鼠和狗的剂量，CoQ10的平均肝浓度。

本发明的详细说明

本发明涉及水溶性差的活性药剂如CoQ10的静脉内制剂。

本发明的静脉内制剂允许递送精确量的活性治疗剂如CoQ10到血流中以输送到器官如肝脏和心脏及其它组织(包括肿瘤)中。本发明提供了临床和治疗有效的且可用的例如CoQ10的静脉内制剂，其在通常的环境温度下是稳定的且在至少12个月的时期内保持基本不变的分散特性。

为了优化可读性的目的和帮助理解本文所述的本发明，可能有益的是考虑以下本文中所用的术语和短语的定义。

I.定义

按照本公开及如本文中所使用的，以下术语定义为具有以下含义，除非明确表明为其它情况。

如本文中所用的，“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文清楚地指示为其它的情况。

如本文中所用的，“药学上可接受的”成分是适合用于人和/或动物而无过度的副作用(如毒性、刺激性和变态反应)、与合理的利益/风险比相称的成分。

如本文中所用的，术语“安全和治疗有效量”是指当以本公开的方式使用时，足以产生与合理的利益/风险比相称的希望的治疗反应而无过度副作用(如毒性、刺激性和变态反应)的成分量。“治疗有效量”是指足以产生希望的治疗反应的本公开化合物的量。例如，加速的伤口愈合、疼痛和疲劳的减轻。具体的安全和有效量或治疗有效量随着如待治疗的特定病症、患者的生理状况、待治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗的持续时间、同时治疗(如果有的话)的特性及采用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构的因素而变化。

“治疗”是以防止疾病的发生或改变疾病的病理或症状为目的的干预。因此，“治疗”是指治疗性的处理和预防性或防止性的措施。需要治疗的那些是指已经患有病症诉那些以及将发生病症的那些。如本文中所用的，“改善”或“治疗”指的是接近于标准化值(例如在健康患者或个体中获得的值)的症状，例如，如使用常规统计检验测定的，与标准化值的差异小于50％，在一些实施方案中与标准化值的差异小于约25％，在其它实施方案中与标准化值的差异小于10％，和在再其它的实施方案中存在与标准化值无明显差异的症状。

如本文中所用的，“改善的症状”或“治疗的症状”是指接近于标准化值的症状，例如，如使用常规统计检验测定的，与标准化值的差异小于50％，在一些实施方案中与标准化值的差异小于约25％，在其它实施方案中与标准化值的差异小于10％，和在再其它的实施方案中存在与标准化值无明显差异的症状。

如本文中所用的，“调理素作用(opsonization)”是指本文所述的亲脂性生物活性剂经标记以被吞噬细胞摄取和破坏的过程。调理素作用包括调理素与生物活性剂的结合。在调理素结合到膜上后，吞噬细胞被吸引至活性剂。调理剂是用作吞噬作用过程的结合增强剂的任何分子。

如本文中所用的，术语“调理素作用缩减剂”是指与活性剂一起起到降低调理素用作吞噬作用过程的结合增强剂的能力的任何试剂。

按照本公开，提供了用于改善亲脂性生物活性剂(其在本文中也可称为疏水性生物活性剂)的施用的制剂。如本文中所用的，“亲脂性生物活性剂”或“疏水性生物活性剂”包括不溶于或基本上不溶于水的试剂。特别地，如本文中所用的亲脂性生物活性剂在水中具有低于约1000份的水中约1份生物活性药物的溶解度。

如本文中所用的，术语“胶体状”是指细分的状态，暗示分散于介质中的分子或多分子颗粒在至少一个方向上具有粗略地在1nm至1μm之间的尺寸。

如本文中所用的，“分散体”或“胶体状分散体”是指其中任何特性(如固体、液体或气体)的胶体大小的颗粒分散于不同组成或状态的连续相中。在静脉内药物递送中，该连续相基本上是水且分散的颗粒可以是固体(悬浮液)或不混溶的液体(乳液)。

如本文中所用的，“超冷熔体”是指均质化后活性剂的状态，其中在低于活性剂整体物质的熔点的温度下，胶体颗粒不是处于固体或晶体形式而是处于无定形状态。

如本文中所用的，“冻干保护剂”是指药学可接受的赋形剂，其在冻干处理、后续的储存和重构过程中保护分散的活性剂对抗去稳定化的条件。

术语“胶体颗粒”、“分散体颗粒”、“纳米分散体颗粒”和“胶体状分散体颗粒”在本文中都可互换使用，且是指活性剂分散成整块状态或熔融状态的纳米颗粒的分散形式。

如本文中用于指称CoQ10的术语“制剂”包括泊洛沙姆，除非另外地指明。

通过本发明的方法治疗的“患者”或“受试者”可以指人或非人类动物，优选哺乳动物。应注意，本文描述的临床观察是对于人类受试者进行的，且在至少一些实施方案中，受试者是人。

“治疗有效量”意思是当施用于患者以治疗疾病时，足以实现这种对疾病的治疗的化合物量。当施用以预防疾病时，该量足以避免或延迟疾病的发作。“治疗有效量”随化合物、疾病及其严重性和待治疗的患者的年龄、体重等等而变化。

“预防”或“防止”是指获致疾病或障碍的风险的降低(即使得疾病的至少一种临床症状不在可能暴露于或易患疾病但还未发生或显示该疾病的症状的患者中发生)。

术语“预防性的”或“治疗性的”治疗是指向受试者施用一种或多种所述的组合物。如果在不希望的病症(例如，疾病或主体动物的其它不希望的状态)的临床表现之前施用，则治疗是预防性的，即保护主体免于发生不希望的病症，而如果在不希望的病症表现出来之后施用，该治疗是治疗性的(即，意图消除、改善或维持现有的不希望的病症或其副作用)。

术语“治疗效果”是指在动物，特别是哺乳动物和更特别是人类中由药理活性物质引起的局部或系统效应。因此该术语意思是任何意图用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或用于在动物或人中增强希望的生理或精神进展或状态的物质。短语“治疗有效量”意思是以可应用于任何治疗的合理效益/风险比产生一些希望的局部或系统效应的这种物质的量。在某些实施方案中，化合物的治疗有效量取决于其治疗指数、溶解性等等。例如，本发明的方法公开的某些化合物可以以产生适用于这种治疗的合理效益/风险比的足够量施用。

术语“障碍”和“疾病”包含性地使用，且是指与身体任何部分、器官或系统(或其任何组合)的正常结构或功能的任何偏离。特定的疾病通过特征性的症状和征兆表现，包括生物的、化学的和物理的变化，且通常与多种其它的因素(包括，但不限于人口统计学的、环境的、职业的、遗传的和病史的因素)相关。某些特征性的征兆、症状和相关因素可以通过多种方法量化以产生重要的诊断信息。

术语“表达”在本文中用于指从DNA产生多肽的过程。该过程涉及基因转录成mRNA和该mRNA翻译成多肽。取决于其使用的语境，“表达”可以指RNA、蛋白质或这两者的产生。

术语“基因的表达水平”或“基因表达水平”是指细胞中由基因编码的mRNA以及前mRNA新生转录本、转录本加工中间体、成熟mRNA和降解产物的水平，或者蛋白质的水平。

将详细地参照本发明的优选实施方案进行说明。尽管本发明结合优选的实施方案进行描述，但应理解，这并非意图将本发明限制于这些优选实施方案。相反，意图的是覆盖可以包括在如所附权利要求限定的本发明精神和范围内的替代、改进和等同方式。

在本申请中，在其中存在一系列述及的数值的所有情况中，应理解任何所述及的数值可以是数值范围的上限或下限。还应理解，本发明包括所有的这些数值范围，即具有该数值上限和数值下限的组合的范围，其中各该上限和下限的数值可以是本文中述及的任何数值。

II.组合物

本公开提供了用于治疗和预防癌症的CoQ10组合物。本发明的组合物可以以其本身或以其中本发明的组合物与适宜的载体或赋形剂混合的药物组合物的形式施用。在治疗表现出目标障碍的患者时，施用治疗有效量的一种或多种药剂如这些药剂。治疗有效的剂量是指导致患者的症状缓解或生存延长的化合物的量。

来自许多不同物种的受试者可以用本发明的组合物治疗。这些动物的非穷尽的示例性列表包括哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、马、牛、狗、猫和灵长类(如猴、猿和人类)。已知患有肌肉疲劳、疼痛、创伤等等的那些动物受试者可能适合用于本公开的应用。特别地，具有损伤、手术、关节炎、肌肉疲劳、癌症等等的人类患者是适合用于本文公开的本发明用途的动物受试者。通过使本文教导的方法适应于医学或兽医学中已知的其它方法(例如，根据受试动物的体重调整所施用物质的剂量)，本发明中使用的组合物可以方便地为用于其它动物中而进行优化。

本发明的适宜施用途径可以包括肠胃外递送，包括，举例来说，静脉内、肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。在一个实施方案中，本文提供的组合物可以通过直接注射到肿瘤而施用。在一些实施方案中，本发明的制剂可以通过静脉内注射或静脉内输注施用。在一个实施方案中，本发明的组合物通过静脉内注射施用。在一个实施方案中，本发明的组合物通过静脉内输注施用。在施用途径为例如静脉内输注的情况下，本文提供了其中IV输注液包含约40mg/mL浓度的活性剂(例如辅酶Q10)的实施方案。在组合物通过IV输注施用的情况下，其在磷酸盐缓冲盐水中稀释。在一些实施方案中，可以组合一种或多种施用途径，例如，静脉内和肿瘤内，或者静脉内和经口，或者静脉内和口服，或者静脉内和透皮或透粘膜。

本文描述的组合物可以以任何合适的制剂施用于受试者。例如，CoQ10可以配制用于肠胃外递送，例如用于皮下、静脉内、肌肉内或肿瘤内注射。组合物可以以单次浓注、多次注射或通过连续输注(例如，静脉内或通过腹膜透析)施用。对于肠胃外施用，组合物可以配制成灭菌的无热原形式。本发明的组合物也可以通过简单地将该组合物添加到包含细胞的流体中而体外施用于细胞(例如应用于细胞中或体外培养物中的Bcl-2产生)。

为实施本发明而使用药学可接受的载体将本文公开的化合物配制成适合全身施用的剂量是在本公开的范围内。通过适当的载体选择和适宜的制备实践，本发明的组合物，特别是配制为溶液的那些，可以肠胃外施用，如通过静脉内注射。

这些化合物的毒性和治疗效力可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学过程测定，例如测定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效应之间的剂量比率为治疗指数，且其可表示为LD50/ED50比。表现出大的治疗指数的化合物可能是理想的。从这些细胞培养物试验和动物研究获得的数据可以用于确定在人体中使用的剂量范围。这些化合物的剂量可以在具有很少或没有毒性而包括ED50的循环浓度范围内。剂量可以根据采用的剂型和利用的施用途径在该范围内变化。

适用于本发明中的药物组合物包括其中以有效量包含活性成分以实现预期的目的的组合物。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是按照本文提供的详细公开内容。除了活性成分外，这些药物组合物可以包含适宜的药学可接受的载体，包括有助于将活性化合物加工成可以作为药物使用的制剂的赋形剂和辅剂。配制用于静脉内施用的制剂可以为胶体状分散体的溶液的形式。

用于肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性化合物的水性溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备为适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酸酯，或者脂质体。水性注射悬浮液可以包含提高悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或提高化合物的溶解性的试剂以允许制备高度浓缩的溶液。

III.制剂

本发明提供了如上所述适合静脉内施用于受试者的包含疏水活性剂如辅酶Q10(CoQ10)的治疗制剂。通过高压均质化，活性剂(例如，CoQ10)颗粒被减小从而产生足够小以通过200nm无菌滤器的颗粒。足够小以通过200nm无菌滤器的颗粒可以静脉内注射。这些颗粒比血细胞小得多而因此不会栓塞毛细管。例如红细胞为6mm X 2mm的圆盘。该颗粒分散并被稳定剂包装或包围。尽管不希望限制于任何理论，据认为稳定剂被吸引到疏水活性剂上以使得分散的疏水活性剂颗粒被稳定剂包围从而形成悬浮液或乳液。悬浮液或乳液中的分散颗粒包括稳定剂表面和由固体颗粒形式(悬浮液)或不可混溶的液体形式(乳液)的疏水活性剂组成的核心。在某些方面，分散的颗粒占据在脂质体的亲水性区域中。

本文提供的分散的胶体体系提供了优于现有技术的特定性能优势。例如，本发明允许制剂中的高药物载量而无需使用共溶剂。另外，获得了高的和相对可再现的血浆水平而不依赖于内源的低密度脂蛋白载体。更重要的是，由于疏水活性剂的胶体颗粒的被动累积，本发明允许在实体肿瘤中维持高药物水平。

本静脉内制剂主要包含连续的水相和分散的固体物质(悬浮液)或分散的不混溶的液体(乳液)。分散的胶体体系(其中颗粒大部分由活性剂(药物)本身组成)通常可以比连续的增溶体系每单位体积递送更多的药物，如果可以使得该体系足够稳定。本发明提供了水溶性差的活性剂如CoQ10的胶体状分散体。

通过利用机械装置如微射流均质机，颗粒尺寸通过高压连续均质化而减小，从而在喷射系统中形成胶体尺寸的小滴，或者通过在受限制的和曲折的通道中以高速率流动的液体中剪切颗粒而减小。需要大量的能量以切割整体颗粒本身。较小的颗粒增加了活性剂的界面面积。表面活性剂用于降低界面能从而稳定该分散体。颗粒尺寸决定着总界面面积和必须适应于获得稳定体系的界面能。随着颗粒尺寸下降，需要更多的能量来产生该颗粒，且由于总表面积上升，表面活性剂必须适应于更高的界面能。

通过如本文中所例示的高压均质化，活性剂例如CoQ10的颗粒尺寸减小到低于200nm。在一些实施方案中，颗粒尺寸减小到10nm至200nm或10nm至100nm或更优选30nm至80nm。在一些实施方案中，所获得的胶体状活性剂(例如CoQ10)颗粒为如本文中定义的无定形超冷状态。

在某些实施方案中，分散的CoQ10颗粒通过冻干过程结晶以产生其中活性剂核心为晶体形式的纳米分散体颗粒(参见图1-3)。偏振光学显微术(PLM)或X-射线粉末衍射(XRDP)用于确认CoQ10胶体状分散体的晶体性并与整体CoQ10的XRDP进行比较(参见图4-13)。在R型中，如图1所示，包含5.0wt％的CoQ10、3.3wt％的泊洛沙姆和91wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图1中左侧第一个小瓶中所示的颗粒。如图9中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在A型中，如图1中左侧第二个小瓶所示，包含3wt％的CoQ10、1.8wt％的类脂SPC-3和95.2wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环以减小颗粒尺寸。然后颗粒冻干以产生图1中左侧第二个小瓶中所示的颗粒。如以下图4中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在O型中，如图1中所示，包含5.0wt％的CoQ10、3.0wt％的DMPC和92wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图1中左侧第三个小瓶中所示的颗粒。如以下图7中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在C型中，如图1中所示，包含5.0wt％的CoQ10、3.3wt％的泊洛沙姆和91wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图1中左侧第四个小瓶中所示的颗粒。如图5中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在G型中，如图2中所示，包含5.0wt％的CoQ10、3.0wt％的类脂SPC-3和92wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图2中左侧第一个小瓶中所示的颗粒。如图6中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在Q型中，如图2中所示，包含5.0wt％的CoQ10、2.5wt％的DMPC、0.5wt％的去氧胆酸钠和92wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图2中左侧第二个小瓶中所示的颗粒。如图8中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在S型中，如图2中所示，包含7.5wt％的CoQ10、4.5wt％的DMPC和88wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图2中左侧第三个小瓶中所示的颗粒。如图10中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在T型中，如图2中所示，包含7.5wt％的CoQ10、5.0wt％的泊洛沙姆和87.5wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图2中左侧第四个小瓶中所示的颗粒。如图11中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在U型中，如图3中所示，包含7.5wt％的CoQ10、4.0wt％的DMPC、1.0wt％的泊洛沙姆188和87.5wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图3中左侧第一个小瓶中所示的颗粒。如图12中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。在V型中，如图3中所示，包含3.0wt％的CoQ10、1.5wt％的DMPC和95.5wt％的水的制剂在微射流均质机中经过20次循环，且然后冻干以产生图3中左侧第二个小瓶中所示的颗粒。如图13中所示的XRDP表明，该CoQ10颗粒是晶体。

在冻干颗粒的过程中，干燥器冷却至-35℃。3毫升的上述各种制剂一式两份地加入5mL的血清小瓶中。血清瓶塞置于顶上但留出水蒸汽逸出的空隙。制剂置于-78℃的冷冻箱中1小时以快速冷冻。在这一时间后，全部转移到干燥器的中间架子上。立即启动真空。16小时后，温度从-35℃调整到-30℃。在24小时后，温度从-30℃调整到-28℃。在2小时后，温度从-28℃调整到-26℃。在4小时后，温度进一步调整到-26℃至-25℃之间。在达到-25℃后，小瓶加塞并释放真空到环境空气中。小瓶被绑扎并如图1-3中所示对干燥的产物照相。

在减小分散体颗粒尺寸的过程中，可能希望的是CoQ10混合物通过微射流均质机数轮以获得希望的颗粒尺寸。在通过具有75μm通道的F12Y相互作用室的M110P微射流均质机一轮后，产生小于200nm平均直径的颗粒。在20轮后，颗粒的平均直径小于50nm(参见图14)。制剂包含5g CoQ10、3g DMPC和92mL水。本领域普通技术人员可以理解，CoQ10、DMPC和水的量可以根据希望的治疗用途而调节。微射流均质机在25,000PSI的最大压力下操作。在某些实施方案中，优选的是添加分散稳定剂和调理素作用缩减剂中的至少一种。在某些实施方案中，胶体颗粒使用分散稳定剂和调理素作用缩减剂两者来制备。优选的分散稳定剂包括聚乙氧基化的(即聚乙二醇化的)蓖麻油(Cremophor

EL)、聚乙氧基化的氢化蓖麻油(Cremophor

RH 40)、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(聚乙二醇维生素E、维生素E TPGS)、聚山梨醇酯(Tweens

