CN102652175A - 织物和家居护理产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含一种或多种冷水蛋白酶的织物和家居护理产品，以及用于制造和使用此类产品的方法。此类组合物提供改善的清洁和新鲜度。此类冷水蛋白酶可通过对一个或多个亲本酶的氨基酸的取代、插入和/或删除而来源于亲本酶，所述亲本酶包括BPN′枯草杆菌蛋白酶和来源于迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。

Description

织物和家居护理产品
发明领域
本发明涉及包含冷水蛋白酶的织物和家居护理产品，以及制造和使用此类织物和家居护理产品的方法。
发明背景
洗涤剂制造商将蛋白酶掺入他们的产品中，以提供对污渍(例如血迹)的良好清洁。然而，考虑到可持续性和消费者降低洗涤温度的趋势，要实现消费者可接受的有益效果被证明越来越困难，依然存在改进这些衣物洗涤剂组合物的清洁和新鲜度特征的需求。发明人已发现，向织物和家居护理产品，例如包含调色剂、清洁聚合物和/或香料胶囊的衣物洗涤剂组合物中，附加地掺入某些冷水蛋白酶，改进了白度、白色感和/或新鲜度。
发明概述
本发明涉及包含一种或多种冷水蛋白酶的织物和家居护理产品，以及用于制造和使用此类产品的方法。此类组合物提供改善的清洁和新鲜度。此类冷水蛋白酶可通过对亲本酶的一个或多个氨基酸的取代、插入和/或删除，而来源于亲本酶，所述亲本酶包括BPN′枯草杆菌蛋白酶和来源于迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶。
附图简述
图1提供了pHPLT-BPN′-v3的质粒图谱。
图2提供了pHPLT-BPN′-v3+S78N的质粒图谱。
图3提供了pHPLT-BPN′partial opt的质粒图谱。
图4提供了pHPLT-BPN′-v36的质粒图谱。
图5提供了成熟的参考枯草杆菌蛋白酶的比对，所述蛋白酶包括：BPN′(SEQ ID NO：2)和GG36(SEQ ID NO：755)。本文所述的每种蛋白酶变体的每一氨基酸位点，包括每种冷水蛋白酶变体，均基于如图5中所示的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN′(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列中对应的氨基酸位点的编号，如通过将所述蛋白酶变体的氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列进行比对所确定的而被编号。因此，除非另外指明，取代位点均以与BPN′的关系给出。
图6提供了pHPLT-GG36的图谱。
图7提供了pRA68的图谱。
图8提供了pRA96的图谱。
图9提供了pAC-FNAre的图谱。
图10是方法的示意图或靶向ISD库的构建。
图11提供了pAC-FNA10的图谱。
图12提供了pHPLT-FNA的图谱。
发明详述
定义
如本文所用，“织物和家居产品”是指一般旨在以其被销售时的形式被使用或消费，用于在织物和家居护理领域中处理织物、硬质表面和任何其他表面的产品或装置，包括：空气处理(包括空气清新剂和香味递送体系)，汽车护理，盘碟洗涤，织物处理(包括柔化和/或新鲜化)，衣物去污，衣物洗涤和漂洗添加剂和/或护理，包括地板和抽水马桶清洁剂在内的硬质表面清洁和/或处理，以及用于消费者或机构用途的其他清洁。
如本文所用，术语“清洁和/或处理组合物”是织物和家居护理产品的子集，除非另外指明，其包括织物和家庭护理产品。此类产品包括但不限于：用于在织物和家居护理领域中处理织物、硬质表面和任何其他表面的产品，包括：包括空气清新剂和香味递送体系在内的空气处理，汽车护理，盘碟洗涤，织物处理(包括柔化和/或新鲜化)，衣物去污，衣物洗涤和漂洗添加剂和/或护理，包括地板和抽水马桶清洁剂在内的硬质表面清洁和/或处理，以及用于消费者或机构用途的其他清洁颗粒状或粉末状的通用型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁剂；液体、凝胶或糊状的通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗盘碟洗涤剂或轻垢洗碗剂，尤其是那些高度起泡型；机洗盘碟洗涤剂，包括用于家庭和机构用途的各种片状、颗粒状、液体和辅助漂洗类型；汽车或地毯香波，包括抽水马桶清洁剂在内的浴室清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理型，负载基质的产品如添加的烘干机用香水纸。
如本文所用，术语“织物和/或硬质表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指明，其包括颗粒状或粉末状通用型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂状的通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机洗盘碟洗涤剂，包括各种用于家庭和机构用途的片剂、颗粒、液体和辅助漂洗类型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，包括抽水马桶清洁剂在内的浴室清洁剂；可为液体、固体和/或烘干机用香水纸形式的织物调理产品(包括软化和/或清新化)；以及清洁助剂，如漂白添加剂和“去污棒”或预处理型，负载基质的产品如添加的烘干机用香水纸。可应用的所有此类产品可为标准品、浓缩的或者甚至高度浓缩的形式，甚至到此类产品可在某个方面为非水性的程度。
如本文所用，当用于权利要求中时，冠词如“一个”和“一种”被理解为是指一种或多种受权利要求书保护的或所述的物质。
如本文所用，术语“包括”和“包含”是非限制性的。
如本文所用，术语“固体”包括颗粒、粉末、棒状和片剂产品形式。
如本文所用，术语“流体”包括液体、凝胶、糊剂和气体产品形式。
本文所用术语“部位”包括织物、衣服和/或硬质表面。
除非另外指明，所有组分或组合物含量均是关于该组分或组合物的活性物质部分，不包括可能存在于这些组分或组合物的市售来源中的杂质，例如残余溶剂或副产物。
除非另外指明，所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于总组合物计算。
应当理解，在整个说明书中给出的每一最大数值限度均包括每一较低数值限度，就像这样的较低数值限度在本文中明确地写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同该较高数值限度在本文中被明确表示。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括包含于该较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同该较窄数值范围在本文中被明确表示。
包含一种或多种蛋白酶的织物和家居产品
公开了包含蛋白酶和一种或多种辅助成分的组合物，并且所述组合物为织物和家居护理产品，所述蛋白酶选自由下列组成的组：
a)冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶在pH 8和60°F下，在与具有SEQ IDNO：4的酶比较时，对于BMI具有大于1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1至约10、1至约8或甚至1至约5的性能指数，所述性能指数如测试方法2和/或测试方法3所定义；
b)冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶在pH 8和60°F下，在与具有SEQ IDNO：6的酶比较时，对于BMI具有至少1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1至约10、1至约8或甚至1至约5的性能指数，所述性能指数如测试方法2和/或测试方法3所定义；
c)冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶选自由下列组成的组：
(i)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：4具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：P210S，P210S-N218A，S063T-S078N-S101A-S183T-T244N，N061A-S078N-S224A，S053G-S078N-P129T-Q185T，S063T-S078N-S101A，S078N-P129T，S063T-S078N-S101A-S183T和S063T-S078N-S101A-T244I；
(ii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：G097A-I111V-M124V-Y217Q，G097A-I111V-Y167A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-V203Y-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S 101N-G128S-V203Y-Y217Q，V068A-A092G-Y217Q，N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q  和S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q；
(iii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含下列突变中的三个、四个、五个或六个：X24G/R，X53G，X78N，X101N，X128A/S和X217L/Q；所述变体任选地包含选自下列各组的突变中的至少一组突变：A116V，G160S，I111L，I115V，N109S，N117M，P005G，Q059V，T164S，Y262M，A015Q，A015S，A098E，A098N，A098S，A098T，A098V，A098Y，A114S，A114T，A116G，A116L，A116S，A116T，A116W，A133G，A133H，A133T，A133V，A137G，A137I，A137L，A137S，A137T，A138S，A216E，A216F，A216V，D099S，D181E，F261A，F261Q，G024F，G024I，G024Q，G024Y，G097S，G160T，G211L，G211V，H017F，H017W，H039V，H226A，I031V，I111V，I268V，K170R，K265R，L016Q，L016T，L135M，L209T，L209V，L233M，L257T，L257V，L267A，L267V，N025A，N025I，N025Q，N025R，N025T，N025V，N101I，N101Q，N101S，N109A，N109G，N109H，N109L，N109M，N109Q，N109T，N117Q，N184A，N184L，N184T，N184W，N212G，N212L，N212V，N243P，N252G，N252M，P005T，P014S，P040G，P040L，P040Q，P129A，P129S，P172G，P172S，P194Q，P210A，P210S，Q185F，Q185G，Q185I，Q185M，Q185N，Q185S，Q275H，R186K，S009A，S009G，S009H，S009M，S018T，S130T，S132N，S145K，S159T，S161I，S161K，S161N，S161T，S162I，S162M，S162Y，S163G，S182F，S182G，S182V，S182W，S183F，S183L，S183M，S183T，S183V，S183W，S224A，S236T，S249V，T022A，T022G，T022Q，T022V，T208V，T242S，T253N，T253S，T254A，T254S，T255L，255S，T255V，V004A，V004P，V004W，V084C，V139C，V165M，V203F，Y021K，Y021N，Y021T，Y021V，Y167F，Y171F，Y214F，Y262F，Y262T，A088T-L257G，A116T-A128S，N061S-N109G-A128S-N243V-S260P，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V，S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R，S162G-K256R，A088T-N243V，G024E-A116T，K043Y，N076D-A116T，N218S-S248N，S033T-N243V，S033T-S063G，S248N-L257G，A001E-S249A，A088T-A116T，A088T-A128S，A088T-G131H，A088T-N109G，A088T-S248N，A088T-S249A，A116T-N243V，A116T-T158S，A128S，A128S-K256R，A128S-L257G，A128S-N243V，A128S-S248N，A128S-T158S，G024E-A088T，G024E-A128S，G024E-G131H，G024E-K256R，G024E-L257G，G024E-N218S，G024E-N243V，G024E-S162G，G024E-S249A，G024E-T158S，G131H，G131H-K256R，G131H-S249A，K043Y-A088T，K043Y-A116T，K256R，N076D-K256R，N109G，N109G-A116T，N109G-A128S，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-G131H，N109G-K256R，N109G-L257G，N109G-N218S，N109G-N243V，N109G-S248N，N218S-L257G，N243V，N243V-K256R，N243V-L257G，N243V-S248N，N243V-S249A，Q103H-A128S，Q103H-G131H，Q103H-K256R，Q103H-L257G，Q103H-N243V，Q103H-S248N，Q103H-S249A，Q103H-T158S，Q206D-N243V，S033T-A128S，S033T-K256R，S033T-N076D，S033T-N218S，S033T-S248N，S033T-T158S，S063G-A128S，S063G-K256R，S063G-N243V，S063G-S162G，S063G-T158S，S248N-K256R，S249A，T158S-N243V，T158S-S249A，A088T-A116T-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N243V-L257G，A088T-T158S-N218S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-L257G，A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S，A088T-N109G-A116T-G131H-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-N243V-L257G，A088T-N109G-N243V-S248N，A088T-N109G-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G，A116T-T158S-S248N-L257G，Y006H-A116T-G131H-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-K256R，A088T-N109G-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-T158S-K256R  A088T-N109G-T158S-N243V，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G，A116T-N218S-N243V-L257G-N269S，A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-K256R-L257G，N109G-A116T-N243V，N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-L257G，N109G-G131H-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-K256R-L257G，S003P-A116T-T158S-S248N-K256R，T158S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S，A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-L257G，A088T-G131H-N243V-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-W241R-S248N-K256R，A088T-N109G-K256R-L257G，A088T-N109G-L257G，A088T-N109G-N243V，A088T-N109G-N243V-K256R，A088T-N109G-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D，A088T-N109G-T158S-S248N-L257G，A088T-T158S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-T158S-N243V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d)冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶选自由下列组成的组：
(i)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：4具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：E156S-P210S，P210S-N218S，Y104F-E156S-P210I，E156A-P210S-N218S，N218A，N061A-S078N-S087E-S224A，Q059V-S078N-G211A，Q059V-S078N-V147Q，Q059V-S078N，Q059V-S078N-I108V-N252Q，S053G-S078N-P129T，S078N-G211A，S078N-Q185T，S078N-V147Q，S078N，S078N-S224A，S078N-S224A-A274D，S078N-I108V-V147Q，N061A-S078N-S224A，S053G-S078N-P129T-Q185T和S078N-P129T；
(ii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：G097A-I111V-Y217Q，I111V-G128A-Y217Q，I111V-M124V-Y167A，I111V-M124V-Y217Q，L096T-G097A-Y217Q，N062Q-G097A-I111V，S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q，S089Y-M124V-Y217Q，V068A-I111V-Y217Q，G097A-I111V-M124V，G097A-L126A-Y217Q，G097A-M124V-Y217Q，I111V-Y167A-Y217Q，M124V-Y167A-Y217Q，P052L-V068A-G097A，S089Y-I111V-M124V，V068A-A092G-G097A，V068A-A092G-U111V，V068A-G097A-I111V，V068A-S089Y-I111V，Y104N-G128A-Y217Q，G097A-G128A-P210S-Y217Q，G097A-G128S-P210S-Y217Q，G097A-I111V-M124I-Y217Q，G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q，N061P-G097A-G128S-Y217Q，N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，N061P-G102A-P129S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q，N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q，S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S 101N-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q，S078N-G097A-G128S-Y217Q，S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-M124I-Y217Q，N061P-G097A-M124V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q，N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q，N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q，N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-I035V-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-G097A-A116S-G128A，T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q；
(iii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含下列突变中的三个、四个、五个或六个：X24G/R，X53G，X78N，X101N，X128A/S和X217L/Q；所述变体任选地包含选自下列各组的突变中的至少一组突变：A001G，A001Y，A013G，A013V，A015F，A015G，A015K，A015M，A015P，A015T，A015W，A015Y，A029G，A073S，A088C，A088I，A088L，A088T，A088V，A098D，A098K，A098P，A098R，A098W，A116D，A116E，A116R，A128S，A133L，A133M，A133S，A134G，A134S，A137N，A137V，A144M，A144Q，A144S，A144T，A144V，A151C，A176S，A176T，A179S，A216G，A216L，A216P，A216Q，A216S，A216T，A216Y，A228T，A230C，A231C，A272I，A272L，A272Q，A272S，A272T，A272W，A273S，A274G，A274L，A274Q，A274T，A274V，D041E，D099G，D099N，D120A，D120K，D120Q，D120R，D120S，D140E，D181S，D259E，E054D，E156D，E156T，E251V，F261G，F261H，F261L，F261R，F261S，F261T，F261V，F261W，G007A，G007S，G020A，G020D，G020S，G024N，G024R，G024S，G024T，G024V，G024W，G053H，G053K，G053N，G053T，G097A，G097D，G097T，G131A，G131H，G131P，G131Q，G131T，G131V，G160H，G160P，G166A，G166S，G166T，G211A，G211D，G211M，G211N，G211P，G211Q，G211R，G211W，G215A，G215N，G215V，H017L，H017M，H017T，H017V，H017Y，H039A，H039C，H039N，H226F，H226I，H226M，H226S，H226V，H226Y，I035V，I079A，I079S，I079T，I079V，I079W，I108V，I115L，I122A，I234L，I234V，K012R，K027R，K136R，K141F，K213W，K237R，K256R，K265Q，L016A，L016F，L016I，L016S，L016V，L042I，L075A，L075M，L075Q，L075V，L075Y，L082K，L082M，L082Q，L082V，L090I，L196I，L196V，L209Q，L209W，L233A，L233Q，L233V，L235I，L235K，L250I，L257A，L257H，L257Q，L257S，L257Y，L267Q，L267R，L267S，L267T，M199V，N025F，N025G，N025H，N025K，N025L，N025M，N025S，N025Y，N061F，N061H，N061P，N061S，N061T，N061V，N061W，N076G，N076W，N078S，N078T，N078V，N101A，N101H，N101L，N101T，N109K，N109R，N117A，N117E，N117H，N117K，N118G，N184G，N184H，N184I，N184S，N184V，N212A，N212F，N212I，N212K，N212P，N212Q，N212S，N212Y，N218A，N218H，N218L，N218S，N240E，N240H，N240L，N240R，N240T，N243A，N243Q，N243T，N243V，N252A，N252K，N252L，N252Q，N252R，N252S，N252T，N269Q，N269S，P014G，P014Q，P014T，P040A，P040H，P040S，P040T，P040V，P040Y，P086A，P086C，P086F，P086H，P086S，P129D，P129G，P129K，P129T，P172A，P172Q，P194A，P194G，P194L，P194M，P194S，P194V，P194Y，P210G，P210R，P210V，Q002A，Q002S，Q010A，Q010F，Q010H，Q010I，Q010L，Q010N，Q010S，Q010T，Q019A，Q019G，Q019N，Q019S，Q019T，Q019V，Q019W，Q059I，Q103L，Q103S，Q185A，Q185H，Q185L，Q185T，Q185Y，Q206P，Q206S，Q206Y，Q217I，Q217N，Q217S，Q217T，Q245K，Q275D，Q275S，Q275W，S003A，S003G，S003H，S003M，S003P，S003Q，S003T，S003V，S009I，S009L，S009P，S009T，S009W，S018A，S018G，S018I，S018L，S018M，S018N，S018P，S018V，S018W，S033T，S037Q，S037T，S037V，S038G，S038H，S038K，S038Q，S038T，S063K，S063N，S063Q，S063T，S087A，S087F，S087G，S087Q，S087T，S089L，S089M，S089N，S089Q，S089T，S089W，S130A，S130F，S130G，S130L，S130V，S145A，S145H，S145M，S145V，S159A，S159G，S159H，S159Q，S159R，S161A，S161G，S161H，S161L，S161M，S161P，S161Q，S161W，S162A，S162F，S162G，S162L，S162N，S162P，S162R，S162V，S163P，S173A，S173G，S182A，S182H，S182K，S182L，S182N，S182P，S182Q，S182T，S183A，S183G，S183H，S183Q，S188A，S188G，S188T，S188V，S191A，S204A，S204I，S204L，S204Q，S204V，S224C，S236A，S236N，S236Q，S248A，S248F，S248G，S248I，S248K，S248L，S248M，S248N，S248Q，S248T，S248V，S249A，S249C，S249H，S249Q，S249T，S249W，S249Y，S260H，S260N，S260P，S260T，T022H，T022K，T022N，T022R，T022S，T022Y，T055A，T055G，T055L，T055N，T055P，T055Q，T071S，T158H，T158S，T164N，T208C，T208L，T220S，T242N，T244A，T244G，T244H，T244I，T244Q，T244S，T244V，T244W，T253A，T253G，T253H，T253Q，T254V，T255A，T255G，T255H，T255I，T255Q，T255Y，V004G，V004N，V004R，V008A，V008C，V008M，V026I，V044I，V044L，V045H，V045K，V045L，V045M，V045Q，V045S，V045W，V045Y，V051I，V081L，V081Q，V081T，V084A，V084S，V084T，V093I，V121I，V143N，V143S，V143Y，V147C，V147I，V147L，V147T，V180I，V180L，V180T，V192A，V192S，V192T，V198I，V198L，V198M，V203H，V203I，V203L，V203N，V203Q，V203T，V203W，V203Y，V270A，V270S，V270T，W241M，W241Y，Y006G，Y006H，Y006I，Y006K，Y006L，Y006P，Y006Q，Y006T，Y006V，Y006W，Y021A，Y021D，Y021E，Y021L，Y021Q，Y021R，Y021S，Y104F，Y104I，Y214L，Y214V，Y214W，Y262A，Y262G，Y262L，Y262N，Y262S，Y262W，Y263G，Y263W，A001F，A001K，A001L，A001M，A001Q，A001R，A001S，A001T，A001V，A013C，A013S，A015D，A015E，A015L，A015R，A048S，A073N，A073T，A074G，A074S，A085C，A085G，A085S，A085V，A088M，A088S，A092S，A098G，A114G，A133P，A137E，A137H，A144G，A144H，A144K，A144L，A144N，A153S，A153V，A176C，A179G，A187G，A187S，A200G，A216W，A223S，A228S，A230T，A230V，A231V，A232C，A232V，A272E，A272G，A272K，A272P，A273G，A273L，A273V，A274M，A274R，D036E，D099A，D099Q，D120E，D181A，D181G，D259A，D259G，D259Q，D259T，E156A，E156S，E251I，E251L，E251Q，E251T，F058Y，F261C，F261D，F261K，F261P，G020E，G020F，G020H，G020L，G020N，G020Q，G020R，G020T，G020Y，G024A，G024P，G053A，G053D，G053E，G053F，G053L，G053Q，G053S，G053Y，G097K，G097M，G157A，G157S，G160A，G160L，G166C，G166I，G166Q，G169A，G211K，G215H，G215L，G215S，G215T，G215W，G258S，H017I，H039S，H226L，H238N，H238Y，I011L，I011V，I031L，I079F，I079K，I079L，I079M，I079Q，I205A，I205V，I268L，I268M，K012G，K043F，K043H，K043I，K043N，K043Q，K043T，K141A，K141R，K141W，K170A，K213A，K213G，K213H，K213I，K213L，K213N，K213Q，K213R，K213S，K213T，K213V，K237A，K237H，K237I，K237L，K237N，K237S，K256A，K256G，K256H，K256M，K256P，K256Q，K256W，K265H，L016E，L042V，L075G，L075H，L075I，L075T，L082A，L082F，L082H，L082R，L082S，L082T，L090M，L135F，L196M，L209C，L209H，L209S，L233S，L235M，L235R，L235W，L257C，L257G，L267F，M050Y，M119C，M119I，M124L，N025C，N025E，N025P，N061A，N061G，N061I，N061K，N061L，N061Q，N061R，N062S，N062T，N076A，N076P，N076Q，N076S，N076T，N076V，N078G，N078H，N078K，N078P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K141R-T158S-N218S-K256R，G131H-K256R，G131H-N218S-K256R-L257G，G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，G131H-N218S-S248N-K256R，G131H-N243V-S248N，G131H-N243V-S248N-L257G，G131H-T158S-N218S，G131H-T158S-N218S-N240H-N243V-S248N-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V，G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-N269S，G131H-T158S-N243V-L257G，G131H-T158S-N243V-S248N，G131H-T158S-S248N，K256R，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-N218S-N243V-S248N，N109G-A116T-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-K237R-N243V-S248N，N109G-G131H-N218S-N243V-S248N，N109G-G131H-S248N，N109G-G131H-T158S，N109G-G131H-T158S-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-K256R，N109G-N218S-K256R-L257G，N109G-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-N218S-S248N-L257G，N109G-S248N，N109G-T158S-N218S，N109G-T158S-N218S-N243V，N109G-T158S-N243V-L257G，N218S-N243V-K256R，N218S-N243V-S248N，N218S-S248N，N218S-S248N-K256R，N243V-L257G，S003P-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，S003P-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R，S105H-W106G-I107L-I108S-N109A-G110A-I111S-E112N-W113G-A114P，S248N-L257G，T158S-N218S-K256R，T158S-N218S-L233S-S248N，T158S-N218S-L257G，T158S-N218S-N243V-K256R，T158S-N218S-N243V-S248N，T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，T158S-N218S-S248N-L257G，T158S-N243V-S248N-L257G，V004L-A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A133V-S260N，N061S-S260P，P014T-S037T，S009T-K141F，S009T-K141R，S018F-S162L，S018L-Y021S，S018P-D120N，S018T-S162P，S018T-Y021N，S018Y-K213R，S161P-S162L，S161P-S260P，T253A-S260P，A134T-S260G，I115V-N184Y，N025K-S037P，Q010L-S037P，Q019L-S260N，Q019L-S260P，S037P-T254S，S161P-T253A，N061S-S260P，Q010L-S037P，S009T-K141F，S018L-Y021S，S018T-S162P，S018T-Y021N，S018Y-K213R，S037P-T254S，S161P-S260P，S161P-T253A，T253A-S260P，A133V-S260N，A134T-S260G，I115T-S183T，I115V-N184Y，N061D-S260I，Q019L-S260N，Q019L-S260P，S183T-S249R，N61D-Q206R，Y262N-Q275R，K43R-N76S，K170R-D259G，Y6F-S249C，Q19A-N109S，H17L-Q19A，Q19R-Q185R，S18Y-V203A，S161E-S260T，S18K-V203I，V4A-T55A，N252S-L257H，S249R-Y262H，N61L-Q206H，N184Y-Y262N，Q19R-N25D，A74S-P129Q，K27R-D120H，V4A-T55A，Y21H-N252H，K27R-N269D，A98T-T158A，I79V-Q217H，S9L-N218S，V4A-Y6F，V203A-Q217R，T22S-T242S，N76P-N212S，S37T-S260P，T55A-V147A，V4A-Y6F，Y262N-Q275R，G160R-T244A，N25D-Q185R，G211V-T244A，S9L-N218S，A144H-T244A，Y21H-N252H，A1Y-Q275R，V198L-D259G，K141I-S248N，S183T-R186K，S161E-Q185H，P129S-K136R，K43N-S163T，S37G-Q275H，Y6F-S249C，N62Y-T244A，S260P-Q275R，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R，S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-A128S-N218S，A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S，N109G-A114S-A128S-S183L-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S-N243V，N109G-A128S-S224A-N243V，N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L-S224A，N61G-N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L，S33T-N76D，N109S-A128S-S224A，N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，N109M-A128S-S224A-N243V，S63G-N109G，N109G-K256R，S63G-N76D，S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V，N062L，N062L-S063G，N062S-S063G-Q217L，N062S-S063L-Q217L，N062S-S063N，N062S-S063R，S063G，S063G-Q217L，S063G-Q217L-M222S，S063L-Q217L，S063N，S063N-Q217L，D099N-K141Y-K213Q，D099N-K141Y-K256Q，K043T-K141Y-E156Q，N062L-Q217E，N062L-Q217L，N062L-S063G-Q217E，N062L-S063L，N062L-S063N-Q217L，N062S-Q217L，N062S-S063G，N062S-S063L，N062S-S063N-Q217L，N062S-S063R-Q217E，S063G-Q217E，S063N-Q217E，S063R，S063R-Q217E和S063R-Q217L；
e)蛋白酶，所述蛋白酶选自由下列组成的组：
(i)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：4具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：Q059V-S078N-I108V-V147Q-G211A-N252Q，S078N-I108V-V147Q-G211A，S078N-S087E-M124I-S224A，S078N-I108V-V147Q-N252Q，S078N-I108V-V147Q-G211A-N252Q和Q059V-S078N-I108V-V147Q-G211A-N252Q；
(ii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：G097A-M124V-Y167A-Y217Q，V068A-Y167A-Y217Q，G097A-I111V-M124V-Y167A，I111V-M124V-Y167A-Y217Q，V068A-I111V-Y167A-Y217Q，G097A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q，P052L-V068A-I111V，G097A-N123A-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q，N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q，Y217Q，N061P-G102A-G128S-Y217Q，N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q，S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q，G102A-N123Q-Y217Q，N061P-G102A-G128S-Y217Q，S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q和G102A-N123Q-Y217Q；和
(iii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含下列突变中的三个、四个、五个或六个：X24G/R，X53G，X78N，X101N，X128A/S和X217L/Q，所述变体任选地包含选自下列各组的突变中的至少一组突变：A001D，A001H，A001N，A015C，A048C，A048E，A085T，A133R，A137R，A142C，A144D，A144R，A152S，A153G，A187P，A187Q，A187T，A187V，A216R，A230S，A272R，A273H，A273T，A274H，D036N，D036S，D181H，D181T，D259N，D259P，D259S，E156G，E156H，E156L，E156Q，E156V，E251C，F189S，F189T，F189W，F189Y，F261E，G020C，G024D，G053M，G053R，G097R，G131D，G131R，G157N，G160R，G160V，G166L，G166W，G211E，G215D，G258A，G258D，G258P，I011T，I031C，I079E，I079R，I175L，I205C，K012H，K012N，K027A，K027N，K027S，K043A，K043D，K043E，K043G，K043L，K043M，K043P，K043V，K043W，K043Y，K136H，K141H，K141L，K141M，K141N，K141Q，K141T，K141V，K170G，K170S，K237T，K237V，K256D，K256S，K256T，K256V，K265N，K265S，L042F，L042M，L082E，L209A，L209E，L209G，L209R，L233G，L235V，L257D，L257E，L257P，L257R，L257W，L267E，M050L，N056D，N056S，N061C，N061D，N062A，N062H，N062L，N062V，N062Y，N076D，N076L，N076M，N078D，N078F，N101D，N101R，N118A，N212C，N212E，N218C，N218D，N218E，N252D，N252E，P014F，P014K，P057A，P057W，P172R，P194E，P201T，P210E，Q059C，Q059D，Q059R，Q185E，Q206D，Q217A，Q217K，Q217R，Q245A，Q245D，Q245E，Q245H，Q245R，Q271E，Q271F，Q271R，Q271W，Q275G，Q275IR186I，R186L，R186V，R186W，S003E，S009C，S009E，S018C，S037D，S037E，S037H，S037R，S037Y，S038D，S038P，S038R，S038Y，S063L，S087D，S087R，S089C，S089E，S130C，S130R，S145D，S159C，S159P，S161C，S173T，S182C，S188E，S188F，S188K，S188L，S188R，S188W，S190A，S190G，S190T，S204R，S236D，S236E，S248C，S248E，S260C，S260E，S260R，T022P，T055C，T055W，T071A，T158D，T158E，T158P，T158R，T158Y，T164R，T242D，T242G，T255C，V004E，V004T，V045C，V045D，V045R，V045T，V051H，V081R，V143C，V143E，V143G，V192G，V203C，V203D，V203E，V203M，V203R，V270G，W241L，Y214H，Y214Q，A001E，A133E，A187L，A187N，A216C，A216H，A273Q，D099H，D259H，E156C，E195G，F189H，G131C，G146A，G166V，G215C，G215E，I107L，K012A，K012S，K012T，K043C，K170C，K256C，K256E，K265G，K265Y，L233EM222F，M222S，N062Q，N076E，N078E，N184P，N218R，P005V，P014D，Q002K，Q002L，Q002R，Q010W，Q271C，R186H，S049C，S063C，S063D，S105T，S188C，S190C，S204E，T055R，T164G，V004D，V044T，V045I，V165C，V180S，Y006C，Y006D，Y006E，Y104T，A001C，A187C，A230G，A273D，A273P，D036Q，F189G，F189L，F189R，G157T，G178A，I031F，I111M，K012F，K012L，K027T，K043R，K136G，K141G，K170Q，M222A，M222L，N062R，N117G，N269C，P005W，P129V，P239A，P239H，P239T，Q059W，Q217G，Q275A，R186A，S191G，T164A，T220A，A001P，A187F，A187W，A273R，D041C，D060G，D197T，F189A，G046D，G157P，K012C，K012E，K012W，L042C，M222T，N062C，P239G，P239N，Q217C，R186M，S049T，S089P，S125A，S173V，V044A，A001E，A001E-A128S，A001E-G024E，A001E-G131H，A001E-G169A，A001E-L257G，A001E-218S，A001E-Q103H，A001E-S063G，A001E-S248N，A001E-S249A，G024E-N076D，K043Y-N076D，K043Y-Q206D，N076D-A116T，N076D-G169A，N076D-Q206D，Q103H-Q206D，S033T-G169A，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V，A001E-K043Y，A001E-N076D，A001E-N076D-N109G-A128S，A001E-Q206D，G024E-Q206D，A001E-A128S-G131H-N243V，A001E-G131H-G169A-N243V，A001E-S033T-N109G-N218S，A116T-G169A，A116T-Q206D，G169A-S249A，K043Y-G169A，N109G-G169A，P040E-N109G-128S-G131H，Q206D-L257G，S033T-A128S-G131H-N243P，S033T-A128S-G131H-N243V，S033T-P040E-Q103H-N109G，S033T-Q103H-A128S-G131H，S063G-N109G-A128S-G131H，S063G-Q206D，T158S-Q206D，A001E-N076D-N109G-A128S，A015S-A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T-A098S-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-N218S-L257G，A088T-A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-K256R，A088T-G131H-N218S-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V，A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-D140G-N243V，A088T-N109G-G131H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-K141E-T158S-N218S-K256R，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-Q271R，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-V149L-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271K，A088T-N109G-T158S-N218S-L257G，A088T-N109G-T158S-S248N-K256R，A088T-N218S-S248N-L257G-Q27R，A088T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-Y104H-A116T-G131H-N218S-N243V，A116T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G-N269D，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-Q271R，A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，A116T-G157E-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-T158S-N218S，G131H-N218S-L257G，G131H-N218S-S248N，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，G131H-T158S-N218S-S248N-I268V，I107T-N109G-G131H-N218S-L257G，L090I-N109G-T158S-N243V，L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271R，N109G-A116T-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-K141E-L257G，N109G-G131H-N218S-N243V，N109G-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-T158S-N218S-S248N-K256R，，N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N218S-S248N-K256R-L257G，S003P-N109G-G131H-T158S-L257G，S003P-S248N-L257G，T158S-S248N-K256R-L257G，V004A-A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，Y006H-N218S-N243V-S248N，Y104H-N109G-G131H-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-N243V，A088T-G131H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-A223G-S248N-K256R，A088T-K213N-N243V-S248N-K256R，A088T-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A232S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-M124I-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-V148A-N218S-N243V，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-L257G，A088T-T158S-N218S-Q245K-S248N-K256R，A088T-T158S-N218S-S248N-K256R，A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A116T-G131H-V150A-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，I107T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-K141E-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N，T158S-N243V-S248N-K256R，T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-G146C，A088T-A116T-N218S，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A138E-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243F-S248N，A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G，A116T-D140G-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-E251K-K256R-L257G，A088T-I108T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-K141E-N218S，A088T-N109G-W241R-S248N-K256R，G065D-A088T-G131H-N243V-S248N，A045S-S236G，G024A-S037W，I031V-S038W，N061D-S260I，Q010R-S037T，I115T-S183T，N025K-P129K，N025K-P129R，A045S-S236Y，S162L-D181H，I031V-S038W，N025K-S037P，N025K-P129R，Y21H-D259G，A133V-D259N，I79V-Q217H，S18K-V203I，T158A-D259P，N61K-N252K，K43N-Q217R，Q206R-S260P，V198L-D259G，S161E-S260T，G160A-D259G，A1Y-Q275R，A200T-H226L，Q217R-T244A，S260P-Q275R，T158I-D259N，L75I-N76D，S161E-Q185H，Y21H-S37E，S249R-Q275R，N76T-N212D，S260P-Q275L，G131S-K265N，V4A-S249N，N25D-Q185R，K43R-N76S，S183D-Q206R，Q10R-Q275K，K43N-S163T，N25D-V26A，S260P-Q275L，K141I-S248N，L16Q-Q217H，K27R-N269T，P210S-N212D，N118G-V121A，G215D-D259V，N62Y-G97D，V4E-S260P，K27E-Y91F，Y6D-T55A，N77D-N252T，N25K-H238R，V44A-Q206H，S37P-S260F，V44A-Q206R，I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，S33T-N76D-A128S-N218S，N76D-N109G-A128S-S224A，D099N，K141Y-E156Q，N062L-S063L-Q217L，N062L-S063N，N062L-S063N-Q217E，N062L-S063R，N062L-S063R-Q217L，N062S-Q217E，N062S-S063G-Q217E，N062S-S063G-Q217R，N062S-S063N-Q217R，S063G-S125A，D060G-Q217L，D120N-K141Y-K213Q，K043T-D099N-D120N-K141Y，K043T-D099N-K141Y-K256Q，K043T-K237A，N062L-S063G-Q217R，N062L-S063G-S125A，N062L-S063L-Q217E，N062L-S063N-S125A-Q217L，N062S-Q217R，N062S-S063L-Q217E，N062S-S063R-Q217L，S063G-M222S，S063G-Q217R，K141Y-D197N，N062L-Q217R，N062L-S063G-Q217L-M222S，N062L-S063L-Q217R，N062L-S063N-Q217R，N062S-Q217G，N062S-S063G-Q217G，N062S-S063G-Q217L-M222L，N062S-S063G-S125A-Q217L，N062S-S063N-Q217E，Q217G，S033G-N062S-S063G，S063G-Q217G，S063G-Q217L-M222L，S063G-S125A-Q217R，S063L-Q217R，S063N-M222S，S063N-Q217R，S063N-S125A-Q217L，S063R-Q217R，S063R-S125A-Q217L，D099N-E156Q-K256Q，E156Q，K012T-D099N-K213Q，K012T-K256Q，K043T-D099N-K141Y-K213Q，K043T-E156Q，K141Y-K213Q，N062L-Q217G，N062L-Q217L-M222L，N062L-Q217L-M222S，N062L-S063G-M222S，N062L-S063G-Q217L-M222L，N062L-S063G-Q217R-M222S，N062L-S063N-Q217L-M222S，N062L-S063N-S125A，N062L-S063R-S125A，N062L-S125A，N062S-S063G-M222S，N062S-S063G-Q217G-M222S，N062S-S063G-S125A，N062S-S063N-Q217L-M222L，N062S-S063N-S125A-Q217L，N062S-S063R-Q217G，N062S-S063R-Q217L-M222S，Q217G-M222S，Q217L-M222S，Q217R，S033G-S063G-Q217R，S063G-Q217E-M222S，S063G-S125A-Q217G，S063L-Q217E，S063N-Q217G，S063N-Q217G-M222S，S063N-Q217L-M222S，S063R-Q217L-M222S和S063R-S125A；
f)亲本蛋白酶的变体，所述变体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含三个至六个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自由下列组成的组：X024G/R，X053G，X078N，X101N，X128A/S和X217L/Q，其中所述变体具有蛋白水解活性；
g)蛋白酶的变体，所述变体具有蛋白水解活性并包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在与SEQ ID NO：2上选自位点24、53、78、97、101、128和217的氨基酸位点相对应的氨基酸位点包含二个至七个改变，其中每个改变独立地为
(i)在占据所述位点的氨基酸残基的上游或下游，一个或多个氨基酸残基的插入，
(ii)占据所述位点的氨基酸残基的缺失，或
(iii)用不同的氨基酸残基对占据所述位点的氨基酸残基的取代，
h)亲本蛋白酶的变体，其中：所述变体具有相对于所述亲本蛋白酶有不超过15个改变，其中所述改变独立地选自插入、缺失、或取代，并且所述改变包括在位点24和53的甘氨酸取代、在位点78和101的天冬酰胺取代、在位点128的丙氨酸或丝氨酸取代、以及在位点217的谷氨酰胺取代；所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性；并且所述变体相对于所述亲本蛋白酶具有提高的蛋白水解活性
i)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、或97％的序列同一性，所述变体具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、或97％的同一性；所述变体包含在位点24和53的甘氨酸取代、在位点78和101的天冬酰胺取代、在位点128的丙氨酸或丝氨酸取代、以及在位点217的谷氨酰胺取代，并且所述变体相对于所述亲本蛋白酶具有提高的蛋白水解活性；
j)它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，所述冷水蛋白酶在pH 8和60°F下，在与具有SEQ ID NO：4的酶比较时，对于BMI具有大于1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少1至约10、至少1至约8或甚至至少1至约5的性能指数，所述性能指数如测试方法2或测试方法3所定义，或者所述冷水蛋白酶在pH 8和60°F下，在与具有SEQ ID NO：6的酶比较时，对于BMI具有至少1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的性能指数，所述性能指数如测试方法2或测试方法3所定义，并且所述冷水蛋白酶选自由下列组成的组：
a)具有SEQ ID NO：4的亲本蛋白酶的变体，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：P210S，P210S-N218A，S063T-S078N-S101A-S183T-T244N，N061A-S078N-S224A，S053G-S078N-P129T-Q185T，S063T-S078N-S101A，S078N-P129T，S063T-S078N-S101A-S183T和S063T-S078N-S101A-T244I；
b)具有SEQ ID NO：2的亲本蛋白酶的变体，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：G097A-I111V-M124V-Y217Q，G097A-I111V-Y167A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-V203Y-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q，V068A-A092G-Y217Q，N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q和S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q；
c)具有SEQ ID NO：6的亲本蛋白酶的变体，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：A116V，G160S，I111L，I115V，N109S，N117M，P005G，Q059V，T164S，Y262M，A015Q，A015S，A098E，A098N，A098S，A098T，A098V，A098Y，A114S，A114T，A116G，A116L，A116S，A116T，A116W，A133G，A133H，A133T，A133V，A137G，A137I，A137L，A137S，A137T，A138S，A216E，A216F，A216V，D099S，D181E，F261A，F261Q，G024F，G024I，G024Q，G024Y，G097S，G160T，G211L，G211V，H017F，H017W，H039V，H226A，I031V，I111V，I268V，K170R，K265R，L016Q，L016T，L135M，L209T，L209V，L233M，L257T，L257V，L267A，L267V，N025A，N025I，N025Q，N025R，N025T，N025V，N101I，N101Q，N101S，N109A，N109G，N109H，N109L，N109M，N109Q，N109T，N117Q，N184A，N184L，N184T，N184W，N212G，N212L，N212V，N243P，N252G，N252M，P005T，P014S，P040G，P040L，P040Q，P129A，P129S，P172G，P172S，P194Q，P210A，P210S，Q185F，Q185G，Q185I，Q185M，Q185N，Q185S，Q275H，R186K，S009A，S009G，S009H，S009M，S018T，S130T，S132N，S145K，S159T，S161I，S161K，S161N，S161T，S162I，S162M，S162Y，S163G，S182F，S182G，S182V，S182W，S183F，S183L，S183M，S183T，S183V，S183W，S224A，S236T，S249V，T022A，T022G，T022Q，T022V，T208V，T242S，T253N，T253S，T254A，T254S，T255L，T255S，T255V，V004A，V004P，V004W，V084C，V139C，V165M，V203F，Y021K，Y021N，Y021T，Y021V，Y167F，Y171F，Y214F，Y262F，Y262T，A088T-L257G，A116T-A128S，N061S-N109G-A128S-N243V-S260P，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V，S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R，S 162G-K256R，A088T-N243V，G024E-A116T，K043Y，N076D-A116T，N218S-S248N，S033T-N243V，S033T-S063G，S248N-L257G，A001E-S249A，A088T-A116T，A088T-A128S，A088T-G131H，A088T-N109G，A088T-S248N，A088T-S249A，A116T-N243V，A116T-T158S，A128S，A128S-K256R，A128S-L257G，A128S-N243V，A128S-S248N，A128S-T158S，G024E-A088T，G024E-A128S，G024E-G131H，G024E-K256R，G024E-L257G，G024E-N218S，G024E-N243V，G024E-S 162G，G024E-S249A，G024E-T158S，G131H，G131H-K256R，G131H-S249A，K043Y-A088T，K043Y-A116T，K256R，N076D-K256R，N109G，N109G-A116T，N109G-A128S，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-G131H，N109G-K256R，N109G-L257G，N109G-N218S，N109G-N243V，N109G-S248N，N218S-L257G，N243V，N243V-K256R，N243V-L257G，N243V-S248N，N243V-S249A，Q103H-A128S，Q103H-G131H，Q103H-K256R，Q103H-L257G，Q103H-N243V，Q103H-S248N，Q103H-S249A，Q103H-T158S，Q206D-N243V，S033T-A128S，S033T-K256R，S033T-N076D，S033T-N218S，S033T-S248N，S033T-T158S，S063G-A128S，S063G-K256R，S063G-N243V，S063G-S162G，S063G-T158S，S248N-K256R，S249A，T158S-N243V，T158S-S249A，A088T-A116T-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N243V-L257G，A088T-T158S-N218S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-L257G，A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S，A088T-N109G-A116T-G131H-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-N243V-L257G，A088T-N109G-N243V-S248N，A088T-N109G-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G，A116T-T158S-S248N-L257G，Y006H-A116T-G131H-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-K256R，A088T-N109G-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-T158S-K256R A088T-N109G-T158S-N243V，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G，A116T-N218S-N243V-L257G-N269S，A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-K256R-L257G，N109G-A116T-N243V，N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-L257G，N109G-G131H-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-K256R-L257G，S003P-A116T-T158S-S248N-K256R，T158S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S，A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-L257G，A088T-G131H-N243V-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-W241R-S248N-K256R，A088T-N109G-K256R-L257G，A088T-N109G-L257G，A088T-N109G-N243V，A088T-N109G-N243V-K256R，A088T-N109G-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D，A088T-N109G-T158S-S248N-L257G，A088T-T158S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-T158S-N243V-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，A116T-G131H-S248N-L257G，A116T-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A116T-T158S-N218S-S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9G-T158S-N243V-K256R-I268V，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-Q275R，A088T-N218S-N243V，A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N218S-S248N，A088T-N218S-S248N-L257G，A088T-N243V-K256R，A088T-N243V-L257G，A088T-S145T-T158S-S248N，A088T-T158S-L257G，A088T-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G-Q271H，A088T-T158S-S248N，A088T-V143A-T158S-K256R，A116T-G131H-K256R，A116T-G131H-N218S，A116T-G131H-N243V，A116T-G131H-N243V-K256R，A116T-G131H-N243V-L257G，A116T-G131H-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N243V-L257G，A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-V143F-T158S-N218S，A116T-L257G，A116T-N218S，A116T-N218S-L257G，A116T-N218S-N243V-L257G，A116T-N243V-K256R，A116T-N243V-S248N，A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-S248N，A116T-T158S-N218S-N243V，A116T-T158S-N218S-S248N，A116T-T158S-N243V，A116T-T158S-N243V-K256R，A116T-T158S-N243V-L257G，A116T-T158S-N243V-S248N，A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A116T-V149I-T158S-N243V-S248N-K256R-Q271H，G131H-N218S-N243V-L257G，G131H-N243V，G131H-N243V-S248N-K256R，G131H-T158S，G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V-L257G，N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-S248N，N109G-A116T-G131H-S248N-I268V，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R，N109G-A116T-N218S，N109G-A116T-N218S-N243V-K256R，N109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-N243V-K256R，N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-S248N-L257G，N109G-A116T-T158S-G211V-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N243V，N109G-A116T-T158S-Q275R，N109G-G131H-A137V-T158S-N218S-S248N，N109G-G131H-N218S-K237N，N109G-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，N109G-G131H-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-S145F-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-S248N-K256R，N109G-G131H-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，N109G-G131H-T158S-N243V，N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-Q271R，N109G-N218S-L257G，N109G-N218S-N243V，N109G-N243V-K256R-L257G，N109G-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-T158S-I268V，N109G-T158S-K256R，N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-T158S-N243V，N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-T158S-N243V-S248N，N109S-A116T-S248N，N218S，N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N218S-S248N-L257G，N243V-K256R，N243V-S248N-K256R，N243V-S248N-K256R-L257G，S 105P-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，S248N，T158S-N243V-K256R，T158S-N243V-L257G，S018F-S162L，S018P-D120N，P014T-S037T，S009T-K141R，S161P-S162L，N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V，N109G-A128S-S183V，N109M-A128S-S224A，A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V，N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V，S63G-A128S，N109S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-N243V，N61S-N109G-N243V，N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R，N109G-A116T，A88T-N109G，N61G-N109G-N243V，N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V，N062L-S063N-Q217L，N062S-S063R-Q217E，N062S-S063L-Q217L，S063G，S063G-Q217L，S063N和S063N-Q217L。
在所述组合物的一个方面，其中所述亲本蛋白酶的变体包含氨基酸取代S024G+S053G+S078N+S101N+G128A/S+Y217Q/L/D；和任选地一组或多组选自下列突变的组的取代：A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G，S033T+N076D，S009T+N109G+K141R+N243V，S162G+K256R，N109G+A116T，N109G+L257G，S162G+L257G，N061G+N109G+N243V，N109G+N243V+S248A，S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R，N109G+A116T+N243V+K256R，A088T+N109G+A116T+G131H+N243V，A088T+N109G，N109G+N243V，T158S+L257G，N061S+N109G+N243V，P040A+N109G+N243V+S248N+K256R，S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R，A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R，A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G，N109G+K256R，N109G+N243V+K256R，S063G+K256R，S063G+N109G，S063G，S063G+N076D，S033T+N076D+N218S和N076D+N218S，其中所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在所述组合物的一个方面，所述蛋白酶为具有SEQ ID NO：6的亲本蛋白酶的变体，所述变体包含下列各组氨基酸取代中的一组或多组：A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G，S033T+N076D，S009T+N109G+A128S+K141R+N243V，S162G+K256R，N109G+A116T，N109G+L257G，S162G+L257G，N061G+N109G+N243V，N109G+A128S+N243V+S248A，S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R，N109G+A116T+N243V+K256R，A088T+N109G+A116T+G131H+N243V，A088T+N109G，N109G+N243V，T158S+L257G，N061S+N109G+N243V，P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R，S009T+S018T+Y021N+N109G+A128S+K141R，A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R，A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G，N109G+K256R，N109G+A128S+N243V+K256R，S063G+K256R，S063G+N109G，S063G+A128S，S063G+N076D，S033T+N076D+A128S+N218S和N076D+N218S。
在所述组合物的一个方面，所述亲本蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶。
在所述组合物的一个方面，所述亲本蛋白酶为选自由下列组成的组的枯草杆菌蛋白酶：解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN′(SEQ ID NO：2)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus，以前被分类为嗜热芽孢杆菌B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。
在所述组合物的一个方面，所述冷水蛋白酶为亲本蛋白酶的变体，所述冷水蛋白酶包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个选自下列组(a)和组(b)的突变，其中至少一个突变选自组(a)：
a)1、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、33、43、76、102、109、137、141、158、169、204、210、218、243、248、249、256、257、260和269；和
b)24、25、40、52、53、55、58、59、61、62、63、68、78、86、87、88、89、92、96、97、100、101、103、104、106、111、114、115、116、117、118、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、144、145、159、161、162、167、194、203、206、213、217、227、232、239、240、242、265、267和275。
在所述组合物的一个方面，亲本蛋白酶具有SEQ ID NO：2，所述亲本蛋白酶的所述变体包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个选自下列组(a)和组(b)的突变，其中至少一个突变选自组(a)：
(a)A1E/T，S9/T，P14L，A15L，L16C，H17T，S18L/T，Q19K，G20A，Y21N/T，T22L，G23E，S33T，K43Y，N76D，G102A，N109A/S/G，A137V，K141R，T158S，G169A，S204E，P210S，N218S，N243P/V，S248N/A，S249A，K256R，L257G，S260P和N269D；和
(b)S24G/R/E，N25G，P40A/E，P52L，S53G，T55P，F58G，Q59S，N61E/P/G/S，N62Q/R/S，S63G/H，V68A，S78N，P86S，S87D/G，A88T/V，S89Y，A92G，L96T，G97A，G100N/Q/T，S101N，Q103E/H，Y104N，W106F，I111V，A114G，I115V，A116N/T，N117S，N118G，N123A/G/Q/V，M124I/V，S125A，L126A，G128A/S，P129E/Q/S/V，S130G，G131S/H，S132N，A133V，A134T，A144K，S145D，S159K，S161P，S162G/K，Y167A，P194L，V203Y，Q206D/E，K213L，Y217Q/L/D，V227T，A232T，P239R/V，N240K，T242R，K265N，L267V和Q275E。
在所述组合物的一个方面，所述亲本蛋白酶的变体相对于BPN′野生型具有-1、0或+1的总净电荷。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含辅助成分，所述辅助成分选自由下列组成的组：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、一种或多种附加的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预制的过酸、聚合物分散剂、粘土移除/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、香料递送体系、结构弹性化剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料以及它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含材料，所述材料选自由下列组成的组：包含香料的包封物，调色剂，两亲清洁聚合物以及它们的混合物，增白剂，螯合剂以及它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含第二非免疫等价蛋白酶，所述蛋白酶选自由下列组成的组：
a)枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)；
b)胰蛋白酶样或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶；
c)金属蛋白酶；和
d)它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含第二非免疫等价蛋白酶，所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)型的蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)型的蛋白酶为冷水GG36变体蛋白酶。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含附加的酶，所述附加的酶选自由下列组成的组：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣多糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、或它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含附加的酶，所述附加的酶选自由下列组成的组：
a)第一洗涤脂肪酶；
b)与来源于芽孢酵母属(Bacillus sp.)NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513，DSM 9375DSM 12368，DSMZ no.12649，KSM AP1378，KSM K36或KSM K38的野生型碱性α-淀粉酶具有大于90％的同一性的α-淀粉酶；
c)微生物来源的内葡聚糖酶；和
d)它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含材料，所述材料选自由下列组成的组：
a)脂肪醇乙氧基硫酸酯表面活性剂；
b)螯合剂，所述螯合剂选自由下列组成的组：DTPA(二亚乙基三胺五醋酸)、HEDP(羟基乙烷二磷酸)、DTPMP(二乙烯三胺五甲叉膦酸)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸二钠水合物和此类螯合剂的衍生物；和
c)它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含材料，所述材料选自由下列组成的组：
a)具有10至14的烷基链长和1至4的乙氧基化度的脂肪醇乙氧基硫酸酯表面活性剂；
b)螯合剂，所述螯合剂选自由下列组成的组：DTPA(二亚乙基三胺五醋酸)、HEDP(羟基乙烷二磷酸)、DTPMP(二乙烯三胺五甲叉膦酸)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸二钠水合物和此类螯合剂的衍生物；和
c)它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，基于总组合物重量计，所述组合物包含约1％至约5％水平的螯合剂。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含织物调色剂，所述织物调色剂选自由下列组成的组：
a)染料；
b)包含至少一种阳离子-碱性染料和蒙脱石粘土的染料-粘土缀合物；和
c)它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，所述组合物包含织物调色剂，所述织物调色剂选自由下列组成的组：
a)小分子染料；聚合的染料以及它们的混合物；
b)包含至少一种阳离子-碱性染料和蒙脱石粘土的染料-粘土缀合物；和
c)它们的混合物。
在所述组合物的一个方面，基于总组合物重量计，所述组合物包含：
a)约0.0005重量％至约0.1重量％的所述冷水蛋白酶；和
b)下列中的一种或多种：
(i)约0.00003wt％至约0.1wt％的织物调色剂；
(ii)约0.001wt％至约5wt％的香料胶囊和/或
(iii)约0.1wt％至约5wt％的两亲清洁聚合物。
在所述组合物的一个方面，所述组合物具有单独的或多隔室的单位剂型。
在所述组合物的一个方面，所述组合物为多隔室的单位剂量形式，其中至少一种蛋白酶处于与任何附加的酶和/或螯合剂不同的隔室中。
