CN103502446B - 包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法 - Google Patents
包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了包含丝氨酸蛋白酶变体，更具体地，由此产生的枯草杆菌蛋白酶变体的消费品。具体地，本发明提供了包含丝氨酸蛋白酶变体，更具体地，与参考丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个取代的枯草杆菌蛋白酶变体的消费品。此外，本发明提供了制备此类组合物的方法和处理表面，尤其是织物表面的方法，所述方法包括使表面与包含丝氨酸蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体和助剂材料的含水液体接触。
Description
技术领域
本发明提供了包含丝氨酸蛋白酶变体的消费品。具体地，本发明提供了包含与参考丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶变体的组合物。此外，本发明提供了制备和使用此类消费品的方法。所述蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶变体。
背景技术
尽管蛋白酶提供对污渍（例如血液）的良好清洁是已知的，考虑到可持续性和对较低洗涤温度的消费者趋势，对递送消费者可接受的有益效果的洗涤剂的需求在持续增长，并且仍然存在提供那些带来清洁和清新度的组合物的需求。尽管丝氨酸蛋白酶作为工业酶类很久以来在本领域中是已知的，仍然存在对适合特定条件和用途的工程化的蛋白酶的需求，并且本发明人已发现，这些对于帮助解决对有效的清洁和/或处理组合物的持续增长的需求能够是有用的。
发明内容
在一个实施例中，本发明包括清洁和/或处理组合物，其包含：分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表1-19的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号；和助剂材料。
在一个实施例中，本发明包括清洁和/或处理组合物，其包含：迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表1-19的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号；和助剂材料。
在上文所列的每一实施例中，与具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的GG36蛋白酶相比，所述变体能够具有改善的清洁。
在一些实施例中，本发明包括任何上述变体，其中所述变体的总净电荷相对于所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷是0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4、或-5。
在一些实施例中，本发明包括具有至少一种上文所列的变体的组合物，其中所述组合物是织物和家居护理产品。
在另一个实施例中，本发明包括制备上述组合物的方法，其包括获得至少一种上文所列的变体并且将它与助剂材料或其混合物混合。
在另一个实施例中，本发明包括处理表面（尤其是织物）的方法，其包括使所述表面与包含至少一种上文所列的变体和助剂材料的含水液体接触。
序列表简述
图1提供了成熟的参考蛋白酶的比对，所述蛋白酶包括：BPN’（SEQ ID NO:1）和GG36（SEQ ID NO:2）。每种蛋白酶变体（更具体地，本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体，包括每一冷水蛋白酶变体）的每一氨基酸位置均根据如图1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’（SEQ ID NO:1）的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号，如通过将所述蛋白酶变体的氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列进行比对所确定的。因此，除非本文另外指明，取代位置均以与BPN’的关系给出。
具体实施方式
定义
除非另外指明，本发明的制备涉及分子生物学、蛋白质工程、微生物学、和重组DNA中常用的常规技术，它们是在本领域的技术范围内。此类技术是本领域的技术人员已知的，并且描述于本领域的技术人员所熟知的众多文献和参考工作中。在上文和下文中，本文提及的全部专利、专利申请、文章和出版物，均以引用方式特此并入本文。
除非本文另外指明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员一般理解的相同的含义。许多技术辞典是本领域的技术人员已知的。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的制备中，但是本文描述了一些合适的方法和材料。因此，下面即将限定的术语通过参考说明书作为整体而得到更加充分的描述。此外，如本文所用，单数的“一个”、“一种”和“所述”包括复数的参考，除非上下文清楚地另外指明。数值范围包括限定该范围的数值在内。除非另外指明，分别地，核酸以5′至3′方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。应当理解，本发明不限于所描述的特定方法、规程和试剂，因为本领域技术人员可以根据它们的应用背景对它们进行改变。
除非另外指明，本发明的制备采用了蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和蛋白质测序的常规技术，这些全部均在本领域的那些技术范围内。
此外，本文提供的标题并非对通过参考说明书作为整体能够得到的本发明的实施例的各种方面的限制。因此，下面即将限定的术语通过参考说明书作为整体而得到更加充分的限定。尽管如此，为了有利于理解本发明，多个术语被定义如下。
如本文所用，术语“蛋白酶”和“朊酶”是指具有分解其他蛋白质的能力的酶蛋白质。蛋白酶具有进行“蛋白水解”的能力，其通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解，开始蛋白质的分解代谢。蛋白酶作为蛋白质消化酶类的活性被称为“蛋白水解活性”。存在许多用于测量蛋白水解活性的为人们所熟知的方法（参见，例如，Kalisz，“Microbial Proteinases，”见：Fiechter（编辑），Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，（1988））。例如，通过分析相应的蛋白酶水解商品化底物的能力的比较性测定，可确定蛋白水解活性。在蛋白酶或蛋白水解活性的分析中有用的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白（Sigma C-9801）、牛胶原（Sigma C-9879）、牛弹性蛋白（Sigma E-1625）、和牛角蛋白（ICN Biomedical902111）。利用这些底物的比色测定是本领域中为人们所熟知的（参见，例如，WO99/34011和美国专利6,376,450，二者均以引用方式并入本文）。pNA测定法（参见，例如，Del Mar等人，Anal.Biochem.99:316-320[1979]）也可用于测定在梯度稀释中收集的部分的活性酶浓度。该测定法测量随着酶使可溶的合成底物丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺（suc-AAPF-pNA）水解，对-硝基苯胺释放的速率。在分光光度计上于410nm测量了来自水解反应的黄颜色的产生速率，并且其与活性酶的浓度成比例。此外，在280纳米（nm）处的吸光度测量能够被用于测定总蛋白质浓度。活性酶/总蛋白质比率给出了酶的纯度。
如本文所用，术语“枯草杆菌蛋白酶”是指如MEROPS-肽酶数据库（参见，Rawlings等人，MEROPS:the peptidase database，Nucl Acids Res，34Database issue，D270-272[2006]）中所述的S8丝氨酸蛋白酶家族的任何成员。如本文所述，肽酶家族S8包含丝氨酸肽链内切酶枯草杆菌蛋白酶和它的同系物（Rawlings和Barrett，Biochem J.，290:205-218，[1993]）。家族S8，也被称为枯草杆菌酶家族，是第二大的丝氨酸肽酶家族。家族S8的多个成员的三级结构现在已是被确定的。典型的S8蛋白质结构，由夹在两个螺旋层之间的三个七股β折叠的层组成。枯草杆菌蛋白酶（S08.001）是家族SB（SB）的类型结构。尽管结构不同，枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶（S01.001）的活性位点能够是重叠的，这表明这种相似性是趋同进化而不是趋异进化的结果。
如本文所用，术语“蛋白酶变体”、“变体蛋白酶”、“变体丝氨酸蛋白酶”、“丝氨酸蛋白酶变体”、“枯草杆菌蛋白酶变体”、“突变型蛋白酶”，被用于指（尤其是在它们的功能上）与参考蛋白酶（其可以是野生型枯草杆菌蛋白酶）相似，但在它们的氨基酸序列中具有使得它们在序列上不同于野生型蛋白酶或该变体蛋白酶所来源于的任何初始参考蛋白酶（即，“亲本”蛋白酶）的突变的那些蛋白酶。在一些实施例中，本发明提供了“GG36变体”（或“GG36枯草杆菌蛋白酶变体”），其中在SEQ ID NO:2中所示的成熟的GG36序列中存在突变。然而，并不旨在使参考蛋白酶限于任何特定的氨基酸序列。此外，该术语旨在涵盖亲本蛋白酶的变体，其中所述亲本蛋白酶的序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同。
如本文所用，术语“冷水蛋白酶变体”是指蛋白酶变体，更具体地，亲本蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌（B.lentus）枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中所述蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体，具有下列特性中的一个或多个：a）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8、或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；b）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8、或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；c）至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8、或甚至1.1至约5的测试方法4性能指数；和/或d）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8、或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数；和/或e）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约15、1.1至约10、或甚至1.1至约7的测试方法7性能指数。下文的实例1中标题为“测试方法”的章节中明确描述了测试方法2、测试方法3、测试方法4、测试方法6、和测试方法7。此外，该术语旨在涵盖亲本蛋白酶的变体，其中所述亲本蛋白酶的序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同。
在本发明的一些实施例中，所述蛋白酶变体的亲本蛋白酶（即，“参考”或“初始”蛋白酶）是可商购获得的蛋白酶，包括但不限于以商品名 （来自NovozymesA/S）；和 （由DaniscoUS，Genencor Division）销售的蛋白酶；和可得自Henkel/Kemira的那些，即BLAP（示于US5,352,604的图29中的序列，具有下列突变：S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文称为BLAP）和BLAP X（具有S3T+V4I+V205I的BLAP）。
如本文所用，术语“变体多肽”是指包含在至少一个氨基酸残基处不同于亲本或参考多肽（包括但不限于野生型多肽）的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽。
如本文所用，“芽孢杆菌属（Bacillus）”包括“芽孢杆菌属（Bacillus）”内的全部物种，如本领域的技术人员已知的，包括但不限于枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、迟缓芽孢杆菌（B.lentus）、短芽孢杆菌（B.brevis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）、嗜碱芽孢杆菌（B.alkalophilus）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、克劳氏芽孢杆菌（B.clausii）、耐碱芽孢杆菌（B.halodurans）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、凝结芽孢杆菌（B.coagulans）、环状芽孢杆菌（B.circulans）、灿烂芽孢杆菌（B.lautus）、和苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）。已经认识到，芽孢杆菌属（Bacillus）在继续接受分类学上的重组。因此，该属旨在包括已被重新分类的物种，包括但不限于诸如嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）（其现在被命名为“嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）”）的生物。耐受性内孢子在氧气的存在下的产生被认为是芽孢杆菌属（Bacillus）的典型特征，尽管该特征也适用于最近被命名的脂环酸芽孢秆菌属（Alicyclobacillus）、双芽孢杆菌属（Amphibacillus）、解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）、厌氧芽抱杆菌属（Anoxybacillus）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、Filobacillus属、薄壁芽孢杆菌属（Gracilibacillus）、盐芽孢杆菌属（Halobacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、需盐芽孢杆菌属（Salibacillus）、耐热芽孢杆菌属Thermobacillus）、解脲芽孢杆菌属（Ureibacillus）、和枝芽孢菌属（Virgibacillus）。
术语“多核苷酸”和“核酸”本文中可互换使用，是指在一条链中共价键合的核苷酸单体的任何长度的聚合物。DNA（脱氧核糖核酸）（包含脱氧核苷酸的多核苷酸）、和RNA（核糖核酸）（核苷酸的聚合物）是具有不同生物学功能的多核苷酸或核酸的例子。多核苷酸或核酸包括但不限于：单、双或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基、或其他天然的、化学的、生物化学的修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。下列是多核苷酸的非限制性例子：基因、基因片段、染色体片段、表达序列标签（EST）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）、核酶、互补DNA（cDNA）、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。在一些实施例中，多核苷酸包含经修饰的核苷酸（例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物）、尿嘧啶、其他糖类和连接基团如氟代核糖和硫代核糖、和核苷酸支链。在具体实施例中，核苷酸的序列被非核苷酸的组分打断。
如本文所用，术语“突变”是指在初始氨基酸或核酸序列中发生的改变。该术语旨在涵盖取代、插入和缺失。
如本文所用，术语“载体”是指用于将核酸或多核苷酸引入或转移至靶细胞或组织的核酸构建体或多核苷酸构建体。载体通常被用于将外来DNA引入另外的细胞或组织。载体一般来讲包含作为转基因的DNA序列和作为该载体的“主链”起作用的大的多核苷酸序列。载体通常用来将遗传信息，例如所插入的转基因，转移至靶细胞或组织，以便分离、增殖、或表达该靶细胞或组织中的插入序列。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒（例如，病毒载体）、粘粒、表达载体、穿梭载体、盒等。载体通常包括复制起点、多克隆位点、和选择性标记。将载体插入靶细胞的过程通常被称为转染。用病毒载体转染细胞通常被称为转导。在一些实施例中，本发明包括载体，该载体包含编码变体蛋白酶（例如，前体或成熟的变体蛋白酶）的DNA序列，所述DNA序列可操作地连接至能够影响其在适合的宿主中的表达的适合的前序列（例如，分泌、信号肽序列等）。
如本文所用，术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指用于在靶细胞中表达所关注的核酸（例如，外来核酸或转基因）的重组地或合成地产生的核酸构建体或载体。所关注的核酸通常表达所关注的蛋白质。表达载体或表达盒通常包含驱动或促进外来核酸的表达的启动子核苷酸序列。表达载体或盒还通常包括允许特定核酸在靶细胞中的转录的任何其他指定的核酸元件。重组表达盒能够被整合进质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒、或核酸片段中。一些表达载体具有在宿主细胞中整合和表达异源DNA片段的能力。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。适当的表达载体的选择是在本领域的技术人员的知识范围内的。用于从整合进表达载体的核酸序列表达蛋白质的适当的表达载体的选择是在本领域的技术人员的知识范围内的。
DNA构建体是可被引入靶细胞或组织的人工构建的核酸片段。DNA构建体通常包含已被亚克隆进载体的DNA插入序列，所述DNA插入序列包含编码所关注的蛋白质的核苷酸序列。载体可包含用于细菌中的生长的细菌抗性基因和用于在生物体中表达所关注的蛋白质的启动子。DNA可以通过PCR或本领域中已知的任何其他适合的技术在体外产生。在一些实施例中，所述DNA构建体包含所关注的核酸序列。在一些实施例中，所述序列可操作地连接至附加的元件如控制元件（例如，启动子等）。DNA构建体还可包含选择性标记，并且还可包含侧接同源盒的输入序列。构建体还可包含附加至端部的其他非同源的序列（例如，填充序列或侧翼）。在一些实施例中，所述序列的端部是封闭的，使得该DNA构建体形成封闭的环。所关注的核酸序列（其被整合进DNA构建体，采用本领域中为人们所熟知的技术）可以是野生型的、突变型的、或经修饰的核酸。在一些实施例中，所述DNA构建体包含一种或多种与宿主细胞染色体同源的核酸序列。在其他实施例中，所述DNA构建体包含一种或多种非同源的核苷酸序列。一旦DNA构建体在体外被组装，其即可被用于，例如：1）将异源序列插入所期望的宿主细胞的靶序列；和/或2）诱变处理宿主细胞染色体的区域（即，用异源序列替换内源序列）；3）删除靶基因；和/或4）将复制的质粒引入宿主内。“DNA构建体”在本文中与“表达盒”可互换地使用。
如本文所用，“质粒”是指能够从染色体DNA独立地复制的染色体外DNA分子。质粒是双链的，并且可以是环状的，并且通常被用作克隆载体。