)、山梨聚糖脂肪酸酯(Spans

)、胆汁酸和胆汁酸盐及DMPC，而优选的调理素作用缩减剂包括各种链长的聚乙二醇、多糖、其它含PEG的共聚物、poloxamine或泊洛沙姆如泊洛沙姆188。在某些实施方案中，肝素也构成合适的调理素作用缩减剂。泊洛沙姆提供了亲水表面以在施用后降低颗粒调理素作用。泊洛沙姆也起到颗粒表面改性剂的作用以添加大体积链而通过空间相互作用降低调理素作用。泊洛沙姆188(PluronicF68，Lutrol

F68)大约在中央嵌段具有28个PPG单元和在末端嵌段具有79个PEG单元。疏水的中央嵌段将分子锚定至颗粒上，且PEG末端嵌段从颗粒延伸。调理素作用通过PEG链的亲水性和通过链的空间(空间填充)效应(即蛋白质不能达到表面)而降低。

通过本文中进一步描述的方法，本发明提供了适合静脉内施用于受试者的治疗制剂。该治疗制剂包含水性溶液。在本发明的某些实施方案中，水性溶液是水。该水性溶液可以起到胶体体系的分散介质或用于肠胃外施用和胶体颗粒递送的制剂介质中的任一种或这两者的作用。作为分散介质，水性溶液可以包含其它水溶性的或水可分散的稳定剂，等渗剂如甘油或木糖醇，冻干保护剂如蔗糖、葡萄糖、海藻糖等，电解质，缓冲剂，抗絮凝剂如柠檬酸钠、焦磷酸钠或十二烷基硫酸钠或防腐剂。

冻干保护剂包括，但不限于，由糖、多元醇(例如，糖醇)和氨基酸组成的组。优选的冻干保护剂包括糖如蔗糖、海藻糖和葡萄糖。其它合适的糖包括乳糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神经氨酸、氨基糖(如葡糖胺、半乳糖胺、N-甲基葡糖胺(“甲葡胺”))、多元醇(如甘露醇和山梨糖醇)及氨基酸(如精氨酸和甘氨酸)。

作为制剂介质，水性溶液可以包括Hank’s溶液、林格氏液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水缓冲液或其它合适的盐或组合以获得用于肠胃外递送制剂的适宜pH和摩尔渗透压浓度。水性溶液可以包含提高溶液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。

本发明的治疗制剂包含疏水的或另外地水溶性差的活性剂。疏水活性剂分散于水性溶液中从而形成其中疏水活性剂的纳米分散体颗粒被分散稳定剂覆盖或包装或环绕的胶体状分散体，以形成活性剂(例如，CoQ10)颗粒的纳米分散体。纳米分散的活性剂(例如，CoQ10)颗粒具有由所述稳定剂包围的疏水活性剂形成的核心。类似地，在某些方面中，稳定剂是同时具有亲水性和疏水性部分的磷脂。磷脂在均质化时形成脂质体或其它纳米颗粒。在某些方面中，这些脂质体是双层的单层脂质体，而在其它方面中，脂质体是双层的复层脂质体。分散的活性剂(例如，CoQ10)颗粒分散于由磷脂形成的脂质体的双层结构的亲脂性部分中。在其它的某些方面中，脂质体的核心，如活性剂(例如，CoQ10)颗粒的纳米分散体的核心由疏水活性剂形成，而外层由磷脂的双层结构形成。在某些实施方案中，胶体状分散体通过冻干过程处理，从而纳米颗粒分散体转化成干粉。

在本发明的某些实施方案中，疏水活性剂是辅酶Q10(CoQ10)。辅酶Q10，在本文中也称为CoQ10，也以泛醌或泛癸利酮为人所知。CoQ10是本领域公知的且在国际公开No.WO 2005/069916中进一步描述，其全部公开内容通过引用并入本文。CoQ10是存在于真核细胞的线粒体电子传递系统中的一系列聚异戊二烯基2，3-二甲氧基-5-甲基苯醌(泛醌)之一。人体细胞专门地产生CoQ10且其存在于细胞中和所有人体细胞的线粒体膜中，在具有高能量需求的器官如肝脏和心脏中以最高水平存在。CoQ10的身体池(body pool)据估计为约2克，其中超过50％是内源的。每天需要大约0.5克的CoQ10来自于饮食或生物合成。CoQ10以吨的数量由全世界的补充剂市场产生出来且可以从Kaneka(具有位于帕萨迪纳，德克萨斯的工厂)和Takasagoshi，日本获得。

CoQ10在人体中的组织分布和氧化还原状态已经被表征。典型地，具有高能量需求或代谢活性的组织如心脏、肾脏、肝脏和肌肉具有相对高的CoQ10浓度。血浆中的大部分CoQ10作为还原的泛醇存在。组织中CoQ10的主要部分作为氢醌或泛醇以还原形式存在。例外的是脑和肺。氧化状态推测是组织中氧化应激增加的反映。更具体地，在心脏、肾脏、肝脏、肌肉、肠和血液(血浆)中，分别约61％、75％、95％、65％、95％和96％的CoQ10是还原形式。

CoQ10是高度亲脂的且很大程度上是不溶于水的。由于其在水中的不溶性、在脂质中的有限溶解性和相对大的分子量，口服施用CoQ10的吸收效率是差的。Bhagavan等Free Rad.Res.40：445-453(2006))报道，在大鼠中，仅约2-3％的口服施用的CoQ10被吸收且在肠的吸收过程中或者在肠吸收之后CoQ10被还原成泛醇。在Matthews等进行的研究(Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：8892-8897(1998))中，发现CoQ10摄取在一些组织中是年龄依赖的。例如，在幼年大鼠中，血浆、肝和脾浓度在给药四天后提高，但在心脏和肾中没有观察到提高。类似地，在1-2月大的动物中口服施用不提高脑中的CoQ10浓度。但是，CoQ10施用于12个月大和24个月大的大鼠导致CoQ10在脑组织中以氧化和还原形式蓄积。有趣的是，在局部缺血-再灌注损伤后，CoQ10的产生在幼年大鼠而不在老年大鼠中受到刺激。

在本发明的一个实施方案中，疏水活性剂是CoQ10、CoQ10的代谢物、CoQ10的结构块、CoQ10的类似物或CoQ10的衍生物。CoQ10的类似物包括不具有或具有至少一个异戊二烯重复单元的类似物。CoQ10具有以下结构：

其中x是10。在本发明中，CoQ10可以包括CoQ10的衍生物，其中x代表4-10个的多个异戊二烯单元，或6-10个的多个异戊二烯单元，或8-10个的多个异戊二烯单元，或9-10个异戊二烯单元。CoQ10包括完全氧化的形式(也称作泛醌)、部分氧化的形式(也称作半醌或泛半醌)或者完全还原的形式(也称作泛醇)，或者它们的任何混合物或组合。

CoQ10的结构块包括CoQ10的任何元件或合成前体，优选生物相关前体。因此，CoQ10的结构块包括，但不限于，苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯基丙酮酸、苯基乙酸、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸、香草酸、4-羟基苯甲酸、甲羟戊酸、法呢基、2，3-二甲氧基-5-甲基-p-苯醌以及对应的酸或其离子。实验数据表明，CoQ10生物合成的结构块，如用于苯醌环生物合成的前体及用于类异戊二烯重复单元生物合成的那些和它们与苯醌环的连接物，可以单独地施用或组合地施用于靶细胞以调节细胞凋亡抑制剂Bcl-2的表达和/或细胞凋亡促进剂半胱天冬酶-3的表达。参见，例如，美国专利申请系列号12/778,094和本文中提供的实施例。

CoQ10的代谢物包括任何已知的CoQ10的代谢物。参见，例如，Turunen，M.等，Biochemica et Biophysica Acta 1660：171-199(2004)，其全部内容通过引用并入本文。主要代谢物已经确认为具有带缩短到5-7个原子的侧链的芳香环。这种代谢物显示如下。该代谢物可以任选地在碳4或碳1处磷酸化。

CoQ10的衍生物包括结构上与CoQ10等同的任何化合物，除了一个原子被另一个原子或原子团替代外。

适合于引入这一胶体体系中的其它疏水活性剂包括麻醉剂如布坦卡因、福吗卡因、利多卡因、丙胺卡因、丁卡因和依托咪酯；抗生素如磷霉素、膦胺霉素和利福喷丁；抗高血压药如米诺地尔、双氢麦角碱和恩屈嗪；抗低血压药如双氢麦角胺；系统抗真菌剂如酮康唑、咪康唑和灰黄霉素；消炎剂(antiphiogistics)如消炎痛、双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬和吡洛芬；抗病毒剂如阿昔洛韦、阿糖腺苷和免疫球蛋白；ACE抑制剂如卡托普利和依那普利；β-受体阻滞剂如普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、吲哚洛尔、氧烯洛尔和拉贝洛尔；支气管扩张剂如异丙托溴铵和索布瑞醇；钙拮抗剂如地尔硫

氟桂嗪、维拉帕米、硝苯地平、尼莫地平和尼群地平；强心苷类如洋地黄毒苷、地高辛、甲基地高辛和醋地高辛；头孢菌素类如头孢唑肟、头孢氨苄、头孢噻吩和头孢噻肟；细胞抑制剂如氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、长春新碱、丝裂霉素C、阿霉素、博来霉素、顺铂、紫杉醇、本可麦定(penclomedine)和雌氮芥；催眠药如氟西泮、硝西泮和劳拉西泮；精神药物如奥沙西泮、安定和溴西泮；类固醇激素如可的松、氢化可的松、强的松、强的松龙、地塞米松、孕酮、孕烷醇酮、睾酮和十一酸睾酮；血管扩张剂如吗多明、肼苯哒嗪和双肼酞嗪；脑血管扩张药如双氢麦角碱、环烟酯和长春蔓胺；泛醌类及它们的类似物如泛癸利酮和阿托伐醌；亲脂性维生素如维生素A、E、D、K及其衍生物；杀昆虫剂、除草剂和杀虫剂如乙酰甲胺磷、氟氯氰菊酯、甲基谷硫磷(azinphosphomethyl)、氯氰菊酯、芬氯磷、氯菊酯(permelthrin)、胡椒醛、胺菊酯和氟乐灵。在其它的某些实施方案中，胶体体系包含mTor抑制剂、EGFr和FGF类似物。

活性剂可以位于胶体颗粒的核心中，在此处它们溶化、溶解或分散在基质中和/或在包围颗粒核心的稳定剂层中，和/或可以吸附到胶体颗粒的表面上。生物活性物质可以是溶解的或者可以是晶体或无定形的或者任何这些状态的混合物。治疗制剂也可以包括分散稳定剂和调理素作用缩减剂中的至少一种。胶体颗粒可以是如本文所述的脂质体且也可以包含其它活性剂或其它非活性剂或者其它疏水或亲水试剂。

由于颗粒尺寸随着通过均质化过程而减小，活性剂(例如CoQ10)整体物质分散成纳米颗粒提高了界面能。分散稳定剂(例如DMPC)对活性剂(例如CoQ10)纳米颗粒的亲和性导致分散稳定剂(例如DMPC)包装该纳米颗粒并形成活性剂(例如CoQ10)纳米分散体。分散稳定剂通过调和高界面能并从而防止或减轻分散的活性剂(例如CoQ10)颗粒的合并而稳定活性剂(例如CoQ10)纳米分散体。在本发明的某些实施方案中，脂质体由胶体状分散体形成，其中磷脂稳定剂形成疏水生物活性剂或物质的分散颗粒周围的双层体系。在某些实施方案中，脂质体是如图15中所示的双层的单层脂质体。在其它实施方案中，脂质体是如图15中所示的双层的复层脂质体。在某些实施方案中，分散的疏水活性剂颗粒在该双层的亲脂性部分内。在其中脂质体为复层的其它某些实施方案中，疏水活性剂在该双层的亲脂性部分中。在其中脂质体为复层的其它某些实施方案中，分散的疏水活性剂在脂质体双层的亲脂性部分内和第二试剂在位于复层脂质体的双层部分之间的亲水性部分内。

适当地选择表面活性剂或表面活性剂的混合物可以产生其中贮存产品(shelfproduct)是液体表面活性剂中的药物浓溶液且在加入输注流体时，通过表面活性剂获得的界面能降低足以乳化该系统为胶体体系的制剂。分散稳定剂可以选自聚乙氧基化(即，聚乙二醇化)蓖麻油(Cremophor

EL)、聚乙氧基化氢化蓖麻油(Cremophor

RH 40)、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(聚乙二醇化维生素E、维生素E TPGS)、聚山梨醇酯(Tweens

)、山梨聚糖脂肪酸酯(Spans

)、胆汁酸和胆汁酸盐及二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)。分散稳定剂在尺寸减小的颗粒的界面处组织化并降低界面能，从而使得分散体更稳定。

磷脂对于CoQ10具有高亲和性，如由这两者在生物膜中的紧密关联所证明的。分散稳定剂包括在制剂中以至少随着颗粒尺寸减小而降低界面能。在胶体状分散体中，纳米分散体颗粒包括由稳定性包围的活性剂核心。分散稳定剂通常是两亲性物质，即具有疏水的和亲水的分子部分的物质。在颗粒表面处，两亲性物质主要地以使得分子的疏水性部分伸入核心内和亲水性部分伸入周围分散介质中的方式排列。因此表面是亲水的。

其它合适的磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂酰乙醇胺及其组合和与它们的组合。

在一个实施方案中，分散稳定剂不是选自卵磷脂、聚山梨醇酯80和olacta的试剂。在一个实施方案中，分散稳定剂不是卵磷脂。在一个实施方案中，分散稳定剂不是聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，分散稳定剂不是olacta。

本发明的制剂可以进一步包括调理素作用缩减剂。调理素作用缩减剂可以选自各种链长的聚乙二醇、多糖、其它含PEG的共聚物、poloxamine或泊洛沙姆如泊洛沙姆188。如本文中所定义的，调理素作用缩减剂是指与活性剂结合起到降低调理素用作吞噬作用过程的结合增强剂的能力的任何非活性剂。该非活性剂必须包括在FDA的非活性成分列表中，其通过引用全文在此并入。非活性剂必须不包括聚乙二醇化非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80、聚乙氧基化蓖麻油及分别脂肪醇和酸的PEG醚和酯)，因为这些物质可以引起极端的超敏性反应。因此，在一个实施方案中，调理素作用缩减剂不是聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，调理素作用缩减剂不是聚乙氧基化蓖麻油。在一个实施方案中，调理素作用缩减剂不是脂肪醇的PEG醚。在一个实施方案中，调理素作用缩减剂不是脂肪酸的PEG酯。

例如，大于10nm的胶体尺寸颗粒不被肾脏过滤且进行循环直到它们通过主动过程清除或者它们通过血管内皮细胞之间的间隙扩散而渗出。网状内皮系统(RES)或单核吞噬细胞系统(MPS)的吞噬细胞通过内吞作用捕获胶体颗粒。这些细胞包括与肝脏(库普弗细胞)、脾、淋巴结(血管周巨噬细胞)、神经系统(小胶质细胞)和骨(破骨细胞)相关的巨噬细胞。调理素(例如，免疫球蛋白、补体成分、其它血清蛋白)的非特异性连接将该颗粒标记为外源的。内涵体中的酶和氧化反应性环境会破坏捕获的颗粒。

胶体颗粒的调理素作用可以通过多种因素(包括小于100nm的粒径、中性或负表面电荷和大体积疏水链的吸附或键合)被降低，导致更长的循环时间。至实体肿瘤的胶体药物递送应用的一个重要元素是由于肿瘤的独特解剖和生理特性。肿瘤的毛细管网络是曲折的，具有宽的内皮细胞间连接(100-780nm)，且肿瘤没有淋巴引流。这些特性导致胶体颗粒被动地靶向于肿瘤。颗粒通过渗漏的细胞连接渗出并保持在肿瘤间质中。

调理素作用缩减剂包括在制剂中以改变对颗粒的生物反应。本发明提供了其中由调理素作用清除胶体药物颗粒的能力通过在本文给出的制剂中包含调理素作用缩减剂而降低的方法。包含调理素作用缩减剂导致在肿瘤中的药物水平高于血浆中。

在一个实施方案中，本发明的制剂不包含聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，本发明的制剂不包含聚乙氧基化蓖麻油。在一个实施方案中，本发明的制剂不包含脂肪醇的PEG醚。在一个实施方案中，本发明的制剂不包含脂肪酸的PEG酯。在一个实施方案中，本发明的制剂不包含选自卵磷脂、聚山梨醇酯80和olacta的试剂。在一个实施方案中，本发明的制剂不包含卵磷脂。在一个实施方案中，本发明的制剂不包含聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，本发明的制剂不包含olacta。

已发现且在本文中公开，活性剂和非活性剂的比率对于颗粒尺寸的控制不是重要的。为了获得分散稳定剂和调理素作用缩减剂的益处而不负面地影响其任一的益处或者颗粒尺寸的益处，可以调节活性剂(例如，CoQ10)、分散稳定剂(例如，DMPC)和调理素作用缩减剂(例如，泊洛沙姆)的比率以适应于希望的颗粒尺寸和静脉内施用时所希望的对于胶体状分散体的生物反应。在某些实施方案中，制剂经制备以使得活性剂(例如，CoQ10)、分散稳定剂(例如，DMPC)和调理素作用缩减剂(例如，泊洛沙姆)各自的重量/体积比分别为4％、3％和1.5％。在其它的某些实施方案中，活性剂(例如，CoQ10)、分散稳定剂(例如，DMPC)和调理素作用缩减剂(例如，泊洛沙姆)的重量/体积比分别为8％、6％和3.0％。在某些实施方案中，制剂经制备以使得CoQ10、DMPC和泊洛沙姆各自的重量/体积比分别为4％、3％和1.5％。在其它的某些实施方案中，CoQ10、DMPC和泊洛沙姆的重量/体积比分别为8％、6％和3.0％。

疏水活性剂在高于其熔点的温度下进行分散以利于分散。CoQ10的熔点为大约48℃。本文中预想熔点可以变化且可以例如包括从47.5℃至49.5℃的范围的任何值，例如47.5℃、48.0℃、48.5℃、49.0℃或49.5℃。在某些实施方案中，CoQ10在65℃的水浴中混合以形成CoQ10/水混合物，从而提高分散和减小CoQ10的颗粒尺寸的能力。