在一个方面，公开了一种组合物，所述组合物包含冷水蛋白酶和选自由下列组成的组的材料：包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物，所述组合物为织物和家居护理产品。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述冷水蛋白酶为具有SEQ ID NO：2(枯草杆菌蛋白酶BPN′)的蛋白酶的变体，所述变体包含下列各组突变、插入或缺失中的一组或多组：S182E，N109I，N109D-Y217L-S248R，N109D-S188R-Y217L，S87D-Y217L-S248R，S87R-N109D-Y217L-S248R，S87R-N109D-S188D-Y217L-S248R，G128A-Y217Q，I111V-M124V，M124V-Y217Q，N62Q-G97A，S89Y-M124V，V68A，V68A-A92G，V68A-G97A，V68A-I111V，V68A-S89Y，V68A-V227T，V68A-Y217Q，W106F-Y217Q，G97A-G128A-Y217Q，G97A-L126A-Y217Q，G97A-M124V-L126A-Y217Q，G97A-N123G-Y217Q，L96T-G97A-Y217Q，M124V-L126A-Y217Q，N62Q-G128A-Y217Q，N62Q-G97A-Y217Q，G97N-G128A-Y217M，G97G-G128S-Y217E，G97A-G128A-Y217Q，G97M-G128S-Y217E，G97A-G128S-Y217Q，G97D-G128S-Y217Q，G97M-G128G-Y217M，G97G-G128S-Y217Q，G97S-G128S-Y217Q，G97G-G128A-Y217Q，G97S-G128A-Y217E，G97A-G128S-Y217L，G97A-G128A-Y217N，G97Q-G128S-Y217L，G97A-G128A-Y217M，G97A-G128A-Y217S，G97D-G128A-Y217Q，G97M-G128S-Y217Q，G97Q-G128G-Y217D-S87Y，G97S-G128A-Y217N，G97A-G128S-Y217T，G97D-G128S-Y217E，G97D-G128A-Y217L，G97G-G128S-Y217E-S78P-A272T，G97T-G128S-Y217D，G97D-G128A-Y217I，G97Q-G128S-Y217Q，G97G-G128A-Y217D，G97Q-G128A-Y217N，G97S-G128A-Y217M，G97S-G128S-Y217N，G97S-G128S-Y217M，G97E-G128S-Y217M，G97S-G128P-Y217Q，G97T-G128S-Y217Q，G97D-G128S-Y217Q-A73T，G97E-G128S-Y217N，G97G-G128A-Y217I，G97Q-G128A-Y217D，G97Q-G128S-Y217M，G97R-G128T-Y217Q-S162P，G97S-G128S-Y217D，G97T-G128P-Y217I，G97Q-G128G-Y217E，G97C-G128G-Y217N，G97D-G128S-Y217H，G97M-G128S-Y217L，G97M-G128S-Y217N，G97S-G128S-Y217E，G97M-G128S-Y217I，G97A-G128P-Y217A，G97R-G128S-Y217D，G97A-G128A-Y217Q-S145D，G97A-G128A-Y217Q-P239R，G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S162K-K213L-N240K，G97A-G128A-Y217Q-N61E，G97A-G128A-Y217Q-P40E-A144K-K213L，G97A-G128A-Y217Q-P129E，G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S159K，G97A-G128A-Y217Q-K213L，G97A-G128A-Y217Q-S87D，G97A-G128A-Y217Q-Q206E，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-S145D-S159K-K213L，G97A-G128A-Y217Q-K265N，G97A-G128A-Y217Q-S24R，G97A-G128A-Y217Q-P40E，G97A-G128A-Y217Q-Q275E，G97A-G128A-Y217Q-P129E-S145D-N240K，G97A-G128A-Y217Q-A144K，G97A-G128A-Y217Q-S159K，G97A-G128A-Y217Q-S162K，G97A-G128A-Y217Q-N240K，G97A-G128A-Y217Q-S53G，G97A-G128A-Y217Q-S78N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-I111V，G97A-G128A-Y217Q-S53G-N117S，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S132N，G97A-G128A-Y217Q-Y104N-S132N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-I111V，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-N117S，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S132N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-Y104N-S132N，G97A-G128A-Y217Q-S78N-Y104N-S132N，Y217L-V068C-A069G，Y217L-I079F-A098G，Y217L-P086T-S101D-Q103S-V147I，Y217L-A088T-P129S-G146D，Y217L-V093I-G128D-P129R，Y217L-Z096.01D-A098R，Y217L-Z096.01H-A098G，Y217L-G097S-Z097.01S-A098G-A273T，Y217L-A098S-D099G-G100D，Y217L-Z098.01N，Y217L-D099G-Z099.01N，Y217L-D099G-Z099.01S，Y217L-D099V-S101D，Y217L-Z099.01S，Y217L-G100D，Y217L-S101D-Q103H，Y217L-S101G-A151V，Y217L-S101H-G102S，Y217L-S101H-Q103D，Y217L-G102R-Q103C-Y104C-V192I，Y217L-Q103D，Y217L-V121I-I122S-N123C，Y217L-V121L-N123C，Y217L-I122S-N123S，Y217L-M124I，Y217L-M124V，Y217L-L126F-P129Z-S182N，Y217L-L126Y，Y217L-G127S-P129D，Y217L-Z127.01N-G128S-P129S，Y217L-G128H-P129Y，Y217L-G128S-P129D，Y217L-G128S-P129D-S248R，Y217L-G128S-P129G，Y217L-P129G-G131Z，Y217L-P129G-S130H-S132Z，Y217L-P129H-G131Z，Y217L-P129L，Y217L-P129S-S130H-S132Z，Y217L-P129Z，Y217L-P129Z-S130G，Y217L-P129Z-S130G-G131H-S132H，Y217L-P129Z-S130H，Y217L-S130V-G131D-S132I，S87T-A88L-S89G-G97A-G128A-Y217Q，N61P-S63H-G97A-G128A-Y217Q，S87G-A88V-S89A-G97A-G128A-Y217Q，P86S-S87G-A88V-G97A-G128A-Y217Q，Q59S-N61P-G97A-G128A-Y217Q，S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q，N61P-N62S-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-P129Q-S130G-G131S-Y217Q，L75S-N76Y-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-V203Y-Y217Q，T55P-G97A-G128A-Y217Q，A88V-L90I-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-G211R-N212S-K213V-Y217Q，G23A-S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q，T22N-S24A-G97A-G128A-Y217Q，S24R-G97A-G128A-Y217Q，G97A-A98S-G128A-Y217Q，G97A-G128A-T158G-S159G-Y217Q，Q59E-N61P-G97A-G128A-Y217Q，G97A-A98E-G128A-Y217Q，G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-S63T-P86S-S87G-A88V，G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-P239R，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61P-N62S-P194L-A232T，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-A133V-L267V，G97A-G128A-Y217Q-A134T-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-P129E-S159K-K265R，G97A-G128A-Y217Q-A134T-G211T，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129E，G97A-G128A-Y217Q-I111V-S161P，G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q，G97A-G128A-Y217Q-I115V-L267V，G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116S-N117G-N118R，G97A-G128A-Y217Q-V203Y-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-P52S-T55P-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A116S-N117G-N118R，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-T242R，G97A-G128A-Y217Q-P40E-T55P-N269K，G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-V8L-N25Y-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N，G97A-G128A-Y217Q-G211T-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-S24R-A128S-P129G，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-N240K，G97A-G128A-Y217Q-N25Y-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A134T，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-N61P-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N，G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129V-P194S，G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129V，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N-S101N，G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-I115V，G97A-G128A-Y217Q-N25Y-S87G-A88V-S89A，G97A-G128A-Y217Q-A134T-N240K，G97A-G128A-Y217Q-S24R-Q59S-N61P，G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P239R，G97A-G128A-Y217Q-T55P-A116S-N117G-N118R，G97A-G128A-Y217Q-A134T-S161P，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-N61P-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-N25Y-Q59S-N61P，G97A-G128A-Y217Q-N25Y-P129Q-S130G-G131S-A137T，G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-N61P-S63H，G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S78N-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-N240K，G97A-G128A-Y217Q-T55P-A134T，G97A-G128A-Y217Q-N25Y-N61P-S63H，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-P129S，G97A-G128A-Y217Q-T55P-L75H-N76G，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-T55P-I115V，G97A-G128A-Y217Q-T55P-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-G211R-N212S-K213V，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-N61P-S78N-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N，G97A-G128A-Y217Q-I115V-A273S，G97A-G128A-Y217Q-N25Y-T55P，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-N240K，G97A-G128A-Y217Q-S161P-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S 101N，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S 101N，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61P-S101N，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-N240K，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S101N，G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-A128S-P129Q，G97A-G128A-Y217Q-S89Y-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-I115V-N240K，G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61P-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S161P-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-N240K，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-P239R，G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-I115V-A134T，G97A-G128A-Y217Q-Y6Q-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S89Y，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N-A88V-S101N，G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-S78N-I111V-A134T，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S78N-S101N，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61P-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-S78N-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N，G97A-G128A-Y217Q-N240K-A273S，G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-S87T-A88L-S89G，G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-S78N-S161P，G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-S78N-I111V，G97A-G128A-Y217Q-T55P-A128S-P129Q，G97A-G128A-Y217Q-N61P-S78N-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-N61E-A144K，G97A-G128A-Y217Q-A134T-P239R，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-T55P-N240K，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S87T-A88L-S89G-S101N，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-P239R，G97A-G128S-Y217Q，G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61P-S101N，G97A-G128A-Y217Q-I111V-P129Q-G211T，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-S87G-A88V-S89A，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-S162K，G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-T55P-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G，G97A-G128A-Y217Q-I111V-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-I111V-A273S，G97A-G128A-Y217Q-N61P-S87T-A88L-S89G，G97A-G128A-Y217Q-T22N-S24A-N61P-S63H，G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-P129S-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S159K-L267V，G97A-G128A-Y217Q-P40E-S53Y-S78Y-P86S-S87G-A88V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-S145D，G97A-G128A-Y217Q-I111V-S159K，G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129L，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S101N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S89Y，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129V，G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G-P172H，G97A-G128A-Y217Q-I111V-A134T，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-P5S-S87G-A88V-S89A-A116G-N117R，Y217Q-N61P-A97G-G102A-A128G-P129S，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-N61P-S78N，G97A-G128A-Y217Q-S145D-S159K-N240K-Q275E，G97A-G128A-Y217Q-T55P-A128S-P129D，G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-A128S-P129D，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-I111V-P239R，G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-S162K，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I115V，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N，G97A-G128A-Y217Q-T55P-A92G，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S87T-A88L-S89G-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-T22N-S24A-T55P，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-S159K，G97A-Y217Q-N61P-N62Q-G100N-A128G，G97A-G128A-Y217Q-S24R-S78N-S182P-L267V，G97A-G128A-Y217Q-P239R-A273S，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-T242R，G97A-G128A-Y217Q-S3F-S87T-A88L-S89G-G211T，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-L75H-N76G，G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A144K，G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I111V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-S145D-P239R-Q275E，G97A-G128A-Y217Q-S145D-A273S，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-K141E-T242R，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-A116N-N117S-N118G-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-S89Y-G211T，G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G-A144T，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129V，G97A-Y217Q-N61P-A128G-P129S-S130P，G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S87T-A88L-S89G-G110C-S130P，G97A-Y217Q-N123G-A128G，G97A-G128A-Y217Q-N61P-N62Q-G100N-G102A-M124I，S78N-G97A-G128A-Y217Q，G97A-S101N-G128A-Y217Q，G97A-G128A-A137V-Y217Q，N61P-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-S130P-Y217Q，G97A-Q103N-G128A-Y217Q，S63T-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G102A-G128A-Y217Q，G97A-N109D-G128A-Y217Q-S248R，S87R-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-S188D-Y217Q，S87D-G97A-G128A-Y217Q-S248R，G97A-G128A-S188D-S248R-Y217Q，G97A-G128A-S248D-Y217Q，S78N-G97A-G128A-Y217Q-L267V，S78N-G97A-G128A-Y217Q-S161P，S78N-G97A-G128A-Y217Q-I115V，S78N-G97A-G128A-Y217Q-A273S，S78N-G97A-G128A-Y217Q-G211T，S78N-G97A-G128A-Y217Q，S78N-G97A-G128A-Y217Q-I111V，S78N-G97A-G128A-Y217Q-V147L，S78N-G97A-G128A-Y217Q-I108V，S78N-G97A-G128A-Y217Q-S89Y，S78N-G97A-G128A-Y217Q-A138T，G97A-G128A-Y217Q-A134T-K213L，G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P129V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P239R，G97A-G128A-Y217Q-S24R-S87T-A88L-S89G。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述具有SEQ ID NO：2的蛋白酶的变体，在包括位点24、25、40、52、53、55、58、59、61、62、63、68、78、86、87、88、89、92、96、97、100、101、103、104、106、111、114、115、116、117、118、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、144、145、159、161、162、167、194、203、206、213、217、227、232、239、240、242、265、267和275的位点的组中包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个突变。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述具有SEQ ID NO：2的蛋白酶的变体包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个选自下列组(a)和组(b)的突变：
(a)带电突变，所述带电突变选自由下列组成的组：N61E，A144K，P129E，P239R，P40E，Q103E，Q206E，Q275E，S145D，S159K，S162K，S24R，S63H，S87D和T242R；和
(b)中性突变，所述中性突变选自由下列组成的组：A114G，A116N，A133V，A134T，A232T，A88V，A92G，F58G，G100T，G128A，G131S，G97A，I111V，I115V，K213L，K265N，L126A，L267V，L96T，M124V，N117S，N118G，N123G，N240K，N25G，N61P，N62Q，N62R，N62S，P129Q，P129V，P194L，P239V，P52L，P86S，Q59S，S101N，S125A，S130G，S132N，S161P，S24G，S53G，S78N，S87G，S89Y，T55P，V203Y，V227T，V68A，W106F，Y104N，Y167A和Y217Q。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述具有SEQ ID NO：2的蛋白酶的变体包含一个或多个突变，并且相对于BPN′野生型具有-1、0或+1的总净电荷。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物包含辅助成分，所述辅助成分选自由下列组成的组：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、一种或多种附加的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预制的过酸、聚合物分散剂、粘土移除/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、香料递送体系、结构弹性化剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料以及它们的混合物。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物包含第三非免疫等价蛋白酶，所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)型的蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)型的蛋白酶为冷水GG36变体蛋白酶。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物包含附加的酶，所述附加的酶选自由下列组成的组：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣多糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、或它们的混合物。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物包含附加的酶，所述附加的酶选自由下列组成的组：
a)第一洗涤脂肪酶；
b)与来源于芽孢酵母属(Bacillus sp.)NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513，DSM 9375 DSM 12368，DSMZ no.12649，KSM AP1378，KSM K36或KSM K38的野生型碱性α-淀粉酶具有大于90％的同一性的α-淀粉酶；
c)微生物来源的内葡聚糖酶；和
d)它们的混合物。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物包含材料，所述材料选自由下列组成的组：
a)脂肪醇乙氧基硫酸酯表面活性剂；
b)螯合剂，所述螯合剂选自由下列组成的组：DTPA(二亚乙基三胺五醋酸)、HEDP(羟基乙烷二磷酸)、DTPMP(二乙烯三胺五甲叉膦酸)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸二钠水合物和此类螯合剂的衍生物；和
c)它们的混合物。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物包含材料，所述材料选自由下列组成的组：
a)具有10至14的烷基链长和1至4的乙氧基化度的脂肪醇乙氧基硫酸酯表面活性剂；
b)螯合剂，所述螯合剂选自由下列组成的组：DTPA(二亚乙基三胺五醋酸)、HEDP(羟基乙烷二磷酸)、DTPMP(二乙烯三胺五甲叉膦酸)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸二钠水合物和此类螯合剂的衍生物；和
c)它们的混合物。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，基于总组合物重量计，所述组合物包含约1％至约5％水平的螯合剂。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物包含织物调色剂，所述织物调色剂选自由下列组成的组：
a)染料；
b)包含至少一种阳离子-碱性染料和蒙脱石粘土的染料-粘土缀合物；和
c)它们的混合物。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物包含织物调色剂，所述织物调色剂选自由下列组成的组：
a)小分子染料；聚合的染料以及它们的混合物；
b)包含至少一种阳离子-碱性染料和蒙脱石粘土的染料-粘土缀合物；和
c)它们的混合物。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，基于总组合物重量计，所述组合物包含：
a)约0.0005重量％至约0.1重量％的所述冷水蛋白酶；和
b)下列中的一种或多种：
(i)约0.00003wt％至约0.1wt％的织物调色剂；
(ii)约0.001wt％至约5wt％的香料胶囊；
(iii)约0.1wt％至约5wt％的两亲清洁聚合物；
(iv)约0.00003wt％至约0.1wt％的GG36变体蛋白酶。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物具有单独的或多隔室的单位剂型。
在所述包含冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料的组合物的一个方面，所述组合物为多隔室的单位剂量形式，其中至少一种蛋白酶处于与任何附加的酶和/或螯合剂不同的隔室中。
公开了一种织物和家居产品，所述织物和家居产品可包含一种或多种冷水蛋白酶和选自由包含香料的包封物、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物组成的组的材料，并且考虑到前述组合物的任何方面的平衡包含一种或多种助剂材料。
在前述织物和家居护理产品的一个方面，基于总的织物和家居护理产品重量计，所述织物和家居护理产品可包含约0.0005wt％至约0.1wt％、约0.001wt％至约0.05wt％、或甚至约0.002wt％至约0.03wt％的所述冷水蛋白酶。
在前述织物和家居护理产品的一个方面，基于总的织物和家居护理产品重量计，所述织物和家居护理产品可包含约0.00003wt％至约0.1wt％、约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂；
在前述织物和家居护理产品的一个方面，基于总的织物和家居护理产品重量计，所述织物和家居护理产品可包含约0.001wt％至约5wt％、约0.01wt％至约2wt％、或甚至约0.03wt％至约0.5wt％的香料胶囊。
在前述织物和家居护理产品的一个方面，基于总的织物和家居护理产品重量计，所述织物和家居护理产品可包含约0.1wt％至约5wt％、约0.25wt％至约2.5wt％、或甚至约0.3wt％至约1.5wt％的两亲清洁聚合物。
冷水蛋白酶
除上文在“织物和家居护理产品”中公开的冷水蛋白酶外，适合的冷水蛋白酶变体为那些表现出下列四项标准中的一项或多项的酶：
(a)在pH 8和60°F下，在与Purafect Prime(SEQ ID NO：2，带有突变Y217L)比较时，对于BMI具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的性能指数，所述性能指数如测试方法2和/或测试方法3所定义；
(b)在pH 8和60°F下，在与BPN′(SEQ ID NO：2)比较时，对于BMI具有至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.3至约10、1.3至约8或甚至1.3至约5的性能指数，所述性能指数如测试方法2和/或测试方法3所定义；
(c)在pH 8和60°F下，在与SEQ ID NO：4比较时，对于BMI具有至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、0.9至约10、0.9至约8或甚至0.9至约5的性能指数，所述性能指数如测试方法2和/或测试方法3所定义；
(d)在pH 8和60°F下，在与SEQ ID NO：6比较时，对于BMI具有至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、0.9至约10、0.9至约8或甚至0.9至约5的性能指数，所述性能指数如测试方法2和/或测试方法3所定义；
此类蛋白酶的实例可见于本说明书的实施例2-18和31中。如上所定义的冷水蛋白酶可被用于织物和家居护理产品中。因此，在一个方面，公开了包含此类冷水蛋白酶的织物和家居护理产品。
本发明的GG36蛋白酶
适合的GG36蛋白酶可以选自实施例19至30中所描述的变体。在一个方面，GG36冷水蛋白酶可以是系列1的GG36冷水蛋白酶。
适合的系列1的GG36冷水蛋白酶变体包括来源于亲本蛋白酶的酶，所述亲本蛋白酶的序列与SEQ ID NO：755的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的同一性，所述变体具有下列特征中的一项或多项：
a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法4性能指数；
b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法5性能指数。
c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数。
适合的系列1的GG36冷水蛋白酶可以来源于枯草杆菌蛋白酶，尤其是来源于SEQ ID NO：755的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的那些，并且在一个方面可包含下列突变中的一个或多个：
A1R，Q2S，V4R，V4S，S9A，R10S，P14K，A16S，H17R，N18R，G20R，T22A，T22R，S24R，S24W，G25R，G25V，V26F，L42I，N43R，N43A，G46R，P52F，P52E，P52N，T57R，Q59A，N62E，N62Q，V68A，V68C，T71G，I72C，A74C，L75A，L75F，L75R，N76D，S78R，L82R，P86W，E89P，E89T，E89G，E89H，E89I，E89V，E89W，Y91N，K94N，G100S，S101A，S101N，S101G，S101D，S103G，S103N，V104L，V104I，S106V，S106G，A108I，L111V，E112V，G115K，G115R，N117F，G118I，V121F，S128D，S128F，S128L，S128N，P129E，S144R，L148I，A158E，G159E，S160D，S166D，N185E，N185I，R186H，S188E，S188D，D 197F，V203E，Y209S，Y209N，Y209F，Y209T，Y209E，Y209H，Y209G，P210R，S212I，S212F，Y214F，A215N，A215D，A215E，L217E，L217N，T224A，A230E，A231I，Q236F，N238R，N238K，P239K，P239G，P239R，P239S，W241R，S242R，S242L，N243R，V244R，N248I，N248V，H249R，L250I，N252R，T253R，L262D，Y263F，S265F，L267V，L267N，N269I，N269R，E271F，E271I，E271H，E271P，E271T，E271V，E271L和/或A272F。
在一个方面，适合的系列1的GG36冷水蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶(尤其是SEQ ID NO：755的迟缓芽孢杆菌的)，其可包含下列各组突变、插入或缺失中的一组或多组：
T022R-S024R，S009A-E271L，N018R-W241R，N018R-G115R，N043R-H249R，G020R-H249R，V004R-H249R，G020R-S024R，N018R-H249R，S009A-G020R，G020R-W241R，S009A-S078R，G020R-G115R，N018R-S024R，S024R-S242R，T022R-G115R，N018R-N043R，G020R-N043R，N018R-S242R，S242R-N269R，N018R-V244R，S024R-N269R，G020R-E271L，S024R-E271L， V004R-S009A，G020R-N269R，A001R-S024R，V244R-E271L，S009A-N018R，W241R-E271L，V004R-S024R，S009A-H249R，S009A-T022R，N062E-P129E，N062E-G159E，A016S-L148I，A158E-H249R，A016S-N062E，L111V-S188D，T022A-N062E，N062E-L148I，T022A-P129E，N062E-E271F，N062E-A158E，A016S-G159E，N062E-R186H，S128N-G159E，N062E-S188D，N062E-S128N，L148I-G159E，S103G-A158E，L111V-G159E，A158E-E271F，A016S-S188D，T022A-L111V，S128N-A158E，A016S-A158E，V104L-A158E，S128N-R186H，G159E-Y209E，N062E-S101A，L111V-Y209E，L148I-S188D，S101A-Y209E，T022A-S188D，A016S-T022A，S128N-P129E，A016S-Y209E，A016S-S128N，T022A-E089P，S128N-Y209E，E089P-A158E，N062E-S103G，R186H-E271F，A016S-P129E，E089P-G159E，L111V-H249R，S101A-P129E，L148I-Y209E，T022A-G159E，P129E-H249R，P129E-Y209E，V104L-P129E，S128N-S188D，L111V-A158E，T022A-A158E，N062E-Y209E，N062E-H249R，S 101A-R186H，E089P-P129E，P129E-E271，T22A-L111V-G159E，S101A-S103G-V104L-Y209E，S101A-S103G-V104L-G159E，S101A-S103G-V104L-S188D，S101G-S103A-V104I-G159D，T22A-S103G-G159E，T22A-S128N-E271F-Y209E，T22A-Y209E-E271F，T22A-S101A-Y209E，S101A-Y209E-E271F，T22A-L111V-S128N，T22A-S101A-G159E，S101A-S103G-V104L，T22A-S101A-S103G-V104L，S101A-S103G-V104L，S101G-S103A-V104I，S101A-S103G-V104L-S128N，S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D，N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F，N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R，T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R，S 101G-S 103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R，T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F，S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R，S101G-S 103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F，S 101G-S 103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D和/或S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F。
在一个方面，适合的系列1的GG36冷水蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶(尤其是SEQ ID NO：755的迟缓芽孢杆菌的)的变体，所述变体在包括位点1、2、4、9、10、14、16、17、18、20、22、24、25、26、42、43、46、52、57、59、62、68、71、72、74、75、76、78、82、86、89、91、94、100、101、103、104、106、108、111、112、115、117、118、121、128、129、144、148、158、159、160、166、185、186、188、197、203、209、210、212、214、215、217、224、230、231、236、238、239、241、242、243、244、248、249、250、252、253、262、263、265、267、269、271和272的位点的组中包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个突变。
在一个方面，适合的系列1的GG36冷水蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶(尤其是SEQ ID NO：755的迟缓芽孢杆菌的)的变体，所述变体包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个选自由下列组成的组的突变：A1R，Q2S，V4R，V4S，S9A，R10S，P14K，A16S，H17R，N18R，G20R，T22A，T22R，S24R，S24W，G25R，G25V，V26F，L42I，N43R，N43A，G46R，P52F，P52E，P52N，T57R，Q59A，N62E，N62Q，V68A，V68C，T71G，I72C，A74C，L75A，L75F，L75R，N76D，S78R，L82R，P86W，E89P，E89T，E89G，E89H，E89I，E89V，E89W，Y91N，K94N，G100S，S101A，S101N，S101G，S101D，S103G，S103N，V104L，V104I，S106V，S106G，A108I，L111V，E112V，G115K，G115R，N117F，G118I，V121F，S128D，S128F，S128L，S128N，P129E，S144R，L148I，A158E，G159E，S160D，S166D，N185E，N185I，R186H，S188E，S188D，D197F，V203E，Y209S，Y209N，Y209F，Y209T，Y209E，Y209H，Y209G，P210R，S212I，S212F，Y214F，A215N，A215D，A215E，L217E，L217N，T224A，A230E，A231I，Q236F，N238R，N238K，P239K，P239G，P239R，P239S，W241R，S242R，S242L，N243R，V244R，N248I，N248V，H249R，L250I，N252R，T253R，L262D，Y263F，S265F，L267V，L267N，N269I，N269R，E271F，E271I，E271H，E271P，E271T，E271V，E271L和A272F；和任选地下列突变中的一个或多个：S103A，G159D，Q236H，Q245R，N248D和N252K。
在一个方面，所述系列1的GG36冷水蛋白酶为具有SEQ ID NO：755的枯草杆菌蛋白酶GG36的变体，公开了包含一个或多个突变，并且相对于野生型枯草杆菌蛋白酶GG36带有-5、-4、-3、-2、-1或0的总净电荷的所述变体。
在一个方面，所述系列1的GG36冷水蛋白酶为低离子强度冷水蛋白酶。此类低离子强度冷水蛋白酶为具有SEQ ID NO：755的枯草杆菌蛋白酶GG36的变体，公开了包含一个或多个突变，并且相对于野生型枯草杆菌蛋白酶GG36带有-5、-4、-3、-2、-1或0的总净电荷的所述变体。这些突变选自：
(a)下列突变中的两个或更多个：A1R，Q2S，V4R，V4S，S9A，R10S，P14K，A16S，T22A，T22R，S24R，G25V，V26F，L42I，P52F，P52E，P52N，N62E，N62Q，V68A，V68C，T71G，I72C，A74C，L75A，L75F，S78R，E89P，E89T，E89G，E89H，E89W，Y91N，K94N，G100S，S101A，S101N，S101G，S101D，S103G，S103N，V104L，V104I，A108I，L111V，E112V，G115K，N117F，V121F，S128D，S128F，S128L，S128N，P129E，L148I，A158E，G159E，S160D，S166D，N185E，R186H，S 188E，S 188D，V203E，Y209S，Y209N，Y209F，Y209T，Y209E，Y209H，Y209G，P210R，S212I，S212F，Y214F，A215N，A215D，A215E，L217E，L217N，T224A，A230E，A231I，Q236F，N238R，N238K，P239K，P239G，P239R，N248V，H249R，L250I，L262D，Y263F，S265F，L267V，L267N，N269I，N269R，E271F，E271I，E271H和A272F；和/或
(b)下列突变的组中的一个或多个：N062E-P129E，N062E-G159E，A016S-L148I，A158E-H249R，A016S-N062E，L111V-S188D，T022A-N062E，N062E-L148I，T022A-P129E，N062E-E271F，N062E-A158E，A016S-G159E，N062E-R186H，S128N-G159E，N062E-S188D，N062E-S128N，L148I-G159E，S103G-A158E，L111V-G159E，A158E-E271F，A016S-S188D，T022A-L111V，S128N-A158E， A016S-A158E，V104L-A158E，S128N-R186H，G159E-Y209E，N062E-S101A，L111V-Y209E，L148I-S188D，S101A-Y209E，T022A-S188D，A016S-T022A，S128N-P129E，A016S-Y209E，A016S-S128N，T022A-E089P，S128N-Y209E，E089P-A158E，N062E-S103G，R186H-E271F，A016S-P129E，E089P-G159E，L111V-H249R，S101A-P129E，L148I-Y209E，T022A-G159E，P129E-H249R，P129E-Y209E，V104L-P129E，S128N-S188D，L111V-A158E，T022A-A158E，N062E-Y209E，N062E-H249R，S101A-R186H，E089P-P129E，P129E-E271F，T22A-L111V-G159E，S101A-S103G-V104L-Y209E，S101A-S103G-V104L-G159E，S101A-S103G-V104L-S188D，S101G-S103A-V104I-G159D，T22A-S103G-G159E，T22A-S128N-E271F-Y209E，T22A-Y209E-E271F，T22A-S101A-Y209E，S101A-Y209E-E271F，T22A-L111V-S128N，T22A-S101A-G159E，S101A-S103G-V104L，T22A-S101A-S103G-V104L，S101A-S103G-V104L，S101G-S103A-V104I，S101A-S103G-V104L-S128N，S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D，N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F，N62E-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R，T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R，S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R，T22A-S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F，S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R，S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D和S101G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271F；
在一个方面，上述低离子强度系列1的GG36冷水蛋白酶形成一种洗涤剂组合物的部分，该组合物被稀释于水中(典型地在洗衣机内)，形成洗涤液体，所述洗涤液体的电导率为约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm、或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm。
在一个方面，所述系列1的GG36冷水蛋白酶为高离子强度冷水蛋白酶。此类高离子强度冷水蛋白酶为具有SEQ ID NO：755的枯草杆菌蛋白酶GG36的变体，所述变体包含两个或更多个突变，并且相对于野生型枯草杆菌蛋白酶GG36带有+5、+4、+3、+2、+1或0的总净电荷。这些突变选自：
a)下列突变中的两个或更多个：V4R，H17R，N18R，G20R，T22R，S24R，S24W，G25R，N43R，N43A，G46R，P52F，P52N，T57R，Q59A，N62Q，T71G，L75R，N76D，S78R，L82R，P86W，E89P，E89W，E89T，E89I，E89H，E89V，V104L，S106V，S106G，G115R，G118I，V121F，S144R，N185I，D197F，Y209N，Y209S，L217E，A231I，P239R，P239S，W241R，S242R，S242L，N243R，V244R，N2481，H249R，N252R，T253R，E271T，E271V，E271L，E271H，E271F，E271P，A1R，S9A，S212F和N269R；和/或
b)下列突变的组中的一个或多个：T022R-S024R，S009A-E271L，N018R-W241R，N018R-G115R，N043R-H249R，G020R-H249R，V004R-H249R，G020R-S024R，N018R-H249R，S009A-G020R，G020R-W241R，S009A-S078R，G020R-G115R，N018R-S024R，S024R-S242R，T022R-G115R，N018R-N043R，G020R-N043R，N018R-S242R，S242R-N269R，N018R-V244R，S024R-N269R，G020R-E271L，S024R-E271L，V004R-S009A，G020R-N269R，A001R-S024R，V244R-E271L，S009A-N018R，W241R-E271L，V004R-S024R，S009A-H249R，S009A-T022R，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F，S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271F，S101G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R，S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K，S101G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K
在一个方面，上述高离子强度系列1的GG36冷水蛋白酶形成一种洗涤剂组合物的部分，该组合物被稀释于水中(典型地在洗衣机内)，形成洗涤液体，所述洗涤液体的电导率为约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm、或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。
上述系列1的GG36冷水蛋白酶变体的电荷按相对于具有SEQ IDNO：755的氨基酸序列的野生型枯草杆菌蛋白酶GG36来表示。赋予单个负电荷的氨基酸是D和E，赋予单个正电荷的是R、H和K。改变了电荷的任何相对于SEQ ID NO：755的氨基酸变化均被用于计算所述系列1的GG36冷水蛋白酶变体的电荷。例如，从一个野生型中性位点引入一个负电荷突变将向所述系列1的GG36冷水蛋白酶变体加上-1的净电荷，而从一个野生型带正电的氨基酸残基(R、H或K)引入一个负电荷突变(D或E)将加上-2的净电荷。将来自就系列1的GG36冷水蛋白酶变体相对于具有SEQ IDNO：755的氨基酸序列的野生型枯草杆菌蛋白酶GG36而言不同的全部氨基酸残基的电荷变化求和，就得到了所述系列1的GG36冷水蛋白酶变体的电荷变化。不受理论的束缚，据信：
(a)就用于低电导率的衣物洗涤剂溶液的系列1的GG36冷水蛋白酶而言，优选的电荷范围是-5、-4、-3、-2、-1、0，尤其是-2、-1；
(b)就用于高电导率的衣物洗涤剂溶液的系列1的GG36冷水蛋白酶而言，优选的电荷范围是+5、+4、+3、+2、+1、0，尤其是+2、+1；通过正确地选择电荷，能够获得出人意料地改进的水平的低温清洁效力。
低电导率溶液被定义为具有约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm、或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm的电导率。
高电导率溶液被定义为具有约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm、或甚至约4mS/cm至约10mS/cm的电导率。
上述实例应被视作非限制性的。一旦突变被合并以使低温效力最优化，酶的电荷还能够通过在另外的位点的突变被平衡。
蛋白酶氨基酸编号、酶的命名和附加的定义。
本专利中所用的氨基酸位点编号是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN′编号体系。每种蛋白酶变体的每一氨基酸位点包括每种系列1的GG36冷水蛋白酶变体，均基于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列中对应的氨基酸位点的编号，如通过将所述蛋白酶变体的氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列进行比对所确定的而被编号。
供选择的替代编号方案是对迟缓芽孢杆菌(B.lentus)枯草杆菌蛋白酶GG36的特定氨基酸序列编号，该蛋白酶具有SEQ ID NO：755的氨基酸序列。本文所述的蛋白酶变体(包括系列1的GG36冷水蛋白酶变体)，没有一个氨基酸位点是用这种供选择的替代编号方案编号的。
在对本文的系列1的GG36冷水蛋白酶变体的描述中，使用下列命名法以便于参考：原来的氨基酸：位点：取代的氨基酸。
突变按以下方式命名：表示亲本氨基酸的单字母编码，接着是三位数字的位点编号，然后是表示变体氨基酸的单字母编码。例如，在位点87使甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)被表示为“G087S”或“G87S”。多重突变通过在突变之间插入“-”表示。在位点87和90的突变被表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。就缺失而言，用单字母编码“Z”表示。就相对于亲本序列的插入而言，单字母编码“Z”位于位点编号的左侧。就缺失而言，单字母编码“Z”位于位点编号的右侧。就插入而言，位点编号是该插入的氨基酸之前的位点编号，每一个氨基酸加上0.01。例如，在位点87和88之间丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和酪氨酸(Y)三个氨基酸的插入表示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。如此，合并上述所有突变，再加上在位点100的一个缺失，得到：“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。
在所有情况下，使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。单字母X是指二十种氨基酸中的任何一种。
术语“野生型”用于指氨基酸序列或核酸序列时表示该氨基酸序列或核酸序列是自然的或者天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指天然存在的(即尚未通过重组方法被操纵的)任何事物(例如，蛋白质、氨基酸或核酸序列)。如本文所用，术语“非天然存在的”是指并非天然存在的任何事物(例如，在实验室中产生的重组核酸)。
如本文所用，就氨基酸残基位点而言，“与......相应”或“对应于”或“对应的”是指在蛋白质或多肽中的所列举位点的氨基酸残基，或与蛋白质或多肽中的所列举残基同样的、同源的或等同的氨基酸残基。如本文所用，“对应的区域”一般是指相关的蛋白质或参考蛋白质上同样的位点。
术语“来源于”和“获得自”不仅是指通过所关注的生物菌株生产的或可生产的蛋白酶，还指由从此类菌株分离的DNA序列编码的和在包含此类DNA序列的宿主生物中生产的蛋白酶。此外，该术语还指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的并且具有所关注的蛋白酶的标识性特征的蛋白酶。例如，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”是指由芽孢杆菌属天然地产生的具有蛋白水解活性的那些酶，以及与通过芽孢杆菌属来源产生的那些相似，但却是通过使用基因工程技术，由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的非芽孢杆菌属生物产生的丝氨酸蛋白酶。
当论及两种核酸或多肽时，术语“同一的”是指当就最大一致性进行比对(如使用下列的序列比对或分析算法所测量的)时，这两种序列中的残基是相同的。
如本文所用，“同源基因”是指来自不同但通常相关的物种，彼此相当并且彼此相同或非常相似的一对基因。该术语包括被物种形成(即新物种的产生)所分离的基因(例如直系同源基因)，以及通过基因复制被分离的基因(例如旁系同源基因)。
蛋白质、多肽、或肽的“成熟的”形式，是指蛋白质、多肽、或肽不含信号肽序列和前肽序列的功能性形式。
如本文所用，“同源性”是指序列的相似性或同一性，优选的是同一性。同源性可利用本领域中已知的标准技术测定(参见例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443[1970\；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444[1988]；软件程序如Wisconsin Genetics Software Package(Genetics ComputerGroup，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；和Devereux等人，Nucl.Acid Res.12：387-395[1984])。有用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP采用渐进的双重比对从一组相关的序列产生多重序列比对。它还能够生成显示用于产生上述比对的聚类关系的树状图。PILEUP采用Feng和Doolittle(参见Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360[1987])的渐进比对方法的简化形式。该方法与Higgins和Sharp(参见Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153[1989])所描述的方法相似。有用的PILEUP参数包括默认为3.00的空位权重、默认为0.10的空位长度权重和加权末端空位。有用的算法的另一个实例是Altschul等人描述的BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410[1990]；和Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787[1993])。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul等人，Meth.Enzymol.266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用多个检索参数，大多数的这些参数被设定为默认值。可调整的参数被设定为下列值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠部分(overlap fraction)＝0.125，字长阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态的值，由程序自身依据特定序列的组成和针对其进行对所关注的序列的检索的特定数据库的组成而确定。但是，可以调整这些值以提高敏感度。
本领域的技术人员可容易地确定参考序列与所关注的测试序列之间的序列同一性百分比。多核苷酸或多肽序列之间的同一性百分比，由这些分子之间序列信息的直接比较所决定，比较通过比对序列和用本领域中已知的方法测定同一性进行。适合用于测定序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410[1990])。进行BLAST分析的软件可从美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过识别当与数据库序列中相同字长的序列比对时，检索序列中相匹配的或满足某种为正值的阈值分数T的字长为W的短序列，而识别高评分序列对(HSP)。这些初始的相邻的字符命中，被作为发现包含它们的更长的HSP的起始点。字符命中沿被比较的两个序列在两个方向上延伸，只要累积的比对评分能够增加。字符命中的延伸在下列情况时停止：累积的比对评分从所得到的最高值下降数量X；累积评分达到零或更低；或者达到两条序列之一的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的敏感度和速度。BLAST程序使用下列默认值：字长(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915[1992])比对(B)为50，期望值(E)为10，M′5，N′-4和对双链均进行比较。
然后，BLAST算法进行对两条序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul，见上文)。BLAST算法所提供的一种相似性量度是最小概率总和(smallest sum probability)(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列间会随机出现匹配的概率的指示。例如，认为一条序列与本发明的丝氨酸蛋白酶核酸序列相似的条件是：将该测试核酸与丝氨酸蛋白酶核酸进行比较时的最小概率总和小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001。当该测试核酸编码丝氨酸蛋白酶多肽时，如果最小概率总和的比较结果为小于约0.5，更优选地为小于约0.2，则认为其与所指定的丝氨酸蛋白酶核酸是相似的。
当论及两种或更多种核酸或多肽序列时，“同一性”百分比或“同一性”是指当就最大相似度(如使用序列比对算法或目测所确定的)被比较和比对时，两种或更多种序列是相同的，或者分别有指定百分比的核酸残基或氨基酸残基是相同的。受试氨基酸序列与参考(即查询)氨基酸序列的“序列同一性百分比”或“％同一性”或“％序列同一性”或“％氨基酸序列同一性”是指当序列被最优化对齐时，上述受试氨基酸序列在一段比对长度上与查询氨基酸序列按所指定的百分比是同一的(即以氨基酸连着氨基酸的原则)。因此，关于两段氨基酸序列的“80％氨基酸序列同一性”或“80％同一性”意指在两条最优化地对齐的氨基酸序列中80％的氨基酸残基是相同的。
受试核酸序列与参考(即查询)核酸序列的“序列同一性百分比”或“％同一性”或“％序列同一性”或“％核酸序列同一性”是指当序列被最优化对齐时，上述受试核酸序列在一段比对长度上与查询核酸序列按所指定的百分比是同一的(即就多核苷酸序列而言以核苷酸连着核苷酸的原则)。因此，关于两段核酸序列的“80％核酸序列同一性”或“80％同一性”意指在两条最优化地对齐的核酸序列中80％的核酸残基是相同的。
在一些实施方案中，受试序列与查询序列的“序列同一性百分比”或“％序列同一性”或“％同一性”，能够通过最优化地对齐这两段序列并在比对长度上比较这两段最优化对齐的序列而被算出。确定最优化的对齐中相同的残基在两条序列上均出现的位点的数量，从而提供了匹配位点的数量，然后用匹配位点的数量除以上述比对长度(除非另外指明，比对长度即查询序列的长度)的总的位点数量。将所得到的数字乘以100，即得到上述受试序列与查询序列的序列同一性百分比。
“最优化对齐”或“最优化地对齐的”是指两条(或更多条)序列给出最高的同一性百分比评分的对齐。例如，两种蛋白质序列的最优化对齐能够通过人工对齐序列以使得每种序列中最大数量的相同的氨基酸残基被对齐、或者通过使用本文所述的或本领域中已知的软件程序或方法而实现。两种核酸序列的最优化对齐能够通过人工对齐序列以使得每种序列中最大数量的相同的核苷酸残基被对齐、或者通过使用本文所述的或本领域中已知的软件程序或方法而实现。
在一些实施方案中，当采用所定义的参数，例如所定义的氨基酸取代矩阵、空位存在罚分(也被称为空位开放罚分)和空位延伸罚分，以实现一对多肽序列所可能的最高的相似性评分，而将这对序列对齐时，这两条多肽序列被视为是“最优化地对齐的”。在多肽序列比对算法(例如，BLASTP)中，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，见上文)，经常被用作默认的评分的取代矩阵。空位存在罚分应用于所比对的序列之一中单个氨基酸空位的引入，而空位延伸罚分应用于空位中的每一个残基位点。示例性的所采用的比对参数是：BLOSUM62评分矩阵，空位存在罚分＝11和空位延伸罚分＝1。比对评分由每一序列上比对在其处开始和结束的氨基酸位点(即比对窗口)限定，并且任选地通过向一条或两条序列均插入一个空位或多个空位，以实现最高的可能的相似性评分。
两种或更多种序列之间的最优化对齐能够通过目测或通过使用计算机而被确定，例如但不限于：用于氨基酸序列的BLASTP程序和用于核酸序列的BLASTN程序(参见例如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402(1997)；亦参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站)。
适用的织物调色剂
荧光增白剂发出至少一些可见的光。与之相反，织物调色剂能改变表面颜色是因为它们吸收至少一部分可见光谱。适用的织物调色剂包括染料、染料-粘土共轭物和颜料，它们能满足本说明书测试方法部分的测试方法1的需求。适用的染料包括小分子染料和聚合物染料。适宜的小分子染料包括选自由下列染料组成的组：所述染料属于直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或它们的混合物的颜色索引(C.I.)分类，例如：
(1)下式的三-偶氮直接蓝染料
Figure BDA00001742984400931
其中A、B和C萘基环中的至少两个被磺酸根基团取代，C环可在位点5处被NH2或NHPh基团取代，X是由最多2个磺酸根基团取代的苄基或萘基环，其可在位点2处被OH基团取代，也可被NH2或NHPh基团取代。
(2)下式的双-偶氮直接紫染料：
Figure BDA00001742984400941
其中Z是H或苯基，A环优选地被甲基和甲氧基基团在箭头所示位点取代，A环也可为萘基环，Y基团是苯基或萘基环，它被硫酸根基团取代，也可被甲基一取代或二取代。
(3)蓝色或红色酸性染料的化学式
Figure BDA00001742984400942
其中X和Y中的至少其中一个必须是芳基。在一个方面，两个芳基均可为取代的苄基或萘基，它可被非水增溶的基团取代，例如烷基或烷氧基或芳氧基，X和Y不能被水增溶的基团取代，例如磺酸盐或羧酸盐。在另一方面，X是硝基取代的苄基，Y是苄基。
(4)以下结构的红色酸性染料
Figure BDA00001742984400951
其中B是萘基或苄基基团，它可被非水增溶的基团取代，例如烷基或烷氧基或芳氧基，B不能被水增溶的基团取代，例如磺酸根或羧酸根。
(5)重氮基染料的结构
Figure BDA00001742984400952
其中彼此独立的X和Y是氢、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基，Rα是氢或芳基，Z是C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；卤素；羟基或羧基，n是1或2而m是0、1或2，以及它们的相应的盐，以及它们的混合物
(6)以下结构的三苯甲烷染料
Figure BDA00001742984400971
以及它们的混合物。
在另一方面，适合的小分子染料包括选自由下列组成的组的小分子染料：颜色索引(英国染色师学会，Society of Dyers and Colourists，Bradford，UK)号1，4-萘二酮、1-[2-[2-[4-[[4-(乙酰氧基)丁基]乙胺基]-2-甲基苯基]二氮烯基]-5-硝基-3-噻吩基]-乙酮、1-羟基-2-(1-萘基偶氮)-萘二磺酸、离子(2-)、1-羟基-2-[[4-(苯偶氮基)苯基]偶氮]-萘二磺酸、离子(2-)、2-[(1E)-[4-[二(3-甲氧基-3-氧丙基)氨基]-2-甲基苯基]偶氮]-5-硝基-3-噻吩甲酸、乙酯、2-[[4-[(2-氰乙基)乙胺基]苯基]偶氮]-5-(苯偶氮基)-3-氰基噻吩、2-[2-[4-[(2-氰乙基)乙胺基]苯基]二氮烯基]-5-[2-(4-硝基苯基)二氮烯基]-3-氰基噻吩、2-羟基-1-(1-萘基偶氮)-萘二磺酸、离子(2-)、2-羟基-1-[[4-(苯偶氮基)苯基]偶氮]-萘二磺酸、离子(2-)、4，4′-[[4-(二甲基氨基)-2，5-环己二烯-1-取代]亚甲基]二[N，N-二甲基-苯胺、6-羟基-5-[(4-甲氧苯基)偶氮]-2-萘磺酸、谷氨酸钠盐、6-羟基-5-[(4-甲基苯基)偶氮]-2-萘磺酸、谷氨酸钠盐、7-羟基-8-[[4-(苯偶氮基)苯基]偶氮]-1，3-萘二磺酸、离子(2-)、7-羟基-8-[2-(1-萘基)二氮烯基]-1，3-萘二磺酸、离子(2-)、8-羟基-7-[2-(1-萘基)二氮烯基]-1，3-萘二磺酸、离子(2-)、8-羟基-7-[2-[4-(2-苯偶氮基)苯基]二氮烯基]-1，3-萘二磺酸、离子(2-)、酸性黑1、酸性黑24、酸性蓝113、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝3、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝62、酸性蓝7、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝9、酸性蓝90、酸性绿27、酸性橙12、酸性橙7、酸性红14、酸性红150、酸性红151、酸性红17、酸性红18、酸性红266、酸性红27、酸性红4、酸性红51、酸性红52、酸性红73、酸性红87、酸性红88、酸性红92、酸性红94、酸性红97、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性紫49、碱性蓝159、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝3、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝9、碱性紫1、碱性紫2、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、C.I.酸性黑1、C.I.酸性蓝10、C.I.酸性蓝113、C.I.酸性蓝25、C.I.酸性蓝29、C.I.酸性蓝290C.I.酸性红103、C.I.酸性红150、C.I.酸性红52、C.I.酸性红73、C.I.酸性红88、C.I.酸性红91、C.I.酸性紫17、C.I.酸性紫43、C.I.直接蓝1、C.I.直接蓝120、C.I.直接蓝34、C.I.直接蓝70、C.I.直接蓝71、C.I.直接蓝72、C.I.直接蓝82、C.I.直接紫51、C.I.分散蓝10、C.I.分散蓝100、C.I.分散蓝101、C.I.分散蓝102、C.I.分散蓝106:1、C.I.分散蓝11、C.I.分散蓝12、C.I.分散蓝121、C.I.分散蓝122、C.I.分散蓝124、C.I.分散蓝125、C.I.分散蓝128、C.I.分散蓝130、C.I.分散蓝133、C.I.分散蓝137、C.I.分散蓝138、C.I.分散蓝139、C.I.分散蓝142、C.I.分散蓝146、C.I.分散蓝148、C.I.分散蓝149、C.I.分散蓝165、C.I.分散蓝165:1、C.I.分散蓝165:2、C.I.分散蓝165:3、C.I.分散蓝171、C.I.分散蓝173、C.I.分散蓝174、C.I.分散蓝175、C.I.分散蓝177、C.I.分散蓝183、C.I.分散蓝187、C.I.分散蓝189、C.I.分散蓝193、C.I.分散蓝194、C.I.分散蓝200、C.I.分散蓝201、C.I.分散蓝202、C.I.分散蓝205、C.I.分散蓝206、C.I.分散蓝207、C.I.分散蓝209、C.I.分散蓝21、C.I.分散蓝210、C.I.分散蓝211、C.I.分散蓝212、C.I.分散蓝219、C.I.分散蓝220、C.I.分散蓝222、C.I.分散蓝224、C.I.分散蓝225、C.I.分散蓝248、C.I.分散蓝252、C.I.分散蓝253、C.I.分散蓝254、C.I.分散蓝255、C.I.分散蓝256、C.I.分散蓝257、C.I.分散蓝258、C.I.分散蓝259、C.I.分散蓝260、C.I.分散蓝264、C.I.分散蓝265、C.I.分散蓝266、C.I.分散蓝267、C.I.分散蓝268、C.I.分散蓝269、C.I.分散蓝270、C.I.分散蓝278、C.I.分散蓝279、C.I.分散蓝281、C.I.分散蓝283、C.I.分散蓝284、C.I.分散蓝285、C.I.分散蓝286、C.I.分散蓝287、C.I.分散蓝290、C.I.分散蓝291、C.I.分散蓝294、C.I.分散蓝295、C.I.分散蓝30、C.I.分散蓝301、C.I.分散蓝303、C.I.分散蓝304、C.I.分散蓝305、C.I.分散蓝313、C.I.分散蓝315、C.I.分散蓝316、C.I.分散蓝317、C.I.分散蓝321、C.I.分散蓝322、C.I.分散蓝324、C.I.分散蓝328、C.I.分散蓝33、C.I.分散蓝330、C.I.分散蓝333、C.I.分散蓝335、C.I.分散蓝336、C.I.分散蓝337、C.I.分散蓝338、C.I.分散蓝339、C.I.分散蓝340、C.I.分散蓝341、C.I.分散蓝342、C.I.分散蓝343、C.I.分散蓝344、C.I.分散蓝345、C.I.分散蓝346、C.I.分散蓝351、C.I.分散蓝352、C.I.分散蓝353、C.I.分散蓝355、C.I.分散蓝356、C.I.分散蓝357C.I.分散蓝358、C.I.分散蓝36、C.I.分散蓝360、C.I.分散蓝366、C.I.分散蓝368、C.I.分散蓝369、C.I.分散蓝371、C.I.分散蓝373、C.I.分散蓝374、C.I.分散蓝375、C.I.分散蓝376、C.I.分散蓝378、C.I.分散蓝38、C.I.分散蓝42、C.I.分散蓝43、C.I.分散蓝44、C.I.分散蓝47、C.I.分散蓝79、C.I.分散蓝79:1、C.I.分散蓝79:2、C.I.分散蓝79:3、C.I.分散蓝82、C.I.分散蓝85、C.I.分散蓝88、C.I.分散蓝90、C.I.分散蓝94、C.I.分散蓝96、C.I.分散紫10、C.I.分散紫100、C.I.分散紫102、C.I.分散紫103、C.I.分散紫104、C.I.分散紫106、C.I.分散紫107、C.I.分散紫12、C.I.分散紫13、C.I.分散紫16、C.I.分散紫2、C.I.分散紫24、C.I.分散紫25、C.I.分散紫3、C.I.分散紫33、C.I.分散紫39、C.I.分散紫42、C.I.分散紫43、C.I.分散紫45、C.I.分散紫48、C.I.分散紫49、C.I.分散紫5、C.I.分散紫50、C.I.分散紫53、C.I.分散紫54、C.I.分散紫55、C.I.分散紫58、C.I.分散紫6、C.I.分散紫60、C.I.分散紫63、C.I.分散紫66、C.I.分散紫69、C.I.分散紫7、C.I.分散紫75、C.I.分散紫76、C.I.分散紫77、C.I.分散紫82、C.I.分散紫86、C.I.分散紫88、C.I.分散紫9、C.I.分散紫91、C.I.分散紫92、C.I.分散紫93、C.I.分散紫93:1、C.I.分散紫94、C.I.分散紫95、C.I.分散紫96、C.I.分散紫97、C.I.分散紫98、C.I.分散紫99、C.I.活性黑5、C.I.活性蓝19、C.I.活性蓝4、C.I.活性红2、C.I.溶剂蓝43、C.I.溶剂蓝43、C.I.溶剂红14、C.I.酸性黑24、C.I.酸性蓝113、C.I.酸性蓝29、C.I.直接紫7、C.I.食品红14、Dianix紫CC、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝75、直接蓝78、直接蓝80、直接蓝279、直接紫11、直接紫31、直接紫35、直接紫48、直接紫5、直接紫51、直接紫66、直接紫9、分散蓝106、分散蓝148、分散蓝165、分散蓝3、分散蓝354、分散蓝364、分散蓝367、分散蓝56、分散蓝77、分散蓝79、分散蓝79:1、分散红1、分散红15、分散紫26、分散紫27、分散紫28、分散紫63、分散紫77、伊红Y、乙醇2，2′-[[4-[(3，5-二硝基-2-噻吩基)偶氮]苯基]亚氨基]双乙醇二乙酸酯(酯)、Lumogen F蓝650、Lumogen F紫570、N-[2-[2-(3-乙酰基-5-硝基-2-噻吩基)二氮烯基]-5-(二乙氨基)苯基]-乙酰胺、N-[2-[2-(4-氯-3-氰基-5-甲酰基-2-噻吩基)二氮烯基]-5-(二乙氨基)苯基]-乙酰胺、N-[5-[二(2-甲氧基乙基)氨基]-2-[2-(5-硝基-2，1-苯并异噻唑-3-基)二氮烯基]苯基]-乙酰胺、N-[5-[二[2-(乙酰氧基)乙基]氨基]-2-[(2-溴-4，6-二硝基苯基)偶氮]苯基]-乙酰胺、萘酰亚胺及其衍生物、石油炭黑860、焰红染料B、吡唑、玫瑰红、6-羟基-5-(4-异丙基苯基偶氮)-2-萘磺酸钠、溶剂黑3、溶剂蓝14、溶剂蓝35、溶剂蓝58、溶剂蓝59、溶剂红24、溶剂紫13、溶剂紫8、苏丹红380、三苯甲烷、三苯甲烷及其衍生物、或它们的混合物。
适宜的聚合物染料选自由下列组成的组：包含共轭色原体(染料-聚合物共轭物)的聚合物、色原体共聚合进入聚合物主链的聚合物、以及它们的混合物。
在另一方面，适宜的聚合物染料选自由下列组成的组：以商品名
Figure BDA00001742984401001
(Milliken，Spartanburg，South Carolina，USA)销售的织物-实体着色剂、由至少一种活性染料形成的染料-聚合物共轭物、以及选自由包含以下部分的聚合物组成的组的聚合物：羟基部分、伯胺部分、仲胺部分、硫醇部分、以及它们的混合物。在另一方面，适宜的聚合物染料选自由下列组成的组：
Figure BDA00001742984401002
(Milliken，Spartanburg，South Carolina，USA)Violet CT、与活性蓝共轭的羟甲基纤维素(CMC)、活性紫或活性红染料如与C.I.活性蓝19共轭的CMC，由Megazyme，Wicklow，Ireland以产品名AZO-CM-CELLULOSE，产品代码S-ACMC销售，烷氧基化的三苯基-甲烷聚合着色剂、烷氧基化的噻吩聚合着色剂、以及它们的混合物。
适宜的染料粘土共轭物选自由下列组成的组：包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土粘土、以及它们的混合物。在另一方面，适宜的染料粘土缀合物选自由下列组成的组：一种阳离子/碱性染料，它选自由下列组成的组：C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕1至23、CI碱性黑1至11、以及粘土，所述粘土选自由下列组成的组：蒙脱石粘土、锂蒙脱石粘土、皂石粘土、以及它们的混合物。在另一方面，适宜的染料粘土缀合物包括选自由下列组成的组的染料粘土缀合物：蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595缀合物、蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015缀合物、蒙脱石碱性紫V3C.I.42555缀合物、蒙脱石碱性绿G1C.I.42040缀合物、蒙脱石碱性红R1C.I.45160缀合物、蒙脱石C.I.碱性黑2缀合物、锂蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595缀合物、锂蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015缀合物、锂蒙脱石碱性紫V3C.I.42555缀合物、锂蒙脱石碱性绿G1C.I.42040缀合物、锂蒙脱石碱性红R1C.I.45160缀合物、锂蒙脱石C.I.碱性黑2缀合物、皂碱性蓝B7C.I.42595缀合物、皂碱性蓝B9C.I.52015缀合物、皂碱性紫V3C.I.42555缀合物、皂碱性绿G1C.I.42040缀合物、皂碱性红R1C.I.45160缀合物、皂石C.I.碱性黑2缀合物、以及它们的混合物。
适宜的颜料包括选自由下列组成的组的颜料：黄烷士酮、蓝蒽酮、包含1至4个氯原子的氯化蓝蒽酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3，4，9，10-四羧酸二酰亚胺酯，其中所述酰亚胺基团可为未取代的或者被C1至C3的烷基或苯基或杂环基取代，并且其中苯基和杂环基可另外带有不提供水中溶解度的取代基、吡唑嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二嗪颜料、每个分子可包含最多2个氯原子的铜酞菁、多氯铜酞菁或每个分子包含最多14个溴原子的多溴铜酞菁、以及它们的混合物。
在另一方面，适宜的颜料选自由下列组成的组：群青蓝(C.I.颜料蓝29)、群青紫(C.I.颜料紫15)、以及它们的混合物。
可以组合使用上述织物调色剂(可使用织物调色剂的任何混合物)。合适的织物调色剂可得自Aldrich，Milwaukee，Wisconsin，USA；CibaSpecialty Chemicals，Basel，Switzerland；BASF，Ludwigshafen，Germany；Dayglo Color Corporation，Mumbai，India；Organic Dyestuffs Corp.，EastProvidence，Rhode Island，USA；Dystar，Frankfurt，Germany；Lanxess，Leverkusen，Germany；Megazyme，Wicklow，Ireland；Clariant，Muttenz，Switzerland；Avecia，Manchester，UK和/或根据本文包含的实例制成。
适宜的调色剂更详细地描述于US 7,208,459 B2中。
胶囊包封物
在一个方面，包封物包含核心，具有内表面和外表面的外壳，所述外壳包封所述核心。
在所述包封物的一个方面，所述核心可包含材料，所述材料选自由下列组成的组：香料；增白剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂，在一个方面，石蜡；酶；抗菌剂；漂白剂；感觉剂；以及它们的混合物；所述外壳可包含材料，所述材料选自由下列组成的组：聚乙烯；聚酰胺；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一个方面所述氨基塑料可包含聚脲、聚氨酯和/或聚脲氨酯，在一个方面所述聚脲可包含聚羟甲脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一个方面所述多糖可包含海藻酸钠和/或几丁聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物；水不溶的无机物；硅酮；以及它们的混合物。
在所述包封物的一个方面，所述核心可包含香料。
在所述包封物的一个方面，所述外壳可包含三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。
在一个方面，公开了可包含核心材料和外壳的适合的包封物，所述外壳至少部分地围绕所述核心材料。至少75％、85％、或甚至90％的所述包封物可具有约0.2MPa至约10MPa，约0.4MPa至约5MPa，约0.6MPa至约3.5MPa，或甚至约0.7MPa至约3MPa的破裂强度；和约0％至约30％，约0％至约20％，或甚至约0％至约5％的有益剂渗漏度。
在一个方面，至少75％、85％或甚至90％的所述包封物可具有约1微米至约80微米，约5微米至60微米，约10微米至约50微米，或甚至约15微米至约40微米的粒度。
在一个方面，至少75％、85％或甚至90％的所述包封物可具有约30nm至约250nm，约80nm至约180nm，或甚至约100nm至约160nm的颗粒壁厚。
在一个方面，所述包封物的核心材料可包含材料，所述材料选自由下列组成的组：香料原料和/或任选的材料，所述材料选自由下列组成的组：植物油，包括纯的和/或混合的植物油，包括蓖麻油、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油、柠檬油以及它们的混合物；植物油的酯，酯类，包括己二酸二丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、丁基苄基己二酸酯、苄基辛基己二酸酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯以及它们的混合物；直链或支链烃类，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃类；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯，包括单异丙基联苯、烷基萘、包括二丙基萘、石油精、包括煤油、矿物油以及它们的混合物；芳香族溶剂，包括苯、甲苯以及它们的混合物；硅油；以及它们的混合物。
在一个方面，所述包封物的外壳材料可包含适合的树脂，所述树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适宜的胺包括三聚氰胺、脲、苯胍胺、甘脲、以及它们的混合物。适宜的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺、以及它们的混合物。适宜的脲包括二羟甲基脲、甲基化二羟甲基脲、脲-间苯二酚、以及它们的混合物。
在一个方面，适合的甲醛清除剂可被用于所述包封物，例如，加入胶囊悬浮液中和/或在所述包封物被加入到织物和家居护理产品中之前、期间或之后加入此类织物和家居护理产品中。
适合的胶囊能够按照USPA 2008/0305982 A1和/或USPA 2009/0247449A1的教导制得。作为另外一种选择，适合的胶囊可购自Appleton，WisconsinUSA的Appleton Papers Inc.。
此外，用于制备前述包封物的材料可以从Solutia Inc.(St Louis，Missouri U.S.A.)、Cytec Industries(West Paterson，New Jersey U.S.A.)、sigma-Aldrich(St.Louis，Missouri U.S.A.)、San Diego，California，USA的CP Kelco Corp.；Ludwigshafen，Germany的BASF AG；Cranbury，New Jersey，USA的Rhodia Corp.；Wilmington，Delaware，USA的Hercules Corp.；Calgary，Alberta，Canada的Agrium Inc.，New Jersey U.S.A.的ISP，Chicago，IL，USA的Akzo Nobel；Bremen，Germany的Stroever Shellac Bremen；Midland，MI，USA的Dow Chemical Company；Leverkusen，Germany的Bayer AG；St.Louis，Missouri，USA的Sigma-Aldrich Corp.获得。
两亲清洁聚合物
优选地，两亲清洁聚合物是具有以下通式结构的化合物：二((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-二((C2H5O)(C2H4O)n)，其中n＝20至30，并且x＝3至8，或其硫酸化或磺酸化变体。
本发明的两亲烷氧基化的油脂清洁聚合物是指任何具有平衡的亲水性和疏水性的烷氧基化的聚合物，这使得它们从织物和表面移除油脂颗粒。本发明两亲烷氧基化的油脂清洁聚合物具体的实施方案包括核结构和多个连接到那个核结构的烷氧基化物基团。
所述核结构可包括聚亚烷基亚胺结构，其以密集的形式包含化学式(I)、(II)、(III)和(IV)的重复单元：
Figure BDA00001742984401041
其中在每个实例中，#代表在氮原子和化学式(I)、(II)、(III)或(IV)的两个邻近重复单元的基团A1游离的结合位之间的键的二分之一；在每个实例中，*代表连接到烷氧基化物基团中的一个键的二分之一；且A1独立地选自直链或支链的C2-C6-亚烷基；其中所述聚亚烷基亚胺结构由化学式(I)1重复单元、化学式(II)x重复单元、化学式(III)y重复单元和化学式(IV)y+1重复单元组成，其中在每个实例中，x和y具有0至约150范围内的值，其中聚亚烷基亚胺核结构的平均重均分子量Mw，为约60g/mol至约10,000g/mol范围内的值。
作为另一种选择，所述核结构可包含至少一种选自化学式(I.a)和/或(I.b)N-(羟烷基)胺的缩合产物的化合物的聚链烷醇胺结构，
Figure BDA00001742984401051
其中A独立地选自C1-C6-亚烷基；R1、R1*、R2、R2*、R3、R3*、R4、R4*、R5并且R5*独立地选自氢、烷基、环烷基或芳基，其中至少三种提及的基团可以为任选地取代的；并且R6选自氢、烷基、环烷基或芳基。其中至少三种提及的基团可以为任选地取代的。
连接到所述核结构多个烯氧基基团独立地选自化学式(V)的烯氧基单元
Figure BDA00001742984401052
其中在每个实例中，*代表连接到化学式(I)、(II)、(III)或(IV)的氮原子键的二分之一；在每个实例中A2独立地选自1，2-丙烯、1，2-丁烯和1，2-异丁烯；A3为1，2-丙烯；在每个实例中，R独立地选自氢和C1-C4-烷基；m具有0至约2范围内的平均值；n具有20至约50范围内的平均值；且p具有10至约50范围内的平均值；
两亲烷氧基化的油脂清洁聚合物具体的实施方案可选自具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚丙烯氧基嵌段烷氧基化的聚亚烷基亚胺，乙氧基化度和丙氧基化度不会超过或低于具体的限定值。根据本发明的烷氧基化聚亚烷基亚胺的具体实施方案具有约0.6的最小聚乙烯嵌段对聚丙烯嵌段的比率(n/p)和约1.5(x+2y+1)1/2的最大比率。已发现，具有约0.8至约1.2(x+2y+1)1/2的n/p比率的烷氧基化聚亚烷基亚胺具有特别有益的特性。
根据本发明的烷氧基化聚亚烷基亚胺具有一条主链，所述主链由伯胺、仲胺和叔胺氮原子组成，其通过亚烷基A互相连接并且是无规排列的。伯氨基部分，其是聚亚烷基亚胺主链的主要链和侧链的起始点或终结点并且其剩余的氢原子随后被亚烷氧基单元取代，分别被称为式(I)或(IV)的重复单元。仲氨基部分，其剩余的氢原子随后被亚烷氧基单元取代，被称为式(II)的重复单元。叔氨基部分，其使主要链和侧链分叉，被称为式(III)的重复单元。
由于在聚亚烷基亚胺主链的形成中会发生环化，在主链中还可能存在少量的环状氨基部分。当然，包含环状氨基部分的此类聚亚烷基亚胺以与由非环状伯氨基和仲氨基部分组成的那些相同的方式烷氧基化。
由氮原子和基团A1组成的聚亚烷基亚胺主链具有约60g/mol至约10,000g/mol，优选约100g/mol至约8,000g/mol，并且更优选约500g/mol至约6,000g/mol的平均分子量Mw。
(x+2y+1)的和对应于存在于一条单独的聚亚烷基亚胺主链中的亚烷基亚胺单元的总数，并因此直接与所述聚亚烷基亚胺主链的分子量相关。然而，在本说明书中给出的值涉及所述混合物中存在的所有聚亚烷基亚胺的平均数。(x+2y+2)的和对应于存在于一条单独的聚亚烷基亚胺主链中的氨基的总数。
连接氨基氮原子的基团A1可以是相同或不同的、直链或支链的C2-C6-亚烷基，如1，2-亚乙基、1，2-亚丙基、1，2-亚丁基、1，2-亚异丁烯、1，2-亚戊基、1，2-亚己基或六亚甲基。优选的支链亚烷基是1，2-亚丙基。优选的直链亚烷基是亚乙基和六亚甲基。更优选的亚烷基是1，2-亚乙基。
聚亚烷基亚胺主链中伯胺基和仲胺基的氢原子可被式(V)的亚烷氧基单元取代。
Figure BDA00001742984401071
在该式中，所述变量优选具有以下所给出的一种含义：
在各种情况下，A2选自1，2-亚丙基、1，2-亚丁基和1，2-异亚丁基；A2优选为1，2-亚丙基。A3为1，2-亚丙基；在各种情况下，R选自氢和C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基；R优选为氢。在各种情况下，系数m具有0至约2的值；m优选为0或大约1；更优选m为0。系数n具有在约20至约50范围内，优选在约22至约40范围内，并且更优选在约24至约30范围内的平均值。系数p具有在约10至约50范围内，优选在约11至约40范围内，并且更优选在约12至约30范围内的平均值。
式(V)的亚烷氧基单元优选是非随机序列的烷氧基化物嵌段。通过非随机序列是指首先添加[-A2-O-]m(即最接近式(I)、(II)或(III)的重复单元的氮原子的键)，其次添加[-CH2-CH2-O-]n，而第三个添加[-A3-O-]p。该目标提供具有内层聚环氧乙烷嵌段和外层聚环氧丙烷嵌段的烷氧基化聚亚烷基亚胺。
这些式(V)的亚烷氧基单元的基本部分由亚乙氧基单元-[CH2-CH2-O)]n-和亚丙氧基单元-[CH2-CH2(CH3)-O]p-形成。所述亚烷氧基单元还可具有小部分的亚丙氧基或亚丁氧基单元-[A2-O]m-，即用氢原子饱和的聚亚烷基亚胺主链，可最初使每摩尔存在的NH-部分与少量的至多约2mol，尤其是约0.5mol至约1.5mol，特别是约0.8mol至约1.2mol的环氧丙烷或环氧丁烷反应，即初期烷氧基化。
如果需要的话，所述聚亚烷基亚胺主链的这种初始改性可使烷氧基化过程中反应混合物的粘度降低。然而，所述改性通常不会影响烷氧基化聚亚烷基亚胺的性能特性，因此不构成优选的标准。
基于织物和家居护理产品的重量计，两亲的烷氧基化的油脂清洁聚合物以约0.05％至10％范围的水平存在于本发明的织物和家居护理产品中，所述产品包括但不限于洗涤剂。织物和家居护理产品的实施方案可包含按重量计约0.1％至约5％。更具体地讲，所述实施方案可包含约0.25％至约2.5％的油脂清洁聚合物。
非免疫等价的酶和/或附加的酶
织物和家居护理产品可包含一种或多种提供清洁性能和/或织物护理有益效果的酶。合适的酶的实例包括但不限于：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶、或它们的混合物。典型的组合是可包含例如与淀粉酶结合的蛋白酶和脂肪酶的酶组合。当存在于织物和家居护理产品中时，基于所述织物和家居护理产品的重量计，前述附加的酶可以约0.00001％至约2％、约0.0001％至约1％或甚至约0.001％至约0.5％的酶蛋白水平存在。
在一个方面，优选的酶可包括蛋白酶。适合的蛋白酶包括金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，包括中性或碱性微生物丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)。适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些蛋白酶。在一个方面，此类适宜的蛋白酶可源自微生物。适宜的蛋白酶包括化学上或基因上改性的上述适宜蛋白酶的突变体。在一个方面，适宜的蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶，如碱性微生物蛋白酶和/或胰蛋白酶型蛋白酶。适宜中性或碱性蛋白酶的实例包括：
(a)枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)，包括来源于芽孢杆菌属的那些，如US 6,312,936 B1、US 5,679,630、US 4,760,025、US7,262,042和WO09/021867中所述的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌。
(b)胰蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型蛋白酶，如胰蛋白酶(例如源自猪或牛)，包括WO 89/06270中所述的镰孢属蛋白酶，以及WO05/052161和WO 05/052146中所述的来源于纤维单胞菌属的胰凝乳蛋白酶。
(c)金属蛋白酶，包括WO 07/044993 A2中所述的来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
优选的蛋白酶包括来源于吉氏芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的那些。
适合的可商购获得的蛋白酶包括以商品名
Figure BDA00001742984401091
Figure BDA00001742984401092
Figure BDA00001742984401093
和
Figure BDA00001742984401094
由Novozymes A/S(Denmark)出售的那些，以商品名
Figure BDA00001742984401095
Figure BDA00001742984401096
Figure BDA00001742984401097
和
Figure BDA00001742984401098
由Genencor International出售的那些，以商品名
Figure BDA00001742984401099
和由Solvay Enzymes出售的那些，得自Henkel/Kemira的那些即BLAP(序列示于US 5,352,604图29中，具有下列突变S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文称为BLAP)、BLAP R(具有S3T+V4I+V199M+V205I+L217D的BLAP)、BLAP X(具有S3T+V4I+V205I的BLAP)和BLAP F49(具有S3T+V4I+A194P+V199M+V205I+L217D的BLAP)-均得自Henkel/Kemira；和得自Kao的KAP(具有突变A230V+S256G+S259N的嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
在一个方面，织物和家居护理产品可包含与本发明的冷水蛋白酶非免疫等价的蛋白酶。就本发明的目的而言，免疫等价的蛋白酶将与BPN′具有高度的同一性(＞80％)，并且会与相同抗体交叉反应。适合的非免疫等价的酶将包括来源于迟缓芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌的那些以及来源于解淀粉芽孢杆菌的金属蛋白酶。
适宜的α-淀粉酶包括源自细菌或真菌的淀粉酶。包括化学或基因修饰的突变体(变体)。优选的碱性α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属菌株，如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、或其它芽孢杆菌属如芽孢杆菌属NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513，DSM 9375(USP 7,153,818)，DSM 12368，DSMZ no.12649，KSM AP1378(WO97/00324)，KSM K36或KSM K38(EP 1,022,334)。优选的淀粉酶包括：
(a)描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO96/23874和WO97/43424中的变体，尤其是相对于WO 96/23874中如SEQ ID No.2所列的酶，在下列一个或多个位置具有取代基的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
(b)描述于USP 5,856,164以及WO99/23211、WO 96/23873、WO00/60060和WO 06/002643中的变体，尤其是相对于WO06/002643中如SEQ ID No.12所列的AA560酶，在下列位置具有一个或多个取代基的变体：26、30、33、82、37、106、118、128、133、149、150、160、178、182、186、193、203、214、231、256、257、258、269、270、272、283、295、296、298、299、303、304、305、311、314、315、318、319、339、345、361、378、383、419、421、437、441、444、445、446、447、450、461、471、482、484，优选还包含D183*和G184*缺失的变体。
(c)与WO06/002643中的SEQ ID No.4表现出至少90％同一性的变体，来自芽孢杆菌属SP722的野生型酶，尤其是在183和184位具有缺失的变体，以及WO 00/60060中描述的变体，将所述文献以引用方式并入本文。
(d)变体表现出与来自芽孢杆菌属707(Bacillus sp.707)的野生型酶(US 6,093,562中的SEQ ID NO：7)，尤其是包含一个或多个下列突变：M202，M208，S255，R172和/或M261的那些，至少95％的同一性。优选地，所述淀粉酶包含M202L，M202V，M202S，M202T，M202I，M202Q，M202W，S255N和/或R172Q中的一个或多个。尤其优选的是包含M202L或M202T突变的那些。
适合的可商购获得的α-淀粉酶包括
Figure BDA00001742984401101
Figure BDA00001742984401102
和
Figure BDA00001742984401104
(NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark)、
Figure BDA00001742984401105
AT 9000 Biozym Biotech TradingGmbH Wehlistrasse 27b A-1200 Wien Austria、
Figure BDA00001742984401107
和
Figure BDA00001742984401108
(GenencorInternational Inc.，Palo Alto，California)和
Figure BDA00001742984401109
(Kao，14-10 NihonbashiKayabacho，1-chome，Chuo-ku Tokyo 103-8210，Japan)。在一个方面，适合的淀粉酶包括
Figure BDA00001742984401111
和
Figure BDA00001742984401112
以及它们的混合物。
在一个方面，此类附加的酶可选自由下列组成的组：脂肪酶，包括“第一循环脂肪酶”如美国专利6,939,702 B1和US PA 2009/0217464中所述的那些。在一个方面，所述脂肪酶为第一洗涤脂肪酶，优选包含T231R和N233R突变的疏棉状嗜热丝孢菌的野生型脂肪酶变体。野生型序列是Swissprot登录号为Swiss-Prot O59952(来源于疏棉状嗜热丝孢菌(柔毛腐质霉属))的269种氨基酸(氨基酸23-291)。优选的脂肪酶将包括以商品名
Figure BDA00001742984401113
和
Figure BDA00001742984401114
出售的那些。
在一个方面，其他优选的酶包括表现出内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的微生物来源的内葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)，包括芽孢杆菌属的成员内源的细菌多肽，其具有与7,141,403B2中的SEQ ID NO：2氨基酸序列有至少90％、94％、97％和甚至99％同一性的序列，以及它们的混合物。适宜的内葡聚糖酶以商品名
Figure BDA00001742984401115
和
Figure BDA00001742984401116
(Novozymes A/S(Bagsvaerd，Denmark))出售。
其它优选的酶包括以商品名
Figure BDA00001742984401117
出售的果胶酸裂合酶和以商品名
Figure BDA00001742984401118
出售的甘露聚糖酶(均得自NovozymesA/S(Bagsvaerd，Denmark))，和