如本文在将核酸序列引入细胞的上下文中所用，术语“引入的”是指适用于将核酸序列转移至细胞的任何方法。此类用于引入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电穿孔、缀合、和转导（参见，例如，Ferrari等人，“Genetics，”见Hardwood等人（编辑），Bacillus，Plenum Publishing Corp.，第57-72页[1989]）。
转化是指由遗传物质（例如，DNA）的摄入、基因组整合、和表达导致的细胞的遗传改变。
如本文所用，当核酸被置于与另外的核酸序列功能性的关系中时，该核酸“可操作地连接”至另外的核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接至核苷酸编码序列。核糖体结合位点可以可操作地连接至编码序列，如果其位于有利于编码序列的翻译的位置。通常，“可操作地连接”的DNA序列是邻接的。然而，增强子不必是邻接的。连接通过在方便的限制性位点的连接实现。如果不存在此类位点，合成的寡核苷酸接头或连接子可按照常规方式被使用。
如本文所用，术语“基因”是指多核苷酸（例如，DNA片段），其编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域以及各个编码片段（外显子）之间的插入序列（内含子）。
如本文所用，“重组”当被用于指细胞时，通常表示该细胞已通过异源核酸序列的引入而被修饰或该细胞来源于如此被修饰的细胞。例如，重组细胞可包含在天然（非重组的）形式的细胞中不以相同的形式存在的基因，或者重组细胞可包含天然的基因（存在于天然形式的细胞中）但其已被修饰并重新引入细胞。重组细胞可包含对该细胞而言内源的核酸，所述核酸是经过修饰的而没有将核酸移出细胞；此类修饰包括通过基因替换、定点突变、和本领域的普通技术人员已知的相关技术实现的那些。重组DNA技术包括用于在体外产生重组DNA和将重组DNA转移至细胞的技术，重组DNA在细胞中可以被表达或增殖，从而产生重组的多肽。多核苷酸或核酸的“重组”、“使重组”、和“重组的”一般来讲是指组装或组合两种或更多种核酸或多核苷酸链或片段，以产生新的多核苷酸或核酸。重组的多核苷酸或核酸有时被称为嵌合体。当核酸或多肽是人工制成的或工程化得到、或者来源于人工或工程化的蛋白或核酸时，它们是“重组的”
如本文所用，术语核酸或基因的“扩增”是指特定DNA序列不成比例地复制，使得被扩增的核酸或基因变成以比最初在基因组中所存在的更高的拷贝数存在的过程。在一些实施例中，通过在药物（例如，可抑制的酶的抑制剂）的存在下生长进行的细胞的选择，导致编码在所述药物的存在下生长所需的基因产物的内源基因的扩增，或编码所述核酸或基因产物的外源（即，输入）序列的扩增或二者皆有。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。与其形成对照的是非特异性模板复制（即，复制是模板依赖的，但不依赖于特异性模板）。模板特异性在这里区别于复制的保真性（即，正确的多核苷酸序列的合成）和（核糖或脱氧核糖）核苷酸特异性。模板特异性经常以术语“靶”特异性被描述。就靶序列被寻求从其他核酸中挑选出来的意义而言，它们是“靶”。扩增技术主要被设计用于这样的挑选。
如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸（核苷酸残基的聚合物），无论是天然产生的（如在纯化的限制性消化产物中）还是合成产生的，其能够在被置于与核酸链互补的引物延伸产物的合成在其中被诱发的条件下时（即，在核苷酸和诱发剂如DNA聚合酶的存在下并且在适合的温度和pH下），作为合成起始的点起作用。引物优选地是单链的，以便扩增中有最大的效率，但作为另外一种选择可以是双链的。如果是双链的，引物首先被处理，以使它的链在被用于制备延伸产物之前分开。在一些实施例中，所述引物是寡脱氧核苷酸。引物必须足够长，以在诱发剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度依赖于多种因素，包括温度、引物的来源、和方法的使用。
如本文所用，术语“探针”是指寡核苷酸，无论是天然产生的（如在纯化的限制性消化产物中）还是合成产生的，重组的还是通过PCR扩增，其通常能够与所关注的另外的寡核苷酸杂交。探针可以是单链的或双链的。探针在特定基因序列的检测、鉴定和分离中是有用的。预期本发明中使用的任何探针将被任何“报告分子”标记，使得其在任何检测体系中可检测，所述检测体系包括但不限于酶的（例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定法）、荧光的、放射性的、和发冷光的体系。本发明并不旨在被任何具体的检测体系或标记限制。
如本文所用，术语“靶”当用于指聚合酶链反应时，是指由用于聚合物链反应的引物限定的核酸区域。因此，“靶”被寻求从其他核酸序列中被挑选出来。核苷酸“片段”是靶核酸序列内的核酸区域。
如本文所用，术语“聚合酶链反应”（PCR）是指美国专利4,683,195、4,683,202、和4,965,188（以引用方式并入本文）的方法，其包括用于提高基因组DNA的混合物中靶序列的片段的浓度而没有克隆或纯化的方法。用于扩增靶序列的方法是本领域中为人们所熟知的。
如本文所用，术语“扩增试剂”是指除引物、核酸模板、和扩增酶之外扩增所需的那些试剂（例如，脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液等）。通常，扩增试剂与其他反应组分一起被置于并被容纳在反应容器（试管、微孔等）中。
如本文所用，术语“限制性内切核酸酶”或“限制性酶”是指能够在被称为限制性位点的特定核苷酸序列处或其附近切割双链或单链DNA的酶（例如，细菌酶）。包含限制性位点的核苷酸序列被给定的限制性内切核酸酶或限制性酶识别和切割，并经常是用于插入DNA片段的位点。限制性位点能够被工程化至表达载体或DNA构建体中。
“同源重组”是指两个DNA分子或配对的染色体之间，在相同或几乎相同的核苷酸序列处，DNA片段的交换。在一些实施例中，染色体整合是同源重组。
如果核酸或多核苷酸在其天然状态或当通过本领域的技术人员已知的方法被操作时，能够被转录和/或翻译，以产生多肽或其片段，则该核酸或多核苷酸被称为“编码”多肽。此类核酸的反义链也被称为编码该序列。
如本领域中所已知的，DNA序列能够被RNA聚合酶转录，以产生RNA序列，而RNA序列能够被逆转录酶逆转录，以产生DNA序列。
“宿主菌株”或“宿主细胞”是指对包含所关注的DNA序列的表达载体而言适合的宿主。所关注的DNA序列可在宿主菌株或宿主细胞中表达所关注的蛋白质。
“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。本公开通篇使用符合IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会（Joint Commissionon Biochemical Nomenclature）（JCBN）的规定的用于氨基酸的单字母和3字母编码。单字母X是指二十种氨基酸中的任何一种。还应理解的是，由于遗传密码的简并性，可通过多于一种的核苷酸序列编码多肽。突变按以下方式命名：表示亲本氨基酸的单字母编码，接着是三位或两位数字的位置编号，然后是表示变体氨基酸的单字母编码。例如，甘氨酸（G）在位置87至丝氨酸（S）的突变被表示为“G087S”或“G87S”。多重突变通过在突变之间插入“-”表示。在位置87和90的突变被表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。就缺失而言，用单字母编码“Z”表示。就相对于亲本序列的插入而言，单字母编码“Z”位于位置编号的左侧。就缺失而言，单字母编码“Z”位于位置编号的右侧。就插入而言，位置编号是该插入的氨基酸之前的位置编号，每一个氨基酸加上0.01。例如，在位置87和88之间丙氨酸（A）、丝氨酸（S）和酪氨酸（Y）三个氨基酸的插入表示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。如此，合并上述所有突变，再加上在位置100的一个缺失，得到：“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。
“前序列”或“前肽序列”是指在信号肽序列和成熟的蛋白酶序列之间的对蛋白酶的分泌而言必需的氨基酸序列。前序列或前肽序列的裂解产生成熟的活性蛋白酶。
术语“信号序列”或“信号肽”是指可参与分泌或指导成熟或前体形式的蛋白质的转运的氨基酸残基序列。信号序列通常位于前体或成熟蛋白质序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。一个示例性的外源信号序列包含融合至迟缓芽孢杆菌（ATCC21536）的枯草杆菌蛋白酶信号序列的剩余部分的来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前七个氨基酸残基。信号序列通常不存在于成熟蛋白质中。信号序列通常在蛋白质被转运之后被信号肽酶从蛋白质上切下。
术语“杂交信号序列”是指这样的信号序列：在其中从表达宿主获得的序列的部分融合至待表达的基因的信号序列。在一些实施例中，使用了合成的序列。
术语蛋白质、多肽、或肽的“成熟的”形式，是指蛋白质、多肽、或肽不含信号肽序列和前肽序列的功能性形式。
术语蛋白质或肽的“前体”形式是指具有可操作地连接至蛋白质的氨基或羰基末端的前序列的蛋白质的成熟形式。前体还可具有可操作地连接至前序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可具有参与翻译后活性的附加的多核苷酸（例如，从其裂解以留下蛋白质或肽的成熟形式的多核苷酸）。
术语“野生型”用于指氨基酸序列或核酸序列时表示该氨基酸序列或核酸序列是自然的或者天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指天然存在的（即，尚未通过重组方法被操纵的）任何事物（例如，蛋白质、氨基酸或核酸序列）。
如本文所用，术语“非天然存在的”是指并非天然存在的任何事物（例如，在实验室中产生的重组核酸）。
如本文所用，就氨基酸残基位置而言，“与......相对应”或“对应于”或“对应的”是指在蛋白质或多肽中的所列举位置的氨基酸残基，或与蛋白质或多肽中的所列举残基类似的、同源的或等同的氨基酸残基。如本文所用，“对应的区域”一般是指相关的蛋白质或参考蛋白质上类似的位置。
术语“来源于”和“获得自”不仅是指通过所关注的生物菌株生产的或可生产的蛋白酶，还指由从此类菌株分离的DNA序列编码的和在包含此类DNA序列的宿主生物中产生的蛋白酶。此外，该术语还指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的并且具有所关注的蛋白酶的标识性特征的蛋白酶。例如，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”是指由芽孢杆菌属（Bacillus）天然地产生的具有蛋白水解活性的那些酶，以及与通过芽孢杆菌属（Bacillus）来源产生的那些相似，但却是通过使用基因工程技术，由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的非芽孢杆菌属生物产生的丝氨酸蛋白酶。
当论及两种核酸或多肽时，术语“同一的”是指当就最大一致性进行比对（如使用下列的序列比对或分析算法所测量的）时，这两种序列中的残基是相同的。
如本文所用，“同源基因”是指来自不同但通常相关的物种，彼此相当并且彼此相同或非常相似的一对基因。该术语包括被物种形成（即新物种的产生）所分离的基因（例如直系同源基因），以及通过基因复制被分离的基因（例如旁系同源基因）。
如本文所用，“同源性”是指序列的相似性或同一性，优选的是同一性。同源性可利用本领域中已知的标准技术测定（参见，例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443[1970\；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444[1988]；软件程序如Wisconsin Genetics SoftwarePackage（Genetics Computer Group，Madison，WI）中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA；和Devereux等人，Nucl.Acid Res.12:387-395[1984]）。有用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP采用渐进的双重比对从一组相关的序列产生多重序列比对。它还能够生成显示用于产生上述比对的聚类关系的树状图。PILEUP使用简化的Feng和Doolittle的渐进比对方法（参见Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35:351-360[1987]）。该方法与Higgins和Sharp所描述的方法（参见，Higgins和Sharp，CABIOS5:151-153[1989]）相似。有用的PILEUP参数包括默认为3.00的空位权重、默认为0.10的空位长度权重、和加权末端空位。另一个有用算法的例子是由Altschul等人描述的BLAST算法（参见，Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410[1990]；和Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787[1993]）。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序（参见，Altschul等人，Meth.Enzymol.266:460-480[1996]）。WU-BLAST-2使用多个检索参数，大多数的这些参数被设定为默认值。可调整的参数被设定为下列值：overlap span=1，overlap fraction=0.125，word threshold（T）=11。HSP S和HSP S2参数是动态的值，由程序自身依据特定序列的组成和针对其进行对所关注的序列的检索的特定数据库的组成而确定。但是，可以调整这些值以提高灵敏度。
本领域的技术人员可容易地确定参考序列和所关注的测试序列之间的序列同一性百分比。多核苷酸或多肽序列之间的同一性百分比，由这些分子之间序列信息的直接比较所决定，比较通过比对序列和用本领域中已知的方法测定同一性进行。适宜的用于确定序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法，（参见Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403-410[1990]）。进行BLAST分析的软件可从美国国家生物技术信息中心（National Centerfor Biotechnology Information）公开获得。该算法涉及首先通过识别当与数据库序列中相同字长的序列比对时，查询序列中相匹配的或满足某种为正值的阈值分数T的字长为W的短序列，而识别高评分序列对（HSP）。这些初始的相邻的字符命中，被作为发现包含它们的更长的HSP的起始点。字符命中沿被比较的两个序列在两个方向上延伸，只要累积的比对评分能够增加。字符命中的延伸在下列情况时停止：累积的比对评分从所得到的最高值下降数量X；累积的评分达到零或更低；或者达到两条序列之一的端部。BLAST算法的参数W、T、和X确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下列默认值：字长（W）为11，BLOSUM62评分矩阵（参见，Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915[1992]）比对（B）为50，期望值（E）为10，M’5，N’-4，和对双链均进行比较。
然后，BLAST算法进行对两条序列之间相似性的统计学分析（参见，例如，Karlin和Altschul，参见上文）。BLAST算法提供的一种相似度的测量是最小和概率（P(N)），其提供了两种核苷酸或氨基酸序列之间偶然地发生匹配的概率的指示。例如，认为一个核酸与本发明的丝氨酸蛋白酶核酸相似的条件是：该测试核酸与丝氨酸蛋白酶核酸进行比较时的最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001。当该测试核酸编码丝氨酸蛋白酶多肽时，如果最小和概率的比较结果为小于约0.5，并且更优选地为小于约0.2，则认为其与所指定的丝氨酸蛋白酶核酸是相似的。
当论及两种或更多种核酸或多肽序列时，“同一性”百分比或“同一性”是指当就最大相似度（如使用序列比对算法或目测所确定的）被比较和比对时，两种或更多种序列是相同的，或者分别有指定百分比的核酸残基或氨基酸残基是相同的。受试氨基酸序列与参考（即查询）氨基酸序列的“序列同一性百分比”或“%同一性”或“%序列同一性”或“%氨基酸序列同一性”是指当序列被最优化比对时，所述受试氨基酸序列在一段比较长度上与查询氨基酸序列按所指定的百分比是相同的（即，以氨基酸连着氨基酸的原则）。因此，关于两个氨基酸序列的“80%氨基酸序列同一性”或“80%同一性”是指在两个最优化比对的氨基酸序列中80%的氨基酸残基是相同的。
受试核酸序列与参考（即查询）核酸序列的“序列同一性百分比”或“%同一性”或“%序列同一性”或“%核酸序列同一性”是指当序列被最优化比对时，所述受试核酸序列在一段比较长度上与查询核酸序列按所指定的百分比是相同的（即，就多核苷酸序列而言以核苷酸连着核苷酸的原则）。因此，关于两个核酸序列的“80%核酸序列同一性”或“80%同一性”是指在两个最优化比对的核酸序列中80%的核酸残基是相同的。
在一些实施例中，受试序列与查询序列的“序列同一性百分比”或“%序列同一性”或“%同一性”，能够通过最优化比对这两个序列并在比较长度上比对这两个最优化比对的序列而被算出。确定最优化比对中相同的残基在两个序列上均出现的位置数量，从而提供了匹配位置的数量，然后用匹配位置的数量除以所述比较长度（除非另外指明，比较长度即查询序列的长度）的总的位置数量。将所得到的数字乘以100，即得到所述受试序列与查询序列的序列同一性百分比。
“最优化比对”或“最优化地比对的”是指两个（或更多个）序列给出最高的同一性百分比评分的比对。例如，两种蛋白质序列的最优化比对能够通过人工比对序列以使得每种序列中最大数量的相同的氨基酸残基被比对、或者通过使用本文所述的或本领域中已知的软件程序或方法而实现。两种核酸序列的最优化比对能够通过人工比对序列以使得每种序列中最大数量的相同的核苷酸残基被比对、或者通过使用本文所述的或本领域中已知的软件程序或方法而实现。
在一些实施例中，当采用所定义的参数，例如所定义的氨基酸取代矩阵、空位存在罚分（也被称为空位开放罚分）、和空位延伸罚分，以实现一对多肽序列所可能的最高的相似性评分，而将这对序列比对时，这两条多肽序列被视为是“最优化地比对的”。在多肽序列比对算法（例如，BLASTP）中，BLOSUM62评分矩阵（参见Henikoff和Henikoff，参见上文）经常被用作默认的评分的取代矩阵。空位存在罚分应用于所比对的序列之一中单个氨基酸空位的引入，而空位延伸罚分应用于空位中的每一个残基位置。所采用的示例性比对参数是：BLOSUM62评分矩阵，gap existence penalty=11，以及gap extension penalty=1。比对评分由每一序列上比对在其处开始和结束的氨基酸位置（即，比对窗口）限定，并且任选地通过向一个或两个序列均插入一个空位或多个空位，以实现最高的可能的相似性评分。
两种或更多种序列之间的最优化比对能够通过目测或通过使用计算机而被确定，例如但不限于：用于氨基酸序列的BLASTP程序和用于核酸序列的BLASTN程序（参见，例如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25（17）:3389-3402（1997）；亦参见，美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）（NCBI）网站）。
如果所关注的多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.5%的序列同一性的氨基酸序列，则所关注的多肽可被称为是与参考多肽“基本上相同”的。两个此类多肽之间的同一性百分比能够通过检查两个最优化地比对的多肽序列或通过以标准参数使用软件程序或算法（例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL）人工地确定。两个多肽基本上相同的一个指示是第一个多肽与第二个多肽免疫学上是交叉反应的。通常，不同之处在于保守氨基酸取代的多肽是免疫学上交叉反应的。因此，例如，当一个多肽与第二个多肽不同之处仅在于保守氨基酸取代或一个或多个保守氨基酸取代时，这两个肽是基本上相同的。