在优选的实施方案中，活性剂，例如CoQ10，通过高压均质机(微射流均质机)处理，例如可由Microfluidics，Inc.获得的那些高压均质机。包含CoQ10的处理流以高速率泵送至相互作用室中且颗粒通过壁碰撞和空化进行剪切。这些剪切效应随着重复通过微射流均质机减小了颗粒尺寸。如通过光子相关性光谱所测定的，本发明的颗粒具有小于约200nm的平均颗粒直径的纳米尺寸范围的粒径分布。在一个实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸小于约150nm。在一个实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸小于约125nm。在一个实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸小于约100nm。在一个实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸小于约95nm、小于约90nm、小于约85nm、小于约80nm、小于约75nm、小于约70nm、小于约65nm、小于约60nm、小于约55nm、小于约50nm、小于约45nm、小于约40nm、小于约35nm、小于约30nm或小于约25nm。在一个实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸小于约49nm、小于约48nm、小于约47nm、小于约46nm、小于约45nm、小于约44nm、小于约43nm、小于约42nm或小于约41nm。在一个实施方案中，纳米分散体颗粒的平均尺寸小于约45nm。应当理解，具有这些值中的任何一个作为上限或下限的范围也意图是本发明的部分，例如约40nm至49nm、约25nm至48nm或约25nm至47nm。

在其它的某些实施方案中，通过经由微射流均质机的几轮处理，平均颗粒尺寸减小至10nm至200nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸减小至10nm至150nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸减小至10nm至125nm。在其它实施方案中，平均颗粒尺寸减小至10nm至100nm。在其它的某些实施方案中，平均颗粒尺寸减小至10nm至90nm、10nm至80nm、10nm至70nm、10nm至60nm、10nm至50nm、10nm至45nm、10nm至40nm或10nm至30nm。在某些优选的实施方案中，平均颗粒尺寸减小至20nm至80nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸减小至20nm至70nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸减小至20nm至60nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸减小至20nm至50nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸减小至25nm至45nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸减小至30nm至45nm。在某些其它的优选实施方案中，平均颗粒尺寸减小至35nm至40nm。应当理解，具有任何一个前述值作为上限或下限的其它范围也意图是本发明的部分，例如30nm至80nm或30nm至40nm。

可能优选的是具有悬浮液形式的或者乳液形式的胶体状分散体。如本文中它处所定义的，悬浮液或纳米悬浮液包含连续相和分散的固体物质而乳液包含分散的不混溶液体。在某些方面中，乳液包含已经熔融且分散在连续相中以形成纳米颗粒的分散的疏水活性剂。在疏水活性剂为CoQ10的情况中，熔融和分散的颗粒可以进一步分散且颗粒尺寸通过后续轮次的均质化过程进一步减小。对于固体颗粒，熔融的疏水活性剂的颗粒越小，则界面能越高。稳定剂如DMPC用于通过形成分散的颗粒周围的表面层而稳定分散的颗粒，从而生成纳米分散的CoQ10颗粒。所形成的颗粒小于200nm。悬浮液包含通过高能量均质化来分散的整体疏水活性剂的颗粒。悬浮液中是疏水活性剂如CoQ10的纳米分散体。例如，CoQ10的纳米分散体包含被稳定剂如DMPC包围的整体CoQ10的分散颗粒。稳定剂形成分散的整体疏水活性剂周围的表面层且分散的CoQ10颗粒形成纳米分散的颗粒的核心。在某些实施方案中，纳米分散的颗粒处于无定形的状态中。在其它的某些实施方案中，颗粒被冻干且CoQ10纳米分散体颗粒的CoQ10核心被结晶。

本文描述的制剂可以以有效量施用于受试者。有效量是能够在处理的受试者或细胞中产生希望的结果的量。如医学和兽医学领域中公知的，任何一种动物的剂量取决于许多因素，包括特定动物的大小、体形、年龄、待施用的特定组合物、施用的时间和途径、总体健康及在之前、共同或在之后施用的药物的效应。可以预想的是，对于约110至约300磅的受试者，制剂肠胃外施用的适宜剂量为约10至约500mg的CoQ10。用于细胞培养物的有效量也会发生变化，但可以很容易地通过经验确定(即，通过向细胞添加不同的浓度并选择最佳地产生所希望的结果的浓度)。可以预想的是，适宜的浓度为约1至约250μM。

IV.制备制剂的方法

CoQ10是固体且在室温下在整体相(即整块材料)中主要是晶体物质。用作制备本发明的胶体颗粒的起始材料的固态整块材料可以是非颗粒的或颗粒的，例如粉末、沉淀物、聚集体、晶体或通常使用的任何其它原料。

在制备本发明的制剂的过程中，弱水溶性的疏水活性剂如整体相CoQ10或弱水溶性物质的混合物在高于疏水活性剂熔点的温浴中加热。例如，CoQ10的熔点为大约48℃。本文中预想，熔点可以发生变化且可以例如包括47.5℃至49.5℃范围内的任何值。由水组成的该温浴为至少65℃。在室温下为整体形式的CoQ10添加到65℃的水中并混合以形成CoQ10/水混合物。在某些实施方案中，CoQ10/水混合物混合45分钟。在其它的某些实施方案中，混合20-30分钟。粉末DMPC然后添加到CoQ10/水混合物(M1)中并混合以形成CoQ10/水/稳定剂混合物。在某些实施方案中，CoQ10/水/稳定剂混合物(M2)在65℃下混合25至45分钟。在其它的某些实施方案中，CoQ10/水/稳定剂混合物在65℃下混合30分钟。然后加入调理素作用缩减剂以形成CoQ10/水/稳定剂/缩减剂混合物。微射流均质机预热到60-65℃。CoQ10/水/稳定剂/缩减剂(M3)然后以重复轮次在微射流均质机中处理以减小颗粒尺寸至低于200nm。

合适的微射流均质机包括M110P且可通过Microfluidics，Inc.(MFI)获得。M110P具有75μm的通道和F12Y相互作用室。在处理M3的过程中，微射流均质机具有30,000psi的入口压力。

在微射流均质机中的20轮处理后，颗粒尺寸减小到30nm至80nm或优选30nm至75nm。

CoQ10的胶体状分散体通过熔融的CoQ10原料在水中采用各种类型和量的稳定剂和调理素作用缩减剂进行乳化而制备。乳化通过探头超声和/或高压均质化完成。优选地，乳化通过高压均质化完成。高压均质化体系显示出更小的平均粒径和更窄的粒度分布。CoQ10胶体状分散体的平均粒径可以通过改变工艺参数如均质化设备、均质化参数(时间、循环、压力等等)和分散体的组成(稳定剂和调理素作用缩减剂的类型和量、相比率等等)在相当大的范围内变化。Siekmann和Westesen描述了通过乳化制备的亚微米尺寸的CoQ10制剂，其中胶体颗粒处于无定形状态中(Siekmann，B.和K.Westesen.“Preparation and physicochemical characterization of aqueous dispersions ofcoenzyme Q10 nanoparticles.”Pharmaceutical Research 12，no.2(1995)：201-208.)，该文献通过引用全部引入本文中。

本发明提供了通过不同于由Siekmann和Westesen公开的那些方法的方法制备的疏水活性剂如CoQ10的胶体状分散体。本发明提供了其中CoQ10被乳化以产生CoQ10的胶体颗粒的方法。尽管在一些实施方案中颗粒为无定形状态，但在其它实施方案中，颗粒被冻干以使得胶体CoQ10颗粒为晶体形式。在本发明的某些实施方案中，冻干保护剂用于在冻干时稳定颗粒尺寸。本发明中更显著的特性包括本发明的胶体颗粒的均质化中采用的非活性剂。当前公开的方法包括本文中进一步描述的稳定剂和调整缩减剂中的至少一种。

本发明进一步包括疏水剂、稳定剂和调理素作用缩减剂的新比率。CoQ10的均质化过程产生包含泊洛沙姆(作为调理素作用缩减剂)和DMPC(作为分散稳定剂)的无定形CoQ10胶体状分散体，泊洛沙姆和DMPC的比率产生尺寸小于200nm和优选约40nm的胶体CoQ10颗粒。合适的DMPC可以从Genzyme Corporation、Lipoid、Avanti或NOF购买，而合适的泊洛沙姆188可以从Spectrum Corporation或BASF Corporation购买。

在制备胶体状分散体的过程中，CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188的重量/体积比分别选择为4％、3％和1.5％(即4∶3∶1.5的比率)。在其它某些合适的实施方案中，CoQ10、DMPC和泊洛沙姆的重量/体积比分别为8％、6％和3％(即8∶6∶3的比率)。在某些实施方案中，CoQ10的浓度为30mg/mL至90mg/mL。在其它的某些实施方案中，CoQ10的浓度对于4∶3∶1.5的比率为约40mg/mL，对于8∶6∶3的比率为约80mg/mL和对于6∶3∶1的比率为约60mg/mL。

CoQ10的胶体状分散体在室温下稳定超过几个星期。在两至三周的时间内，如表1和表2中所示，颗粒尺寸保持不变。标示为“过滤的”和“重复”的列之间的对比表明，过滤的分散体最长储存两周不会显著影响颗粒尺寸。表1进一步表明，提高DMPC/CoQ10比率和添加泊洛沙姆188导致颗粒尺寸减小。CoQ10/DMPC/P188比率4∶3∶0的制剂储存在25℃和60％湿度的稳定性室中。Z_avg(颗粒尺寸)随时间测定。

表1

表2

4∶3∶1.5和4∶3∶0的制剂用盐水溶液稀释(稀释因子1.6)。200μL的悬浮液加120μL的盐水。稀释的和未稀释的样品储存在25℃和60％湿度的稳定性室中。颗粒尺寸在24、48和96小时后测定。表3给出了稳定性结果。在盐水稀释的和未稀释的样品中都观察到时间相关的颗粒尺寸增加。从“0小时”到“48小时”，颗粒尺寸对于4∶3∶0的制剂增加5-8nm和对于4∶3∶1.5的制剂增加10-11nm。

表3

在一些实施方案中，本发明的制剂可以包含约0.001％至约20％(w/w)的辅酶Q10，更优选约0.01％至约15％和甚至更优选约0.1％至约10％(w/w)的辅酶Q10。在一个实施方案中，制剂包含约4％(w/w)的辅酶Q10。在一个实施方案中，制剂包含约8％(w/w)的辅酶Q10。在各种实施方案中，制剂包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(w/w)的辅酶Q10。CoQ10可以从Kaneka Q10以粉末形式的Kaneka Q10(USP UBIDECARENONE)获得(Pasadena，Texas，USA)。用于本文例示的方法中的CoQ10具有以下特征：残留溶剂满足USP 467的要求；水含量低于0.0％、低于0.05％或低于0.2％；炽灼残渣为0.0％、低于0.05％或低于0.2％；重金属含量低于0.002％或低于0.001％；纯度为98-100％或者为99.9％或99.5％。

在一些实施方案中，本文中提供的IV制剂为在如上制备的纳米悬浮液中包含CoQ10的4％无菌水性胶体状分散体。在某些实施方案中，该制剂适合于肠胃外施用，包括静脉内、腹膜内、原位、颅内、肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、鼻内或眼内注射。在某些实施方案中，制剂以设计用于稳定颗粒的纳米分散体的4∶3∶1.5的比率分别包含CoQ10、二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱和泊洛沙姆188。在一些实施方案中，制剂包含含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠和注射用水的磷酸盐缓冲盐水溶液。

在某些实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为1mg/mL至150mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为5mg/mL至125mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为10mg/mL至100mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为20mg/mL至90mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为30mg/mL至80mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为30mg/mL至70mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为30mg/mL至60mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为30mg/mL至50mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为35mg/mL至45mg/mL。应当理解，具有任一前述值作为上限或下限的其它范围也意图是本发明的部分，例如10mg/mL至50mg/mL或20mg/mL至60mg/mL。

在某些实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为约10、15、20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为约50mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为约60mg/mL。在一个实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为约30mg/mL。在优选的实施方案中，制剂中的CoQ10浓度为约40mg/mL。应当理解，具有这些值中的任一个作为上限或下限的范围也意图是本发明的部分，例如37mg/mL至47mg/mL或31mg/mL至49mg/mL。

在一些实施方案中，制剂的平均颗粒尺寸大约为10nm至200nm。在其它实施方案中，颗粒尺寸范围为约10nm至100nm、约30nm至80nm或约35nm至40nm。在一些实施方案中，制剂的平均颗粒尺寸范围为约10nm至150nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约10nm至125nm。在其它实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约10nm至100nm。在其它的某些实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约10nm至90nm、10nm至80nm、10nm至70nm、10nm至60nm、10nm至50nm、10nm至45nm、10nm至40nm或10nm至30nm。在某些优选的实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约20nm至80nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约20nm至70nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约20nm至60nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约20nm至50nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约25nm至45nm。在一个实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约30nm至45nm。在其它的某些优选实施方案中，平均颗粒尺寸范围为约35nm至45nm。应当理解，具有任一前述值作为上限或下限的其它范围也意图是本发明的部分，例如30nm至80nm或10nm至40nm。

在某些实施方案中，提供了用于储存和操作本文提供的纳米悬浮液胶体制剂的试剂盒，从而纳米悬浮液包装在小瓶中并用氯丁基橡胶塞和铝盖密封。

V.肿瘤疾病的治疗

本发明的制剂可以用于治疗肿瘤疾病。因此，本发明提供了治疗或预防受试者的肿瘤疾病的方法，包括以足以治疗或预防肿瘤疾病的量向受试者静脉内施用本发明的制剂，从而治疗或预防肿瘤疾病。本发明的制剂也可以用于抑制肿瘤细胞生长。因此，本发明进一步提供了抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者静脉内施用本发明的制剂，从而肿瘤细胞的生长受到抑制。在某些实施方案中，受试者是人类受试者。

这些制剂可以包含在药学上可接受的载体中的疏水活性剂，例如CoQ10或其代谢物。在一些实施方案中，这种制剂可以包含约0.001％至约20％(w/w)的辅酶Q10，更优选约0.01％至约15％和甚至更优选约0.1％至约10％(w/w)的辅酶Q10。在一个实施方案中，制剂包含约4％(w/w)的辅酶Q10。在一个实施方案中，制剂包含约8％(w/w)的辅酶Q10。在各种实施方案中，制剂包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(w/w)的辅酶Q10。还如本文中所述的，本发明的组合物可以是液体形式，能够通过本领域技术人员技能范围内的任何施用方式或途径引入受试者体内。例如，组合物可以通过包括但不限于静脉内、肿瘤内、其组合等等的施用途径施用。

在本发明的某些实施方案中，提供了用于通过向人静脉内施用本发明的辅酶Q10制剂治疗或预防人的肿瘤疾病的方法，从而实现治疗或预防，其中该个人被施用约0.5mg/kg至约10,000mg/kg、约5mg/kg至约5,000mg/kg、约10mg/kg至约3,000mg/kg的辅酶Q10剂量。在一个实施方案中，辅酶Q10以约10mg/kg至约1,400mg/kg的范围施用。在一个实施方案中，辅酶Q10以约10mg/kg至约650mg/kg的范围施用。在一个实施方案中，辅酶Q10以约10mg/kg至约200mg/kg的范围施用。在各种实施方案中，辅酶Q10以约2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、110mg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、170mg/kg、180mg/kg、190mg/kg或200mg/kg的剂量施用。应当理解，具有这些值中的任一个作为上限或下限的范围也意图是本发明的部分，例如约50mg/kg至约200mg/kg或约650mg/kg至约1400mg/kg。在一个实施方案中，施用的剂量为至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约12.5mg/kg、至少约20mg/kg、至少约25mg/kg、至少约30mg/kg、至少约35mg/kg、至少约40mg/kg、至少约45mg/kg、至少约50mg/kg、至少约55mg/kg、至少约60mg/kg、至少约75mg/kg、至少约100mg/kg、至少约125mg/kg、至少约150mg/kg、至少约175mg/kg、至少约200mg/kg、至少约300mg/kg或至少约400mg/kg。

在一个实施方案中，辅酶Q10制剂每周施用一次。在一个实施方案中，辅酶Q10制剂每周施用3次。在另一个实施方案中，辅酶Q10制剂每周施用5次。在一个实施方案中，辅酶Q10制剂每天施用一次。在一些实施方案中，在IV制剂通过输注施用的情况中，剂量在约1小时、2小时、3小时、4小时或更长时间内通过输注施用。在一个实施方案中，IV制剂在约4小时时间内通过输注施用。

在另一个实施方案中，辅酶Q10以约10mg/kg至约10,000mg/kg的CoQ10、约20mg/kg至约5000mg/kg、约50mg/kg至约3000mg/kg、约100mg/kg至约2000mg/kg、约200mg/kg至约1000mg/kg或约300mg/kg至约500mg/kg的剂量以CoQ10IV制剂的形式施用，其中，该CoQ10制剂包含约1％至10％的辅酶Q10。在一个实施方案中，CoQ10制剂包含约4％的辅酶Q10。在一个实施方案中，CoQ10IV制剂包含约8％的辅酶Q10。在其它实施方案中，CoQ10IV制剂包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％的辅酶Q10。应当理解，具有这些值中的任一个作为上限或下限的范围也意图是本发明的部分。

如本文中使用的，“肿瘤疾病”是指人体中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括，但不限于：白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌瘤和肉瘤。如本文中使用的，术语或词语“肿瘤疾病”、“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可互换使用且，以单数或复数形式，指已发生使其对于宿主生物体为病理性的恶性转化的细胞。原发癌细胞(即，从靠近恶性转化的位点获得的细胞)可以容易地通过良好确立的技术，特别是组织学检查，与非恶性细胞区分开来。如本文中使用的癌细胞的定义不仅包括原发癌细胞，而且包括癌症干细胞以及癌症祖细胞或源自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞及体外培养物和源自癌细胞的细胞系。当提及通常表现为实体肿瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤是可基于肿瘤团块检测的肿瘤；例如，通过如CAT扫描、MR成像、X-射线、超声或触诊的方法，和/或其由于可由患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达可成为可检测的。