Figure BDA00001742984401119
(Genencor International Inc.(PaloAlto，California))。
助剂材料
虽然对于本发明而言不是必需的，但下文所举例说明的助剂材料的非限制性列表适用于本发明的织物和家居护理产品，并且可期望将其掺入本发明的某些实施方案中，以例如有助于或提高处理待清洁底物的清洁性能，或在含香料、着色剂、染料等的情况下调节所述织物和家居护理产品的美观性。掺入任何织物和家居护理产品中的任何此类助剂的水平是在此前列举用于掺入的任何材料之外附加的。这些附加组分的确切性质及其掺入的含量，将取决于织物和家居护理产品的物理形式和使用其进行的清洁操作性质。适合的助剂材料包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、附加的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预制的过酸、聚合物分散剂、粘土移除/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、香料递送体系、结构弹性化剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下公开内容外，此类其它助剂和用量的合适的实例还存在于美国专利5,576,282、6,306,812 B1和6,326,348 B1中，所述文献以引用方式并入。
如上所述，辅助成分对于申请人的织物和家居护理产品并不是必需的。因此，申请人的织物和家居护理产品的某些实施方案不包含一种或多种以下助剂材料：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、附加的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预制的过酸、聚合物分散剂、粘土移除/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、香料递送体系、结构增弹剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当存在一种或多种助剂时，所述一种或多种助剂可如下详述存在：
香料递送体系和香料-本发明的组合物可包含能够被并入，从而在产品的货架期通过其总的起效周期产生所期望的香味体验的纯的香料和/或香料技术体系。适合的香料包括属于持久型香料和/或象限型香料的那些。此类纯的香料的实例公开于USP 5,500,138；5,500,154；6,491,728；5,500,137和5,780,404中。适宜的香料递送体系，制备某些香料递送体系的方法和此类香料递送体系的应用公开于USPA 2007/0275866 A1中。此类香料递送体系包括：
聚合物辅助递送(PAD)：该香料递送技术使用聚合材料递送香料物质。一些实例是典型的水溶性或部分水溶性材料凝聚成不溶性带电或中性聚合物、液晶、热熔融物、水凝胶、充有香料的塑料、微胶囊、纳米胶乳和微米胶乳、聚合物膜形成剂和聚合物吸收剂、聚合物吸附剂等。PAD包括但不限于：
a.)基质体系：所述芳香剂溶解或分散在聚合物基质或颗粒中。香料，例如，可以1)在配制到所述产品中之前分散到聚合物中，或2)在产品配制期间或之后，与聚合物分别添加。尽管已知许多其它可控制香料释放的触发，香料从聚合物中的扩散是普通的触发，这允许或增加香料从聚合物基质体系中释放的速率，所述的体系被沉积到或施用到期望的表面(部位)。吸收和/或吸附到聚合物颗粒、膜、溶液等之上或颗粒、膜、溶液等之内是该技术的方面。由有机材料(如，乳液)构成的纳米颗粒或微颗粒是实例。适宜的颗粒包括各式各样的材料，所述材料包括但不限于：聚缩醛、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸类、聚丙烯腈、聚酰胺、聚芳醚酮、聚丁二烯、聚丁烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚氯丁二烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸亚环已基二亚甲酯、聚碳酸酯、聚氯丁烯、聚羟基脂肪酸酯、聚酮、聚酯、聚乙烯、聚醚酰亚胺、聚醚砜、氯化聚乙烯、聚酰亚胺、聚异戊二烯、聚乳酸、聚甲基戊烯、聚苯醚、聚苯硫醚、聚邻苯二甲酰胺、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚乙烯酯、聚氯乙烯、以及基于丙烯腈-丁二烯、乙酸纤维素、乙烯-醋酸乙烯、乙烯-乙烯醇、苯乙烯-丁二烯、乙酸乙烯酯-乙烯的聚合物或共聚物、以及它们的混合物。“标准”体系是指为保持所述预加载的香料与所述聚合物相关联直至香料释放的时刻或多个时刻的目的“预加载的”的那些。取决于香料释放的速率，此类聚合物还会抑制纯产品气味并提供浓郁度和/或保质期有益效果。关于此类体系的一个挑战为获得介于以下之间理想的平衡：1)产品中的稳定性(在载体内保持香料直至你需要它)和2)适时的释放(在使用期间或从干燥部位)。获得此类稳定性在产品中的贮藏和产品老化期间是尤其重要的。该挑战对于含水基的、含表面活性剂的产品，如重垢型液体衣物洗涤剂是尤其明显的。当配制成含水基的产品时，有效获得的许多“标准”基质体系变成“平衡”体系。可以选择“平衡”体系或“贮存”体系，其具有可接受的产品内扩散稳定性和可用的用于释放的触发机制(例如摩擦)。“平衡”体系是所述香料和聚合物在其中可被单独添加到所述产品中，并且香料和聚合物之间的平衡相互作用导致在一个或多个消费者触点上的有益效果(相对于不具有聚合物辅助的递送技术的游离香料)的那些体系。所述聚合物还可用香料预加载；然而，在产品贮藏期间，部分或所有的香料可扩散达到平衡，所述平衡包括具有与所述聚合物相关联的期望的香料原料(PRM)。然后所述聚合物携带所述香料至表面，并且释放通常经由香料扩散。此类平衡体系聚合物的使用具有降低纯产品的纯产品气味强度的可能性(通常在预加载的标准体系的情况下更是如此)。此类聚合物的沉积用来“平坦”释放特性并提供增加的保质期。如上文所述，此类保质期将通过抑制初始强度获得，并且可使配制人员能够使用更高影响或低气味检测阈值(ODT)或低科法兹指数(KI)PRM以获得FMOT有益效果而无需太强或扭曲的初始强度。重要的是，香料释放发生在施用的时间框之内，以影响期望的消费者触点或若干触点。适宜的微颗粒和微乳胶以及它们的制造方法可存在于USPA2005/0003980 A1。基质体系也包括热熔融粘合剂和香料塑料。此外，疏水改性的多糖可被配制到发香产品中以增加香料沉积和/或改善香料释放。包括例如多糖和纳米胶乳在内的所有此类基质体系可与其它PDT组合，包括其它PAD体系如香料微胶囊(PMC)形式的PAD贮存体系。聚合物辅助递送(PAD)基质体系可包括描述于下列参考文献中的那些：美国专利申请2004/0110648 A1、2004/0092414 A1、2004/0091445 A1和2004/0087476 A1；以及美国专利6,531,444、6,024,943、6,042,792、6,051,540、4,540,721和4,973,422。
硅氧烷也是可用作PDT的聚合物的实例，并可以类似于聚合物辅助递送“基质体系”的方式提供发香有益效果。此类PDT被称之为硅氧烷辅助递送(SAD)。人们可用香料预负载硅氧烷，或使用它们作为如PAD所述的平衡体系。适宜的硅氧烷以及制备它们的方法存在于WO 2005/102261、USPA 20050124530A1、USPA20050143282A1和WO 2003/015736中。官能化的硅氧烷还可被使用，如USPA 2006/003913 A1中所描述的。硅氧烷的实例包括聚二甲基硅氧烷和聚烷基二甲基硅氧烷。其它实例包括带有胺官能团的那些，其可被用来提供与胺辅助递送(AAD)和/或聚合物辅助递送(PAD)和/或胺反应产物(ARP)相关联的有益效果。其它此类实例可存在于USP 4,911,852、USPA 2004/0058845 A1、USPA 2004/0092425 A1和USPA 2005/0003980 A1中。
b.)贮存体系：贮存体系还被称为核/壳型技术，或其中芳香剂可被用作保护性外壳的香料释放控制膜包裹的技术。在微胶囊内部的材料被称之为芯、内相或填充物，而壁有时被称为外壳、包衣或膜。微粒或压敏胶囊或微胶囊是这些技术的实例。现在发明的微胶囊由多种工序形成，所述工序包括但不限于：包衣、挤出、喷雾干燥、界面、原位和模板聚合。可能的外壳材料在它们对水的稳定性上变化巨大。在最稳定之中的是聚羟甲脲(PMU)基的材料，其可在水溶液(或产品)中保持某些PRM甚至更长的一段时间。此类体系包括但不限于脲甲醛和/或三聚氰胺甲醛。可制备基于胶质的微胶囊以便它们在水中快速或缓慢溶解，取决于例如交联度。可获得许多其它胶囊壁材料并观察到在香料扩散稳定性程度上的变化。不受理论的束缚，例如，一旦沉积到表面时从胶囊中香料释放的速率通常为产品中香料扩散稳定性的相反顺序。同样地，例如，脲甲醛和三聚氰胺甲醛微胶囊通常需要不同于或除扩散释放以外的释放机理，如机械力(如摩擦、压力、剪切应力)，其用来打破所述胶囊并增加香料(芳香剂)释放的速率。其它触发包括熔融、溶解、水解或其它化学反应、电磁辐射等。预加载微胶囊的使用需要在产品中稳定性和在应用中和/或在表面上(在部位上)释放的适当比率，以及PRM适当的选择。基于脲甲醛和/或三聚氰胺甲醛的微胶囊是相对稳定的，尤其在近中性含水基的溶液中。其他适合的微胶囊包括具有包含氨基甲酸酯材料、聚丙烯酸类和/或乙烯醇的外壳的微胶囊。这些材料可需要摩擦触发，这不会适用于所有产品的应用。其它微胶囊材料(如胶质)在基于含水的产品中会不稳定，并且当在产品中老化时，甚至会提供减少的有益效果(相对于游离香料对照物)。刮擦生香技术为PAD的另一个实例。香料微胶囊(PMC)可包括描述于下列参考文献中的那些：美国专利申请：2003/0125222 A1、2003/215417 A1、2003/216488 A1、2003/158344 A1、2003/165692A1、2004/071742 A1、2004/071746 A1、2004/072719 A1、2004/072720 A1、2006/0039934 A1、2003/203829 A1、2003/195133 A1、2004/087477 A1、2004/0106536 A1；以及美国专利6,645,479 B1、6,200,949 B1、4,882,220、4,917,920、4,514,461、6,106,875和4,234,627、3,594,328以及US RE 32713。
分子辅助递送(MAD)：非聚合材料或分子也可用来改善香料的递送。不受理论的束缚，香料可与有机材料非共价地相互作用，导致改变的沉积和/或释放。此类有机材料的非限制性实例包括但不限于：疏水材料，如有机油、蜡、矿物油、凡士林、脂肪酸或酯、糖、表面活性剂、脂质体和甚至其它香料原料(香料油)，以及天然油，包括身体和/或其它污垢。香料固定剂为另一个实例。在一个方面，非聚合材料或分子具有大于约2的CLogP。分子辅助递送(MAD)也可包括描述于USP 7,119,060和USP5,506,201中的那些。
纤维辅助递送(FAD)：部位自身的选择或使用可用来改善香料的递送。实际上，所述部位自身可为香料递送技术。例如，不同的织物类型，如棉或聚酯在关于吸引和/或保持和/或释放香料能力上将具有不同的特性。沉积到纤维上或纤维内香料的量可通过选择纤维，并且也通过纤维的历史或处理，以及通过任何纤维涂层或处理剂来改变。纤维可为织造的和非织造的，以及天然的或合成的。天然纤维包括由植物、动物和地质作用制备的那些，并且包括但不限于：纤维素材料，如棉、亚麻布、大麻、黄麻、亚麻、苎麻和剑麻，以及用来制造纸材和布料的纤维。纤维辅助递送可包括木质纤维的使用，如热力学木浆和漂白的或未漂白的牛皮纸浆或亚硫酸盐纸浆。动物纤维由大量特定蛋白，如丝绸、腱、肠线和毛发(包括羊毛)组成。基于合成化学的聚合物纤维包括但不限于：聚酰胺尼龙、PET或PBT聚酯、苯酚甲醛(PF)、聚乙烯醇纤维(PVOH)、聚氯乙烯纤维(PVC)、聚烯烃(PP和PE)、以及丙烯酸类聚合物。所有此类纤维可用香料预加载，然后加入到产品中，所述产品可包含或可不包含游离香料和/或一种或多种香料递送技术。在一个方面，所述纤维可在用香料加载之前加到产品中，然后通过添加香料用香料加载，所述香料可扩散至纤维，至产品中。不受理论的束缚，所述香料可被吸收至纤维上或纤维内，例如，在产品贮藏期间，然后在一个或多个精确的或消费者触点时刻释放。
胺辅助递送(AAD)：胺辅助递送技术方法采用包含胺基的材料以在产品使用期间提高香料沉积或调节香料释放。在该方法中不需要在添加至产品之前预络合或预反应所述香料原料和胺。在一个方面，适用于本文的包含胺的AAD材料可为非芳族的，例如聚烷基亚胺，如聚乙烯亚胺(PEI)或聚乙烯胺(PVAm)，或芳族的，例如邻氨基苯甲酸盐。此类材料还可为聚合的或非聚合的。在一个方面，此类材料包含至少一种伯胺。不受理论的约束，对于聚合的胺，通过聚合物辅助递送，该技术将允许相对胺官能团同样的低ODT香料香味(如醛、酮、烯酮)增加的保质期和受控释放，以及其它PRM的递送。没有该技术，挥发性的顶香会损失太快，留下中香和底香对顶香更高的比率。聚合的胺的使用允许更高含量的顶香和其它PRM被用来获得新鲜保质期而不会导致纯产品气味比期望的更浓郁，或允许顶香和其它PRM更有效地使用。在一个方面，AAD体系在大于约中性的pH下递送PRM是有效的。不受理论的束缚，其中更多的AAD体系的胺被去质子化的条件会导致对于PRM，如醛和酮，包括不饱和的酮和烯酮，如二氢大马酮去质子化的胺增加的亲和性。在另一方面，聚合的胺在小于约中性的pH下递送PRM是有效的。不受理论的束缚，其中更多的AAD体系的胺被质子化的条件会导致对于PRM，如醛和酮质子化的胺降低的亲和性，和对于广泛范围的PRM聚合物骨架强烈的亲和性。在该方面，聚合物辅助递送可递送更多的发香有益效果；此类体系为AAD的子类，并且可被称作胺聚合物辅助递送或APAD。在一些情况下，当所述APAD被用于具有小于7的pH的组合物中时，此类APAD体系还可被认为是聚合物辅助递送(PAD)。在又一方面，AAD和PAD体系会与其它材料，如阴离子表面活性剂或聚合物相互作用以形成凝聚层和/或类凝聚层的体系。在另一方面，包含不同于氮，例如硫、磷或硒杂原子的材料可被用作替代胺化合物。在又一方面，前述替代化合物可与胺化合物联合使用。在又一方面，单个分子可包含胺部分和一个或多个替代的杂原子部分，例如，硫醇、膦和硒醇。适宜的AAD体系以及其制造方法可存在于US专利申请2005/0003980 A1、2003/0199422A1、2003/0036489 A1、2004/0220074 A1和USP 6,103,678中。
环糊精递送体系(CD)：该技术方法使用环状的低聚糖或环糊精来改善香料的递送。通常形成香料和环糊精(CD)络合物。此类络合物可预形成、原位形成或在所述部位上或内形成。不受理论的束缚，水的损失会起到将平衡向CD-香料络合物方向转移，尤其是如果其它辅助成分(如表面活性剂)没有以高浓度存在而与香料竞争环糊精腔体。如果暴露于水或增加含水量发生在稍后的时间点，可获得浓郁度有益效果。此外，环糊精允许香料配制人员增加在选择PRM上的灵活性。环糊精可用香料预加载或与香料单独加入以获得期望的香料稳定性、沉积或释放有益效果。适宜的CD以及其制造方法可存在于USPA 2005/0003980 A1和2006/0263313 A1中和US专利5,552,378、3,812,011、4,317,881、4,418,144和4,378,923中。
淀粉胶囊包封调和物(SEA)：使用淀粉胶囊包封调和物(SEA)技术能够通过例如加入成分如淀粉将液体香料转换加工成固体，调节所述香料的特性。所述有益效果包括在产品贮藏期间，尤其是在非水性的条件下增加香料驻留。一旦暴露于水，香料浓郁度可被触发。也可获得在精确的其它时刻的有益效果，因为所述淀粉允许产品配制人员选择PRM或PRM浓度，所述浓度通常在没有SEA存在下不能被使用。另一个技术实例包括使用其它有机和无机材料，如二氧化硅以将香料从液体转变成固体。适宜的SEA以及其制造方法可存在于USPA 2005/0003980 A1和USP 6,458,754 B1中。
在一个方面，SEA可通过以下方法制得：制备包含淀粉、水、酸和香料的混合物，所述酸以足以使淀粉-水混合物的pH降低至少0.25单位的量被掺入混合物中；以及雾化和干燥所述混合物从而形成包封的香料。在香料包封方法的第一个步骤中，制备了包含淀粉、水、香料和酸的含水混合物。这些成分可以任何顺序加入，但通常所述淀粉-水混合物最先制备，随后或顺序地或同时加入酸和香料。当它们被顺序地加入时，所述酸可在用于包封的成分之前被加入。作为另外一种选择，所述酸可在用于包封的成分之后被加入。含水混合物中的淀粉的浓度可以为低至5重量％或10重量％至高至60重量％或甚至75重量％。一般来讲，混合物中的淀粉的浓度为20重量％至50重量％，更常见的是在所述含水混合物中为约25重量％至40重量％。
适宜的淀粉可由生淀粉、预胶凝化淀粉、来源于块茎、豆类、谷类食物和谷物的改性淀粉，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、蜡质种玉米淀粉、燕麦淀粉、木薯淀粉、蜡质大麦淀粉、蜡质米淀粉、糯米淀粉、支链淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、以及它们的混合物。改性淀粉尤其可适用于本发明，并且这些包括水解淀粉、酸解淀粉、具有疏水基的淀粉，如长链烃(C5或更高级)的淀粉酯、淀粉乙酸酯、辛烯基琥珀酸淀粉、以及它们的混合物。在一个方面，使用了淀粉酯，如辛烯基琥珀酸淀粉。
术语“水解淀粉”是指典型通过酸水解和/或酶水解淀粉而获得的低聚糖型原料，优选玉米淀粉。优选的是在淀粉-水混合物中包含淀粉酯。尤其优选的是包含淀粉衍生物的改性淀粉，所述淀粉衍生物包含疏水性基团或疏水基和亲水基，其已被至少一种能够从淀粉分子1，4链接非还原性末端断裂的酶降解，以产生短链糖以在提供高度抗氧化性能的同时，保持淀粉基部分基本上高分子量。含水的淀粉混合物也包含用于所述淀粉的增塑剂。适宜的实例包括单糖、二糖、低聚糖和麦芽糖糊精类，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇、阿拉伯树胶、瓜尔胶以及麦芽糖糊精。
用于本发明方法的所述酸可为任何酸。实例包括硫酸、硝酸、盐酸、氨基磺酸和膦酸。在一个方面，使用了有机羧酸。在另一方面，使用了包含一种以上羧酸基团的有机酸。适宜的有机酸的实例包括柠檬酸、酒石酸、马来酸、苹果酸、琥珀酸、癸二酸、己二酸、衣康酸、醋酸和抗坏血酸等，在一个方面，使用了饱和的酸，如柠檬酸。
用于包封适宜的香料包括HIA香料，所述HIA香料包括在正常标准压力确定具有约760mmHg下275℃或更低沸点，约2000或更高辛醇/水分配系数P和小于或等于50份/十亿(ppb)气味察觉阈值的那些。在一个方面，所述香料可具有2或更高的logP。适宜的香料可选自由下列组成的组：3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙醛、3-(4-叔丁基苯基)丙醛、3-(4-异丙基苯基)-2-甲基丙醛、3-(3，4-亚甲基二氧代苯基)-2-甲基丙醛和2，6-二甲基-5-庚烯醛、α-二氢大马酮、Δ-二氢大马酮、异二氢大马酮、β-大马烯酮、6，7-二氢-1，1，2，3，3-五甲基-4(5H)-茚酮、甲基-7，3-二氢-2H-1，5-苯并二氧环丙-3-酮、2-[2-(4-甲基-3-环己烯基-1-基)丙基]环戊-2-酮、2-仲丁基环已酮、以及α-二氢紫罗酮、里哪醇、乙基里哪醇、四氢里哪醇和二氢月桂烯醇。
适宜的成分可得自Mount Olive，New Jersey，USA的Givaudan，International Flavors & South Brunswick，New Jersey，USA的Fragrances或Naarden，Netherlands的Quest。
在包含淀粉、水、香料和酸的含水混合物形成之后，所述混合物在高剪切下混合以在所述含水的淀粉溶液中形成用于包封成分的乳液或分散体。
然后，任何适宜的技术可被用于其中包含酸和香料的所述含水混合物被喷雾并干燥的加工的最后步骤。适宜的技术包括但不限于：本领域已知的那些，包括喷雾干燥、挤出、喷雾冷却/结晶方法、流化床涂覆和使用相转移催化剂以促进界面聚合。喷雾效率可通过本领域已知的方法增加，如通过使用高的干燥塔、略微在隔室的壁上涂油、或使用其中水分已被基本上移除的预处理空气。
无机的载体递送体系(ZIC)：该技术涉及使用多孔的沸石或其它无机材料以递送香料。载有香料的沸石可与辅助成分或不与辅助成分一起使用，例如，用来施用载有香料的沸石(PLZ)以在产品贮藏期间或在使用期间或从所述干燥部位改变其香料释放特性。适宜的沸石和无机载体以及其制造方法可存在于USPA 2005/0003980 A1和US专利5,858,959、6,245,732 B1、6,048,830和4,539,135中。二氧化硅为ZIC的另一种形式。适宜的无机载体的另一个实例包括无机的小管，其中所述香料或其它活性物质被包含在纳米-或微米-小管的管腔内。载有香料的无机小管(或载有香料的小管或PLT)优选为矿物质纳米或微米小管，如多水高岭土或多水高岭土与其它无机材料(包括其它粘土)的混合物。所述PLT技术还可在所述小管的内部和/或外部包括附加的成分，用于改善产品中的扩散稳定性，沉积在期望的部位之目的，或用于控制加载的香料的释放。单体材料和/或聚合材料，包括淀粉包封，可被用来包覆、填塞、加盖或换句话讲包封所述PLT。适宜的PLT体系以及其制造方法可存在于USP 5,651,976中。
前香料(PP)：该技术是指香料技术，所述技术起因于香料材料与其它基质或化学物质反应以形成具有介于一种或多种PRM和一种或多种载体之间的共价键的材料。所述PRM被转化成称作前PRM(即前香料)的新材料，然后其可在暴露于触发，如水或光照时释放所述初始PRM。前香料可提供增强的香料递送特性，如增加的香料沉积、保质期、稳定性、保持力等。前香料包括单体(非聚合的)或聚合的那些，并且可为预成形的或可在平衡条件下原位形成，如在产品中的贮藏期间或在润湿或干燥部位上可能存在的那些。前香料的非限制性实例包括迈克尔加合物(例如β-氨基酮)、芳族或非芳族亚胺(席夫碱)、
Figure BDA00001742984401211
唑烷、β-酮基酯和原酸酯。另一个方面包括化合物，所述化合物包含一种或多种能够释放PRM的β-氧代或β-硫代羰基部分，例如，α-β-不饱和的酮、醛或羧酸酯。用于香料释放典型的触发为暴露于水；尽管其它触发可包括酶、热、光照、pH变化、自氧化、平衡移动、浓度或离子强度以及其它的改变。对于基于含水的产品，光照触发的前香料是尤其适合的。此类光-前香料(PPP)包括但不限于在触发时释放香豆素衍生物以及香料和/或前香料的那些。释放出的前香料可通过任何上述触发释放一种或多种PRM。在一个方面，当暴露于光照和/或水分触发时，所述光-前香料释放氮基的前香料。在另一方面，由所述光-前香料释放的所述基于氮的前香料释放一种或多种PRM，所述PRM选自例如，醛、酮(包括烯酮)和醇。还在另一个方面，所述PPP释放二羟基香豆素衍生物。所述光照触发的前香料还可为释放香豆素衍生物和香料醇的酯在一个方面，所述前香料为安息香双甲醚衍生物，如USPA 2006/0020459 A1中所述。在另一方面，所述前香料为3′，5′-安息香双甲醚(DMB)衍生物，其在暴露于电磁辐射时释放醇。在又一方面，所述前香料释放一种或多种低ODT的PRM，包括叔醇，如里哪醇、四氢里哪醇、或二氢月桂烯醇。适宜的前香料及其制造方法可见于US专利7,018,978 B2、6,987,084 B2、6,956,013 B2、6,861,402 B1、6,544,945 B1、6,093,691、6,277,796 B1、6,165,953、6,316,397 B1、6,437,150 B1、6,479,682 B1、6,096,918、6,218,355 B1、6,133,228、6,147,037、7,109,153B2、7,071,151B2、6,987,084 B2、6,610,646 B2和5,958,870中，以及可见于USPA 2005/0003980 A1和USPA2006/0223726 A1中。
a.)胺反应产物(ARP)：就本专利申请的目的而言，ARP是PP的子集或种类。还可以使用“反应性”聚胺，胺官能度在其中是与一种或多种PRM预反应的，以形成胺反应产物(ARP)。通常所述反应性的胺为伯胺和/或仲胺，并且可为聚合物或单体的(非聚合物)的一部分。此类ARP还可与附加的PRM混合在一起以提供聚合物辅助递送和/或胺辅助递送有益效果。聚合胺的非限制性实例包括基于聚烷基亚胺的聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)或聚乙烯胺(PVAm)。单体(非聚合的)胺的非限制性实例包括羟基胺，如2-氨基乙醇及其烷基取代的衍生物和芳族胺，如邻氨基苯甲酸盐。所述ARP可与香料预混合或在免洗型或洗去型应用中单独添加。在另一方面，包含不同于氮，例如氧、硫、磷或硒杂原子的材料可被用作替代胺化合物。在又一方面，前述替代化合物可与胺化合物联合使用。在又一方面，单个分子可包含胺部分和一个或多个替代的杂原子部分，例如，硫醇、膦和硒醇。所述有益效果可包括香料改善的递送以及受控的香料释放。适宜的ARP以及其制造方法可见于USPA 2005/0003980 A1和USP 6,413,920B1中。
在一个方面，与所述胺反应形成胺反应产物的胺反应产物的香料组分，选自包含酮部分和/或醛部分的香料。在一个方面，此类香料包括包含至少5个碳原子的链。在一个方面，包含酮部分适宜的香料可选自α-二氢大马酮、Δ-二氢大马酮、异二氢大马酮、香芹酮、γ-甲基紫罗酮、异-E-过，2，4，4，7-四甲基-辛-6-烯-3-酮、苄基丙酮、β-二氢大马酮、大马烯酮、二氢茉莉酮酸甲酯、甲基柏木酮、以及它们的混合物。在一个方面，包含醛部分适宜的香料可选自1-癸醛、苯甲醛、花青醛、2，4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛、顺式/反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醛、洋茉莉醛、2，4，6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛、2，6-壬二烯醛、α-正戊基肉桂醛、α-正己基肉桂醛、铃兰醛、新铃兰醛、兔耳草醛、甲基壬基乙醛、己醛、反式-2-己醛、以及它们的混合物。在一个方面，适合的香料可选自十一烯酸醛、γ-十一烷酸内酯、洋茉莉醛、γ-十二烷酸内酯、对甲氧基苯甲醛、对羟基苯基丁酮、兔耳草醛、苄基丙酮、α-紫罗酮、铃兰醛、大马烯酮、β-紫罗酮和甲基壬基酮和/或它们的混合物。按所述胺反应产物重量计，香料通常的含量可为10％至90％，30％至85％甚至45％至80％。在一个方面，适宜的胺反应产物为聚乙烯亚胺聚合物，如Lupasol聚合物与一种或多种下列α-二氢大马酮、Δ-二氢大马酮、香芹酮、(2-戊基-3-氧代-1-环戊基)乙酸甲酯、花青醛、铃兰醛、洋茉莉醛、γ-甲基紫罗酮和2，4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛反应所得的那些；胺反应产物为Astramol Dendrimers与香芹酮反应所得的那些，并且胺反应产物为4-氨基苯甲酸乙酯与2，4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛反应所得的。在一个方面，适宜的胺反应产物为Lupasol HF与Δ-二氢大马酮、LupasolG35与α-二氢大马酮、LupasolG100与2，4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛、4-氨基苯甲酸乙酯与2，4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛反应所得的那些。
在一个方面，适宜的包含伯胺和/或仲胺的化合物特征在于气味强度指数小于邻氨基苯甲酸甲酯在双丙二醇中的1％溶液。
适宜的伯胺化合物通式结构如下所示：
B-(NH2)n
其中B为载体材料，并且n为值为至少1的指数。
包含仲胺基团适宜的化合物可具有类似于上述的结构，除了所述化合物包含一个或多个-NH-部分而不是任何-NH2部分以外。因此，此类胺化合物可具有下式：
B-(NH2)n、B-(NH)n、B-(NH)n-(NH2)n
其中B为载体材料，并且每个n独立地为值为至少1的指数。
在一个方面，B载体可为无机的，不含或基本上不含碳基的主链，或有机载体，具有基本上碳键的主链。
适宜的无机载体包括氨基衍生的有机硅烷、硅氧烷、硅氮烷、氢化铝、铝硅氧烷或硅酸铝化合物的单体或聚合物或有机-有机硅共聚物。此类载体典型的实例为：具有至少一个伯胺部分，如所述二氨基烷基硅氧烷[H2NCH2(CH3)2Si]O，或有机氨基硅烷(C6H5)3SiNH2的有机硅氧烷(描述于：Chemistry and Technology of Silicone，W.Noll，Academic Press Inc.1998，London，第209、106页)。包含一个或多个有机甲硅烷基肼部分的单体或聚合物或有机-有机硅共聚物也是适宜的。此类载体材料典型的实例为N，N′-双(三甲基甲硅烷基)肼(Me3Si)2NNH2。
包含有机载体典型的适宜的胺包括氨基芳基衍生物、多胺、氨基酸及衍生物、取代的胺和酰胺、葡糖胺、树枝状化合物和氨基取代的单糖、二糖、低聚糖和多糖。
所述胺化合物可被连接子或纤维素实体基团中断或取代。对于该胺化合物的通式如下所示：
NH2n-Lm-B-Lm-R*m；
其中每个m为值为0或至少1的指数，并且n为值为至少1的指数，如上文所定义。如上文所见，所述胺基团链接到载体分子，如被下文所述的种类所限定。所述伯胺和/或仲胺基团直接链接到所述载体基团上或者通过连接子基团L。所述载体还可被R*取代基所取代，并且R*可直接或通过连接子基团L链接到所述载体。R*还可包含支化基团，如叔胺和酰胺基团。
对于本发明目的重要的是所述胺化合物包含至少一个伯胺和/或仲胺基团以与香料醛和/或酮反应以形成反应产物。此类反应通常已知为席夫碱反应，因为形成了席夫碱。所述胺化合物不限于仅具有一个胺官能团。实际上，更优选所述胺化合物包含一种以上的胺官能团，因此使所述胺化合物能够与若干个醛和/或酮反应。因此，可获得带有混合的醛和/或酮的反应产物，因此获得此类香料混合的释放。
漂白剂-本发明的织物和家居护理产品可包含一种或多种漂白剂。不同于漂白催化剂的合适漂白剂包括光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预制的过酸以及它们的混合物。一般来讲，当使用漂白剂时，本发明的织物和家居护理产品可包含按所述织物和家居护理产品的重量计约0.1％至约50％或甚至约0.1％至约25％的漂白剂。合适漂白剂的示例包括：
(1)光漂白剂，例如磺化酞菁锌、磺化酞菁铝、氧杂蒽染料以及它们的混合物；
(2)预制的过酸：适宜的预制的过酸包括但不限于选自由下列组成的组的化合物：过羧酸及其盐、过碳酸及其盐、过亚胺酸及其盐、过一硫酸及其盐(例如
Figure BDA00001742984401241
以及它们的混合物。合适的过羧酸包括具有分子式R-(C＝O)O-O-M的疏水和亲水过酸，其中R为烷基，任选支链烷基，当过酸疏水时，其具有6个至14个碳原子或者8个至12个碳原子；当过酸亲水时，其具有小于6个碳原子或甚至小于4个碳原子；并且M为抗衡离子，例如钠、钾或氢；
(3)过氧化氢源，例如无机过氢化合物盐，包括以下碱金属盐如钠盐：过硼酸盐(通常为一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐以及它们的混合物。在本发明的一个方面，无机过氧化氢合物盐选自由下列物质组成的组：过硼酸钠盐、过碳酸钠盐以及它们的混合物。当被使用时，无机过氧化氢合物盐通常以占总的织物和家居护理产品0.05重量％至40重量％、或1重量％至30重量％的量存在，并且通常以可以是被包被的结晶的盐形式被掺入此类织物和家居护理产品中。合适的涂层包括：无机盐如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或它们的混合物，或有机物如水溶性或可分散聚合物、蜡、油或脂肪皂；和
(4)具有R-(C＝O)-L的漂白活化剂，其中R为烷基，任选支链烷基；当漂白活化剂是疏水的时，其具有6个至14个碳原子或者8个至12个碳原子，而当漂白活化剂是亲水的时，其具有小于6个碳原子或甚至小于4个碳原子；并且L为离去基团。合适的离去基团的实例为苯甲酸及其衍生物，尤其是苯磺酸盐。合适的漂白活化剂包括十二烷酰基羟基苯磺酸盐、癸酰基羟基苯磺酸盐、癸酰基羟苯甲酸及其盐、3，5，5-三甲基己酰基羟基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)和壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)。合适的漂白活化剂还公开于WO 98/17767中。尽管可采用任何合适的漂白活化剂，但在本发明的一个方面，本主题织物和家居护理产品可包含NOBS、TAED或它们的混合物。
当存在时，基于织物和家居护理产品的重量计，过酸和/或漂白活化剂通常以约0.1重量％至约60重量％、约0.5重量％至约40重量％或甚至约0.6重量％至约10重量％的量存在于所述织物和家居护理产品中。一种或多种疏水过酸或其前体可与一种或多种亲水过酸或其前体联合使用。
可选择过氧化氢源与过酸或漂白活化剂的量，使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比为1∶1至35∶1，或甚至2∶1至10∶1。
表面活性剂-如本发明所述的织物和家居护理产品可包含表面活性剂或表面活性剂体系，其中所述表面活性剂可选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及它们的混合物。当存在时，基于本主题织物和家居护理产品的重量计，表面活性剂通常以约0.1％至约60％，约1％至约50％或甚至约5％至约40％的含量存在。
助洗剂-本发明的织物和家居护理产品可包含一种或多种洗涤剂助剂或助洗剂体系。当助洗剂被使用时，基于所述织物和家居护理产品的重量计，本主题织物和家居护理产品将通常包含至少约1％、约5％至约60％或甚至约10％至约40％的助洗剂。
助洗剂包括但不限于：碱金属、铵和链烷醇铵的聚磷酸盐、碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐、硅铝酸盐助洗剂和聚羧酸盐化合物、醚羟基聚羧酸盐、马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸和羧基甲氧基琥珀酸、多元乙酸(如乙二胺四乙酸和氨三乙酸)以及多元羧酸(如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧联二琥珀酸、多元马来酸、苯1，3，5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸)的各种碱金属盐、铵盐和取代铵盐、以及它们的可溶性盐。
螯合剂-本文的织物和家居护理产品可包含螯合剂。合适的螯合剂包括铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。当使用螯合剂时，基于所述织物和家居护理产品的重量计，本主题织物和家居护理产品可包含约0.005％至约15％或甚至约3.0％至约10％的螯合剂。适合的螯合剂包括DTPA(二亚乙基三胺五醋酸)、HEDP(羟基乙烷二磷酸)、DTPMP(二乙烯三胺(亚甲基膦酸))、1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸二钠盐水合物、1，2-乙二胺、二乙烯三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚胺二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)以及它们的混合物。
染料转移抑制剂-本发明的织物和家居护理产品还可包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基
Figure BDA00001742984401271
唑烷酮和聚乙烯基咪唑或它们的混合物。当存在于织物和家居护理产品中时，基于所述织物和家居护理产品的重量计，染料转移抑制剂可以约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或甚至约0.1％至约3％的水平存在。
增白剂-本发明的织物和家居护理产品还能够包含可使被清洁物品着色的附加组分，如荧光增白剂。合适的荧光增白剂含量包括约0.01％重量、约0.05％重量、约0.1％重量、或甚至约0.2％重量的较低含量至0.5％重量或甚至0.75％重量的较高含量。
分散剂-本发明的织物和家居护理产品还能够包含分散剂。合适的水溶性有机物包括均聚或共聚酸或它们的盐，其中多元羧酸包含至少两个相隔不超过两个碳原子的羧基。
酶稳定剂-可通过多种技术来稳定用于洗涤剂的酶。本发明使用的酶可由最终的织物和家居护理产品中存在的钙和/或镁离子水溶性源来稳定，所述水溶性源将此类离子提供给酶。就包含蛋白酶的含水的织物和家居护理产品而言，可加入可逆的蛋白酶抑制剂，例如硼化合物，或者例如甲酸钙、甲酸钠和1，2-丙二醇的化合物，以进一步提高稳定性。
催化金属配合物-申请人的组合物可包含催化金属配合物。一类含金属的漂白催化剂是这样的催化剂体系，该体系包含具有确定漂白催化活性的过渡金属阳离子，如铜阳离子、铁阳离子、钛阳离子、钌阳离子、钨阳离子、钼阳离子或锰阳离子；具有很低的或者没有漂白催化活性的辅助金属阳离子，如锌阳离子或铝阳离子；以及对于催化的和辅助的金属阳离子有确定稳定性常数的螯合剂，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐。上述催化剂公开于U.S.4,430,243中。
如果需要，本发明组合物可借助锰化合物进行催化。上述化合物和用量是本领域熟知的，并且包括例如公开于U.S.5,576,282中的基于锰的催化剂。
可用于本发明的钴漂白催化剂是已知的，并且描述于例如U.S.5,597,936、U.S.5,595,967中。上述钴催化剂易于通过已知的方法制备，例如美国专利5,597,936和5,595,967中所提出的方法。
本文的组合物还可适宜地包含配体的过渡金属配合物，所述配体例如bispidones(WO 05/042532 A1)和/或大多环刚性配体(简写为“MRL”)。作为实施项，而不受限制，可调节本文的组合物和方法，使得在含水洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL物质，并且在洗涤液体中将典型地提供为约0.005ppm至约25ppm，约0.05ppm至约10ppm，或甚至约0.1ppm至约5ppm的MRL。
本发明过渡金属漂白催化剂中合适的过渡金属包括例如锰、铁和铬。合适的MRL包括5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。
通过已知步骤易于制备合适的过渡金属MRL，例如在WO 00/32601和U.S.6,225,464中所提出的。
溶剂-合适的溶剂包括水和其它溶剂如亲脂性流体。合适的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其它硅酮、烃、二元醇醚、甘油衍生物如甘油醚、全氟胺、全氟化和氢氟醚溶剂、低挥发性无氟有机溶剂、二醇溶剂、其它对环境友好的溶剂以及它们的混合物。
制备织物和家居护理产品的方法
本发明的织物和家居护理产品可被配制成任何合适的形式并采用配方师选择的任何方法制备，其非限制性实例描述于申请人的实施例和美国专利4,990,280，美国专利20030087791A1；美国专利20030087790A1；美国专利20050003983A1；美国专利20040048764A1；美国专利4,762,636；美国专利6,291,412；美国专利20050227891A1；EP 1070115A2；美国专利5,879,584；美国专利5,691,297；美国专利5,574,005；美国专利5,569,645；美国专利5,565,422；美国专利5,516,448；美国专利5,489,392；美国专利5,486,303中，这些专利均以引用方式并入本文。
使用方法
本发明包括一种清洁和/或处理部位，特别是表面或织物的方法。在一个方面，公开了包括如下步骤的此类方法：任选地洗涤和/或冲洗所述表面或织物，使所述表面或织物与本说明书中公开的任何织物和家居护理产品接触，然后任选地洗涤和/或冲洗所述表面或织物。
如本文所用，洗涤包括但不限于刷洗和机械搅拌。此类表面或织物的干燥可通过家庭或工业环境中采用的任何普通方法而实现。此类方法包括但不限于在电磁辐射(包括日光、红外线、紫外线和微波辐射)的存在或不存在下、在介于5个和0.01个大气压之间的压力下、在环境温度或高温下的强迫通风或静止空气干燥。在一个方面，所述干燥可通过使用熨斗而在高于环境温度的温度下实现，其中，例如，所述织物可处于与所述熨斗的直接接触下，接触持续相对短或甚至是延长的时间，并且其中可以施加由于重力而通常存在的之外的压力。在另一方面，所述干燥可通过使用烘干机而在高于环境温度的温度下实现。用于干燥织物的设备是众所周知的，其通常被称为烘干机。除衣物之外，此类设备还被用于干燥许多其他物品，包括毛巾、床单、枕套、尿布等等，在世界上的许多国家，此类设备已作为基本上取代晾衣绳用于干燥织物的用途的标准便利设备而被接受。如今所使用的大多数烘干机都利用热空气，当织物在烘干机内翻滚时，热空气经过织物之上和/或穿过织物。空气可以，例如，通过气火焰电子地、或甚至通过微波辐射被加热。此类空气可被加热至约15℃至约400℃，约25℃至约200℃，约35℃至约100℃，或甚至约40℃至约85℃，并在烘干机内被用于干燥表面和/或织物。正如本领域的技术人员所认可的那样，本发明的清洁组合物理想地适用于洗衣用途。因此，本发明包括一种用于洗涤织物的方法。所述方法包括以下步骤：将待洗涤的织物与所述清洁洗涤溶液接触，所述清洁洗涤溶液包含申请人的清洁组合物、清洁助剂或它们的混合物的至少一个实施方案。织物可包括大多数可在正常的消费者或机构使用条件下洗涤的任何织物。所述溶液优选具有约8至约10.5的pH。所述组合物可以溶液中约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。水温典型地为约5℃至约90℃。水与织物的比率通常为约1∶1至约30∶1。
测试方法
测试方法1：
本文给定了判断一种染料或颜料物质是否是用于本发明织物的着色剂的方案：
1.)将tergotometer洗涤试验仪的两个瓶装满800mL的Newcastle uponTyne，UK，City Water(总硬度～12格令每美加仑，由Northumbrian Water，Pity Me，Durham，Co.Durham，UK提供)。
2)将瓶装入到洗涤试验仪中，试验期间水温控制在30℃，搅拌设置在40rpm
3)向每个瓶中加入4.8g的IEC-B洗涤剂(IEC 60456 WashingMachine Reference BaseDetergent Type B)，该洗涤剂由wfk(Brüggen-Bracht，Germany)提供。
4)两分钟后，第一瓶中加入2.0mg活性着色剂。
5)一分钟后，向每个瓶中加入50g平整棉背心(由WarwickEquest，Consett，CountyDurham，UK提供)，该背心被切成5cm×5cm的样品。
6)10分钟后，排干筒罐，并且用冷水(16℃)重新注满，所述水具有14.4英制克拉克的硬度和3∶1的钙与镁摩尔比。
7)漂洗2分钟后，移出织物。
8)使用相同的处理，将步骤3-7再重复三个循环。
9)收集并室内挂干所述织物12小时。
10)使用配有D65光源和UVA截止滤光器的Hunter Miniscan光度计分析样品，以获得Hunter a(红-绿轴)和Hunter b(黄-蓝轴)的值。
11)每组织物的平均Hunter a和Hunter b值。如果用着色剂处理的评估织物显示其a轴或b轴上的色调平均差值大于0.2个单位，就认为它是本发明所用的织物调色剂。
测试方法2：就测试方法2而言，用来自表1-3的洗涤剂组合物1、2或4进行BMI微样品分析。将洗涤剂溶解于具有6gpg硬度的水中，并调节至温度为16℃。然后按照所描述的BMI微样品分析测定不同的酶的性能。通过将变体的性能与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的酶的性能比较，测定性能指数，在全部测试中酶的剂量均为1ppm。该方法详细描述于实施例31中。
测试方法3：就测试方法3而言，用来自表1-3的洗涤剂组合物1、2或4进行BMI微样品分析。将洗涤剂溶解于具有6gpg硬度的水中，并调节至温度为16℃。然后按照所描述的BMI微样品分析测定不同的酶的性能。通过将变体的性能与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的酶的性能比较，测定性能指数，在全部测试中酶的剂量均为0.4ppm。该方法详细描述于实施例1中。
测试方法4：就测试方法4而言，用来自表19-4的洗涤剂组合物10进行BMI微样品分析。将洗涤剂溶解于具有12gpg硬度的水中，并调节至温度为16℃。然后按照所描述的BMI微样品分析测定不同的酶的性能。通过将变体的性能与SEQ ID NO：755的酶的性能比较，测定性能指数，在全部测试中酶的剂量均为1.6ppm。具有1.1或更高的性能指数的酶被视为是系列1的GG36冷水蛋白酶。该方法详细描述于实施例19中。
测试方法5：就测试方法5而言，用来自表19-4的洗涤剂组合物7进行BMI微样品分析。将洗涤剂溶解于具有6gpg硬度的水中，并调节至温度为16℃。然后按照所描述的BMI微样品分析测定不同的酶的性能。通过将变体的性能与SEQ ID NO：755的酶的性能比较，测定性能指数，在全部测试中酶的剂量均为4ppm。具有1.1或更高的性能指数的酶被视为是系列1的GG36冷水蛋白酶。该方法详细描述于实施例19中。
测试方法6：就测试方法6而言，用来自表19-4的洗涤剂组合物7进行BMI微样品分析。将洗涤剂溶解于具有6gpg硬度的水中，并调节至温度为16℃。然后按照所描述的BMI微样品分析测定不同的酶的性能。通过将变体的性能与参考酶的性能比较，测定性能指数，所述参考酶是包含A158E突变的SEQ ID NO：755的酶，在全部测试中酶的剂量均为4ppm。具有1.0或更高的性能指数的酶被视为是系列1的GG36冷水蛋白酶。该方法详细描述于实施例19中。
测试方法7：按照标准方法ASTM D1125分析水溶液的电导率，并以milliSiemens/cm单位(在本发明中所写为mS/cm)报告。
试验
在下文实验方面的公开中，使用了下列缩写：PI(性能指数)，ppm(份每一百万份)；M(摩尔)；mM(毫摩尔每升)；μM(微摩尔每升)；nM(纳摩尔每升)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；Pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(足量的)；ND(未完成)；rpm(转每分钟)；GH(德国硬度)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量对体积)；v/v(体积对体积)；w/w(重量对重量)；g(重力)；OD(光密度)；ppm(份每一百万份)；杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)；SOC(2％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mM的NaCl，2.5mM的KCl)；极品肉汤(TB；12g/l的胰化蛋白胨，24g/l甘油，2.31g/l的KH2PO4和12.54g/l的K2HPO4)；OD280(280nm的光密度)；OD600(600nm的光密度)；A405(405nm的吸光度)；Vmax(酶催化的反应的最大初速度t)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸盐缓冲液[150mM的NaCl，10mM的磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；PBST
Figure BDA00001742984401321
PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链式反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙烷磺酸])；HBS(HEPES缓冲液)；Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)；Tricine(N-[三-(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-环己胺)乙烷-磺酸)；TAPS(3-{[三-(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸)；CAPS(3-(环己胺)-丙烷-磺酸；DMSO(二甲基亚砜)；DTT(1，4-二硫代-DL-苏糖醇)；SA(芥子酸(s，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)；TCA(三氯乙酸)；Glut和GSH(还原型谷胱甘肽)；GSSG(氧化型谷胱甘肽)；TCEP(三[2-羧乙基]磷化氢)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；HPLC(高效液相色谱)；RP-HPLC(反相高效液相色谱)；TLC(薄层色谱)；MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/离子化--飞行时间质谱)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙烷基)，Me(甲基)；Taq(水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；EGTA(乙二醇-二(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因)；HDL(重垢洗涤液)；HDD(重垢粉状洗涤剂)；HSG(高起泡粒状洗涤剂)；CEE(中东欧)；WE(西欧)；NA，当用于洗涤剂时(北美)；Japan和JPN，当用于洗涤剂时(日本)；MTP(微量滴定板)；MJResearch(MJ Research，Reno，NV)；Baseclear(Baseclear BV，Inc.，Leiden，The Netherlands)；PerSeptive(PerSeptive Biosystems，Framingham，MA)；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan，San Jose，CA)；Argo(Argo BioAnalytica，Morris Plains，NJ)；Seitz EKS(SeitzSchenk Filtersystems GmbH，BadKreuznach，Germany)；Pall(Pall Corp.，East Hills，NY and Bad Kreuznach，Germany)；Spectrum(Spectrum Laboratories，Dominguez Rancho，CA)；Molecular Structure(Molecular Structure Corp.，Woodlands，TX)；Accelrys(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)；Chemical Computing(Chemical ComputingCorp.，Mohtreal，Canada)；New Brunswick(New Brunswick Scientific，Co.，Edison，NJ)；CFT(Center for Test Materials，Vlaardingen，TheNetherlands)；P&G and Procter & Gamble(Procter & Gamble，Inc.，Cincinnati，OH)；GE Healthcare(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，United Kingdom)；DNA2.0(DNA2.0，Menlo Park，CA)；OXOID(Oxoid，Basingstoke，Hampshire，UK)；Megazyme(Megazyme International Ireland Ltd.，BrayBusiness Park，Bray，Co.，Wicklow，Ireland)；Finnzymes(Finnzymes Oy，Espoo，Finland)；Kelco(CP Kelco，Wilmington，DE)；Corning(CorningLife Sciences，Corning，NY)；(NEN(NEN Life Science Products，Boston，MA)；Pharma AS(Pharma AS，Oslo，Norway)；Dynal(Dynal，Oslo，Norway)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis，Lewisville，TX)；ATCC(American TyPe Culture Collection，Rockville，MD  )；Gibco/BRL(Gibco/BRL，Grand Island，NY)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pharmacia(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)；NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)；Applied Biosystems(AppliedBiosystems，Foster City，CA)；BD Biosciences和/或Clontech(BDBiosciences CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)；Operon Technologies(Operon Technologies，Inc.，Alameda，CA)；MWG Biotech(MWG Biotech，High Point，NC)；Oligos Etc(Oligos Etc.Inc，Wilsonville，OR)；Bachem(Bachem Bioscience，Inc.，King of Prussia，PA)；Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Mediatech(Mediatech，Herndon，VA；Santa Cruz(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)；Oxoid(Oxoid Inc.，Ogdensburg，NY)；Worthington(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)；GIBCOBRL或Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；Millipore(Millipore，Billerica，MA)；Bio-Rad(Bio-Rad，Hercules，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)；NEB(New England Biolabs，Beverly，MA)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pierce(PierceBiotechnology，Rockford，IL)；Takara(Takara Bio Inc.Otsu，Japan)；Roche(Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland)；Gene Oracle(Gene Oracle，Inc.，Mountain View，CA)；EM Science(EM Science，Gibbstown，NJ)；Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Biodesign(Biodesign Intl.，Saco，Maine)；Aptagen(Aptagen，Inc.，Herndon，VA)；Sorvall(Sorvall品牌，来自KendroLaboratory Products，Asheville，NC)；Molecular Devices(Molecular Devices，Corp.，Sunnyvale，CA)；R&D Systems(R&D Systems，Minneapolis，MN)；Siegfried Handel(Siegfried Handel AG，Zofingen，Switzerland)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；Marsh(Marsh Biosciences，Rochester，NY)；Geneart(Geneart GmbH，Regensburg，Germany)；Bio-Tek(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)；(Biacore(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)；PeproTech(PeproTech，Rocky Hill，NJ)；SynPep(SynPep，Dublin，CA)；New Objective(New Objective brand；Scientific Instrument Services，Inc.，Ringoes，NJ)；Waters(Waters，Inc.，Milford，MA)；Matrix Science(Matrix Science，Boston，MA)；Dionex(Dionex，Corp.，Sunnyvale，CA)；Monsanto(Monsanto Co.，St.Louis，MO)；Wintershall(Wintershall AG，Kassel，Germany)；BASF(BASF Co.，Florham Park，NJ)；Huntsman(Huntsman Petrochemical Corp.，Salt Lake City，UT)；Shell Chemicals(ShellChemicals，Inc.，London，UK)；Stepan(Stepan，Northfield，IL)；Clariant(Clariant，Sulzbach，Germany)；Industrial Zeolite(Industrial Zeolite Ltd.，Grays，Essex，UK)；Jungbunzlauer(Jungbunzlauer，Basel，Switzerland)；Solvay(Solvay，Brussels，Belgium)；3V Sigma(3V Sigma，Bergamo，Italy)；Innospec(Innospec，Ellesmere Port，UK)；Thermphos(Thermphos，Vlissiggen-Ost，The Netherlands)；Ciba Specialty(Ciba Specialty Chemicals，Basel，Switzerland)；Dow Corning(Dow Corning，Barry，UK)；Enichem(Enichem Iberica，Barcelona，Spain)；Fluka Chemie AG(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)；Gist-Brocades(Gist-Brocades，NV，Delft，TheNetherlands)；Dow Corning(Dow Corning Corp.，Midland，MI)；Mettler-Toledo(Mettler-Toledo Inc，Columbus，OH)；RB(Reckitt-Benckiser，Slough，UK)；以及Microsoft(Microsoft，Inc.，Redmond，WA)。
就北美(NA)和西欧(WE)的重垢洗衣液(HDL)而言，可商购获得的洗涤剂中存在的酶的热灭活通过将预先称重的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)置于95℃水浴中2小时进行。用于NA和WE的洗碗机用(ADW)洗涤剂的热灭活的孵育时间为8小时。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。酶活性通过AAPF测定法检测。
就对热灭活的洗涤剂中酶活性的检测而言，洗涤剂的工作液从热灭活的原液制得。适当量的水硬度(例如，6gpg或12gpg)和缓冲液被加入洗涤剂溶液中，以匹配所期望的条件。溶液通过旋涡振荡或颠倒瓶子混合。下表提供了关于本文所使用的一些可商购获得的洗涤剂和检测条件的信息。在一些实验中，附加的和/或其他的可商购获得的洗涤剂被用于下列的实施例中。
Figure BDA00001742984401351
在一些附加的方面，使用了下列溶液：
Figure BDA00001742984401361
实施例旨在仅作为本发明的示例，并因此在任何情况下不应被视为对本发明构成限制，实施例也描述和详解了以上所讨论的本发明的方面和实施方案。前述实施例和发明详述是作为例证而非作为限制而被提供。
BPN′变体或部分I实施例
洗涤剂表
BPN′变体(或部分I)实施例中的分析中所使用的洗涤剂的组成显示在表1-3中。BPN′变体蛋白质样品被添加至如部分I实施例1中所述的洗涤剂组合物中，以测定所检测的各种性质。
下列的是适用于顶部加载式自动洗衣机(1、2和4)和前加载式洗衣机(3)的液体衣物洗涤剂组合物。
Figure BDA00001742984401362
Figure BDA00001742984401371
1无规接枝共聚物为聚乙酸乙烯酯接枝的环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。所述聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。
2聚氮丙啶(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲烷氧基化油脂清洁聚合物为聚氮丙啶(MW＝600)，每个-NH具有24个乙氧基化基团，并且每个-NH具有16个丙氧基化基团
用于制备本发明的蛋白酶变体多肽的载体、细胞和方法
适用于产生编码本发明的蛋白酶变体(例如本发明的冷水蛋白酶)的本发明的经修改的多核苷酸的多种方法是本领域中已知的，包括但不限于：例如，点饱和诱变、分区诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变、靶向进化、以及多种其他重组方法。用于制备经修改的多核苷酸和蛋白质(例如，蛋白酶变体)的方法包括DNA改组方法(参见例如StemmerWP，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(22)：10747-51(1994))；基于基因的非同源重组的方法，例如ITCHY(Ostermeier等人，Bioorg.Med.Chem.7：2139-44[1999])；SCRATCHY(Lutz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：11248-53[2001])；SHIPREC(Sieber等人，Nat.Biotechnol.19：456-60[2001])；NRR(Bittker等人，Nat.Biotechnol.20：1024-9[2001]；Bittker等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA101：7011-6[2004])；依赖于寡核苷酸的使用来插入随机和靶向的突变、缺失和/或插入的方法(Ness等人，Nat.Biotechnol.20：1251-5[2002]；Coco等人，Nat.Biotechnol.20：1246-50[2002]；Zha等人，Chembiochem.4：34-9[2003]；Glaser等人，J.Immunol.149：3903-13[1992])；亦参见Arkin和Youvan，Biotechnology 10：297-300(1992)；Reidhaar-Olson等人，Methods Enzymol.208：564-86(1991)。
在一个方面，全长的亲本多核苷酸被链接至适当的表达质粒中，而下列诱变方法被用于促进本发明的经修改的蛋白酶的构建，尽管也可使用其他方法。所述方法基于Pisarchik等人(Pisarchik等人，Prot.Eng.Des.Select.20：257-265[2007])所描述的方法。在一个方面，提供了限制酶在其识别序列外侧切割这一附加的优点，这允许了对几乎任何核苷酸序列的消化和排除了限制性位点“疤痕”的形成。
在一种方法中，获得了编码全长蛋白酶的天然存在的基因，并就期望在其处生成一个或多个氨基酸的突变(例如缺失、插入、取代)的一个或多个位点进行了测序和扫描。为了改变基因的序列以与所期望的序列相符而进行的基因突变，通过与普遍已知的方法相一致的引物延伸而实现。通过PCR扩增了所期望的突变位点左侧和右侧的片段，并包括了Eam1104I限制性位点。用Eam1104I消化左侧和右侧的片段，以产生具有互补的三碱基突出粘性末端的多个片段，然后将它们合并和连接，以产生包含一个或多个突变的经修改的序列的文库。这一方法避免了移框突变的产生。这一方法还简化了诱变过程，因为所有的寡核苷酸都能被合成，以具有相同的限制性位点，并且不需要像通过某些其他方法那样必需要有合成的接头来构建限制性位点。
部分I实施例
实施例1
测定
如下文所示使用了多种测定方法。来自以下提供的规程的任何偏差均已在后面的实施例中指出。
A.用于在96孔微量滴定板中测定蛋白质含量的TCA检测法
就BPN′和BPN′变体而言，该检测法采用来自微量滴定板的经过过滤的枯草芽孢杆菌培养物上清液，其中所述枯草芽孢杆菌培养物已在33-37℃、以230-250rpm摇动下潮湿通气生长3-4天。新的96孔平底微量滴定板(MTP)被用于该检测法。首先，将100μl/孔的0.25N的HCl置于每个孔中。然后，加入25μl经过过滤的培养物肉汤。然后测定405nm的光散射/吸光度(在平板读取器中采用5秒混合模式)以提供“空白”读数。将100μl/孔的30％(w/v)三氯乙酸(TCA)置于板中，并在室温孵育10分钟，以进行检测。然后测定405nm的光散射/吸光度(在平板读取器中采用5秒混合模式)。所使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX(340型；Molecular Devices)MTP读取器；MTP来自Costar(9017型)。
通过从包含TCA的检测读数中减去空白(不含TCA)值进行了计算，以提供对样品中蛋白质含量的相对测量。如果需要，通过用对具有已知的转换因子的克隆的AAPF检测，来校正TCA读数，能够构建标准曲线。然而，就250微克至2500微克蛋白质每毫升(ppm)的蛋白质浓度而言，TCA结果是线性的，因此能够直接用其对酶的性能作图，以便选择性能良好的变体。样品中的浊度/光散射升高与上述培养上清液中可沉淀的蛋白质的总量相关。
B.96孔微量滴定板中的AAPF蛋白酶检测法
为了测定本发明的蛋白酶以及它们的变体的蛋白酶活性，对N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对-硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解进行了测量。所使用的试剂溶液是：100mM的Tris/HCl，pH 8.6，包含
Figure BDA00001742984401391
(Tris稀释缓冲液)；100mM的Tris缓冲液，pH 8.6，包含10mM的CaCl2和
Figure BDA00001742984401392
(Tris/Ca缓冲液)；和160mM的溶于DMSO的suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA原液)(Sigma：S-7388)。将1ml的suc-AAPF-pNA原液添加至100ml的Tris/Ca缓冲液中并充分混合至少10秒，以制备suc-AAPF-pNA工作液。通过将10μl经稀释的蛋白酶溶液添加到每个孔中，然后立即加入190μl的1mg/ml的suc-AAPF-pNA工作液，进行了检测。混合溶液5秒，然后于25℃在MTP读取器中以动力学模式(5分钟内25次读数)读取405nm的吸光度变化。蛋白酶活性表示为AU(活性＝ΔOD·min-1ml-1)。
C.测试方法3的BMI微样品分析法
从CFT获得了5.5毫米圆直径的血液、乳品和墨水(BMI)污染的微样品。在切割上述样品前，用水洗涤了织物(EMPA 116)。在96孔非结合的微量滴定板(Corning 3641)的每个孔中置入一个微样品。用于该分析的洗涤剂包括洗涤剂组合物1、洗涤剂组合物2和洗涤剂组合物4。将洗涤剂在Milli-Q(去离子)水中稀释至0.788g/l的工作强度浓度。用5mM的HEPESpH 8.2或pH 7.2缓冲这些洗涤剂，当加入洗涤剂时，分别缓冲于pH 8或pH7。此外，还加入了6格令每加仑(gpg)的水硬度(3∶1的Ca∶Mg-CaCl2∶MgCl2·6H2O)。就16℃的分析而言，将洗涤剂溶液在冰-水浴中(对于32℃的分析则在室温)预平衡，并泵入循环贮存器(Beckman FX)中。然后，190μl所期望的洗涤剂溶液被添加至包含微样品的MTP的每个孔中。向上述混合物中加入10μl经稀释的酶的主稀释溶液，得到约0.4-0.5μg/mL的酶浓度。上述主稀释液是从8μg/mL的培养上清液制得，其中所述培养上清液和BPN′-v3或BPN′-v36亲本对照物的大致的酶浓度是用AAPF蛋白酶活性检测法测定的，测定基于已知浓度的纯化的BPN′-v3或BPN′-v36标准品的浓度进行。用胶带密封MTP，并放入在冷却的乳品箱中预设在16℃(或者在桌面上预设在32℃)的iEMS孵育/振荡器(Thermo/Labsystems)中20分钟，并以1400rpm搅拌。在适当条件下孵育之后，从每块平板上移除密封胶带，并从每一孔中转移125μl(如果是在较小规模的筛选中通过手工移液，则转移150μl)溶液至一块新的MTP(Corning 9017)。使用MTPSpectraMax读取器(340型；Molecular Devices)在600nm对上述包含125μl-150μl溶液/孔的新的MTP进行读数(在平板读取器中采用5秒混合模式)。检测还包括了包含微样品和洗涤剂但不含酶的空白对照物。用空白值(不含酶的底物)对获得的吸光度值进行了校正，提供了对水解活性的测量。就每种样品(变体)而言，如下文所述计算了性能指数。在60°F(16℃)和pH 8进行的这种BMI微样品分析法，在本文中被称为“测试方法3”。
D.稳定性检测
在稀释于水中的40％浓缩洗涤剂组合物3的存在下，测定了蛋白酶变体的稳定性。所使用的试剂为：在Milli-Q水中稀释至50％的洗涤剂组合物3，10mM的pH 5.8主稀释缓冲液，AAPF试剂：参见AAPF检测法规程。所使用的设备为：用于将经稀释的酶稀释至洗涤剂中以及用作suc-AAPF-pNA平板的F-底部MTP(Corning 9017)，Biomek FX(Beckman Coulter)，Spectramax Plus 384 MTP读取器(MolecularDevices)，iEMS孵育/振荡器(1mm振幅)(Thermo ElectronCorporation)，密封胶带：Nunc(236366)，循环贮存器(Beckman Fx)。
首先将洗涤剂组合物3用水稀释至50％。将上述洗涤剂存放于室温，并循环通过循环贮存器。iEMS孵育/振荡器(Thermo/Labsystems)被预设在43℃。将培养上清液稀释至包含主稀释缓冲液的平板中，使得浓度为约～20ppm(主稀释液平板)。然后，40μl的样品被从上述主稀释液平板中添加至包含160μl的50％洗涤剂组合物3的平板中，以得到4ppm的最终孵育浓度。将上述内容物混合并置于室温下，立即在这些平板上进行三重AAPF检测，并记作“无压力读数”。调整AAPF检测方法，使得20μl来自上述步骤的样品被添加至190μl的suc-AAPF-pNA工作液中。立即用密封胶带覆盖平板，并置于650rpm的43℃的iEMS振荡器中30分钟。孵育30分钟后，在这些压力平板上进行三重AAPF检测，并记作“压力读数”。通过计算残余的与初始的AAPF活性的比率如下：残余活性(％)＝[mOD.min-1压力]*100/[mOD.min-1无压力]，测定了样品的稳定性。就每种样品(变体)而言，如下文所述计算了性能指数。
E.LAS/EDTA稳定性检测
在置于指定条件下孵育之后，测定了在典型的阴离子表面活性剂(LAS＝直链烷基苯磺酸盐，具体而言，十二烷基苯磺酸钠-DOBS)和EDTA二钠的存在下，蛋白酶变体的稳定性，并用AAPF检测法测定了残余活性。所使用的试剂为：十二烷基苯磺酸，钠盐(DOBS，Sigma No.D-2525)，
Figure BDA00001742984401421
(Sigma No.P-8074)，EDTA二钠(Siegfred HandelNo.164599-02)，HEPES(Sigma No.H-7523)，无压力缓冲液：50mM的
Figure BDA00001742984401422
pH 8.0，压力缓冲液：50mM的HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM的EDTA(3.36g/l)，pH 8.0，参考蛋白酶和蛋白酶变体培养上清液，包含200-400μg/ml蛋白质。所使用的设备为：V-或U-底部MTP用作稀释平板(分别为Greiner 651101和650161)，用于无压力和LAS/EDTA缓冲液以及用作suc-AAPF-pNA平板的F-底部MTP(Corning 9017)，Biomek FX(BeckmanCoulter)，Spectramax Plus 384MTP读取器(Molecular Devices)，iEMS孵育/振荡器(1mm振幅)(Thermo Electron Corporation)和Nunc密封胶带(236366)。
iEMS孵育/振荡器(Thermo/Labsystems)被设定在29℃。将培养上清液稀释至包含无压力缓冲液的平板中，使得浓度为约～25ppm(主稀释液平板)。然后，20μl的样品被从上述主稀释液平板中添加至包含180μl的无压力缓冲液的平板中，以得到2.5ppm的最终孵育浓度。将上述内容物混合并置于室温下，在该平板上进行了AAPF检测。然后，20μl来自上述主稀释平板的样品也被添加至包含180μl压力缓冲液(50mM的HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM的EDTA(3.36g/l)，pH 8.0)的平板中。溶液被混合并立即被置于400rpm的29℃的iEMS振荡器中30分钟。孵育30分钟后，在该压力平板上进行了AAPF检测。通过计算残余的与初始的AAPF活性的比率如下：残余活性(％)＝[mOD.min-1压力]*100/[mOD.min-1无压力]，测定了样品的稳定性。就每种样品(变体)而言，如下文所述计算了性能指数。
性能指数
性能指数提供了对变体(实际值)与标准品或参考蛋白酶(理论值)在相同蛋白质浓度的性能的比较。利用标准品/参考蛋白酶的性能剂量反应曲线(即用朗缪尔方程产生性能曲线)，能够计算出理论值。大于1(PI＞1)的性能指数(PI)指示与标准品或参考蛋白酶(其可以是，例如，野生型蛋白酶或其他的蛋白酶变体)相比更好的变体，而等于1的PI(PI＝1)指示与标准品或参考蛋白酶表现相同的变体，小于1的PI(PI＜1)指示表现比标准品或参考蛋白酶更差的变体。因此，PI指示了“胜利者”(例如，具有与标准品/参考蛋白酶的蛋白水解活性相比增强的蛋白水解活性的变体)以及不那么期望在某些情况下使用的变体(例如，具有比标准品/参考蛋白酶的蛋白水解活性更低的蛋白水解活性的变体)。
需要注意的是，具有比参考或标准蛋白酶的性能指数值更更低的性能指数值的本发明的蛋白酶变体，在本文所述的应用和方法中依然是有用的。例如，具有比参考或标准蛋白酶的性能指数值更更低的性能指数值的本发明的蛋白酶变体，具有蛋白水解活性，并因此在本发明的组合物中是有用的，例如但不限于：例如，用于清洁多种表面和物品的清洁组合物(包括但不限于：例如洗涤剂清洁组合物)，所述表面和物品包括但不限于：例如，衣物、织物和餐具，以及在个人护理组合物和本文中在别处所述的组合物中；此类蛋白酶变体在本文中在别处所述的织物和家居护理产品与组合物以及非织物和家居护理产品与组合物中，以及在本发明的方法中，也是有用的，所述方法包括但不限于：例如，本文中在别处所述的清洁方法、用于个人护理的方法等。
下列的多个术语被用于描述上述变体：无害的变体具有＞0.05的PI；有害的变体具有小于或等于0.05的PI；可合并的变体是就至少一种特性而言具有大于或等于0.2的性能指数值，而就全部特性而言具有＞0.05的性能指数值的那些变体。可合并的变体是能被合并以递送就一种或多种所期望的特性而言具有适当的性能指数的蛋白质的那些变体。这些数据被用于改造任何枯草杆菌蛋白酶/枯草杆菌酶或蛋白酶。即使待改造的枯草杆菌酶或蛋白酶在一个或多个特定位点具有与枯草杆菌蛋白酶BPN′的不同的氨基酸，在对改变所期望的特性的氨基酸取代的鉴定中，这些数据通过鉴定出用于取代的最佳选择，包括对BPN′野生型氨基酸的取代，而也是有用的。
实施例2
BPN′库的构建和BPN′变体的清洁性能
a)对用于库的构建的BPN′-v3表达盒的描述
利用BPN′表达盒产生了用于组合库的构建的BPN′-v3(包含G097A-G128A-Y217Q取代的BPN′蛋白酶)表达盒，其包含aprE-BPN′杂合前导序列(即信号序列)、来自解淀粉芽孢杆菌的BPN′前序列和BPN′成熟序列。DNA序列显示为下文的SEQ ID NO：1，其编码下文中显示为SEQ IDNO：168的BPN′前体蛋白。
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGGCA GGGAAATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGAC AATGAGCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAA AGGCGGGAAAGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAG CTACATTAAACGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGC GTCGCTTACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACATGCGTACGCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATTCTATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGGCGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGGACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGTATAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAG(SEQ ID NO：1)
在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中，编码成熟蛋白酶的DNA序列以粗体显示，编码前导序列(aprE-BPN′杂合前导序列)的核苷酸序列显示为标准(不带下划线的)文本，而编码前序列(BPN′)的核苷酸序列则带有下划线。在如SEQ ID NO：168所示的BPN′前体蛋白的氨基酸序列(aprE-BPN′杂合前导序列、BPN′前序列和BPN′成熟蛋白质序列)中，粗体部分表示成熟的BPN′枯草杆菌蛋白酶。
VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ IDNO：168)
成熟的BPN′枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：2。
成熟的BPN′-v3基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：3的序列(BPN′-v3表达盒中所用的信号序列和前肽序列与SEQ ID NO：1中所显示的用于BPN′的是相同的)。成熟的BPN′-v3蛋白酶变体的蛋白质序列是SEQ ID NO：4的序列(BPN′-v3表达盒中所用的信号序列和前肽序列与SEQ ID NO：168中所显示的用于BPN′的是相同的)。
b)利用pHPLT-BPN′-v3质粒的组合库的构建
包含上文所述的BPN′-v3表达盒的pHPLT-BPN′-v3质粒(参见图1)被作为用于克隆的模板DNA，以提供来源于BPN′-v3的变体。载体pHPLT(美国专利6,566,112中的图4)包含地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)LAT启动子(“Plat”)；编码LAT信号肽(“preLAT”)的序列。其他的质粒元件来自McKenzie等人，Plasmid 15(2)：93-103(1986)中公开的质粒pUB110：“ori-pUB”是来自pUB110的复制起点；“neo”是来自pUB110的新霉素/卡那霉素抗性基因；“终止子”是来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录终止子。
在DNA 2.0合成了组合的DNA库，并以单独的连接反应交付。在某些情况下，用Illustra Templiphi试剂盒(GE Healthcare)通过滚环扩增(RCA)扩增了来自连接反应混合物的DNA，以高效地转化枯草芽孢杆菌。反应按照制造商的规程进行。一微升十倍稀释的经扩增的DNA被用于转化50μl感受态枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。在37℃摇动转化混合物1小时。十微升转化混合物被铺于补充了10μg/ml新霉素(Teknova)的脱脂乳(1.6％)Luria琼脂平板上。
在上述脱脂乳平板上形成了色圈的转化体被挑出，并接种至包含150μl补充了10μg/ml新霉素的Luria肉汤(LB)培养基的微量滴定板中。将Enzyscreen盖子(Enzyscreen)用于微量滴定板上，使平板在70-80％湿度下于37℃以250-300rpm摇动生长过夜。利用96针复制工具(Enzyscreen)，将上述过夜培养物平板用于接种至包含180μl含2.5μg/ml新霉素的MBD培养基(基于MOPS的合成培养基)的新微量滴定板中。MBD培养基的制备基本如本领域所已知的(参见Neidhardt等人，J.Bacteriol.119：736-747[1974])，不同的是从基础培养基中去除了NH4Cl、FeSO4和CaCl2，使用了3mM的K2HPO4，并且向基础培养基补充了60mM脲和100ml由210g/l的葡萄糖和350g/l的麦芽糖糊精制成的溶液。加入了1g/l的BD Bacto酵母提取物，并用KOH将pH调节至7.4。微量营养素以100X原液的形式制成，一升原液中包含：400mg的FeSO4·7H2O、100mg的MnSO4·H2O、100mg的ZnSO4·7H2O、50mg的CuCl2·2H2O、100mg的CoCl2·6H2O、100mg的NaMoO4·2H2O、100mg的Na2B4O7·10H2O、10ml的1M的CaCl2和10ml的0.5M的柠檬酸钠。使用Enzyscreen盖子(Enzyscreen)，让包含MBD培养基的微量滴定板在70-80％湿度下于37℃以250-300rpm摇动生长64小时，以表达蛋白酶变体。次日，通过微量过滤平板(0.22um；Millipore)过滤培养物，所得到的包含蛋白酶变体的滤液被用于生物化学分析。
就清洁性能对蛋白酶变体进行了测试，测试使用在洗涤剂组合物1中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法和在洗涤剂组合物2中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法。蛋白质含量采用TCA检测法测定。检测如实施例1中所述进行，并按照测试方法3计算了相对于BPN′-v3(具有等于1的PI值)的性能指数。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′枯草杆菌蛋白酶变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、或大于1.0至约5的PI值：包含氨基酸取代的组G097A-G128A-P210S-Y217Q的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一BMI微样品清洁检测中相对于BPN′-v3具有1.1的PI值，和比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性以及在这一检测中比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体具有包含氨基酸取代G097A-G128A-P210S-Y217Q的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。还包括了在这一检测中具有比SEQ ID NO：2更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含氨基酸取代G097A-G128A-P210S-Y217Q的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。还提供了在BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或比BPN′(SEQ ID NO：2)和/或BPN′-v3的PI值更高的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含取代X097A-X128A-X210S-X217Q，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应，并且任选地，其中所述变体包含至少一种选自由G097A，G128A，P210S和Y217Q组成的组的取代。此类蛋白酶变体可以是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的蛋白酶变体。还包括了包含此类蛋白酶变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值(即具有与BPN′-v3的PI值大致相等的PI值)：包含至少一组选自由G097A-G128A-Y217Q，G097A-G128A-E156S-P210S-Y217Q，G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218A，G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218S和G097A-Y104F-G128A-E156S-P210I-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还提供了在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或与BPN′-v3相比等于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X097A，X104F，X128A，X156A/S，X210I/S，X217Q，X218A/S组成的组的取代，和任选地至少一种选自由G097A，Y104F，G128A，E156A/S，P210I/S，Y217Q和N218A/S组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有约为0.9的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-E156A-P210S-Y217Q-N218S和G097A-G128A-Y217Q-N218A组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218A和G097A-G128A-P210S-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。还提供了在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或与BPN′-v3相比大于1的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X097A，X104F，X128A，X156A/S，X210I/S，X217Q，X218A/S组成的组的取代，和任选地至少一种选自由G097A，Y104F，G128A，E156A/S，P210I/S，Y217Q和N218A/S组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-Y217Q(即BPN′-v3)，G097A-G128A-E156S-P210S-Y217Q和G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218S组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有蛋白水解活性和比BPN′更强的蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-E156A-P210S-Y217Q-N218S，G097A-G128A-Y217Q-N218A和G097A-Y104F-G128A-E156S-P210I-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ IDNO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例3
BPN′-v3+S78N的变体的清洁性能和组合库的产生
a)对BPN′-v3+S78N变体的描述和来源于该变体的合成的基因序列
Gene Oracle合成了八个基因并克隆进了pHPLT-BPN′-v3+S78N(BPN′-S78N-G97A-G128A-Y217Q)亲本质粒(参见图2)中。这些基因中的一些被用作构建组合库的模板(亲本)。利用本领域已知的标准分子生物学方法产生了BPN′-v3+S78N变体。编码BPN′-v3+S78N变体的核苷酸序列是SEQID NO：7的序列，而BPN′-v3+S78N变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：8的序列。基因GcM90-96和GcM100的核苷酸和蛋白质序列显示在下面。
  基因   核苷酸序列   蛋白质序列
  GcM90   SEQ ID NO：9   SEQ ID NO：10
  GcM91   SEQ ID NO：11   SEQ ID NO：12
  GcM92   SEQ ID NO：13   SEQ ID NO：14
  GcM93   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：16
  GcM94   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：18
  GcM95   SEQ ID NO：19   SEQ ID NO：20
  GcM96   SEQ ID NO：21   SEQ ID NO：22
  GcM100   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：24
b)利用合成基因GcM90-94和GcM100进行的组合库CG1-CG5和 CG8的构建
Figure BDA00001742984401521
Figure BDA00001742984401531
Figure BDA00001742984401541
每种合成的基因均被整合进pHPLT-BPN′-S78N-G97A-G128A-Y217Q亲本分子中。所得到的包含GcM90-94和GcM100六种合成基因的质粒被作为模板，以在相应的位点制备组合库(表3-1)。还合成了另外的两种基因，GcM95和GcM96，用于分析，但没有用作库的亲本DNA。这些基因每种均在pHPLT-BPN′-S78N-G97A-G128A-Y217Q亲本分子之上具有九个突变。
用两微克DNA和甲基化酶(NEB)，按照NEB的规程，使包含合成基因GcM90-94和GcM100的亲本质粒(模板DNA)甲基化。然后用DNAClean and Concentrator试剂盒(Zymo Research)纯化了甲基化的DNA。使用
Figure BDA00001742984401542
Multi Site-Directed Mutagenesis试剂盒(“QCMS试剂盒”；Stratagene)，按照制造商的规程，制备了CG1-5和CG8组合库(分别的模板和引物组合参见表3-1)，例外的是库CG3和CG4，它们使用了86.5ng的每种引物而不是规程中所建议的50ng。用于向每一库中引入所期望的突变的全部引物列于表3-1中。它们由Integrated DNA Technologies合成和提供。就每一库而言，在QCMS反应结束之后，通过加入0.5-1μl的DpnI(来自QCMS试剂盒)并于37℃孵育1-4小时，然后再加入0.5-1μl的DpnI并于37℃再孵育1-4小时，消化了模板DNA。为了高效地转化枯草芽孢杆菌，如实施例2中所述在转化之前扩增了来自QCMS反应混合物的DNA和使转化体生长。
另外的BPN′-v3+S78N变体由DNA2.0制备。下列取代被单独地引入了BPN′-v3+S78N亲本分子中：Q59G，N62Q，V68A，S89Y，A92G，I108V，I115V，M124T，P129L，A138T，V147L，S161P，Y 167A，P172V，G211T，L267V和A273S。
就清洁性能对全部的上述组合库变体和在DNA2.0合成的变体进行了测试，测试使用在洗涤剂组合物1中于16℃和pH 8进行的测试方法3的BMI微样品检测法和在洗涤剂组合物2中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法。蛋白质含量采用TCA检测法测定。检测如实施例1中所述进行，并按计算了相对于SEQ ID NO：4的酶(具有等于1.0的PI值)的性能指数。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于SEQ ID NO：4的酶具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q-T244N，N061A-S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A，S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Q185T-Y217Q，S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q，S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q，S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q-T244I和S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性以及比BPN′和BPN′-v3更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X040E，X053G，X059V，X061A，X062H/Q，X068A，X078N，X087E，X101A，X102A，X108V，X124I，X125A，X126V，X129T，X147Q，X159D，X183T，X185T，X211A，X224A，X244I/N，X252Q和X274D组成的组的取代，和任选地至少一种选自由X040E，X053G，X059V，X061A，X062H/Q，X068A，X078N，X087E，X101A，X102A，X108V，M124I，S125A，L126V，P129T，V147Q，S159D，S183T，Q185T，G211A，S224A，T244I/N，N252Q和A274D组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于SEQ ID NO：4的酶(或者称为BPN′-v3)具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-Y217Q，N061A-S078N-S087E-G097A-G128A-Y217Q-S224A，Q059V-S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q，Q059V-S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q，Q059V-S078N-G097A-G128A-Y217Q，Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-Y217Q-N252Q，S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q，S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q，S078N-G097A-G128A-Q185T-Y217Q，S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q，S078N-G097A-G128A-Y217Q，S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A和S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A-A274D组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有为约0.9的PI值：包含氨基酸取代的组S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含上文所述的氨基酸取代的组的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q，S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q，S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q，S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q-N252Q和S078N-S087E-G097A-M124I-G128A-Y217Q-S224A组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q，S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q-T244N，S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q和S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q-T244I组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-Y217Q，N061A-S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A，N061A-S078N-S087E-G097A-G128A-Y217Q-S224A，Q059V-S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q，Q059V-S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q，Q059V-S078N-G097A-G128A-Y217Q，Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-Y217Q-N252Q，S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Q185T-Y217Q，S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q，S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q，S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q，S078N-G097A-G128A-Q185T-Y217Q，S078N-G097A-G128A-Y217Q，S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A和S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A-A274D组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于约1的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有约为0.9的PI值：包含至少一组选自由S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q和S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁需要清洁的物品或表明的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q，S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q，S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q-N252Q，S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q-N252Q和S078N-S087E-G097A-M124I-G128A-Y217Q-S224A组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁需要清洁的物品或表明的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例4
BPN′变体的产生和其清洁性能
通过
Figure BDA00001742984401601
Multi Site-Directed Mutagenesis产生BPN′变体 LC1-LC4
使用Multi Site-Directed Mutagenesis试剂盒从不同的亲本质粒构建了BPN′变体。用NEB Dam Methylase试剂盒通过反应使亲本质粒(表4-1)甲基化，反应包含77.5μl的H20+10μl缓冲液10X+0.25μl的SAM+2uL的DAM甲基化酶+10uL的微量提纯DNA(～150ng/μL)，于37℃过夜。使用
Figure BDA00001742984401603
纯化试剂盒纯化了甲基化的质粒DNA。
Figure BDA00001742984401604