如果所关注的核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.5%的序列同一性的核苷酸序列，则所关注的核酸可被称为是与参考核酸“基本上相同”的。两个此类核酸之间的同一性百分比能够通过检查两个最优化地比对的核酸序列或通过以标准参数使用软件程序或算法（例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL）人工地确定。两个核酸序列基本上相同的一个指示是这两个核酸分子在严格条件（例如，在一系列的中度至高度严格性范围内）下互相杂交。
当核酸或多核苷酸部分或完全地与其他组分（包括但不限于：例如，其他蛋白质、核酸、细胞等）分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，当多肽、蛋白质或肽部分或完全地与其他组分（包括但不限于：例如，其他蛋白质、核酸、细胞等）分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，分离的种类是比组合物中的其他种类更高丰度的。例如，分离的种类可占所存在全部大分子种类的至少约50%、约70%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、或约100%（以摩尔计）。优选地，所关注的种类被纯化至基本上同质（即，污染物种类不能在组合物中通过常规检测方法检测到）。纯度和同质性能够使用本领域中为人们所熟知的多种方法测定，例如蛋白质或核酸样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过染色可视化。如果需要，高分辨率的技术，例如高效液相色谱法（HPLC）或类似的方法能够被用于纯化材料。
术语“纯化的”当用于核酸或多肽时一般表示基本上没有其他组分的核酸或多肽，如通过本领域中为人们所熟知的分析技术测定的（例如，在电泳凝胶、层析洗脱液、和/或经过密度梯度离心的介质中形成离散条带的纯化的多肽或多核苷酸）。例如，在电泳凝胶中产生基本上单个条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50%纯的，通常为至少约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、约99.5%、约99.6%、约99.7%、约99.8%或更纯的（例如，以摩尔计的重量百分比）。在相关的意义上，本发明提供了针对本发明的一种或多种分子富集组合物的方法，所述分子例如用于本发明中的一种或多种多肽或编码多肽的多核苷酸。当应用纯化或富集技术之后，某种分子的浓度显著提高时，一种组合物就该种分子而言是富集的。基本上纯的本发明的多肽或多核苷酸（例如，分别地，基本上纯的本发明的变体蛋白酶或编码变体蛋白酶的多核苷酸）将通常占具体组合物中全部大分子种类的按重量（以摩尔计）计至少约55%、约60%、约70%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98、约99%、约99.5%或更多。
在相关的意义上，在本发明中有用的蛋白酶变体，可以使用针对用于本发明的一种或多种分子，例如用于本发明的一种或多种多肽（例如，用于本发明的一种或多种变体蛋白酶）或编码用于本发明的多肽的一种或多种核酸（例如，编码本发明的一种或多种变体蛋白酶的一种或多种核酸），富集组合物的方法而被提供。当应用纯化或富集技术之后，某种分子的浓度显著提高时，一种组合物就该种分子而言是富集的。基本上纯的多肽或多核苷酸将通常占具体组合物中全部大分子种类的按重量（以摩尔计）计至少约55%、约60%、约70%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98、约99%、约99.5%或更多。
如本文所用，术语“组合诱变”或“组合的”是指参考核酸序列的核酸变体的文库在其中产生的方法。在这些文库中，变体包含选自预先确定的突变的组的一个或多个突变。所述方法还提供了引入并非预先确定的突变的组的成员的随机突变的方法。一些此类方法包括美国专利6,582,914（以引用方式并入本文）中所列的那些。一些此类组合诱变方法包括和/或涵盖可商购获得的试剂盒（例如，Multi Site-DirectedMutagenesis Kit（Stratagene）、PCR融合/延伸PCR）中体现的方法。
如本文所用，与变体蛋白酶相关地使用的“具有改善的性能”是指相对于对应的参考蛋白酶（例如，野生型或天然存在的蛋白酶），具有改善的或增强的洗涤或清洁性能、和/或具有改善的或增强的稳定性而任选地具有保留的洗涤或清洁性能的变体蛋白酶。变体蛋白酶的改善的性能可包括改善的洗涤或清洁性能和/或改善的稳定性。在一些实施例中，本发明使用了表现出一种或多种下列性能的变体蛋白酶：相对于参考蛋白酶（例如，野生型蛋白酶，如野生型枯草杆菌蛋白酶）改善的手洗性能、改善的手动或人工盘碟洗涤性能、改善的自动盘碟洗涤性能、改善的衣物洗涤性能、和/或改善的稳定性。
如本文所用，术语“功能测定法”是指提供蛋白质的活性的指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指蛋白质在其中就其以它通常的能力发挥功能的能力被分析的测定体系。例如，功能测定法涉及测定该酶催化反应的效果。
如本文所用，术语“靶的性能”是指待改变的初始基因的性能。本发明并不旨在被任何特定的靶的性能限制。然而，在一些实施例中，靶的性能是基因产物的稳定性（例如，对变性、蛋白水解或其他降解因素的耐受性），而在其他实施例中，生产性宿主中的生产水平被改变。
术语“性能”或其语法上的等同物就核酸而言，如本文所用，是指核酸的能够被选择或检测的任何特性或属性。这些性能包括但不限于影响与多肽的结合的性能、在包含特定核酸的细胞上赋予的性能、影响基因转录的性能（例如，启动子强度、启动子识别、启动子调控、增强子功能）、影响RNA加工的性能（例如，RNA拼接、RNA稳定性、RNA构象、和转录后修饰）、影响翻译的性能（例如，水平、调控、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰）。例如，核酸与转录因子、聚合酶、调控因子等的结合位点可被改变，以产生所期望的特性或鉴定不合乎期望的特性。
术语“性能”或其语法上的等同物就多肽（包括蛋白质）而言，如本文所用，是指多肽的能够被选择或检测的任何特性或属性。这些性能包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、酶活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性特征、对蛋白水解降解的耐受性、KM、kcat、kcat/kM比率、蛋白质折叠、免疫反应的诱导、结合配体的能力、结合受体的能力、被分泌的能力、在细胞表面被展示的能力、寡聚体化的能力、发出信号的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导细胞凋亡的能力、通过磷酸化或糖基化被修饰的能力、和/或治疗疾病的能力等。
如本文所用，术语“筛选”具有其在本领域中通常的含义。在一个示例性筛选方法中，突变的核酸或由其编码的变体多肽被提供，并且所述突变的核酸或变体多肽的性能分别地被评估或测定。可将所测定的突变的核酸或变体多肽的性能与对应的前体（亲本）核酸的性能或对应的亲本多肽的性能分别地比较。
对技术人员而言将显而易见的是，用于获得具有改变的性能的核酸或蛋白质的筛选过程依赖于起始材料的性能，其中突变的核酸的产生旨在有利于所述初始材料的性能的修改。技术人员将从而会理解，本发明并不限于任何将被筛选的具体性能，并且下列对性能的描述仅列出了例证性的例子。用于筛选任何特定性能的方法是本领域中一般地被描述的。例如，任何人能够测量突变之前和之后的结合、pH、特异性等，其中变化表明了存在改变。优选地，筛选以高通量的方式进行，包括多个样品被同时筛选，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示、和多重底物和/或指示物的测定。
如本文所用，在一些实施例中，筛选方法包括一个或多个选择步骤，在其中所关注的变体被从变体的群体中富集。这些实施例的例子包括赋予宿主生物生长优势的变体的选择，以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中变体能够基于它们的结合或催化性能而被从变体的群体中捕获。在一些实施例中，变体的库被暴露于胁迫（例如，热、变性等），并且随后那些仍然未受损的变体在筛选中被鉴定或通过选择被富集。该术语旨在涵盖用于选择的任何适合的方法。实际上，本发明并不旨在限于任何特定的筛选方法。
术语“经修饰的核酸序列”或“经修饰的基因”本文中可互换使用，是指包括天然存在的（即，野生型）核酸序列的缺失、插入或中断的核酸序列。在一些实施例中，经修饰的核酸序列的表达产物是截短的蛋白质（例如，如果所述修饰是序列的缺失或中断）。在一些实施例中，所述截短的蛋白质保留了生物活性。在替代性实施例中，经修饰的核酸序列的表达产物是延长的蛋白质（例如，修饰包括向所述核酸序列中的插入）。在一些实施例中，核酸序列中的核苷酸插入导致截短的蛋白质（例如，当所述插入导致终止密码子的形成时）。因此，插入可导致作为表达产物的截短的蛋白质或延长的蛋白质。
“突变的”核酸序列通常是指具有在宿主细胞的野生型序列中发生的至少一个密码子的改变，使得该突变的核酸序列的表达产物是相对于野生型蛋白质具有改变的氨基酸序列的蛋白质的核酸序列。所述表达产物可具有改变的功能能力（例如，增强的酶活性）。
如本文所用，短语“底物特异性的改变”是指酶的底物特异性的变化。在一些实施例中，底物特异性的变化被定义为由酶的突变或反应条件的改变导致的就特定底物而言kcat和/或Km的变化。酶的底物特异性通过比较其对不同底物表现出的催化效率而被测定。这些测定在对突变型酶的效率的评估中特别有用，因为一般期望产生对所关注的底物表现出更高的kcat/Km比率的变体酶。然而，本发明并不旨在限于任何特定的底物组合物或底物特异性。
如本文所用，“表面特性”被用于指蛋白质的表面表现出的静电荷，以及诸如疏水性和亲水性的性能。
如本文所用，术语“净电荷”被定义为分子中存在的全部电荷的总和。使亲本蛋白质分子发生了“净电荷变化”，以提供具有的净电荷不同于亲本分子的净电荷的变体（即，所述变体具有的净电荷与亲本分子所具有的是不相同的）。例如，用带负电的氨基酸取代中性氨基酸或用中性氨基酸取代带正电的氨基酸导致相对于亲本分子为-1的净电荷。用带负电的氨基酸取代带正电的氨基酸导致相对于亲本为-2的净电荷。用带正电的氨基酸取代中性氨基酸或用中性氨基酸取代带负电的氨基酸导致相对于亲本为+1的净电荷。用带正电的氨基酸取代带负电的氨基酸导致相对于亲本为+2的净电荷。通过缺失和/或插入带电荷的氨基酸也能够改变亲本蛋白质的净电荷。
术语“热稳定的”和“耐热的”以及“热稳定性”是指蛋白酶在本发明的蛋白分解、水解、清洁或其他过程中普遍的条件下暴露于确定的温度一段给定的时间后，在被暴露于改变的温度时保持了特定量的酶活性。“改变的温度”包括提高的或降低的温度。在一些实施例中，蛋白酶在暴露于改变的温度一段给定的时间，例如，至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等之后，保持了至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%的蛋白水解活性。
术语“增强的稳定性”在关于氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶时，是指与其他蛋白酶（例如，枯草杆菌蛋白酶）和/或野生型的酶相比，随着时间的过去保留的更高的蛋白水解活性。
术语“减弱的稳定性”在关于氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶时，是指与其他蛋白酶（例如，枯草杆菌蛋白酶）和/或野生型的酶相比，随着时间的过去保留的更低的蛋白水解活性。
术语“清洁活性”在本发明的蛋白分解、水解、清洁或其他过程中普遍的条件下，变体蛋白酶或参考蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，变体蛋白酶或参考蛋白酶的清洁性能，可使用针对清洁物品或表面上的一种或多种不同的酶敏感的污渍（例如，由食物、草、血液、墨水、奶、油、和/或蛋的蛋白质导致的污渍）的多种检测法测定。变体或参考蛋白酶的清洁性能，能够通过使物品或表面上的污渍经历标准洗涤条件，并使用多种色谱法的、分光光度法的、或其他定量的方法评估污渍被移除的程度而加以测定。示例性的清洁测定和方法是本领域中已知的，并且包括但不限于WO99/34011和美国专利6,605,458（这两个专利均以引用方式并入本文）中所描述的那些，以及下文的例子中所包括的那些清洁测定和方法。
术语变体蛋白酶或参考蛋白酶的“清洁有效量”是指特定清洁组合物中达到所期望的酶活性水平的蛋白酶的量。此类有效量由本领域的普通技术人员容易地确定，并且其取决于多种因素，例如所使用的特定蛋白酶、清洁用途、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干燥（例如，粒状、片状、条状）组合物等。
术语“助剂材料”是指包含在清洁和/或处理组合物中的除本发明的变体蛋白酶之外的任何液体、固体或气体材料。在一些实施例中，本发明的组合物包含一种或多种清洁助剂材料。每一清洁助剂材料通常基于特定类型和形式的清洁组合物（例如，液体、颗粒、粉末、条棒、糊剂、喷雾、片剂、凝胶、泡沫、或其他组合物）来选择。优选地，每一清洁助剂材料是与组合物中所使用的蛋白酶相容的。
术语“增强的性能”在关于清洁活性时是指酶对某些酶敏感的污渍如蛋、奶、草、墨水、油、和/或血液的提高的或更高的清洁活性，如通过在一个标准的洗涤循环和/或多个洗涤循环之后通常的评估所测定的。
术语“减弱的性能”在关于清洁活性时是指酶对某些酶敏感的污渍如蛋、奶、草、墨水、油、和/或血液的降低的或更低的清洁活性，如通过在一个标准的洗涤循环之后通常的评估所测定的。
术语“相对性能”在关于本发明的变体蛋白酶的清洁活性时，是指比较性或参考蛋白酶（例如，可商购获得的蛋白酶）的清洁活性的至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.5%，所述比较性或参考蛋白酶包括但不限于：例如，OPTIMASETM蛋白酶（Genencor）、PURAFECTTM蛋白酶产品（Genencor）、SAVINASETM蛋白酶（Novozymes）、BPN’-变体（参见，例如，美国专利Re34,606）、RELASETM、DURAZYMETM、EVERLASETM、KANNASETM蛋白酶（Novozymes）、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM蛋白酶（Genencor；亦参见美国专利Re34,606，和美国专利5,700,676；5,955,340；6,312,936；和6,482,628）、以及迟缓芽孢杆菌（B.lentus）变体蛋白酶产品（例如WO92/21760、WO95/23221和/或WO97/07770中所描述的那些）。清洁性能能够通过在涉及酶敏感的污渍如草、血液、墨水、和/或奶的多种清洁测定中比较本发明的变体蛋白酶与参考枯草杆菌蛋白酶而确定，如在标准的洗涤循环条件之后通过通常的分光光度法的或分析的方法所测定的。
如本文所用，术语“消费品”是指织物和家居护理产品。如本文所用，术语“织物和家居护理产品”或“织物和家庭护理产品”包括一般来讲旨在以它们在其中被销售并且被用于处理织物、硬质表面和任何其他表面的形式被使用或消耗的产品，和全部用于护理和清洁非生命的表面的清洁体系，以及织物调理产品和特别地设计用于护理和保养织物的其他产品，以及空气护理产品，包括：空气护理包括空气清新剂和香气递送系统、汽车护理、宠物护理、家畜保健、个人护理、首饰护理、盘碟洗涤、织物调理（包括软化和/或清新）、洗衣去污、洗衣和清洗添加剂和/或护理、预处理清洁组合物、硬质表面清洁和/或处理包括地板和抽水马桶清洁剂、玻璃清洁剂和/或处理、瓷砖清洁剂和/或处理、陶瓷清洁剂和/或处理、和供消费者或机构使用的其他清洁产品。在一些实施例中，织物和家居护理产品适用于伤口和/或皮肤。“织物和家居护理产品”包括消费者和机构的产品。
如本文所用，术语“非织物和家居护理产品”是指被添加至其他组合物，以产生可以是织物和家居护理产品的终产品的组合物。
如本文所用，术语“机构用清洁组合物”是指适合在机构中使用的产品，所述机构包括但不限于学校、医院、工厂、商店、企业、建筑物、餐馆、办公综合体和建筑物、加工和/或制造工厂、兽医院、工厂化农场、工厂化牧场等。
如本文所用，术语“清洁和/或处理组合物”是织物和家居护理产品的子集，除非另外指明，其包括适用于清洁和/或处理物品的组合物。此类产品包括但不限于用于在织物与家居护理领域中处理织物、硬质表面和任何其他表面的产品，包括：包括空气清新剂和香味递送体系在内的空气处理，汽车护理，盘碟洗涤，织物处理（包括柔化和/或新鲜化），衣物去污，衣物洗涤和漂洗添加剂和/或护理，包括地板和抽水马桶清洁剂在内的硬质表面清洁和/或处理，以及用于消费者或机构用途的其他清洁颗粒状或粉末状的通用型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁剂；液体、凝胶或糊状的通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗盘碟洗涤剂或轻垢洗碗剂，尤其是那些高度起泡型；机洗盘碟洗涤剂，包括用于家庭和机构用途的各种片状、颗粒状、液体和辅助漂洗类型；汽车或地毯香波，包括抽水马桶清洁剂在内的浴室清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理型，负载基质的产品如添加的烘干机用香水纸。
实际上，如本文所用，本发明的“清洁组合物”或“清洁制剂”是指对于从待清洁的物体、物品或表面移除或除去化合物（例如，非期望的化合物）有用的本发明的任何组合物，所述待清洁的物体、物品或表面包括但不限于：例如，织物、纺织品、盘碟物品、餐具物品、玻璃物品、隐形眼镜、其他固体基质、毛发（洗发水）（包括人类或动物毛发）、皮肤（肥皂或乳液）、牙齿（漱口水、牙膏）、物品或物体的表面（例如，硬质表面，如桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板、非盘碟物品、非餐具物品等的硬质表面）、过滤器、膜（例如，滤膜，包括但不限于超滤膜）等。该术语涵盖被选择用于所期望的清洁组合物的具体类型的任何材料和/或添加的化合物、以及产品的形式（例如，液体、凝胶、颗粒、喷雾、或其他组合物），只要所述组合物与该组合物中使用的蛋白酶和其他酶类是相容的。通过考虑待清洁的表面、物体、物品、或织物，以及就使用过程中的清洁条件而言所期望的组合物的形式，可容易地决定清洁组合物材料的具体选择。
清洁组合物和清洁制剂包括适合对任何物体、物品、和/或表面进行清洁、漂白、消毒、和/或灭菌的任何组合物。此类组合物和制剂包括但不限于：例如，液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物（例如，液体、片剂、凝胶、条棒、颗粒、和/或固体衣物清洁或洗涤剂组合物和细薄织物洗涤剂组合物；硬质表面清洁组合物和制剂，例如玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；和纺织品、衣物助洗清洁或洗涤剂组合物，洗衣添加清洁组合物，和衣物前处理清洁组合物；盘碟洗涤组合物，包括手工或人工盘碟洗涤组合物（例如，“手工”或“人工”盘碟洗涤洗涤剂）和自动化盘碟洗涤组合物（例如，“自动化盘碟洗涤洗涤剂”）。