术语“肉瘤”一般是指由如胚性结缔组织的物质构成且一般由嵌入纤维状或均质物质中的紧密包装的细胞组成的肿瘤。可以用IV制剂中的CoQ10胶体状分散体治疗的肉瘤的实例包括，例如，软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy′s肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、Jensen′s肉瘤、卡波济氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间质瘤、骨旁肉瘤(parosteal sarcoma)、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。

术语“黑色素瘤”被认为是指由皮肤和其它器官的黑色素细胞系统产生的肿瘤。可以用IV制剂中的CoQ10胶体状分散体治疗的黑色素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、良性青少年性黑色素瘤、Cloudman′s黑色素瘤、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤、青少年性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤(subungal melanoma)和浅表扩散性黑色素瘤。

术语“癌瘤”是指由倾向于渗透周围组织且引起转移的上皮细胞构成的恶性新生长。可以用如本文所述的IV制剂中的CoQ10胶体状分散体治疗的癌瘤包括例如，腺泡癌、腺泡状癌、腺囊癌、腺样囊性癌、瘤性腺癌(carcinomaadenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cellcarcinoma)、基底细胞性癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、髓状癌、胶样癌、粉剌状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、圆柱细胞癌(cylindricalcarcinoma)、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌(epiermoidcarcinoma)、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶体状癌、粘液癌、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、胶样癌(hyaline carcinoma)、hypemephroid癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔氏癌、库尔契茨基细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinomalenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌、Merkel细胞癌、粘液癌(mucinouscarcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液癌(carcinomamucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucouscarcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinomaossificans)、骨样癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门脉周癌、原位癌(preinvasive carcinoma)、棘细胞癌、髓样癌(pultaceous carcinoma)、肾脏的肾细胞癌、贮备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、软癌(carcinoma spongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。

在用于治疗癌症的情况中，制剂可以处于药学可接受的载体中，其可以以单一疗法或者与至少一种用于给定适应症的其它化疗剂结合、与进行外科手术以根本上除去肿瘤后的放疗结合、与其它替代的和/或用于肿瘤的可接受的补充治疗结合等等以治疗有效量施用于肿瘤发生区域。在某些实施方案中，本发明还提供了用于通过施用本发明的组合物到患者的肿瘤发生区域中以再激活突变的/灭活的p53蛋白的方法。

本发明还提供了用于通过施用本发明的组合物到患者的肿瘤发生区域而调节参与肿瘤发生的蛋白质的方法。可以通过本发明的组合物调节的这类蛋白质包括，但不限于：Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Bid蛋白、Bim蛋白、Bad蛋白、Bak蛋白、mcl-1蛋白、Bcl-xl蛋白、Bcl-xs蛋白、Bcl-w蛋白、Bik蛋白、Bok蛋白、BimL蛋白、Al蛋白、Hrk蛋白、Bik蛋白、BNIP3蛋白、BIk蛋白、Noxa蛋白、Puma蛋白、VEGF蛋白、FGF-l/FGF-2蛋白、Hif-α蛋白、血管抑素蛋白、TGF-β蛋白、smad蛋白、cdk(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶)、PI3K/akt复合体。在其它实施方案中，本发明的组合物可以用于调节和/或恢复癌细胞的健康细胞凋亡状态。线粒体功能障碍和细胞凋亡的失调涉及到许多疾病如癌症和神经变性。吸收链(RC)功能障碍可以在细胞凋亡中具有作用，如使用线粒体DNA突变作为遗传模型证明的。虽然一些突变消除了整个RC，但其它突变靶向于特定的复合体，从而导致电子流量的降低或完全损失，这导致呼吸和腺苷三磷酸(ATP)合成受到损害。尽管存在这些相似性，细胞凋亡刺激响应方面存在显著的差异。缺乏RC的细胞受到保护以免受线粒体-和内质网(ER)应激诱导的细胞凋亡的影响。具有RC(但不能产生电子流)的细胞受到保护以免受线粒体细胞凋亡的影响，虽然它们具有对于ER应激的提高的敏感性。最后，电子流部分降低的细胞在这两种情况中具有增加的细胞凋亡。RC调节以与ATP产生无关的环境依赖性方式调节细胞凋亡，且该细胞凋亡反应是线粒体功能状态和环境信号之间相互作用的结果。

细胞凋亡的执行和致癌因子之间的通讯也可以由通过线粒体膜孔(其在膜去极化时开放)的释放的因子如细胞色素C、Endo G或AIF介导。癌细胞也在氧存在的情况下(有氧糖酵解)产生过量乳酸。现在表明，这一现象是两种因素的产物：胚胎的更高糖酵解代谢的回复和增加线粒体反应性氧物质(ROS)产生的氧化磷酸化(OXPHOS)改变。Ras-PI3K-Akt信号转导途径的变化可导致己糖激酶II的诱导和其附着于线粒体膜孔蛋白，从而再定向线粒体ATP以磷酸化葡萄糖和驱动糖酵解。此外，线粒体基因突变(种系或体细胞)导致的OXPHOS部分抑制可以降低通过电子传递链的电子流量，从而增加线粒体ROS的产生。增加的ROS诱变核原-癌基因(起始)并驱动核复制(促进)，从而产生癌症。因此，己糖激酶II和线粒体ROS可能是癌症治疗剂的可用替代靶标。代谢流(在涉及癌症时)在致癌状态中受到损失并转换到糖酵解状态。癌细胞的存活非常依赖于葡萄糖代谢和低氧水平。更复杂的是线粒体活性显著减弱到休眠点。通常与从柠檬酸循环(TCA)接受电子的复合体1-IV相关的氧化磷酸化基本停止。自由基的量和乳酸脱氢酶活性存在显著的提高。因此，癌细胞处于以下的状态：(1)降低的氧(低氧)；(2)增加的自由基形成；(3)失调的细胞凋亡(细胞死亡)；(4)葡萄糖代谢的依赖性；(5)增加的血管形成；和(6)改变的免疫识别(自动调控状态开始)。

一般地，本文描述的CoQ10IV制剂可以用于预防性或治疗性地治疗任何肿瘤。在特定的实施方案中，制剂用于治疗实体肿瘤。在本发明的各种实施方案中，CoQ10用于治疗或预防脑癌、中枢神经系统癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、尿道癌、胆囊癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、肉瘤、骨癌、胃癌和成神经管细胞瘤。在一个实施方案中，本文描述的CoQ10IV制剂可以用于治疗绿色白血病，例如原发绿色白血病或者继发或转移绿色白血病，例如存在、迁移或转移到特定器官如肺、肝或中枢神经系统的。

但是，使用本发明的CoQ10IV制剂的治疗不限于前述的癌症类型。适合于本发明的CoQ10IV制剂治疗的癌症的实例包括，但不限于，例如霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、恶变前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。在一个实施方案中，本文描述的CoQ10IV制剂可以用于治疗或预防各种类型的皮肤癌(例如鳞状细胞癌或基底细胞癌)、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或骨癌。在一个实施方案中，CoQ10用于治疗皮肤肿瘤疾病，包括，但不限于，鳞状细胞癌(包括SCCIS(原位)和更具侵袭性的鳞状细胞癌)、基底细胞癌(包括浅表性、结节性和浸润性基底细胞癌)、黑色素瘤和光化性角化病。在一个实施方案中，可以用CoQ10治疗的肿瘤疾病或癌症不是黑色素瘤。在一个实施方案中，肿瘤疾病是Merkel细胞癌(MCC)。

在某些实施方案中，CoQ10对于癌细胞可能具有的效应可能部分地依赖于癌细胞表现的代谢和氧化流的各种状态。CoQ10可以用于打断和/或干扰致癌细胞的糖酵解依赖性和增加的乳酸利用率的转化。当其涉及癌症状态时，这种对肿瘤微环境的糖酵解和氧化流的干扰可以以减小癌细胞发生的方式影响细胞凋亡和血管生成。在一些实施方案中，CoQ10与糖酵解和氧化流因素的相互作用可以在建立用于药物发现和开发的可用药物靶标的同时增强CoQ10发挥其在肿瘤中的恢复性细胞凋亡效应的能力。尽管本发明集中于CoQ10及其代谢物，可以替代CoQ10或与CoQ10结合施用的与CoQ10相关的其它化合物包括，但不限于，苯醌类、类异戊二烯类、法呢醇类、乙酸法呢酯、焦磷酸法呢酯、l-苯丙氨酸、d-苯丙氨酸、dl-苯丙氨酸、l-酪氨酸、d-酪氨酸、dl-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸、4-羟基-苯基乳酸、4-羟基-肉桂酸、酪氨酸或苯丙氨酸的二肽和三肽、3，4-二羟基扁桃酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸、香草酸、苯基乙酸、吡哆醇、S-腺苷甲硫氨酸、泛醇、甲羟戊酸、焦磷酸异戊酯、苯基丁酸、4-羟基-苯甲酸、焦磷酸癸异戊烯酯、β-羟基丁酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、乙酰肉毒碱、乙酸乙酰肉毒碱、乙酰甘氨酸、乙酸乙酰甘氨酸、肉毒碱、乙酸、丙酮酸、3-羟基-3-甲基戊二酰肉毒碱，丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的所有异构体形式，甚至肉毒碱和甘氨酸的碳原子数C4至C8的脂肪酸(丁酸、己酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸)盐，如棕榈酰肉毒碱和棕榈酰甘氨酸，及4-羟基-苯甲酸聚异戊烯转移酶、这些化合物的任何盐以及它们的任何组合，等等。

在一个实施方案中，如本文所述的CoQ10胶体状分散体的IV制剂减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长和/或延长带瘤受试者的生存时间。因此，本发明也涉及通过向人或其它动物静脉内施用有效的、非毒性量的CoQ10治疗该人或动物的肿瘤的方法。本领域技术人员能够通过常规试验确定什么样的有效、非毒性量的CoQ10用于治疗恶性肿瘤的目的。例如，CoQ10的治疗活性量可以按照如受试者的疾病阶段(例如，I期与IV期)、年龄、性别、医学并发症(例如，免疫抑制状态或疾病)和体重及CoQ10在受试者中引发希望的反应的能力的因素变化。剂量方案可以调节以提供最佳的治疗反应。例如，可以每日施用几个分剂量，或者剂量可以按照治疗情况的急切需要所表明的成比例地降低。

本发明在另一个方面中也提供了用于治疗或预防人类的侵袭性肿瘤疾病的方法。这些方法包括以治疗有效剂量向人体静脉内施用辅酶Q10，从而治疗或预防侵袭性肿瘤疾病。在一个实施方案中，这些方法包括以所选择的低于用于或选择用于低侵袭性或非侵袭性肿瘤疾病的剂量方案的剂量向人体静脉内施用辅酶Q10，从而治疗或预防侵袭性肿瘤疾病。在某些实施方案中，侵袭性肿瘤疾病包括胰腺癌、肝细胞癌、尤文氏肉瘤、转移乳腺癌、转移黑色素瘤、脑癌(星形细胞瘤、成胶质细胞瘤)、神经内分泌癌、结肠癌、肝癌、肺癌、骨肉瘤、雄激素依赖性前列腺癌、卵巢癌和非霍奇金淋巴瘤。

在相关的方面中，本发明提供用于治疗或预防人的非侵袭性肿瘤疾病的方法。这些方法包括以治疗有效剂量向人体静脉内施用辅酶Q10，从而治疗或预防非侵袭性肿瘤疾病。在一个实施方案中，这些方法包括以所选择的高于用于或选择用于侵袭性肿瘤疾病的剂量方案的剂量向人体静脉内施用辅酶Q10，从而治疗或预防非侵袭性肿瘤疾病。在某些实施方案中，非侵袭性肿瘤疾病包括非转移乳腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、小细胞肺癌和急性淋巴细胞性白血病。

在本发明的一些实施方案中，肿瘤疾病的治疗或预防经由CoQ10与选自HNF4-α、Bcl-xl、Bcl-xS、BNIP-2、Bcl-2、Birc6、Bcl-2-L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c-Jun、Bmf、PUMA、cMyc、转醛醇酶1、COQ1、COQ3、COQ6、异戊烯转移酶、4-氢苯甲酸、嗜中性粒细胞胞浆因子2、一氧化氮合酶2A、超氧化物歧化酶2、VDAC、Bax通道、ANT、细胞色素c、复合物1、复合物II、复合物III、复合物IV、Foxo 3a、DJ-1、IDH-1、Cpt1C和Cam激酶II的蛋白质的相互作用而实现。在一些实施方案中，肿瘤疾病选自白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌瘤和肉瘤。

在本发明的某些实施方案中，肿瘤疾病选自白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌瘤和肉瘤。

在本发明的某些实施方案中，所述方法进一步包括治疗方案，其包括手术、放疗、激素疗法、抗体疗法、生长激素疗法、细胞因子和化疗中的任一种或组合。

所得到的CoQ10纳米颗粒也可以用作用于其它亲脂性药物的载体系统。例如，维生素A和K3可以结合于其中。

VI.联合疗法

在某些实施方案中，本发明的制剂，例如CoQ10I.V.制剂，可以用于与至少一种另外的治疗剂的联合疗法中。CoQ10和/或其药物制剂及另外的治疗剂可以累加地或更优选协同地作用。在一个实施方案中，CoQ10和/或其药物制剂与另一治疗剂的施用同时施用。在另一实施方案中，化合物和/或其药物制剂在另一治疗剂的施用之前或之后施用。在一个实施方案中，CoQ10和另外的治疗剂具有协同的活性。在一个实施方案中，CoQ10和另外的治疗剂具有累加的活性。

在一个实施方案中，本发明的治疗方法进一步包括施用一种或多种另外的药剂，例如一种或多种治疗剂。例如，在一个实施方案中，用于本发明的治疗方法中的另外的药剂是化疗剂。

化疗剂一般属于各种种类，包括例如，1.拓扑异构酶II抑制剂(细胞毒性抗生素)，如蒽环抗生素/蒽二酮类，例如阿霉素、表柔比星、去甲氧基柔红霉素和奈莫柔比星，蒽醌类，例如米托蒽醌和洛索蒽醌，和鬼臼素类(podophillotoxines)，例如依托泊甙和替尼泊甙；2.影响微管形成的试剂(有丝分裂抑制剂)，如植物生物碱类(例如属于生物碱家族的化合物、具有生物活性和细胞毒性的源自植物的含氮分子)，例如紫杉烷类如紫杉醇和多西他赛，和长春花生物碱类，如长春花碱、长春新碱和长春瑞滨，及鬼臼毒素衍生物；3.烷基化试剂，如氮芥、乙亚胺化合物、烷基磺酸酯和其它具有烷基化作用的化合物如亚硝基脲、氮烯唑胺、环磷酰胺、异环磷酰胺和马法兰；4.抗代谢物(核苷抑制剂)，例如叶酸类，如叶酸、氟嘧啶类(fiuropyrimidines)、嘌呤或嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、氨甲蝶呤和依达曲沙；5.拓扑异构酶I抑制剂，如托泊替康、依立替康和9-硝基喜树碱，及喜树碱衍生物；和6.铂化合物/络合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂。用于本发明方法中的示例性的化疗剂包括，但不限于阿米斯丁(氨磷丁)、顺铂、氮烯唑胺(DTIC)、放线菌素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链佐星、环磷酰胺、卡莫司丁(BCNU)、罗莫司丁(CCNU)、多柔比星(亚德里亚霉素)、多柔比星脂质体(doxil)、吉西他滨(健择)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(daunoxome)、甲苄肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊甙、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春花碱、长春新碱、博来霉素、紫杉酚(紫杉醇)、多西他赛(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-I 1、10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、氮烯咪胺、S-I卡培他滨、呋氟尿嘧啶、5’脱氧氟尿苷、UFT、恩尿嘧啶、脱氧胞苷、5-氮杂胞嘧啶、5-氮杂脱氧胞嘧啶、别嘌呤醇、2-氯腺苷、曲美沙特、氨基蝶呤、亚甲基-10-去氮杂氨基蝶呤(MDAM)、奥沙立铂(oxaplatin)、皮卡铂、四铂、沙铂、铂-DACH、奥马铂、CI-973、JM-216及其类似物、表柔比星、依托泊甙磷酸酯、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲基二氧喜树碱、(4S)-4-乙基-4-羟基-11-(2-三甲基硅基)乙基)-1H-吡喃并[3′，4′:6，7]氮茚并[1，2-B]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(karenitecin)、9-硝基喜树碱、TAS 103、去乙酰长春酰胺、L-苯丙氨酸氮芥、ifosphamidemefosphamide、过磷酰胺、氯乙环磷酰胺卡莫司丁、司莫司丁、埃博霉素(epothilone)A-E、拓优得、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、安吖啶、依托泊甙磷酸酯、(4S)-4-乙基-4-羟基-11-(2-三甲基硅基)乙基)-1H-吡喃并[3′，4′:6，7]氮茚并[1，2-B]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮、阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、金刚胺、金刚烷乙胺、拉米夫定、齐多夫定、贝伐单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、喷司他丁、曲美沙特、克拉屈滨、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、去甲氧基柔红霉素、美司钠、依立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法兰、巯基嘌呤、光辉霉素、米托坦、培加帕酶、喷司他丁、哌血生、光神霉素、链唑霉素、它莫西芬、替尼泊甙、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、顺铂、阿霉素、紫杉酚(紫杉醇)、博来霉素、mTor、表皮生长因子受体(EGFR)和成纤维细胞生长因子(FGF)及本领域技术人员基于针对特定肿瘤或癌症的适当护理标准很容易理解的其组合。

在另一个实施方案中，用于本发明的联合疗法中的另外的药剂是生物学试剂。

生物学试剂(也称为生物剂(biologies))是生物系统如生物体、细胞或重组体系统的产物。这类生物学试剂的实例包括核酸分子(例如反义核酸分子)、干扰素、白介素、集落刺激因子、抗体如单克隆抗体、抗血管生成剂和细胞因子。示例性的生物学试剂在下面更详细地讨论且一般属于各不同种类，例如：1.激素、激素类似物和激素复合物，例如雌激素和雌激素类似物、孕酮、孕酮类似物和黄体酮、雄激素、肾上腺皮质类固醇类、抗雌激素、抗雄激素、抗睾酮、肾上腺类固醇抑制剂和抗促黄体生成激素；和2.酶、蛋白质、肽、多克隆和/或单克隆抗体扩，如白介素、干扰素、集落刺激因子等。