Multi Site-Directed Mutagenesis(多重定点诱变)反应被设定为对每种DNA模板而言在反应混合液中包含2.5μl缓冲液5X+0.5μl的引物1(25μM)+0.5μl的引物2(25μM)+1μl的dNTP′s+1μl的酶共混物+18μl的H2O+1.5μl的DNA。所使用的PCR程序为：95℃进行1分钟；(95℃进行1分钟，53℃进行1分钟，65℃进行9:39分钟)x29个循环；65℃进行10分钟，4℃保持。引物序列显示在表4-2中。在全部的反应中，PCR使用MJResearch PTC-200 Peltier热循环仪进行。通过向37℃过夜的Multi Site-Directed Mutagenesis反应加入1μl的DpnI，从PCR样品中除去了亲本DNA。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商的规程，通过滚环扩增(RCA)扩增了经DpnI消化的反应，以提高转化率。用每种RCA反应1μL转化了枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)，并将转化的细胞铺于包含10ppm新霉素的LA+1.6％脱脂乳平板上，于37℃孵育过夜。选择了来自过夜生长的菌落来进行菌落PCR，以使用“puReTaq Ready-To-Go PCR Beads”(Amersham)进行测序。所使用的PCR和测序引物是pHPLT F1(/5PHOS/TACATATGAGTTATGCAGTTTG(SEQ ID NO：54))和pHPLTseq R1(/5PHOS/TTATCCTTTACCTTGTCTC(SEQ ID NO：55))。具有适当序列的克隆被冻存。在96孔微量滴定板中，通过使枯草芽孢杆菌转化体于37℃在如实施例2中所述的包含脲的MOPS基培养基中生长68小时，制备了BPN′变体蛋白质。
Figure BDA00001742984401611
附加的BPN′变体LC5-LC37的产生
用BPN′核酸作为在表达质粒pHPLT-BPN′partial opt(参见图3)中包含的亲本基因，由DNA 2.0制备了LC5至LC37连续命名的附加的33种BPN′变体。LC5至LC37BPN′变体分别如下所示：BPN′-P52L-V68A-G97A-I111V，BPN′-I111V-M124V-Y167A-Y217Q，BPN′-Y104N-G128A-Y217Q，BPN′-M124V-Y167A-Y217Q，BPN′-I111V-M124V-Y217Q，BPN′-P52L-V68A-G97A，BPN′-G97A-I111V-M124V，BPN′-V68A-A92G-G97A，BPN′-G97A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q，BPN′-P52L-V68A-I111V-Y217Q，BPN′-P52L-V68A-I111V，BPN′-V68A-A92G-I111V，BPN′-P52L-V68A-G97A-I111V-Y217Q，BPN′-V68A-G97A-I111V，BPN′-G97A-I111V-Y217Q，BPN′-G97A-I111V-M124V-Y167A，BPN′-S89Y-I111V-M124V，BPN′-V68A-S89Y-I111V，BPN′-V68A-A92G-Y217Q，BPN′-I111V-Y167A-Y217Q，BPN′-G97A-I111V-Y167A-Y217Q，BPN′-G97A-I111V-M124V-Y217Q，BPN′-V68A-I111V-Y167A-Y217Q，BPN′-I111V-G128A-Y217Q，BPN′-G97A-M124V-Y217Q，BPN′-V68A-Y167A-Y217Q，BPN′-I111V-M124V-Y167A，BPN′-N62Q-G97A-I111V，BPN′-G97A-M124V-Y167A-Y217Q，BPN′-G97A-L126A-Y217Q，BPN′-V68A-I111V-Y217Q，BPN′-S89Y-M124V-Y217Q  和BPN′-L96T-G97A-Y217Q。质粒pHPLT-BPN′partial opt也由DNA 2.0构建。
如实施例2中所述挑取了转化体至微量滴定板并使其生长。就清洁性能对上述变体进行了检测，检测使用在洗涤剂组合物2中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法。蛋白质含量采用TCA检测法测定。检测如实施例1中所述进行，并计算了相对于BPN′-v3(具有等于1.0的PI值)的性能指数。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由G097A-I111V-M124V-Y217Q，G097A-I111V-Y167A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-V203Y-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q和V068A-A092G-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还提供了在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X024G，X025G，X052L，X053G，X055P，X061P，X062Q，X068A，X089Y，X092G，X096T，X097A，X101N，X104N，X111V，X124V，X126A，X128A/S，X167A，X203Y和X217Q组成的组的取代，和任选地至少一种选自由S024G，N025G，P052L，S053G，T055P，N061P，N062Q，V068A，S089Y，A092G，L096T，G097A，S101N，Y104N，I111V，M124V，L126A，G128A/S，Y167A，V203Y，Y217Q组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ IDNO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-Y217Q，G097A-G128S-Y217Q，G097A-I111V-Y217Q，I111V-G128A-Y217Q，I111V-M124V-Y167A，I111V-M124V-Y217Q，L096T-G097A-Y217Q，N062Q-G097A-I111V，S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q，S089Y-M124V-Y217Q和V068A-I111V-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ IDNO：2序列的氨基酸位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQID NO：2)更强的蛋白水解活性、BPN′更高的PI值和相对于BPN′-v3等于1.0的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由G097A-I111V-M124V，G097A-L126A-Y217Q，G097A-M124V-Y217Q，I111V-Y167A-Y217Q，M124V-Y167A-Y217Q，P052L-V068A-G097A，S089Y-I111V-M124V，V068A-A092G-G097A，V068A-A092G-I111V，V068A-G097A-I111V，V068A-S089Y-I111V和Y104N-G128A-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物2中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由G097A-M124V-Y167A-Y217Q，V068A-Y167A-Y217Q，G097A-I111V-M124V-Y167A，I111V-M124V-Y167A-Y217Q，V068A-I111V-Y167A-Y217Q，G097A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q，P052L-V068A-I111V组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQID NO：2序列的位点相对应。此类变体具有蛋白水解活性。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例5
BPN′变体的清洁性能
基于亲本BPN′的变体由DNA 2.0制备。如实施例2中所述使变体生长，并就清洁性能对它们进行了测试，测试使用在洗涤剂组合物1中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法、在洗涤剂组合物4中于16℃和pH8进行的BMI微样品检测法和在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行鸡蛋的微样品检测法。蛋白质含量采用TCA检测法测定。检测如实施例1中所述进行，并计算了相对于BPN′-v3(具有等于1.0的PI值)的性能指数。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ IDNO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-Y217Q，G097A-G128A-P210S-Y217Q，G097A-G128S-P210S-Y217Q，G097A-I111V-M124I-Y217Q，G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q，N061P-G097A-G128S-Y217Q，N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，N061P-G102A-P129S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，N061P-S078N-G097A-I111V-M1241-Y217Q，N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S 101N-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q，S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，S053-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q，S078N-G097A-G128S-Y217Q，S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由N061P-G097A-M124I-Y217Q，N061P-G097A-M124V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q，N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q，N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在洗涤剂组合物1或4中在pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X024G，X025G，X053G，X061P，X062Q，X078N，X097A，X100D/N/Q，X101N，X102A，X111V，X123A/Q/V，X124I/V，X128A/S，X129S，X210S，X217Q组成的组的取代，和任选地至少一种选自由S024G，N025G，S053G，N061P，N062Q，S078N，G097A，G100D/N/Q，S101N，G102A，I111V，N123A/Q/V，M124I/V，G128A/S，P129S，P210S和Y217Q组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由G097A-N123A-Y217Q，G097A-N123V-Y217Q，N061P-G102A-G128S-Y217Q，N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q，Y217Q，S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q和G102A-N123Q-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由N061P-G097A-G128S-Y217Q，N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-S 101N-I111V-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-Y217Q，G097A-G128A-P210S-Y217Q，G097A-G128S-P210S-Y217Q，G097A-I111V-M124I-Y217Q，G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q，N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-M124V-Y217Q，N061P-G097A-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G102A-P129S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-S 101N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q，N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q，N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q，S078N-G097A-G128S-Y217Q和S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由N061P-G097A-M124I-Y217Q，N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q，N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q和S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由G097A-N123A-Y217Q，G097A-N123V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q，N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q，Y217Q，N061P-G102A-G128S-Y217Q，S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q和G102A-N123Q-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0至约5的PI值：包含氨基酸取代的组N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含氨基酸取代N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128A-Y217Q，N061P-G102A-P129S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q，G097A-G128S-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，N061P-G097A-G128S-Y217Q，G097A-G128A-P210S-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由N061P-G097A-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q，G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-P210S-Y217Q，S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，G097A-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q，S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q，S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q，S078N-G097A-G128S-Y217Q，S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q，N061P-G097A-N123Q-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q，N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q，N061P-G097A-M124V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S 101N-I111V-Y217Q，N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，G097A-I111V-M124I-Y217Q，Y217Q，N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S 101N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-S 101N-Y217Q，N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q，N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q，G097A-N123V-Y217Q，G097A-N123A-Y217Q，G102A-N123Q-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q，S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q和N061P-G102A-G128S-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在这一在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0和至约5的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X024G，X025G，X053G，X061P，X062Q，X078N，X097A，X100D/N/Q，X101N，X102A，X111V，X123A/Q/V，X124I/V，X128A/S，X129S，X210S和X217Q组成的组的取代，和任选地至少一种选自由S024G，N025G，S053G，N061P，N062Q，S078N，G097A，G100D/N/Q，S101N，G102A，I111V，N123A/Q/V，M124I/V，G128A/S，P129S，P210S和Y217Q组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例6
BPN′变体的构建和其清洁性能
由DNA2.0制备了基于BPN′亲本的BPN′组合库，并以连接反应交付。为了高效地转化枯草芽孢杆菌，如实施例2中所述在转化之前扩增了来自连接反应混合物的DNA和使转化体生长。就清洁性能对这些变体进行了测试，测试使用在洗涤剂组合物1和组合物4中于16℃和pH 8进行的测试方法3的BMI微样品检测法，以及在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的鸡蛋微样品检测法。采用TCA检测法测定了蛋白质含量，采用AAPF检测法检测了蛋白酶活性。检测如实施例1中所述进行，并计算了相对于BPN′-v3(具有等于1.0的PI值)的性能指数。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S 101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。
在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128S-Y217Q，G097A-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q，N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-I035V-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S 101N-G128A，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-G097A-A116S-G128A和T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在这一在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X024G，X025G，X035V，X038G，X053G，X055P，X061P，X078N，X097A，X101N，X116S，X128A/S，X130G，X216Q，X217Q和X249N组成的组的取代，和任选地至少一种选自由S024G，N025G，I035V，S038G，S053G，T055P，N061P，S078N，G097A，S101N，A116S，G128A/S，S130G，Y216Q，Y217Q和S249N组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q  和T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的测试方法3的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128S-Y217Q，G097A-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-I035V-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A，S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A，S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的测试方法3的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由T055P-N061P-G097A-A116S-G128A，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有蛋白水解活性并且可具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由G097A-G128S-Y217Q，G097A-G128A-Y217Q，S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S 101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，T055P-N061P-G097A-A116S-G128A，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，S024G-I035V-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有为约0.9的PI值：包含至少一组选自由S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S 101N-G128A，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有为约0.8的PI值：包含氨基酸取代S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.8的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含氨基酸取代S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在AAPF蛋白水解检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1至约12、大于4至约12、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A，N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，T055P-N061P-G097A-A116S-G128A，S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，G097A-G128S-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q和S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′蛋白酶(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一AAPF检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。
在AAPF蛋白水解检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约1.0的PI值：包含氨基酸取代G097A-G128A-Y217Q的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ IDNO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′蛋白酶(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一AAPF检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v3等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含氨基酸取代G097A-G128A-Y217Q的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例7
BPN′-v36的位点评估库的构建和BPN′-v36变体的清洁性能
BPN′-v36的位点评估库的构建
BPN′-v36的氨基酸序列是SEQ ID NO：6的序列，而编码BPN′-v36蛋白酶变体的核酸序列是SEQ ID NO：5的序列。
可以参考SEQ ID NO：2的枯草杆菌蛋白酶BPN′氨基酸序列来表示BPN′-v36的氨基酸序列。也就是说，BPN′-v36可以表示为带有S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q六个氨基酸取代的SEQ ID NO：2的枯草杆菌蛋白酶BPN′序列。BPN′-v36氨基酸序列可以被方便地命名为BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q                          或BPN′+S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q。在本说明书的通篇中，除非另外指明，氨基酸序列的每个氨基酸位点均根据SEQ ID NO：2中显示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列中相应氨基酸位点的编号来编号，如通过将变体氨基酸序列与上述解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′氨基酸序列进行比对所确定的。
通过PCR融合，在成熟的BPN′-v36(即BPN′-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)蛋白质中每一个氨基酸位点构建了位点评估库(SEL)。
对于BPN′-v36蛋白酶中每个待突变的密码子，设计了一对部分重叠的、互补的(正向和反向诱变)引物。每一诱变引物在中央包含NNS(N＝A、C、G、或T，S＝G或C)诱变密码子，其两侧均与至少15个核苷酸侧接。使用一条正常的正向基因侧翼引物(P4974，SEQ ID NO：60)和一条诱变的NNS反向引物，或者一条正常的反向基因侧翼引物(P4976，SEQID NO：61)和一条诱变的NNS反向引物，进行了两个PCR反应，以构建在一个给定位点的库。这些PCR反应产生了两种PCR片段，一种编码突变的BPN′-v36基因(5′基因片段)的5′部分，而另一种编码突变的BPN′-v36基因(3′基因片段)的3′部分。
每个PCR扩增反应包含每种引物30pmol和100ng的BPN′-v36亲本模板DNA(质粒pHPLT-BPN′-v36，参见图4)。扩增使用Vent DNA聚合酶(NEB)进行。PCR反应(20μl)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，通过
Figure BDA00001742984401871
凝胶条带纯化试剂盒对5′和3′基因片段进行凝胶纯化，将二者混合(每种片段50ng)，然后使用引物P4973(SEQ ID NO：62)和P4950(SEQ ID NO：63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长的基因片段。PCR条件与上文所述相同，不同之处在于延伸阶段于72℃进行2分钟。通过
Figure BDA00001742984401872
凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化了全长的DNA片段，用BamHI和HindIII限制性酶对其进行了消化并与也用相同的限制性酶消化的pHPLT-BPN′partial opt载体连接。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商(GEHealthcare)的建议，通过滚环扩增扩增了连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。为了此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接下来，向每一管中加入了5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，然后在30℃孵育10小时。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至150μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中。次日，培养物被加入15％甘油后冻存，或者在MBD培养基中生长以如实施例2中所述进行生物化学分析。
BPN′-v36变体的清洁性能
就清洁性能对来自BPN′-v36SEL的蛋白质变体进行了测试，测试使用在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法和在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的鸡蛋微样品检测法。蛋白质含量采用TCA检测法测定。检测如实施例1中所述进行，并计算了相对于BPN′-v36(即BPN′-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)的性能指数。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一种选自由A116V，G160S，I111L，I115V，N109S，N117M，P005G，Q059V，T164S，Y262M，A015Q，A015S，A098E，A098N，A098S，A098T，A098V，A098Y，A114S，A114T，A116G，A116L，A116S，A116T，A116W，A133G，A133H，A133T，A133V，A137G，A137I，A137L，A137S，A137T，A138S，A216E，A216F，A216V，D099S，D181E，F261A，F261Q，G024F，G024I，G024Q，G024Y，G097S，G160T，G211L，G211V，H017F，H017W，H039V，H226A，I031V，I111V，I268V，K170R，K265R，L016Q，L016T，L135M，L209T，L209V，L233M，L257T，L257V，L267A，L267V，N025A，N025I，N025Q，N025R，N025T，N025V，N101I，N101Q，N101S，N109A，N109G，N109H，N109L，N109M，N109Q，N109T，N117Q，N184A，N184L，N184T，N184W，N212G，N212L，N212V，N243P，N252G，N252M，P005T，P014S，P040G，P040L，P040Q，P129A，P129S，P172G，P172S，P194Q，P210A，P210S，Q185F，Q185G，Q185I，Q185M，Q185N，Q185S，Q275H，R186K，S009A，S009G，S009H，S009M，S018T，S130T，S132N，S145K，S159T，S161I，S161K，S161N，S161T，S162I，S162M，S162Y，S163G，S182F，S182G，S182V，S182W，S183F，S183L，S183M，S183T，S183V，S183W，S224A，S236T，S249V，T022A，T022G，T022Q，T022V，T208V，T242S，T253N，T253S，T254A，T254S，T255L，T255S，T255V，V004A，V004P，V004W，V084C，V139C，V165M，V203F，Y021K，Y021N，Y021T，Y021V，Y167F，Y171F，Y214F，Y262F和Y262T组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q(SEQ ID NO：6)(即BPN′-v36)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36大于1至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一种选自由BPN′-v36，A001G，A001Y，A013G，A013V，A015F，A015G，A015K，A015M，A015P，A015T，A015W，A015Y，A029G，A073S，A088C，A088I，A088L，A088T，A088V，A098D，A098K，A098P，A098R，A098W，A116D，A116E，A116R，A128S，A133L，A133M，A133S，A134G，A134S，A137N，A137V，A144M，A144Q，A144S，A144T，A144V，A151C，A176S，A176T，A179S，A216G，A216L，A216P，A216Q，A216S，A216T，A216Y，A228T，A230C，A231C，A272I，A272L，A272Q，A272S，A272T，A272W，A273S，A274G，A274L，A274Q，A274T，A274V，D041E，D099G，D099N，D 120A，D120K，D120Q，D120R，D120S，D140E，D181S，D259E，E054D，E156D，E156T，E251V，F261G，F261H，F261L，F261R，F261S，F261T，F261V，F261W，G007A，G007S，G020A，G020D，G020S，G024N，G024R，G024S，G024T，G024V，G024W，G053H，G053K，G053N，G053T，G097A，G097D，G097T，G131A，G131H，G131P，G131Q，G131T，G131V，G160H，G160P，G166A，G166S，G166T，G211A，G211D，G211M，G211N，G211P，G211Q，G211R，G211W，G215A，G215N，G215V，H017L，H017M，H017T，H017V，H017Y，H039A，H039C，H039N，H226F，H226I，H226M，H226S，H226V，H226Y，I035V，I079A，I079S，I079T，I079V，I079W，I108V，I115L，I122A，I234L，I234V，K012R，K027R，K136R，K141F，K213W，K237R，K256R，K265Q，L016A，L016F，L016I，L016S，L016V，L042I，L075A，L075M，L075Q，L075V，L075Y，L082K，L082M，L082Q，L082V，L090I，L196I，L196V，L209Q，L209W，L233A，L233Q，L233V，L235I，L235K，L250I，L257A，L257H，L257Q，L257S，L257Y，L267Q，L267R，L267S，L267T，M199V，N025F，N025G，N025H，N025K，N025L，N025M，N025S，N025Y，N061F，N061H，N061P，N061S，N061T，N061V，N061W，N076G，N076W，N078S，N078T，N078V，N101A，N101H，N101L，N101T，N109K，N109R，N117A，N117E，N117H，N117K，N118G，N184G，N184H，N184I，N184S，N184V，N212A，N212F，N212I，N212K，N212P，N212Q，N212S，N212Y，N218A，N218H，N218L，N218S，N240E，N240H，N240L，N240R，N240T，N243A，N243Q，N243T，N243V，N252A，N252K，N252L，N252Q，N252R，N252S，N252T，N269Q，N269S，P014G，P014Q，P014T，P040A，P040H，P040S，P040T，P040V，P040Y，P086A，P086C，P086F，P086H，P086S，P129D，P129G，P129K，P129T，P172A，P172Q，P194A，P194G，P194L，P194M，P194S，P194V，P194Y，P210G，P210R，P210V，Q002A，Q002S，Q010A，Q010F，Q010H，Q010I，Q010L，Q010N，Q010S，Q010T，Q019A，Q019G，Q019N，Q019S，Q019T，Q019V，Q019W，Q059I，Q103L，Q103S，Q185A，Q185H，Q185L，Q185T，Q185Y，Q206P，Q206S，Q206Y，Q217I，Q217N，Q217S，Q217T，Q245K，Q275D，Q275S，Q275W，S003A，S003G，S003H，S003M，S003P，S003Q，S003T，S003V，S009I，S009L，S009P，S009T，S009W，S018A，S018G，S018I，S018L，S018M，S018N，S018P，S018V，S018W，S033T，S037Q，S037T，S037V，S038G，S038H，S038K，S038Q，S038T，S063K，S063N，S063Q，S063T，S087A，S087F，S087G，S087Q，S087T，S089L，S089M，S089N，S089Q，S089T，S089W，S130A，S130F，S130G，S130L，S130V，S145A，S145H，S145M，S145V，S159A，S159G，S159H，S159Q，S159R，S161A，S161G，S161H，S161L，S161M，S161P，S161Q，S161W，S162A，S162F，S162G，S162L，S162N，S162P，S162R，S162V，S163P，S173A，S173G，S182A，S182H，S182K，S182L，S182N，S182P，S182Q，S182T，S183A，S183G，S183H，S183Q，S188A，S188G，S188T，S188V，S191A，S204A，S204I，S204L，S204Q，S204V，S224C，S236A，S236N，S236Q，S248A，S248F，S248G，S248I，S248K，S248L，S248M，S248N，S248Q，S248T，S248V，S249A，S249C，S249H，S249Q，S249T，S249W，S249Y，S260H，S260N，S260P，S260T，T022H，T022K，T022N，T022R，T022S，T022Y，T055A，T055G，T055L，T055N，T055P，T055Q，T071S，T158H，T158S，T164N，T208C，T208L，T220S，T242N，T244A，T244G，T244H，T244I，T244Q，T244S，T244V，T244W，T253A，T253G，T253H，T253Q，T254V，T255A，T255G，T255H，T255I，T255Q，T255Y，V004G，V004N，V004R，V008A，V008C，V008M，V026I，V044I，V044L，V045H，V045K，V045L，V045M，V045Q，V045S，V045V，V045W，V045Y，V051I，V081L，V081Q，V081T，V084A，V084S，V084T，V093I，V121I，V143N，V143S，V143Y，V147C，V147I，V147L，V147T，V180I，V180L，V180T，V192A，V192S，V192T，V198I，V198L，V198M，V203H，V203I，V203L，V203N，V203Q，V203T，V203W，V203Y，V270A，V270S，V270T，W241M，W241Y，Y006G，Y006H，Y006I，Y006K，Y006L，Y006P，Y006Q，Y006T，Y006V，Y006W，Y021A，Y021D，Y021E，Y021L，Y021Q，Y021R，Y021S，Y104F，Y104I，Y214L，Y214V，Y214W，Y262A，Y262G，Y262L，Y262N，Y262S，Y262W，Y263G和Y263W组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2的序列相对应。因此，例如，本发明包括了包含取代A128S的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，例如，BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128S-Y217Q。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3为约1.0的PI值和/或相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约0.9的PI值：包含至少一种选自由A001F，A001K，A001L，A001M，A001Q，A001R，A001S，A001T，A001V，A013C，A013S，A015D，A015E，A015L，A015R，A048S，A073N，A073T，A074G，A074S，A085C，A085G，A085S，A085V，A088M，A088S，A092S，A098G，A114G，A133P，A137E，A137H，A144G，A144H，A144K，A144L，A144N，A153S，A153V，A176C，A179G，A187G，A187S，A200G，A216W，A223S，A228S，A230T，A230V，A231V，A232C，A232V，A272E，A272G，A272K，A272P，A273G，A273L，A273V，A274M，A274R，D036E，D099A，D099Q，D120E，D181A，D181G，D259A，D259G，D259Q，D259T，E156A，E156S，E251I，E251L，E251Q，E251T，F058Y，F261C，F261D，F261K，F261P，G020E，G020F，G020H，G020L，G020N，G020Q，G020R，G020T，G020Y，G024A，G024P，G053A，G053D，G053E，G053F，G053L，G053Q，G053S，G053Y，G097K，G097M，G157A，G157S，G160A，G160L，G166C，G166I，G166Q，G169A，G211K，G215H，G215L，G215S，G215T，G215W，G258S，H017I，H039S，H226L，H238N，H238Y，I011L，I011V，I031L，I079F，I079K，I079L，I079M，I079Q，I205A，I205V，I268L，I268M，K012G，K043F，K043H，K043I，K043N，K043Q，K043T，K141A，K141R，K141W，K170A，K213A，K213G，K213H，K213I，K213L，K213N，K213Q，K213R，K213S，K213T，K213V，K237A，K237H，K237I，K237L，K237N，K237S，K256A，K256G，K256H，K256M，K256P，K256Q，K256W，K265H，L016E，L042V，L075G，L075H，L075I，L075T，L082A，L082F，L082H，L082R，L082S，L082T，L090M，L135F，L196M，L209C，L209H，L209S，L233S，L235M，L235R，L235W，L257C，L257G，L267F，M050Y，M119C，M119I，M124L，N025C，N025E，N025P，N061A，N061G，N061I，N061K，N061L，N061Q，N061R，N062S，N062T，N076A，N076P，N076Q，N076S，N076T，N076V，N078G，N078H，N078K，N078P，N078Q，N078R，N101F，N117R，N117S，N118D，N118H，N118Q，N118R，N118S，N118T，N184C，N184E，N184R，N212D，N212R，N212W，N218F，N218G，N218M，N218P，N218T，N218V，N218W，N240A，N240G，N240Q，N240S，N240W，N243C，N243G，N243S，N252V，N269H，P005A，P005D，P005M，P005Q，P014A，P014M，P014R，P014V，P040F，P040R，P040W，P129E，P129R，P172E，P172K，P194H，P194R，P194W，P201A，P201G，P210L，P239K，P239R，Q002D，Q002E，Q002G，Q002I，Q002P，Q002V，Q010D，Q010R，Q019C，Q019D，Q019E，Q019H，Q019L，Q019P，Q019R，Q059A，Q059E，Q059L，Q059S，Q059T，Q103W，Q185D，Q185K，Q185R，Q185W，Q206G，Q206H，Q206L，Q206V，Q206W，Q217E，Q217F，Q217H，Q217L，Q217V，Q245M，Q271A，Q271D，Q271G，Q271L，Q271P，Q271T，Q271Y，Q275F，Q275L，Q275P，Q275R，S003D，S003F，S003K，S003R，S009K，S018D，S018R，S037A，S037G，S037K，S037L，S037P，S038M，S063A，S063F，S063G，S063M，S063R，S063Y，S087C，S087K，S087L，S087M，S087N，S087Y，S089A，S089D，S089F，S089G，S089H，S089I，S089K，S089R，S089V，S089Y，S130D，S130E，S130K，S130W，S145G，S145L，S145R，S145T，S159D，S159L，S159W，S161E，S161R，S162C，S162E，S162W，S163A，S182E，S182R，S183C，S183D，S183P，S183R，S188D，S188P，S204G，S204Y，S207G，S224G，S224T，S236C，S236G，S248D，S248H，S248R，S249E，S249L，S249R，S260A，S260G，S260K，S260Q，S260V，S260Y，T022L，T055D，T055E，T055I，T055K，T055M，T055S，T055V，T055Y，T158A，T158G，T158L，T158Q，T158V，T164K，T164Q，T208S，T244D，T244E，T244R，T253E，T253R，T253Y，T254G，T255D，T255E，T255K，T255R，V026A，V028I，V028L，V030I，V044C，V044P，V045E，V045G，V045N，V072L，V081A，V081G，V081H，V081S，V084I，V084M，V095A，V095C，V143A，V143F，V143H，V143Q，V143T，V143W，V147A，V147Q，V147S，V148I，V148L，V149C，V149I，V149L，V165L，V180A，V180C，V180M，V192C，V192F，V192I，V192Q，V192Y，V203A，V203G，V203K，V203S，V270C，V270L，V270P，W241F，Y006A，Y006M，Y006N，Y006R，Y006S，Y021C，Y091W，Y104V，Y104W，Y262C，Y262D，Y262E，Y262H，Y262I，Y262R和Y262V组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中可具有比BPN′(SEQID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的测试方法3的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一种选自由A001D，A001H，A001N，A015C，A048C，A048E，A085T，A133R，A137R，A142C，A144D，A144R，A152S，A153G，A187P，A187Q，A187T，A187V，A216R，A230S，A272R，A273H，A273T，A274H，D036N，D036S，D181H，D181T，D259N，D259P，D259S，E156G，E156H，E156L，E156Q，E156V，E251C，F189S，F189T，F189W，F189Y，F261E，G020C，G024D，G053M，G053R，G097R，G131D，G131R，G157N，G160R，G160V，G166L，G166W，G211E，G215D，G258A，G258D，G258P，I011T，I031C，I079E，I079R，I175L，I205C，K012H，K012N，K027A，K027N，K027S，K043A，K043D，K043E，K043G，K043L，K043M，K043P，K043V，K043W，K043Y，K136H，K141H，K141L，K141M，K141N，K141Q，K141T，K141V，K170G，K170S，K237T，K237V，K256D，K256S，K256T，K256V，K265N，K265S，L042F，L042M，L082E，L209A，L209E，L209G，L209R，L233G，L235V，L257D，L257E，L257P，L257R，L257W，L267E，M050L，N056D，N056S，N061C，N061D，N062A，N062H，N062L，N062V，N062Y，N076D，N076L，N076M，N078D，N078F，N101D，N101R，N118A，N212C，N212E，N218C，N218D，N218E，N252D，N252E，P014F，P014K，P057A，P057W，P172R，P194E，P201T，P210E，Q059C，Q059D，Q059R，Q185E，Q206D，Q217A，Q217K，Q217R，Q245A，Q245D，Q245E，Q245H，Q245R，Q271E，Q271F，Q271R，Q271W，Q275G，Q275I，R186I，R186L，R186V，R186W，S003E，S009C，S009E，S018C，S037D，S037E，S037H，S037R，S037Y，S038D，S038P，S038R，S038Y，S063L，S087D，S087R，S089C，S089E，S130C，S130R，S145D，S159C，S159P，S161C，S173T，S182C，S188E，S188F，S188K，S188L，S188R，S188W，S190A，S190G，S190T，S204R，S236D，S236E，S248C，S248E，S260C，S260E，S260R，T022P，T055C，T055W，T071A，T158D，T158E，T158P，T158R，T158Y，T164R，T242D，T242G，T255C，V004E，V004T，V045C，V045D，V045R，V045T，V051H，V081R，V143C，V143E，V143G，V192G，V203C，V203D，V203E，V203M，V203R，V270G，W241L，Y214H，Y214Q，A001E，A133E，A187L，A187N，A216C，A216H，A273Q，D099H，D259H，E156C，E195G，F189H，G131C，G146A，G166V，G215C，G215E，I107L，K012A，K012S，K012T，K043C，K170C，K256C，K256E，K265G，K265Y，L233E，M222F，M222S，N062Q，N076E，N078E，N184P，N218R，P005V，P014D，Q002K，Q002L，Q002R，Q010W，Q271C，R186H，S049C，S063C，S063D，S105T，S188C，S190C，S204E，T055R，T164G，V004D，V044T，V045I，V165C，V180S，Y006C，Y006D，Y006E，Y104T，A001C，A187C，A230G，A273D，A273P，D036Q，F189G，F189L，F189R，G157T，G178A，I031F，I111M，K012F，K012L，K027T，K043R，K136G，K141G，K170Q，M222A，M222L，N062R，N117G，N269C，P005W，P129V，P239A，P239H，P239T，Q059W，Q217G，Q275A，R186A，S191G，T164A，T220A，A001P，A187F，A187W，A273R，D041C，D060G，D197T，F189A，G046D，G157P，K012C，K012E，K012W，L042C，M222T，N062C，P239G，P239N，Q217C，R186M，S049T，S089P，S125A，S173V和V044A组成的组的氨基酸取代的BPN′-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测(测试方法3)中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一种选自由A216E，L090I，A098R，A098W，A098Y，A116G，A116R，A116S，A133M，I107L，I115V，M124L，N101I，N109H，N109S，N109T，N117R，P005G，Q185L，S089V，V095A，A015Y，A029G，A098D，A098E，A098G，A098N，A098S，A098T，A098V，A114S，A114T，A116E，A116L，A116T，A116V，A133H，A133L，A133S，A137G，A137I，A137L，A137S，A137V，A138S，A144S，A144V，A176S，A176T，A187T，A216F，A216P，A216Q，A216R，A216S，A216T，A216V，A216Y，D041E，D120A，D120E，D120Q，D120R，D120S，D181S，G020A，G020S，G024A，G097A，G097D，G097S，G131Q，G160S，G166I，G211L，G215N，H039N，H238N，I111L，I111V，I122A，L075I，L075Q，L135M，L209T，L209V，L233V，L235M，L235R，L257A，M119I，N025A，N025G，N025T，N061K，N101F，N101H，N101L，N101Q，N101R，N101S，N101T，N109A，N109G，N109K，N109L，N117E，N117H，N117K，N117S，N212G，N212S，N218F，N218G，N218H，N218L，N218S，N218W，N240Q，N252M，N252R，N252S，P005T，P040A，P040G，P040T，P129D，P129S，P194S，P210R，Q019R，Q019W，Q103L，Q103W，Q185A，Q185G，Q185M，Q185R，Q185T，Q206G，Q206Y，Q217A，Q217E，Q217R，Q217S，Q217T，S003Q，S009H，S018M，S033T，S130A，S130F，S130G，S130T，S130V，S145T，S159A，S161N，S161T，S162V，S162Y，S182L，S182W，S183F，S183L，S183V，S183W，S188K，S188W，S236Q，S236T，S248L，T022H，T022K，T208C，T253H，T255V，V044I，V121I，V139C，V143H，V143Q，V143T，V143W，V143Y，Y006K，Y021A，Y104W，A001F，A001G，A001H，A001K，A001L，A001Q，A001S，A001Y，A013V，A015G，A015K，A015R，A015S，A015T，A015W，A048S，A073N，A073S，A092S，A098K，A098P，A116D，A116W，A128S，A133P，A133T，A133V，A134G，A134S，A137H，A137N，A137T，A144D，A144K，A144L，A144M，A144N，A144R，A179G，A179S，A187V，A216G，A216L，A216W，A223S，A230C，A272K，A272L，A272P，A272S，A272T，A272W，A273G，A273S，A274G，A274M，A274T，D120K，D140E，D181A，D181E，D181G，D181H，D181T，D259E，D259N，D259Q，E054D，E156D，E156T，E251L，E251T，E251V，F058Y，F189W，F261K，F261Q，F261R，G007A，G007S，G020F，G020H，G020N，G020Q，G020T，G020Y，G024F，G024Q，G024R，G024T，G024V，G024W，G024Y，G053T，G097K，G097M，G097R，G097T，G131A，G131H，G131P，G131R，G131T，G131V，G160H，G160T，G166C，G166Q，G166S，G166T，G211A，G211D，G211K，G211M，G211N，G211Q，G211R，G211V，G211W，G215S，G215T，G215W，H017T，H017W，H017Y，H039V，H226A，H226F，H226I，H226L，H226M，H226V，I035V，I079A，I079S，I108V，I205V，I234L，I234V，I268V，K012S，K043P，K136H，K136R，K141A，K141F，K141T，K141W，K170A，K170G，K170R，K213A，K213R，K213S，K237A，K237H，K237L，K237S，K237V，K256A，K256G，K256H，K256M，K256P，K256Q，K256R，L016A，L016Q，L016T，L016V，L042V，L075M，L075T，L082M，L082V，L135F，L196I，L209H，L209Q，L209R，L209S，L209W，L233A，L233M，L233Q，L235I，L235K，L250I，L257S，L257T，L257V，L267A，L267Q，L267T，L267V，M119C，M199V，N025C，N025E，N025F，N025I，N025K，N025L，N025M，N025Q，N025V，N025Y，N061F，N061P，N061S，N061T，N076G，N078S，N101A，N109M，N109Q，N109R，N117A，N117M，N117Q，N118D，N118G，N118H，N118Q，N118R，N118S，N184A，N184C，N184G，N184L，N184R，N184S，N184T，N184V，N184W，N212C，N212F，N212I，N212K，N212L，N212P，N212Q，N212R，N212V，N212W，N212Y，N218A，N218P，N218T，N240A，N240E，N240G，N240H，N240L，N240R，N240S，N240T，N243C，N243Q，N243T，N243V，N252A，N252G，N252K，N252Q，P014G，P014Q，P014R，P014S，P014T，P040F，P040L，P040Q，P040S，P040V，P086C，P086H，P086S，P129A，P129E，P129G，P129K，P129R，P172A，P172K，P172Q，P172S，P194A，P194G，P194H，P194L，P194M，P194Q，P194R，P194V，P194W，P194Y，P210A，P210G，P210L，P210S，P239K，P239R，Q002A，Q002S，Q010A，Q010N，Q010R，Q010T，Q019A，Q019C，Q019D，Q019G，Q019S，Q019T，Q019V，Q059I，Q059V，Q103S，Q185F，Q185H，Q185I，Q185K，Q185N，Q185S，Q185Y，Q206H，Q206L，Q206P，Q206W，Q217F，Q217H，Q217I，Q217K，Q217L，Q217N，Q217V，Q271G，Q271R，Q271T，Q275F，Q275P，Q275R，R186A，R186I，R186K，S003A，S003F，S003G，S003H，S003K，S003R，S003T，S009T，S018N，S018T，S037G，S037T，S037V，S038G，S038Q，S063N，S063Q，S063T，S089M，S089N，S130K，S130L，S130R，S130W，S132N，S145G，S145K，S145M，S145R，S145V，S159C，S159H，S159L，S159Q，S159R，S159T，S159W，S161A，S161C，S161G，S161H，S161I，S161K，S161P，S161Q，S161R，S162F，S162G，S162I，S162L，S162M，S162N，S162P，S162R，S163G，S173A，S173G，S182F，S182G，S182K，S182N，S182Q，S182V，S183A，S183M，S183Q，S183R，S183T，S188A，S188F，S188G，S188P，S188R，S188T，S188V，S190C，S204A，S204G，S204I，S204L，S204Q，S204R，S204V，S207G，S224A，S224T，S236C，S236D，S236E，S236G，S236N，S248A，S248F，S248K，S248M，S248T，S249A，S249R，S249T，S249V，S249W，S249Y，S260G，S260H，S260K，S260N，T022A，T022G，T022Q，T022S，T022V，T022Y，T055A，T055K，T158A，T158S，T208L，T208S，T208V，T220S，T242D，T242N，T242S，T244E，T244G，T244I，T244R，T244V，T244W，T253A，T253G，T253N，T253S，T254S，T254V，T255H，T255I，T255K，T255L，T255Q，T255R，T255S，T255Y，V004A，V004N，V004P，V004W，V008A，V008M，V026I，V045S，V045W，V051I，V081Q，V081T，V084C，V093I，V095C，V143A，V143E，V143F，V143N，V143S，V147I，V147L，V147S，V147T，V148I，V149C，V149I，V165M，V180A，V180C，V180I，V180L，V180T，V192A，V192C，V192I，V192S，V192T，V192Y，V198L，V203A，V203F，V203K，V203L，V203M，V203N，V203Y，W241Y，Y006A，Y006G，Y006H，Y006L，Y006N，Y006P，Y006Q，Y006T，Y021E，Y021K，Y021L，Y021N，Y021Q，Y021R，Y021S，Y021T，Y104F，Y104I，Y104V，Y171F，Y214F，Y214L，Y214W，Y262F和Y262S组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，比BPN′-v3的PI值更高的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一种选自由BPN′-v36，A001D，A001M，A001N，A001R，A001T，A001V，A013C，A013G，A013S，A015D，A015F，A015L，A015M，A015P，A015Q，A074G，A074S，A085S，A085T，A085V，A088C，A088L，A088S，A088T，A088V，A133E，A133G，A133R，A137E，A144G，A144H，A144Q，A144T，A151C，A152S，A153G，A153S，A153V，A176C，A187G，A187Q，A187S，A200G，A228S，A228T，A230T，A230V，A231C，A231V，A232C，A232V，A272E，A272G，A272I，A272Q，A272R，A273L，A273V，A274L，A274Q，A274R，A274V，D036E，D259A，D259G，D259P，D259S，D259T，E156A，E156S，E156V，E195G，E251C，E251I，E251Q，F189Y，F261A，F261G，F261H，F261L，F261P，F261S，F261T，F261V，F261W，G020C，G020D，G020E，G020L，G020R，G024D，G024I，G024N，G024P，G024S，G053A，G053D，G053F，G053H，G053K，G053N，G053S，G053Y，G157A，G157S，G160A，G160L，G160P，G160R，G166A，G166L，G166V，G166W，G169A，G211E，G211P，G215A，G215D，G215E，G215H，G215V，G258D，G258S，H017F，H017I，H017L，H017M，H017V，H039C，H226S，H226Y，I011T，I011V，I031C，I031L，I031V，I079F，I079K，I079L，I079M，I079Q，I079R，I079T，I079V，I079W，I115L，I205A，I205C，I268L，K012R，K012T，K027R，K043A，K043E，K043F，K043H，K043I，K043M，K043N，K043Q，K043T，K043V，K043Y，K141H，K141Q，K141V，K170S，K213G，K213H，K213I，K213L，K213N，K213Q，K213T，K213W，K237I，K237N，K237R，K237T，K256C，K256E，K256S，K256T，K256V，K256W，K265H，K265R，L016E，L016F，L016I，L016S，L042I，L042M，L075A，L075H，L075Y，L082K，L082Q，L082T，L196M，L196V，L209A，L209C，L209E，L209G，L235W，L257C，L257H，L257Q，L257Y，L267E，L267F，L267R，L267S，M050Y，N025H，N025P，N025S，N056D，N061A，N061C，N061D，N061G，N061H，N061I，N061L，N061Q，N061R，N061V，N061W，N062A，N062S，N062V，N076A，N076E，N076L，N076M，N076Q，N076S，N076T，N076W，N078G，N078H，N078K，N078P，N078Q，N078T，N101D，N118A，N118T，N184E，N184H，N184I，N212A，N212D，N212E，N218C，N218D，N218E，N218M，N218R，N218V，N240W，N243A，N243G，N243P，N243S，N252D，N252E，N252L，N252T，N252V，N269S，P005A，P005D，P005M，P005Q，P014A，P014D，P014F，P014M，P014V，P040H，P040R，P040W，P040Y，P086A，P129T，P172E，P172G，P172R，P194E，P201A，P201G，P210E，P210V，Q002E，Q002G，Q010D，Q010F，Q010H，Q010I，Q010L，Q010S，Q019E，Q019H，Q019N，Q059A，Q059L，Q059R，Q059S，Q059T，Q185D，Q185E，Q206D，Q206S，Q206V，Q217G，Q245D，Q245E，Q245K，Q245M，Q245R，Q271A，Q271F，Q271P，Q271Y，Q275D，Q275H，Q275I，Q275L，Q275S，Q275W，R186H，R186L，R186V，R186W，S003D，S003E，S003M，S003P，S003V，S009A，S009E，S009G，S009I，S009K，S009M，S009P，S009W，S018A，S018G，S018I，S018L，S018P，S018R，S018V，S018W，S037A，S037D，S037Q，S037R，S037Y，S038D，S038H，S038K，S038M，S038R，S038T，S063A，S063G，S063K，S063M，S063R，S087A，S087D，S087F，S087G，S087Q，S087T，S089A，S089C，S089H，S089I，S089K，S089L，S089Q，S089R，S089T，S089Y，S130D，S130E，S145A，S145H，S145L，S159G，S161E，S161L，S161M，S161W，S162A，S162C，S162E，S162W，S163P，S173T，S182A，S182C，S182E，S182H，S182R，S182T，S183C，S183D，S183G，S183H，S188C，S188D，S188E，S188L，S190T，S191A，S204Y，S224C，S236A，S248C，S248D，S248G，S248I，S248N，S248Q，S248R，S248V，S249C，S249H，S249L，S249Q，S260A，S260C，S260E，S260P，S260Q，S260R，S260T，T022L，T022N，T022R，T055C，T055D，T055G，T055I，T055L，T055N，T055Q，T055S，T055V，T055Y，T071A，T071S，T158G，T158H，T158L，T158P，T158Q，T158R，T158V，T158Y，T164N，T164S，T244A，T244D，T244H，T244Q，T244S，T253Q，T253R，T253Y，T254A，T254G，T255A，T255D，T255E，V004E，V004G，V004R，V008C，V026A，V028L，V030I，V044C，V045D，V045E，V045H，V045M，V045Q，V045Y，V072L，V081L，V081S，V084A，V084I，V084M，V084T，V143C，V147C，V147Q，V149L，V165L，V180M，V192F，V192G，V192Q，V198I，V198M，V203C，V203E，V203H，V203I，V203Q，V203R，V203T，V203W，V270A，V270L，V270T，W241F，W241M，Y006C，Y006D，Y006E，Y006I，Y006M，Y006R，Y006S，Y006V，Y006W，Y021C，Y021D，Y021V，Y091W，Y167F，Y214V，Y262A，Y262C，Y262I，Y262M，Y262R，Y262T，Y262V和Y262W组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3为约1.0的PI值和/或相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约0.9的PI值：包含至少一种选自由A001E，A015C，A015E，A048C，A048E，A073T，A085C，A085G，A088I，A088M，A114G，A137R，A187L，A187N，A187P，A187W，A216C，A230S，A273D，A273H，A273T，D036N，D099N，D259H，E156C，E156G，E156H，E156Q，F189H，F189R，F189S，F189T，F261C，F261D，F261E，G053E，G053M，G053Q，G131C，G131D，G157N，G160V，G215C，G215L，G258A，H039A，I011L，I079E，I268M，K012A，K012G，K012H，K012N，K027N，K043C，K043D，K043G，K043L，K043W，K136G，K141G，K141L，K141M，K141N，K141R，K170C，K170Q，K213V，K256D，K265G，K265N，K265Q，K265S，L082A，L082F，L082H，L082R，L082S，L090M，L233S，L235V，L257E，L257G，L257R，L257W，M222S，N025R，N062H，N062T，N076D，N076P，N078D，N078E，N078F，N078R，N078V，N269H，N269Q，P014K，P057A，P086F，P201T，Q002D，Q002I，Q002P，Q002V，Q019L，Q019P，Q059C，Q059D，Q059E，Q185W，Q271C，Q271D，Q271E，Q271L，Q271W，Q275G，R186M，S009C，S009L，S018D，S037E，S037H，S037K，S037L，S037P，S038P，S063C，S063D，S063F，S063L，S063Y，S087L，S087N，S087R，S087Y，S089D，S089F，S089G，S089W，S105T，S125A，S130C，S159D，S159P，S163A，S182P，S183P，S190A，S 190G，S204E，S224G，S248E，S248H，S249E，S260V，S260Y，T055M，T055R，T055W，T158D，T158E，T164G，T164K，T164Q，T220A，T242G，T253E，T255C，T255G，V004D，V044L，V044P，V045C，V045G，V045L，V045N，V045R，V045V，V081A，V081G，V081H，V084S，V147A，V203D，V203G，V270C，V270P，V270S，W241L，Y104T，Y214Q，Y262D，Y262E，Y262G，Y262H，Y262L，Y262N，Y263G和Y263W组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一种选自由A001C，A142C，A187C，A216H，A273Q，A274H，D036Q，D036S，D099S，D197T，E156L，F189A，F189L，G053L，G053R，G157P，G178A，G258P，H039S，H238Y，K012C，K012E，K012L，K012W，K136E，K265Y，L075G，L075V，L082E，L126W，L257D，L257P，M050L，M222A，M222F，M222L，N056S，N062C，N062L，N062Y，N269C，P057W，Q002K，Q002L，Q217C，Q245A，Q245H，S018C，S038Y，S049C，S087C，S087K，S145D，S191G，T022P，T055E，T164A，T164R，V045K，V051H，V081R，V143G，V148L，V180S，V203S，V270G，Y214H，A187F，A273P，F189G，G046D，G146A，G157T，I031F，I175L，K012F，K027T，L042F，L233E，L233G，M222T，N062R，N184P，P005V，P005W，P129V，P239N，P239T，Q010W，Q059W，Q275A，V004T，V165C，A128H，A230G，D041C，H067T，K027S，K043R，L090T，N062Q，N117G，P225G，P225S，P239G，P239H，Q002R，S089E，V044A，V045I，A001P，A273R，D041N，D099A，D099H，D099Q，F058G，I111M，L042C，N118L，P239A，S049N，S089P，S173V，T242P，V044T和V045T组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例8
基于BPN′-v36亲本的附加的组合变体的清洁性能
由DNA 2.0制备并提供了基于亲本BPN′-v36(BPN′-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)的附加的组合变体。就这些变体的清洁性能对它们进行了测试，测试使用在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法、在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 7进行的BMI微样品检测法、在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的鸡蛋微样品检测法和在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的禾草微样品检测法。采用TCA检测法测定了蛋白质含量，采用AAPF检测法检测了蛋白酶活性。所有检测均如实施例1中所述进行，并计算了相对于BPN′-v36的性能指数。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由A088T-L257G，A116T-A128S，N061S-N109G-A128S-N243V-S260P，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V，S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R和S162G-K256R组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A088T，A088T-A116T，A088T-G131H，A088T-K256R，A088T-N109G，A088T-N243V，A088T-Q103H，A088T-S 162G，A088T-S248N，A088T-S249A，A088T-T158S，A116T，A116T-G131H，A116T-K256R，A116T-L257G，A116T-N243V，A116T-S 162G，A116T-S248N，A116T-S249A，A116T-T158S，A128S-K256R，A128S-L257G，A128S-N243V-S248N-K256R，A128S-S162G，A128S-S248N，A128S-S249A，A128S-T158S，G024E-A116T，G024E-K256R，G024E-L257G，G024E-N109G，G024E-N243V，G024E-T158S，G131H，G131H-K256R，G131H-L257G，G131H-N243V-K256R，G131H-S162G，G131H-S248N，G131H-S249A，G131H-T158S，K043Y-A088T，K043Y-K256R，K043Y-N243V，K256R，K256R-L257G，L257G，N061G-N109G-N243V，N061P-N109G-G131H-N243V，N061P-N109G-N243V，N061S-A128S-N243V-S260P，N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P，N061S-N109G-A128S-S260P，N061S-N109G-N243V，N076D-K256R，N076D-L257G，N076D-N109G，N076D-T158S，N109A-A128S-N243V-K256R，N109G，N109G-A116T，N109G-A128S，N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-A128S-N243V-S248A-K256R，N109G-A128S-N243V-S248N，N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-S248N-K256R，N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H，N109G-K256R，N109G-L257G，N109G-N218S，N109G-N243P-S248A-K256R，N109G-N243P-S248N-K256R，N109G-N243V，N109G-N243V-K256R，N109G-N243V-S248A-K256R，N109G-N243V-S248N，N109G-N243V-S248N-K256R，N109G-S 162G，N109G-S248N-K256R，N109G-S249A，N109G-T158S，N109Q-A128S-N243V-K256R，N109S-A128S-N243V-K256R，N218S-N243V，N243V，N243V-K256R，N243V-L257G，N243V-S248N，N243V-S248N-K256R，N243V-S249A，P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，Q103H-A116T，Q103H-A128S，Q103H-G131H，Q103H-K256R，Q103H-L257G，Q103H-N109G，Q103H-N218S，Q103H-N243V，Q103H-S162G，Q103H-S248N，Q103H-S249A，Q103H-T158S，S009T-A128S-K141R-N243V，S009T-N109G-A128S-K141R，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R，S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V，S018T-Y021N-A128S-N243V，S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P，S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P，S018T-Y021N-N109G-A128S，S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V，S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R，S033T-N243V，S033T-Q103H，S033T-T158S，S063G，S063G-A088T，S063G-A128S，S063G-K256R，S063G-L257G，S063G-N076D，S063G-N109G，S063G-Q103H，S063G-S162G，S063G-S248N，S063G-T158S，S162G，S162G-L257G，S162G-N243V，S162G-S248N，S248N，S248N-L257G，S249A，T158S，T158S-L257G，T158S-N218S，T158S-N243V，T158S-S248N和T158S-S249A组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测(测试方法3)中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测(测试方法3)中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由A001E-A088T，A001E-A116T，A001E-A128S-G131H-N243V，A001E-G131H-G169A-N243V，A001E-K256R，A001E-N109G，A001E-N243V，A001E-S033T，A001E-S033T-N109G-N218S，A001E-S033T-N109G-N243V，A001E-S162G，A001E-T158S，A088T-A128S，A088T-G169A，A088T-N218S，A088T-Q206D，A116T-G169A，A116T-N218S，A116T-Q206D，A128S，A128S-G131H，A128S-G169A，A128S-N218S，A128S-N243V，A128S-Q206D，G024E，G024E-A088T，G024E-A128S，G024E-G131H，G024E-K043Y，G024E-N218S，G024E-Q103H，G024E-S033T，G024E-S063G，G024E-S162G，G024E-S248N，G024E-S249A，G131H-G169A，G131H-N218S，G131H-N243V，G131H-Q206D，G169A，G169A-K256R，G169A-L257G，G169A-N218S，G169A-N243V，G169A-Q206D，G169A-S248N，G169A-S249A，K043Y，K043Y-A116T，K043Y-A128S，K043Y-G131H，K043Y-G169A，K043Y-L257G，K043Y-N109G，K043Y-N218S，K043Y-Q103H，K043Y-S063G，K043Y-S162G，K043Y-S248N，K043Y-S249A，K043Y-T158S，N076D，N076D-A088T，N076D-A128S，N076D-G131H，N076D-N218S，N076D-N243V，N076D-Q103H，N076D-S 162G，N076D-S248N，N076D-S249A，N109G-G169A，N109G-Q206D，N109G-S248N，N218S，N218S-K256R，N218S-L257G，N218S-S248N，N218S-S249A，P040E-N109G-A128S-G131H，Q103H，Q103H-G169A，Q206D，Q206D-K256R，Q206D-L257G，Q206D-N218S，Q206D-N243V，Q206D-S248N，Q206D-S249A，S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T，S033T-A088T，S033T-A116T，S033T-A128S，S033T-A128S-G131H-N243P，S033T-G131H，S033T-K043Y，S033T-K256R，S033T-L257G，S033T-N076D，S033T-N076D-A128S-N218S，S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R，S033T-N109G，S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T-N218S，S033T-P040E-Q103H-N109G，S033T-Q103H-A128S-G131H，S033T-Q206D，S033T-S063G，S033T-S162G，S033T-S248N，S033T-S249A，S063G-A116T，S063G-G131H，S063G-G169A，S063G-N109G-A128S-G131H，S063G-N218S，S063G-N243V，S063G-Q206D，S063G-S249A，S162G-G169A，S162G-N218S，S162G-Q206D，S162G-S249A，S248N-K256R，S248N-S249A，S249A-K256R，S249A-L257G，T158S-G169A，T158S-K256R，T158S-Q206D和T158S-S162G组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测(测试方法3)中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A001E，A001E-A128S，A001E-G024E，A001E-G131H，A001E-G169A，A001E-L257G，A001E-N218S，A001E-Q103H，A001E-S063G，A001E-S248N，A001E-S249A，G024E-N076D，K043Y-N076D，K043Y-Q206D，N076D-A116T，N076D-G169A，N076D-Q206D，Q103H-Q206D，S033T-G169A，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V，A001E-K043Y，A001E-N076D，A001E-N076D-N109G-A128S，A001E-Q206D和G024E-Q206D组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 7和16℃进行的BMI微样品清洁检测(测试方法3)中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由A116T，A088T-N243V，G024E-A116T，K043Y，N076D-A116T，N218S-S248N，S033T-N243V，S033T-S063G，S248N-L257G，A001E-S249A，A088T-A116T，A088T-A128S，A088T-G131H，A088T-L257G，A088T-N109G，A088T-S248N，A088T-S249A，A116T-N243V，A116T-T158S，A128S，A128S-K256R，A128S-L257G，A128S-N243V，A128S-S248N，A128S-T158S，G024E-A088T，G024E-A128S，G024E-G131H，G024E-K256R，G024E-L257G，G024E-N218S，G024E-N243V，G024E-S162G，G024E-S249A，G024E-T158S，G131H，G131H-K256R，G131H-S249A，K043Y-A088T，K043Y-A116T，K256R，N076D-K256R，N109G，N109G-A116T，N109G-A128S，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-G131H，N109G-K256R，N109G-L257G，N109G-N218S，N109G-N243V，N109G-S248N，N218S-L257G，N243V，N243V-K256R，N243V-L257G，N243V-S248N，N243V-S249A，Q103H-A128S，Q103H-G131H，Q103H-K256R，Q103H-L257G，Q103H-N243V，Q103H-S248N，Q103H-S249A，Q103H-T158S，Q206D-N243V，S033T-A128S，S033T-K256R，S033T-N076D，S033T-N218S，S033T-S248N，S033T-T158S，S063G-A128S，S063G-K256R，S063G-N243V，S063G-S162G，S063G-T158S，S162G-K256R，S248N-K256R，S249A，T158S-N243V和T158S-S249A组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 7和16℃进行的BMI微样品清洁检测(测试方法3)中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A001E-A128S，A001E-G131H，A001E-K256R，A001E-N218S，A001E-N243V，A001E-S033T，A001E-S063G，A001E-S162G，A088T，A088T-K256R，A088T-N218S，A088T-Q103H，A088T-S162G，A088T-T158S，A116T-A128S，A116T-G131H，A116T-K256R，A116T-L257G，A116T-S162G，A116T-S248N，A116T-S249A，A128S-G169A，A128S-N218S，A128S-S162G，A128S-S249A，G024E，G024E-N109G，G024E-Q103H，G024E-S033T，G024E-S063G，G024E-S248N，G131H-L257G，G131H-N243V，G131H-S162G，G131H-T158S，G169A，G169A-L257G，G169A-S248N，K043Y-A128S，K043Y-G131H，K043Y-K256R，K043Y-L257G，K043Y-N109G，K043Y-N243V，K043Y-Q103H，K043Y-S063G，K043Y-S162G，K043Y-S248N，K043Y-S249A，K043Y-T158S，K256R-L257G，L257G，N061G-N109G-N243V，N061S-A128S-N243V-S260P，N061S-N109G-A128S-N243V-S260P，N061S-N109G-A128S-S260P，N076D-A088T，N076D-A128S，N076D-G169A，N076D-N218S，N076D-N243V，N076D-S162G，N076D-S248N，N076D-T158S，N109A-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A-K256R，N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-Q206D，N109G-S162G，N109G-S249A，N109G-T158S，N109Q-A128S-N243V-K256R，N109S-A128S-N243V-K256R，N218S，N218S-K256R，N218S-N243V，P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，Q103H，Q103H-A116T，Q103H-G169A，Q103H-N109G，Q103H-N218S，Q103H-S162G，S009T-A128S-K141R-N243V，S009T-N109G-A128S-K141R，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V，S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R，S018T-Y021N-N109G-A128S，S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V，S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T-A088T，S033T-A116T，S033T-G131H，S033T-K043Y，S033T-L257G，S033T-N109G，S033T-Q103H，S033T-Q206D，S033T-S 162G，S033T-S249A，S063G，S063G-A088T，S063G-A116T，S063G-L257G，S063G-N076D，S063G-N109G，S063G-N218S，S063G-Q103H，S063G-S248N，S063G-S249A，S162G，S162G-G169A，S162G-L257G，S162G-N218S，S162G-N243V，S162G-S248N，S162G-S249A，S248N，S248N-S249A，S249A-K256R，S249A-L257G，T158S，T158S-G169A，T158S-K256R，T158S-L257G，T158S-N218S和T158S-S248N组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′蛋白酶(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 7和16℃进行的BMI微样品清洁检测(测试方法3)中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由A001E，A001E-A088T，A001E-A116T，A001E-G169A，A001E-L257G，A001E-N109G，A001E-S033T-N109G-N243V，A001E-T158S，A088T-G169A，A088T-Q206D，A116T-N218S，A128S-G131H，A128S-N243V-S248N-K256R，A128S-Q206D，G024E-K043Y，G024E-N076D，G024E-Q206D，G131H-G169A，G131H-N218S，G131H-N243V-K256R，G131H-Q206D，G131H-S248N，G169A-K256R，G169A-N218S，G169A-N243V，G169A-Q206D，K043Y-N076D，K043Y-N218S，N061P-N109G-G131H-N243V，N061P-N109G-N243V，N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P，N061S-N109G-N243V，N076D，N076D-G131H，N076D-L257G，N076D-N109G，N076D-Q103H，N076D-S249A，N109G-A128S-N243V-S248N，N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-S248N-K256R，N109G-N243P-S248A-K256R，N109G-N243P-S248N-K256R，N109G-N243V-K256R，N109G-N243V-S248A-K256R，N109G-N243V-S248N，N109G-N243V-S248N-K256R，N109G-S248N-K256R，N218S-S249A，N243V-S248N-K256R，Q103H-Q206D，Q206D，Q206D-K256R，Q206D-N218S，Q206D-S248N，Q206D-S249A，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R，S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V，S018T-Y021N-A128S-N243V，S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P，S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P，S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T，S033T-G169A，S033T-N076D-A128S-N218S，S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R，S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R，S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S063G-G131H，S063G-G169A，S162G-Q206D和T158S-S162G组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 