除非另外指明，如本文所用，清洁组合物或清洁制剂是指颗粒状或粉状多功能或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂、或糊状多功能洗涤剂，尤其是通常所说的重垢型液体（HDL）洗涤剂或重垢型粉末洗涤剂（HDD）类型；液体精细织物洗涤剂；手工或人工盘碟洗涤剂，包括高泡型的那些；手工或人工盘碟洗涤、自动化盘碟洗涤、或盘碟或餐具洗涤剂，包括各种供家庭和机构使用的片状、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶、和漂洗助剂型洗涤剂；液体清洁和杀菌剂，包括抗菌手洗型、清洁皂、漱口水、假牙清洁剂、汽车香波、地毯香波、浴室清洁剂；用于人类和其他动物的洗发香波和/或护发液；洗浴凝胶和泡沫浴液以及金属清洁剂；以及清洁助剂，如漂白添加剂和“去污棒”或预处理型助剂。在一些实施例中，颗粒状组合物是处于“致密”形式的；在一些实施例中，液体组合物是处于“浓缩”形式的。
如本文所用，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，其包括衣物洗涤添加剂组合物和适合用于带污渍的织物（例如，衣服、亚麻制品、和其他纺织材料）的浸泡和/或预处理中的组合物。
如本文所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织品（即，非织物的）表面清洁组合物，包括但不限于：例如，手工或人工或自动化盘碟洗涤洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、和个人清洁组合物。
如本文所用，术语“织物和/或硬质表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指明，其包括颗粒状或粉末状通用型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂状的通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体类型；液体精细织物洗涤剂；手洗盘碟洗涤剂或轻垢型盘碟洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机洗盘碟洗涤剂，包括各种用于家庭和机构用途的片剂、颗粒、液体和辅助漂洗类型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，包括抽水马桶清洁剂在内的浴室清洁剂；可为液体、固体和/或烘干机用香水纸形式的织物调理产品（包括软化和/或清新化）；以及清洁助剂，如漂白添加剂和“去污棒”或预处理型，负载基质的产品如添加的烘干机用香水纸。可应用的所有此类产品可为标准品、浓缩的或甚至高度浓缩的形式，甚至到此类产品可在某个方面为非水性的程度。
如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于指旨在用于针对带污渍的或弄脏的物体的清洁的洗涤介质中的组合物，所述物体包括特定织物和/或非织物的物体或物品。本发明的此类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些实施例中，本发明的洗涤剂包含至少一种本发明的变体蛋白酶，以及在此之外，一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂（例如，助洗盐）、漂白剂、漂白激活剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂、和/或增溶剂。在一些情况下，助洗盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐（例如，三聚磷酸钠）更多的硅酸盐（例如，偏硅酸钠）。一些本发明的组合物，例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物，不包含任何磷酸盐（例如，磷酸盐或磷酸盐助洗剂）。
如本文所用，术语“漂白”是指在适当的pH和/或温度条件下，对材料（例如，织物、衣物、纸浆等）或表面进行的足够长时间的、用以有效地亮化（即，增白）和/或清洁所述材料的处理。适合用于漂白的化学品的例子包括但不限于：例如ClO2、H2O2、过酸、NO2等。
如本文所用，蛋白酶（例如，本发明的变体蛋白酶）的“洗涤性能”是指变体蛋白酶对洗涤的贡献，与没有将变体蛋白酶添加至组合物中的洗涤剂相比，其为洗涤剂提供了附加的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下比较的。在一些测试体系中，其他相关因素，如洗涤剂组成、泡沫浓度、水的硬度、洗涤力学、时间、pH、和/或温度，能够以使得模拟了就某些细分市场中的家庭应用（例如，手工或人工盘碟洗涤、自动化盘碟洗涤、盘碟清洁、餐具清洁、织物清洁等）而言典型的条件的方式被控制。
术语“相关的洗涤条件”在本文中用于指在手工盘碟洗涤、自动化盘碟洗涤、或衣物洗涤剂细分市场中在家庭中实际使用的条件，尤其是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水的硬度。
术语“改善的洗涤性能”被用于指相对于对应的野生型或初始的亲本蛋白酶，在相关的洗涤条件下获得了污渍移除的更好的最终结果，或获得相同的最终结果需要更少的以重量计的变体蛋白酶。
如本文所用，术语“消毒”是指污物从表面的移除，以及在物品表面的微生物的抑制或灭杀。本发明不旨在限于任何特定的表面、物品、或待移除的污物或微生物。
本文的清洁组合物的“致密”形式最佳的体现是通过密度，以及就组合物而言，通过无机填料盐的量。无机填料盐是粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规的洗涤剂组合物中，填料盐以充分的量存在，通常为按总的组合物的重量计约17至约35%。与此相对，在致密组合物中，填料盐以总的组合物的不超过约15%的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过所述组合物的重量的约10%，或者更优选地，约5%的量存在。在一些实施例中，所述无机填料盐选自碱和碱土金属的硫酸盐和氯化物。在一些实施例中，所述填料盐是硫酸钠。
氨基酸残基在给定氨基酸序列中的位置在本文中通常采用SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的对应氨基酸残基的位置的编号来编号。SEQ ID NO:1的解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列因此充当了参考序列。给定的氨基酸序列，如本文所述的变体蛋白酶氨基酸序列，能够使用本文所述的比对算法与BPN’序列（SEQ ID NO:1）比对，并且与所述BPN’序列中的氨基酸残基比对（优选为最佳比对）的所述给定氨基酸序列中的氨基酸残基，能够方便地参考所述枯草杆菌蛋白酶BPN’序列中对应的氨基酸残基而被编号。作为另外一种选择，如果枯草杆菌蛋白酶变体蛋白酶序列的氨基酸残基位置是使用GG36氨基酸序列（SEQ ID NO:2）中氨基酸残基位置的实际编号来编号的，而不是在比对时参考BPN’序列中对应的氨基酸位置，则该枯草杆菌蛋白酶变体蛋白酶能够被描述为SEQ ID NO:2中所示的GG36蛋白酶的变体蛋白酶。
一般来讲，本文使用的命名法和下文描述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学、和蛋白质化学中的许多实验室方法是为人们所熟知的，并且被本领域的普通技术人员普遍采用。用于制备和操作重组核酸的方法、核酸合成、细胞培养方法、和转基因的整合（例如，转染、电穿孔）是本领域的技术人员已知的，并且描述于众多的标准文献中。寡核苷酸的合成和纯化是通常按照说明书进行的。技术和规程一般是按照本领域中为人们所熟知的常规方法和本文件通篇提供的多种一般性参考文献进行的。其中的规程据信是本领域的普通技术人员所熟知的，并且是为了读者的方便而被提供。
用于本发明中的多肽
本发明包括一种或多种蛋白酶变体，即新型多肽，其可以被统称为“用于本发明中的多肽”。用于本发明中的多肽包括具有酶活性（例如，蛋白水解活性）的分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体蛋白酶多肽，包括例如，枯草杆菌蛋白酶变体多肽。在一些实施例中，所述多肽，如枯草杆菌蛋白酶变体、或具有SEQ ID NO:2的序列的GG36的变体，与亲本（例如，具有SEQ ID NO:2的序列的GG36蛋白酶）相比具有改善的清洁性能。在一些实施例中，所述多肽在清洁应用中是有用的，并且可被掺入在需要清洁的物品或表面（例如，物品的表面）的清洁方法中有用的清洁组合物中。
在一些实施例中，用于本发明中的变体蛋白酶包括“变体枯草杆菌蛋白酶”。在一些实施例中，本发明使用了“芽孢杆菌属（Bacillus sp.）变体蛋白酶”。在一些实施例中，本发明使用了“芽孢杆菌属（Bacillus sp.）变体枯草杆菌蛋白酶”。在一些实施例中，本发明使用了分离的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，本发明使用了迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
在任何上文的实施例中，本发明可包括具有蛋白水解活性的分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体蛋白酶，其多肽包含与编码本文提供的变体蛋白酶的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.5%、或100%的序列同一性的多肽序列。
如上文所指出的，在清洁应用中，所述变体蛋白酶多肽具有酶活性（例如，蛋白水解活性）并因此在本发明中是有用的，所述清洁应用包括但不限于：用于清洁盘碟物品、餐具物品、织物、和具有硬质表面的物品（例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬质表面）的方法。包含一种或多种变体蛋白酶多肽的示例性清洁组合物描述于下文中。对于本发明必不可少的变体蛋白酶多肽的酶活性（例如，蛋白酶活性）能够使用本领域的普通技术人员所熟知的规程容易地测定。下文显示的例子描述了用于评估酶活性、清洁性能、和/或洗涤性能的方法。本发明的变体蛋白酶在移除污渍（例如，蛋白质的污渍）、清洁硬质表面、或清洁衣物、盘碟或餐具物品中的性能，能够使用本领域中为人们所熟知的规程和/或使用例子中所列的规程容易地测定。
对于本发明必不可少的多肽能够接受多种改变，如一个或多个氨基酸的插入、缺失、和/或保守的或非保守的取代，包括在此类改变并不在实质上改变该多肽的酶活性的地方。类似地，本发明的核酸也能够接受多种改变，如一种或多种核酸在一个或多个密码子中的一个或多个取代，使得特定的密码子编码相同的或不同的氨基酸，导致沉默变异（例如，在氨基酸序列中导致沉默突变的核苷酸序列的突变，例如当所编码的氨基酸不被该核酸突变改变时）或非沉默变异，一种或多种核酸（或密码子）在序列中的一个或多个缺失，一种或多种核酸（或密码子）在序列中的一个或多个添加或插入，和/或一种或多种核酸（或密码子）在序列中的断裂或一个或多个截断。与由初始的核酸序列编码的变体蛋白酶相比，核酸序列中的许多此类变化可能并不在实质上改变所得到的被编码的变体蛋白酶的酶活性。本发明的核酸还能够被修改，以包括在表达体系（例如，细菌的表达体系）中提供最佳表达的一个或多个密码子，同时，如果需要的话，所述一个或多个密码子仍然编码相同的氨基酸。
在一些实施例中，本发明包括了包括具有所期望的酶活性（例如，蛋白酶活性或清洁性能活性）的变体蛋白酶多肽的种类，其包含具有本文描述的氨基酸取代的序列，并且其包含一个或多个附加的氨基酸取代，如保守的和非保守的取代，其中所述多肽表现出、维持、或大致维持了所期望的酶活性（例如，蛋白酶活性或枯草杆菌蛋白酶活性，如在所述变体蛋白酶的清洁活性或性能中所反映的）。根据本发明的氨基酸取代可包括但不限于一个或多个非保守的取代和/或一个或多个保守的氨基酸取代。保守的氨基酸残基取代通常涉及用氨基酸残基的一个功能性类别中的成员替换属于相同的功能性类别的残基（在功能同源性百分比的计算中，相同的氨基酸残基被认为是功能上同源的）。保守的氨基酸取代通常涉及用功能上相似的氨基酸对氨基酸序列中的氨基酸的取代。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、和苏氨酸是功能上相似的，并因此可彼此作为保守的氨基酸取代。天冬氨酸和谷氨酸可彼此作为保守的取代。天冬酰胺和谷氨酰胺可彼此作为保守的取代。精氨酸、赖氨酸、和组氨酸可彼此作为保守的取代。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸可彼此作为保守的取代。苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸可彼此作为保守的取代。
能够设想其他的保守氨基酸取代。例如，氨基酸能够按照相似的功能或化学结构或组成（例如，酸性、碱性、脂肪族、芳香族、含硫的）被分组。例如，脂肪族的分组可包括：甘氨酸（G）、丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）。包含被认为彼此是保守的取代的氨基酸的其他分组包括：芳香族的：苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）；含硫的：甲硫氨酸（M）、半胱氨酸（C）；碱性的：精氨酸（R）、赖氨酸（K）、组氨酸（H）；酸性的：天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）；非极性不带电的残基：半胱氨酸（C）、甲硫氨酸（M）、和脯氨酸（P）；亲水性不带电的残基：丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）、和谷氨酰胺（Q）。氨基酸的附加的分组是本领域的技术人员所熟知的，并且描述于多种标准教科书中。本文的多肽序列的列表，结合上述取代的分组，提供了全部保守取代的多肽序列的快捷列表。
更多的保守取代存在于上文描述的氨基酸残基的分类中，其同样地或替代性地能够是适合的。保守度更高的取代的保守的组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，例如，在一些实施例中，本发明提供了具有蛋白水解活性的分离的或重组的变体蛋白酶多肽（例如，变体枯草杆菌蛋白酶），所述变体蛋白酶多肽包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、或约99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在本发明的变体蛋白酶中一个氨基酸对另一个的保守的取代预期不会显著改变该变体蛋白酶的酶活性或清洁性能活性。所得到的蛋白酶的酶活性或清洁性能活性能够使用标准检测法和本文所述的检测法容易地测定。
本发明的多肽序列（例如，本发明的变体蛋白酶）的保守取代的变异包括占小的百分比的取代，有时为所述多肽序列的氨基酸的小于约25%、约20%、约15%、约14%、约13%、约12%、约11%、约10%、约9%、约8%、约7%、或约6%，或者当保守地选择的氨基酸属于相同的保守取代的组时，为所述多肽序列的氨基酸的小于约5%、约4%、约3%、约2%、或约1%。
如本文中其他地方更详细地描述的和本文提供的例子中描述的，用于本发明中的多肽可具有可以与已知的蛋白酶，包括已知的枯草杆菌蛋白酶，相比较的清洁能力。示例性的已知的枯草杆菌蛋白酶包括但不限于：例如，迟缓芽孢杆菌（B.lentus）枯草杆菌蛋白酶GG36、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）枯草杆菌蛋白酶BPN’、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L、和克劳氏芽孢杆菌（B.clausii）PB92。成熟的迟缓芽孢杆菌（B.lentus）枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白质的氨基酸序列是：
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO:2)
成熟的解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白质的氨基酸序列是：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGAS
MVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGA
DGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGV
VVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELD
VMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQ
VRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO:1)
本发明可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022R+V104I+Q245R，G020R+S024R+S101A，T022R+S103A+V104I，
T022R+V104I+A232V，T022R+S103A+Q245R，T022R+A232V+Q245R，
T022R+S103A+A232V，T022R+S103A+V104I+A232V，
T022R+V104I+A232V+Q245R，T022R+S103A+V104I+Q245R，
T022R+S103A+A232V+Q245R，T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R，
T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R，
T022A+N076D+S103A+V104I+A232V，
T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R，
T022A+N076D+S103A+A232V+Q245R，
T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R，T022A+N076D+V104I+Q245R，
T022A+N076D+A232V+Q245R，T022A+N076D+V104I+A232V，
T022A+N076D+S103A+Q245R，T022A+N076D+S103A+A232V，
T022A+N076D+S103A+V104I，T022A+N076D+S103A，
T022A+N076D+V104I，T022A+N076D+A232V，T022A+N076D+Q245R，
G020R+S101A+T213A，G020R+R045T+S101A，G020R+S101A+G211Q，
S024R+S101A+T213A，G020R+T022W+S101A，S024R+S101A+G211Q，
N043R+S101A+T213A，N043R+R045T+S101A，S024R+N043R+S101A，
S024R+R045T+S101A，S101A+G211Q+T213A，G020R+N043R+S101A，
R045T+S101A+T213A，T022W+S024R+S101A，T022R+S101G+V104I，
T022W+S101A+T213A，T022R+S101G+Q245R，T022W+S101A+G211Q，
G020R+S024R+Q245R，T022R+S101G+V104I+Q245R，
T022R+S101G+A232V，T022R+S101G+S103A，T022R+S101G+S103A+V104I，
T022R+S101G+S103A+Q245R，T022R+S101G+A232V+Q245R，
T022R+S101G+V104I+A232V，G020R+S024R+S101A+T213A，
G020R+S024R+T213AS101N+V104I+A232V，S101N+S103A+V104I，
S101N+S103A+A232V，S101N+S103A+V104I+A232V，
G020R+S103A+A232V，G020R+V104I+A232V，
G020R+S103A+V104I+A232V，G020R+S103A+V104I，
N018R+N076D+N116A，N018R+N076D+T213A，N018R+N076D+S101A，