在一个实施方案中，生物学试剂是干扰素。干扰素(IFN)是一类在机体中天然发生的生物学物质。干扰素也在实验室中产生和在生物疗法中给予癌症患者。它们已证明改善癌症患者的免疫系统对抗癌细胞的方式。

干扰素可以直接作用于癌细胞以减缓其生长，或者它们可以引起癌细胞转变成具有更正常行为的细胞。一些干扰素也可以刺激天然杀伤(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞，其是血流中帮助对抗癌细胞的白细胞类型。

在一个实施方案中，生物剂是白介素。白介素(IL)刺激许多种免疫细胞的生长和活性。它们是在机体中天然发生的蛋白质(细胞因子和趋化因子)，但也可以在实验室中制备。

一些白介素刺激起到破坏癌细胞的作用的免疫细胞如淋巴细胞的生长和活性。

在另一个实施方案中，生物剂是集落刺激因子。

集落刺激因子(CSF)是给予患者以激励骨髓中的干细胞产生更多血细胞的蛋白质。机体持续地需要新的白细胞、红细胞和血小板，特别是当存在癌症时。CSF与化疗一起施用以帮助加强免疫系统。当癌症患者接受化疗时，骨髓产生新的血细胞的能力受到抑制，使得患者更易于发生感染。免疫系统的部分在没有血细胞的情况下不能发挥功能，因此集落刺激因子激励骨髓干细胞产生白细胞、血小板和红细胞。

在具有适当的细胞产生的情况下，其它癌症治疗可以继续以使得患者能够安全地接受更高剂量的化疗。

在另一个实施方案中，生物剂是抗体。抗体，例如单克隆抗体，是在实验室中产生的结合癌细胞的试剂。

当癌破坏性的药剂引入机体时，它们找出抗体并杀死癌细胞。单克隆抗体剂不破坏健康细胞。单克隆抗体通过各种不同机制获得其治疗效应。它们可以具有产生细胞凋亡或程序性细胞死亡的直接效应。它们可以阻断生长因子受体，从而有效地抑止肿瘤细胞的增殖。在表达单克隆抗体的细胞中，它们可以导致抗个体基因型抗体的形成。

可以用于本发明的联合疗法中的抗体实例包括抗-CD20抗体，例如，但不限于西妥昔单抗、托西莫单抗、利妥昔单抗和替依莫单抗。抗-HER2抗体也可以用于与治疗癌症的环境影响剂(environmental influencer)组合。在一个实施方案中，抗-HER2抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀)。可以用于与治疗癌症的环境影响剂组合的抗体的其它实例包括抗-CD52抗体(例如阿仑单抗)、抗-CD-22抗体(例如依帕珠单抗)和抗-CD33抗体(例如吉妥珠单抗奥米唑星)。抗-VEGF抗体也可以用于与治疗癌症的环境影响剂组合。在一个实施方案中，抗-VEGF抗体是贝伐单抗。在其它实施方案中，生物剂是作为抗-EGFR抗体的抗体，例如西妥昔单抗。另一个实例是抗-糖蛋白17-1A抗体依决可单抗。许多的其它抗肿瘤抗体是本领域中已知的且本领域技术人员理解其包括在本发明内。

在另一个实施方案中，生物剂是细胞因子。细胞因子疗法使用蛋白质(细胞因子)帮助受试者的免疫系统识别和破坏为癌性的那些细胞。细胞因子在机体中由免疫系统天然产生，但也可以在实验室中制备。这一疗法用于晚期黑色素瘤和用于辅助治疗(在主要癌症治疗后或在主要癌症治疗之外给予的疗法)。细胞因子疗法到达机体的所有部分以杀灭癌细胞和防止肿瘤生长。

在另一个实施方案中，生物剂是融合蛋白。例如，重组人Apo2L/TRAIL(Genentech)可以用于联合疗法中。Apo2/TRAIL是第一个设计用于激活促细胞凋亡受体DR4和DR5(其参与细胞凋亡(程序性细胞死亡)的调节)的双重促细胞凋亡受体激动剂。

在一个实施方案中，生物剂是反义核酸分子。

如本文中所使用的，“反义”核酸包含与编码蛋白质的“正义”核酸互补的核苷酸序列，例如与双链cDNA分子的编码链互补、与mRNA序列互补或与基因的编码链互补。因此，反义核酸可以与正义核酸氢键键合。

在一个实施方案中，生物剂是siRNA分子，例如增强血管生成的分子(例如bFGF、VEGF和EGFR)的siRNA分子。在一个实施方案中，抑制血管生成的生物剂介导RNAi。RNA干扰(RNAi)是翻译后的靶向基因沉默技术，其使用双链RNA(dsRNA)以降解含有与dsRNA相同的序列的信使RNA(mRNA)(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.等，Cell 101，25-33(2000).Tuschl，T.等，Genes Dev.13，3191-3197(1999)；Cottrell TR和Doering TL.2003.Trends Microbiol.11：37-43；Bushman F.2003.MoI Therapy.7：9-10；McManus MT和Sharp PA.2002.Nat Rev Genet.3.737-47)。当内源核糖核酸酶将较长的dsRNA切割成较短的(例如21-或22-核苷酸长度的)RNA(称为小干扰RNA或siRNA)时，该过程发生。较小的RNA片段然后介导靶mRNA的降解。用于合成RNAi的试剂盒可从例如New England Biolabs或Ambion商购得到。在一个实施方案中，一种或多种用于反义RNA中的化学作用可用于介导RNAi的分子中。

反义核酸用于下调细胞中特定蛋白质的表达的用途是本领域中公知的(参见例如，Weintraub，H.等，Antisense RNA as a molecular tool for geneticanalysis，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986；Askari，F.K.和McDonnell，W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334：316-318；Bennett，M.R.和Schwartz，S.M.(1995)Circulation 92：1981-1993；Mercola，D.和Cohen，J.S.(1995)Cancer Gene Ther.2：47-59；Rossi，JJ.(1995)Br.Med.Bull.51.217-225；Wagner，R.W.(1994)Nature372：333-335)。反义核酸分子包含与另一核酸分子的编码链(例如，mRNA序列)互补的核苷酸序列且因此能够与该另一核酸分子的编码链氢键键合。与mRNA的序列互补的反义序列可以与mRNA的编码区、mRNA的5′或3′非翻译区或桥接该编码区和非翻译区的区域(例如5’非翻译区和编码区的接头处)中存在的序列互补。此外，反义核酸在序列上可以与编码mRNA的基因的调控区域互补，例如转录起始序列或调控元件。优选地，反义核酸经设计以使得与编码链上启动密码子之前或跨越启动密码子的区域或mRNA的非翻译区中的区域互补。

给出增强血管生成的分子的编码链序列的情况下，本发明的反义核酸可以按照沃森-格里格碱基配对规则设计。反义核酸分子可以与mRNA的整个编码区互补，但更优选是仅对于mRNA的编码或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与围绕mRNA的翻译起始位点的区域互补。反义寡核苷酸长度可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。

本发明的反义核酸可以使用本领域已知的方法利用化学合成和酶促接合反应构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸，或者可以使用经设计以提高分子的生物稳定性或提高反义和正义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的各种各样修饰的核苷酸化学合成，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤(xantine)、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。为抑制细胞中的表达，可以使用一种或多种反义寡核苷酸。或者，反义核酸可以使用其中核酸已按反义方向亚克隆到其中的表达载体通过生物学方法产生(由插入的核酸转录的RNA为目标靶核酸的反义方向，在以下分段中进一步描述)。

在再另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子形成与互补RNA的特定双链杂交体，其中与通常的α-单元相反，链彼此平行地延伸(Gaultier等(1987)Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可以包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic AcidsRes.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215：327-330)。

在另一个实施方案中，本发明的反义核酸是介导RNAi的化合物。RNA干扰剂包括，但不限于核酸分子，其包括与靶基因或基因组序列同源的RNA分子、“短干扰RNA”(siRNA)、“短发夹”或“小发夹RNA”(shRNA)和通过RNA干扰(RNAi)来干扰或抑制靶基因的表达的小分子。RNA干扰是转录后的靶向基因沉默技术，其采用双链RNA(dsRNA)降解包含与dsRNA相同的序列的信使RNA(mRNA)(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.等，Cell 101，25-33(2000).Tuschl，T.等，Genes Dev.13，3191-3197(1999))。当内源核糖核酸酶将较长的dsRNA切割较短的(例如21-或22-核苷酸长度的)RNA(称为小干扰RNA或siRNA)时，该过程发生。然后较小的RNA片段介导靶mRNA的降解。用于合成RNAi的试剂盒可从例如New England Biolabs或Ambion商购得到。在一个实施方案中，可使用一种或多种用于反义RNA中的上述化学作用。

可以以适合在受试者细胞中表达编码的蛋白质的形式引入受试者中的编码例如抑制血管生成的分子的核酸分子也可以用于本发明的方法中。抑制血管生成的示例性分子包括，但不限于TSP-I、TSP-2、IFN-g、IFN-a、血管他丁、内皮他丁、tumastatin、血管能抑制素(canstatin)、VEGI、PEDF、vasohibin和促乳素2-甲氧基雌二醇的16kDa片段(综述参见Kerbel(2004)J.Clin Invest114：884)。

例如，全长或部分cDNA序列克隆到重组表达载体中且该载体使用标准的分子生物学技术转染到细胞中。cDNA可以例如通过使用聚合酶链反应(PCR)扩增或通过筛选适宜的cDNA文库获得。cDNA的核苷酸序列可以用于设计允许通过标准PCR方法扩增cDNA的PCR引物或用于设计可用于利用标准杂交方法筛选cDNA文库的杂交探针。在cDNA的分离或扩增后，DNA片段引入合适的表达载体中。

用于本发明方法中的示例性生物剂包括，但不限于吉非替尼(易瑞沙)、阿那曲唑、二乙基己烯雌酚、雌二醇、普雷马林、雷洛昔芬、孕酮、异炔诺酮、esthisterone、dimesthisterone、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、诺塞甾酮、甲基睾酮、睾酮、地塞米松(dexamthasone)、强的松、皮质醇、甲强龙、它莫西芬、氟维司群、托瑞米芬、氨鲁米特、睾内酯、屈洛昔芬、阿纳托唑、比卡鲁胺、氟他米特、尼鲁米特、戈舍瑞林、氟他胺、亮脯利特、曲普瑞林、氨苯哌酮、米托坦、戈舍瑞林、西妥昔单抗、厄洛替尼、伊马替尼、托西莫单抗、阿仑单抗、曲妥珠单抗、吉姆单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗、贝伐单抗、地尼白介素2(Denileukin diftitox)、达克珠单抗、干扰素α、干扰素β、抗-4-lBB、抗-4-lBBL、抗-CD40、抗-CD 154、抗-OX40、抗-OX40L、抗-CD28、抗-CD80、抗-CD86、抗-CD70、抗-CD27、抗-HVEM、抗-LIGHT、抗-GITR、抗-GITRL、抗-CTLA-4、可溶性OX40L、可溶性4-IBBL、可溶性CD154、可溶性GITRL、可溶性LIGHT、可溶性CD70、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CTLA4-Ig、GVAX

及本领域技术人员基于对于特定肿瘤或癌症的适当护理标准很容易理解的其组合。试剂的可溶性形式可以通过将该试剂与例如Ig-Fc区域可操作地连接而制备为例如融合蛋白。

应注意，一种以上的另外的试剂，例如1、2、3、4、5种，可以与本发明的CoQ10制剂联合施用。例如，在一个实施方案中，两种化疗剂可以与CoQ10联合施用。在另一个实施方案中，可以施用化疗剂、生物剂和CoQ10。

可以使用各种不同形式的生物剂。这些包括，但不限于如原形分子(proform molecule)、未改变分子、分子复合物、盐、醚、酯、酰胺等等的形式，其在植入、注射或以另外形式插入肿瘤中时为生物活性的。

本发明进一步通过以下实施例理解。但是，本领域技术人员很容易理解，特定的实验细节仅用于说明而不意图限制本文中所描述的本发明，其由后面所附的权利要求限定。本说明书全文中引用的任何专利、专利申请、专利申请公开和参考文献在此通过引用全文并入。

实施例

以下实施例提供了CoQ10的胶体状分散体制备的示例性制剂。

实施例1-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶3∶0-SOP4.1)：(a)4g CoQ10加入93mL的65℃水中并混合10分钟以形成CoQ10/水混合物(M1)；(b)3g的DMPC(粉末)加入M1中并在65℃下再混合10分钟以形成CoQ10/水/DMPC混合物(M2)；(c)高剪切混合器，7000rpm 65℃下应用于M22分钟；(d)微射流均质机室预热到65℃；(e)M2在微射流均质机中65℃和28000PSI下处理。

实施例2-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶2∶0-SOP4.2)：(a)4gCoQ10加入94mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)3g的DMPC(粉末)加入M1中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M2；(c)8000rpm的高剪切混合器于65℃下应用于M22分钟；(d)微射流均质机处理室预热到65℃；(e)M2在预热的微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

实施例3-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶3∶1-SOP4.3)：(a)4g CoQ10加入92mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)3g的DMPC(粉末)加入M1中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M2；(c)高剪切混合器于8000rpm下65℃下应用于M22分钟；(d)1g的P188(粉末)加入M2中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M3；(e)然后高剪切混合器于8000rpm下应用于M3；(f)微射流均质机室然后预热到65℃；(g)M3然后在微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

实施例4-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶2∶1-SOP4.4)：(a)4g CoQ10加入93mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)2g的DMPC(粉末)加入M1中并在65℃下再混合10分钟；(c)高剪切混合器于8000rpm下65℃下应用于M22分钟；(d)1g的P188(粉末)然后加入剪切的M2混合物中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M3；(e)微射流均质机预热到65℃；(f)M3然后在微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

实施例5-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶3∶1-SOP4.4)：(a)4g CoQ10加入92mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)3g的DMPC(粉末)然后加入M1中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M2；(c)然后高剪切混合器于8000rpm下65℃下应用于M2 2分钟；(d)1g的P188(粉末)加入剪切的M2混合物中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M3；然后微射流均质机处理室预热到65℃；混合物M3然后在微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

实施例6-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶1∶0-SOP4.4)：(a)4g CoQ10加入95mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)1g的DMPC(粉末)加入M1中并混合10分钟以形成混合物M2；(c)然后高剪切混合器于8000rpm下65℃下应用于M22分钟；(c)微射流均质机处理室预热到65℃；(d)剪切的M2然后在微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

实施例7-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶1∶1-SOP4.4)：(a)4g CoQ10加入94mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)1g的DMPC(粉末)加入M1中并混合10分钟以形成混合物M2；(c)高剪切混合器于8000rpm下65℃下应用于M22分钟；(d)1g的P188(粉末)加入剪切的M2混合物中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M3；(e)微射流均质机处理室预热到65℃；(f)M3混合物在微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

实施例8-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶3∶0.5-SOP4.4)：(a)4g CoQ10加入92mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)3g的DMPC(粉末)加入M1中并混合10分钟以形成混合物M2；(c)高剪切混合器于8000rpm下65℃下应用于M2 2分钟；(d)0.5g的P188(粉末)加入剪切的M2混合物中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M3；(e)微射流均质机处理室预热到65℃；(f)M3混合物在微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

实施例9-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶3∶1.5-SOP4.4)：(a)4gCoQ10加入91.5mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)3g的DMPC(粉末)加入M1中并混合10分钟以形成混合物M2；(c)高剪切混合器于8000rpm下65℃下应用于M22分钟；(d)1.5g的P188(粉末)加入剪切的M2混合物中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M3；(e)微射流均质机处理室预热到65℃；(f)M3混合物在微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

实施例10-制剂CoQ10/DMPC/P188(4∶2∶1.5-SOP4.4)：(a)4g CoQ10加入92mL的65℃水中并混合10分钟以形成混合物M1；(b)2g的DMPC(粉末)加入M1中并混合10分钟以形成混合物M2；(c)高剪切混合器于8000rpm下65℃下应用于M2 2分钟；(d)1.5g的P188(粉末)加入剪切的M2混合物中并在65℃下再混合10分钟以形成混合物M3；(e)微射流均质机处理室预热到65℃；(f)M3混合物在微射流均质机中65℃和30000PSI下处理。

如可以从图17中看到的，制剂4∶3∶0-SOP4.1混合物的处理在18轮后产生约50nm的颗粒尺寸；制剂4∶2∶0-SOP4.2在18轮后产生约60nm的颗粒尺寸；制剂4∶1∶0-SOP4.4在18轮后导致约80nm的颗粒尺寸。

如图18中所示，向混合物中添加泊洛沙姆(P188)表明，制剂4∶1∶1-SOP4.4在12轮后产生约80nm的颗粒尺寸；制剂4∶2∶1-SOP4.4在12轮后产生约50nm的颗粒尺寸；和制剂4∶3∶1-SOP4.4在12轮后产生约40nm的颗粒尺寸。因此DMPC/CoQ10和DMPC/P188比率在确定颗粒尺寸方面是关键的因素。尽管不希望局限于任何特定理论，据认为P188软化DMPC层并促进较小尺寸颗粒的初始形成。

在某些实施方案中，4∶3和4∶2的CoQ10/DMPC比率利用不同量的P188来调节。如图19中所示的，当CoQ10/DMPC比率为4∶3时，P188浓度对于最终颗粒尺寸没有显著效果。