7和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A001E-A128S-G131H-N243V，A001E-G024E，A001E-G131H-G169A-N243V，A001E-Q103H，A001E-S033T-N109G-N218S，A001E-S248N，A116T-G169A，A116T-Q206D，G169A-S249A，K043Y-G169A，N109G-G169A，P040E-N109G-A128S-G131H，Q206D-L257G，S033T-A128S-G131H-N243P，S033T-A128S-G131H-N243V，S033T-P040E-Q103H-N109G，S033T-Q103H-A128S-G131H，S063G-N109G-A128S-G131H，S063G-Q206D，T158S-Q206D，A001E-K043Y，A001E-N076D，A001E-Q206D，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V，A001E-N076D-N109G-A128S，K043Y-Q206D和N076D-Q206D组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由A088T-L257G，G024E-K256R，G024E-L257G，N109G-A116T，N109G-L257G，N243V-K256R，S033T-N109G，S033T-T158S，S063G-L257G，A001E-L257G，A088T-A128S，A088T-G169A，A088T-K256R，A088T-N109G，A088T-N218S，A088T-N243V，A088T-S248N，A088T-T158S，A116T，A116T-A128S，A116T-G131H，A116T-K256R，A116T-L257G，A116T-N218S，A116T-S162G，A116T-T158S，A128S，A128S-G169A，A128S-K256R，A128S-L257G，A128S-N218S，G024E，G024E-A128S，G024E-G131H，G024E-N109G，G024E-N243V，G024E-S033T，G024E-S063G，G024E-S248N，G024E-S249A，G024E-T158S，G131H，G131H-G169A，G131H-K256R，G131H-N218S，G131H-S249A，G169A，G169A-L257G，G169A-N243V，K043Y-A088T，K043Y-N109G，K256R，K256R-L257G，N061G-N109G-N243V，N076D-N109G，N109G，N109G-A128S，N109G-G131H，N109G-K256R，N109G-N218S，N109G-S162G，N109G-S248N，N109G-S249A，N109G-T158S，N218S，N218S-K256R，N218S-L257G，N218S-S248N，N243V，N243V-L257G，N243V-S248N，N243V-S249A，P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，Q103H-K256R，Q103H-L257G，Q103H-N109G，S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R，S033T-A088T，S033T-A116T，S033T-A128S，S033T-G131H，S033T-K043Y，S033T-K256R，S033T-L257G，S033T-N076D，S033T-N218S，S033T-N243V，S033T-Q103H，S033T-S063G，S033T-S162G，S033T-S248N，S033T-S249A，S063G，S063G-A088T，S063G-A116T，S063G-A128S，S063G-G131H，S063G-K256R，S063G-N109G，S063G-N218S，S063G-N243V，S063G-S248N，S063G-S249A，S063G-T158S，S162G-K256R，S162G-N218S，S162G-N243V，S162G-S248N，S162G-S249A，S248N，S249A，S249A-L257G，T158S，T158S-L257G和T158S-N243V组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A001E，A001E-A116T，A001E-G131H，A001E-G169A，A001E-K256R，A001E-N109G，A001E-S033T-N109G-N243V，A001E-S063G，A001E-S248N，A001E-S249A，A001E-T158S，A088T，A088T-A116T，A088T-G131H，A088T-Q103H，A088T-Q206D，A088T-S162G，A088T-S249A，A116T-G169A，A116T-N243V，A116T-S248N，A116T-S249A，A128S-G131H，A128S-N243V，A128S-S162G，A128S-S248N，A128S-S249A，A128S-T158S，G024E-A088T，G024E-A116T，G024E-K043Y，G024E-N076D，G024E-N218S，G024E-Q103H，G024E-S162G，G131H-L257G，G131H-N243V，G131H-N243V-K256R，G131H-S162G，G131H-S248N，G131H-T158S，G169A-K256R，G169A-N218S，G169A-Q206D，G169A-S248N，G169A-S249A，K043Y，K043Y-A116T，K043Y-A128S，K043Y-G169A，K043Y-K256R，K043Y-L257G，K043Y-N076D，K043Y-N218S，K043Y-N243V，K043Y-S063G，K043Y-S248N，K043Y-S249A，K043Y-T158S，L257G，N061P-N109G-G131H-N243V，N061P-N109G-N243V，N061S-A128S-N243V-S260P，N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P，N061S-N109G-A128S-S260P，N061S-N109G-N243V，N076D，N076D-A088T，N076D-A116T，N076D-G131H，N076D-G169A，N076D-K256R，N076D-L257G，N076D-N218S，N076D-N243V，N076D-Q103H，N076D-S249A，N076D-T158S，N109A-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-A128S-N243V-S248A-K256R，N109G-A128S-N243V-S248N，N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R，N109G-G169A，N109G-N243P-S248A-K256R，N109G-N243V-K256R，N109G-N243V-S248A-K256R，N109G-N243V-S248N，N109G-N243V-S248N-K256R，N109G-S248N-K256R，N109Q-A128S-N243V-K256R，N109S-A128S-N243V-K256R，N218S-N243V，N218S-S249A，Q103H，Q103H-A116T，Q103H-A128S，Q103H-G131H，Q103H-G169A，Q103H-N218S，Q103H-N243V，Q103H-S162G，Q103H-S248N，Q103H-S249A，Q103H-T158S，Q206D，Q206D-L257G，Q206D-N218S，S009T-A128S-K141R-N243V，S009T-N109G-A128S-K141R，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R，S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V，S018T-Y021N-A128S-N243V，S018T-Y021N-N109G-A128S，S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V，S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T，S033T-A128S-G131H-N243V，S033T-G169A，S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R，S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T-Q103H-A128S-G131H，S033T-Q206D，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V，S063G-G169A，S063G-N076D，S063G-N109G-A128S-G131H，S063G-Q103H，S063G-S162G，S162G，S162G-G169A，S162G-L257G，S248N-K256R，S248N-L257G，S248N-S249A，S249A-K256R，T158S-G169A，T158S-K256R，T158S-N218S，T158S-S162G，T158S-S248N和T158S-S249A组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′蛋白酶(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A001E-A088T，A001E-A128S，A001E-A128S-G131H-N243V，A001E-G024E，A001E-G024E-S204E-Q206D，A001E-G131H-G169A-N243V，A001E-K043Y，A001E-N076D，A001E-N076D-N109G-A128S，A001E-N218S，A001E-N243V，A001E-Q103H，A001E-Q206D，A001E-S033T，A001E-S033T-N109G-N218S，A001E-S162G，A116T-Q206D，A128S-N243V-S248N-K256R，A128S-Q206D，G024E-Q206D，G131H-Q206D，K043Y-G131H，K043Y-Q103H，K043Y-Q206D，K043Y-S162G，N061S-N109G-A128S-N243V-S260P，N076D-A128S，N076D-Q206D，N076D-S162G，N076D-S248N，N109G-A128S-S248N-K256R，N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-N243P-S248N-K256R，N109G-Q206D，N243V-S248N-K256R，P040E-N109G-A128S-G131H，Q103H-Q206D，Q206D-K256R，Q206D-N243V，Q206D-S248N，Q206D-S249A，S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P，S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P，S033T-A128S-G131H-N243P，S033T-N076D-A128S-N218S，S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R，S033T-P040E-Q103H-N109G，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P，S063G-Q206D，S162G-Q206D和T158S-Q206D组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的禾草微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由T158S-L257G，K256R，L257G，S033T-N109G，S162G-K256R，S162G-L257G，G024E-K256R，G024E-L257G，G024E-S033T，N109G-A116T，N218S-L257G，S033T-A088T，S033T-A116T，S033T-N243V，S033T-Q103H，S162G-N218S，S162G-N243V，T158S，T158S-N218S，T158S-N243V，A088T，A088T-G169A，A088T-K256R，A088T-L257G，A088T-S162G，A088T-T158S，A116T-K256R，A116T-L257G，A116T-N243V，A128S-L257G，A128S-N218S，A128S-N243V，A128S-S248N，G024E-A116T，G024E-A128S，G024E-G131H，G024E-N243V，G024E-S248N，G024E-S249A，G024E-T158S，G131H-N243V，G131H-T158S，G169A-N218S，G169A-N243V，G169A-S248N，K256R-L257G，N109G-A128S，N109G-G131H，N109G-N218S，N109G-N243V，N109G-S249A，N218S，N218S-K256R，N218S-N243V，N218S-S249A，N243V，N243V-K256R，N243V-L257G，N243V-S248N，Q103H-N109G，Q103H-N218S，S033T-A128S，S033T-L257G，S033T-N218S，S033T-S162G，S033T-S248N，S033T-T158S，S063G-K256R，S063G-L257G，S162G，S162G-G169A，S162G-S248N，S248N，S248N-K256R，S248N-L257G，S249A，T158S-S162G和T158S-S248N组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′，BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的禾草微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A001E-A088T，A001E-A116T，A088T-A128S，A088T-N243V，A088T-Q103H，A088T-S248N，A088T-S249A，A116T，A116T-G169A，A116T-N218S，A116T-S162G，A116T-S249A，A116T-T158S，A128S-G169A，A128S-K256R，A128S-S162G，A128S-S249A，A128S-T158S，G024E-A088T，G024E-K043Y，G024E-N218S，G024E-Q103H，G024E-S063G，G024E-S162G，G131H-G169A，G131H-K256R，G131H-N218S，G131H-S162G，G131H-S248N，G131H-S249A，G169A，G169A-L257G，G169A-S249A，N076D，N076D-K256R，N076D-L257G，N076D-S162G，N076D-S249A，N109G-K256R，N109G-L257G，N109G-S248N，N243V-S249A，Q103H-A116T，Q103H-G169A，Q103H-K256R，Q103H-L257G，Q103H-N243V，Q103H-S162G，S033T-G131H，S033T-G169A，S033T-K043Y，S033T-N076D，S033T-Q206D，S063G，S063G-A116T，S063G-A128S，S063G-N243V，S063G-S162G，S063G-S248N，S063G-S249A，S063G-T158S，S249A-L257G，T158S-G169A和T158S-K256R组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一BMI微样品清洁检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的禾草微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A001E-G169A，A001E-K256R，A001E-N109G，A001E-N218S，A088T-A116T，A088T-G131H，A088T-N109G，A088T-N218S，A116T-A128S，A116T-G131H，A116T-S248N，A128S，A128S-G131H，G024E，G024E-N109G，G131H，G131H-L257G，G169A-K256R，G169A-Q206D，K043Y，K043Y-A088T，K043Y-L257G，K043Y-N109G，N076D-A088T，N076D-G131H，N076D-G169A，N076D-N243V，N076D-T158S，N109G，N109G-S162G，N109G-T158S，N218S-S248N，Q103H-A128S，Q103H-S248N，Q103H-S249A，Q103H-T158S，Q206D-K256R，Q206D-L257G，Q206D-N218S，Q206D-N243V，Q206D-S248N，S033T，S033T-K256R，S033T-S063G，S033T-S249A，S063G-A088T，S063G-G131H，S063G-G169A，S063G-N109G，S162G-Q206D，S162G-S249A，S248N-S249A，S249A-K256R，T158S-Q206D，T158S-S249A，A001E-L257G，A001E-N243V，A001E-Q103H，A001E-S063G，A001E-S162G，A001E-T158S，G024E-N076D，G131H-Q206D，K043Y-A116T，K043Y-G169A，K043Y-K256R，K043Y-N076D，K043Y-S063G，K043Y-S162G，K043Y-S248N，K043Y-S249A，K043Y-T158S，N076D-A116T，N076D-A128S，N076D-S248N，N109G-G169A，Q103H，Q103H-G131H，Q206D-S249A，S063G-N076D，S063G-N218S，S063G-Q103H，A001E-A128S，A001E-G024E，A001E-G131H，A001E-N076D，A001E-Q206D，A001E-S033T，A001E-S248N，A001E-S249A，A088T-Q206D，A116T-Q206D，A128S-Q206D，G024E-Q206D，K043Y-A128S，K043Y-G131H，K043Y-N218S，K043Y-Q103H，N076D-N109G，N076D-N218S，N076D-Q103H，N109G-Q206D，Q103H-Q206D，Q206D，A001E，A001E-K043Y，K043Y-N243V，S063G-Q206D，N076D-Q206D组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一禾草微样品清洁检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在AAPF蛋白水解检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由S033T-N076D-A128S-N218S，A001E-S033T-N109G-N218S，S033T-N218S，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V，A128S-G169A，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P，S018T-Y021N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T-A128S-G131H-N243P，P040E-N109G-A128S-G131H，S033T-A128S，S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，N109G-G169A，S063G-N109G-A128S-G131H，G169A，N109G-A128S-G131H-N243V-S248N-K256R，S033T-A128S-G131H-N243V，A128S-N218S，A001E-G169A，A088T-G169A，G169A-L257G，N109G-N218S，S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R，G169A-K256R，N076D-G169A，A001E-G131H-G169A-N243V，G169A-S249A，S033T-N109G，G169A-S248N，K043Y-G169A，K043Y-N218S，N218S-L257G，N218S-N243V，S063G-G169A，A001E-A128S-G131H-N243V，A001E-S033T-N109G-N243V，A088T-N218S，G024E-N218S，G024E-S033T，G169A-Q206D，N076D-N218S，S033T-L257G，S162G-G169A，A001E-N218S，A116T-N218S，G169A-N243V，N218S，P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T-N076D，A001E-S033T，A128S-G131H，N218S-S248N，S018T-Y021N-N109G-A128S，S033T-K043Y，S033T-N243V，S033T-Q206D，S063G-N218S，S162G-N218S，T158S-G169A，A116T-G169A，G131H-G169A，N061S-N109G-A128S-S260P，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-A128S-N243V-S248A-K256R，N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G，N218S-K256R，S009T-N109G-A128S-K141R，S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R，S033T-A088T，S033T-S063G，S033T-S162G，T158S-N218S，A001E-N076D-N109G-A128S，N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-S248N-K256R，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V，S018T-Y021N-N061S-N109G-A128S-S260P，S033T-A116T，S033T-S248N，S033T-S249A，S033T-T158S，G131H-N218S，N109A-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S，N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R，N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R，N218S-S249A，Q206D-N218S，S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V，S018T-Y021N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R，S033T-K256R，A116T-A128S，N061S-N109G-A128S-N243V-S260P，N109G-A128S-N243V-S248N，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R，G024E-A128S，N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P，N109S-A128S-N243V-K256R，S033T，S033T-G131H，A001E-A128S，A128S，A128S-L257G，A128S-Q206D，N109Q-A128S-N243V-K256R，S009T-A128S-K141R-N243V，S009T-S018T-Y021N-A128S-K141R-N243V，A088T-A128S，A128S-K256R，A128S-N243V，N061P-N109G-N243V，N061S-A128S-N243V-S260P，S018T-Y021N-A128S-N243V，A128S-N243V-S248N-K256R，A128S-S248N，A128S-S249A，N076D-A128S，S063G-A128S，A128S-S162G，A128S-T158S，S018T-Y021N-N061S-A128S-N243V-S260P，S033T-Q103H-A128S-G131H，N061S-N109G-N243V，K043Y-A128S，N061P-N109G-G131H-N243V，N109G-L257G，A001E-G024E-S204E-Q206D，A001E-L257G，A088T-N109G，G024E-N109G，K043Y-N109G，N061G-N109G-N243V，N076D-N109G，N109G，N109G-A116T，N109G-K256R，N109G-N243V-K256R，N109G-N243V-S248A-K256R，N109G-Q206D，S063G-N109G，A001E-A116T，A001E-N109G，A001E-Q206D，A088T-A116T，A088T-N243V，A116T-L257G，G024E-A116T，G024E-L257G，G024E-N243V，G024E-Q206D，N109G-G131H，N109G-N243V，N109G-S162G，N109G-S248N，N109G-S248N-K256R，N109G-S249A，N109G-T158S，N243V-L257G，A001E-A088T，A001E-G024E，A001E-K256R，A001E-N076D，A001E-N243V，A088T，A088T-L257G，A088T-Q206D，A116T，A116T-K256R，A116T-N243V，G024E-A088T，G024E-K043Y，G024E-K256R，G024E-N076D，G024E-S162G，G024E-S248N，K043Y-A088T，K043Y-A116T，K043Y-L257G，K043Y-N243V，K043Y-Q206D，K256R-L257G，N076D-A116T，N076D-L257G，N076D-N243V，N076D-Q206D，N109G-N243V-S248N，N109G-N243V-S248N-K256R，N243V-K256R，Q206D，Q206D-L257G，Q206D-N243V，Q206D-S248N，S063G-K256R，S063G-L257G，T158S-L257G，A001E，A001E-K043Y，A001E-S162G，A001E-S248N，A001E-S249A，A001E-T158S，A088T-K256R，A088T-S162G，A088T-S248N，A088T-S249A，A116T-Q206D，A116T-S248N，A116T-S249A，G024E，G024E-G131H，G024E-S249A，G024E-T158S，G131H，G131H-K256R，G131H-L257G，K043Y-K256R，K043Y-N076D，K256R，L257G，N076D-A088T，N076D-K256R，N076D-S162G，N076D-S248N，N076D-S249A，N109G-N243P-S248A-K256R，N109G-N243P-S248N-K256R，N243V，Q206D-K256R，S033T-P040E-Q103H-N109G，S063G，S063G-A116T，S063G-Q206D，S162G-K256R，S162G-L257G，S162G-N243V，S162G-Q206D，S162G-S248N，S248N，S248N-L257G，S249A，S249A-L257G，T158S，T158S-N243V和T158S-Q206D组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在AAPF蛋白水解检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A001E-G131H，A001E-S063G，A088T-G131H，A088T-T158S，A116T-G131H，A116T-S162G，A116T-T158S，G024E-S063G，G131H-N243V，G131H-N243V-K256R，G131H-Q206D，G131H-S249A，K043Y，K043Y-S063G，K043Y-S248N，K043Y-S249A，K043Y-T158S，N076D，N076D-G131H，N076D-T158S，N243V-S248N，N243V-S248N-K256R，N243V-S249A，Q103H-G169A，Q206D-S249A，S063G-N076D，S063G-N243V，S063G-S162G，S063G-S249A，S063G-T158S，S162G，S162G-S249A，S248N-K256R，S248N-S249A，S249A-K256R，T158S-K256R，T158S-S248N和T158S-S249A组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在AAPF蛋白水解检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由G131H-S162G，G131H-S248N，G131H-T158S，K043Y-G131H，K043Y-S162G，S063G-A088T，S063G-G131H，S063G-S248N，T158S-S162G，Q103H-N218S，S033T-Q103H  和Q103H-A128S组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在BMI微样品清洁检测中具有蛋白水解活性，比BPN′更强的蛋白水解活性，或比BPN′(SEQ ID NO：2)的PI值更高的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X001E，X009T，X018T，X021N，X024G，X033T，X040A，X043Y，X061G/P/S，X063G，X076D，X088T，X103H，X109A/G/Q/S，X116T，X128S，X131H，X141R，X158S，X162G，X169A，X204E，X206D，X218S，X243P/V，X248A/N，X249A，X256R，X257G和X260P组成的组的取代，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应，以及任选地，其中所述变体包含至少一种选自由A001E，S009T，S018T，Y021N，S024G，S033T，P040A，K043Y，N061G/P/S，S063G，N076D，A088T，Q103H，N109A/G/Q/S，A116T，G128S，G131H，K141R，T158S，S162G，G169A，S204E，Q206D，N218S，N243P/V，S248A/N，S249A，K256R，L257G和S260P组成的组的取代。还包括了包含至少一种此类蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类蛋白酶变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例9
来自基于BPN′-v36亲本的组合库的变体的构建及其清洁性能
由DNA2.0制备了基于BPN′-v36亲本分子的BPN′组合库，并以连接反应交付。为了高效地转化枯草芽孢杆菌，如实施例2中所述在转化之前扩增了来自连接反应混合物的DNA和使转化体生长。就清洁性能对上述变体进行了测试，测试使用在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法和在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的鸡蛋微样品检测法。蛋白质含量采用TCA检测法测定。检测如实施例1中所述进行，并计算了相对于BPN′-v36(即BPN′-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)的性能指数。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由A088T-A116T-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N243V-L257G，A088T-T158S-N218S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-L257G，A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S，A088T-N109G-A116T-G131H-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-N243V-L257G，A088T-N109G-N243V-S248N，A088T-N109G-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G，A116T-T158S-S248N-L257G，Y006H-A116T-G131H-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-K256R，A088T-N109G-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-T158S-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G，A116T，A116T-N218S-N243V-L257G-N269S，A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-K256R-L257G，N109G-A116T-N243V，N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-L257G，N109G-G131H-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-K256R-L257G，S003P-A116T-T158S-S248N-K256R，T158S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S，A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-L257G，A088T-G131H-N243V-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-L257G，A088T-N109G-A116T，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-W241R-S248N-K256R，A088T-N109G-K256R-L257G，A088T-N109G-L257G，A088T-N109G-N243V，A088T-N109G-N243V-K256R，A088T-N109G-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D，A088T-N109G-T158S-S248N-L257G，A088T-T158S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-T158S-N243V-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，A116T-G131H-S248N-L257G，A116T-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A116T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271R，A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，G131H-S248N，G131H-T158S-I234T-N243V-K256R，G131H-W241L-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-A137V-T158S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-A151S-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，N109G-A116T-S248N，N109G-A116T-T158S-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-W241R-N243V，N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-S248N-L257G，N109G-G131H-N218S-L257G，N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-A274T，N109G-K256R，N109G-N243V-L257G，N109G-T158S-N218S-K256R-L257G，N109G-T158S-N218S-L257G，N109G-T158S-S248N-K256R，P014L-A015L-L016C-H017T-S018L-Q019K-G020A-Y021T-T022L-G023E，S003F-A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，V004A-A088T-A116T-T158S-N218S，V004A-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，V004L-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G，Y006H-N109G-N218S-N243V-S248N，A001T-A116T-T158S-N243V-L257G，A088T-A116T，A088T-A116T-G131H-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-K256R，A088T-A116T-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-N243V-K256R，A088T-A116T-N243V-L257G，A088T-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-N218S-N2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在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测(测试方法3)中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A088T，A088T-A116T-G131H-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-A274T，A088T-A116T-G131H-N218S-K256R，A088T-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-A274V，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-K256R，A088T-A116T-L257G，A088T-A116T-N218S，A088T-A116T-N218S-N243V-K256R，A088T-A116T-N218S-N243V-N269D，A088T-A116T-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-N218S-S248N，A088T-A116T-N218S-S248N-L257G，A088T-A116T-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-S248N，A088T-A116T-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-A216S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-S248N，A088T-G131D-T158S-N243V-S248N，A088T-G131H-A138V-N218S-L257G，A088T-G131H-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-K256R，A088T-G131H-N218S-S248N，A088T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-N218T-L257G，A088T-G131H-N243V-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-S248N，A088T-G131H-S248N-L257G，A088T-G131H-T158S-K256R，A088T-G131H-T158S-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S，A088T-G131H-T158S-N218S，A088T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G-I268V，A088T-G131H-T158S-N243V-K256R，A088T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N243V-S248N，A088T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218T-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-T158S-N218S-K256R，A088T-N109G-A116T-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-S248N，A088T-N109G-A116T-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-L257G，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16T-N218S-N243V-S248N-L257G，A116T-N218S-S248N，A116T-N218S-S248N-K256R，A116T-N218S-S248N-L257G，A116T-N243V-S248N-L257G，A116T-S248N-L257G，A116T-T158S-L257G-Q271R，A116T-T158S-N218S-L257G，A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A116T-T158S-N218S-S248N-K256R，A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，G024S-G053S-N078S-G097A-N101S-A128S，G131H，G131H-N218S，G131H-N218S-K256R，G131H-N218S-N243V-K256R，G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，G131H-N218S-N243V-S248N，G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，G131H-N218S-S248N-L257G，G131H-N243V-K256R，G131H-N243V-K256R-L257G，G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，G131H-S248N-K256R，G131H-T158S-K256R，G131H-T158S-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-K256R，G131H-T158S-N218S-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，G131H-T158S-N243V-K256R，G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，G131H-T158S-S248N-L257G，G131H-V147I-N218S-S248N-K256R，I107T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，I107T-N109G-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G，N109G-A116T-G131H，N109G-A116T-G131H-A144V-T158S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V，N109G-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N243V-S248N，N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-V149A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-K256R，N109G-A116T-N218S-K256R，N109G-A116T-N218S-N243V，N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-I268V，N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-N243V-S248N，N109G-A116T-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-S248N-K256R，N109G-A116T-T158S，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R，N109G-A116T-T158S-N243V-L257G，N109G-A116T-T158S-N243V-S248N，N109G-A116T-T158S-S248N，N109G-A116T-T158S-S248N-K256R，N109G-G131H，N109G-G131H-K256R，N109G-G131H-N218S-K256R，N109G-G131H-N218S-K256R-L257G，N109G-G131H-N218S-N243V-L257G，N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-G131H-N218S-S248N-L257G，N109G-G131H-N243V，N109G-G131H-N243V-K256R，N109G-G131H-N243V-S248N，N109G-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-N243V-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-I268V，N109G-G131H-T158S-N243V-S248N，N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N，N109G-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，N109G-K141E-N218S-S248N-L257G，N109G-N218S，N109G-N218S-N243V-K256R，N109G-N218S-N243V-L257G，N109G-N218S-N243V-S248N-S260F，N109G-N218S-S248N，N109G-N218S-S248N-K256R，N109G-N243V-K256R，N109G-N243V-S248N，N109G-N243V-S248N-K256R，N109G-N243V-S248N-L257G，N109G-N243V-S248N-L257G-Q275R，N109G-S 182F-S204F-S207L-N218S-S236F-S248N-L257G，N109G-S248N-K256R，N109G-T158S-K256R-L257G，N109G-T158S-L257G，N109G-T158S-N218S-N243V-K256R，N109G-T158S-N218S-N243V-S248N，N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-T158S-N243V-K256R，N109G-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-T158S-N243V-S248N-L257G，N109G-T158S-S248N-L257G，N218S-N243V-L257G，N218S-N243V-S248N-K256R，N243V-K256R-L257G，N243V-S248N-L257G-Q271R，P057Q-A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N，S003P-A116T-N218S-K256R，S003P-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，S248N-K256R-L257G，T158S-K256R-L257G，T158S-N218S-A272V，T158S-N218S-K256R-L257G，T158S-N218S-L233S，T158S-N218S-N243V，T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，T158S-N218S-N243V-L257G，T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，T158S-N218S-S248N-K256R，T158S-N243V，T158S-N243V-K256R-L257G，T158S-N243V-S248N，T158S-N243V-S248N-K256R-N269D  和V004A-N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-L257G组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测(测试方法3)中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由A088T-A098S-N218S-K256R，A088T-A116T-G131H-K256R，A088T-A116T-G131H-K256R-L257G-L267M，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V，A088T-A116T-G131H-S248N，A088T-A116T-G131H-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-1268V，A088T-A116T-N218S-K256R，A088T-A116T-N218S-N243V-Q271R，A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-Q275R，A088T-A116T-N218S-S248N，A088T-A116T-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S，A088T-A116T-T158S-N218S-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-S248N-L257G，A088T-G131H，A088T-G131H，A088T-G131H-N218S-K237R-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-K256R，A088T-G131H-N218S-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-N243V-L257G，A088T-G131H-N218S-N243V-L257G，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-S248N，A088T-G131H-N243V，A088T-G131H-N243V-K256R，A088T-G131H-N243V-K256R-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N，A088T-G131H-N243V-S248N，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-S248N，A088T-G131H-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-N269D，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-Q275R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G-I268V，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-W241L-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-S248N，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-A138V-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G-Q275R，A088T-N109G-G131H-N243V-S248N，A088T-N109G-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S，A088T-N109G-G131H-T158S-L233S-N243V-S248N，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-V149A-K256R-L257G，A088T-N109G-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-N243V-K256R，A088T-N109G-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S，A088T-N109G-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-S248N，A088T-N109G-T158S-S248N，A088T-N109G-T158S-S248N，A088T-N218S-N243V-K256R，A088T-N218S-N243V-L257G，A088T-N218S-N243V-S248N，A088T-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N218S-S248N，A088T-N218S-S248N-L257G，A088T-S248N-K256R-L257G，A088T-T158S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-T158S-N218S-S248N，A088T-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q275K，A088T-T158S-N243V，A088T-T158S-N243V-K256R，A088T-T158S-N243V-S248N，A088T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-T158S-S248N-L257G，A088T-V147I-N218S-N243V-K256R-L257G，A116T-G131H-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V，A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-G131H-N218S-S248N，A116T-G131H-N218S-S248N-K256R，A116T-G131H-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N，A116T-G131H-T158S-N243V-K256R，A116T-G131H-V139I-N218S-N243V-S248N，A116T-K141E-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-K256R，A116T-N218S-N243V-S248N，A116T-N218T-N243V-S248N，A116T-N243V-K256R-L257G，A116T-S248N-K256R，A116T-T158S-N218S-K256R，A116T-T158S-N218S-K256R-L257G，A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，A116T-T158S-N218S-N243V-S248N，A116T-T158S-N218S-S248N-L257G，G024S-G053S-N078S-G097A-N101S，G053S-A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-G169S-N218S-S248N-K256R-L257G，G131H-K141R-T158S-N218S-K256R，G131H-K256R，G131H-N218S-K256R-L257G，G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，G131H-N218S-S248N-K256R，G131H-N243V-S248N，G131H-N243V-S248N-L257G，G131H-T158S-N218S，G131H-T158S-N218S-N240H-N243V-S248N-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V，G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-N269S，G131H-T158S-N243V-L257G，G131H-T158S-N243V-S248N，G131H-T158S-S248N，K256R，K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-N218S-N243V-S248N，N109G-A116T-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-K237R-N243V-S248N，N109G-G131H-N218S-N243V-S248N，N109G-G131H-S248N，N109G-G131H-T158S，N109G-G131H-T158S-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-K256R，N109G-N218S-K256R-L257G，N109G-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-N218S-S248N-L257G，N109G-S248N，N109G-T158S-N218S，N109G-T158S-N218S-N243V，N109G-T158S-N243V-L257G，N218S-K256R，N218S-N243V-K256R，N218S-N243V-S248N，N218S-S248N，N218S-S248N-K256R，N243V-L257G，S003P-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，S003P-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R，S105H-W106G-I107L-I108S-N109A-G110A-I111S-E112N-W113G-A114P，S248N-L257G，T158S，T158S-K256R，T158S-N218S，T158S-N218S-K256R，T158S-N218S-L233S-S248N，T158S-N218S-L257G，T158S-N218S-N243V-K256R，T158S-N218S-N243V-S248N，T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，T158S-N218S-S248N-L257G，T158S-N243V-S248N-L257G，T158S-S248N和V004L-A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测(测试方法3)中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A015S-A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T-A098S-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-N218S-L257G，A088T-A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-K256R，A088T-G131H-N218S-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V，A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-D140G-N243V，A088T-N109G-G131H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-K141E-T158S-N218S-K256R，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-Q271R，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-V149L-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271K，A088T-N109G-T158S-N218S-L257G，A088T-N109G-T158S-S248N-K256R，A088T-N218S-S248N-L257G-Q271R，A088T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-Y104H-A116T-G131H-N218S-N243V，A116T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G-N269D，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-Q271R，A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，A116T-G157E-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-T158S-N218S，G131H-N218S-L257G，G131H-N218S-S248N，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，G131H-T158S-N218S-S248N-I268V，I107T-N109G-G131H-N218S-L257G，L090I-N109G-T158S-N243V，L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271R，N109G-A116T-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-K141E-L257G，N109G-G131H-N218S-N243V，N109G-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-T158S-N218S-S248N-K256R，N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N218S-S248N-K256R-L257G，S003P-N109G-G131H-T158S-L257G，S003P-S248N-L257G，T158S-S248N-K256R-L257G，V004A-A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，Y006H-N218S-N243V-S248N，Y104H-N109G-G131H-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-N243V，A088T-G131H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-A223G-S248N-K256R，A088T-K213N-N243V-S248N-K256R，A088T-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A232S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-M124I-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-V148A-N218S-N243V，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-L257G，A088T-T158S-N218S-Q245K-S248N-K256R，A088T-T158S-N218S-S248N-K256R，A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A116T-G131H-V150A-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，I107T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-K141E-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N，T158S-N243V-S248N-K256R，T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-G146C，A088T-A116T-N218S，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A138E-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243F-S248N，A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G，A116T-D140G-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-E251K-K256R-L257G，A088T-I108T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-K141E-N218S，A088T-N109G-W241R-S248N-K256R  和G065D-A088T-G131H-N243V-S248N组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G，A116T-N218S-N243V-L257G-N269S，A088T-A116T-K256R，A088T-G131H-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T，A088T-A116T-N243V-L257G，A088T-A116T-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-N218S-S248N-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-I268V，A088T-T158S-N218S-S248N-L257G，A116T-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T，N109G-A116T-G131H-T158S-L257G，N109G-A116T-N243V，N109G-A116T-N243V-K256R，N109G-A116T-T158S-L257G，N109G-K256R，N109G-N243V-K256R-L257G，S003P-N109G-G131H-T158S-K256R，A088T-A116T，A088T-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-Q275R，A088T-A116T-T158S-A216S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S，A088T-A116T-T158S-N243V，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R，A088T-A116T-V147I-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-G131H-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-I107T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-N218T-K256R，A088T-N109G-A116T-N218T-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V，A088T-N109G-A116T-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-K256R-L257G-N269D，A088T-N109G-A116T-T158S，A088T-N109G-A116T-T158S，A088T-N109G-A116T-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-A138V-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-V149A-K256R-L257G，A088T-N109G-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-N243V，A088T-N109G-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-N243V-L257G，A088T-N109G-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-Q275R，A088T-N109G-T158S-N243V，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-I268V，A088T-N109G-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N218S-N243V-L257G，A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N218S-S248N，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-V143A-T158S-K256R，A088T-V147I-N218S-N243V-K256R-L257G，A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A116T-G131H-N243V-K256R，A116T-G131H-N243V-L257G，A116T-G131H-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-S248N-L257G，A116T-G131H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A116T-N218S-L257G，A116T-T158S-N218S-K256R-L257G，A116T-T158S-N218S-S248N，A116T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271R，A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A116T-T158S-S248N-L257G，G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，I107T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-A137V-T158S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-A151S-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-G131H-N243V-L25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在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1，0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A015S-A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N243V，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-N218S-I268V，A088T-A116T-N218S-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-N269D，A088T-A116T-N218S-S248N，A088T-A116T-N218S-S248N，A088T-A116T-N218S-S248N-L257G，A088T-A116T-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-S248N，A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-V143A-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H-A138V-N218S-L257G，A088T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-K256R，A088T-G131H-N218S-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-S248N，A088T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H-N243V-K256R-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-S248N，A088T-G131H-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-K256R，A088T-G131H-T158S-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N243V，A088T-G131H-T158S-N243V-K256R，A088T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-A223G-S248N-K256R，A088T-L257G，A088T-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A232S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-N269D，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243F-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218T-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-S248N，A088T-N109G-A116T-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-S248N，A088T-N109G-A116T-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G-Q275R，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-Q271R，A088T-N109G-G131H-N243V，A088T-N109G-G131H-N243V-K256R，A088T-N109G-G131H-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S，A088T-N109G-G131H-T158S，A088T-N109G-G131H-T158S-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-S248N，A088T-N109G-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-V149A-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-V149L-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-K256R，A088T-N109G-K256R-L257G，A088T-N109G-K256R-L257G，A088T-N109G-L257G，A088T-N109G-N218S-K256R，A088T-N109G-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-N218S-S248N，A088T-N109G-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-N243V-K256R，A088T-N109G-N243V-S248N-L257G-I268V，A088T-N109G-S248N，A088T-N109G-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-Q271H，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-S248N-N269D，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G-N269D，A088T-N218S-K256R，A088T-N218S-N243V，A088T-N218S-N243V-K256R，A088T-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N218S-S248N-L257G，A088T-N243V-S248N，A088T-N243V-S248N-K256R，A088T-N243V-S248N-L257G，A088T-S145T-T158S-S248N，A088T-S248N-K256R-L257G，A088T-S248N-L257G，A088T-T158S，A088T-T158S，A088T-T158S-K256R，A088T-T158S-L257G，A088T-T158S-N218S，A088T-T158S-N218S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-T158S-N218S-S248N，A088T-T158S-N218S-S248N，A088T-T158S-N243V，A088T-T158S-N243V-K256R，A088T-T158S-N243V-S248N-L257G，A116T，A116T-G131H-L257G，A116T-G131H-N218S-K256R，A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-N218S-S248N，A116T-G131H-T158S-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G，A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G-N269D，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-Q271R，A116T-G131H-T158S-N218T-L257G，A116T-G131H-T158S-N243V-K256R，A116T-G131H-V150A-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-K141E-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-L257G，A116T-N218S-N243V-S248N，A116T-N218T-N243V-S248N，A116T-N243V-S248N-L257G，A116T-S248N，A116T-S248N-L257G，A116T-T158S-K256R，A116T-T158S-N218S-L257G，A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，A116T-T158S-N243V，A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A116T-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-V149I-T158S-N243V-S248N-K256R-Q271H，G024S-G053S-N078S-G097A-N101S，G024S-G053S-N078S-G097A-N101S-A128S，G131H-K256R，G131H-N218S-K256R-L257G，G131H-N218S-N243V-L257G，G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，G131H-N218S-S248N-K256R，G131H-N218S-S248N-L257G，G131H-N243V，G131H-N243V-S248N，G131H-N243V-S248N-L257G，G131H-T158S-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S，G131H-T158S-N218S-K256R，G131H-T158S-N218S-N240H-N243V-S248N-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-S248N-I268V，G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-N269S，G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，G131H-T158S-N243V-S248N，G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，G131H-T158S-S248N，G131H-T158S-S248N-L257G，G131H-W241L-N243V-S248N-K256R，I107T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，I107T-N109G-G131H-N218S-L257G，N109G-A116T-G131H-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-S248N-I268V，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，N109G-A116T-K141E-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-K256R，N109G-A116T-N218S-N243V，N109G-A116T-N218S-N243V-S248N，N109G-A116T-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-S248N，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-T158S-N218S-W241R-N243V，N109G-A116T-T158S-N243V-S248N，N109G-A116T-T158S-S248N-L257G，N109G-G131H-K256R，N109G-G131H-N218S-K256R，N109G-G131H-N218S-N243V，N109G-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，N109G-G131H-N243V，N109G-G131H-N243V-S248N，N109G-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-S248N，N109G-G131H-T158S-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-S248N-K256R，N109G-K141E-N218S-S248N-L257G，N109G-N218S-N243V，N109G-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-N218S-S248N-K256R-L257G，N109G-N218S-S248N-L257G，N109G-N243V-S248N-L257G-Q275R，N109G-T158S-I268V，N109G-T158S-N218S，N109G-T158S-N218S-N243V，N109G-T158S-N218S-N243V-S248N，N109G-T158S-N218S-S248N-K256R，N109S-A116T-S248N，N218S-K256R，N218S-N243V-K256R，N218S-N243V-L257G，N218S-N243V-S248N，N218S-S248N，N218S-S248N-K256R，N218S-S248N-K256R-L257G，S003P-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，S248N-K256R-L257G，T158S-K256R，T158S-K256R-L257G，T158S-N218S-K256R-L257G，T158S-N218S-L233S-S248N，T158S-N243V，T158S-N243V-S248N-K256R-N269D，T158S-N243V-S248N-L257G，V004L-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G和Y006H-N218S-N243V-S248N组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A088T-A098S-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-K256R，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-S248N，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-K256R-L257G，A088T-A116T-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-Q271R，A088T-A116T-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S，A088T-A116T-T158S，A088T-A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H，A088T-G131H-L257G，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N243V-K256R，A088T-G131H-N243V-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-K141E-N218S，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-Q275R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-T158S-N218S-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A137E-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-D140G-N243V，A088T-N109G-G131H-A152S-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V，A088T-N109G-G131H-T158S-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-W241R-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-N109G-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-Q275R，A088T-N109G-T158S-S248N，A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N243V-L257G，A088T-S248N，A088T-T158S-K256R，A088T-T158S-N218S-K256R，A088T-T158S-N218S-L257G，A088T-T158S-N218S-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-T158S-N218S-Q245K-S248N-K256R，A088T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q275K，A088T-T158S-N243V-K256R，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-T158S-S248N，A088T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-T158S-S248N-L257G，A088T-T158S-S248N-L257G，A098S-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G，A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-G131H-N243V，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A116T-G131H-V139I-N218S-N243V-S248N，A116T-N218S-S248N-K256R，A116T-T158S-L257G-Q271R，A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，G053S-A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-G169S-N218S-S248N-K256R-L257G，G131H-N218S-L257G，G131H-T158S，G131H-T158S-K256R，K256R，L090I-N109G-T158S-N243V，L257G，N109G-A116T-G131H，N109G-A116T-G131H-N243V，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-S248N-K256R，N109G-A116T-T158S-N218S-K237R-N243V-S248N，N109G-A116T-T158S-S248N，N109G-G131H-T158S，N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-Q271R，N109G-N218S-S248N-K256R，N109G-N243V-S248N-L257G，N109G-S248N，N109G-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，S003P-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R，S003P-N109G-G131H-T158S-L257G，S105H-W106G-I107L-I108S-N109A-G110A-I111S-E112N-W113G-A114P，T158S-N218S-S248N-K256R，T158S-N243V-S248N，T158S-S248N，T158S-S248N-K256R-L257G，V004A-A088T-A116T-T158S-N218S，V004A-A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，Y006H-N109G-N218S-N243V-S248N，Y104H-A116T-T158S-S248N，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S，A088T-G131D-T158S-N243V-S248N，A088T-G131H-N218S-K237R-K256R-L257G，A088T-G131H-N218S-K256R，A088T-K213N-N243V-S248N-K256R，A088T-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-M124I-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-S248N，A088T-N109G-G131H-K256R-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-N243V-S248N，A088T-N109G-G131H-T158S-L233S-N243V-S248N，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-L257G，A088T-N109G-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G，A088T-N109G-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-S248N，A088T-S248N-K256R-L257G，A088T-S248N-L257G-I268V，A088T-T158S-N243V-L257G，A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G，A088T-Y104H-A116T-G131H-N218S-N243V，A116T-D140G-T158S-N218S-N243V-S248N，A116T-G131H-T158S-K256R-L257G，A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，A116T-G157E-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-S248N-K256R，G131H-N218S-S248N，G131H-N243V-K256R，G131H-T158S-N243V-L257G，K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N243V，N109G-A116T-T158S-S248N-K256R，N109G-N243V，N109G-T158S-K256R-L257G，N243V，P014L-A015L-L016C-H017T-S018L-Q019K-G020A-Y021T-T022L-G023E，S003P-S248N-L257G，T158S-N218S-N243V-S248N，T158S-S248N-K256R，Y104H-N109G-G131H-N243V-S248N，A088T-A116T-G131H-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V，A088T-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-L257G，A088T-A116T-N218S，A088T-A116T-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-N218S-S248N，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-A138E-N218S-N243V-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G-I268V，A088T-N109G-A116T-G131H-W241L-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N，A088T-N109G-G131H-N218S-L257G，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-S248N-K256R，A088T-N109G-W241R-S248N-K256R，A088T-N218S-S248N-L257G，A088T-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-T158S-N218S-S248N-L257G，A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A116T-N218S-S248N，A116T-N243V-K256R，A116T-T158S，G131H-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R，N109G-G131H，N109G-G131H-A137V-T158S-N218S-S248N，N109G-G131H-K141E-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-S248N，A088T-S248N-L257G，A088T-Y104H-N109G-G131H-A137E-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，G065D-A088T-G131H-N243V-S248N，Y104H-N218S-L257G，A088T-A116T-G131H-V150A-N218S-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-K256R-L257G，A088T-I108T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G-Q271P，A088T-N109G-A116T-V148A-N218S-N243V，A088T-Y104H-N109G-A116T-A153S-N218S-N243V-S248N-L257G-N269D和V004M-A116T-V148A-T158S-N243V-S248N-K256R组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在洗涤剂组合物4中在pH 8和16℃进行的BMI微样品或鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′-v36和/或BPN-‘v3更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36大于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X001R/T，X002R，X003F/P，X004A/L/M/P，X005S，X006H，X014L，X015L/S，X016C，X017T，X018L，X019K，X020A，X021T，X022L，X023E，X024S，X034S，X053S，X057Q，X065D，X078S，X086L，X088T，X090I，X097A，X098S，X101S，X104H，X105H/P，X106G，X107L/T，X108S/T，X109A/G/S，X110A，X111S，X112N，X113G，X114P/S，X116T，X124I，X128S，X131D/H，X137E/V，X138E/V，X139I，X140G，X141E/R，X143A/F，X144V，X145F/P/T，X146C，X147A/I，X148A，X149A/I/L，X150A，X151S，X152S，X153S，X154A，X155P，X156T，X157E/L，X158M/S，X159E，X160E，X161L，X169S，X182F，X203I，X204F，X207L，X211V，X212D，X213N，X216S，X218S/T，X223G，X231V，X232S，X233S，X234T，X235P，X236F/P，X237N/R，X240H，X241L/R，X243F/V，X245K，X248N，X251K，X255K，X256R，X257G，X260F，X267M，X268V，X269D/S，X271H/K/P/R，X272G/V，X273T，X274D/L/T/V  和X275K/R/S组成的组的取代，以及任选地至少一种选自由A001R/T，Q002R，S003F/P，V004A/L/M/P，P005S，Y006H，P014L，A015L/S，L016C，H017T，S018L，Q019K，G020A，Y021T，T022L，G023E，G024S，G034S，G053S，P057Q，G065D，N078S，P086L，A088T，L090I，G097A，A098S，N101S，Y104H，S105H/P，W106G，I107L/T，I108S/T，N109A/G/S，G110A，I111S，E112N，W113G，A114P/S，A116T，M124I，A128S，G131D/H，A137E/V，A138E/V，V139I，D140G，K141E/R，V143A/F，A144V，S145F/P/T，G146C，V147A/I，V148A，V149A/I/L，V150A，A151S，A152S，A153S，G154A，N155P，E156T，G157E/L，T158M/S，S159E，G160E，S161L，G169S，S182F，V203I，S204F，S207L，G211V，N212D，K213N，A216S，N218S/T，A223G，A231V，A232S，L233S，I234T，L235P，S236F/P，K237N/R，N240H，W241L/R，N243F/V，Q245K，S248N，E251K，T255K，K256R，L257G，S260F，L267M，I268V，N269D/S，Q271H/K/P/R，A272G/V，A273T，A274D/L/T/V，Q275K/R/S组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，和比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36的PI值更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例10