N018R+N076D+A215F，或N018R+N076D+G211Q
（列表1），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R（列表2）的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R，
T022A+N076D+S103A+V104I+A232V，
T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R，
T022A+N076D+S103A+A232V+Q245R，或
T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R
（列表3），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022R+S103A+V104I+A232V，T022R+V104I+A232V+Q245R，
T022R+S103A+V104I+Q245R，T022R+S103A+A232V+Q245R，
T022A+N076D+V104I+Q245R，T022A+N076D+A232V+Q245R，
T022A+N076D+V104I+A232V，T022A+N076D+S103A+Q245R，
T022A+N076D+S103A+A232V，T022A+N076D+S103A+V104I，
T022R+S101G+V104I+Q245R，T022R+S101G+S103A+V104I，
T022R+S101G+S103A+Q245R，T022R+S101G+A232V+Q245R，
T022R+S101G+V104I+A232V，G020R+S024R+S101A+T213A，
S101N+S103A+V104I+A232V或G020R+S103A+V104I+A232V
（列表4），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022R+V104I+Q245R，G020R+S024R+S101A，T022R+S103A+V104I，
T022R+V104I+A232V，T022R+S103A+Q245R，T022R+A232V+Q245R，
T022R+S103A+A232V，T022A+N076D+S103A，T022A+N076D+V104I，
T022A+N076D+A232V，T022A+N076D+Q245R，G020R+S101A+T213A，
G020R+R045T+S101A，G020R+S101A+G211Q，S024R+S101A+T213A，
G020R+T022W+S101A，S024R+S101A+G211Q，N043R+S101A+T213A，
N043R+R045T+S101A，S024R+N043R+S101A，S024R+R045T+S101A，
S101A+G211Q+T213A，G020R+N043R+S101A，R045T+S101A+T213A，
T022W+S024R+S101A，T022R+S101G+V104I，T022W+S101A+T213A，
T022R+S101G+Q245R，T022W+S101A+G211Q，G020R+S024R+Q245R，
T022R+S101G+A232V，T022R+S101G+S103A，G020R+S024R+T213A，
S101N+V104I+A232V，S101N+S103A+V104I，S101N+S103A+A232V，
G020R+S103A+A232V，G020R+V104I+A232V，G020R+S103A+V104I，
N018R+N076D+N116A，N018R+N076D+T213A，N018R+N076D+S101A，
N018R+N076D+A215F，或N018R+N076D+G211Q
（列表5），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V104I、S101N+S103A+A232V、或S101N+S103A+V104I+A232V（列表6）的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有S101N+S103A+V104I+A232V（列表7）的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ IDNO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V104I、或S101N+S103A+A232V（列表8）的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
S103A+V104I+S188D，S188D+Q245R+N248D，S103A+S188D+Q245R，
V104I+S188D+Q245R，S103A+V104I+S188D+Q245R，T022A+S103A+S188D，
T022A+V104I+S188D，T022A+S103A+V104I+S188D，G159D+S188D+Q245R，
S103A+S188D+A232V，S103A+G159D+S188D，V104I+S188D+A232V，
V104I+G159D+S188D，S103A+V104I+S188D+A232V，
S103A+V104I+G159D+S188D，S103A+S188D+N248D，V104I+S188D+N248D，
S103A+V104I+S188D+N248D，G159D+S188D+N248D，
S188D+A232V+Q245R，S103A+S188D+A232V+Q245R，
V104I+S188D+A232V+Q245R，S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S188D+Q245R，T022A+S103A+S188D+Q245R，
T022A+V104I+S188D+Q245R，S103A+S188D+E271F，V104I+S188D+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R，S103A+V104I+S188D+E271F，
T022A+S188D+N248D，T022A+S103A+S188D+N248D，
T022A+V104I+S188D+N248D，S103A+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+V104I+S188D+N248D，V104I+S188D+Q245R+N248D，
S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D，T022A+S188D+A232V，
T022A+S103A+S188D+A232V，T022A+V104I+S188D+A232V，
T022A+S103A+V104I+S188D+A232V，S188D+A232V+N248D，
S188D+Q245R+E271F，T022A+S188D+E271F，
T022A+S188D+Q245R+N248D，S103A+S188D+A232V+N248D，
S103A+S188D+Q245R+E271F，S188D+N248D+E271F，
V104I+S188D+A232V+N248D，V104I+S188D+Q245R+E271F，
T022A+S103A+S188D+E271F，T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D，
S103A+S188D+N248D+E271F，T022A+V104I+S188D+E271F，
T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D，S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F，
S103A+V104I+S188D+A232V+N248D，V104I+S188D+N248D+E271F，
S188D+A232V+E271F，T022A+S103A+V104I+S188D+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D，
S103A+V104I+S188D+N248D+E271F，S103A+S188D+A232V+E271F，
V104I+S188D+A232V+E271F，T022A+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S188D+Q245R+E271F，T022A+S188D+N248D+E271F，
S103A+V104I+S188D+A232V+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R，S188D+A232V+Q245R+N248D，
S188D+Q245R+N248D+E271F，T022A+S188D+A232V+N248D，
T022A+S103A+S188D+Q245R+E271F，
T022A+S103A+S188D+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R，
S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D，
S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+N248D，
T022A+V104I+S188D+N248D+E271F，T022A+V104I+S188D+Q245R+E271F，
S188D+A232V+Q245R+E271F，S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R，
V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+V104I+S188D+A232V+N248D，
V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F，T022A+S188D+A232V+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+N248D+E271F，
T022A+S188D+Q245R+N248D+E271F，
S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F，
S103A+S188D+A232V+N248D+E271F，
S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+N248D，
S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+S103A+S188D+A232V+E271F，
V104I+S188D+A232V+N248D+E271F，V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+E271F，
T022A+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D，
S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F，
S103A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F，
S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D，
S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F，
G159D+S188D+Q245R+N248D，T022A+G159D+S188D，
T022A+S103A+G159D+S188D，T022A+V104I+G159D+S188D，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D，S103A+G159D+S188D+Q245R，
V104I+G159D+S188D+Q245R，S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R，
S103A+G159D+S188D+N248D，V104I+G159D+S188D+N248D，
S103A+V104I+G159D+S188D+N248D，G159D+S188D+A232V，
S103A+G159D+S188D+A232V，V104I+G159D+S188D+A232V，
S103A+V104I+G159D+S188D+A232V，T022A+G159D+S188D+Q245R，
G159D+S188D+E271F，T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R，
S103A+G159D+S188D+E271F，T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R，
V104I+G159D+S188D+E271F，T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R，
S103A+V104I+G159D+S188D+E271F，T022A+G159D+S188D+N248D，
T022A+S103A+G159D+S188D+N248D，
T022A+V104I+G159D+S188D+N248D，
S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+N248D，
V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D，
S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D，
T022A+G159D+S188D+A232V，T022A+S103A+G159D+S188D+A232V，
T022A+V104I+G159D+S188D+A232V，G159D+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+A232V，
S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R，G159D+S188D+Q245R+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R，G159D+S188D+A232V+N248D，
T022A+G159D+S188D+E271F，S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F，
G159D+S188D+N248D+E271F，
S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R，
S103A+G159D+S188D+A232V+N248D，
T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+G159D+S188D+E271F，
V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F，T022A+V104I+G159D+S188D+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+N248D，
S103A+G159D+S188D+N248D+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D，
S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F，
V104I+G159D+S188D+N248D+E271F，G159D+S188D+A232V+E271F，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+E271F，
S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D，
T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D，
S103A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F，
S103A+G159D+S188D+A232V+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+E271F，
T022A+G159D+S188D+N248D+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R，
T022A+G159D+S188D+Q245R+E271F，
S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F，
G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+N248D+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+N248D，
G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R，
S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F，
G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F，
G159D+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+N248D，
V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F，
S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+G159D+S188D+A232V+E271F，
T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F，
S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D，
V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D，
S103A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F，
G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D，S101G+S103A+S188D，
S101G+V104I+S188D，S101G+S103A+V104I+S188D
（列表9），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+N248D+E271F，
S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+N248D，
S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F，
S103A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F，
S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D，
S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+N248D，
S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+A232V，