类似地，如在图20中看到的，改变P188浓度对于4∶2的CoQ10/DMPC比率具有显著的效果。

以下实施例提供了示例性实施方案，其表明与本文中提供的CoQ10胶体状分散体的CoQ10IV制剂的施用相关的用途和方法。

实施例11-辅酶Q10的pK的测定：39只雌性SCID.CB 17小鼠，4-6周龄，在研究给药前适应3-5天。这39只小鼠按照在给药日前采集的平均体重置于每组3只的13个组中。在第0天，组1-6施用单剂没有泊洛沙姆的如本文所述的制剂(制剂1)。组1-6通过制剂1的IV注射施用100mg/kg，且血浆和组织(脾、肝、胰、肺和脑)样品在给药后2h、4h、8h、12h、24h和36h采集。在第0天，组7-12施用单剂具有泊洛沙姆的如本文所述的CoQ10制剂(制剂2)。组7-12通过制剂2的IV注射施用100mg/kg，且血浆和组织(脾、肝、胰、肺和脑)样品在给药后2h、4h、8h、12h、24h和36h采集。组13不接受处理。

进行生物分析以通过使用LC/MS/MS定量小鼠血浆、肝、肺、脾、胰和脑组织中的CoQ10水平。在IV施用后最长36小时的时间CoQ10对于小鼠血浆定量在1-600μg/mL的范围内和对于小鼠组织定量在0.25-100μg/mL的范围内。图22和23提供了血浆中CoQ10制剂1的浓度分布。图24和25提供了血浆中CoQ10制剂2的浓度分布。图26和27分别提供了制剂1和2的肝浓度。图28和29分别提供了制剂1和2的肺浓度。图30和31分别提供了制剂1和2的脾浓度。图32和33分别提供了制剂1和2的胰浓度。图34和35分别提供了制剂1和2的脑浓度。

表4

表5

表6

表7

表8

表9

表10

表11

表12

表13

表14

表15

这一研究的结果表明，不包含泊洛沙姆的制剂1与包含泊洛沙姆的制剂2相比，辅酶Q10更多地在肝和脾中累积。这些结果显示辅酶Q10在不存在泊洛沙姆的情况下更多地通过肝和脾从血液中清除，和在泊洛沙姆存在的情况下辅酶Q10较少地通过这些器官从血液中清除，且这些结果与泊洛沙姆在辅酶Q10制剂中作为调理素作用缩减剂的作用一致。

实施例12-CoQ10IV制剂对肝癌的效应：本发明的辅酶Q10制剂抑制肝肿瘤细胞增殖的能力在动物模型中检验。24只Fischer 344大鼠腹膜内注射恶性绿色瘤的肝克隆。大鼠然后随机分入每组6只的组中。组1用作对照，以0.5mL的磷酸盐缓冲盐水在周一、周三和周五处理，持续三周。组II通过IP注射20mg的辅酶Q10接受无菌纳米分散体。这一制剂包含4重量％的辅酶Q10、3重量％的DMPC和1.5重量％的PBS中的泊洛沙姆188。制剂在周一、周三和周五以0.5mL的体积IP注射施用，持续三周。组III接受35mg/kg的环磷酰胺一次。组IV在周一、周三和周五接受0.5mL的20mg的4∶3∶1.5CoQ10制剂，持续三周。另外，它们接受35mg/kg的环磷酰胺一次。

对照组中的所有动物到移植后第20天时都死于肝转移。在用无菌4∶3∶1.5CoQ10IV纳米分散体制剂处理的组(组II)中，50％的大鼠存活并保持无疾病。其它50％存活38天或更长。在仅用化疗处理的组(组III)中，1只大鼠保持无疾病而其它3只大鼠存活最长到第34天且因此。在接受4∶3∶1.5CoQ10IV制剂和化疗的组(组IV)中，6只大鼠中的5只保持无疾病且1只存活最长到第38天。

4∶3∶1.5CoQ10IV制剂显示更好的安全分布。如通过体重增加和行为证明的，接受CoQ10的动物中未观察到副作用。单独的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂作为单一药剂比单独的化疗显示出更显著的效力。此外，在4∶3∶1.5CoQ10IV制剂用于与化疗组合的情况中，对于存活的效应是协同的，从而产生83％的存活率。图35描绘了这些结果。

总之，CoQ10制剂显示出比化疗改善的安全性，在治疗肝癌中比单独的化疗更有效的显著治疗活性，且显示出在肝癌治疗中与化疗的协同治疗活性。

实施例13-CoQ10IV制剂每日给药对于肝肿瘤的效力：七日龄Fischer344大鼠的组(n＝30/组)腹膜内注射恶性绿色瘤的肝克隆。在6小时后开始，动物在20天内如下每日经腹膜内注射以0.5、2、5、10、25和50mg/kg/天给药：未处理的、盐水对照、媒介对照(DMPC和PBS中的泊洛沙姆188)或4∶3∶1.5CoQ10IV制剂。死亡率如下：在未处理和盐水对照中(至第29天)为30/30；0.5mg/kg/天剂量下(至第29天)为29/30；2mg/kg/天剂量下(至第44天)为27/30或28/30；5mg/kg/天剂量下(至第55天)为24/30；10mg/kg/天剂量下(至第46天)为21/30；25mg/kg/天剂量下(至第46天)为15/30；和50mg/kg/天剂量下(至第53天)为13/30。除了剂量相关的存活率提高外，4∶3∶1.5CoQ10IV制剂延长死亡开始时的天数(即对于未处理和盐水对照大约为第15天，分别与2、5、10、25和50mg/kg/天的大致第25、38、36、40和45天形成对比)且降低死亡率曲线的斜率。

实施例14-CoQ10IV制剂对肺肿瘤的效应：本发明的辅酶Q10制剂抑制肺肿瘤细胞增殖的能力在动物模型中检验。24只Fischer 344大鼠腹膜内注射恶性绿色瘤的肺克隆。大鼠然后随机分入每组6只大鼠的组中。组1用作对照，在三周时间内于周一、周三和周五用0.5mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理。组II接受20mg的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂，其在无菌纳米分散体中以40mg/mL的浓度包含在4∶3∶1.5制剂中的辅酶Q10。该制剂以0.5mL的体积在三周时间内于周一、周三和周五通过IP注射施用。组III通过IP注射接受35mg/kg环磷酰胺一次。组IV经由与用于组II的相同制剂接受20mg的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂，和以0.5mL的体积在三周时间内于周一、周三和周五IP注射，且另外接受35mg/kg环磷酰胺一次。

对照组中的所有动物到移植后的第21天全都由于肺转移而死亡。在用4∶3∶1.5CoQ10IV制剂处理的组(组II)中，50％的大鼠存活并保持无疾病。另外50％存活40天或更长时间。在单独用化疗处理的组(组III)中，1只大鼠保持无疾病而4只大鼠存活最长至第35天。一只动物在对照范围内死亡并因此认为是非反应者。在接受4∶3∶1.5CoQ10IV制剂和化疗的联合治疗的组中，6只大鼠全部保持无疾病。

4∶3∶1.5CoQ10IV制剂表现较好的安全分布。如通过体重增加和行为证明的，接受CoQ10的动物中没有观察到副作用。4∶3∶1.5CoQ10IV制剂单独作为单一药剂显示出比单独的化疗显著的和更高的效力。在其中4∶3∶1.5CoQ10IV制剂与化疗组合使用的情况下，治疗活性是协同的，从而产生100％的存活率。图36描绘了这些结果。

总之，4∶3∶1.5CoQ10制剂表现出与化疗相比改善的安全性，在治疗肺癌方面比单独化疗显著的和更好的治疗活性，和表现出在治疗肺癌方面与化疗协同的治疗活性。

实施例15-通过CoQ10IV制剂体外诱导细胞凋亡：三个细胞凋亡分析，(1)氧消耗率(OCR)，(2)半胱天冬酶3活性分析，和(3)半胱天冬酶3的蛋白质印迹分析用于验证CoQ10制剂对癌细胞的效应。

对于氧消耗率分析，细胞系中的氧消耗率使用Seahorse设备测定。半胱天冬酶3活性按照制造商的说明使用商购的试剂盒利用比色法测定。作为细胞凋亡量度的半胱天冬酶3表达的增加使用对于半胱天冬酶3蛋白质的检测特异性的抗体通过蛋白质印迹分析测定。

两种CoQ10IV制剂的效果使用OCR作为结果输出进行检验。第一制剂(无泊洛沙姆)包括4％CoQ10、3％DMPC和93％的水。第二制剂(具有泊洛沙姆)包括4％CoQ10、3％DMPC、1.5％泊洛沙姆P188和91.5％的水。这两种制剂对于OCR的效应在开始处理后6小时相对于各细胞系的未处理的“单独介质”对照进行评估。50μM和100μM CoQ10的终浓度用于这两种制剂。

如图25-28中所描述的，这一研究的结果证明高度癌性的或转移性的细胞系对于4∶3∶1.5CoQ10IV制剂处理是特别敏感的。测试的大多数癌细胞系具有对于4∶3∶1.5CoQ10IV制剂处理敏感的OCR值。CoQ10IV制剂在HepG2细胞(50和100uM)、MCF-7细胞(100uM)、PC-3细胞(50和100uM)和PaCa2细胞(50和100uM)中降低OCR。非转移性细胞系LnCap和正常细胞系如HDFa对于CoQ10IV制剂不敏感。

半胱天冬酶3水平在用与上面使用的两种相同的CoQ10IV制剂(第一制剂包括4％CoQ10、3％DMPC和93％的水，和第二制剂包括4％CoQ10、3％DMPC、1.5％泊洛沙姆P188和91.5％的水)处理后的各种细胞系中测定。具体地说，PC-3、HepG2、MCF-7、HDFa和MIAPACA2细胞用CoQ10IV制剂处理并在处理24小时后收获。这些细胞的全细胞沉淀用于蛋白质印迹。等同于10μg蛋白质的样品体积使用Lamelli Loading Dye(LDS)和水制备并如下面详细描述的在两个10道的凝胶(每道加载15μL)上在Bis-Tris NovelNuPAGE凝胶上运行。

对于凝胶1(图29和30)，道1含有来自仅用介质处理的MCF-7细胞的样品，道2含有来自用没有泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的MCF-7细胞的样品，道3含有来自用包含泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的MCF-7细胞的样品，道4含有来自仅用介质处理的HDFa细胞的样品，道5含有来自用没有泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的HDFa细胞的样品，道6含有来自用包含泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的HDFa细胞的样品，道7含有来自仅用介质处理的Paca2细胞的样品，道8含有来自用没有泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的Paca2细胞的样品，道9含有来自用包含泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的HDFa细胞的样品，和道10含有标准蛋白质大小标志物。

对于凝胶2(图31和32)，道1含有蛋白质标志物，道2含有来自仅用介质处理的PC3细胞的样品，道3含有来自用没有泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的PC3细胞的样品，道4含有来自用包含泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的PC3细胞的样品，道5含有来自仅用介质处理的HepG2细胞的样品，道6含有来自用没有泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的HepG2细胞的样品，道7含有来自用包含泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的HepG2细胞的样品，道8是空白的且道9和10两者含有蛋白质大小标志物。

凝胶使用1X MOPS缓冲液采用NOVEX Xcell Surelock系统以200V电压运行50分钟。然后凝胶使用NOVEX Xcell Surelock湿式转印方案在35V电压下转印1小时。印迹使用来自Invitrogen的Simply Blue Safestain(LC6065)染色5小时。

进行蛋白质印迹分析以测定上述样品中半胱天冬酶3和β肌动蛋白的水平。为了半胱天冬酶3的检测，在转印后，各印迹置于2个Whatman滤纸之间并干燥15-20分钟。印迹使用甲醇活化5秒，用水洗涤5分钟，和用TBST洗涤15分钟。印迹在室温下用TBS-T中的5％封闭试剂封闭1小时，然后用TBS-T洗涤三次(1X-15′；2X各5′)和用5％BSA中的半胱天冬酶3的初级抗体(Santacruz sc7272)(1∶200稀释度)通过在4℃振摇下孵育过夜来探测。

在用半胱天冬酶3的初级抗体孵育过夜后，印迹用TBS-T洗涤三次(1X-15′；2X各5′)并在室温下振摇的同时用二级抗体(抗小鼠，1∶10,000稀释度)探测1小时。印迹用TBS-T洗涤三次(1X-15′；2X各5′)，用ECF试剂孵育5分钟，且然后各印迹用5100Fuji Laser扫描仪以25uM的分辨率、16比特、绿色激光在400V和500V下进行扫描。

为检测样品中的肌动蛋白，半胱天冬酶3印迹通过用甲醇孵育30分钟剥离，之后用TBS-T洗涤两个10分钟，然后在50℃用剥离缓冲液孵育30分钟，且之后用100mL或更多的TBS-T洗涤两次，每次30分钟。印迹在激光扫描仪中扫描以确认完全剥离。印迹用甲醇活化5秒，用水洗涤5分钟，和用TBST洗涤15分钟。印迹在室温下用TBS-T中的5％封闭试剂封闭1小时，且随后用TBS-T洗涤3次(1X-15′；2X各5′)和在室温下振摇的同时用5％BSA中的肌动蛋白抗体(Sigma#A5316克隆AC 74)(1∶5000的稀释度)探测1小时。

在用肌动蛋白的初级抗体孵育后，膜用TBS-T洗涤3次(1X-15′；2X各5′)和用二级抗体(抗小鼠，1∶10,000的稀释度)在室温振摇下探测1小时。印迹用TBS-T洗涤3次(1X-15′；2X各5′)，用ECF试剂孵育5分钟，且随后各印迹用5100Fuji Laser扫描仪以25uM分辨率、16比特、绿色激光在400V和500V下扫描。

凝胶1的最终蛋白质印迹显示于图29(半胱天冬酶3)和图30(肌动蛋白)中，且凝胶2的最终蛋白质印迹显示于图31(半胱天冬酶3)和图32(肌动蛋白)中。半胱天冬酶3的水平被定量、相对于肌动蛋白标准化且所得的数据呈现于图33-36中。

这一研究的结果表明，标准化的半胱天冬酶3蛋白质水平的增加在用包含泊洛沙姆的CoQ10制剂处理的PC3(图33)和MiaPACA2(图34)细胞中处理后24小时观察到。处理后24小时HepG2细胞中未标准化的半胱天冬酶3蛋白质水平描绘于图35中，因为对于这些样品未获得肌动蛋白。HepG2下带的增加与具有上带的PACA2(图34)和PC-3(图33)细胞中观察到的非常相似。在HDFa细胞中仅检测到下带，且该带的强度随CoQ10处理降低(图36)，与HepG2中对于上带观察到的图案(图35)相似。总之，在CoQ10处理后，半胱天冬酶3蛋白水平的提高在至少PACA2和PC-3细胞两者中观察到，且也很可能在HepG2细胞中观察到，从而表明在这些细胞中诱导细胞凋亡。在正常细胞中，在暴露于CoQ10IV制剂后没有观察到细胞凋亡的诱导。

实施例16-CoQ10IV制剂对胰腺癌细胞系的效应：MiaPACA2，一种胰腺细胞系，用于NSG小鼠上。小鼠在它们被饲养的无菌环境中麻醉。一旦动物达到手术平面麻醉(surgical-plane anesthesia)，小鼠被放平，且触摸腹部区域。胰腺位于胃后面、脾和胃之间，这两者都是可触摸的器官。之后，10X10⁶⁵细胞通过轻柔地操作动物以达到胃后的区域而注射到胰腺中。所有这些过程在生物安全箱中在无菌条件下进行，且动物也在严格无菌条件下饲养以避免机会感染。在注入细胞后，动物每日密切地监测。然后动物随机分入接受不同剂量CoQ10IV制剂的8个组中。组1保持不处理，组2仅接受盐水，组3接受赋形剂对照，组4接受0.5mg/kg的如本文中描述的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂，组5接受5mg/kg的如本文中描述的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂，组6接受10mg/kg的如本文中描述的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂，组7接受25mg/kg的如本文中描述的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂和组8接受50mg/kg的如本文中描述的4∶3∶1.5CoQ10IV制剂。制剂经由尾静脉静脉内施用，每周三次每隔一天给药，持续最多28天。结果的总结描绘于以下曲线图中(图49-56)。

未处理的和盐水处理的对照组中的所有动物到第21天时死亡。赋形剂处理的动物到第36天时死亡。在用CoQ10IV制剂处理后注意到剂量相关的死亡率改善。0.5、5和10mg/kg/剂的剂量分别到第31、41和56天时完全死亡。在25和50mg/kg/剂下，没有观察到完全死亡，而有3和11只动物存活。在5mg/kg/剂和更高剂量下存活率显著提高，且在这些剂量下健康改善。另外，在25和50mg/kg/剂下，存活的动物中分别有3和4只具有肿瘤。50mg/kg的CoQ10IV制剂与阿霉素联用导致存活率的显著改善(与阿霉素组的30只动物中0只存活相比，30只动物中25只在60天时存活)以及没有肿瘤的动物数显著提高(CoQ10IV制剂组25/30)。

实施例17-使用CoQ10IV制剂和化疗辅药的联合疗法：阿霉素，一种有力的化疗剂，当在啮齿动物中以其本身在腹膜内施用时是致死的。CoQ10IV制剂与阿霉素组合施用。如可在图45和46中显示的曲线图中看到的，当阿霉素与4∶3∶1.5CoQ10IV制剂组合施用时，啮齿动物的存活率比阿霉素单独施用时显著提高。

如可在图58中看到的，CoQ10IV不仅是累加的，而且针对阿霉素毒性是保护性的。死亡率是统计学高度显著的低，在第41天时仅开始少数死亡。然而，30只动物中的25只到第60天时保持存活和无癌，6只动物在第60天时表现出小的肿瘤。这些发现证明，施用的辅酶Q10制剂发挥强力的佐剂效应。

实施例18-CoQ10对于乳腺癌的效应：在另一体外研究中，评估了CoQ10(50和100μM)对于两种乳腺癌细胞系(MCF-7和Sk-BR3)中各种Bcl-2家族成员(bcl-2、bcl-xl、bid、bad、bak、mcl-1、bim和bax)、p53和半胱天冬酶4、8、12的效应。Bcl-2蛋白质家族作为主要贡献因子参与形成对癌症治疗的抗性。CoQ10上调促凋亡成员和BH3亚家族成员(bid、bad、bax、bim和bak)的蛋白质表达，显著降低抗凋亡成员(bcl-xl、mcl-1和bcl-2)的水平和增加细胞凋亡(通过半胱天冬酶3、6和9的活化测量)，从而恢复乳腺癌的细胞凋亡潜能而不表现出对于正常乳腺组织的任何副作用。