附加的BPN′-v36的变体的构建及其清洁性能
通过易错PCR进一步诱变了来自BPN′-v36的位点评估库(描述于实施例7中)的DNA。利用Taq DNA聚合酶(Promega)，用引物P4973和P4950(描述于实施例7中)扩增了这些库。每一PCR反应包含每种引物30pmol、100ng的模板DNA(BPN′-v36的SEL)和各种量的MnCl2。PCR反应(20μl)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸2分钟。通过
Figure BDA00001742984402721
凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化了DNA片段，用BamHI和HindIII限制性酶对其进行了消化并与也用相同的限制性酶消化的pHPLT-BPN′partial opt载体连接。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商(GE Healthcare)的建议，通过滚环扩增扩增了连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。为了此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接下来，向每一管中加入了5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，然后在30℃孵育10小时。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。
约500,000个克隆在脱脂乳平板上被预筛选。它们中的极少数形成了色圈(即表明了功能性蛋白酶的存在)。挑取了带有色圈的菌落，接种至150μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中，并进行了测序(Quintara)。通过寻找在这一库中发生了多次并且可能提供性能有益效果的突变的组合，对这些克隆的序列进行了分析。为了评估这些突变组合的性能，通过PCR融合在BPN′-v36背景中构建了双重突变。出于此目的，通过诱变引物扩增了两段或三段部分重叠的片段。用于产生相应变体的引物组合显示于表10-1中，引物序列显示于表10-2中。
Figure BDA00001742984402731
Figure BDA00001742984402741
每个PCR扩增反应包含每种引物30pmol和100ng的BPN′-v36亲本模板DNA(质粒pHPLT-BPN′-v36)(参见图4)。扩增使用Vent DNA聚合酶(NEB)进行。PCR反应(20μl)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，通过
Figure BDA00001742984402752
凝胶条带纯化试剂盒对5′和3′基因片段进行凝胶纯化，将二者混合(每种片段50ng)，然后使用引物P4973和P4950再次通过PCR进行扩增，以产生全长的基因片段。PCR条件与上文所述相同，不同之处在于延伸阶段于72℃进行2分钟。通过
Figure BDA00001742984402753
凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化了全长的DNA片段，用BamHI和HindIII限制性酶对其进行了消化并与也用相同的限制性酶消化的pHPLT-BPN′partial opt载体连接。使用IllustraTempliphi试剂盒，按照制造商(GE Healthcare)的建议，通过滚环扩增扩增了连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。为了此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接下来，向每一管中加入了5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，然后在30℃孵育10小时。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至150μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中。次日，培养物被加入15％甘油后冻存，或者在MBD培养基中生长以如实施例2中所述进行生物化学分析。
就清洁性能对上述变体进行了测试，测试使用在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测法、在洗涤剂组合物4中于16℃和pH7进行的BMI微样品检测法、以及在洗涤剂组合物4中于16℃和pH 8进行的鸡蛋微样品检测法。蛋白质含量采用TCA检测法测定。所有检测均如实施例1中所述进行，并计算了相对于BPN′-v36(即BPN′-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q)的性能指数。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A133V-S260N，N061S-S260P，P014T-S037T，S009T-K141F，S009T-K141R，S018F-S162L，S018L-Y021S，S018P-D120N，S018T-S162P，S018T-Y021N，S018Y-K213R，S161P-S162L，S161P-S260P和T253A-S260P组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由A134T-S260G，I115V-N184Y，N025K-S037P，Q010L-S037P，Q019L-S260N，Q019L-S260P，S037P-T254S和S161P-T253A组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A045S-S236G，G024A-S037W，I031V-S038W，N061D-S260I，Q010R-S037T，I115T-S183T，N025K-P129K，N025K-P129R，A045S-S236Y和S162L-D181H组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 7和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由S018F-S162L，S018P-D120N，P014T-S037T，S009T-K141R和S161P-S162L组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 7和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，N061S-S260P，Q010L-S037P，S009T-K141F，S018L-Y021S，S018T-S162P，S018T-Y021N，S018Y-K213R，S037P-T254S，S161P-S260P，S161P-T253A和T253A-S260P组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 7和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′变体被测定为相对于BPN′-v3具有等于约0.9的PI值：包含至少一组选自由A133V-S260N，A134T-S260G，I115T-S183T，I115V-N184Y，N061D-S260I，Q019L-S260N和Q019L-S260P组成的组的氨基酸取代的BPN′氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于0.9的PI值和/或比BPN′更强的蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ IDNO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 7和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A045S-S236G，G024A-S037W，Q010R-S037T，A045S-S236Y，I031V-S038W，N025K-S037P，S162L-D181H和N025K-P129R组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由I031V-S038W，P014T-S037T，S018F-S162L，S018P-D120N和S162L-D181H组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于约1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v36，A133V-S260N，A134T-S260G，G024A-S037W，I115V-N184Y，N025K-P129K，N025K-P129R，N061D-S260I，Q019L-S260P，S009T-K141F，S009T-K141R，S018L-Y021S，S018T-S162P，S018T-Y021N，S018Y-K213R，S161P-S162L，S161P-T253A和T253A-S260P组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3等于1.0的PI值和相对于BPN′-v36等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.8且等于或小于0.9的PI值：包含至少一组选自由A045S-S236G，A045S-S236Y，I115T-S183T，N025K-S037P，N061S-S260P，Q010L-S037P，Q010R-S037T，Q019L-S260N，S037P-T254S和S161P-S260P组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在洗涤剂组合物4中在pH 8和16℃进行的BMI或鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′-v36更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36大于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种选自由X009T，X010L/R，X014T，X018F/L/P/T/Y，X019L，X021N/S，X024A，X025K，X031V，X037P/T/W，X038W，X045S，X061D/S，X115T/V，X120N，X129K/R，X133V，X134T，X141F/R，X161P，X162L/P，X181H，X183T，X184Y，X213R，X236G/Y，X253A，X254S和X260G/I/N/P组成的组的取代，以及任选地至少一种选自由S009T，Q010L/R，P014T，S018F/L/P/T/Y，Q019L，Y021N/S，G024A，N025K，I031V，S037P/T/W，S038W，A045S，N061D/S，I115T/V，D120N，P129K/R，A133V，A134T，K141F/R，S161P，S162L/P，D181H，S183T，N184Y，K213R，S236G/Y，T253A，T254S和S260G/I/N/P组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，和比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36的PI值更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例11
1.组合库FS1-FS3的构建
包含BPN′表达盒的pHPLT-BPN′-v3质粒作为模板DNA(亲本质粒)被用于克隆。在DNA 2.0合成了三个分别的组合库(FS1、FS2和FS3)，并以单独的连接反应交付。库和可能的取代的列表显示于表11-1中。上述库被设计为允许野生型残基或表11-1中所述的在每一位点的取代的掺入。
用Illustra Templiphi试剂盒(GE Healthcare)通过滚环扩增(RCA)扩增了来自连接反应的DNA，以高效地转化枯草芽孢杆菌。反应按照制造商的规程进行。一微升十倍稀释的经扩增的DNA被用于转化50μl感受态枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。在37℃摇动转化混合物1小时。十微升转化混合物被铺于补充了10μg/ml新霉素(Teknova)的脱脂乳(1.6％)Luria琼脂平板上。
挑取了转化体至包含125-150μl补充了10μg/ml新霉素的Luria肉汤培养基的微量滴定板中。将Enzyscreen盖子(Enzyscreen)用于微量滴定板上，使平板在70-80％湿度下于37℃以250-300rpm摇动生长过夜。介于7微升和10微升之间的来自上述过夜平板的培养物被用于接种新的包含190μl含10μg/ml新霉素的MBD培养基(基于MOPS的合成培养基)的微量滴定板。MBD培养基的制备基本如本领域所已知的(参见Neidhardt等人，J.Bacteriol.119：736-747(1974))，不同的是从基础培养基中去除了NH4Cl、FeSO4和CaCl2，使用了3mM的K2HPO4，并且向基础培养基补充了60mM脲和100ml由210g/l的葡萄糖和350g/l的麦芽糖糊精制成的溶液。微量营养素以100X原液的形式制成，一升原液中包含：400mg的FeSO4·7H2O、100mg的MnSO4·H2O、100mg的ZnSO4·7H2O、50mg的CuCl2·2H2O、100mg的CoCl2·6H2O、100mg的NaMoO4·2H2O、100mg的Na2B4O7·10H2O、10ml的1M的CaCl2和10ml的0.5M的柠檬酸钠。使用Enzyscreen盖子(Enzyscreen)，让包含MBD培养基的微量滴定板在70-80％湿度下于37℃以250-300rpm摇动生长60-70小时，以测定蛋白质的表达。次日，通过微量过滤平板(0.22um；Millipore)过滤培养物，所得到的滤液被用于生物化学分析。
2.用于提高BPN′稳定性的变体的构建
利用亲本分子pHPLT-BPN′G97A-G128A-Y217Q-S87D或pHPLT-BPN′G97A-G128A-Y217Q-P40E(二者均由Gene Oracle合成)，或者由GeneArt合成的亲本分子pHPLT-BPN′G97A-G128A-Y217Q-S78N和pHPLT-partialopt FNA(解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L)，构建了变体，以提高BPN′稳定性。
表11-2和11-3中所列的信息总结了构建本文提供的变体所使用的亲本分子、加入的突变和所用的引物。
Figure BDA00001742984402841
将表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株划线接种至包含10ppm新霉素的1.6％脱脂乳平板上，并在37℃生长过夜。使来自上述平板的单菌落在5ml包含10ppm新霉素的Luria肉汤中于37℃以250rpm摇动生长过夜。采用试剂盒规程提取了质粒，其中向缓冲液P1中添加了1微升的Ready Lyse溶菌酶(Epicentre)在37℃孵育15分钟，以帮助细胞裂解。在进行后续步骤前，对质粒进行了测序以保障DNA序列正确。用NEB的Dam Methylase试剂盒通过反应使上述质粒甲基化，反应包含77.5μl的水+10μl缓冲液10X+0.25μl的SAM+2μl的DAM甲基化酶+10μl的微量提纯DNA(～150ng/μL)，于37℃过夜。使用DNA Clean and Concentrator试剂盒(Zymo)或
Figure BDA00001742984402843
纯化试剂盒纯化了甲基化的质粒DNA。多重位点诱变反应被设定为对每种DNA模板而言在反应混合液中包含2.5μl缓冲液5X+0.75μl的Quik Solution+0.5μl的引物1(25μM)+0.5μl的引物2(25μM)+1.5μl的dNTP′s+1μl的酶共混物+16.25μl的H2O+2μl的DNA。所使用的PCR程序为：95℃进行1分钟；(95℃进行1分钟，53℃进行1分钟，65℃进行10分钟)x29个循环；65℃进行10分钟，4℃保持。在全部的反应中，PCR使用MJ Research PTC-200Peltier热循环仪进行。通过向37℃过夜的
Figure BDA00001742984402851
诱变试剂盒反应加入1μl的DpnI，从PCR样品中除去了亲本DNA。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商的规程，通过滚环扩增(RCA)扩增了经DpnI消化的反应，以提高转化率。用每种RCA反应1μL转化了枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)，并将转化的细胞铺于包含10ppm新霉素的LA+1.6％脱脂乳平板上，于37℃孵育过夜。选择了来自过夜生长的菌落，以使用“puReTaq Ready-To-Go PCR Beads”(Amersham)进行用于测序的菌落PCR。所使用的PCR和测序引物是pHPLT F1(SEQ ID NO：54))和pHPLT seq R1(SEQ ID NO：55。具有适当序列的克隆被冻存。在96孔微量滴定板中，通过使枯草芽孢杆菌转化体于37℃在包含脲的MOPS基培养基中生长68小时，制备了BPN′变体蛋白质。
3.来自五种不同亲本质粒的BPN′变体的构建
利用下列的总共五种不同的模板构建了BPN′变体：BPN′-v3(G97A-G128A-Y217Q)、BPN′-v4(G97A-N123G-Y217Q)、BPN′变体8，(S87D-G97A-N109D-G128A-S188D-S248R-Y217Q)、BPN′变体16(S87D-G97A-N109D-G128A-S188D-Y217Q)和BPN′变体21(S87R-G97A-N109R-G128A-S188R-Y217Q-S248R)，如表11-4中所示。BPN′-v4和BPN′-v3的产生描述于2009年6月3日提交的PCT申请PCT/US09/46066(WO 09/149144)中，该文献就此类描述以引用方式并入本文。BPN′变体8、16、21有GeneOracle合成，并被用作亲本质粒以构建其他的变体。所有的变体均使用
Figure BDA00001742984402852
诱变试剂盒构建，除了使用如下文所述的融合PCR构建的两个(变体5和33)以外。用于构建变体的引物(列于表11-5中)由Integrated DNA Technologies合成。所引入的突变(以粗体表示)和所使用的引物与模板显示于表11-4中。
Figure BDA00001742984402853
Figure BDA00001742984402861
Figure BDA00001742984402871
通过
Figure BDA00001742984402872
诱变构建BPN′变体
将包含表达BPN′-v3、BPN′-v4、BPN′变体8、BPN′变体16和BPN′变体21的质粒的枯草芽孢杆菌菌株划线接种至包含10ppm新霉素的1.6％脱脂乳平板上，并在37℃生长过夜。使来自上述平板的单菌落在5ml包含10ppm新霉素的Luria肉汤中于37℃以250rpm摇动生长过夜。采用
Figure BDA00001742984402873
Miniprep试剂盒规程(不同之处是在细胞裂解之后，添加了1微升的ReadyLyse溶菌酶(Epicentre)并在37℃孵育15分钟)提取了表达BPN′-v3、BPN′-v4、BPN′变体8、BPN′变体16和BPN′变体21的质粒。用NEB的Dam Methylase试剂盒通过反应使上述质粒甲基化，反应包含77.75μl的H20+10μl缓冲液10X+0.25μl的SAM+2μl的DAM甲基化酶+10μl的微量提纯DNA，于37℃过夜。使用
Figure BDA00001742984402874
纯化试剂盒纯化了甲基化的DNA。使用QUIKCHANGE LIGHTNINGTM Multi Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)，在包含2.5μl缓冲液5X+0.75μl的Quik Solution+0.5μl的引物1(25μM)+0.5μl的引物2(25μM)+1.5μl的dNTP′s+1μl的酶共混物+16.25μl的H2O+2μl的DNA的反应混合物中，构建了表11-4中所列的变体14、18和19。所使用的PCR程序如下：95℃进行2分钟；(95℃进行20秒，55℃进行30秒，64℃进行2分钟30秒)x29个循环；64℃进行5分钟，4℃保持。
使用
Figure BDA00001742984402881
Multi Site-Directed Mutagenesis试剂盒，在包含2.5μl缓冲液5X+0.75μl的Quik Solution+0.5μl的引物1(25μM)+0.5μl的引物2(25μM)+1.5μl的dNTP′s+1μl的酶共混物+16.25μl的H2O+2μl的DNA的反应混合物中，构建了其余的变体。所使用的PCR程序如下：95℃进行1分钟；(95℃进行1分钟，53℃进行1分钟，65℃进行10分钟)x29个循环；65℃进行10分钟，4℃保持。在全部的反应中，PCR使用MJ ResearchPTC-200Peltier热循环仪进行。用于Quik-Change反应的引物提供于表11-5中。引物以引物序列(5′至3′)显示。
Figure BDA00001742984402882
Figure BDA00001742984402891
通过向37℃过夜的Quik-Change反应加入1μl的DpnI，从PCR样品中除去了亲本DNA。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商的规程，通过滚环扩增(RCA)扩增了一微升经DpnI消化的反应，以提高转化率。用每种RCA反应1μL转化了枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)，并将转化的细胞铺于包含10ppm新霉素的LA+1.6％脱脂乳平板上，于37℃孵育过夜。选择了来自过夜生长的菌落，以使用“puReTaq Ready-To-Go PCR Beads”(Amersham)进行菌落PCR。所使用的PCR引物是pHPLT F1(SEQ ID NO：54))和pHPLT seq R1(SEQ ID NO：55。具有适当序列的克隆被冻存。在96孔微量滴定板中，通过使枯草芽孢杆菌转化体于37℃在包含脲的MOPS基培养基中生长68小时，表达了BPN′变体。
通过融合PCR构建BPN′变体
通过融合PCR，用扩增自模板pHPLT-BPN′-v3的片段构建了变体5和33。用于构建这些变体的PCR引物包括于表11-5中。就变体5而言，使用正向引物pHPLT F1(SEQ ID NO：54)和反向引物S248D revfus扩增了BPN′基因的5′片段。使用包含所关注的突变的正向引物S248D forfus和反向引物pHPLT R1扩增了BPN′的3′片段。这两种产物包含20bp重叠序列，在最终的PCR反应中，通过混合每种片段1μl以及融合引物QC FUSION_For1和QC FUSION_Rev1，使上述产物融合。全部的PCR反应均使用Herculase IIPCR试剂盒(Stratagene)的标准条件进行。PCR混合物包含1μl的DNA聚合酶，1μl的质粒DNA(或用于融合的片段DNA)，0.5μl的dNTP′s，1.25μl的25μM的正向引物，1.25μl的25μM的反向引物，10μl缓冲液5X，35μl的H2O，所使用的PCR程序如下：95℃进行2分钟，(95℃进行30秒，55℃进行30秒，72℃进行“X”秒)29个循环，72℃进行1分钟，4℃保持(“X”为每1kB待扩增的DNA15秒)。
就变体33而言，使用模板pHPLT-BPN′-v3和引物pHPLT F1(SEQ IDNO：54)和G100E_Fsrev扩增了BPN′基因的5′片段。使用引物G100E_Fsfor和pHPLT R1扩增了包含变体的3′片段。这两种产物包含20bp重叠序列，在最终的PCR反应中，通过混合每种片段1μl以及融合引物QCFUSION_For1和QC FUSION_Rev1，使上述产物融合。PCR条件与上文所列相同。
使用纯化柱，采用制造商提供的条件，纯化了上述两种融合产物，并用Bgl I和HindIII酶消化过夜。用相同的酶消化了质粒pHPLT-BPN′partial opt，凝胶提取了载体条带，并用凝胶纯化柱，采用制造商的建议，进行了纯化。限制酶混合物包含：10μl的纯化的DNA，5μl的Roche缓冲液B，0.5μl的HindIII，0.5μl的Bgl I，34μl的H2O，反应在37℃进行8小时，然后在65℃进行20分钟。用
Figure BDA00001742984402903
纯化柱纯化了消化产物，并用Mighty Mix Ligase试剂盒(Tekara)在16℃与切开的载体主链连接过夜。孵育之后，用Illustra TempliPhi试剂盒扩增了1μL的连接混合物。
就扩增反应而言，将1μL的连接反应混合物与5μl来自TempliPhi试剂盒的样品缓冲液混合，并在95℃加热3分钟，以使DNA变性。反应被置于冰上冷却2分钟，然后短暂离心。加入来自TempliPhi试剂盒的五微升反应混合物和0.2μl的phi29聚合酶，在MJ Research PCR仪中将反应在30℃孵育了4小时。通过在上述PCR仪中于65℃孵育10分钟，加热灭活了反应中的phi29酶。用1μL的反应混合物转化了枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)，并使转化体于37℃在包含10ppm新霉素的1.6％脱脂乳平板上生长过夜。对转化体进行了选择，以使用“puReTaqReady-To-Go PCR Beads”(Amersham)和引物pHPLT F1(SEQ IDNO：54)与pHPLT seqR1(SEQ ID NO：55)进行菌落PCR和测序。
4.来自库RCL4-RCL7的BPN′变体的构建
RCL4库
“RCL4”是指通过使BPN′-v3-编码基因(BPN′-G97A-G128A-Y217Q)中的三个连续的密码子随机化的PCR融合构建的一组位点饱和库。对应于每一库中的三个突变密码子的氨基酸位点提供于表11-6中。各包含三个简并密码子的两种部分重叠的、互补的诱变引物，被用于在每一库中引入突变，如下文的表11-6中所示。在每种引物中，所关注的每一简并密码子(NNX，N＝A、C、T、或G，X是未改变的核苷酸)只有前两个核苷酸是突变的(表11-6)。
使用正常的3′基因侧翼引物(P4976，CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC；(SEQ ID NO：61))和诱变引物，或者正常的5′基因侧翼引物(P4974，GCCTCACATTTGTGCCACCTA；(SEQID NO：60))和诱变引物，进行两个PCR反应，以构建每一库，如表11-6中就每一库所示。这些PCR反应产生了两种PCR片段，一种编码突变的BPN′-v3基因(5′基因片段)的5′部分，而另一种编码突变的BPN′-v3基因(3′基因片段)的3′部分。每个PCR扩增反应包含每种引物30pmol和100ng的BPN′-v3亲本模板DNA(质粒pHPLT-BPN′-v3)(参见图1)。扩增使用Vent DNA聚合酶(NEB)进行。PCR反应(20μl)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，通过
Figure BDA00001742984402911
凝胶条带纯化试剂盒对5′和3′基因片段进行凝胶纯化，将二者混合(每种片段50ng)，然后使用引物P4973(AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC；SEQ ID NO：62)和P4950(CTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAA；SEQ ID NO：63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长的基因片段。PCR条件与上文所述相同，不同之处在于延伸阶段于72℃进行2分钟。通过
Figure BDA00001742984402912
凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化了全长的DNA片段，用BamHI和HindIII限制性酶对其进行了消化并与也用相同的限制性酶消化的pHPLT-BPN′partial opt载体连接。使用IllustraTempliphi试剂盒，按照制造商(GE Healthcare)的建议，通过滚环扩增扩增了连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。为了此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接下来，向每一管中加入了5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，然后在30℃孵育10小时。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至120μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中。
表11-6：用于构建RCL4库的引物列表
Figure BDA00001742984402931
Figure BDA00001742984402941
Figure BDA00001742984402951
Figure BDA00001742984402961
Figure BDA00001742984402971
Figure BDA00001742984402981
Figure BDA00001742984402991
RCL5变体
“RCL5”是指用多种BPN′突变体作为亲本(模板)分子，通过PCR融合构建的一组组合变体。引入每种亲本质粒的突变显示于表11-7中，用于构建突变体的诱变引物显示于表11-8中。
Figure BDA00001742984402992
Figure BDA00001742984403001
Figure BDA00001742984403011
Figure BDA00001742984403021
表11-8：用于构建RCL5组合变体的引物
Figure BDA00001742984403022
Figure BDA00001742984403031
使用正常的3′基因侧翼引物(P4976，CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC；SEQ ID NO：61))和诱变引物，或者正常的5′基因侧翼引物(P4974，GCCTCACATTTGTGCCACCTA；SEQ IDNO：60和诱变引物，进行两个PCR反应，以构建每一突变体，如表11-8中就每一库所示。这些PCR反应产生了两种PCR片段，一种编码突变的BPN′基因的5′部分(5′基因片段)，而另一种编码突变的BPN′基因的3′部分(3′基因片段)。每一PCR扩增反应包含每种引物30pmol和100ng的表11-7中所列的亲本分子。扩增使用Vent DNA聚合酶(NEB)进行。PCR反应(20μl)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，通过
Figure BDA00001742984403032
凝胶条带纯化试剂盒对5′和3′基因片段进行凝胶纯化，将二者混合(每种片段50ng)，然后使用引物P4973(SEQ ID NO：62)和P4950(SEQ ID NO：63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长的基因片段。PCR条件与上文所述相同，不同之处在于延伸阶段于72℃进行2分钟。通过
Figure BDA00001742984403033
凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化了全长的DNA片段，用BamHI和HindIII限制性酶对其进行了消化并与也用相同的限制性酶消化的pHPLT-BPN′partial opt连接。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商(GE Healthcare)的说明，通过滚环扩增扩增了连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。为了此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接下来，向每一管中加入了5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，然后在30℃孵育10小时。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至120μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中。
RCL 6组合库
“RCL6”是指用多种BPN′突变体作为亲本(模板)分子，通过PCR融合构建的一组组合库。在这些库的每一个的构建中，BPN′突变体的混合物被用作模板(亲本分子)。用于构建这些库的亲本分子的五种不同的混合物提供于表11-9中，引入每一库中的突变列于表11-10中。
使用正常的3′基因侧翼引物(P4976，SEQ ID NO：61))和诱变引物，或者正常的5′基因侧翼引物(P4974，SEQ ID NO：60和诱变引物，进行两个PCR反应，以构建每一突变体，如表11-10中就每一库所示。这些PCR反应产生了两种PCR片段，一种编码突变的BPN′基因的5′部分(5′基因片段)，而另一种编码突变的BPN′基因的3′部分(3′基因片段)。每一PCR扩增反应包含每种引物30pmol和100ng的表11-9中所列的亲本分子。扩增使用Vent DNA聚合酶(NEB)进行。PCR反应(20μl)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，通过
Figure BDA00001742984403041
凝胶条带纯化试剂盒对5′和3′基因片段进行凝胶纯化，将二者混合(每种片段50ng)，然后使用引物P4973(SEQID NO：62)和P4950(SEQ ID NO：63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长的基因片段。PCR条件与上文所述相同，不同之处在于延伸阶段于72℃进行2分钟。通过
Figure BDA00001742984403042
凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化了全长的DNA片段，用BamHI和HindIII限制性酶对其进行了消化并与也用相同的限制性酶消化的pHPLT-BPN′partial opt载体连接。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商(GE Healthcare)的说明，通过滚环扩增扩增了连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。为了此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接下来，向每一管中加入了5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，然后在30℃孵育10小时。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至120μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中。
Figure BDA00001742984403051
表11-10：引入RCL6库的突变
Figure BDA00001742984403052
Figure BDA00001742984403061
Figure BDA00001742984403071
Figure BDA00001742984403081
Figure BDA00001742984403091
Figure BDA00001742984403101
RCL 7组合变体
“RCL7”是指用多种BPN′突变体作为亲本(模板)质粒，通过PCR融合构建的一组组合变体。引入每种亲本质粒的突变列于表11-11中，用于构建突变体的诱变引物描述于表11-10中。
使用正常的3′基因侧翼引物(P4976，SEQ ID NO：61))和诱变引物，或者正常的5′基因侧翼引物(P4974，SEQ ID NO：60和诱变引物，进行两个PCR反应，以构建每一突变体，如表11-10中就每一库所示。这些PCR反应产生了两种PCR片段，一种编码突变的BPN′基因的5′部分(5′基因片段)，而另一种编码突变的BPN′基因的3′部分(3′基因片段)。每一PCR扩增反应包含每种引物30pmol和100ng的表11-11中所列的亲本分子。扩增使用Vent DNA聚合酶(NEB)进行。PCR反应(20μl)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸40秒。扩增之后，用
Figure BDA00001742984403102
凝胶条带纯化试剂盒对5′和3′基因片段进行凝胶纯化，将二者混合(每种片段50ng)，然后使用引物P4973(SEQID NO：62)和P4950(SEQ ID NO：63)再次通过PCR进行扩增，以产生全长的基因片段。PCR条件与上文所述相同，不同之处在于延伸阶段于72℃进行2分钟。用
Figure BDA00001742984403111
凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化了全长的DNA片段，用BamHI和HindIII限制性酶对其进行了消化并与也用相同的限制性酶消化的pHPLT-BPN′partial opt连接。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商(GE Healthcare)的说明，通过滚环扩增扩增了连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。为了此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接下来，向每一管中加入了5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，然后在30℃孵育10小时。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至120μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中。
Figure BDA00001742984403121
Figure BDA00001742984403131
Figure BDA00001742984403141
Figure BDA00001742984403151
实施例12
洗涤剂表
用于部分I实施例12的检测中的洗涤剂的组成显示于表12-1中。BPN′变体蛋白质样品被添加至如部分I实施例1中所述的洗涤剂组合物中，以测定所列的各种性质。
Figure BDA00001742984403172
Figure BDA00001742984403181
1“无规接枝共聚物”为聚乙酸乙烯酯接枝的环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。所述聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。
2聚氮丙啶(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲烷氧基化油脂清洁聚合物为聚氮丙啶(MW＝600)，每个-NH具有24个乙氧基化基团，并且每个-NH具有16个丙氧基化基团。
BPN′组合变体的去污性能
使用BMI污染的微样品进行了实验，以评估如实施例11中所述产生的BPN′组合变体的去污性能。检测如实施例1中所述进行(BMI微样品检测法)。表12-2提供了在洗涤剂组合物1中于pH 8和16℃和在洗涤剂组合物1中于pH 8和32℃进行的BMI微样品检测中，以及在热灭活的商品化
Figure BDA00001742984403191
(Procter & Gamble)洗涤剂中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测中，产生自RCL4库的变体的性能指数(PI)值。商品化洗涤剂的热灭活起到破坏任何蛋白质组分的内源性酶活性，同时保持非酶组分的特性的作用。洗涤剂的热灭活通过将预先称重的量的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)于95℃水浴2小时进行。
Figure BDA00001742984403192
洗涤剂购自当地超市。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。酶活性通过AAPF检测法测定。工作液制备自热灭活的原液。适当量的水硬度和缓冲液被添加至洗涤剂溶液中，以匹配所期望的条件(表12-2)。溶液通过旋涡振荡或颠倒瓶子混合。
表12-3中所列的变体的序列是相对于BPN′-v3：G97A-G128A-Y217Q。PI值是相对于BPN′-v3计算的。这一列表中的全部突变体就至少一种被检测的特性而言具有等于或大于0.5的PI截止值。“Det.Comp.”是指洗涤剂组合物。
Figure BDA00001742984403194
Figure BDA00001742984403201
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自表12-3中的那些的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。每种蛋白酶变体可以是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的蛋白酶变体。还包括了包含至少一种此类蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类蛋白酶变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
表12-4提供了在洗涤剂组合物1(来自表1-3)中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测中、在洗涤剂组合物2(来自表1-3)中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测中、以及洗涤剂组合物3(来自表1-3)中进行的稳定性检测中，产生自RCL 5-7和FS1-3的变体的性能指数(PI)值。还测定了就通过AAPF水解作用的比活性而言的PI值(特异性AAPF PI)。所有的检测均如实施例1中所述进行。所列的变体的序列是相对于BPN′-v3：G97A-G128A-Y217Q。PI值是相对于BPN′-v3计算的。这一列表中的全部突变体就至少一种被检测的特性而言具有等于或大于0.5的PI截止值。小于0.01的PI值被调整为显示粗斜体的0.01。
Figure BDA00001742984403221
Figure BDA00001742984403231
Figure BDA00001742984403241
Figure BDA00001742984403261
Figure BDA00001742984403281
Figure BDA00001742984403301
Figure BDA00001742984403321
Figure BDA00001742984403331
Figure BDA00001742984403341
Figure BDA00001742984403351
Figure BDA00001742984403361
Figure BDA00001742984403371
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自表12-4中所列的那些的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。每种蛋白酶变体可以是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的蛋白酶变体。还包括了包含至少一种此类蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类蛋白酶变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
表12-5提供了就去污而言在洗涤剂组合物1中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测(Det.Comp.1，pH 8，16℃，BMI PI)中，和就稳定性而言在LAS/EDTA(LAS/EDTA稳定性PI)中，BPN′变体(如“用于提高BPN′稳定性的变体的构建”中所述构建的；参见表11-3)的性能指数(PI)值。检测如实施例1中所述进行(BMI微样品检测法，LAS/EDTA稳定性检测法)。变体的序列相对于BPN′和FNA二者显示。即每一变体序列是带有特定的变体氨基酸取代的BPN′或FNA序列。PI值是相对于FNA亲本显示的，所述FNA亲本是BPN′-Y217L。
Figure BDA00001742984403381
本发明包括具有蛋白水解活性和/或相对于FNA提高的稳定性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自表12-5中所列的那些的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。每种蛋白酶变体可以是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的蛋白酶变体。还包括了包含至少一种此类蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类蛋白酶变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
表12-6提供了就去污而言在洗涤剂组合物1中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测中和就稳定性而言在LAS/EDTA中，产生自库亲本BPN′-v3：G97A-G128A-Y217Q(如“用于提高BPN′稳定性的变体的构建”中所述；参见表11-3)BPN′变体的性能指数(PI)值。检测如实施例1中所述进行(BMI微样品检测法和LAS/EDTA稳定性检测法)。性能指数是相对于BPN′-v3：G97A-G128A-Y217Q计算的。这一列表中的全部突变体就至少一种被检测的特性而言具有等于或大于0.5的PI截止值。
Figure BDA00001742984403391
本发明包括具有蛋白水解活性和相对于BPN′-v3提高的稳定性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自表12-6中所列的那些的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。每种蛋白酶变体可以是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的蛋白酶变体。还包括了包含至少一种此类蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类蛋白酶变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
表12-7提供了就去污而言在洗涤剂组合物1中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测中，BPN′变体(如“来自五种不同质粒的BPN′变体的构建”中所述构建的；参见表11-4)的性能指数(PI)值。检测如实施例1中所述进行(BMI微样品检测法)。每种变体的性能指数是相对于BPN′-v3：G97A-G128A-Y217Q计算的。这一列表中的全部突变体就至少一种被检测的特性而言具有等于或大于0.5的PI截止值。
Figure BDA00001742984403401
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自表12-7中所列的那些的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。每种蛋白酶变体可以是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的蛋白酶变体。还包括了包含至少一种此类蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类蛋白酶变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
表12-8提供了就去污而言在洗涤剂组合物1中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测中，(如实施例3中所述的“BPN′-v3+S78N的变体和组合库的产生”中所述产生的)BPN′变体的性能指数(PI)值。检测如实施例1中所述进行(BMI微样品检测法)。每种变体的性能指数是相对于BPN′-S78N-G97A-G128A-Y217Q计算的。调整了小于0.01的PI值并显示为粗斜体的“0.01”。
Figure BDA00001742984403411
Figure BDA00001742984403421
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自表12-8中所列的那些的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。每种蛋白酶变体可以是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的蛋白酶变体。还包括了包含至少一种此类蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类蛋白酶变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
表12-9提供了就去污而言在洗涤剂组合物2中于16℃和pH 8进行的BMI微样品检测中，和就稳定性而言在洗涤剂组合物3中进行的测量中，(如2009年6月3日提交的PCT申请PCT/US09/46156中所述利用PCR融合构建的，该文献就此类描述以引用方式并入本文)BPN′单一变体的性能指数(PI)值。测定了就通过AAPF水解作用的比活性而言的PI值(特异性AAPF PI)。所有的检测均如实施例1中所述进行。性能指数值是相对于BPN野生型计算的。小于0.01的PI值被显示为粗斜体的“0.01”。“Det.Comp.”是指洗涤剂组合物。
Figure BDA00001742984403432
Figure BDA00001742984403441
本发明包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一种选自表12-9中所列的那些的取代的氨基酸序列，其中所述变体的位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。每种蛋白酶变体可以是分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的蛋白酶变体。还包括了包含至少一种此类蛋白酶变体的组合物(包括清洁组合物)和利用至少一种此类蛋白酶变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例13
人工碗碟液体洗涤剂组合物
在本实施例中，提供了多种人工碗碟液体洗涤剂配方。下文中提供了下列本发明的人工碗碟液体洗涤剂组合物。在这些配方中的每一种中，至少一种本文提供的蛋白酶变体被以约0.0001至约10重量百分比的浓度被包括在内。在一些供选择的替代的方面，如由配制人员所决定的，将基于他们的需求使用其他的浓度。
表13-1：轻垢液体盘碟洗涤剂组合物
Figure BDA00001742984403451
Figure BDA00001742984403461
任选的微量组分*：染料、遮光剂、香料、防腐剂、水溶助长剂、加工助剂和/或稳定剂。
(1)直链烷基苯磺酸钠：LAS：C11.4
(2)烷基乙氧基硫酸盐：AExS：
(3)非离子：烷基乙氧基化物
(4)二甲基椰油烷基氧化胺
(5)醇：乙醇
(6)盐：NaCl
(7)阳离子改性的羟乙基纤维素(聚季铵盐-10-UCARE LR-400，得自Amerchol)。
实施例14
液体和颗粒状的衣物洗涤剂
本实施例提供了用于液体衣物洗涤剂的多种配方。下文中提供了下列本发明的液体衣物洗涤剂配方。在这些配方中的每一种中，至少一种本文提供的蛋白酶变体被以约0.0001至约10重量百分比的浓度被包括在内。在一些供选择的替代的方面，如由配制人员所决定的，将基于他们的需求使用其他的浓度。
适用于前加载式自动洗衣机的液体衣物洗涤剂组合物。
Figure BDA00001742984403462
Figure BDA00001742984403471
适用于顶部加载式自动洗衣机的液体衣物洗涤剂组合物。
Figure BDA00001742984403472
Figure BDA00001742984403481
根据本发明制得的适用于洗涤织物的颗粒状洗涤剂组合物。
Figure BDA00001742984403482
Figure BDA00001742984403491
1无规接枝共聚物为聚乙酸乙烯酯接枝的环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。所述聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。
2聚氮丙啶(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲烷氧基化油脂清洁聚合物为聚氮丙啶(MW＝600)，每个-NH具有24个乙氧基化基团，并且每个-NH具有16个丙氧基化基团
4具有下列结构的可逆蛋白酶抑制剂：
Figure BDA00001742984403492
5乙氧基化的噻吩调色染料描述于US 7,208,459B2。
*注意：所有的酶水平均表示为％酶原料，除了(本发明的)冷水蛋白酶是表示为％添加至产品的活性蛋白质以外。
实施例15
单位剂量组合物
本实施例提供了用于单位剂量衣物洗涤剂的多种配方。此类单位剂量配方可包括一个或多个隔室。
下文中提供了下列本发明的单位剂量衣物洗涤剂配方。
Figure BDA00001742984403501
1聚氮丙啶(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
表15-2：多隔室的单位剂量组合物
下文中提供了本发明的多隔室的单位剂量衣物洗涤剂配方。在这些实施例中，单位剂量具有三个隔室，但类似的组合物能够以两个、四个或五个隔室被制得。用于包封所述隔室的膜是聚乙烯醇。
  基础组合物1  ％
  成分
  甘油(最少99)  5.3
  1，2-丙二醇  10.0
  柠檬酸  0.5
  单乙醇胺  10.0
  苛性钠  -
  Dequest 2010  1.1
  亚硫酸钾  0.2
  非离子Marlipal C24EO7  20.1
  HLAS  24.6
  荧光美白剂FWA49  0.2
  C12-15脂肪酸  16.4
  聚合物Lutensit Z96  2.9
  聚乙烯亚胺乙氧基化物PEI600E20  1.1
  MgCl2  0.2
  溶剂(1，2-丙二醇、乙醇)  至100％
多隔室配方
Figure BDA00001742984403511
实施例16
BPN′-v36多肽变体的清洁性能
用BPN′-v36变体作为主链或亲本序列，通过标准的PCR融合，构建了包含两个氨基酸取代的BPN′-v36多肽变体。出于此目的，通过诱变引物扩增了两个或三个部分重叠的片段，所述诱变引物被设计为使得引物编码所期望的取代。PCR扩增反应如上文部分I的实施例7中所述进行。构建了下列的BPN′-v36双重突变变体(即带有下列的两个氨基酸取代的BPN′-v36)：Q019R-N025D，A001Y-Q275R，V004A-S249N，V004E-S260P，V004A-T55A，Y006F-S249C，Y006D-T55A，V008L-Q275R，Q010R-Q275K，L016Q-Q217H，H017R-T158A，S183D-Q206R，P210S-N212D，S018Y-V203A，S018K-V203I，Y021H-D259G，Y021H-D259R，K027R-N269D，K027R-N269T，S037P-S260F，S037T-S260P，D041E-N077D，D041G-N077E，G166V-S183T，N252S-L257H，V044A-Q206H，V044A-Q206K，V044A-Q206R，N076T-N212D，N076P-N212S，N077D-N252D，N077D-N252T，K141I-S248N，T158I-D259N，T158A-D259P，S161E-Q185H，K237M-H238R，G160A-D259G，G160R-D259V，G215R-D259R，G215D-D259V，N061D-Q206R，N061L-Q206H，S009L-N218S，S161E-S260T，Q019A-N109S，T022S-G166V，Y021H-N252H，P129S-K136R，T022S-T242S，N025K-H238R，N025D-Q185R，S037G-Q275H，K043R-N076S，K043N-Q217R，K043N-S163T，T055A-V147A，N061K-N252K，N062Y-G097D，Y021H-V084E，Y021H-S037E，N062Y-T244A，K027E-Y091F，A074S-P129Q，S249R-Q275R，I079V-Q217H，A098T-T158A，K027R-D120H，Q019R-Q185R，G131S-K265N，A133V-D259N，A144H-T244A，I035V-K043N，G160R-T244A，S161P-T253A，S163T-Q245L，K170R-D259G，S183T-S249R，N184Y-Y262N，V198L-D259G，A200T-H226L，Q206R-S260P，G211V-T244A，Q217R-T244A，L75I-N76D，S260P-Q275L，S260P-Q275R，Y262N-Q275R，V004A-Y006F，H017L-Q019A，N025D-V026A，N118G-V121A，V072F-L075I，S183T-R186K，V203A-Q217R和S249R-Y262H。在洗涤剂组合物4中在pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中和在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，检测了这些变体的清洁性能，如部分I的实施例1中所述。结果提供于下文中。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′蛋白酶变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.9且等于或小于1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v3，BPN′-v36，S183T-S249R，N61D-Q206R，Y262N-Q275R，K43R-N76S，S183T-S249R，K170R-D259G，Y6F-S249C，Q19A-N109S，H17L-Q19A，Q19R-Q185R，S18Y-V203A，N61D-Q206R，S161E-S260T，S18K-V203I，V4A-T55A，N252S-L257H，S249R-Y262H，N61L-Q206H，N184Y-Y262N，Q19R-N25D，S249R-Y262H，A74S-P129Q，H17L-Q19A，K27R-D120H，V4A-T55A，Y21H-N252H，K27R-N269D，K27R-N269D，A98T-T158A，179V-Q217H，S9L-N218S，V4A-Y6F，S161P-T253A，V203A-Q217R，T22S-T242S，N76P-N212S，K170R-D259G，S37T-S260P，T55A-V147A，Q19R-Q185R，V4A-Y6F，Q19A-N109S，Y262N-Q275R，G160R-T244A，Q19R-N25D，N25D-Q185R，A98T-T158A，N61L-Q206H，G211V-T244A，S9L-N218S，A144H-T244A，A144H-T244A，S18Y-V203A，Y21H-N252H，A74S-P129Q，A1Y-Q275R，V198L-D259G，T55A-V147A，K141I-S248N，S183T-R186K，S37T-S260P，K27R-D120H，T22S-T242S，S161E-Q185H，P129S-K136R，G211V-T244A，N76P-N212S，K43N-S163T，S37G-Q275H，S161P-T253A，Y6F-S249C，N184Y-Y262N，N252S-L257H，G160R-T244A，S37G-Q275H，P129S-K136R，N62Y-T244A和S260P-Q275R组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性和比BPN′更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v36等于或大于0.9且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在洗涤剂组合物4中在pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种包括至少一种选自由X1Y，X4A，X6F，X9L，X17L，X18K/Y，X19A/R，X21H，X22S，X25D，X27R，X37G/T，X43N/R，X55A，X61D/L，X62Y，X74S，X76P/S，X79V，X98T，X109S，X120H，X129Q/S，X136R，X141I，X144H，X147A，X158A，X160R，X161E/P，X163T，X170R，X183T，X184Y，X185H/R，X186K，X198L，X203A/I，X206H/R，X211V，X212S，X217H/R，X218S，X242S，X244A，X248N，X249C/R，X252H/S，X253A，X257H，X259G，X260P/T，X262H/N，X269D和X275H/R组成的组的取代的取代，以及任选地至少一种选自由A1Y，V4A，Y6F，S9L，H17L，S18K/Y，Q19A/R，Y21H，T22S，N25D，K27R，S37G/T，K43N/R，T55A，N61D/L，N62Y，A74S，N76P/S，I79V，A98T，N109S，D120H，P129Q/S，K136R，K141I，A144H，V147A，T158A，G160R，S161E/P，S163T，K170R，S183T，N184Y，Q185H/R，R186K，V198L，V203A/I，Q206H/R，G211V，N212S，Q217H/R，N218S，T242S，T244A，S248N，S249C/R，N252H/S，T253A，L257H，D259G，S260P/T，Y262H/N，N269D和Q275H/R组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，和比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36的PI值更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′枯草杆菌蛋白酶变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由Y21H-D259G，Y21H-D259G，A133V-D259N，I79V-Q217H，S18K-V203I，T158A-D259P，N61K-N252K，K43N-Q217R，T158A-D259P，Q206R-S260P，A133V-D259N，V198L-D259G，N61K-N252K，S161E-S260T，G160A-D259G，K43N-Q217R，A1Y-Q275R，A200T-H226L，Q217R-T244A，S260P-Q275R，Q206R-S260P，T158I-D259N，Q217R-T244A，L75I-N76D，S161E-Q185H，Y21H-S37E，S249R-Q275R，G160A-D259G，T158I-D259N，Y21H-S37E，N76T-N212D，S260P-Q275L，G131S-K265N，V4A-S249N，N25D-Q185R，K43R-N76S，S183D-Q206R，Q10R-Q275K，K43N-S163T，Q10R-Q275K，N25D-V26A，G131S-K265N，S260P-Q275L，K141I-S248N，L16Q-Q217H，S249R-Q275R，K27R-N269T，P210S-N212D，L75I-N76D，S183D-Q206R，N118G-V121A，G215D-D259V，N76T-N212D，V4A-S249N，K27R-N269T，N62Y-G97D，V4E-S260P，G215D-D259V，K27E-Y91F，Y6D-T55A，N77D-N252T，V4E-S260P，Y6D-T55A，N77D-N252T，N25K-H238R，V44A-Q206H，L16Q-Q217H，S37P-S260F，V44A-Q206R，V44A-Q206H，V44A-Q206R和S37P-S260F组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性、具有比BPN′更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由Y21H-D259G，S183T-S249R，N61D-Q206R，Y262N-Q275R，Y021H-D259G，K043R-N076S，S183T-S249R，A133V-D259N和I079V-Q217H组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ IDNO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在洗涤剂组合物4中在pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中具有比BPN′更强的蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种包括至少一种选自由X021H，X043R，X061D，X076S，X079V，X133V，X183T，X206R，X217H，X249R，X259G/N，X262N和X275R组成的组的取代的取代，和任选地至少一种选自由Y021H，K043R，N061D，N076S，I079V，A133V，S183T，Q206R，Q217H，S249R，D259G/N，Y262N和Q275R组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，和比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36的PI值更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于或等于1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′-v3，BPN′-v36，K170R-D259G，S18K-V203I，Y6F-S249C，Q19A-N109S，H17L-Q19A，Q19R-Q185R，S18Y-V203A，N61D-Q206R，S161E-S260T，S18K-V203I，V4A-T55A，N252S-L257H，S249R-Y262H，N61L-Q206H，N184Y-Y262N，Q19R-N25D，S249R-Y262H，A74S-P129Q，T158A-D259P，H17L-Q19A，K27R-D120H，V4A-T55A，N61K-N252K，Y21H-N252H，K27R-N269D，K43N-Q217R，T158A-D259P，Q206R-S260P，K27R-N269D，A98T-T158A，I79V-Q217H，S9L-N218S，V4A-Y6F，S161P-T253A，V203A-Q217R，T22S-T242S，N76P-N212S，A133V-D259N，K170R-D259G，S37T-S260P，T55A-V147A，V198L-D259G，Q19R-Q185R，V4A-Y6F，Q19A-N109S，Y262N-Q275R，G160R-T244A，Q19R-N25D，N25D-Q185R，N61K-N252K，S161E-S260T，A98T-T158A，N61L-Q206H，G211V-T244A，S9L-N218S，A144H-T244A，A144H-T244A，S18Y-V203A，Y21H-N252H，A74S-P129Q，G160A-D259G，K43N-Q217R，A1Y-Q275R，A1Y-Q275R，A200T-H226L，Q217R-T244A，S260P-Q275R，V198L-D259G，T55A-V147A，Q206R-S260P，K141I-S248N，S183T-R186K，T158I-D259N，S37T-S260P，K27R-D120H，T22S-T242S，Q217R-T244A，S161E-Q185H，P129S-K136R，G211V-T244A，N76P-N212S，L75I-N76D，S161E-Q185H，Y21H-S37E，S249R-Q275R，G160A-D259G，K43N-S163T，T158I-D259N，Y21H-S37E，S37G-Q275H，S161P-T253A，N76T-N212D，S260P-Q275L，Y6F-S249C，N184Y-Y262N，G131S-K265N，V4A-S249N，N25D-Q185R，N252S-L257H，K43R-N76S，S183D-Q206R，G160R-T244A，Q10R-Q275K，S37G-Q275H，K43N-S163T，Q10R-Q275K，N25D-V26A，P129S-K136R，G131S-K265N，S260P-Q275L，K141I-S248N，T22S-G166V，N62Y-T244A，L16Q-Q217H，S249R-Q275R，S260P-Q275R，K27R-N269T，P210S-N212D，L75I-N76D，S183D-Q206R，N118G-V121A，G215D-D259V，N76T-N212D，V4A-S249N，K27R-N269T，G166V-S183T，N62Y-G97D，V4E-S260P，G215D-D259V，K27E-Y91F，Y21H-D259R，Y6D-T55A，N77D-N252T，V4E-S260P，Y6D-T55A，N77D-N252T，Y21H-D259R，N25K-H238R，N77D-N252D，V44A-Q206H，L16Q-Q217H，V72F-L75I，S37P-S260F，V72F-L75I，N77D-N252D，V44A-Q206R，S163T-Q245L，V44A-Q206H，V44A-Q206R，S37P-S260F，G215R-D259R，V44A-Q206K和V44A-Q206K组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例17
附加的BPN′-v36多肽变体的清洁性能
用包含BPN′表达盒的pHPLT-BPN′-v36质粒作为用于克隆的模板DNA(亲本质粒)，由DNA2.0(Menlo Park，CA)合成了下列BPN′-v36变体：N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N61G-N109G-A128S-S224A，N61G-N109G-A128S-S224A-N243V，N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N109Q-A128S-S224A，N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V，N109S-A128S-S224A，N109S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V，N109M-A128S-S224A，N109M-A128S-S224A-N243V，A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S，N109G-A114S-A128S-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V，N109G-A114S-A128S-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A-N243V，N109G-A128S-S183V，N109G-A128S-S183L，N109G-A128S-S183L-S224A，N109G-A114S-A128S-S183L-S224A，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V，N76D-N109G-A128S-S224A，N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V，N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，S33T-A128S-N218S，S33T-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V，S33T-N61P-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，I31L-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q  和A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q。
使上述变体生长以表达蛋白质，如部分I的实施例11中所述。就这些变体的性能，在洗涤剂组合物4中在pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测、在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测和AAPF检测中，测试了这些变体，如部分I的实施例1中所述。结果提供于下文中。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V，N109G-A128S-S183V，N109G-A128S-N243V-K256R，N109M-A128S-S224A，A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V，N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V，N109S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-AI16T-N243V，N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V，N109G-A116T-N243V-K256R，N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在洗涤剂组合物4中在pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中具有比BPN′-v36更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种包括至少一种选自由X61G/P/S，X63G，X88T，X101Q，X109G/M/Q/S，X114S，X116T，X128S，X129S，X130T，X158S，X183L/V，X224A，X243V，X248A和X256R组成的组的取代的取代，和任选地至少一种选自由N61G/P/S，S63G，A88T，N101Q，N109G/M/Q/S，A114S，A116T，A128S，P129S，S130T，T158S，S183L/V，S224A，N243V，S248A和K256R组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，和比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36的PI值更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.9且等于或小于1.0的PI值：包含至少一组选自由G24S-G53S-N78S-G97A-N101S-A128S，G24S-G53S-N78S-G97A-N101S，BPN′-v36，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R，S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-A128S-N218S，A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S，N109G-A114S-A128S-S183L-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S-N243V，N109G-A128S-S224A-N243V，N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L-S224A，N61G-N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L，S33T-N76D，N109S-A128S-S224A，N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，N109M-A128S-S224A-N243V，S63G-N109G，N109G-K256R，S63G-N76D，S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V和S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性，比BPN′更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.9且小于或等于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，S33T-N76D-A128S-N218S，N76D-N109G-A128S-S224A和S33T-N61P-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ IDNO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-A128S-N218S，A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S，N109G-A114S-A128S-S183L-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N109G-A128S-S183V，N109G-A114S-A128S-N243V，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-A128S-S224A-N243V，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L-S224A，N61G-N109G-A128S-S224A，N109M-A128S-S224A，A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V，N109M-A128S-S224A-N243V，S63G-A128S，A88T-N109G-A116T-N243V，N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V，N109G-A116T-N243V-K256R，N109G-A116T，S63G-N109G，A88T-N109G，N109G-K256R，N61G-N109G-N243V，S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V，N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于例如清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在洗涤剂组合物4中在pH 8和16℃进行的鸡蛋微样品清洁检测中具有比BPN′-v36更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36大于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种包括至少一种选自由X1G，X33T，X55P，X61G/P/S，X63G，X76D，X88T，X101Q，X109G/M/Q/S，X114S，X116T，X128S，X129S，X130T，X131H，X158S，X169A，X183L/V，X218S，X224A，X243V，X248A/N，X249Q，X256R组成的组的取代的取代，和任选地至少一种选自由A1G，S33T，T55P，N61G/P/S，S63G，N76D，A88T，N101Q，N109G/M/Q/S，A114S，A116T，A128S，P129S，S130T，G131H，T158S，G169A，S183L/V，N218S，S224A，N243V，S248A/N，S249Q，K256R组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，和比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36的PI值更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的鸡蛋BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值：包含至少一组选自由取代S33T-N76D-A128S-N218S，N76D-N109G-A128S-S224A和S063G-N76D组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含选自由S33T-N76D-A128S-N218S、N76D-N109G-A128S-S224A和S063G-N076D组成的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在AAPF蛋白水解检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有大于1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、大于1.0至约10、大于1.0至约8、或大于1.0至约5的PI值：包含至少一组选自由G24S-G53S-N78S-G97A-N101S-A128S，I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R，S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-A128S-N218S，S33T-A128S-N218S，A1G-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S，N109G-A114S-A128S-S183L-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N109G-A128S-S183V，N109G-A114S-A128S-N243V，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-A128S-S224A-N243V，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L-S224A，N61G-N109G-A128S-S224A，N76D-N109G-A128S-S224A，N109M-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L，S33T-N76D，A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V，N109Q-A128S-S224A-N243V，N109S-A128S-S224A，A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V，N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，N109M-A128S-S224A-N243V，S63G-A128S，N109S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-N243V，N61S-N109G-N243V，N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V，N109G-A116T-N243V-K256R，A88T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R，N109G-A116T，S63G-N109G，A88T-N109G，N109G-K256R，N61G-N109G-N243V，S33T-N61P-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V，N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V和A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，以及比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更高的PI值。本发明包括在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)更强的蛋白水解活性，比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，相对于BPN′-v3大于1.0至约5的PI值和/或相对于BPN′-v36大于1.0至约5的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
还提供了在AAPF蛋白水解检测中具有比BPN′-v36更强的蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36大于1.0的PI值的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％的同一性的氨基酸序列，其中所述变体包含至少一种包括至少一种选自由X1G，X31L，X33T，X55P，X61G/P/S，X63G，X76D，X88T，X101Q，X109G/M/Q/S，X114S，X116T，X128S，X129S，X130T，X131H，X158S，X169A，X183L/V，X218S，X224A，X243V，X248A/N，X249Q和X256R组成的组的取代的取代，和任选地至少一种选自由A1G，I31L，S33T，T55P，N61G/P/S，S63G，N76D，A88T，N101Q，N109G/M/Q/S，A114S，A116T，A128S，P129S，S130T，G131H，T158S，G169A，S183L/V，N218S，S224A，N243V，S248A/N，S249Q和K256R组成的组的取代，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的位点相对应。此类变体在这一检测中具有比BPN′(SEQ ID NO：2)、BPN′-v3和BPN′-v36更强的蛋白水解活性，和比BPN′、BPN′-v3和BPN′-v36的PI值更高的PI值。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在AAPF蛋白水解检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值：包含氨基酸取代G24S-G53S-N78S-G97A-N101S或S063G-N76D的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含取代G24S-G53S-N78S-G97A-N101S或S063G-N76D的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
实施例18
来自基于BPN′-v36多肽的组合库的多肽BPN′-v36多肽变体的清洁性能
由DNA2.0(Menlo Park，CA)合成了两个分别的组合库(AJ1和AJ2)，并以单独的连接反应交付。包含BPN′表达盒的pHPLT-BPN′-v36质粒(图4)被作为用于构建库的模板DNA(亲本质粒)。就每一库而言，可能的氨基酸位点和取代的列表显示于表23-1中。用于每一库的连接反应被用于转化枯草芽孢杆菌，使库的变体生长以表达蛋白质，如实施例11中所述。在洗涤剂组合物4(来自表1-3)中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，测试了上述变体的性能，如实施例1中所述。
Figure BDA00001742984403681
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于或等于1.0的PI值：包含至少一组选自由BPN′v36，BPN′v3(G024S-G053S-N078S-G097A-N101S)，BPN′v3(G024S-G053S-N078S-G097A-N101S，BPN′v12(G024S-G053S-N078S-G097A-N101S-A128S)，N062L，N062L-S063G，N062S，N062S-S063G-Q217L，N062S-S063L-Q217L，N062S-S063N，N062S-S063R，Q217E，S063G，S063G-Q217L，S063G-Q217L-M222S，S063L-Q217L，S063N，S063N-Q217L，D099N-K141Y-K213Q，D099N-K141Y-K256Q，K043T，K043T-K141Y-E156Q，N062L-Q217E，N062L-Q217L，N062L-S063G-Q217E，N062L-S063L，N062L-S063N-Q217L，N062S-Q217L，N062S-S063G，N062S-S063L，N062S-S063N-Q217L，N062S-S063R-Q217E，Q217L，S063G-Q217E，S063N-Q217E，S063R，S063R-Q217E，S063R-Q217L，)，D099N-K141Y-K213Q，D099N-K141Y-K256Q，K043T，K043T-K141Y-E156Q，N062L-Q217E，N062L-Q217L，N062L-S063G-Q217E，N062L-S063L，N062S-Q217L，N062S-S063G，N062S-S063L，N062S-S063N-Q217L，Q217L，S063G-Q217E，S063N-Q217E，S063R，S063R-Q217E和S063R-Q217L组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且等于或小于1.0的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
在洗涤剂组合物4中于pH 8和16℃进行的BMI微样品清洁检测中，下列BPN′-v36变体被测定为相对于BPN′-v36具有等于或大于0.5且小于0.9的PI值：包含至少一组选自由D099N，K141Y-E156Q，N062L-S063L-Q217L，N062L-S063N，N062L-S063N-Q217E，N062L-S063R，N062L-S063R-Q217L，N062S-Q217E，N062S-S063G-Q217E，N062S-S063G-Q217R，N062S-S063N-Q217R，S063G-S125A，D060G-Q217L，D120N-K141Y-K213Q，K043T-D099N-D120N-K141Y，K043T-D099N-K141Y-K256Q，K043T-K237A，N062L-S063G-Q217R，N062L-S063G-S125A，N062L-S063L-Q217E，N062L-S063N-S125A-Q217L，N062S-Q217R，N062S-S063L-Q217E，N062S-S063R-Q217L，S063G-M222S，S063G-Q217R，D120N-E156Q-K256Q，K141Y-D197N，N062L-Q217R，N062L-S063G-Q217L-M222S，N062L-S063L-Q217R，N062L-S063N-Q217R，N062S-Q217G，N062S-S063G-Q217G，N062S-S063G-Q217L-M222L，N062S-S063G-S125A-Q217L，N062S-S063N-Q217E，Q217G，S033G-N062S-S063G，S063G-Q217G，S063G-Q217L-M222L，S063G-S125A-Q217R，S063L-Q217R，S063N-M222S，S063N-Q217R，S063N-S125A-Q217L，S063R-Q217R，S063R-S125A-Q217L，D099N-E156Q-K256Q，E156Q，K012T-D099N-K213Q，K012T-K256Q，K043T-D099N-K141Y-K213Q，K043T-E156Q，K141Y-K213Q，N062L-Q217G，N062L-Q217L-M222L，N062L-Q217L-M222S，N062L-S063G-M222S，N062L-S063G-Q217L-M222L，N062L-S063G-Q217R-M222S，N062L-S063N-Q217L-M222S，N062L-S063N-S125A，N062L-S063R-S125A，N062L-S125A，N062S-S063G-M222S，N062S-S063G-Q217G-M222S，N062S-S063G-S125A，N062S-S063N-Q217L-M222L，N062S-S063N-S 125A-Q217L，N062S-S063R-Q217G，N062S-S063R-Q217L-M222S，Q217G-M222S，Q217L-M222S，Q217R，S033G-S063G-Q217R，S063G-Q217E-M222S，S063G-S125A-Q217G，S063L-Q217E，S063N-Q217G，S063N-Q217G-M222S，S063N-Q217L-M222S，S063R-Q217L-M222S和S063R-S125A组成的组的氨基酸取代的BPN′-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2的序列相对应。此类变体具有蛋白水解活性。本发明包括在这一检测中具有蛋白水解活性和/或相对于BPN′-v36等于或大于0.5且小于0.9的PI值的蛋白酶变体，所述变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％或99％的同一性并且包含至少一组选自上文所述的组的氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸位点的编号与SEQ ID NO：2序列的氨基酸位点相对应。还包括了包含至少一种此类变体的组合物(包括但不限于：例如，清洁组合物)和利用至少一种此类变体的用于清洁的方法，如本文中在别处所详述的。
部分II
用于制备GG36冷水蛋白酶变体的方法
适用于产生编码GG36冷水蛋白酶变体的本发明的经修改的多核苷酸的多种方法是本领域中已知的，包括但不限于：例如，点饱和诱变、分区诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变、靶向进化、以及多种其他重组方法。制备系列IGG36冷水蛋白酶变体的非限制性的示例性方法提供于上文的部分中，题目为“用于制备本发明的蛋白酶变体多肽的载体、细胞和方法”。
实施例19
就对热灭活的洗涤剂中酶活性的检测而言，洗涤剂的工作液从热灭活的原液制得。适当量的水硬度(例如，6gpg或12gpg)和缓冲液被加入洗涤剂溶液中，以匹配所期望的条件。溶液通过旋涡振荡或颠倒瓶子混合。下表提供了关于本文所使用的一些可商购获得的洗涤剂和检测条件的信息。在一些实验中，附加的和/或其他的可商购获得的洗涤剂被用于下列的实施例中。
在一些附加的实施例中，使用了下列溶液：
表19-3提供了根据本发明制备的适用于洗涤织物的颗粒状的衣物洗涤剂组合物。
Figure BDA00001742984403721
在表19-3中，所有的酶水平均表示为％酶原料，除了(本发明的)冷水蛋白酶变体是表示为％添加至产品的活性蛋白质以外。表19-4提供了适用于顶部加载式自动洗衣机(洗涤剂组合物7-9)和前加载式洗衣机(洗涤剂组合物10-11)的颗粒状衣物洗涤剂组合物。被测试的GG36蛋白酶变体和/或本发明的BPN′变体和/或冷水蛋白酶变体被分别地添加至这些制剂中。
Figure BDA00001742984403722
Figure BDA00001742984403731
Figure BDA00001742984403741
在表19-4中，表面活性剂成分可以从任何适当的供应商获得，包括但不限于BASF(例如，
Figure BDA00001742984403742
)、Shell Chemicals、Stepan、Huntsman和Clariant(例如，
Figure BDA00001742984403743
)。沸石可以从类似Industrial Zeolite的来源获得。柠檬酸和柠檬酸钠可以从类似Jungbunzlauer的来源获得。过碳酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠和碳酸氢三钠可以从类似Solvay的来源获得。丙烯酸盐/马来酸盐共聚物可以从赖斯BASF的来源获得。羧甲基纤维素和疏水改性的羧甲基纤维素可以从类似CPKelco的来源获得。C.I.荧光增白剂260可以从3V Sigma获得(例如，
Figure BDA00001742984403744