S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D，
S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D+E271F，
S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D，
T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D，
S103A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F，
S103A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+N248D+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+N248D+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R，
S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+N248D，
V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F，
S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F，
S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+N248D，
V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D，
S103A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+A232V+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+V104I+G159D+S188D+A232V+E271F，
G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F，或
T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D
（列表10），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R，T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R，
T022A+S103A+V104I+S188D+N248D，
S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+V104I+S188D+A232V，
T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D，
T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D，S103A+V104I+S188D+Q245R+E271F，
S103A+V104I+S188D+A232V+N248D，T022A+S103A+V104I+S188D+E271F，
S103A+V104I+S188D+N248D+E271F，S103A+V104I+S188D+A232V+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S103A+S188D+Q245R+E271F，
T022A+S103A+S188D+N248D+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R，
S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D，
S103A+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+N248D，
T022A+V104I+S188D+N248D+E271F，T022A+V104I+S188D+Q245R+E271F，
V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D，
T022A+V104I+S188D+A232V+N248D，
V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S188D+Q245R+N248D+E271F，
S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F，
S103A+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S103A+S188D+A232V+E271F，
V104I+S188D+A232V+N248D+E271F，V104I+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+V104I+S188D+A232V+E271F，
T022A+S188D+A232V+N248D+E271F，
T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D，
S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S188D+A232V+Q245R+E271F，
T022A+S103A+V104I+G159D+S188D，
S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R，
S103A+V104I+G159D+S188D+N248D，
S103A+V104I+G159D+S188D+A232V，
T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R，
T022A+V104I+G159D+S188D+Q245R，S103A+V104I+G159D+S188D+E271F，
T022A+S103A+G159D+S188D+N248D，
T022A+V104I+G159D+S188D+N248D，
S103A+G159D+S188D+Q245R+N248D，
V104I+G159D+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+G159D+S188D+A232V，
T022A+V104I+G159D+S188D+A232V，
S103A+G159D+S188D+A232V+Q245R，
V104I+G159D+S188D+A232V+Q245R，
S103A+G159D+S188D+Q245R+E271F，
S103A+G159D+S188D+A232V+N248D，
T022A+G159D+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+G159D+S188D+E271F，
V104I+G159D+S188D+Q245R+E271F，T022A+V104I+G159D+S188D+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+N248D，
S103A+G159D+S188D+N248D+E271F，
V104I+G159D+S188D+N248D+E271F，
S103A+G159D+S188D+A232V+E271F，
V104I+G159D+S188D+A232V+E271F，
T022A+G159D+S188D+N248D+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+Q245R，
T022A+G159D+S188D+Q245R+E271F，
G159D+S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+G159D+S188D+A232V+N248D，
G159D+S188D+A232V+Q245R+N248D，
G159D+S188D+A232V+Q245R+E271F，
G159D+S188D+A232V+N248D+E271F，或
T022A+G159D+S188D+A232V+E271F
（列表11），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
S103A+V104I+S188D+Q245R，T022A+S103A+V104I+S188D，
S103A+V104I+S188D+A232V，S103A+V104I+G159D+S188D，
S103A+V104I+S188D+N248D，S103A+S188D+A232V+Q245R，
V104I+S188D+A232V+Q245R，T022A+S103A+S188D+Q245R，
T022A+V104I+S188D+Q245R，S103A+V104I+S188D+E271F，
T022A+S103A+S188D+N248D，T022A+V104I+S188D+N248D，
S103A+S188D+Q245R+N248D，V104I+S188D+Q245R+N248D，
T022A+S103A+S188D+A232V，T022A+V104I+S188D+A232V，
T022A+S188D+Q245R+N248D，S103A+S188D+A232V+N248D，
S103A+S188D+Q245R+E271F，V104I+S188D+A232V+N248D，
V104I+S188D+Q245R+E271F，T022A+S103A+S188D+E271F，
S103A+S188D+N248D+E271F，T022A+V104I+S188D+E271F，
V104I+S188D+N248D+E271F，S103A+S188D+A232V+E271F，
V104I+S188D+A232V+E271F，T022A+S188D+A232V+Q245R，
T022A+S188D+Q245R+E271F，T022A+S188D+N248D+E271F，
S188D+A232V+Q245R+N248D，S188D+Q245R+N248D+E271F，
T022A+S188D+A232V+N248D，S188D+A232V+Q245R+E271F，
S188D+A232V+N248D+E271F，T022A+S188D+A232V+E271F，
G159D+S188D+Q245R+N248D，T022A+S103A+G159D+S188D，
T022A+V104I+G159D+S188D，S103A+G159D+S188D+Q245R，
V104I+G159D+S188D+Q245R，S103A+G159D+S188D+N248D，
V104I+G159D+S188D+N248D，S103A+G159D+S188D+A232V，
V104I+G159D+S188D+A232V，T022A+G159D+S188D+Q245R，
S103A+G159D+S188D+E271F，V104I+G159D+S188D+E271F，
T022A+G159D+S188D+N248D，T022A+G159D+S188D+A232V，
G159D+S188D+A232V+Q245R，G159D+S188D+Q245R+E271F，
G159D+S188D+A232V+N248D，T022A+G159D+S188D+E271F，
G159D+S188D+N248D+E271F，G159D+S188D+A232V+E271F，或
S101G+S103A+V104I+S188D
（列表12），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
S103A+V104I+S188D，S188D+Q245R+N248D，S103A+S188D+Q245R，
V104I+S188D+Q245R，T022A+S103A+S188D，T022A+V104I+S188D，
G159D+S188D+Q245R，S103A+S188D+A232V，S103A+G159D+S188D，
V104I+S188D+A232V，V104I+G159D+S188D，S103A+S188D+N248D，
V104I+S188D+N248D，G159D+S188D+N248D，S188D+A232V+Q245R，
T022A+S188D+Q245R，S103A+S188D+E271F，V104I+S188D+E271F，
T022A+S188D+N248D，T022A+S188D+A232V，S188D+A232V+N248D，
S188D+Q245R+E271F，T022A+S188D+E271F，S188D+N248D+E271F，
S188D+A232V+E271F，T022A+G159D+S188D，G159D+S188D+A232V，
G159D+S188D+E271F，S101G+S103A+S188D，或S101G+V104I+S188D
（列表13），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-
S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-S101G-
V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-S101G-S103A-
G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-S101G-S103A-V104I-
S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-
S188D-Q245R-N248D-E271F，T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-
A232V-N248D-E271F，T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-
Q245R-E271F，T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-
N248D，S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-
E271F，T022A-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-
E271F，T022A-S101G-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-
E271F，T022A-S101G-S103A-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-
E271F，T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-S188D-A232V-Q245R-N248D-
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L217Q，G020R-G118R-S188D-N248D，S024R-S188D-N248D，G020R-S024R-
S188D-Q245R-N248D，G020R-S024R-G118R-P129E-G159D-N248D-H249R，
G020R-P129E-N248D，G159D-S188D，P129E-G159D，G020R-S188D-H249R，
P129E-G159D-Q245R-N248D，G020R-G118R-G159D-N248D-H249R，G118R-
S188D-N248D-H249R，G020K-S101D-G102A-L217E-S240R，N043R-G102A-
L217E，N062E-S078N-S101D-S240R，G102A-L217E，G020K-S128L-L217E-
S240R，G020K-N062E-S078N-L217E-S240R，N043R-S101D-S128L-L217E-
S240R，G020K-S078N-S101D-G102A-P210L，N043R-S101D-L217E，G020K-
G100S-L217E-S240R，S078N-G100S，G020K-N043R-S101D-G102A-L217E，
G100S-S240R，G020K-G102A-L217E，G020K-S024G-N062E-S078N-S101N-
Q109N-N116L-S128A-S188D，G020K-L217E-S240R，N043R-S101D，N043R-
S078N-S101D-S128L-S240R，N043R-S078N-S101D-L217E-S240R，G020K-
S078N-S101D，N043R-S128L-S240R，G020K-N062E-N116L-N123G-T213A，
G020K-N062E-G097S-S101G-Q109G-N116L-S128A，G020K-N062E-S078N-
G097A-S101N-Q109N-N116L-S188D，N043R-S078N-S101D-G102A-L217E，
G020K-S078N-S099G-S128L-L217E，G020K-N062E-S101D，G020K-S128L-
L217E，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101G-Q109G-N116L-L217Q，
N043R-G097A-S101D-S128L，G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109N-N116L-
S128A，G020K-S024G-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-L217Q，S078N-
G102A-S240R，N043R-S078N-G100S-L217E-S240R，G020K-S078N-S128L-
L217E-S240R，G020K-N062E-N116L-S128Q，G020K-S101G-L217E-S240R，
G020K-S024G-N062E-S101N-Q109G-N116L-S128A-L217Q，G020K-N062E-
S078N-G097S-S101N-N116L-L217Q，G020K-N062E-G097S-S101N-Q109G-
N116L-L217Q，G020K-S024G-N062E-S078N-G097A-S101Q-Q109N-N116L-
M222S，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109N-N116L-S128A-
S188D-L217Q，G020K-N062E-S078N-S101N-Q109G-N116L-S188D-L217Q，
或G020K-N062E-S105G-N116L-S128L-T213A
（列表14），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ IDNO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022A-S101G-S103A-V104I-N116L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D，
S024R-N116L-A158E-S188D，G020K-S024F-S078N-G118R-T213A，T022A-
S024R-T033S-N116L-G118R-S128I，G020R-S078D-G118D-S188D-Q245R，
S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-T213A-A232V，S024R-N062E-
S078G-G118D-G159D-S188D，T022A-N062E-N116L-G118R-A158E-S166D，