实施例19-CoQ10IV制剂的吸收/药代动力学：CoQ10IV制剂的药代动力学在静脉内施用100mg/kg的一种或两种CoQ10IV制剂后测定(表16-18)。制剂1不包含任何泊洛沙姆188，而制剂2包含泊洛沙姆188。在各制剂组中存在18只雌性小鼠，且三只小鼠在给药后2、4、8、12、24和36小时处死进行采样。对于这两种制剂，在血浆分布中不存在明显差异。测定了大约38小时的t_1/2值。在三只未处理小鼠的组中没有可测量的CoQ10IV制剂的血浆浓度。

在Sprague Dawley大鼠中CoQ10IV制剂的药代动力学参数在两项毒性研究的毒物代谢动力学评估中测定。Charles River研究号20000711是具有后续7天处理期的剂量升高的研究。对于剂量升高阶段中的毒物代谢动力学评估(表18)，九只雄性和九只雌性大鼠的组接受作为单一浓注静脉内注射的100、250、750和1,000mg/kg CoQ10IV制剂。对于多剂量阶段(表19)，九只雄性和九只雌性动物的组每三天接受作为浓注静脉内注射的250或500mg/kg CoQ10IV制剂，持续7天。对于剂量升高阶段和多剂量阶段的第7天，在给药前、给药后5和15分钟及1、4和24小时从三只雄性和三只雌性动物的亚组收集样品。对于接受100、250或500mg/kg的动物，许多浓度高于1mg/mL，且对于接受750或1,000mg/kg的动物，相当多的浓度高于10mg/mL，和其余样品中许多高于1mg/mL。血浆分布不是静脉内施用典型的分布。虽然C_max和AUC_0-t通常随剂量增加，但其中存在例外，且不存在明显的线性剂量相关性，这对于静脉内施用是可预想的。估计的t_1/2值范围为0.8至10.0小时，且对于性别或剂量不存在明显相关性。

单次给药后的药代动力学

表16

单次给药后的药代动力学(续)

表17

单次给药后的药代动力学(续)

表18

重复给药(7天或更短)后的药代动力学

表19

在第二大鼠毒性研究(Charles River研究号20000328)中，CoQ10作为1.0mL/min速率的短静脉内输注施用，一周三次，持续四周。对于毒物代谢动力学评估，九只雄性和九只雌性动物的三个组接受62.5、125和250mg/kgCoQ10IV制剂(表20)。在第1和26天，在给药后5和15分钟及1、4、24和48小时从三只雄性和三只雌性动物的亚组收集样品。CoQ10IV制剂的峰值系统暴露(如通过C_max测量的)和总的暴露(如通过AUC_0-t测量的)随着提高的剂量增加。C_max的增加接近于与剂量成线性，且AUC_0-t的增加略微大于剂量比例。在第1天与第26天之间，C_max和AUC_0-t降低。T_max在0.083或0.25小时(前两个采样时间)出现。可能存在小的剂量依赖性的t_1/2增加。没有明显的性别差异。

重复给药(4周)后的药代动力学

表20

CoQ10IV制剂在比格犬中的药代动力学参数在两项毒性研究的毒物代谢动力学评估中测定。Charles River研究号20000713是具有后续的5-7天处理期的剂量增加研究。在该研究的剂量增加阶段(表16-18)，两只雄性和两只雌性狗的一个组接受作为单次浓注的静脉内注射的250mg/kg CoQ10IV制剂。在该研究的多剂量阶段(表19)，两只雄性和两只雌性狗的一个组在第1、3和5天接受作为浓注静脉内注射的125mg/kg CoQ10IV制剂。对于雄性动物在第5天，CoQ10IV制剂的量不确定的，且雄性在第7天再次给药。在剂量增加阶段的第1天及在多剂量阶段的第1天和第5天(雌性)或第7天(雄性)，血浆样品在给药后的5和15分钟及1、4和24小时收集。如通过C_max和AUC_0-24测量的药物暴露对于250mg/kg大约为125mg/kg的两倍高。对于250mg/kg(5.94-8.16hr)可能具有比125mg/kg(2.07-4.87hr)更长的半衰期。在以交替日给药的过程中，对于雄性动物在第1天和第7天参数是相似的及对于雌性动物在第1天和第5天参数是相似的。对于任何药代动力学参数不存在一致的性别差异。

在第二项狗毒性研究(Charles River研究号20000334)中，CoQ10IV制剂以5.0mL/min的速率作为短静脉内输注施用，一周三次，持续四周。5只雄性和5只雌性狗的四个组接受媒介、31.25、62.5或125mg/kg CoQ10IV制剂(表20)。血浆样品在第1天和第26天的给药前、给药后5、15和30分钟及1、2、4、8和24小时收集。在两个采样日对于两种性别，C_max、AUC_0-t和AUC_0-∞随剂量提高。C_max的提高在第1天高于剂量比例，但在第26天接近于剂量比例。在第1和第26天AUC_0-t的提高高于剂量比例，但是非线性的幅度在第26天较低。在第1天和第26天之间，对于低-和中等-剂量组存在平均C_max和AUC_0-t的轻微或小的变化，表明对于这两个较低剂量组，药物暴露的很小变化。对于高剂量组，在第1天和第26天之间，平均C_max和AUC_0-t都降低。一只高剂量雌性动物是例外，其具有0.5hr的T_max值，所有其它T_max值在第一和第二采样时间出现。对于在这两天的低-和中等-剂量组和在第26天的高剂量动物，平均t_1/2值范围为1.91-3.62hr。对于在第1天的高剂量雄性和雌性动物，平均t_1/2值分别为3.92和4.14hr。对于任何药代动力学参数不存在明显的性别差异。

非GLP四周毒性研究使用亚成年雄性恒河猴进行(Mannheimer基金会研究2010-01)。四只恒河猴的组通过静脉内注射接受媒介、31.25、62.5或125mg/kg的CoQ10，每周三周，持续四周。用于毒物代谢动力学分析的血浆样品在给药前、在给药第1天的给药后0.25、1、6、24和48小时收集。给药前而非给药后样品在第7、14、21和29天收集。初步结果表明C_max和AUC_0-t随提高的剂量增加。C_max的增加略微高于直接剂量比例。AUC_0-t的增加明显地大幅高于直接剂量比例，但非线性可能部分地是采样时间安排的反映。T_max在第一采样时间(0.25小时)出现，除了一只动物具有1小时的T_max。由于缺乏6和24小时之间的采样时间，对于t_1/2不能获得确实的结论。

大鼠、狗和恒河猴的四周毒性研究表明，C_max和AUC_0-t随剂量增加。对于某些增加观察到非线性，但对于其它增加观察到线性。大鼠和狗的研究(其包括两种性别的动物)未揭示药代动力学的任何明显的性别差异。

肝、肺、脾、胰和脑的样品在单次施用制剂1或2中的100mg/kg CoQ10后从小鼠收集(表21-23)。肝、肺、脾和胰的样品在给药后2、4、8、12、24和36小时收集。脑的样品在给药后12、24和36小时收集。所有组织的样品也从未处理的小鼠收集。来自未处理小鼠的样品中没有任何一个具有任何可测量的CoQ10浓度。给药后样品的结果对于制剂1和制剂2是相似的。对于组织的结果表明，肝和脾具有CoQ10IV制剂的高摄取，肺具有中等的摄取，和脾具有非常少的摄取。对于脑的非常有限的数据表明可能的脑水平类似于血浆浓度，至少在12至36小时。

药代动力学：器官分布

表21

药代动力学：器官分布(续)

表22

药代动力学：器官分布(续)

表23

在Charles River研究号20000328中，肝、肺、胰和脑的样品在每周三次静脉内施用0、62.5、125或250mg/kg/剂的CoQ10IV制剂的四周时间结束后的大约72小时从大鼠收集(表21-23)。在来自对照组的任何组织中没有可测量浓度的CoQ10IV制剂。在给药后72小时，在肝中具有大致线性剂量相关的高浓度。肺和胰中的浓度低于肝中。高剂量雄性动物中仅两只在脑中具有可测量的CoQ10IV制剂浓度，所有其它动物没有可测量的浓度。在组织浓度上没有明显的性别差异。

在Charles River研究号20000334中，肝、肺、胰和脑的样品在每周三次静脉内施用0、31.25、62.5或125mg/kg/剂的CoQ10的四周时间结束后的大约72小时从狗收集(表21-23)。在来自对照组的肺、胰或脑样品中没有可测量的CoQ10IV制剂浓度。对照组中的两只雄性动物在肝样品中具有低水平的CoQ10IV制剂，表明内源CoQ10IV制剂的低水平。在给药后72小时，在来自CoQ10IV制剂处理的狗的肝样品中具有高浓度。平均浓度是大致线性地剂量相关的。肺中的浓度低于肝中浓度的1％。胰或脑样品中没有一个具有可测量的浓度。在组织浓度上没有明显的性别差异。

图47显示了雄性和雌性大鼠和狗相对于剂量的平均CoQ10IV制剂肝浓度。其表明剂量相关性对于大鼠和狗是相似的，且对于任一物种不存在明显的性别差异。

大鼠和狗中的四周毒性研究表明，C_max和AUC_0-t随剂量增加。对于某些增加观察到非线性，但对于其它的增加观察到线性。大鼠和狗的研究(其包括两种性别的动物)没有显示药代动力学的任何明显的性别差异。

小鼠中的组织分布研究的结果表明肝和脾具有对CoQ10IV制剂的高摄取，肺具有中等的摄取和胰具有非常少的摄取。对于小鼠脑的非常有限的数据表明可能的脑水平类似于血浆浓度，至少在12至36小时。公开的大鼠和小鼠中的分布研究总体上与来自小鼠的CoQ10IV制剂研究的有限数据相符。

在四周处理期间的最后剂量后72小时采集的尸检样品显示在肝中的高CoQ10IV制剂浓度、在肺中的较低浓度、在胰中的低(大鼠)或非可测量的(狗)浓度及在任一物种的脑中的不可测量的水平。平均肝浓度的剂量相关性对于大鼠和狗是相似的。在组织浓度上没有明显的性别差异。

实施例20-大鼠中CoQ10IV制剂的单剂量毒理学研究：在大鼠的单剂量毒性研究中，Sprague-Dawley大鼠(n＝3只/性别/组)经尾静脉以100、250、750mg/kg(使用45.9mg/mL制剂)及750和1000mg/kg(使用80mg/mL制剂)接受CoQ10制剂的单次IV注射(Charles River研究号20000711；表24)。动物给药后观察三天。一个另外的组(3只/性别)仅接受媒介(3％DMPC和1.5％泊洛沙姆188)。另外的9只/性别/组的组类似地进行处理并用于毒物代谢动力学研究。评价的参数包括死亡率和对处理的反应、详细的检验、体重、食物消耗、血液学和临床化学、宏观病理学和器官重量。对来自所有组(除了750mg/kg(45.9mg/mL))的动物的有限数目的组织(心脏、肾、肝、肺、胰、变色的皮肤样品、淋巴结)进行组织病理学检查。毒物代谢动力学在各次剂量后评估。

以100和250mg/kg(使用45.9mg/mL制剂)处理的动物在单剂量后未显示明显的测试物相关效应，且血液学数据一般是不显著的。750和1000mg/kg的剂量(使用80mg/mL制剂)产生死亡率(在750mg/kg下各性别的两只动物和1000mg/kg下的两只雌性动物)。以45.9mg/mL制剂给予750mg/kg的一只雌性动物也死亡。这些动物在给药日表现为正常，但在次日发现死亡或垂死而处死。

对于体重或食物消耗没有一致的效应。临床化学数据也是不显著的。

750和1000mg/kg下的尸检发现显示胸腔积液和变色肝；在100和250mg/kg下注意到变色的淋巴结。来自死亡的以750和1000mg/kg处理的动物的组织病理学评估显示了胸腔积液、注射部位损伤和组织变色。肾小球中的纤维蛋白沉积在750mg/kg下死亡的两只雄性动物中看到，但没有在1000mg/kg下死亡的两只雌性动物中看到。肺中的纤维蛋白沉积在两个剂量下死亡的动物中都看到。肝坏死在750mg/kg下死亡的一只动物中看到。组织在这两个剂量下存活的动物中一般是正常的，除了在注射部位的血管炎症。媒介处理的动物的评估一般是不显著的，除了肾中的嗜曙红晶体(一只雌性动物)、肺中的肺泡上皮细胞增生(一只雌性动物)和胰中的最小炎症(一只雌性动物)。这些变化可能是偶然的。

实施例21-狗中CoQ10IV制剂的单剂量毒理学研究：比格犬(n＝1或2/性别)接受作为250和125mg/kg的缓慢浓注IV注射的单剂量无菌CoQ10纳米悬浮液注射(Charles River Laboratories研究号20000713；表24)。为评估在250mg/kg下观察到的所观察显著毒性后媒介的可能效应(使用含有6％DMPC和3％泊洛沙姆188的媒介)，狗的另外的组用媒介(6％DMPC和3％泊洛沙姆)、“完全”媒介(3％DMPC和1.5％泊洛沙姆188)或PBS/泊洛沙姆(PBS中DMPC的合适制剂可能未制备)处理。基于45.9mg/mL的CoQ10浓度的制剂，用于250mg/kg剂量和用于媒介的初始注射率为5.44mL/kg。基于35.6mg/mL的CoQ10浓度的制剂，用于125mg/kg剂量的注射率为3.51mL/kg。评价的参数包括死亡率和对处理的反应、详细的检验、体重、食物消耗、血液学和生物化学、宏观病理学和器官重量及有限的组织病理学检查(来自以250mg/kg、媒介和完全媒介给药的狗的心脏、肾、肝、肺、胰、变色皮肤)。毒物代谢动力学在各次剂量后评估。

以250mg/kg给药的两只雄性和两只雌性动物在第2天由于严重的不良临床征象而被垂死处死。为评估媒介的可能作用，媒介施用于1只动物/性别的另一个组。所观察到的反应是与对于250mg/kg处理的动物所看到的相同的(包括垂死处死)，表明这一剂量的媒介造成部分(如果不是全部)注意到的效应。这一点在另一雄性和雌性动物以相同的5.44mL/kg的比率给予完全媒介时得到确认。PBS和泊洛沙姆188施用于另一雄性和雌性狗未产生这些效应，表明具有较高浓度赋形剂的媒介制剂中的DMPC是引起该效应的成分。在1只动物/性别的第5组中，药物制剂使用3.51mL/kg的减小给药体积以125mg/kg给予。效应局限于呕吐和软便，但动物存活。

在体重、食物消耗、临床病理(溶血作用)、肾、胃肠道、胆囊和膀胱中的宏观病理改变及与肾和肝中的溶血作用一致的微观变化方面的不良反应仅在施用250mg/k剂量、媒介和完全媒介的动物中看到。在施用PBS/泊洛沙姆188或125mg/kg的狗中没有发现。

毒物代谢动力学数据显示了250mg/kg/剂与125mg/kg/剂相比，C_max和AUC的剂量比例的增加和半衰期的略微增加。

实施例22-大鼠中CoQ10IV制剂的重复剂量毒理学研究：在大鼠的一周重复剂量研究中，5只大鼠/性别的两个组每3天接受250和500mg/kg，总共3个剂量(Charles River Laboratories研究号20000711；表25)。评估的参数包括死亡率和对处理的反应、详细检验、体重和宏观病理学(在死亡的动物上进行)。对这些动物不进行组织病理学检查。在处理的最后一天评估毒物代谢动力学。在250mg/kg/剂下没有观察到不良临床征象。在500mg/kg/剂下，四只动物死亡或在垂死状态中处死：两只雄性动物在第2天死亡，一只雌性动物在第3天垂死而被安乐死(低体温的临床征象和降低的活性)，且一只雌性动物在第6天死亡。在500mg/kg/剂下的存活者未显示不良临床征象。在两种剂量下的动物到第4天一般体重得到维持(雄性)或体重增加(雌性)，且随后发生轻微的体重损失。血液学数据表明在500mg/kg/天剂量下网织红细胞和各种白细胞类型增加。在处理期结束(三剂)时，在接受500mg/kg/剂的动物中观察到ALT、AST、GGT和尿素氮值的提高以及总蛋白质、白蛋白和球蛋白的降低。在尸检时，观察到变色的淋巴结、皮肤的皮下层的变色和苍白肝以及注射部位损伤。与250mg/kg/剂的动物相比，注意到胸腺、附睾、前列腺、精囊、卵巢和子宫重量的下降，以及雌性动物中肝重量的增加。未进行组织病理学检查。

毒物代谢动力学表明，一般地，CoQ10的血浆浓度、C_max和AUC_0-t值随提高的剂量增加。基于这些结果，选择250mg/kg/剂作为确定性研究中的高剂量。

实施例23-大鼠中CoQ10IV制剂的4周重复剂量毒理学研究：四组年轻成年Sprague Dawley大鼠(n＝10只/性别/组)通过每周三次的IV注射接受媒介(含泊洛沙姆188的PBS和DMPC)或0、62.5、125和250mg/kg剂量的测试物(Charles River Laboratories研究号20000328；表26)。另外的5只大鼠/性别包括在各组中并在处理后保持2周的恢复期。提供具有40mg/mL CoQ10目标浓度的单批次(#0494-02-021)的测试物用于研究。62.5、125和250mg/kg的剂量分别使用1.56、3.13和6.25mL/kg的给药体积实现。媒介以与高剂量组相同的给药体积施用。另外，9只动物/性别的3个组用作毒物代谢动力学(TK)动物并以与主要研究组相同的方式接受测试物。评估的参数包括笼侧(cageside)观察、临床观察、体重、食物消耗、眼科学、临床病理学评估(血液学、凝血测试、临床化学和尿分析)、宏观病理学和器官重量。对于对照和高剂量组中在处理期结束时处死的动物的所有组织及对于低和中等剂量组中的动物的骨髓、肾、肝、下颌淋巴结和肠系膜淋巴结及脾进行组织病理学检查。对恢复期处死的动物的检验限于显示出宏观损伤的那些组织，并包括肝和淋巴结。用于测定测试物的血浆浓度的血样在第1和28天(在最后一次给药后)给药后的5、15和60分钟及4、24和48小时从每剂量组每性别的三只TK动物的同龄组收集。