Figure BDA00001742984403745
或
Figure BDA00001742984403746
S，S-乙二胺二琥珀酸四钠可以从类似Innospec的来源获得。对苯二甲酸共聚物可以从Clariant获得(例如，REPELOTEX SF 2)。此外，1-羟乙烷-1，1-二膦酸可以从Thennphos获得。基于过氧亚胺正离子的漂白增强剂具有下列结构，其中R1＝2-丁基辛基，并且依照US 2006/0089284A1来制备。
酶
Figure BDA00001742984403747
Figure BDA00001742984403748
和可以从Novozymes获得。四磺酸酞菁锌可以从Ciba Specialty Chemicals获得(例如，
Figure BDA000017429844037410
)。抑泡剂颗粒可以从Dow Corning获得。在这些洗涤剂组合物中，无规接枝共聚物为聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。所述聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。
检测和测试方法
本实施例描述了多种使用的检测法并提供了测试方法4-6的更多细节。
用于在96孔微量滴定板中测定蛋白质含量的TCA检测法
就GG36和GG36变体而言，该检测法采用来自微量滴定板的经过过滤的枯草芽孢杆菌培养物上清液，其中所述枯草芽孢杆菌培养物已在37℃、以250rpm摇动下潮湿通气生长2-3天。新的96孔平底微量滴定板(MTP；Costar 9017培养基结合的透明聚苯乙烯板)被用于这一检测法。首先，将100μl/孔的0.25N的HCl置于每个孔中。然后，加入20-25μl经过过滤的培养物上清液，并在桌面型混合器(例如，Lab line Instruments，Titer平板振荡器，型号4825)上混合溶液5-10秒。然后测定405nm的光散射/吸光度，以提供“空白”读数。就“测试”读数而言，100μl/孔的30％(w/v)三氯乙酸(TCA)被添加至每一包含HCL和培养上清液的混合物的孔中，并于室温孵育平板10分钟。在桌面型混合器上短暂混合上述溶液不超过2-3秒后，测定405nm的光散射/吸光度。样品中的浊度/光散射升高与上述培养上清液中可沉淀的蛋白质的总量相关。通过从“测试”读数(在加入TCA后获得，如上所述)中减去“空白”读数(在仅加入HCl后获得，不含TCA)进行了计算，以提供对样品中蛋白质含量的相对测量。如果需要，通过用对具有已知的转换因子的克隆的AAPF检测，来校正TCA读数，能够构建标准曲线。然而，就50份至500份每一百万份(ppm)蛋白质(其中1ppm相当于1mg/L)的蛋白质浓度而言，TCA结果是线性的，因此能够直接用其对酶的性能作图，以便选择具有所期望的性能的变体。
96孔微量滴定板中的AAPF蛋白酶检测法
为了测定所述丝氨酸蛋白酶变体的蛋白酶活性，对N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对-硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解进行了测量。所使用的试剂溶液是：100mM的Tris/HCl，pH 8.6，包含
Figure BDA00001742984403751
(Tris稀释缓冲液)；100mM的Tris缓冲液，pH 8.6，包含1mM的CaCl2和
Figure BDA00001742984403752
(Tris/Ca缓冲液)；和160mM的溶于DMSO的suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA原液)(Sigma：S-7388)。将1ml的suc-AAPF-pNA原液添加至100ml的Tris/Ca缓冲液中并充分混合至少10秒，以制备suc-AAPF-pNA工作液。通过将10μl经稀释的蛋白酶溶液添加到96孔MTP的每个孔中，然后立即加入190μl的1mg/ml的suc-AAPF-pNA工作液，进行了检测。混合溶液5秒，然后于25℃在MTP读取器中以动力学模式(5分钟内25次读数)读取405nm的吸光度变化。蛋白酶活性表示为AU(活性＝ΔOD·min-1ml-1)。
Eglin C抑制检测法
如本文所述，通过用名为eglin c(水蛭素c)的抑制剂滴定，测定了丝氨酸蛋白酶的浓度和比活性。来自水蛭(Hirudo medicinalis，医用水蛭)的Eglin c是枯草杆菌蛋白酶和ASP蛋白酶的紧密结合的蛋白抑制剂(Heinz等人，Biochemistry，31：8755-66[1992])，因此能够被用于测量蛋白酶的酶浓度，从而允许比活性的计算。通过标准方法合成了eglin c的基因并在大肠杆菌(E.coli)中表达。其特性和抑制性效能与购自Sigma的eglin c是相同的。
(i)Eglin C原液的浓度测定
已知比活性的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶样品被稀释于包含1mM的CaCl2和
Figure BDA00001742984403761
的pH 8.6的100mM的Tris缓冲液(Tris/Ca缓冲液)中，稀释至适合上文所述的AAPF蛋白酶检测法的浓度。在上述Tris/Ca缓冲液中还制备了eglin c原液的多种稀释液。将每种经稀释的eglinc溶液的一份等分试样与等体积的经稀释的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶溶液混合。将仅有Tris/Ca缓冲液而不含eglin c的一份等分试样也与等体积的经稀释的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶溶液混合，以测量不存在eglin c时未被抑制的枯草杆菌蛋白酶活性。于室温孵育混合的溶液15-30分钟，然后通过上文所述的AAPF检测法测量了每一样品的蛋白酶活性。利用迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的已知的比活性，测定了每一样品中活性蛋白酶的浓度。然后，基于与未被抑制的枯草杆菌蛋白酶样品(其仅与Tris/Ca缓冲液混合，不含eglin c)的比较所观察到的蛋白酶活性的降低，计算了每一样品中eglin c的浓度。如此，利用eglin c溶液已知的稀释度和体积，确定了原液中的eglin c浓度。
(ii)枯草杆菌蛋白酶变体的浓度和比活性测定
枯草杆菌蛋白酶变体的样品被稀释于包含1mM的CaCl2和
Figure BDA00001742984403762
的pH 8.6的100mM的Tris缓冲液(Tris/Ca缓冲液)中。在上述Tris/Ca缓冲液中还制备了已知浓度的eglin c原液的多种稀释液。将每种经稀释的eglin c溶液的一份等分试样与等体积的枯草杆菌蛋白酶变体溶液混合。于室温孵育混合的溶液15-30分钟，然后通过AAPF检测法测量了每一样品的蛋白酶活性。利用当加入每一eglin c样品时所观察到的蛋白酶活性的降低和eglin c的已知的浓度，计算了完全抑制每种枯草杆菌蛋白酶变体所需的eglin c的浓度。这一浓度等价于样品中的酶浓度。将仅有Tris/Ca缓冲液而不含eglin c的一份等分试样也与每种枯草杆菌蛋白酶变体样品混合，并通过AAPF检测法测量了不存在eglin c时的蛋白酶活性。然后利用如上测定的酶浓度计算了枯草杆菌蛋白酶变体的比活性。
测试方法4-6的BMI微样品检测法
从CFT获得了5.5毫米圆直径的血液、乳品和墨水(BMI)污染的微样品(EMPA116)。在一种方法中，在将上述EMPA116BMI织物按每孔一份微样品切割至96孔微量滴定板(Corning 3641)中之前，在水中预清洗了所述EMPA116BMI织物。在第二种方法中，上述EMPA 116织物被直接切割至96孔微量滴定板(Corning 3641)中，然后用两次水洗在其中清洗了样品。通过将200μl的Milli Q水添加至每一孔/样品中，然后在桌面型混合器(Lab line instruments，Titer平板振荡器，型号4825)上于设定7混合15分钟，进行了清洗。移除洗涤液体，再次向样品加入200μl水，进行另一次15分钟的清洗。移除洗涤水，然后在所述微量滴定板中空气干燥了所述样品。
将洗涤剂组合物7-11(表19-4)在Milli-Q(去离子)水中稀释至表19-1中所述的最终工作浓度。用2mM的碳酸钠，pH 10.3缓冲了这些洗涤剂。此外，还向每一洗涤剂溶液中添加了水硬度组合物(3∶1的Ca∶Mg.-CaCl2∶MgCl2·6H2O)至表19-5中所述的最终浓度。将上述洗涤剂溶液在室温混合0.5小时至2小时，在50ml聚丙烯锥形管中于3000×g离心5-10分钟，然后置于室温以用于32℃的检测或在冰-水浴中预平衡以用于16℃的检测。然后，190μl所期望的洗涤剂溶液被添加至包含BMI微样品的MTP的每个孔中。将5-15μl经稀释的酶主稀释溶液添加至这一混合物中，得到在反应中0.25-2μg/ml的适当酶浓度。上述酶主稀释溶液制备自经过过滤的培养上清液(参见上文所述的TCA检测法)，浓度为～2.5-20μg/mL。用胶带密封MTP，并放入在冰箱中预设在16℃的iEMS孵育/振荡器(Thermo/Labsystems)中30分钟或者在桌面上预设在32℃进行30分钟，并以1400rpm搅拌。在适当条件下孵育之后，从每一孔中转移120-125μl溶液至一块新的MTP(Corning 9017)。使用MTP SpectraMax读取器在600nm对上述包含125μl溶液/孔的新的MTP进行读数(在平板读取器中采用5秒混合模式)。检测还包括了包含微样品和洗涤剂但不含任何酶的空白对照物。用空白值(不含酶的底物)对获得的吸光度值进行了校正，提供了对水解活性的测量。对每种样品(变体)计算了性能指数。性能指数比较了变体(测量值)和标准品酶(理论值)在相同蛋白质浓度的性能。此外，利用标准品蛋白酶的性能剂量反应曲线的参数，能够计算所述理论值。大于1(PI＞1)的性能指数(PI)指示与标准品(例如，野生型)相比更好的变体，而等于1的PI(PI＝1)指示与标准品表现相同的变体，小于1的PI(PI＜1)指示表现比标准品更差的变体。因此，PI指示了“胜利者”，以及不那么期望在某些情况下使用的变体。
Figure BDA00001742984403781
LAS/EDTA稳定性检测
在置于指定条件下孵育之后，测定了在典型的阴离子表面活性剂(LAS＝直链烷基苯磺酸盐，十二烷基苯磺酸钠-DOBS)和EDTA二钠的存在下，蛋白酶变体的稳定性，并用上文所述的AAPF检测法测定了残余活性。所使用的试剂为：十二烷基苯磺酸，钠盐(DOBS；Sigma No.D-2525)，
Figure BDA00001742984403782
(Sigma No.P-8074)，EDTA二钠(Siegfried HandelNo.164599-02)，HEPES(Sigma No.H-7523)，无压力缓冲液：50mM的
Figure BDA00001742984403783
pH 8.0，压力缓冲液：50mM的HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM的EDTA(3.36g/l)，pH 8.0，参考蛋白酶和蛋白酶变体培养上清液，包含200-400μg/ml蛋白质。所使用的设备为：V-或U-底部MTP用作稀释平板(分别为Greiner 651101和650161)，用于无压力和LAS/EDTA缓冲液以及用作suc-AAPF-pNA平板的F-底部MTP(Corning 9017)，Biomek FX(BeckmanCoulter)，Spectramax Plus 384MTP读取器(Molecular Devices)和iEMS孵育/振荡器(Thermo Electron Corporation)。
iEMS孵育/振荡器(Thermo/Labsystems)被设定在29℃。将培养上清液稀释至包含无压力缓冲液的平板中，使得浓度为约～25ppm(主稀释液平板)。就该检测而言，20μl的样品被从上述主稀释液平板中添加至包含180μl的无压力缓冲液的平板中，以得到2.5ppm的最终孵育浓度。将上述内容物混合并置于室温下，在该平板上进行了AAPF检测。此外，20μl来自上述主稀释平板的样品也被添加至包含180μl压力缓冲液(50mM的HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM的EDTA(3.36g/l)，pH8.0)的平板中。溶液被混合并立即被置于400rpm的29℃的iEMS振荡器中30分钟。孵育30分钟后，在该压力平板上进行了AAPF检测。通过计算残余的与初始的AAPF活性的比率如下：残余活性(％)＝[mOD.min-1压力]*100/[mOD.min-1无压力]，测定了样品的稳定性。
基于待使用的检测体系(例如，北美、日本、西欧、或中欧条件)，确定了最终的洗涤剂、水硬度和缓冲液浓度。在一些方面，在可商购获得的洗涤剂中测定了蛋白酶变体的去污性能。商品化洗涤剂的热灭活起到破坏任何蛋白质组分的酶活性，同时保持非酶组分的特性的作用。因此，这一方法适用于准备商购的洗涤剂以用于对本发明的酶变体的测试中。
烤鸡蛋微量滴定检测法
就这一检测法而言，由鸡蛋黄制备了96孔烤鸡蛋黄底物平板。将鸡蛋黄与蛋白分离，从膜囊中释放蛋黄，并用Milli-Q水稀释20％(体积/重量)。用磁力搅拌器于室温搅拌稀释的蛋黄15分钟。用8通道移液器吸取五μl加至96孔V底平板(Costar#3894)的每一孔的中央。将平板在90℃烘烤1小时，然后在室温冷却。上述烤鸡蛋黄底物平板被贮存于室温，并在制备后一周内被使用。如本文所述制备自动碗碟洗涤剂，并预热至50℃。用8通道移液器向上述96孔板的每一孔加入一份190μl的洗涤剂等分试样。用96通道移液设备向每一孔加入十μl经稀释的酶。用黏性的金属箔密封层小心地密封平板，并于50℃摇动孵育30分钟。将120μl反应混合物转移至新的96孔平底平板，并测定405nm的吸光度/光散射。405nm的吸光度/光散射与鸡蛋黄的移除成比例。
性能指数
性能指数比较了变体(测量值)和标准品酶(理论值)在相同蛋白质浓度的性能。此外，利用标准品蛋白酶的性能剂量反应曲线的参数，能够计算所述理论值。下列的多个术语被用于描述上述变体：无害的变体具有＞0.05的PI；有害的变体具有＝0.05的PI；可合并的变体是就至少一种特性而言具有大于或等于0.2的性能指数值，而就全部特性而言具有＞0.05的性能指数值的那些变体。可合并的变体是能被合并以递送就一种或多种所期望的特性而言具有适当的性能指数的蛋白质的那些变体。这些数据被用于改造任何枯草杆菌蛋白酶/枯草杆菌酶。即使待改造的枯草杆菌酶在特定位点具有与枯草杆菌蛋白酶GG36的不同的氨基酸，在发现将改变所期望的特性的取代方面，这些数据通过鉴定出用于取代的最佳选择，包括对GG36野生型氨基酸的取代，而也是有用的。
实施例20
用位点评估库(SEL)构建GG36单突变体
本实施例中所述的GG36SEL的构建，是由GENEART采用他们用于基因优化、基因合成、库的构建和分析的专有方法和技术平台进行的(WO2004/059556A3，欧洲专利0200362和0201184；以及美国专利4,683,195、4,683,202和6,472,184)。由发明人使用pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒(参见图6)在预先选择的位点制备了GG36SEL。这种枯草芽孢杆菌表达质粒包含下文所示的GG36表达盒、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)LAT启动子(Plat)和来自pUB110(McKenzie等人，Plasmd，15：93-103，1986)的附加的元件，包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博莱霉素抗性标记(bleo)(美国专利6,566,112中的图4)。pHPLT-GG36质粒图谱提供于图6中。GG36表达盒序列提供于下文中。
GG36的DNA序列(信号序列以小写字母显示，前肽以小写加下划线的文本表示，GG36成熟序列以大写字母表示)提供如下：
Gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagt agaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgatt cctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgagctcgatccagcgatttcttatattgaagaggat gcagaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAA(SEQ ID NO：756)
GG36的蛋白质序列(信号序列以小写字母显示，前肽以小写加下划线的文本表示，GG36成熟蛋白酶序列以大写字母表示)提供如下：
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhe fetipvlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAOSVPWGISRVOAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQID NO：757)。
诱变方法是基于密码子特异性的突变方法，在该方法中，利用在所关注的位点包含简并密码子NNS((A、C、T或G)，(A、C、T或G)，(C或G))的正向和反向诱变引物，在所关注的特异性密码子处同时产生全部可能的氨基酸取代。为了构建每一GG36SEL，进行了三个PCR反应：两个诱变反应(初始PCR1和PCR2)使用NNS正向和反向诱变引物(25-45个核苷酸长度)来将所关注的突变密码子引入成熟的GG36DNA序列，以及用于使上述两种诱变PCR产物融合到一起，以构建在成熟的GG36序列中具有所期望的突变密码子的pHPLT-GG36表达载体的第三个反应。
在本实施例中使用的引物序列提供如下：
Figure BDA00001742984403821
Phusion高保真DNA聚合酶(Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，Finnzymes目录号F-530L)被用于所有的PCR中，反应按照随聚合酶提供的制造商规程进行。具体地讲，就初始PCR 1而言，使用pHPLT-BglII-Fw引物和NNS反向诱变引物各1μl(10μM)，就初始PCR 2而言，使用pHPLT-BglII-Rv引物和NNS正向诱变引物各1μl(10μM)。每一反应还包括1μl的pHPLT-GG36质粒模板DNA(0.1-1ng/μL)。MJ Research PTC-200Peltier热循环仪被用于上述PCR。上述反应产生两段大约2kb至3kb的片段，所述片段具有围绕所关注的GG36密码子的大约30个核苷酸的重叠。在与以上所述的类似的第三个PCR反应中，使所获得的片段融合，第三个PCR反应使用1μl的初始PCR 1反应混合物、1μl的初始PCR 2反应混合物和正向和反向SacI-Fw和HindIII-Rv引物各1μl(10μM)。(用
Figure BDA00001742984403822
Qiaquick PCR纯化试剂盒)纯化了所扩增的编码GG36变体基因的859bp线性片段，并用SacI和HindIIII限制性酶消化，以在上述融合片段的两端产生粘性末端。约50ng的pHPLT-GG36质粒在用SacI和HindIIII消化后也被纯化，得到3.9kb的载体主链片段。使用T4DNA连接酶(Invitrogen)，按照用于粘性末端的克隆的制造商规程，将上述经消化的载体片段与50ng经消化的编码变体酶的859bp片段连接。随后，连接混合物被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::[xylR，pxylA-comK])，如文献(WO 2002/014490)所述。
携带GG36变体质粒的枯草芽孢杆菌菌株被接种至包含150μl的补充了10μg/ml新霉素的Luria肉汤培养基的微量滴定板中，以表达变体蛋白质，用于进一步的生物化学分析。将Enzyscreen盖子(Enzyscreen)用于微量滴定板上，使平板在80％湿度下于37℃以300rpm摇动生长过夜。十微升的来自上述过夜平板的培养物被用于接种新的包含190μl含10ug/ml新霉素的MBD培养基(基于MOPS的合成培养基)的微量滴定板。MBD培养基的制备基本如本领域所已知的(参见Neidhardt等人，J.Bacteriol.119：736-747[1974])，不同的是从基础培养基中去除了NH4Cl，FeSO4和CaCl2，使用了3mM的K2HPO4，并且向基础培养基补充了60mM脲和100ml由210g/l的葡萄糖和350g/l的麦芽糖糊精制成的溶液。微量营养素以100X原液的形式制成，一升原液中包含：400mg的FeSO4·7H2O、100mg的MnSO4·H2O、100mg的ZnSO4·7H2O、50mg的CuCl2·2H2O、100mg的CoCl2·6H2O、100mg的NaMoO4·2H2O、100mg的Na2B4O7·10H2O、10ml的1M的CaCl2和10ml的0.5M的柠檬酸钠。使用Enzyscreen盖子(Enzyscreen)，让包含MBD培养基的微量滴定板在80％湿度下于37℃以300rpm摇动生长68小时，以测定蛋白质的表达。次日，通过微量过滤平板(0.22um；Millipore)过滤培养物，所得到的滤液被用于生物化学分析。针对洗涤剂组合物7-11的TCA和BMI微样品检测法如实施例19中所述进行。还如测试方法4-6(测试方法4-6如实施例19中所详述的)的BMI检测法之下所述计算了性能指数，并相对于GG36显示于表20-2中。在下列的表中，洗涤剂组合物(“Det.”)对应于上文的表19-4中显示的那些。此外，如文，氨基酸位点按照BPN′编号列出。
Figure BDA00001742984403841
Figure BDA00001742984403851
Figure BDA00001742984403861
Figure BDA00001742984403871
Figure BDA00001742984403881
Figure BDA00001742984403882
Figure BDA00001742984403891
实施例21
NHJ1和WCE1组的GG36变体的构建和清洁性能
本文所述的NHJ1和WCE1组的GG36变体是在DNA 2.0，Inc.处利用上文所述的pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒(图6)构建的。变体在枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)中表达，如实施例20中所述，并使用如实施例19中所述的用于测定蛋白质含量的TCA检测法、LAS/EDTA稳定性检测法和BMI微样品清洁检测法对其进行了进一步表征。这些结果显示于表21-1和21-2中。在下列的表中，洗涤剂组合物(“Det.”)对应于上文的表19-4中显示的那些。此外，如文，氨基酸位点按照BPN′编号列出。
Figure BDA00001742984403901
Figure BDA00001742984403911
Figure BDA00001742984403912
Figure BDA00001742984403921
实施例22
NHJ4组的GG36变体的构建和清洁性能
利用pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒(图6)，采用PCR融合或
Figure BDA00001742984403922
多重定点诱变试剂盒(“QCMS kit”；Stratagene)构建了表22-1中所述的NHJ4组的GG36变体，如下文所述。
a)通过
Figure BDA00001742984403923
多重定点诱变(Multi Site-Directed Mutagenesis)构建NHJ4变体
采用
Figure BDA00001742984403924
Multi Site-Directed Mutagenesis构建的变体显示于表22-1中。使用两微克的DNA和Dam甲基化酶(NEB)，按照制造商的说明，使亲本质粒pHPLT-GG36(模板DNA)甲基化。用
Figure BDA00001742984403931
Multi Site-Directed Mutagenesis试剂盒(“QCMS试剂盒kit”；Stratagene)，按照制造商的规程制备了定点突变体。下列的突变被引入亲本质粒中：
S101A-S103G-V104L，G159E，T22A，Y209E，E271F，S101A，S103G，L111V，S128N，N62E和S188D。用Illustra Templiphi试剂盒(GE Healthcare)通过滚环扩增(RCA)扩增了来自QCMS反应的DNA，以高效地转化枯草芽孢杆菌，并且上述反应是按照制造商的规程进行的。一微升十倍稀释的经扩增的DNA被用于转化50μl感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：aprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。在37℃摇动转化混合物1小时。十微升转化混合物被铺于补充了10μg/ml新霉素(Teknova)的脱脂乳(1.6％)Luria琼脂平板上。随后，带有色圈的菌落被接种至120μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中，用于质粒DNA的提取(QIAprep Spin Miniprep试剂盒，Qiagen)。提取的质粒被测序，以确认所期望的突变的存在。
b)通过延伸PCR构建NHJ4变体
通过延伸PCR构建了十种GG36的组合突变体。被引入到包含于pHPLT质粒中的GG36基因中的突变的列表是：T22A，N62E，S103G，S103G-L111V，S101G-S103A-V104I，S101A-S103G-V104L，S101A，S128N，G159D，G159E，Y209E和L111V。为了构建每一突变体，利用诱变引物以及正向和反向引物来扩增整个GG36变体，扩增了包含所期望的突变的PCR片段。每一PCR扩增反应包含每种诱变引物30pmol和100ng的DNA模板，pHPLT-GG36质粒。扩增使用Vent DNA聚合酶(NEB)进行。PCR反应(20μl)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸1分钟。扩增之后，利用
Figure BDA00001742984403932
凝胶条带纯化试剂盒对每种变体的2至4个PCR片段进行凝胶纯化，并将它们混合(每一片段50ng)。这些混合物作为DNA模板被用于延伸PCR，以产生全长基因片段。PCR条件与上文所述相同，不同之处在于延伸阶段于72℃进行2分钟。用
Figure BDA00001742984403933
凝胶条带纯化试剂盒凝胶纯化了全长的DNA片段，用BamHI和HindIII限制性酶对其进行了消化并与也用相同的限制性酶消化的pHPLT-GG36连接。使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商(GEHealthcare)的说明，通过滚环扩增扩增了一微升的连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(基因型：aprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至120μl包含10μg/mL新霉素的Luria肉汤培养基中，用于质粒DNA的提取(QIAprep Spin Miniprep试剂盒，Qiagen)。提取的质粒被测序，以确认所期望的突变的存在。通过延伸PCR构建的变体显示于表22-1中。
携带变体质粒的枯草芽孢杆菌菌株被接种至包含150μl的补充了10μg/ml新霉素的Luria肉汤培养基的微量滴定板中，以表达NHJ4组的变体蛋白质，用于进一步的生物化学分析。使培养物生长以表达蛋白质，如实施例20中所述，通过微量过滤平板(0.22μm；Millipore)对它们进行了过滤，亦如实施例20中所述。所得到的滤液被用于生物化学分析。进行了用于蛋白质含量测定的eglin c抑制检测法和在多种洗涤剂中测试的BMI微样品检测法，如实施例19中所述。还如实施例19中所详述的测试方法4-6的BMI检测法之下所述计算了性能指数。表22-1提供了关于这些多重突变变体的信息和从它们获得的结果。PI值是相对于GG36的。在下列的表中，洗涤剂组合物(“Det.”)对应于上文的表19-4中显示的那些。此外，如文，氨基酸位点按照BPN′编号列出。
Figure BDA00001742984403941
实施例23
NHJ3组的GG36变体的构建和清洁性能
本文所述的NHJ3组的变体是基于包含下列突变的GG36的变体(称为GG36-9)：S101G，S103A，V104I，G159D，A232V，Q236H，Q245R，N248D和N252K(BPN′编号)。这些变体是用pRA68质粒(参见图7)作为DNA模板，使用
Figure BDA00001742984403952
Lightning Site-Directed Mutagenesis试剂盒(QCLDS试剂盒；Stratagene)构建的。质粒pRA68来源于pBN3载体(参见Babé等人，Biotech.Appl.Biochem.27：117-124[1998])。
GG36-9变体的DNA序列(信号序列以小写字母显示，前肽以小写加下划线的文本表示，GG36-9成熟蛋白酶序列以大写字母表示)提供如下：Gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagagg caaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttt tatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaa gtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGGGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACATAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAAAACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCGAAGCTGCAACTCGTTAA(SEQ ID NO：762)
GG36-9变体的蛋白质序列(信号序列以小写字母显示，前肽以小写加下划线的文本表示，GG36-9成熟蛋白酶序列以大写字母表示)提供如下：vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhefetipv lsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAVLVKHKNPSWSNVRIRDHLKKTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ IDNO：763)按照制造商的规程，设计了针对每一种变体的诱变引物，以使用QCLSD试剂盒构建NHJ3变体。就每一变体而言，诱变反应由0.5μl的10X缓冲液，0.5μl的pRA68质粒DNA(168ng/μL)，0.5μl的正向诱变引物(25μM)，0.5μl的反向诱变引物(25μM)，1μl的dNTP(QCLSD试剂盒中提供)，1.5uL的Quik溶液(QCLMS试剂盒中提供)，1μl的酶共混物(QCLSD试剂盒中提供)和40μl的经蒸馏的去离子水组成，以按照制造商的说明制备50μl的反应体积。循环程序是：1个循环的95℃进行2分钟，18个循环的95℃进行20秒、60℃进行10秒和68℃进行3分钟22秒，和最后的1个循环的68℃进行5分钟。然后，1μl试剂盒中提供的DpnI限制性酶被用于消化上述反应中的质粒DNA，接下来2μl的反应被用于转化TOP10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen)。在包含50μg/mL(ppm)羧苄青霉素的Luria肉汤培养基平板上，大肠杆菌转化体于37℃过夜生长之后被选择。用QIAprep spin miniprep试剂盒(Qiagen)从生长于包含50μg/mL(ppm)羧苄青霉素的LA培养基中的4-8个大肠杆菌菌落提取了质粒DNA。上述质粒被测序，以确认所期望的突变的存在。然后将变体质粒转入了枯草芽孢杆菌细胞中，如实施例20中所述。如实施例20中所述使枯草杆菌变体菌株生长，用于进一步的生物化学分析，例如采用eglin c抑制检测法(实施例19)的蛋白质含量测定和BMI微样品清洁检测(测试方法4-6，实施例19)。结果提供于下面的表23-1和23-2中。PI值是相对于GG36的。在下列的表中，洗涤剂组合物(“Det.”)对应于上文的表19-4中显示的那些。此外，如文，氨基酸位点按照BPN′编号列出。
实施例24
NHJ5组的GG36变体的构建和清洁性能
本文所述的NHJ5组的变体是基于包含下列突变的GG36的变体(称为GG36-7)：S101G，S103A，V104I，G159D，A232V，Q245R，N248D和(BPN′编号)。这些变体是用pRA96质粒(参见图8)作为DNA模板，使用
Figure BDA00001742984403982
Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis试剂盒(“QCLMS试剂盒”)构建的。掺入的突变包括：H243R(H249R)，E265F(E271F)，D157E(D159E)，A156E(A158E)，A156E-D157G(A158E-D159E)，T22A，N60E(N62E)，N232R(N238R)，D242R(D248R)，T247R(T253R)，S24R，N74D(N76D){GG36编号和BPN′编号显示于圆括号中。
使用实施例23中所述的方法构建了变体。如实施例20中所述使枯草杆菌变体菌株生长，用于进一步的生物化学分析，例如采用eglin c抑制检测法(实施例19)的蛋白质含量测定和BMI微样品清洁检测(实施例19)。结果提供于下文的表24-1中。PI值是相对于GG36的。在下列的表中，洗涤剂组合物(“Det.”)对应于上文的表19-4中显示的那些。此外，如文，氨基酸位点按照BPN′编号列出。
GG36-7变体的DNA序列(信号序列以小写字母显示，前肽以小写加下划线的文本表示，GG36-7成熟蛋白酶序列以大写字母表示)提供如下：gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagtagagg caaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttt tatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaa gtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGGGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCGAAGCTGCAACTCGT(SEQ ID NO：764)
GG36-7变体的蛋白质序列(信号序列以小写字母显示，前肽以小写加下划线的文本表示，GG36-7成熟蛋白酶序列以大写字母表示)提供如下：vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhefetipv lsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAIS SIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAVLVKQKNPSWSNVRIRDHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR  (SEQ  IDNO：765)
实施例25
NHJ2组合库的构建
本实施例描述了包括下列突变中的一个或多个的GG36组合库的构建：A16S，T22A，S101A，S103G，V104L，L111V，S128N和L148I(BPN′编号)。pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒被提供给DNA 2.0Inc.，用于构建NHJ2组合库。由DNA 2.0，Inc.提供了构建的NHJ2库的连接反应，用于转化枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物，就低温清洁应用对所产生的包含一个或多个本文所述的突变的变体进行了测试。
实施例26
附加的库和GG36变体的构建
使用下列的突变的组构建了附加的库和变体：A1R，A230E，E271L，G115R，G20R，H249R，K235F，K27V/F/L，L75E，L82R，N18R，N269R，N43D，N43R，N76D，R45T，S212F，S242R，S24R，S78R，S9A，T22R，V121E，V244R，V28E，V30E，V4R，W241R(BPN′编号)。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物，就低温清洁应用对所产生的包含这些突变中的一个或更多个的变体进行了测试。
使用本文所述的方法和洗涤剂组合物，就低温清洁应用构建和测试的附加的GG36变体的组包括：G20R-N43R-H249R，G20R-T22R-N43R，G20R-N43R-S242R，G20R-N43R-E271L，G20R-N43R-V244R，G20R-S24R-N43R-S242R，S9A-T22R-S78R-S212F-W241R，S9A-G20R-N43R-S212F，S9A-N43R-S212F，G20R-N43R-S212F，G20R-T22R-N43R-S212F，S24R-S78R-S212F，S9A-N43R-S78R，S9A-N43R-S78R-S242R，S9A-G20R-N43R-S78R，G20R-S24R-N43R-S78R-S242R，T22R-S24R-S78R-S212F，S9A-G20R-N43R-S78R-S242R，G20R-N43R-S78R-H249R，G20R-N43R-S78R，S9A-S78R-S212F，S9A-T22R-N43R-S78R，S9A-G20R-S24R-N43R，S9A-T22R-S78R-S212F，V4R-S9A-T22R-S78R-S212F，G20R-S24R-N43R，A1R-S9A-N43R，G20R-S24R-N43R-G115R，S9A-S24R-N43R，G20R-T22R-S24R-N43R，A1R-S24R-N43R，S9A-G20R-S24R-N43R-S242R，S9A-G20R-T22R-S78R-S212F，S9A-S24R-N43R-V244R，S9A-S24R-N43R-S242R，V4R-S9A-T22R-S24R-S212F和T22R-S24R-N43R(BPN′编号)。
实施例27
GG36库WCE2的构建和清洁性能
由DNA 2.0，Inc使用pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌表达质粒构建了WCE2组合库。由DNA 2.0，Inc.提供了构建的WCE2库的连接反应，用于转化枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，aprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。用于构建WCE2库的突变的组是A230E，G20R，H249R，N18R，N43R/D，N76D，R45T，S242R和S24R(BPN′编号)。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物，就低温清洁应用对所产生的包含这些突变中的一个或更多个的变体进行了测试。
实施例28
WCE3组的GG36变体的构建和清洁性能
本实施例描述了基于GG36变体、GG36-7(实施例23)和GG36-9(实施例22)的WCE3组的突变。这些变体是：S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R，S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D，S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R，S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R，S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R，S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R和S101G，S103A，V104I，A232V，Q236H，Q245R和N252K。它们是用实施例23中所述的pRA96质粒作为DNA模板，使用
Figure BDA00001742984404021
Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis试剂盒(QCLMS试剂盒；Stratagene)构建的。将使用本专利申请中所述的方法和洗涤剂组合物，就低温清洁应用对所产生的变体进行测试。
实施例29
附加的库和GG36变体的构建
本实施例描述了利用枯草芽孢杆菌表达质粒(例如，pHPLT-GG36；图6)，使用下列突变中的一个或多个进行的GG36变体和库的构建：A16S，T22A，S24R，N62E，N76D，E89P，S101A/G，S103G/A，V104L/I，L111V，S128N，P129E，A232V，L148I，A158E，G159D/E，S166D，R186H，S188D，Y209E，Q236H，N238R，Q245R，N248D/R，H249R，N252K/R，T253R，E271F(BPN′编号)。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物，就低温清洁应用对所产生的包含这些突变中的一个或更多个的变体进行了测试。
实施例30
附加的库和GG36变体的构建
本实施例描述了使用下列突变中的一个或多个(BPN′编号)，在枯草芽孢杆菌中的GG36变体和库的构建：A1R，Q2S，Q2M，Q2A，Q2R，Q2W，S3R，V4R，V4S，V4C，I8A，S9A，S9F，S9W，R10S，R10A，R10H，R10M，Q12F，Q12R，P14K，P14F，P14Q，A15R，A15F，A16S，H17R，H17M，H17F，N18R，N18K，G20F，G20K，G20R，T22A，T22R，T22Y，T22V，T22Q，T22L，T22W，G23A，G23S，G23F，S24R，S24F，S24W，S24Q，S24H，S24L，G25V，G25F，G25R，V26F，K27L，K27F，K27R，K27V，V28A，V28N，V28E，A29T，V30E，L31F，T33S，T33G，T33D，G34P，I35M，S36T，S36F，S36R，T38L，T38F，T38R，P40N，P40L，P40T，P40W，P40H，P40R，L42I，N43A，N43F，N43I，N43S，N43R，N43M，N43W，N43D，R45T，G46R，A48R，F50C，V51W，V51F，V51H，P52F，P52E，P52N，P55Y，T57R，Q59A，Q59F，Q59R，D60P，D60Q，D60A，N62E，N62Q，G63V，G63M，G63T，G63I，G63A，G63S，G63H，G63Q，G63D，G63E，G63P，H64F，H64T，V68A，V68C，A69N，A69T，A69P，A69W，T71G，I72C，A74C，L75A，L75F，L75E，L75R，N76D，S78R，S78N，S78I，I79W，I79Q，V81R，L82F，L82T，L82V，L82R，L82M，A85M，P86W，P86L，P86I，E89P，E89T，E89G，E89H，E89L，E89V，E89W，E89F，E89I，Y91N，Y91F，A92F，K94N，S99F，S99T，S99P，S99G，S99M，G100S，G100N，G100Q，G100I，S101A，S101N，S101G，S101T，S101D，S101E，S101P，S101F，G102A，G102T，G102N，G102H，G102E，S103G，S103N，S103D，S103A，V104L，V104I，V104E，V104D，S105T，S105E，S105Q，S106G，S106T，S106E，S106D，S106A，S106V，S106F，I107M，I107F，A108I，A108G，Q109M，L111V，L111I，E112V，E112L，E112Q，A114G，G115K，G115R，N116K，N116A，N116L，N117F，G118R，G118I，M119C，H120A，H120F，H120R，V121F，V121E，N123G，N123E，L124S，S128D，S128F，S128L，S128N，S128H，S128M，S128I，S128Q，P129E，S132A，S132E，A138G，S144R，V147L，L148I，A158E，G159D，G159E，G159C，S160D，S166D，S166E，Y167W，M175V，V177C，D181A，Q182R，N183I，N183D，N183M，N183F，N183R，N185E，N185V，N185I，R186H，R186K，S188E，S188D，S188R，Y192H，Y192W，A194E，A194V，A194F，D197F，I198L，I198F，V203E，V203C，T208S，Y209S，Y209N，Y209F，Y209T，Y209E，Y209H，Y209G，Y209L，P210R，P210V，P210L，G211Q，G211R，S212I，S212M，S212F，T213A，Y214F，A215N，A215D，A215E，A215H，A215F，S216F，S216A，L217E，L217N，L217D，N218D，N218P，N218E，T224A，T224G，V227I，A230E，A231I，A231C，A232V，L233C，V234F，K235F，Q236F，Q236N，Q236H，N238R，N238K，N238L，P239K，P239G，P239R，P239H，P239T，P239N，P239S，P239F，S240R，W241R，S242L，S242R，N243F，N243R，V244R，Q245R，I246S，N248D，N248V，N248I，N248R，H249R，H249T，L250I，K251R，K251S，N252I，N252F，N252R，N252K，N252H，T253I，T253R，T253F，A254C，S256N，G258R，T260V，T260I，L262D，L262H，Y263F，S265F，L267V，L267N，L267M，N269I，N269R，A270C，E271I，E271V，E271H，E271M，E271L，E271P，E271A，E271F，E271T，A272F，A272F，A272R，A273F，A273I和T274G。使用本文所述的方法和洗涤剂组合物，就低温清洁应用对所产生的包含这些突变中的一个或更多个的变体进行了测试。
实施例31
于60F在BMI样品上的清洁性能检测(测试方法2)
在可商购获得的洗涤剂(除非另有指明)中测定了蛋白酶变体的去污性能。商品化洗涤剂的热灭活起到破坏任何蛋白质组分的酶活性，同时保持非酶组分的特性的作用。因此，这一方法适用于准备商购的洗涤剂以用于对本发明的酶变体的测试中。
微样品：
订购了1/4″圆直径的微样品，并由CFT(Vlaardingen，The Netherlands)交付。在96孔MTP的每一孔中，垂直放置了单个微样品或两个微样品，以使整个表面区域暴露(即不是平放于孔的底部)。
BMI微样品检测法
从CFT获得了0.25英寸圆直径的包含血液、乳品和墨水(BMI)的微样品。在切割上述样品前，用水洗涤了织物(EMPA 116)。在96孔微量滴定板(以下称为MTP)的每一孔中，垂直放置了一个微样品，以使整个表面区域暴露(即不是平放于孔的底部)。如本文所述制备了所期望的洗涤剂溶液。使恒温混匀器在25℃平衡，然后向包含微样品的MTP的每一孔添加了190μl的洗涤剂溶液。向上述混合物中添加了10μl经稀释的酶溶液，使得最终的酶浓度为1μg/ml(通过TCA检测法测定)。用胶带将MTP密封，并置于孵育器内30分钟，同时以1400rpm搅拌。在适当条件下温育之后，从每一孔转移了100μl溶液至一个新的MTP。使用MTP SpectraMax读取器在405nm对上述包含100μl的溶液/孔的新的MTP进行了读数。还包括了空白对照，以及包含两个微样品和洗涤剂但不含酶的对照。
“预洗涤的”微样品
这种类型的微样品是于环境温度下在去离子水中预洗涤了20分钟的。在预洗涤步骤之后，微样品被置于纸巾上干燥。然后，使用1/4″的圆板牙将上述空气干燥的样品挤压打孔。最后，在96孔MTP的每一孔中，垂直放置了两个微样品，以使整个表面区域暴露(即不是平放于孔的底部)。
洗涤剂
就北美(NA)和西欧(WE)的重垢洗衣液(HDL)而言，通过将预先称重的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)置于95℃水浴中2小时进行了热灭活。所有的洗涤剂均购自当地的超市。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。酶活性通过AAPF测定法检测。
就对热灭活的洗涤剂中酶活性的检测而言，洗涤剂的工作液从热灭活的原液制得。适当量的水硬度(例如，就NA HDL而言是6gpg，就WEHDL而言是12gpg)和缓冲液被加入洗涤剂溶液中，以匹配如下面的表31-1中所说明的期望的条件。溶液通过旋涡振荡或颠倒瓶子混合。
Figure BDA00001742984404051
*缩写：Procter & Gamble(P&G)；
酶和设备
参考丝氨酸蛋白酶的变体的样品获得自MTP平板中生长的培养物的经过过滤的培养物肉汤。所使用的设备是Biomek FX机械手(BeckmanCoulter)，SpectraMAX MTP读取器(340型；Molecular Devices)，iEMS孵育/振荡器(Thermo/Labsystems)；F-底部MTP(Costar 9017型，用作孵育之后读取反应的平板)；和V-底部MTP(Greiner 651101，用于上清液的预稀释)。这这一检测中，蛋白酶使底物水解，使得颜料和不溶性颗粒从底物释放出来。因此，浊度的变化速率是酶活性的一种量度。
在热灭活的可商购获得的洗涤剂中，在MTP尺度上测定了参考丝氨酸蛋白酶和其变体在微样品上的去污性能。所使用的实际是：5mM的HEPES，pH 8.0或5mM的MOPS，pH 7缓冲液，用于介质水硬度的3∶1的Ca∶Mg(CaCl2∶MgCl2·6H2O)；15000格令每加仑(gpg)的原液稀释至6gpg，2BMI(血液/乳品/墨水)样品每平板：由CFT加工的EMPA-116BMI棉质样品：经预洗涤并打孔2样品至每一孔，和经热灭活的
Figure BDA00001742984404061
Cold现货供应的洗涤剂(蛋白酶活性在其中的缺失已被确认)。
表31-2洗涤剂工作液
Figure BDA00001742984404062
孵育器被设定在所期望的温度(16℃或32℃)。来自～10ppm酶的主稀释平板的10μl样品被添加至含有190μl上文所列的洗涤剂工作液的BMI 2-样品平板。调节体积，以在检测平板中得到0.5ppm的变体终浓度。平板被立即转移至iEMS孵育器，并于设定的温度在1400rpm摇动下孵育30分钟。孵育之后，100μl的上清液被转入一块新的96孔平板中，并在MTP读取器中测量了405nm和/或600nm的吸光度。在这一测试中还包括了包含1个或2个微样品和洗涤剂但未添加蛋白酶样品的对照孔。在405nm的测量提供了较高的值，反映了颜料的移除，而在600nm的测量则反映了浊度和清洁。
用于所有微样品检测方法的对去污活性的计算：
用空白值(不含酶的底物)对获得的吸光度值进行了校正，提供了对水解活性的测量。对每种样品(变体)计算了性能指数。性能指数比较了变体(实际值)和标准品酶(理论值)在相同蛋白质浓度的性能。此外，利用标准品酶的朗缪尔方程的参数，能够计算出理论值。
性能指数
性能指数比较了变体(实际值)和标准品参考蛋白酶(理论值)在相同蛋白质浓度的性能。此外，利用标准品蛋白酶的结合曲线(即朗缪尔方程)的参数，能够计算出理论值。大于1(PI＞1)的性能指数(PI)指示与标准品(例如，野生型)相比更好的变体，而等于1的PI(PI＝1)指示与标准品表现相同的变体，小于1的PI(PI＜1)指示表现比标准品更差的变体。因此，PI指示了“胜利者”，以及不那么期望在某些情况下使用的变体。
用于在96孔微量滴定板中测定蛋白质含量的TCA检测法
就BPN′(例如，参考蛋白酶)和BPN′变体而言，该检测法采用来自微量滴定板的经过过滤的培养物上清液，其中所述培养物已在33℃、以230rpm摇动下潮湿通气生长3-4天。新的96孔平底微量滴定板(MTP)被用于该检测法。首先，将100μl/孔的0.25N的HCl置于每个孔中。然后，加入50μl经过过滤的培养物肉汤。然后测定405nm的光散射/吸光度(在平板读取器中采用5秒混合模式)以提供“空白”读数。将100μl/孔的15％(w/v)三氯乙酸(TCA)置于板中，并在室温孵育5分钟至30分钟之间，以进行检测。然后测定405nm的光散射/吸光度(在平板读取器中采用5秒混合模式)。
所使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX(340型；Molecular Devices)MTP读取器；MTP来自Costar(9017型)。所使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX 340型(Molecular Devices)MTP读取器；和9017型MTP(Costar)。
通过从包含TCA的检测读数中减去空白(不含TCA)值进行了计算，以提供对样品中蛋白质含量的相对测量。如果需要，通过用对具有已知的转换因子的克隆的AAPF检测，来校正TCA读数，能够构建标准曲线。然而，就50微克至500微克蛋白质每毫升(ppm)的蛋白质浓度而言，TCA结果是线性的，因此能够直接用其对酶的性能作图，以便选择性能良好的变体。样品中的浊度/光散射升高与上述培养上清液中可沉淀的蛋白质的总量相关。
96孔微量滴定板中的AAPF蛋白酶检测法
为了测定本发明的蛋白酶以及它们的变体的蛋白酶活性，对N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对-硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解进行了测量。所使用的试剂溶液是：100mM的Tris/HCl，pH 8.6，包含
Figure BDA00001742984404071
(Tris稀释缓冲液)；100mM的Tris缓冲液，pH 8.6，包含10mM的CaCl2和
Figure BDA00001742984404072
(Tris/Ca缓冲液)；和160mM的溶于DMSO的suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA原液)(Sigma：S-7388)。将1ml的suc-AAPF-pNA原液添加至100ml的Tris/Ca缓冲液中并充分混合至少10秒，以制备suc-AAPF-pNA工作液。通过将10μl经稀释的蛋白酶溶液添加到每个孔中，然后立即加入190μl的1mg/ml的suc-AAPF-pNA工作液，进行了检测。混合溶液5秒，然后于25℃在MTP读取器中以动力学模式(5分钟内20次读数)读取410nm的吸光度变化。蛋白酶活性表示为AU(活性＝ΔOD·min-1ml-1)。
稳定性检测
在表1-3中所示的洗涤剂组合物3稀释于水的40％浓缩溶液的存在下，测定了蛋白酶变体的稳定性。所使用的试剂为：在Milli-Q水中稀释至50％的表1-3中所示的洗涤剂组合物3，10mM的MES 0.01％Tween 80pH 5.8主稀释缓冲液，AAPF试剂：参见AAPF检测法规程。所使用的设备为：用于将经稀释的酶稀释至洗涤剂中以及用作suc-AAPF-pNA平板的F-底部MTP(Corning 9017)，Biomek FX(Beckman Coulter)，Spectramax Plus 384MTP读取器(Molecular Devices)，iEMS孵育/振荡器(1mM的振幅)(Thermo Electron Corporation)，密封胶带：Nunc(236366)，循环贮存器(Beckman Fx)。
表1-3中所示的洗涤剂组合物3首先在水中被稀释至50％。将上述洗涤剂存放于室温，并循环通过循环贮存器。iEMS孵育/振荡器(Thermo/Labsystems)被预设在43°。将培养上清液稀释至包含主稀释缓冲液的平板中，使得浓度为约～20ppm(主稀释液平板)。然后，40μl的样品被从上述主稀释液平板中添加至包含160μl的50％表1-3中所示的洗涤剂组合物3的平板中，以得到4ppm的最终孵育浓度。将上述内容物混合并置于室温下，立即在这些平板上进行三重AAPF检测，并记作“无压力读数”。调整AAPF检测方法，使得20μl来自上述步骤的样品被添加至190μl的suc-AAPF-pNA工作液中。立即用密封胶带覆盖平板，并置于650rpm的43℃的iEMS振荡器中30分钟。孵育30分钟后，在这些压力平板上进行三重AAPF检测，并记作“压力读数”。通过计算残余的与初始的AAPF活性的比率如下：残余活性(％)＝[mOD.min-1压力]*100/[mOD.min-1无压力]，测定了样品的稳定性。
LAS/EDTA稳定性检测
在置于指定条件下孵育之后，测定了在典型的阴离子表面活性剂(LAS＝直链烷基苯磺酸盐，十二烷基苯磺酸钠-DOBS)和EDTA二钠的存在下，蛋白酶变体的稳定性，并用AAPF检测法测定了残余活性。所使用的试剂为：十二烷基苯磺酸，钠盐(DOBS，Sigma No.D-2525)，
Figure BDA00001742984404091
(Sigma No.P-8074)，EDTA二钠(Siegfried Handel No.164599-02)，HEPES(Sigma No.H-7523)，无压力缓冲液：50mM的
Figure BDA00001742984404093
pH 8.0，压力缓冲液：50mM的HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM的EDTA(3.36g/l)，pH 8.0，参考蛋白酶和蛋白酶变体培养上清液，包含200-400μg/ml蛋白质。所使用的设备为：V-或U-底部MTP用作稀释平板(分别为Greiner 651101和650161)，用于无压力和LAS/EDTA缓冲液以及用作suc-AAPF-pNA平板的F-底部MTP(Corning 9017)，Biomek FX(Beckman Coulter)，Spectramax Plus384MTP读取器(Molecular Devices)，iEMS孵育/振荡器(1mM的振幅)(Thermo Electron Corporation)和密封胶带：Nunc(236366)。
iEMS孵育/振荡器(Thermo/Labsystems)被设定在29℃。将培养上清液稀释至包含无压力缓冲液的平板中，使得浓度为约～25ppm(主稀释液平板)。20μl的样品被从上述主稀释液平板中添加至包含180μl的无压力缓冲液的平板中，以得到2.5ppm的最终孵育浓度。将上述内容物混合并置于室温下，在该平板上进行了AAPF检测。20μl来自上述主稀释平板的样品也被添加至包含180μl压力缓冲液(50mM的HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM的EDTA(3.36g/l)，pH 8.0)的平板中。溶液被混合并立即被置于400rpm的29℃的iEMS振荡器中30分钟。孵育30分钟后，在该压力平板上进行了AAPF检测。通过计算残余的与初始的AAPF活性的比率如下：残余活性(％)＝[mOD.min-1压力]*100/[mOD.min-1无压力]，测定了样品的稳定性。
BPN′变体的性能数据
下列的表例示了本专利中所述的系列1的BPN′冷水蛋白酶变体通过测试方法2测得的性能。
表31-3：单突变蛋白酶的性能
库亲本：  BPN′野生型(SEQ ID NO：2的酶)
PI参考值：就BMI pH816℃检测相对于BPN′计算的。
洗涤剂：  热灭活的商品化的Tide 2X Cold
说明：
在本实施例中，描述了用于测定BPN′和BPN′变体的蛋白质表达、去污活性、LAS稳定性和AAPF活性的实验(对所关注的特性的测试)的结果。BPN′单一变体采用如2009年6月3日提交的USPA 2009/46156中所述的PCR融合构建，上述文献以引用方式并入本文。结果采用测试方法2中所述的方法获得。如通篇所述的，BPN′变体的功能性被定量为性能指数(PI)，其为变体对亲本蛋白质的性能比率。表32-1提供了枯草杆菌蛋白酶BPN′变体的性能指数(PI)。小于或等于0.1的性能指数被固定为0.1，并在表中以粗斜体表示。同样，就稳定性测量而言，如果在该稳定性检测中，活性的性能指数是小于或等于0.1的，则相关的稳定性性能指数被固定为0.1。
Figure BDA00001742984404101
Figure BDA00001742984404111
Figure BDA00001742984404121
Figure BDA00001742984404151
Figure BDA00001742984404161
Figure BDA00001742984404181
Figure BDA00001742984404191
Figure BDA00001742984404201
Figure BDA00001742984404211
Figure BDA00001742984404221
Figure BDA00001742984404231
Figure BDA00001742984404241
Figure BDA00001742984404251
表31-4
亲本：FNA(SEQ ID NO：2，带有Y217L突变)
测量：就BMI pH816C检测而言，PI对FNA
洗涤剂：如表31-1中所示(NA洗涤剂是热灭活的商品化的Tide 2X；WE洗涤剂是热灭活的商品化的西欧Henkel Persil液体衣物洗涤剂，Japan衣物洗涤剂是热灭活的日本Tide洗衣粉)。
涉及带电残基取代的BPN′-Y217L组合变体的构建
包含BPN′-Y217L基因的图9中的pAC-FNAre质粒被送至DNA 2.0Inc.(Menlo Park，CA)，用于构建包含涉及电荷改变的取代的组合变体。他们还备有用于转化的枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。通过鉴定在活性位点外的四种均匀分布的、表面暴露的、不带电的极性氨基酸残基，设计了枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L组合带电变体。这些残基是Ser-87、Asn-109、Ser-188和Ser-248。这些变体以甘油储备液的形式由DNA 2.0提供。
用钢制96孔复制器将包含BPN′变体蛋白的枯草芽孢杆菌转化体从甘油储备液转入包含200μl的LB培养基+25μg/ml氯霉素的96孔培养平板(BD，353075)中，并于37℃、220rpm在潮湿的容器内生长过夜，以复制所述转化体。200μl过夜培养物被用于接种5ml塑料摇管中的2000μl的MBD合成培养基+25μg/ml氯霉素。MBD(基于MOPS的合成培养基)基本上如本领域已知的制得(参见Neidhardt等人，J.Bacteriol.，119：736-747[1974])，不同的是从基础培养基中去除了NH4Cl、FeSO4和CaCl2，使用了3mM的K2HPO4，并且向基础培养基补充了60mM脲、75g/l的葡萄糖和1％大豆蛋白胨。微量营养素以100X原液的形式制成，一升原液中包含：400mg的FeSO47H2O、100mg的MnSO4H2O、100mg的ZnSO47H2O、50mg的CuCl22H2O、100mg的CoCl26H2O、100mg的NaMoO42H2O、100mg的Na2B4O710H2O、10ml的1M的CaCl2和10ml的0.5M的柠檬酸钠。于37℃以220rpm孵育了摇管60小时。60小时后，在离心机中以大于8000xRCF转速离心培养物肉汤。上清液被倒入15ml聚丙烯锥形管中用于贮藏。没有进行进一步的纯化或浓缩。为了长期的稳定性，上清液原液被配制为含40％丙二醇。
描述
本实施例描述了在洗涤剂中对BPN′-Y217L变体在BMI微样品检测法中的测试，如测试方法2所述，其中所述洗涤剂反映了在衣物洗涤应用中不同的市场地理学(例如，不同的pH，T和/或水硬度)。
表31-4：涉及带电残基取代的BPN′-Y217L组合变体的性能
表31-5：经选择的双突变蛋白酶的洗涤性能
亲本：  BPN′野生型(SEQ ID NO：2)
测量：  就pH816C的BMI检测而言，相对于野生型(SEQ ID NO：2)
        至少1.3的PI
洗涤剂：热灭活的商品化的Tide 2X Cold
描述
下面的表31-5中显示的BPN′双突变体是由DNA 2.0(Menlo Park，CA)利用BPN′作为包含于表达质粒pHPLT-BPN′partial opt中的亲本基因制备的。质粒pHPLT-BPN′partial opt也是由DNA 2.0(Menlo Park，CA)利用编码BPN′蛋白酶的密码子优化的基因和上文所述的pHPLT-BPN′质粒(参见图3)构建的。
以下提供了pHPLT-BPN′表达盒(aprE-BPN′杂交前导序列，来自解淀粉芽孢杆菌的BPN′前序列和BPN′成熟DNA序列)的DNA序列，其编码BPN′前体蛋白：
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGGCAGGGA AATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGACAATGA GCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGGC GGGAAAGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACA TTAAACGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCT TACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACATGCGTACGCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATTCTATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGGCGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGGACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAGGCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGTATAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAG
在以上序列中，粗体表示编码成熟蛋白酶的DNA，标准字体表示前导序列(aprE-BPN′杂交前导序列)，而下划线表示前序列(BPN′)。成熟的BPN′蛋白酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。质粒图谱
此外，如前文所述制备了BPN′变体蛋白质。通过TCA沉淀测定了培养上清液的蛋白质浓度，如测试方法2的TCA检测法所述。于pH 8/16℃，pH 7/16℃和pH 8/32℃在EMPA116样品(BMI污渍，CFT)上测试了上述变体在衣物洗涤应用中的去污性能，测试使用测试方法2的检测法中所述的方法，加上下列的修改。所使用的测试洗涤剂是热灭活的
Figure BDA00001742984404281
洗涤剂(Procter & Gamble)。商品化洗涤剂的热灭活起到破坏任何蛋白质组分的内源性酶活性，同时保持非酶组分的特性的作用。洗涤剂的热灭活通过将预先称重的量的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)于95℃水浴2小时进行。所述洗涤剂购自当地超市。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。BPN′变体的功能性被定量为性能指数(PI)，(即变体相对于亲本BPN′的性能比率)。结果显示于表31-5中-在该表中，“ND”表示“未能确定”。显示了就BMI pH816C清洁检测而言具有至少1.3的PI的变体的数据。
Figure BDA00001742984404291
表31-6：经选择的系列1的BPN′冷水蛋白酶的洗涤性能
亲本：BPN′野生型(SEQ ID NO：2)
测量：就pH816C的BMI检测而言，相对于野生型(SEQ ID NO：2)
      至少1.3的PI
洗涤剂：热灭活的商品化的Tide 2X Cold
描述
由Geneart或DNA 2.0使用BPN′作为亲本蛋白质制备了BPN′多重突变库(或组合库)。通过TCA沉淀测定了培养上清液的蛋白质浓度，如测试方法2所述。于pH 8/16℃，pH 7/16℃和pH 8/32℃在EMPA116样品(BMI污渍，CFT)上测试了上述变体在衣物洗涤应用中的去污性能，测试使用测试方法2中所述的方法，加上下列的修改。所使用的测试洗涤剂是如测试方法2中所述制备的热灭活的
Figure BDA00001742984404301
洗涤剂(Procter & Gamble)。商品化洗涤剂的热灭活起到破坏任何蛋白质组分的内源性酶活性，同时保持非酶组分的特性的作用。洗涤剂的热灭活通过将预先称重的量的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)于95℃水浴2小时进行。所述洗涤剂购自当地超市。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。酶活性通过AAPF检测法测定。BPN′变体的功能性被定量为性能指数(PI)，(即变体相对于亲本BPN′的性能比率)。结果显示于表31-6中。小于或等于0.1的性能指数被固定为0.1，并在表中以粗斜体表示。就具有小于或等于0.1的TCA蛋白质性能指数的每种变体而言，所有的值均被固定为0.1。
表31-7：经选择的系列1的BPN′冷水蛋白酶变体的洗涤性能
亲本：  FNA(SEQ ID NO：2，带有Y217L突变)
测量：  就BMI pH816C检测而言，PI对FNA
洗涤剂：热灭活的商品化的Tide 2X Cold
描述
由DNA 2.0制备了BPN′(亲本)中位点97-128-217的饱和库。通过TCA沉淀测定了培养上清液的蛋白质浓度，如测试方法2所述。于pH8/16℃在EMPA116样品(BMI污渍，CFT)上测试了上述变体在衣物洗涤应用中的去污性能，测试使用测试方法2中所述的方法。变体的功能性被定量为性能指数(PI)，(即变体相对于FNA的性能比率)。结果显示于表31-7中。
Figure BDA00001742984404311
Figure BDA00001742984404321
表31-8：经选择的系列1的BPN′冷水蛋白酶变体的洗涤性能
亲本：   BPN′v3(SEQ ID NO：4)
测量：   PI对上述亲本，使用BMI pH816℃检测
洗涤剂： 热灭活的商品化的Tide 2X Cold
描述
由Geneart或Gene Oracle使用BPN′：G97A-G128A-Y217Q蛋白作为亲本分子制备了附加的BPN′多重突变库。用于测定BPN′变体的去污活性(使用EMPA 116样品(BMI污渍，CFT Vlaardingen)，测定在衣物洗涤应用中的去污性能的微样品检测(BMI pH8，BMI pH7，BMI 32℃))、通过TCA沉淀进行的蛋白质测定和LAS/EDTA稳定性的实验(对所关注的特性的测试)的结果显示于表31-8中。上述结果采用测试方法2中所述的方法获得，加上下列针对去污性能检测的修改。所使用的测试洗涤剂是热灭活的洗涤剂(Procter & Gamble，Cincinnati，OH，USA)。商品化洗涤剂的热灭活起到破坏任何蛋白质组分的内源性酶活性，同时保持非酶组分的特性的作用。洗涤剂的热灭活通过将预先称重的量的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)于95℃水浴2小时进行。所述洗涤剂购自当地超市。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。酶活性通过AAPF检测法测定。如本文通篇所述，BPN′变体的功能性被定量为性能指数(PI)，其为变体对亲本蛋白BPN′：G97A-G128A-Y217Q(即SEQ ID NO：4的酶)的性能比率。
表31-9：经选择的系列1的BPN′冷水蛋白酶变体的洗涤性能
亲本：   BPN′v3(G97A-G128A-Y217Q)
测量：   在BMI pH816C检测中相对于BPN′v3(G97A-G128A-Y217Q)
         的PI值
洗涤剂： 热灭活的商品化的Tide 2X Cold
描述
由Geneart或Gene Oracle使用BPN′：G97A-G128A-Y217Q蛋白作为亲本分子制备了附加的BPN′多重突变库。用于测定BPN′变体的去污活性(使用EMPA 116样品(BMI污渍，CFT Vlaardingen)，测定在衣物洗涤应用中的去污性能的微样品检测(BMI pH8，BMI pH7，BMI 32℃))、通过TCA沉淀进行的蛋白质测定和LAS/EDTA稳定性的实验(对所关注的特性的测试)的结果显示于表31-9中。上述结果采用测试方法2中所述的方法获得，加上下列针对去污性能检测的修改。所使用的测试洗涤剂是热灭活的
Figure BDA00001742984404341
洗涤剂(Procter & Gamble，Cincinnati，OH，USA)。商品化洗涤剂的热灭活起到破坏任何蛋白质组分的内源性酶活性，同时保持非酶组分的特性的作用。洗涤剂的热灭活通过将预先称重的量的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)于95℃水浴2小时进行。所述洗涤剂购自当地超市。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。酶活性通过AAPF检测法测定。如本文通篇所述，BPN′变体的功能性被定量为性能指数(PI)，其为变体对亲本蛋白BPN′：G97A-G128A-Y217Q(即SEQ ID NO：4的酶)的性能比率。
Figure BDA00001742984404342
Figure BDA00001742984404351
表31-10
亲本      FNA(BPN′Y217L)
测量      就BMI pH816℃检测而言相对于FNA(BPN′Y217L)的PI
洗涤剂：  热灭活的商品化Tide 2X
靶向ISD(插入、取代、缺失)库的构建
基于PCR的方法被用于构建经修饰的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′-Y217L(可作为枯草杆菌蛋白酶商购获得)多肽的库，所述多肽在BPN′-Y217L的两个区域(成熟区域的位点63-77和92-132)包含框内插入、缺失和/或取代，如图10所示。这一方法除有几处小的改变外，与Pisarchik等人，Prot.Eng.Des.Select.，20：257-265[2007]中所述的基本上相同。首先，我们使用EamI限制性酶来在我们的PCR片段而不是KasI中产生粘性末端。我们还在紧邻上述粘性末端处引入了简并密码子(NDT)。最后，我们放置引物的位置要紧密得多，下列的每种引物向下游移动仅3bp即到达靶区域的末端。
两组在正向和反向均匀地覆盖蛋白质全长为392个氨基酸的BPN′-Y217L基因的靶区域的寡核苷酸，被用于扩增BPN′-Y217L基因的部分的5′和3′片段。BPN′-Y217L成熟蛋白酶的编码区包含用于克隆的KpnI和XhoI限制性位点。
gaattcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatccagcgcgcaggctgcaggg aaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaag acgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagctagcgctacattaaacgaaa aagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacacgcgtacgcgcagtccgtgccatatggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacaccggttcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatccagatcttaaagtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaacacacgttgctggtaccgttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggcgccgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccgtccggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggcaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgtcgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagctcgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagccgcggctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctctctagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcggcagctcagtaaaactcgagataaaaaaccggccttggccccgccggtttttt at
以下提供了BPN′-Y217L前体蛋白质的氨基酸序列。在该序列中，粗体表示成熟的BPN′-Y217L蛋白酶：
mrskklwisllfalaliftmafgstssaqaagksngekkyivgfkqtmstmsaakkkdvisekggkvqkqfkyvdaasatlnekavkelkkdpsvayveedhvahayaqsvpygvsqikapalhsqgytgsnvkvavidsgidsshpdlkvaggasmvpsetnpfqdnnshgthvagtvaalnnsigvlgvapsaslyavkvlgadgsgqyswiingiewaiannmdvinmslggpsgsaalkaavdkavasgvvvvaaagnegtsgssstvgypgkypsviavgavdssnqrasfssvgpeldvmapgvsiqstlpgnkygalngtsmasphvagaaalilskhpnwtntqvrsslentttklgdsfyygkglinvqaaaq。
成熟的BPN′-Y217L蛋白酶的氨基酸序列被用作制备本文所述的变体库的基础：
aqsvpygvsqikapalhsqgytgsnvkvavidsgidsshpdlkvaggasmvpsetnpfqdnnshgthvagtvaalnnsigvlgvapsaslyavkvlgadgsgqyswiingiewaiannmdvinmslggpsgsaalkaavdkavasgvvvvaaagnegtsgssstvgypgkypsviavgavdssnqrasfssvgpeldvmapgvsiqstlpgnkygalngtsmasphvagaaalilskhpnwtntqvrsslentttklgdsfyygkglinvqaaaq
每一扩增反应包含每种寡核苷酸30pmol和100ng的pAC-FNA10模板DNA(参见图11)。扩增使用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)进行。PCR混合物(20uL)首先是在95℃加热2.5分钟，然后是30个循环的94℃变性15s、55℃退火15s和72℃延伸40s。扩增之后，用Qiagen凝胶条带纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化了通过PCR反应产生的左侧和右侧片段，并将它们混合(每种片段约200ng)。每一混合物包含三种靶向三个紧邻密码子的左侧片段和三种靶向相同密码子的右侧片段。用Eam1104I消化了这些混合物，用T4DNA连接酶连接，并通过侧翼引物(P4299CGTTGAAGAAGATCACGTAGCA和P3246TTTATTTTATAAACTCATTCCCTGAT)进行了扩增，以产生全长的基因片段。PCR条件与上文所述相同，不同之处在于延伸阶段是在72℃进行2分钟。通过Qiagen凝胶条带纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化了所得到的片段，用MluI和XhoI消化，并克隆至枯草芽孢杆菌表达质粒pHPLT-FNA中的MluI/XhoI位点(参见图12)。
来自所使用的pHPLT载体(Plat启动子-pre-pro-BPN′-Y217L-终止子)的BPN′-Y217L表达盒具有以下显示的多核苷酸序列。
GCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGGAATATTTATACAATATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAAAATCGTGAAACAACAAAAACGGCTTTAGTCTAGCAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGGCAGGGAAATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGACAATGAGCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGGCGGGAAAGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACATTAAACGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCTTACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACACGCGTACGCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGATTCTTCTCATCCTGATTTAAAGGTAGCAGGCGGAGCCAGCATGGTTCCTTCTGAAACAAATCCTTTCCAAGACAACAACTCTCACGGAACTCACGTTGCCGGCACAGTTGCGGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTATTAGGCGTTGCGCCAAGCGCATCACTTTACGCTGTAAAAGTTCTCGGTGCTGACGGTTCCGGCCAATACAGCTGGATCATTAACGGAATCGAGTGGGCGATCGCAAACAATATGGACGTTATTAACATGAGCCTCGGCGGACCTTCTGGTTCTGCTGCTTTAAAAGCGGCAGTTGATAAAGCCGTTGCATCCGGCGTCGTAGTCGTTGCGGCAGCCGGTAACGAAGGCACTTCCGGCAGCTCAAGCACAGTGGGCTACCCTGGTAAATACCCTTCTGTCATTGCAGTAGGCGCTGTTGACAGCAGCAACCAAAGAGCATCTTTCTCAAGCGTAGGACCTGAGCTTGATGTCATGGCACCTGGCGTATCTATCCAAAGCACGCTTCCTGGAAACAAATACGGCGCGTTGAACGGTACATCAATGGCATCTCCGCACGTTGCCGGAGCGGCTGCTTTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAAACTCGAGAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTAAGCTTG
使用Illustra Templiphi试剂盒，按照制造商(GE Healthcare，Piscataway，NJ)的建议，通过滚环扩增扩增了连接混合物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌的多聚体DNA。为了此目的，将1μl连接混合物与5μl样品缓冲液混合，加热至95℃保持3分钟并在冰上冷却。接下来，向每一管中加入了5μl的反应缓冲液和0.2μl的酶，然后在30℃孵育10小时。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6％脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至120μl包含10μg/mL新霉素的LB培养基中，用Enzyscreen盖子覆盖，并于37℃和70％湿度剧烈摇动(250rpm)孵育过夜。第二天早晨，将过夜培养物冻存，稍后在如测试方法2中所述的BMI检测中筛选。
描述
用于测定BPN′-Y217L变体的去污活性(使用EMPA 116样品(BMI污渍，CFT)，在pH 8/16℃测定在衣物洗涤应用中的去污性能的微样品检测)和通过TCA沉淀进行的蛋白质测定的实验(对所关注的特性的测试)的结果显示于表31-10中。上述结果采用测试方法2中所述的方法获得，加上下列针对去污性能检测的修改。所使用的测试洗涤剂是热灭活的Tide 2X洗涤剂(Procter & Gamble)。商品化洗涤剂的热灭活起到破坏任何蛋白质组分的内源性酶活性，同时保持非酶组分的特性的作用。洗涤剂的热灭活通过将预先称重的量的液体洗涤剂(在玻璃瓶中)于95℃水浴2小时进行。所述洗涤剂购自当地超市。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。酶活性通过AAPF检测法测定。如本文通篇所述，BPN′-Y217L变体的功能性被定量为性能指数(“Pi”或“PI”)，其为变体对亲本蛋白BPN′-Y217L的性能比率。
显示了在16C的BMI检测中相对于FNA具有至少1.1的PI的变体的数据。
Figure BDA00001742984404391
Figure BDA00001742984404401
本文所公开的量纲和值不旨在被理解为严格地限于所述的精确值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲是指所引用的数值和围绕该数值的功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或换句话讲有所限制，本文中引用的每一个文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请，均据此以引用方式全文并入本文。对任何文献的引用均不是承认其为本文公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术、或承认其独立地或以与任何其它一个或多个参考文献的任何组合的方式提出、建议或公开任何此类发明。进一步讲，如果此文献中术语的任何含义或定义与以引用方式并入本文的文献中相同术语的任何含义或定义相冲突，将以此文献中赋予那个术语的含义或定义为准。
尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，随附权利要求书中旨在涵盖本发明范围内的所有这些改变和变型。

Claims (15)

1.一种组合物，所述组合物包含蛋白酶和一种或多种辅助成分，并且所述组合物为织物和家居护理产品，所述蛋白酶选自由下列组成的组：
a)冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶在pH 8和60°F下，在与具有SEQID NO：4的酶比较时，对于BMI具有大于1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1至10、1至8或甚至1至5的性能指数，所述性能指数如测试方法2和/或测试方法3所定义；
b)冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶在pH 8和60°F下，在与具有SEQID NO：6的酶比较时，对于BMI具有至少1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1至10、1至8或甚至1至5的性能指数，所述性能指数如测试方法2和/或测试方法3所定义；
c)冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶选自由下列组成的组：
(i)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：4具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：P210S，P210S-N218A，S063L-S078N-S101A-S183T-T244N，N061A-S078N-S224A，S053G-S078N-P129T-Q185T，S063T-S078N-S101A，S078N-P129T，S063T-S078N-S101A-S183T和S063T-S078N-S101A-T244I；
(ii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：
G097A-I111V-M124V-Y217Q，G097A-I111V-Y167A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-V203Y-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q，V068A-A092G-Y217Q，N061P-G097A-S101N-G128A-P210S Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y2170，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-1055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q和S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q；
(iii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含下列突变中的三个、四个、五个或六个：X24G/R，X53G，X78N，X101N，X128A/S和X217L/Q；所述变体任选地包含选自下列各组的突变中的至少一组突变：
A116V，G160S，I111L，I115V，N109S，N117M，P005G，Q059V，T164S，Y262M，A0015Q，A015S，A098E，A098N，A098S，A098T，A098V，A098Y，A114S，A114T，A116G，A116L，A116S，A116T，A116W，A133G，A133H，A133T，A133V，A137G，A137I，A137L，A137S，A137T，A138S，A216E，A216F，A216V，D099S，D181E，F261A，F261Q，G024F，G024I，G024Q，G024Y，G097S，G160T，G211L，G211V，H017F，H017W，H039V，H226A，I031V，I111V，I268V，K170R，K265R，L016Q，L016T，L135M，L209T，L209V，L233M，L257T，L257V，L267A，L267V，N025A，N025I，N025Q，N025R，N025T，N025V，N101I，N101Q，N101S，N109A，N109G，N109H，N109L，N109M，N109Q，N109T，N117Q，N184A，N184L，N184T，N184W，N212G，N212L，N212V，N243P，N252G，N252M，1005T，P014S，P040G，P040L，P040Q，P129A，P129S，P172G，P172S，P194Q，P210A，P210S，Q185F，Q185G，Q185I，Q185M，Q185N，Q185S，Q275H，R186K，S009A，S009G，S009H，S009M，S018T，S130T，S132N，S145K，S159T，S161I，S161K，S161N，S161T，S162I，S162M，S162Y，S163G，S182F，S182G，S182V，S182W，S183F，S183L，S183M，S183T，S183V，S183W，S224A，S236T，S249V，T022A，T022G，T022Q，T022V，T208V，T242S，T253N，T253S，T254A，T254S，T255L，T255S，T255V，V004A，V004P，V004W，V084C，V139C，V165M，V203F，Y021K，Y021N，Y021T，Y021V，Y167F，Y171F，Y214F，Y262F，Y262T，A088T-L257G，A116T-A128S，N061S-N109G-A128S-N243V-S260P，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V，S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R，S162G-K256R，A088T-N243V，G024E-A116T，K043Y，N076D-A116T，N218S-S248N，S033T-N243V，S033T-S063G，S248N-L257G，A001E-S249A，A088T-A116T，A088T-A128S，A088T-G131H，A088T-N109G，A088T-S248N，A088T-S249A，A116T-N243V，A116T-T158S，A128S，A128S-K256R，A128S-L257G，A128S-N243V，A128S-S248N，A128S-T158S，G024E-A088T，G024E-A128S，G024E-G131H，G024E-K256R，G024E-L257G，G024E-N218S，G024F-N243V，G024E-S162G，G024E-S249A，G024E-T158S，G131H，G131H-K256R，G131H-S249A，K043Y-A088T，K043Y-A116T，K256R，N07GD-K256R，N109G，N109G-A116T，N109G-A128S，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-G131H，N109G-K256R，N109G-L257G，N109G-N218S，N109G-N243V，N109G-S248N，N218S-L257G，N243V，N243V-K256R，N243V-L257G，N243V-S248N，N243V-S249A，Q103H-A128S，Q103H-G131H，Q103H-K256R，Q103H-L257G，Q103H-N243V，Q103H-S248N，Q103H-S249A，Q103H-T158S，Q206D-N243V，S033T-A128S，S033T-K256R，S033T-N076D，S033T-N218S，S033T-S248N，S033T-T158S，S063G-A128S，S063G-K256R，S063G-N243V，S063G-S162G，S063G-T158S，S248N-K256R，S249A，T158S-N243V，T158S-S249A，A088T-A116T-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N243V-L257G，A088T-T158S-N218S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-L257G，A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S，A088T-N109G-A116T-G131H-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-N243V-L257G，A088T-N109G-N243V-S248N，A088T-N109G-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G，A116T-T158S-S248N-L257G，Y006H-A116T-G131H-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-K256R，A088T-N109G-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-T158S-K256R A088T-N109G-T158S-N243V，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G，A116T-N218S-N243V-L257G-N269S，A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-K256R-L257G，N109G-A116T-N243V，N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-L257G，N109G-G131H-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-K256R-L257G，S003P-A116T-T158S-S248N-K256R，T158S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S，A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-L257G，A088T-G131H-N243V-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-W241R-S248N-K256R，A088T-N109G-K256R-L257G，A088T-N109G-L257G，A088T-N109G-N243V，A088T-N109G-N243V-K256R，A088T-N109G-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D，A088T-N109G-T158S-S248N-L257G，A088T-T158S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-T158S-N243V-L257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，A116T-G131H-S248N-L257G，A116T-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A116T-T158S-N218S-S248N-L257G-0271R，A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A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S248N-0275R，A088T-N218S-N243V，A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N218S-S248N，A088T-N218S-S248N-L257G，A088T-N243V-K256R，A088T-N243V-L257G，A088T-S145T-T158S-S248N，A088T-T158S-L257G，A088T-T158S-N218S-S248N-L2570，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G-0271H，A088T-T158S-S248N，A088T-V143A-T158S-K256R，A116T-G131H-K256R，A116T-G131H-N218S，A116T-G131H-N243V，A116T-G131H-N243V-K256R，A116T-G131H-N243V-L257G，A116T-G131H-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N243V-L257G，A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-V143F-T158S-N218S，A116T-L257G，A116T-N218S，A116T-N218S-L257G，A116T-N218S-N243V-L257G，A116T-N243V-K256R，A116T-N243V-S248N，A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-S248N，A116T-T158S-N218S-N243V，A116T-T158S-N218S-S248N，A116T-T158S-N243V，A116T-T158S-N243V-K256R，A116T-T158S-N243V-L257G，A116T-T158S-N243V-S248N，A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A116T-V149I-T158S-N243V-S248N-K256R-Q271H，G131H-N218S-N243V-L257G，G131H-N243V，G131H-N243V-S248N-K256R，G131H-T158S，G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V-L257G，N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-S248N，N109G-A116T-G131H-S248N-I268V，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R，N109G-A116T-N218S，N109G-A116T-N218S-N243V-K256R，N109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-N243V-K256R，N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-S248N-L257G，N109G-A116T-T158S-G211V-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N243V，N109G-A116T-T158S-Q275R，N109G-G131H-A137V-T158S-N218S-S248N，N109G-G131H-N218S-K237N，N109G-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，N109G-G131H-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-S145F-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-S248N-K256R，N109G-G131H-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，N109G-G131H-T158S-N243V，N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-Q271R，N109G-N218S-L257G，N109G-N218S-N243V，N109G-N243V-K256R-L257G，N109G-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-T158S-I268V，N109G-T158S-K256R，N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-T158S-N243V，N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-T158S-N243V-S248N，N109S-A116T-S248N，N218S，N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N218S-S248N-L257G，N243V-K256R，N243V-S248N-K256R，N243V-S248N-K256R-L257G，S105P-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，S248N，T158S-N243V-K256R，T158S-N243V-L257G，S018F-S162L，S018P-D120N，P014T-S037T，S009T-K141R，S161P-S162L，N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V，N109G-A128S-S183V，N109M-A128S-S224A，A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V，N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V，S63G-A128S，N109S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-N243V，N61S-N109G-N243V，N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R，N109G-A116T，A88T-N109G，N61G-N109G-N243V，N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V，N062L-S063N-Q217L，N062S-S063R-Q217E，N062S-S063L-Q217L，S063G，S063G-Q217L，S063N和S063N-Q217L；