G020K-T022L-S078N-S166D-L217E，G020R-S078D-G118D-G159D，T022A-
S024R-T033S-N116L，G020R-S078D-G118D-P129E-G159D，G020R-S078D-
G118D-G159D-H249R，S024R-N062E-S078G-G118S，S024R-S078D-G118D-
S188D-Q245R-H249R，A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-
Y209V-T213A-A232V，G020R-N062E-S078D-G118D-P129E-G159D-Q245R，
S024F-S101G-S103A-V104I-N116L-G118V-Y209V-G211Q-A232V，S024F-
S166D-L217E，T022A-S024R-S166D，S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-
N248D，A016S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V，A016S-
T022A-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-A232V，S078D-G118S-
G159D-N248D-H249R，S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D，T022A-
S024R-N062E-N116L-G118R-S128I-S188D，S103A-S128N，T022L-S078N-
G118R-S166D-T213A，S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-
Y209A-T213A-A232V，T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-
G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V，S024R-S078D-G118S-
S128N-P129E，S024R-S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R，
T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-
Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V，T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-
S188D-A232T-Q245T-N248D，S024R-T033S-N116L-A158E，S130E-N269K，
S024R-T033S-N116L-S128I-A158E，A016V-G020R-S024R-S078D-G118D-
P129E-Q245R-N248D，S099G-S101A-G102A-S103G-V104I，A016S-T022A-
S101A-V104L-S128N-L148I，G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D，
S259W，S259H，T022A-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-S188D-A232V-
Q245R-N248D-E271F，N018D-S101G-S103A-V104I-N116A-Y209A-G211Q-
T213A-A232V，G020K-S024F-S078N-S166D-T213A，N076D-S101A-S103A-
V104I-S188D-A232V-Q245R，S078D-G118D-P129E-G159D-H249R，S024R-
S078G-G118D-P129E-G159D-N248D，S024R-N062E-S101A-S103A-V104I-
S188D-A232V-Q245R，E271R，G020R-S024R-S078D-G118D-P129E-G159D-
S188D，T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-
Q245R-N248D-A270V-E271F，G020R-N062E-S078D-G118S-G159D-S188D-
Q245R-H249R，Q012R-S101G-S103A-V104I-N116L-S128N-Y209V-A232V，
G020R-S078G-G118D-P129E-G159D-S188D-Q245R-N248D，G020R-N062E-
S078G-G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R-H249R，T022A-S101G-S103A-
V104I-G118R-S128L-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，G020R-
S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-N248D，T022A-S101G-S103A-V104I-
G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V，G020R-S024R-N062E-
S078D-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R，G020R-S078G-G118S-
G159D-H249R，G020K-T022L-S024F-G118R-S128D-S166D，T022A-S024R-
N062E-N116L-G118R-S128I-A158E-S166D，A016S-S103G-V104L，A016S-
T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V，G020R-S024R-N062E-
S078D-G118S-P129E-S188D-N248D，G020K-T022L-S078N-G118R-S166D，
G020K-T213A-L217E，S024R-N062E-S078D-G118S-P129E-G159D-S188D-
Q245R-N248D-H249R，S078N-S166D-T213A-L217E，S078D-G118S-P129E-
G159D-Q245R-H249R，T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-P129E-G159D-
S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F-A272V，G020K-T022L-G118R-L217E，
T022A-V104L-L111V，T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129E-G159D-
S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，S024R-N062E-S078G-G118S-P129E-
S188D-N248D，G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-S188D-N248D，T022L-
S078N-L217E，G020R-S024R-S078G-G118S-S188D，S024F-S101G-S103A-
V104I-N116L-Y209V-G211Q-T213A-A232V，T022A-N116L-G118R-A158E-
S166D，G020R-S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-N248D-H249R，
T022A-V104I-S128N，S024R-S078G-G118D-Q245R，N062E-S078G-G118S-
P129E-G159D-S188D-H249R，T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-G159D-
S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V，S024R-N062E-S078D-
G118S-P129E-G159D-Q245R-N248D-H249R，T022A-T033S-G118R-A158E-
S188D，T022A-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-
L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-S024R-S166D-S188D，A016S-
S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116L-Y209A-A232V，T022A-T033S-
S128I-A158E，S024R-T033S-N116L-S188D，N062E-N076D-S101A-S103A-
V104I-P210I-A232V-Q245R，T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-
S188D-A232V-Q245R-N248D-A270V-E271F-A272V，S130D，G020K-T022L-
S024F-S078N-G118R-S166D-L217E，T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-
S188E-A232S-Q245V-N248E，S024R-T033S-N116L-S166D-S188D，S024R-
S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R，T022A-S024R-T033S-A158E-S166D-
S188D，G020K-T022L-S024F-S166D-T213A-L217E，T022A-N062E-N116L-
G118R-S188D，G020R-S078G-G118D-Q245R-N248D-H249R，T022A-N116L-
G118R-S128I，T022L-S078N-S166D，T022L-G118R-S128D，G097P-S099A，
T022L-S024F-G118R-S128D，S242K，N062E-S078D-G118S-G159D，A016S-
S103G-S128N-L148I，G097P-A098Q-S101A，T022A-S103A-V104L-S128N-
L148I，T022A-S101G-S103A-V104I-G118R-G159D-S188D-T213A-A232V-
Q245R-N248D-E271F，S099G-S101G-G102A，T022Q-S101G-S103A-V104I-
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G159D-Q245R-N248D，A016S-S024F-T033S-S101G-S103A-V104I-N116A-
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Q245R-N248D，S024F-S078N-G118R-S128D，T022L-S024F-S078N-G118R-
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S103A-V104L-S128N，T022A-S024R-N062E-N116L-S128I，T022A-N062E-
N116L-G118R-A158E-S188D，T022A-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-
S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，G020R-S024R-N062E-
S078D-G118D-G159D-S188D-Q245R-H249R，N062E-S078D-G118S-S188D-
Q245R-N248D，T022A-S103A-L148I，T022A-S024R-N116L-S128I-A158E-
S188D，G097P-S099T-S101G-V104I，S166D-T213A-L217E，A016S-T033S-
S101G-S103A-V104I-N116L-Y209V-A232V，N062E-S078D-G118S-P129E-
G159D-S188D-Q245R，T022A-S024F-S101G-S103A-V104I-N116A-S128N-
Y209A-G211Q-A232V，G020K-T022L-S078N-G118R-S128D-S166D-L217E，
T033S-S188D，T033S-N116L-G118R-A158E，T022A-S024G-N076D-V093I-
S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，
G020R-S078D-G118S-P129E-Q245R-H249R，T022A-S024R-A158E-S166D-
S188D，G020K-T022L-S078N-G118R-S128D，G020R-S024R-S078D-G118D-
P129E-S188D，S099T-G102A，S024R-N116L-G118R-A158E-S188D，T033S-
N116L-G118R-S166D，T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232L-
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S101D-L217E-S240R，G020K-S101D-L217E-E271L，G020K-S078N-S128Q-
L217E-S240R，G020K-N062E-S101D-N116L-T213A，G100S-S101D，S078N-
G097S-S101G-S128A-L217Q，G020K-N062E-G097S-S101N-N116L-S128A-
L217Q，G020K-N062E-G097S-S101N-N116L-L217Q，S101N-Q109G-S188D，
G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-Q109N-N116L-S128A-L217Q，G020K-
S024G-N062E-G097S-S101N-N116L，G020K-S024G-N062E-S101N-N116L-
S128A，G020K-S024G-N062E-S078N-S101Q-Q109N-N116L-S128A，G020K-
N062E-S078N-S101N-Q109G-N116L-S188D，G020K-N062E-S078N-S101N-
Q109G-N116L-S128A，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-
N116L-S128A-M222S，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101G-N116L-
S128A，S024G-S078N-G097S-S101Q-Q109G-S128A-S188D-L217Q，S024G-
S078N-S101G-Q109N-S188D-L217Q，S024G-S078N-G097A-S101G-Q109G-
S188D，S078N-S101D-S128Q-L217E-S240R-E271L，G020K-S128Q-L217E，
S128Q-L217E-S240R-E271L，G020K-S078N-S101D-L217E，G020K-S078N-
S101D-L217E-E271L，G020K-N116L-S128Q-T213A，G020K-N116L-N123G，
S101G-S188D-L217Q，G020K-S024G-N062E-S078N-S101G-N116L-L217Q，
S078N-G097A-S101G-Q109N-S128A-S188D，G020K-S078N-S128L-L217E-
E271L，G020K-N062E-S101Q-Q109G-N116L，G020K-S101D-L217E，S024G-
G097A-S101N-Q109N-S128A，G020K-S078N-S101D-S128L-L217E-S240R，
G097A-S101G-L217Q，S024G-S101Q-Q109G-S128A-L217Q，G020K-S024G-
N062E-T071A-S078N-G097S-S101G-N116L-L217Q，G020K-S024G-N062E-
S078N-S101G-N116L-S128A，G020K-S024G-N062E-S078N-G097A-S101N-
N116L，G020K-N062E-G097A-S101N-N116L，G020K-S024G-N062E-G097A-
S101N-Q109G-N116L-S128A，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101G-
Q109N-N116L，G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A-
S188D-L217Q，G020K-N062E-S101N-Q109G-N116L-L217Q，G020K-S024G-
N062E-G097A-S101N-Q109G-N116L-S188D-L217Q，G020K-S024G-N062E-
S101G-N116L，S078N-G097S-S101N-Q109G-G159D-L217Q，S024G-G097A-
S101N-Q109G-S188D，S078N-S101G-S128A-L217Q，S078N-G097A-S101N-
S128A-S188D-L217Q，S024G-G097S-S101G-S128A-S188D-L217Q，S024G-
S078N-G097S-S101Q-Q109G-S128A-S188D-L217Q-V227A，G020K-N062E-
S078N，S078N-S128L-L217E-S240R-E271L，G020K-N062E-I072N-S101D-
N116L-S128Q，G020K-T057P-N062E-N116L-S128Q-T213A，G020K-N043R-
S078N-S101D-S240R，S078N-G097S-S101N-Q109N-S128A-S188D-L217Q，
S024G-S101N-Q109N-S128A-S188D，G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-
N116L-S128A，S024G-S078N-G097S-S101N-Q109N-S128A-S188D，N043R-
G100S，G020K-N062E-S078N-S101Q-Q109G-N116L-S128A，S078N-S101Q-
Q109N-S188D-L217Q，G020K-N116L-S128L-T213A，G020K-S078N-S101D-
L217E-S240R，G020K-N062E-S101N-Q109N-N116L-M222S，G020K-S024G-
N062E-G097A-S101Q-Q109N-N116L-S128A，S078N-G097S-S101G-S128A-
S188D，G097S-S101G-Q109N-S128A-M222S，S024G-S078N-G097A-S101Q-
S128A-M222S，G097A-S101G-Q109N-L217Q，S024G-S078N-S101G-S128A-
S188D-L217Q，S024G-G097A-S101N-Q109G-S128A-S188D，G097S-S101N-