重复剂量毒性报告标题：通过静脉内(浓注)注射施用于大鼠的31510的4周毒性研究，具有2周恢复期

表26

所有动物存活到终点进行安乐死。没有观察到临床观察、眼科学、血液学或尿分析参数方面的不良的测试物相关效应。对于以高剂量处理的动物观察到体重增加量和食物消耗量的减少，和对于中等剂量处理的动物观察到较低程度的体重增加量和食物消耗量的减少。在非处理期结束时观察到某些恢复。

血液学数据的评价揭示了红细胞参数的轻微但不一致的降低，这主要限于高剂量雄性动物。网织红细胞未受到有意义的影响。激活的部分促凝血酶原激酶时间高剂量动物中有些长，这倾向于坚持到完成恢复期。仅在最高剂量下观察到总白细胞计数的提升，这也反映在嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或淋巴细胞的增加。临床化学数据揭示了高剂量雄性动物在治疗期结束时AST、ALT、GGT和胆固醇的增加值且在恢复期结束时更明显。对于雌性动物，仅在恢复期结束时观察到增加。

在尸检(终点和恢复)时，测试物相关的宏观改变包括在62.5mg/kg/剂和以上的剂量下肝苍白变色和多淋巴结苍白变色/增大、在125mg/kg/剂和以上的剂量下脾增大及在250mg/kg/剂剂量下的苍白肾上腺、苍白卵巢和皮下皮肤变色。在250mg/kg/剂剂量下脾和肝重量在终点和恢复尸检时增加。

在第29天预定终点时的测试物相关组织病理学发现包括轻微至中度的肾上腺皮层胞质空泡形成(250mg/kg/剂)、雄性动物的最小到轻微的胸骨骨髓红细胞增生(≥125mg/kg/剂)、轻微到明显的注射部位单核细胞浸润(250mg/kg/剂)、最小到轻微的肝细胞胞质空泡形成(≥62.5mg/kg/剂)、最小到中度的肝的组织细胞浸润(≥62.5mg/kg/剂)、最小到轻微的多淋巴结的组织细胞浸润(≥62.5mg/kg/剂)、轻微到中度的雌性动物卵巢的组织细胞浸润(250mg/kg/剂，雌性动物)、轻微到中度的雌性动物真皮和/或皮下组织的组织细胞浸润(≥125mg/kg/剂)及雄性动物(≥125mg/kg/剂)和雌性动物(≥62.5mg/kg/剂)的最小到中度的脾组织细胞浸润。在恢复的动物中，如在主研究动物中观察到的一样，注意到相似的测试物相关损伤，这些改变的严重程度遵循剂量-反应。发现包括：在≥62.5mg/kg/剂下(雄性动物和雌性动物)最小到明显的肾上腺皮层空泡形成、≥125mg/kg/剂下(雄性动物和雌性动物)最小到中度的局灶性或多病灶性肝坏死、≥62.5mg/kg/剂下(雄性动物和雌性动物)最小到中度的肝组织细胞浸润和空泡形成、≥62.5mg/kg/剂下(雄性动物和雌性动物)最小到中度的淋巴结组织细胞浸润、≥62.5mg/kg/剂下(雄性动物和雌性动物)最小到明显的脾组织细胞浸润和≥62.5mg/kg/剂下(雌性动物)最小到中度的卵巢组织细胞浸润。在几种器官/组织中，在恢复的动物中(特别是125和250mg/kg/剂下)观察到的改变的严重程度比在终点尸检时更明显，包括肾上腺、肝和另外的淋巴结(髂、肾、胰、子宫颈、腘、纵隔和/或上臂)。

毒物代谢动力学分析揭示按剂量比例的或高于剂量比例的方式提高的Cmax和AUC。在第26天的值相对于第1天显著较低。不存在明显的性别差异。相关数据的表格报告显示如下(表27)。

基于这些数据，STD10确定为62.5mg/kg/剂。

表27

在狗中进行的一周毒性研究中，2只狗/性别的一个组每3天接受125mg/kg，共3个剂量(Charles River Laboratories研究号20000713；表25)。评估的参数包括死亡率和对治疗的反应、详细检查、体重、食物消耗、心脏学参数、血液学和临床化学参数、器官重量和宏观病理学。对这些动物不进行组织病理学检查。毒物代谢动力学在处理的最后一天进行评估。

在125mg/kg/剂水平下对于任何评估的参数没有观察到不良反应，除了在治疗期结束时红细胞量和形态的轻微下降。

毒物代谢动力学数据表明CoQ10IV制剂的血浆浓度及Cmax、AUC_0-24和AUC_0-∞的平均值在施用的第一和第三剂之间是相当的。

基于这些结果，选择125mg/kg/剂作为确定性的狗的研究中的高剂量。

在狗中进行的4周重复剂量研究中，四组的比格犬(n＝3只/性别/组)通过IV注射每天接受媒介或含31.25、62.5和125mg/kg剂量的CoQ10IV制剂的药物产品，进行四周(Charles River Laboratories研究号20000334；表28)。各组中包括另外的2只狗/性别并在处理后维持2周的恢复。40mg/mL的单一测试物浓度用于该研究。分别使用0.78、1.56和3.13mL/kg的剂量体积实现31.25、62.5和125mg/kg的剂量。评估的参数包括笼侧观察、临床观察、体重、食物消耗、眼科学、心电图学、临床病理学、宏观病理学、器官重量和组织病理学。用于测定CoQ10IV制剂的血浆浓度的血液样品在第1天和第26天的给药前以及在给药后的5、15、30和60分钟及2、4、8和24小时收集。

重复剂量毒性    报告标题：通过静脉内(浓注)注射施用于狗的31510的4周毒性研究，具有2周恢复期

表28

所有动物存活到治疗期结束。一只高剂量雌性狗(125mg/kg/天)在恢复期第二周期间在垂死状态中处死。临死前征象包括食物消耗减少、体重损失、肝脏酶的升高和尸检时苍白外观的肝，但确定的死亡原因未在该动物组织的组织病理学评估后确定。

在所有其它动物中，在临床观察、体重、食物消耗、眼科学和心电图评估、临床病理学、肉眼检查和器官重量参数中未观察到不良的测试物相关发现。对于媒介和高剂量处理的动物在处理期结束时注意到网织红细胞计数的提高，其仅在雄性动物中持续到恢复期结束时。不能排除与制剂媒介的相关性。在尸检时，肉眼观察限于在中和高剂量组的肝的苍白外观，这在恢复期尸检时也看到。在组织病理学方面，在任何组织(除肝以外)没有看到形态改变。肝细胞糖原沉积在所有组中确认，包括媒介处理组。在这些动物的肝中没有看到不良变化。在恢复期后，这些微观改变限于中和高剂量动物。

毒物代谢动力学评估揭示，随剂量增加提高的药物暴露具有倾向高于剂量比例的C_max和AUC提高。不存在明显的性别差异，且在大多数情况中，暴露参数在第1天和第26天相似，除了高剂量动物在第26天的值降低。相关参数的表格总结如下所示(表29)。

基于来自这一4周重复剂量毒性研究的数据，HNSTD确定为62.5mg/kg/剂。

表29

IX.相关参考文献

本申请中引用的所有公开和专利文献对于所有目的在相关部分中通过引用并入，其程度正如各单个公开或专利文献单独地表示在相关部分中通过引用并入一样。在本文中对于各个参考文献的引用，申请人并非承认任何特定参考文献的公开内容为“现有技术”。应理解，尽管本公开结合其详细说明进行了描述，但前面的说明意图是说明性的而非限制本公开的范围，该范围应由所附权利要求的范围限定。其它的方面、优点和改进包含在下面权利要求及其等同物的范围内。

所有附图以图解而非限制的方式提供。尽管提供了特定的实施例，本说明书是说明性的而非限制性的。前面描述的实施方式的任何一个或多个特征可以以任何方式与本公开中的任何其它实施方式的一个或多个特征组合。此外，本公开的许多改变对于本领域技术人员在阅读了本公开后是显而易见的。

等同

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规试验确定本文中描述的本发明特定实施方式的许多等同方式。这些等同方式意图包括在以下权利要求中。

Claims (78)

1.适合静脉内施用于受试者的治疗制剂，包含：

水性溶液；

分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂；和

分散稳定剂和调理素作用缩减剂中的至少一种；

其中活性剂的胶体状纳米分散体分散成平均尺寸小于200nm的纳米分散体颗粒。

2.权利要求1的制剂，其中所述分散稳定剂选自聚乙二醇化蓖麻油、CremphorEL、Cremophor RH 40、聚乙二醇化维生素E、维生素E TPGS和二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)。

3.权利要求2的制剂，其中所述分散稳定剂是DMPC。

4.权利要求1的制剂，其中所述调理素作用缩减剂选自泊洛沙姆和poloxamine。

5.权利要求4的制剂，其中所述调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188。

6.权利要求1的制剂，其中所述疏水活性剂是辅酶Q10(CoQ10)。

7.前述权利要求任一项的制剂，其中所述疏水活性剂是CoQ10，所述调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188和所述分散稳定剂是DMPC。

8.权利要求1的制剂，其中所述胶体状纳米分散体是悬浮液。

9.权利要求1的制剂，其中所述胶体状纳米分散体是乳液。

10.权利要求1的制剂，其中所述胶体状纳米分散体的活性剂是晶体形式。

11.权利要求1的制剂，其中所述胶体状纳米分散体的活性剂是超冷熔体形式。

12.权利要求7的制剂，其中所述制剂分别具有4％、3％和1.5％重量/体积比的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。

13.权利要求7的制剂，其中所述制剂分别具有8％、6％和3％重量/体积比的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。

14.权利要求1的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸为约10nm至约200nm。

15.权利要求1的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸为约10nm至约100nm。

16.权利要求1的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸为约30nm至约80nm。

17.权利要求1的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸为约35nm至约40nm。

18.权利要求1的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸小于约45nm。

19.适合静脉内施用于受试者的治疗制剂，包含：

水性溶液；

分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂；和

分散稳定剂和调理素作用缩减剂中的至少一种；

其中所述活性剂的胶体状纳米分散体分散成尺寸小于200nm的脂质体。

20.权利要求19的制剂，其中所述脂质体是单层的。

21.权利要求19的制剂，其中所述脂质体是双层的复层脂质体，其具有该双层之间的水性空间和该双层内的亲脂性空间。

22.权利要求21的制剂，其中所述疏水活性剂封闭在所述双层的亲脂性空间内。

23.权利要求21的制剂，其中所述复层脂质体进一步包括封闭在所述双层之间的水性空间中的亲水试剂。

24.适合静脉内施用于受试者的治疗制剂，包含：

水性溶液；

分散以形成颗粒胶体状纳米分散体的疏水活性剂；和

DMPC和调理素作用缩减剂。

25.权利要求24的制剂，其中所述调理素作用缩减剂选自泊洛沙姆和poloxamine。

26.权利要求24的制剂，其中所述调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188。

27.权利要求24的制剂，其中所述疏水活性剂是辅酶Q10(CoQ10)。

28.权利要求24的制剂，其中所述疏水活性剂是辅酶Q10(CoQ10)和所述调理素作用缩减剂是泊洛沙姆188。

29.权利要求28的制剂，其中所述制剂分别具有4％、3％和1.5％重量/体积比的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。

30.权利要求28的制剂，其中所述制剂分别具有8％、6％和3％重量/体积比的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。

31.权利要求24的制剂，其中所述胶体状纳米分散体为悬浮液。

32.权利要求24的制剂，其中所述胶体状纳米分散体为乳液。

33.权利要求24的制剂，其中所述胶体状纳米分散体的活性剂为晶体形式。

34.权利要求24的制剂，其中所述胶体状纳米分散体的活性剂为超冷熔体形式。

35.适合静脉内施用于受试者的治疗制剂，包含：

水性溶液；

分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的疏水活性剂；和

DMPC；

其中所述活性剂的胶体状纳米分散体分散成平均尺寸小于200nm的纳米分散体颗粒。

36.权利要求35的制剂，其中所述疏水活性剂是辅酶Q10(CoQ10)。

37.权利要求35的制剂，其中所述胶体状纳米分散体为悬浮液。

38.权利要求35的制剂，其中所述胶体状纳米分散体为乳液。

39.权利要求35的制剂，其中所述胶体状纳米分散体的活性剂为晶体形式。

40.权利要求35的制剂，其中所述胶体状纳米分散体的活性剂为超冷熔体形式。

41.权利要求36的制剂，其中所述制剂分别具有4％和3％重量/体积比的CoQ10和DMPC。

42.权利要求36的制剂，其中所述制剂分别具有8％和6％重量/体积比的CoQ10和DMPC。

43.权利要求35的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸为约10nm至约200nm。

44.权利要求35的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸为约10nm至约100nm。

45.权利要求35的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸为约30nm至约80nm。

46.权利要求35的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸为约35nm至约40nm。

47.权利要求35的制剂，其中所述纳米分散体颗粒的平均尺寸小于约45nm。

48.适合静脉内施用于受试者的治疗制剂，包含：

水性溶液；

分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的CoQ10；

选自聚乙二醇化蓖麻油、Cremphor EL、Cremophor RH 40、聚乙二醇化维生素E、维生素E TPGS和二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)的分散稳定剂；和

选自泊洛沙姆和poloxamine的调理素作用缩减剂；

其中所述CoQ10的胶体状纳米分散体分散成平均尺寸为10nm至100nm的纳米分散体颗粒。

49.适合静脉内施用于受试者的治疗制剂，包含：

水性溶液；

分散以形成颗粒的胶体状纳米分散体的CoQ10；

DMPC；和

泊洛沙姆188；

其中所述CoQ10的胶体状纳米分散体分散成平均尺寸为30nm至80nm的纳米分散体颗粒。

50.制备权利要求1的治疗制剂的方法，其中该方法包括通过以下步骤利用高压均质化使疏水活性剂分散：

将疏水活性剂添加到65℃水浴中并混合以形成疏水活性剂/水混合物；

向所述疏水活性剂/水混合物中加入分散稳定剂并在65℃下混合以形成疏水活性剂/水/稳定剂混合物；

加入调理素作用缩减剂以形成疏水活性剂/水/稳定剂/缩减剂混合物；

预热微射流均质机到65℃；和

通过在65℃的微射流均质机中混合所述疏水活性剂/水/稳定剂/缩减剂混合物进行加工，以使得形成平均粒径小于200nm的疏水活性剂胶体状纳米分散体。

51.权利要求1的治疗制剂，通过权利要求50的方法制备。

52.权利要求50的方法，其中所述分散稳定剂选自聚乙二醇化蓖麻油、Cremphor EL、Cremophor RH 40、聚乙二醇化维生素E、维生素E TPGS和二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)。

53.权利要求52的方法，其中所述分散稳定剂为DMPC。

54.权利要求50的方法，其中所述调理素作用缩减剂选自泊洛沙姆和poloxamine。

55.权利要求54的方法，其中所述调理素作用缩减剂为泊洛沙姆188。

56.权利要求50的方法，其中所述调理素作用缩减剂为泊洛沙姆188和所述分散稳定剂为DMPC。

57.权利要求50的方法，其中所述疏水活性剂为CoQ10。

58.权利要求50的方法，其中所述疏水活性剂为CoQ10，所述调理素作用缩减剂为泊洛沙姆188和所述分散稳定剂为DMPC。

59.权利要求57或58的方法，其中所述胶体状纳米分散体的CoQ10为超冷熔体的形式。

60.权利要求58的方法，其中所述制剂分别具有4％、3％和1.5％重量/体积比的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。

61.权利要求58的方法，其中所述制剂分别具有8％、6％和3％重量/体积比的CoQ10、DMPC和泊洛沙姆188。

62.权利要求50的方法，其中形成平均尺寸为10nm至100nm的疏水活性剂胶体状纳米分散体。

63.权利要求50的方法，其中形成平均尺寸为35nm至40nm的疏水活性剂胶体状纳米分散体。

64.权利要求50的方法，其中形成平均尺寸小于约45nm的疏水活性剂胶体状纳米分散体。

65.权利要求50的方法，进一步包括冻干所述胶体状纳米分散体以使所述CoQ10胶体状纳米分散体颗粒结晶的步骤。

66.权利要求65的方法，进一步包括加入冻干保护剂的步骤。

67.权利要求66的方法，其中所述冻干保护剂为营养糖。

68.权利要求67的方法，其中所述营养糖选自乳糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神经氨酸、葡糖胺、半乳糖胺、N-甲基葡糖胺、甘露醇、山梨糖醇、精氨酸、甘氨酸和蔗糖。

69.治疗或预防受试者的肿瘤疾病的方法，包括：

向所述受试者静脉内施用权利要求1-49中任一项所述的治疗制剂，从而实现所述肿瘤疾病的治疗或预防。

70.权利要求69的方法，其中所述静脉内施用是通过经选择以在受试者中提供对于所治疗的肿瘤疾病的效力的剂量。

71.权利要求69的方法，其中所述肿瘤疾病是侵袭性的或转移性的肿瘤疾病。

72.权利要求71的方法，其中所述侵袭性的或转移性的肿瘤疾病选自胰腺癌、肝细胞癌、尤文氏肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑色素瘤、脑癌(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、雄激素依赖性前列腺癌、卵巢癌和非霍奇金氏淋巴瘤。

73.权利要求69的方法，其中所述肿瘤疾病是非侵袭性肿瘤疾病。

74.权利要求73的方法，其中所述非侵袭性肿瘤疾病选自非转移性乳腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、小细胞肺癌和急性淋巴细胞性白血病。

75.权利要求69的方法，其中所述制剂包含约4％的辅酶Q10、3％的DMPC和1.5％的泊洛沙姆188。

76.用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，包括：

向所述受试者静脉内施用权利要求1-49中任一项所述的治疗制剂，从而抑制肿瘤细胞生长。

77.权利要求76的方法，其中所述静脉内施用是通过经选择以在受试者中提供抑制肿瘤细胞生长的效力的剂量。

78.权利要求76的方法，其中所述制剂包含约4％的辅酶Q10、3％的DMPC和1.5％的泊洛沙姆188。

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