d)冷水蛋白酶，所述冷水蛋白酶选自由下列组成的组：
(i)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：4具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：
E156S-P210S，P210S-N218S，Y104F-E156S-P210I，E156A-P210S-N218S，N218A，N061A-S078N-S087E-S224A，Q059V-S078N-G211A，Q059V-S078N-V147Q，Q059V-S078N，Q059V-S078N-I108V-N252Q，S053G-S078N-P129T，S078N-G211A，S078N-Q185T，S078N-V147Q，S078N，S078N-S224A，S078N-S224A-A274D，S078N-I108V-V147Q，N061A-S078N-S224A，S053G-S078N-P129T-Q185T和S078N-P129T；
(ii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：
G097A-I111V-Y217Q，I111V-G128A-Y217Q，I111V-M124V-Y167A，I111V-M124V-Y217Q，L096T-G097A-Y217Q，N062Q-G097A-I111V，S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q，S089Y-M124V-Y217Q，V068A-I111V-Y217Q，G097A-I111V-M124V，G097A-L126A-Y217Q，G097A-M124V-Y217Q，I111V-Y167A-Y217Q，M124V-Y167A-Y217Q，P052L-V068A-G097A，S089Y-I111V-M124V，V068A-A092G-G097A，V068A-A092G-I111V，V068A-G097A-I111V，V068A-S089Y-I111V，Y104N-G128A-Y217Q，G097A-G128A-P210S-Y217Q，G097A-G128S-P210S-Y217Q，G097A-I111V-M124I-Y217Q，G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-P210S-Y217Q，G097A-N123Q-Y217Q，N0611-G097A-G128A-P210S-Y217Q，N061P-G097A-G128S-Y217Q，N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-N123Q-Y217Q，N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，N061P-G102A-P129S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q，N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q，N062Q-G097A-I111V-Y217Q，N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S 101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q，S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q，S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q，S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q，S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q，S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q，S078N-G097A-G128S-Y217Q，S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q，N061P-G097A-M124I-Y217Q，N061P-G097A-M124V-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-S101N-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q，N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q，N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-M124I-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q，N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q，N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-I035V-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101-G128A，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q，S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S038G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-G097A-A116S-G128A，T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N061P-S1Q1N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N001P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q和T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q；
(iii))亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含下列突变中的三个、四个、五个或六个：X24G/R，X53G，X78N，X101N，X128A/S和X217L/Q，所述变体任选地包含选自下列各组的突变中的至少一组突变：A001G，A001Y，
A013G，A013V，A015F，A015G，A015K，A015M，A015P，A015T，A015W，A015Y，A029G，A073S，A088C，A088I，A088L，A088T，A088V，A098D，A098K，A098P，A098R，A098W，A116D，A116E，A116R，A128S，A133L，A133M，A133S，A134G，A134S，A137N，A137V，A144M，A144Q，A144S，A144T，A144V，A151C，A176S，A176T，A179S，A216G，A216L，A216P，A216Q，A216S，A216T，A216Y，A228T，A230C，A231C，A272I，A272L，A272Q，A272S，A272T，A272W，A273S，A274G，A274L，A274Q，A274T，A274V，D041E，D099G，D099N，D120A，D120K，D120Q，D120R，D120S，D140E，D181S，D259E，E054D，E156D，E156T，E251V，F261G，F261H，F261L，F261R，F261S，F261T，F261V，F261W，G007A，G007S，G020A，G020D，G020S，G024N，G024R，G024S，G024T，G024V，G024W，G053H，G053K，G053N，G053T，G097A，G097D，G097T，G131A，G131H，G131P，G131Q，G131T，G131V，G160H，G160P，G166A，G166S，G166T，G211A，G211D，G211M，G211N，G211P，G211Q，G211R，G211W，G215A，G215N，G215V，H017L，H017M，H017T，H017V，H017Y，H039A，H039C，H039N，H226F，H226I，H226M，H226S，H226V，H226Y，I035V，I079A，I079S，I079T，I079V，I079W，I108V，I115L，I122A，I234L，I234V，K012R，K027R，K136R，K141F，K213W，K237R，K256R，K265Q，L016A，L016F，L016I，L016S，L016V，L042I，L075A，L075M，L075Q，L075V，L075Y，L082K，L082M，L082Q，L082V，L090I，L196I，L196V，L209Q，L209W，L233A，L233Q，L233V，L235I，L235K，L250I，L257A，L257H，L257Q，L257S，L257Y，L267Q，L267R，L267S，L267T，M199V，N025F，N025G，N025H，N025K，N025L，N025M，N025S，N025Y，N061F，N061H，N061P，N061S，N061T，N061V，N061W，N076G，N076W，N078S，N078T，N078V，N101A，N101H，N101L，N101T，N109K，N109R，N117A，N117E，N117H，N117K，N118G，N184G，N184H，N184I，N184S，N184V，N212A，N212F，N212I，N212K，N212P，N212Q，N212S，N212Y，N218A，N218H，N218L，N218S，N240E，N240H，N240L，N240R，N240T，N243A，N243Q，N243T，N243V，N252A，N252K，N252L，N252Q，N252R，N252S，N252T，N269Q，N269S，P014G，P014Q，P014T，P040A，P040H，P040S，P040T，P040V，P040Y，P086A，P086C，P086F，P086H，P086S，P129D，P129G，P129K，P129T，P172A，P172Q，P194A，P194G，P194L，P194M，P194S，P194V，P194Y，P210G，P210R，P210V，Q002A，Q002S，Q010A，Q010F，Q010H，Q010I，Q010L，Q010N，Q010S，Q010T，Q019A，Q019G，Q019N，Q019S，Q019T，Q019V，Q019W，Q059I，Q103L，Q103S，Q185A，Q185H，Q185L，Q185T，Q185Y，Q206P，Q206S，Q206Y，Q217I，Q217N，Q217S，Q217T，Q245K，Q275D，Q275S，Q275W，S003A，S003G，S003H，S003M，S003P，S003Q，S003T，S003V，S009I，S009L，S009P，S009T，S009W，S018A，S018G，S018I，S018L，S018M，S018N，S018P，S018V，S018W，S033T，S037Q，S037T，S037V，S038G，S038H，S038K，S038Q，S038T，S063K，S063N，S063Q，S063T，S087A，S087F，S087G，S087Q，S087T，S089L，S089M，S089N，S089Q，S089T，S089W，S130A，S130F，S130G，S130L，S130V，S145A，S145H，S145M，S145V，S159A，S159G，S159H，S159Q，S159R，S161A，S161G，S161H，S161L，S161M，S161P，S161Q，S161W，S162A，S162F，S162G，S162L，S162N，S162P，S162R，S162V，S163P，S173A，S173G，S182A，S182H，S182K，S182L，S182N，S182P，S182Q，S182T，S183A，S183G，S183H，S183Q，S188A，S188G，S188T，S188V，S191A，S204A，S204I，S204L，S204Q，S204V，S224C，S236A，S236N，S236Q，S248A，S248F，S248G，S248I，S248K，S248L，S248M，S248N，S248Q，S248T，S248V，S249A，S249C，S249H，S249Q，S249T，S249W，S249Y，S260H，S260N，S260P，S260T，T022H，T022K，T022N，T022R，T022S，T022Y，T055A，T055G，T055L，T055N，T055P，T055Q，T071S，T158H，T158S，T164N，T208C，T208L，T220S，T242N，T244A，T244G，T244H，T244I，T244Q，T244S，T244V，T244W，T253A，T253G，T253H，T253Q，T254V，T255A，T255G，T255H，T255I，T255Q，T255Y，V004G，V004N，V004R，V008A，V008C，V008M，V026I，V044I，V044L，V045H，V045K，V045L，V045M，V045Q，V045S，V045W，V045Y，V051I，V081L，V081Q，V081T，V084A，V084S，V084T，V093I，V121I，V143N，V143S，V143Y，V147C，V147I，V147L，V147T，V180I，V180L，V180T，V192A，V192S，V192T，V198I，V198L，V198M，V203H，V203I，V203L，V203N，V203Q，V203T，V203W，V203Y，V270A，V270S，V270T，W241M，W241Y，Y006G，Y006H，Y006I，Y006K，Y006L，Y006P，Y006Q，Y006T，Y006V，Y006W，Y021A，Y021D，Y021E，Y021L，Y021Q，Y021R，Y021S，Y104F，Y104，Y214L，Y214V，Y214W，Y262A，Y262G，Y262L，Y262N，Y262S，Y262W，Y263G，Y263W，A001F，A001K，A001L，A001M，A001Q，A001R，A001S，A001T，A001V，A013C，A013S，A015D，A015E，A015L，A015R，A048S，A073N，A073T，A074G，A074S，A085C，A085G，A085S，A085V，A088M，A088S，A092S，A098G，A114G，A133P，A137E，A137H，A144G，A144H，A144K，A144L，A144N，A153S，A153V，A176C，A179G，A187G，A187S，A200G，A216W，A223S，A228S，A230T，A230V，A231V，A232C，A232V，A272E，A272G，A272K，A272P，A273G，A273L，A273V，A274M，A274R，D036E，D099A，D099Q，D120E，D181A，D181G，D259A，D259G，D259Q，D259T，E156A，E156S，E251I，E251L，E251Q，E251T，F058Y，F261C，F261D，F261K，F261P，G020E，G020F，G020H，G020L，G020N，G020Q，G020R，G020T，G020Y，G024A，G024P，G053A，G053D，G053E，G053F，G053L，G053Q，G053S，G053Y，G097K，G097M，G157A，G157S，G160A，G160L，G166C，G166I，G166Q，G169A，G211K，G215H，G215L，G215S，G215T，G215W，G258S，H017I，H039S，H226L，H238N，H238Y，I011L，，I011V，I031L，I079F，I079K，I079L，I079M，I079Q，I205A，I205V，I268L，I268M，K012G，K043F，K043H，K043I，K043N，K043Q，K043T，K141A，K141R，K141W，K170A，K213A，K213G，K213H，K213I，K213L，K213N，K213Q，K213R，K213S，K213T，K213V，K237A，K237H，K237I，K237L，K237N，K237S，K256A，K256G，K256H，K256M，K256H，K256Q，K256W，K265H，L016E，L042V，L075G，L075H，L075I，L075T，L082A，L082F，L082H，L082R，L082S，L082T，L090M，L135F，L196M，L209C，L209H，L209S，L233S，L235M，L235R，L235W，L257C，L257G，L267F，M050Y，M119C，M119I，M124L，N025C，N025E，N025P，N061A，N061G，N061I，N061K，N061L，N061Q，N061R，N062S，N062T，N076A，N076P，N076Q，N076S，N076T，N076V，N078G，N078H，N078K，N078P，N078Q，N078R，N101F，N117R，N117S，N118D，N118H，N118Q，N118R，N118S，N118T，N184C，N184EN184R，N212D，N212R，N212W，N218，N218G，N218M，N218P，N218T，N218V，N218W，N240A，N240G，N240Q，N240S，N240W，N243C，N243G，N243S，N252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6R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V，G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-N269S，G131H-T158S-N243V-L257G，G131H-T158S-N243V-S248N，G131H-T158S-S248N，K256R，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-N218S-N243V-S248N，N109G-A116T-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-158S-N218S-K237R-N243V-S248N，N109G-G131H-N218S-N243V-S248N，N109G-G131H-S248N，N109G-G131H-T 158S，N109G-G131H-T158S-L257G，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-K256R，N109G-N218S-K256R-L257G，N109G-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-N218S-S248N-L257G，N109G-S248N，N109G-T158S-N218S，N109G-T158S-N218S-N243V，N109G-T158S-N243V-L257G，N218S-N243V-K256R，N218S-N243V-S248N，N218S-S248N，N218S-S248N-K256R，N243V-L257G，S003P-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N，S003P-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R，S105H-W106G-I107L-I108S-N109A-G110A-I111S-E112N-W113G-A114P，S248N-L257G，T158S-N218S-K256R，T158S-N218S-L233S-S248N，T158S-N218S-L257G，T158S-N218S-N243V-K256R，T158S-N218S-N243V-S248N，T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，T158S-N218S-S248N-L257G，T158S-N243V-S248N-L257G，V004L-A088T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A133V-S260N，N061S-S260P，P014T-S037T，S009T-K141F，S009T-K141R，S018F-S162L，S018L-Y021S，S018P-D120N，S018T-S162P，S018T-Y021N，S018Y-K213R，S161P-S162L，S161P-S260P，T253A-S260P，A134T-S260G，I115V-N184Y，N025K-S037P，Q010L-S037P，Q019L-S260N，Q019L-S260P，S037P-T254S，S161P-T253A，N061S-S260P，Q010L-S037P，S009T-K141F，S018L-Y021S，S018T-S162P，S018T-Y021N，S018Y-K213R，S037P-T254S，S161P-S260P，S161P-T253A，T253A-S260P，A133V-S260N，A134T-S260G，I115T-S183T，I115V-N184Y，N061D-S260I，Q019L-S260N，Q019L-S260P，S183T-S249R，N61D-Q206R，Y262N-Q275R，K43R-N76S，K170R-D259G，Y6F-S249C，Q19A-N109S，H17L-Q19A，Q19R-Q185R，S18Y-V203A，S161E-S260T，S18K-V203I，V4A-T55A，N252S-L257H，S249R-Y262H，N61L-Q206H，N184Y-Y262N，Q19R-N25D，A74S-P129Q，K27R-D120H，V4A-T55A，Y21H-N252H，K27R-N269D，A98T-T158A，I79V-Q217H，S9L-N218S，V4A-Y6F，V203A-Q217R，T22S-T242S，N76P-N212S，S37T-S260P，T55A-V147A，V4A-Y6F，Y262N-Q275R，G160R-T244A，N25D-Q185R，G211V-T244A，S9L-N218S，A144H-T244A，Y21H-N252H，A1Y-Q275R，V198L-D259G，K141-S248N，S183T-R186K，S161E-Q185H，P129S-K136R，K43N-S163T，S37G-Q275H ，Y6F-S249C，N62Y-T244A，S260P-Q275R，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R，S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V，S33T-A128S-N218S，A1G-N61-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，N61P-S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，S63G-N109Q-A128S-G131H-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S，N109G-A114S-A128S-S183L-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A，N109G-A114S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V，N109G-A114S-A128S-N243V，N109G-A128S-S224A-N243V，N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L-S224A，N61G-N109G-A128S-S224A，N109G-A128S-S183L，S33T-N76D，N109S-A128S-S224A，N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，S63G-N19Q-A128S-S224A-N243V，N109M-A128S-S224A-N243V，S63G-N109G，N109G-K256R，S63G-N76D，S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V，N062L，N062L-S06G，N062S-S063G-Q217L，N062S-S063L-Q217L，N062S-S063N，N062S-S063R，S063G，S063G-Q217L，S063G-Q217L-M222S，S063L-Q217L，S063N，S063N-Q217L，D099N-K141Y-K213Q，1099N-K141Y-K256Q，K043T-K141Y-E156Q，N062L-Q217E，N062L-Q217L，N062L-S063G-Q217E，N062L-S063L，N062L-S063N-Q217L，N062S-Q217L，N062S-S063G，N062S-S063L，N062S-S063N-Q217L，N062S-S063R-Q217E，S063G-Q217E，S063N-Q217E，S063R，S063R-Q217E和S063R-Q217L；
e)蛋白酶，所述蛋白酶选自由下列组成的组：
(i)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：4具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：
Q059V-S078N-I108V-V147Q-G211A-N252Q，S078N-I108V-V147Q-G211A，S078N-S087E-M124I-S224A，S078N-I108V-V147Q-N252Q，S078N-I108V-V147Q-G211A-N252Q，和Q059V-S078N-I108V-V147Q-G211A-N252Q
(ii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：
G097A-M124V-Y167A-Y217Q，V068A-Y167A-Y217Q，G097A-I111V-M124V-Y167A，I111V-M124V-Y167A-Y217Q，V068A-I111V-Y167A-Y217Q，G097A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q，P052L-V068A-I111V，G097A-N123A-Y217Q，N061P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q，N061P-S101N-G102A-G128S-Y217Q，Y217Q，N061P-G102A-G128S-Y217Q，N0611-S101N-G102A-G128S-Y217Q，S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q，G102A-N123Q-Y217Q，N061P-G102A-G128S-Y217Q，S078N-G097A-I111V-N123Q-Y217Q，和G102A-N123Q-Y217Q和
(iii)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少60％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或甚至100％的同一性，所述变体包含下列突变中的三个、四个、五个或六个：X24G/R，X53G，X78N，X101N，X128A/S和X217L/Q，所述变体任选地包含选自下列各组的突变中的至少一组突变：A001D，A001H，A001N，A015C，A048C，A048E，A085T，A133R，A137R，A142C，A144D，A144R，A152S，A153G，A187P，A187Q，A187T，A187V，A216R，A230S，A272R，A273H，A273T，A274H，D036N，D036S，D181H，D181T，D259N，D259P，D259S，E156G，E156H，E156L，E156Q，E156V，E251C，F189S，F189T，F189W，F189Y，F261E，G020C，G024D，G053M，G053R，G097R，G131D，G131R，G157N，G160R，G160V，G166L，G166W，G211E，G215D，G258A，G258D，G258P，I011T，I031C，I079E，I079R，I175L，I205C，K012H，K012N，K027A，K027N，K027S，K043A，K043D，K043E，K043G，K043L，K043M，K043P，K043V，K043W，K043Y，K136H，K141H，K141L，K141M，K141N，K141Q，K141T，K141V，K170G，K170S，K237T，K237V，K256D，K256S，K256T，K256V，K265N，K265S，L042F，L042M，L082E，L209A，L209E，L209G，L209R，L233G，L235V，L257D，L257E，L257P，L257R，L257W，L267E，M050L，N056D，N056S，N061C，N061D，N062A，N062H，N062L，N062V，N062Y，N076D，N076L，N076M，N078，N078F，N101D，N101R，N118A，N212C，N212E，N218C，N218，N218E，N252D，N252E，P014F，P014K，P057A，P057W，P172R，，P194E，P201T，P210E，Q059C，Q059D，Q059R，Q185E，Q206D，Q217A，Q217K，Q217R，Q245A，Q245D，Q245E，Q245H，Q245R，Q271E，Q271F，Q271R，Q271W，Q275G，Q275IR186I，R186L，R186V，R186W，S003E，S009C，S009E，S018C，S037D，S037E，S037H，S037R，S037Y，S038D，S038P，S038R，S038Y，S06L，S087D，S087R，S089C，S089E，S130C，S130R，S145D，S159C，S159P，S161C，S173T，S182C，S188E，S188F ，S188K，S188L，S188R，S188W，S190A，S190G，S190T，S204R，S236D，S236E ，S248C，S248E，S260C，S260E，S260R，T022P，T055C，T0055W，T071A，T158D，T158E，T158P，T158R，T158Y，T164R，T242D，T242G，T255C，V004E，V004T，V045C，V045D，V045R，V045T，V051H，V081R，V143C，V143E，V143G，V192G，V203C，V203D，V203E，V203M，V203R，V270G，W241L，Y214H，Y214Q，A001E，A133E，A187L，A187N，A216C，A216H，A273Q，D099H，D259H，E156C，E195G，F189H，G131C，G146A，G166V，G215C，G215E，I107L，K012A，K012S，K012T，K043C，K170C，K256C，K256E，K265G，K265Y，L233EM222F，M222S，N062Q，N076E，N078E，N184P，N218R，P005V，P014D，Q002K，Q002L，Q002R，Q010W，Q271C，R186H，S049C，S063C，S063D，S105T，S188C，S190C，S204E，T055R，T164G，V004D，V044T，V045I，V165C，V180S，Y006C，Y006D，Y006E，Y104T，A001C，A187C，A230G，A273D，A273P，D036Q，F189G，F189L，F189R，G157T，G178A，I031F，I111M，K012F，K012L，K027T，K043R，K136G，K141G，K170Q，M222A，M222L，N062R，N117G，N269C，P005W，P129V，P239A，P239H，P239T，Q059W，Q217G，Q275A，R186A，S191G，T164A，T220A，A001P，A187F，A187W，A273R，D041C，D060G，D197T，F189A，G046D，G157P，K012C，K012E，K012W，L042C，M222T，N062C，P239G，P239N，Q217C，R186M，S049T，S089P，S125A，S173V，V044A，A001E，A001E-A128S，A001E-G024E，A001E-G131H，A001E-G169A，A001E-L257G，A001E-218S，A001E-Q103H，A001E-S063G，A001E-S248N，A001E-S249A，G024E-N076D，K043Y-N076D，K043Y-Q206D，N076D-A116T，N076D-G169A，N076D-Q206D，Q103H-Q206D，S033T-G169A，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P，S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V，A001E-K043Y，A001E-N076D，A001E-N076D-N109G-A128S，A001E-Q206D，G024E-Q206D，A001E-A128S-G131H-N243V，A001E-G131H-G169A-N243V，A001E-S033T-N109G-N218S，A116T-G169A，A116T-Q2061，G169A-S249A，K043Y-G169A，N109G-G169A，P040E-N109G-128S-G131H，Q206D-L257G，S033T-A128S-G131H-N243P，S033T-A128S-G131H-N243V，S033T-P040E-Q103H-N109G，S033T-Q103H-A128S-G131H，S063G-N109G-A128S-G131H，S063G-Q206D，T158S-Q206D，A001E-N076D-N109G-A128S，A015S-A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N，A088T-A098S-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-N218S-L257G，A088T-A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-K256R，A088T-G131H-N218S-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R，A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V，A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-158S-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-D140G-N243V，A088T-N109G-G131H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-K141E-T158S-N218S-K256R，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-K256R-Q271R，A088T-N109G-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-T158S-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R，A088T-N1G9G-G131H-V149L-T158S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271K，A088T-N109G-T158S-N218S-L257G，A088T-N109G-T158S-S248N-K256R，A088T-N218S-S248N-L257G-Q27R，A088T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R，A088T-Y104H-A116T-G131H-N218S-N243V，A116T-G131H-K141E-N218S-N243V-S248N-I257G，A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G-N269D，A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-Q271R，A116T-G131H-T158S-N243V-S248N，A116T-G157E-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-T158S-N218S，G131H-N218S-L257G，G131H-N218S-S248N，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，G131H-T158S-N218S-S248N-I268V，I107T-N109G-G131H-N218S-L257G，L090I-N109G-T158S-N243V，L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271R，N109G-A116T-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-K141E-L257G，N109G-G131H-N218S-N243V，N109G-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-T158S-N218S-S248N-K256R，，N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N218S-S248N-K256R-L257G，S003P-N109G-G131H-T158S-L257G，S003P-S248N-L257G，T158S-S248N-K256R-L257G，V004A-A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G，Y006H-N218S-N243V-S248N，Y104H-N109G-G131H-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-A116T-T158S-N243V，A088T-G131H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G，A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-G131H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-I17T-N109G-G131H-N218S-A223G-S248N-K256R，A088T-K213N-N243V-S248N-K256R，A088T-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A232S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-D140G-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-M124I-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-V148A-N218S-N243V，A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N，A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G，A088T-T158S-N218S-L257G，A088T-T158S-N218S-Q245K-S248N-K256R，A088T-T158S-N218S-S248N-K256R，A116T-G131H-N218S-N243V-K256R，A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-G131H-T158S-N218S-L257G，A116T-G131H-V150A-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，I107T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-K141E-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N，T158S-N243V-S248N-K256R，T158S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-G146C，A088T-A116T-N218S，A088T-A116T-158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A138E-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243F-S248N，A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G，A116T-D140G-T158S-N218S-N243V-S248N，A088T-A116T-T158S-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-E251K-K256R-L257G，A088T-I108T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-K141E-N218S，A088T-N109G-W241R-S248N-K256R，G065D-A088T-G131H-N243V-S248N，A045S-S236G，G024A-S037W，I031V-S038W，N061D-S260I，Q010R-S037T，I115T-S183T，N025K-P129K，N025K-P129R，A045S-S236Y，S162L-D181H，I031V-S038W，N025K-S037P，N025K-P129R，Y21H-D259G，A133V-D259N，I79V-Q217H，S18K-V203I，T158A-D259P，N61K-N252K，K43N-Q217R，Q206R-S260P，V198L-D259G，S161E-S260T，G160A-D259G，A1Y-Q275R，A200T-H226L，Q217R-T244A，S260P-Q275R，T158I-D259N，L75I-N76D，S161E-Q185H，Y21H-S37E，S249R-Q275R，N76T-N212D，S260P-Q275L，G131S-K265N，V4A-S249N，N25D-Q185R，K43R-N76S，S183D-Q206R，Q10R-Q275K，K43N-S 163T，N25D-V26A，S260P-Q275L，K141I-S248N，L16Q-Q217H，K27R-N269T，P210S-N212D，N118G-V121A，G215D-D259V，N62Y-G97D，V4E-S260P，K27E-Y91F，Y6D-T55A，N77D-N252T，N25K-H238R，V44A-Q206H，S37P-S260F，V44A-Q206R，I31L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，A1G-I31L-S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-G169A-S224A-N243V-S249Q，S33T-N61G-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V，S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V，S33T-T55P-N61P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131H-S224A-N243V-S249Q，S33T-N76D-A128S-N218S，N76D-N109G-A128S-S224A，D099N，K141Y-E156Q，N062L-S063L-Q217L，N062L-S063N，N062L-S063N-Q217E，N062L-S063R，N062L-S063R-Q217L，N062S-Q217E，N062S-S063G-Q217E，N062S-S063G-Q217R，N062S-S063N-Q217R，S063G-S125A，D060G-Q217L，D120N-K141Y-K213Q，K043T-D099N-D120N-K141Y，K043T-D099N-K141Y-K256Q，K043T-K237A，N062L-S063G-Q217R，N062L-S063G-S125A，N062L-S063L-Q217E，N062L-S063N-S125A-Q217L，N062S-Q217R，N062S-S063L-Q217E，N062S-S063R-Q217L，S063G-M222S，S063G-Q217R，K141Y-D197N，N062L-Q217R，N062L-S063G-Q217L-M222S，N062L-S063L-Q217R，N062L-S063N-Q217R，N062S-Q217G，N062S-S063G-Q217G，N062S-S063G-Q217L-M222L，N062S-S063G-S125A-Q217L，N062S-S063N-Q217E，Q217G，S033G-N062S-S063G，S063G-Q217G，S063G-Q217L-M222L，S063G-S125A-Q217R，S063L-Q217R，S063N-M222S，S063N-Q217R，S063N-S125A-Q217L，S063R-Q217R，S063R-S125A-Q217L，D099N-E156Q-K256Q，E156Q，K012T-D099N-K213Q，K012T-K256Q，K043T-D099N-K141Y-K213Q，K043T-E156Q，K141Y-K213Q，N062L-Q217G，N062L-Q217L-M222L，N062L-Q217L-M222S，N062L-S063G-M222S，N062L-S063G-Q217L-M222L，N062L-S063G-Q217R-M222S，N062L-S063N-Q217L-M222S，N062L-S063N-S125A，N062L-S063R-S125A，N062L-S125A，N062S-S063G-M222S，N062S-S063G-Q217G-M222S，N062S-S063G-S125A，N062S-S063N-Q217L-M222L，N062S-S063N-S125A-Q217L，N062S-S063R-Q217G，N062S-S063R-Q217L-M222S，Q217G-M222S，Q217L-M222S，Q217R，S033G-S063G-Q217R，S063G-Q217E-M222S，S063G-S125A-Q217G，S063L-Q217E，，S063N-Q217G，S063N-Q217G-M222S，，S063N-Q217L-M222S，S063R-Q217L-M222S和S063R-S125A.
f)亲本蛋白酶的变体，所述变体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含三个至六个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自由下列组成的组：X024G/R，X053G，X078N，X101N，X128A/S和X217L/Q，其中所述变体具有蛋白水解活性；
g)蛋白酶的变体，所述变体具有蛋白水解活性并包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在与SEQ ID NO：2上选自位点24、53、78、97、101、128和217的氨基酸位点相对应的氨基酸位点包含二个至七个改变，其中每个改变独立地为
(i) 在占据所述位点的氨基酸残基的上游或下游，一个或多个氨基酸残基的插入，
(ii)占据所述位点的氨基酸残基的缺失，或
(iii)用不同的氨基酸残基对占据所述位点的氨基酸残基的取代，
h)亲本蛋白酶的变体，其中：所述变体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于所述亲本蛋白酶有不超过15个改变，其中所述改变独立地选自插入、缺失或取代，并且所述改变包括在位点24和53的甘氨酸取代、在位点78和101的天冬酰胺取代、在位点128的丙氨酸或丝氨酸取代、以及在位点217的谷氨酰胺取代；所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性；并且所述变体相对于所述亲本蛋白酶具有提高的蛋白水解活性
i)亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、或97％的序列同一性，所述变体具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、或97％的同一性；所述变体包含在位点24和53的甘氨酸取代、在位点78和101的天冬酰胺取代、在位点128的丙氨酸或丝氨酸取代、以及在位点217的谷氨酰胺取代，并且所述变体相对于所述亲本蛋白酶具有提高的蛋白水解活性；
j)它们的混合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述冷水蛋白酶在pH 8和60°F下，在与具有SEQ ID NO：4的酶比较时，对于BMI具有大于1、至1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少1至10、至少1至8或甚至至少1至5的性能指数，所述性能指数如测试方法2或测试方法3所定义，或者所述冷水蛋白酶在pH 8和60°F下，在与具有SEQ IDNO：6的酶比较时，对于BMI具有至少1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至10、1.0至8或甚至1.0至5的性能指数，所述性能指数如测试方法2或测试方法3所定义，并且所述冷水蛋白酶选自由下
列组成的组：
a)具有SEQ ID NO：4的亲本蛋白酶的变体，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：P210S，P210S-N218A，S063T-S078N-S101A-S183T-T244N，N061A-S078N-S224A，S053G-S078N-P129T-Q185T，S063T-S078N-S101A，S078N-P129T，S063T-S078N-S101A-S183T和S063T-S078N-S101A-T244I；
b)具有SEQ ID NO：2的亲本蛋白酶的变体，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：G097A-I111V-M124V-Y217Q，G097A-I111V-Y167A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-V203Y-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q，V068A-A092G-Y217Q，N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y2170，N061P-S101N-G128A-Y2170，S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y2170，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y2170，S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q，S053G-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y2170-S249N，S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q，S053G-S078N-G097A-S 101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q，S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q，S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q，T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q和S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y2170；
c)具有SEQ ID N0：6的亲本蛋白酶的变体，所述变体包含选自下列各组的突变中的一组突变：A116V，G160S，I111L，I115V，N109S，N117M，P005G，Q059V，T164S，Y262M，A015Q，A015S，A098E，A098N，A098S，A098T，A098V，A098Y，A114S，A114T，A116G，A116L，A116S，A116T，A116W，A133G，A133H，A133T，A133V，A137G，A137I，A137L，A137S，A137T，A138S，A216E，A216F，A216V，D099S，D181E，F261A，F261Q，G024F，G024I，G024Q，G024Y，G097S，G160T，G211L，G211V，H017F，H017W，H039V，H226A，I031V，I111V，I268V，K170R，K265R，L016Q，L016T，L135M，L209T，L209V，L233M，L257T，L257V，L267A，L267V，N025A，N025I，N025Q，N025R，N025T，N025V，N101I，N101Q，N101S，N109A，N109G，N109H，N109L，N109M，N109Q，N109T，N117Q，N184A，N184L，N184T，N184W，N212G，N212L，N212V，N243P，N252G，N252M，P005T，P014S，P040G，P040L，P040Q，P129A，P129S，P172G，P172S，P194Q，P210A，P210S，Q185F，Q185G，Q185I，Q185M，Q185N，Q185S，Q275H，R186K，S009A，S009G，S009H，S009M，S018T，S130T，S132N，S145K，S159T，S161I，S161K，S161N，S161T，S162I，S162M，S162Y，S163G，S182F，S182G，S182V，S182W，S183F，S183L，S183M，S183T，S183V，S183W，S224A，S236T，S249V，T022A，T022G，T022Q，T022V，T208V，T242S，T253N，T253S，T254A，T254S，T255L，T255S，T255V，V004A，V004P，V004W，V084C，V139C，V165M，V203F，Y021K，Y021N，Y021T，Y021V，Y167F，Y171，Y214F，Y262F，Y262T，A088T-L257G，A116T-A128S，N061S-N109G-A128S-N243V-S260P，S009T-N109G-A128S-K141R-N243V，S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141R，S162G-K256R，A088T-N243V，G024E-A116T，K043Y，N076D-A116T，N218S-S248N，S033T-N243V，S033T-S063G，S248N-L257G，A001E-S249A，A088T-A116T，A088T-A128S，A088T-G131H，A088T-N109G，A088T-S248N，A088T-S249A，A116T-N243V，A116T-T158S，A128S，A128S-K256R，A128S-L257G，A128S-N243V，A128S-S248N，A128S-T158S，G024E-A088T，G024E-A128S，G024E-G131H，G024E-K256R，G024E-L257G，G024E-N218S，G024E-N243V，G024E-S162G，G024E-S249A，G024E-T158S，G131H，G131H-K256R，G131H-S249A，K043Y-A088T，K043Y-A116T，K256R，N076D-K256R，N109G，N109G-A116T，N109G-A128S，N109G-A128S-N243V-K256R，N109G-A128S-N243V-S248A，N109G-G131H，N109G-K256R，N109G-L257G，N109G-N218S，N109G-N243V，N109G-S248N，N218S-L257G，N243V，N243V-K256R，N243V-L257G，N243V-S248N，N243V-S249A，Q103H-A128S，Q103H-G131H，Q103H-K256R，Q103H-L257G，Q103H-N243V，Q103H-S248N，Q103H-S249A，Q103H-T158S，0206D-N243V，S033T-A128S，S033T-K256R，S033T-N076D，S033T-N218S，S033T-S248N，S033T-T158S，S063G-A128S，S063G-K256R，S063G-N243V，S063G-S162G，S063G-T158S，S248N-K256R，S249A，T158S-N243V，T158S-S249A，A088T-A116T-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N243V-L257G，A088T-T158S-N218S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-A153S-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-L257G，A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-K256R，A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S，A088T-N109G-A116T-G131H-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-N243V-L257G，A088T-N109G-N243V-S248N，A088T-N109G-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G，A116T-T158S-S248N-L257G，Y006H-A116T-G131H-S248N，A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V，A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-N243V，A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G，A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-G131H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-K256R，A088T-N 109G-N243V-S248N-L257G，A088T-N109G-T158S-K256R A088T-N109G-T158S-N243V，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G，A116T-N218S-N243V-L257G-N269S，A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-K256R-L257G，N109G-A116T-N243V，N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-L257G，N109G-G131H-S248N-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-K256R-L257G，S003P-A116T-T158S-S248N-K256R，T158S-S248N-K256R，A088T-A116T-G131H-N243V-K256R，A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G，A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，A088T-A116T-S248N-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S，A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-A116T-T158S-N218S-L257G，A088T-G131H-N243V-L257G，A088T-G131H-T158S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S，A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R，A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G，A088T-N109G-0131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-G131H-T158S-W241R-S248N-K256R，A088T-N109G-K256R-L257G，A088T-N109G-L257G，A088T-N109G-N243V，A088T-N109G-N243V-K256R，A088T-N109G-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R，A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D，A088T-N109G-T158S-S248N-L257G，A088T-T158S-K256R，A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，A088T-T158S-N243V-L257G，A116T-G131h-N218S-N243V-S248N，A116T-G131H-S248N-L257G，A116T-S248N-K256R-L257G，A116T-T158S-N218S-N243V-K256R，A116T-T158S-N218S-S24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G-T158S-N243V-K256R-I268V，A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-Q275R，A088T-N218S-N243V，A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，A088T-N218S-S248N，A088T-N218S-S248N-L257G，A088T-N243V-K256R，A088T-N243V-L257G，A088T-S145T-T158S-S248N，A088T-T158S-L257G，A088T-T158S-N218S-S248N-L257G，A088T-T158S-N243V-K256R-L257G-Q271H，A088T-T158S-S248N，A088T-V143A-T158S-K256R，A116T-G131H-K256R，A116T-G131H-N218S，A116T-G131H-N243V，A116T-G131H-N243V-K256R，A116T-G131H-N243V-L257G，A116T-G131H-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-T158S-N243V-L257G，A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R，A116T-G131H-V143F-T158S-N218S，A116T-L257G，A116T-N218S，A116T-N218S-L257G，A116T-N218S-N243V-L257G，A116T-N243V-K256R，A116T-N243V-S248N，A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，A116T-S248N，A116T-T158S-N218S-N243V，A116T-T158S-N218S-S248N，A116T-T158S-N243V，A116T-T158S-N243V-K256R，A116T-T158S-N243V-L257G，A116T-T158S-N243V-S248N，A116T-T158S-S248N-K256R-L257G，A116T-V1491-T158S-N243V-S248N-K256R-Q271H，G131H-N218S-N243V-L257G，G131H-N243V，G131H-N243V-S248N-K256R，G131H-T158S，G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，G131H-T158S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V-K256R，N109G-A116T-G131H-N243V-L257G，N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-G131H-S248N，N109G-A116T-G131H-S248N-I268V，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N，N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R，N109G-A116T-N218S，N109G-A116T-N218S-N243V-K256R，N109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-N218S-S248N-L257G，N109G-A116T-N243V-K256R，N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-S248N-L257G，N109G-A116T-T158S-G211V-N243V-S248N-K256R，N109G-A116T-T158S-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G，N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G，N109G-A116T-T158S-N243V，N109G-A116T-T158S-Q275R，N109G-G131H-A137V-T158S-N218S-S248N，N109G-G131H-N218S-K237N，N109G-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-N218S-S248N-K256R，N109G-G131H-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-S145F-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-S248N-K256R，N109G-G131H-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-K256R，N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R，N109G-G131H-T158S-N243V，N109G-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-G131H-T158S-N243V-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-L257G，N109G-G131H-T158S-S248N-Q271R，N109G-N218S-L257G，N109G-N218S-N243V，N109G-N243V-K256R-L257G，N109G-N243V-S248N-K256R-L257G，N109G-T158S-I268V，N109G-T158S-K256R，N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G，N109G-T158S-N218S-S248N-L257G，N109G-T158S-N243V，N109G-T158S-N243V-K256R-L257G，N109G-T158S-N243V-S248N，N109S-A116T-S248N，N218S，N218S-N243V-S248N-K256R-L257G，N218S-S248N-L257G，N243V-K256R，N243V-S248N-K256R，N243V-S248N-K256R-L257G，S105P-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R，S248N，T158S-N243V-K256R，T158S-N243V-L257G，S18F-S162L，S018P-D120N，P014T-S037T，S009T-K141R，S161P-S162L，N61P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V，A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V，N109G-A128S-S183V，N109M-A128S-S224A，A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V，N1090-A128S-S224A-N243V，A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V，S63G-A128S，N109S-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-N243V，N61S-N109G-N243V，N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V，A88T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R，N109G-A116T，A88T-N109G，N61G-N109G-N243V，N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V，A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V，N062L-S063N-Q217L，N062S-S063R-Q217E，N062S-S063L-Q217L，S063G，S063G-Q217L，S063N和S063N-Q217L。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白酶为具有SEQ ID NO：6的亲本蛋白酶的变体，所述变体包含下列各组氨基酸取代中的一组或多组：A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G，
S033T+N076D，S009T+N109G+A128S+K141R+N243V，S162G+K256R，N109G+A116T，N109G+L257G，S162G+L257G，N061G+N109G+N243V，N109G+A128S+N243V+S248A，
S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R，N109G+A116T+N243V+K256R，A088T+N109G+A116T+G131H+N243V，A088T+N109G，N109G+N243V，T158S+L257G，N061S+N109G+N243V，P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R，S009T+S018T+Y021N+N109G+A128S+K141R，A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R，A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G，N109G+K256R，N109G+A128S+N243V+K256R，S063G+K256R，S063G+N109G，S063G+A128S，S063G+N076D，S033T+N076D+A128S+N218S和N076D+N218S。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述冷水蛋白酶为亲本蛋白酶的变体，所述冷水蛋白酶包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个选自下列组(a)和组(b)的突变，其中至少一个突变选自组(a)；
a)1、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、33、43、76、102、109、137、141、158、169、204、210、218、243、248、249、256、257、260和269；和
b)24、25、40、52、53、55、58、59、61、62、63、68、78、86、87、88、89、92、96、97、100、101、103、104、106、111、114、115、116、117、118、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、144、145、159、161、162、167、194、203、206、213、217、227、232、239、240、242、265、267和275。
5.如权利要求1所述的组合物，其中亲本蛋白酶具有SEQ ID NO：2，所述亲本蛋白酶的所述变体包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个选自下列组(a)和组(b)的突变，其中至少一个突变选自组(a)：
(a)A1E/T，S9/T，P14L，A15L，L16C，H17T，S18L/T，Q19K，G20A，Y21N/T，T22L，G23E，S33T，K43Y，N76D，G102A，N19A/S/G，A137V，K141R，T158S，G169A，S204E，P210S，N218S，N243P/V，S248N/A，S249A，K256R，L257G，S260P，和N269D；和
(b)
S24G/R/E，N25G，P40A/E，P52L，S53G，T55P，F58G，Q59S，N61E/P/G/S，N62Q/R/S，S63G/H，V68A，S78N，P86S，S87D/G，A88T/V，S89Y，A92G，L96T，G97A，G100N/Q/T，S101N，Q103E/H，Y104N，W106F，I111V，A114G，I115V，A116N/T，N117S，N118G，N123A/G/Q/V，M124I/V，S125A，L126A，G128A/S，P129E/Q/S/V，S130G，G131S/H，S132N，A133V，A134T，A144K，S145D，S159K，S161P，S162G/K，Y167A，P194L，V203Y，Q206D/E，K213L，Y217Q/L/D，V227T，A232T，P239R/V，N240K，T242R，K265N，L267V和Q275E。
6.如权利要求1所述的组合物，其中亲本蛋白酶的所述变体相对于BPN′野生型具有-1、0或+1的总净电荷。
7.如任一项前述权利要求所述的组合物，所述组合物包含辅助成分，所述辅助成分选自由下列组成的组：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、一种或多种附加的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预制的过酸、聚合物分散剂、粘土移除/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、香料递送体系、结构弹性化剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料以及它们的混合物。
8.如任一项前述权利要求所述的组合物，所述组合物包含第二非免疫等价蛋白酶，所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)型的蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)型的蛋白酶为冷水GG36变体蛋白酶。
9.一种组合物，所述组合物包含冷水蛋白酶和选自由下列组成的组的材料：包含香料的包封物、GG36变体蛋白酶、调色剂、两亲清洁聚合物以及它们的混合物，所述组合物为织物和家居护理产品，优选地所述冷水蛋白酶为具有SEQ ID NO：2(枯草杆菌蛋白酶BPN′)的蛋白酶的变体，所述变体包含下列各组突变、插入或缺失中的一组或多组：S182E，N109I，N109D-Y217L-S248R，N109D-S188R-Y217L，S87D-Y217L-S248R，S87R-N109D-Y217L-S248R，S87R-N109D-S188D-Y217L-S248R，G128A-Y217Q，I111V-M124V，M124V-Y217Q，N62Q-G97A，S89Y-M124V，V68A，V68A-A92G，V68A-G97A，V68A-I111V，V68A-S89Y，V68A-V227T，V68A-Y217Q，W106F-Y217Q，G97A-G128A-Y217Q，G97A-L126A-Y217Q，G97A-M124V-L126A-Y217Q，G97A-N123G-Y217Q，L96T-G97A-Y217Q，M124V-L126A-Y217Q，N62Q-G128A-Y217Q，N62Q-G97A-Y217Q，G97N-G128A-Y217M，G97G-G128S-Y217E，G97A-G128A-Y217Q，G97M-G128S-Y217E，G97A-G128S-Y217Q，G97D-G128S-Y217Q，G97M-G128G-Y217M，G97G-G128S-Y217Q，G97S-G128S-Y217Q，G97G-G128A-Y217Q，G97S-G128A-Y217E，G97A-G128S-Y217L，G97A-G128A-Y217N，G97Q-G128S-Y217L，G97A-G128A-Y217M，G97A-G128A-Y217S，G97D-G128A-Y217Q，G97M-G128S-Y217Q，G97Q-G128G-Y217D-S87Y，G97S-G128A-Y217N，G97A-G128S-Y217T，G97D-G128S-Y217E，G97D-G128A-Y217L，G97G-G128S-Y217E-S78P-A272T，G97T-G128S-Y217D，G97D-G128A-Y217I，G97Q-G128S-Y217Q，G97G-G128A-Y217D，G97Q-G128A-Y217N，G97S-G128A-Y217M，G97S-G128S-Y217N，G97S-G128S-Y217M，G97E-G128S-Y217M，G97S-G128P-Y217Q，G97T-G128S-Y217Q，G97D-G128S-Y217Q-A73T，G97E-G128S-Y217N，G97G-G128A-Y217I，G97Q-G128A-Y217D，G97Q-G128S-Y217M，G97R-G128T-Y217Q-S162P，G97S-G128S-Y217D，G97T-G128P-Y217I，G97Q-G128G-Y217E，G97C-G128G-Y217N，G97D-G128S-Y217H，G97M-G128S-Y217L，G97M-G128S-Y217N，G97S-G128S-Y217E，G97M-G128S-Y217I，G97A-G128P-Y217A，G97R-G128S-Y217D，G97A-G128A-Y217Q-S145D，G97A-G128A-Y217Q-P239R，G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S162K-K213L-N240K，G97A-G128A-Y217Q-N61E，G97A-G128A-Y217Q-P40E-A144K-K213L，G97A-G128A-Y217Q-P129E，G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S159K，G97A-G128A-Y217Q-K213L，G97A-G128A-Y217Q-S87D，G97A-G128A-Y217Q-Q206E，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-S145D-S159K-K213L，G97A-G128A-Y217Q-K265N，G97A-G128A-Y217Q-S24R，G97A-G128A-Y217Q-P40E，G97A-G128A-Y217Q-Q275E，G97A-G128A-Y217Q-P129E-S145D-N240K，G97A-G128A-Y217Q-A144K，G97A-G128A-Y217Q-S159K，G97A-G128A-Y217Q-S162K，G97A-G128A-Y217Q-N240K，G97A-G128A-Y217Q-S53G，G97A-G128A-Y217Q-S78N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-I111V，G97A-G128A-Y217Q-S53G-N117S，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S132N，G97A-G128A-Y217Q-Y104N-S132N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-I111V，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-N117S，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S132N，G97A-G128A-Y217Q-S53G-Y104N-S132N，G97A-G128A-Y217Q-S78N-Y104N-S132N，Y217L-V068C-A069G，Y217L-I079F-A098G，Y217L-P086T-S101D-Q103S-V147I，Y217L-A088T-P129S-G146D，Y217L-V093I-G128D-P129R，Y217L-7096，01D-A098R，Y217L-Z096，01H-A098G，Y217L-G097S-Z097.01S-A098G-A273T，Y217L-A098S-D099G-G100D，Y217L-Z098.01N，Y217L-D099G-Z099.01N，Y217L-D099G-Z099，01S，Y217L-D099V-S101D，Y217L-Z099.01S，Y217L-G100D，Y217L-S101D-Q103H，Y217L-S101G-A151V，Y217L-S101H-G102S，Y217L-S101H-Q103D，Y217L-G102R-Q103CY104C-V192I，Y217L-Q103D，Y217L-V121I-I122S-N123C，Y217L-V121L-N123C，Y217L-I122S-N123S，Y217L-M124I，Y217L-M124V，Y217L-L126F-P129Z-S182N，Y217L-L126Y，Y217L-G127S-P129D，Y217L-Z127，01N-G128S-P129S，Y217L-G128H-P129Y，Y217L-G128S-P129D，Y217L-G128S-P129D-S248R，Y217L-G128S-P129G，Y217L-P129G-G131Z，Y217L-P129G-S130H-S132Z，Y217L-P129H-G131Z，Y217L-P129L，Y217L-P129S-S130H-S132Z，Y217L-P129Z，Y217L-P129Z-S130G，Y217L-P129Z-S130G-G131H-S132H，Y217L-P129Z-S130H，Y217L-S130V-G131D-S132I，S87T-A88-S89G-G97A-G128A-Y217Q，N61P-S63H-G97A-G128A-Y217Q，S87G-A88V-S89A-G97A-G128A-Y217Q，P86S-S87G-A88V-G97A-G128A-Y217Q，Q59S-N61P-G97A-G128A-Y217Q，S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q，N61P-N62S-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-P129Q-S 130G-G131S-Y217Q，L75S-N76Y-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-V203Y-Y217Q，T55P-G97A-G128A-Y217Q，A88V-L90I-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-G211R-N212S-K213V-Y217Q，G23A-S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q，T22N-S24A-G97A-G128A-Y217Q，S24R-G97A-G128A-Y217Q，G97A-A98S-G128A-Y217Q，G97A-G128A-T158G-S159G-Y217Q，Q59E-N61P-G97A-G128A-Y217Q，G97A-A98E-G128A-Y217Q，G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-S63T-P86S-S87G-A88V，G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-P239R，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61P-N62S-P194L-A232T，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-A133V-L267V，G97A-G128A-Y217Q-A134T-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-P129E-S159K-K265R，G97A-G128A-Y217Q-A134T-G211T，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129E，G97A-G128A-Y217Q-I111V-S161P，G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q，G97A-G128A-Y217Q-I115V-L267V，G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116S-N117G-N118R，G97A-G128A-Y217Q-V203Y-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-P52S-T55P-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A116S-N117G-N118R，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-T242R，G97A-G128A-Y217Q-P40E-T55P-N269K，G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-V8-N25Y-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N，G97A-G128A-Y217Q-G211T-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-S24R-A128S-P129G，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-N240K，G97A-G128A-Y217Q-N25Y-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A134T，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-L267V，G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G，G97A-G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62Q-G1G00N-A128G，G97A-G128A-Y217Q-S24R-S78N-S182P-L267V，G97A-G128A-Y217Q-P239R-A273S，G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-T242R，G97A-G128A-Y217Q-S3F-S87T-A88L-S89G-G211T，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-L75H-N76G，G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A144K，G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A116N-N117S-N118G，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I111V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-S145D-P239R-Q275E，G97A-G128A-Y217Q-S145D-A273S，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-K141E-T242R，G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-A116N-N117S-N118G-P129Q-S130G-G131S，G97A-G128A-Y217Q-S89Y-G211T，G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G-A144T，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y，G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129V，G97A-Y217Q-N61P-A128G-P129S-S130P，G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S87T-A88L-S89G-G110C-S130P，G97A-Y217Q-N123G-A128G，G97A-G128A-Y217Q-N61P-N62Q-G100N-G102A-M124I，S78N-G97A-G128A-Y217Q，G97A-S101N-G128A-Y217Q，G97A-G128A-A137V-Y217Q，N61P-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-S130P-Y217Q，G97A-Q103N-G128A-Y217Q，S63T-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G102A-G128A-Y217Q，G97A-N109D-G128A-Y217Q-S248R，S87R-G97A-G128A-Y217Q，G97A-G128A-S188D-Y217Q，S87D-G97A-G128A-Y217Q-S248R，G97A-G128A-S188D-S248R-Y217Q，G97A-G128A-S248D-Y217Q，S78N-G97A-G128A-Y217Q-L267V，S78N-G97A-G128A-Y217Q-S161P，S78N-G97A-G128A-Y217Q-I115V，S78N-G97A-G128A-Y217Q-A273S，S78N-G97A-G128A-Y217Q-G211T，S78N-G97A-G128A-Y217Q，S78N-G97A-G128A-Y217Q-I111V，S78N-G97A-G128A-Y217Q-V147L，S78N-G97A-G128A-Y217Q-I108V，S78N-G97A-G128A-Y217Q-S89Y，S78N-G97A-G128A-Y217Q-A138T，G97A-G128A-Y217Q-A134T-K213L，G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P129V，G97A-G128A-Y217Q-S24R-P239R，G97A-G128A-Y217Q-S24R-S87T-A88L-S89G。
10.如权利要求9所述的组合物，其中具有SEQ ID NO：2的蛋白酶的所述变体在包括位点24、25、40、52、53、55、58、59、61、62、63、68、78、86、87、88、89、92、96、97、100、101、103、104、106、111、114、115、116、117、118、123、124、125、126、128、129、130、131、132、133、134、144、145、159、161、162、167、194、203、206、213、217、227、232、239、240、242、265、267和275的位点的组中包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个突变。
11.如权利要求9所述的组合物，其中具有SEQ ID NO：2的蛋白酶的所述变体包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个或15个选自下列组(a)和组(b)的突变：
(a)带电突变，所述带电突变选自由下列组成的组：N61E，A144K，P129E，P239R，P40E，Q103E，Q206E，Q275E，S145D，S159K，S162K，S24R，S63H，S87D和T242R；和
(b)中性突变，所述中性突变选自由下列组成的组：A114G，A116N，A133V，A134T，A232T，A88V，A92G，F58G，G100T，G128A，G131S，G97A，I111V，I115V，K213L，K265N，L126A，L267V，L96T，M124V，N117S，N118G，N123G，N240K，N25G，N61P，N62Q，N62R，N62S，P129Q，P129V，P194L，P239V，P52L，P86S，Q59S，S101N，S125A，S130G，S132N，S161P，S24G，S53G，S78N，S87G，S89Y，T55P，V203Y，V227T，V68A，W106F，Y104N，Y167A，和Y217Q。
12.如权利要求9所述的组合物，其中具有SEQ ID NO：2的蛋白酶的所述变体包含一个或多个突变，并且相对于BPN′野生型具有-1、0或+1的总净电荷。
13.如权利要求9-12中的任一项所述的组合物，所述组合物包含辅助成分，所述辅助成分选自由下列组成的组：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、一种或多种附加的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预制的过酸、聚合物分散剂、粘土移除/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、香料递送体系、结构弹性化剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料以及它们的混合物，优选地所述附加的酶选自由下列组成的组：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣多糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、或它们的混合物。
14.如权利要求9-12中的任一项所述的组合物，所述组合物包含第三非免疫等价蛋白酶，所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)型的蛋白酶，所述枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)型的蛋白酶为冷水GG36变体蛋白酶。
15.一种处理和/或清洁表面或织物的方法，所述方法包括下列步骤：任选地洗涤和/或冲洗所述表面或织物，使所述表面或织物与如权利要求1-14中的任一项所述的组合物接触，然后任选地洗涤和/或冲洗所述表面或织物。
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