Q109G-S128A，S078N-G097A-S101Q-L217Q，G020K-N043R-S078N-S101D，
G020K-N043R-E054D-N062E-S078N-S240R，G020K-S101D-S240R，S128Q-
L217E-S240R，G020K-S128Q-L217E-V244A-E271L，G020K-L217E-E271L，
G020K-S078N-S128L-L217E，S078N-S101D-S128Q-L217E-E271L，G020K-
N062E-L217E-E271L，G020K-N062E-S101D-N116L-S128Q-T213A，G020K-
N062E-S078N-N116L-S128I，G020K-N062E-S078N-S128Q-T213A，S024G-
G097A-S101G-Q109G-S128A，S024G-G097S-S101N-Q109N-S128A-L217Q，
G020K-S024G-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-S188D-L217Q，G020K-
S101D，G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S128A，G020K-N062E-
G097S-S101G-N116L-S188D，N043R-S078N-G100S-S128L-S240R，G097S-
S101N-Q109N-S188D，G097S-S101Q-Q109N-S128A-L217Q，G020K-N062E-
S101N-Q109G-N116L-S128A-S188D-M222S，G020K-S024G-N062E-S078N-
G097S-S101Q-Q109G-N116L，G020K-N062E-M222S，G097S-S101Q-Q109G-
S188D，G020K-S078N-L217E-S240R，G020K-N062E-S078N-G097A-S101N-
Q109G-N116L-S188D，G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-Q109G-N116L-
S188D，G020K-N062E-S078N-G097A-S101Q-N116L-S128A-M222S，G020K-
N062E-S078N-S101N-N116L-S188D，G020K-S024G-N062E-S078N-S101G-
N116L，G020K-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-S188D，G020K-S024G-
N062E-G097S-S101N-Q109G-N116L-S128A-S188D-L217Q，G020K-N062E-
G097S-S101N-Q109N-N116L，G020K-N062E-S101G-N116L-S188D-L217Q，
G097A-S101N-S128A，S101G-Q109N-S128A-M222S，S024G-G097S-S101Q-
Q109G-S188D-L217Q，G097S-S101Q-Q109N-S128A-S188D，S024G-S078N-
G097A-S101Q-S188D-L217Q，S024G-S078N-S101G-Q109G-S128A-L217Q，
G020K-N062E-S128L-S240R，N062E-S078N-S128L-S240R，N043R-G102A-
S128L-L217E-S240R，N062E-S078N-L217E-S240R-E271L，S078N-S128Q-
L217E-N269S，G020K-N062E-N123G-T213A，G020K-N062E-S078N-S099G-
N116L-S128Q-T213A-L217N，G020K-N062E-S078N-S128I-L217N，G097A-
S101Q-S128A-S188D-L217Q，G020K-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-
N116L，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-Q109G-N116L-S188D，
G020K-N043R-S128L-S240R，S024G-S078N-G097A-S101N-Q109N-S128A，
G020K-N062E-G097S-S101Q-N116L-L217Q，G020K-N062E-S078N-S128I，
G020K-S024G-N062E-L090V-G097A-S101Q-N116L-M222S，G020K-N062E-
S078N-S101Q-Q109G-N116L-S188D-L217Q，G020K-S024G-N062E-G097A-
S101G-N116L-S128A-S188D-L217Q，G020K-N062E-G097S-S101N-Q109N-
N116L-S188D-L217Q，G020K-S024G-A048V-N062E-S078N-G097A-S101N-
N116L-S128A-L217Q，G020K-N062E-S078N-S101Q-Q109G-N116L，G020K-
S024G-N062E-G097S-S101N-Q109N-N116L-S128A，G020K-N062E-S078N-
G097A-S101Q-Q109G-N116L-S188D，G020K-N062E-S078N-G097A-S101N-
Q109N-N116L-N218D，S024G-S101N-Q109G-S128A-S188D-M222S，S024G-
G097A-S101Q-Q109N-S188D-L217Q，S024G-S078N-G097S-S101Q-Q109N-
S128A-S188D，S101N-Q109G-M222S，S024G-I072V-G097S-S101N-S128A-
L217Q，S101G-S128A，N043R-S078N-G102A-A215G，G020K-S101D-S128L-
L217E-S240R，S078N-S101D-S128Q-L217E-S240R，G020K-N116L-S128L-
M222S，G020K-N062E-S078N-N116L-T213A-M222S，G020K-N062E-S078N-
N116L-S128Q，G020K-N062E-T213A，或G020K-N062E-S078N-N116L-
N123G-M222S
（列表15），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ IDNO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-
A232V-Q245R-N248D-E271F，G020K-T022L-S078N-G118R-S128D-T213A，
S024R-S078G-G118S-P129E-S188D-Q245R-H249R，T022A-N076D-S101G-
S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-
S101G-S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-
E271F，T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-G159D-S188D-
A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-G159D-
S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T033S-G118R-S128I-A158E，T022A-
S103A-L111V-L148I，T022A-N076D-A085T-S101G-S103A-V104I-P129E-
S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-
V104I-A158E-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-G097A-S101N-
S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，
G020K-T022L-S078N-S128D-T213A-L217E，T022A-T033S-P129E-S166D，
T022A-S024G-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-
A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-
G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，G020K-S078N-S166D-
T213A，T022A-S101Q-S103A-V104I-L124V-P129S-G159D-S188D-A232V-
Q245R-N248D-E271F，T022Q-S101G-S103A-V104I-G159D-S188E-A232V-
Q245T-N248D，A158E-S166D-S188D，L021S-T022A-S024G-N076D-S101Q-
S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，
T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L124V-S128A-P129E-G159D-S188D-
L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-S101G-S103A-V104I-G159D-
S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-E271F，T022A-T033S-N062E-
N116L-S188D，T022A-S024G-S049N-N076D-S101G-S103A-V104I-G159D-
S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-G097S-S101Q-S103A-
V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，G097P-A098Q-S099A-
S103G-V104I，G020K-S024F-G118R-S128D-S166D，T022A-S024G-S101G-
S103A-V104I-S128A-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-
G097A-S101Q-S103A-V104I-L124V-P129S-G159D-S188D-A232V-Q245R-
N248D-E271F，T022A-S024R-T033S-G118R-S166D，T022A-S024R-N076D-
S101G-S103A-V104I-G159D-S188D-A232V-N238Y-Q245R-N248D-A270V-
E271F，N062E-S078D-G118S-P129E-N248D-H249R，T022A-S024G-V026I-
S101N-S103A-V104I-G159D-S188D-L217Q-A232V-Q245R-N248D-E271F，
G097P-A098Q-S099A-S101A，S078G-G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R，
T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129E-G159D-S188D-L217Q-
A232V-Q245R-N248D-E271F，G020R-S024R-N062E-S078G-G118D-P129E-
G159D-S188D-Q236R-Q245R-N248D，T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-
V104I-G159D-S188D-A232V-Q245R-N248D-E271F，T022A-N076D-S101G-
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S128A，G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-N116L-S128A-S188D-L217Q，
S024G-S101N-Q109N-S128A，S024G-G097S-S101Q-S128A-S188D，S024G-
S101Q-L217Q，G097S-S101G-S128A，S024G-S078N-S101Q-S128A-L217Q，
S024G-S078N-G097S-S101N-S188D，S024G-G097A-S101N-S128A-M222S，
G097A-S101Q-Q109N-S188D-M222S，S024G-S078N-G097S-S101Q，G020K-
S101D-S128L-S212P-L217E-S240R，G020K-S101D-S128L-L217E-N218S-
S240R，S101D-S128Q，G020K-N062E-S078N-E271L，S101D-E271L，S101D-
S240R-E271L，G020K-S101D-E271L，G020K-N116L-S128L-T213A-M222S，
G020K-N116L-S128Q-M222S，G020K-N062E-V084A-S128Q-M222S，G020K-
N062E-S078N-N116L，S078N-S101N-Q109G-S128A-M222S，S024G-G097S-
S101Q-Q109G，G020K-N062E-T213A-L217N，G097S-S101G-S128A-S188D，
G020K-S240R，N062E-S078N，G020K-S128Q-M222S，S078N-G097S-S101G-
Q109G，G020R-S024G-N043R-S078N-S101Q，G097S-S101N-Q109G-S128A-
M222S，S024G-G097S-S101G-Q109N，S024G-S078N-G097A-S101G-Q109N，
G020K-N062E-S078N-S101N-N116L-S128A-S188D-L217Q，G020K-N062E-
S101Q-Q109G-N116L-S128A-M222S，G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109N-
N116L，S024G-S078N-S101Q-M222S，S024G-G097A-S101Q-Q109G-S128A，
S101Q-Q109N-L217Q，S101Q-Q109G-S188D-L217Q，S024G-G097A-S101N-
S188D-M222S，S024G-S078N-G097A-S101Q-Q109N，G097A-S101Q-S128A，
G097A-S101Q-Q109G-S128A，S024G-G097S-S101Q-M222S，S078N-S101D-
L217E-S240R，G020K-G100S-S128L，G020K-N043R-S078N-S128L-S240R，
G020K-N043R-S101D-S240R，G020K-N043R-S078N-S128L，N062E-S128L，
G020K-S078N-S101D-S128L，S078N-S101D，G020K-S101D-N116L-T213A-
M222S，G020K-T213A-M222S，G020K-N116L-T213A，G020K-N116L，
G020K-N062E-S128Q-L217N，S078N-G097S-S101G-Q109N-S128A，S078N-
S101Q-Q109G，N062E-S078N-S128L，G020K-N062E-N116L-S128Q-T213A-
L217N，G020K-N116L-T213A-M222S，G020K-S024G-N062E-S101Q-Q109H-
N116L-M222S，G020K-N116L-S128Q-T213A-M222S，S024G-G097S-S101N，
G020K-P055T-N062E-N116L-L217N，S024G-S101Q-S128A-S188D-M222S，
G020K-M222S，G020K-N062E-S078N-G097A-S101N-N116L-S188D-L217Q，
G097S-S101G-Q109N-M222S，G020K-S024G-N062E-S078N-G097A-S101N-
N116L-S128A-L217Q-M222S，G020K-S024G-N062E-G097S-S101N-Q109N-
N116L-S128A-S188D-L217Q-M222S，G020K-N062E-S078N-S101Q-N116L-
S128A，S024G-S078N-S101N-Q109G-S188D-L217Q-M222S，S101N-Q109N-
S128A-M222S，S101Q-Q109G-S128A-S188D，G097A-S101G-S188D-M222S，
S078N-G097S-S101N-Q109G-S128A-S188D-L217Q-M222S，S024G-G097A-
S101Q-M222S，S024G-G097S-S101N-Q109N-S128A-M222S，S024G-S078N-
G097S-S101N-M222S，G020K-G102A-S240R，S078N-S128Q-E271L，G020K-
N062E-S078N-S128Q，G020K-N062E-S078N-T213A-M222S，G020K-N062E-
S078N-S128I-T213A-L217N，S078N-G097A-S101N，G020K-N062E-N116L-
S128I-T213A-L217N，S024G-G097A-S101Q-S128A-S188D-M222S，S024G-
S078N-G097A-S101N，S024G-S078N-G097S-S101G-M222S，G020K-N062E-
S078N-N116L-S128Q-T213A-M222S，G020K-N062E-S128Q-M222S，G020K-
N062E-S101Q-N116L，G020K-N062E-S101Q-Q109G-N116L-S188D-L217Q，
G020K-S024G-N062E-G097A-S101N-N116L-S128A-S188D，G020K-S024G-
N062E-S078N-S101Q-Q109G-N116L-S188D-M222S，S078N-G097S-S101N-
Q109G-S128A-L217Q-M222S，S024G-S078N-S101N-Q109G-S128A-L217Q-
M222S，G097A-S101Q-S128A-S188D，S024G-S078N-G097A-S101N-Q109N-
S128A-S188D-L217Q-M222S，S024G-S078N-G097A-S101G-L217E-M222S，
S078N-G097S-S101Q-Q109G-T274I，G097A-S101G-M222S，S101N-Q109N，
G020K-L217E-S240R-E271L，S128Q-S240R-E271L，G020K-S101D-N116L-
S128Q-M222S，G020K-P055L-N062E-N116L-S128I，G020K-N062E-S101G-
N116L-S128A-M222S，G020K-S078N-S101D-S128L-S240R-E271L，G020K-
N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109N-N116L-L217Q-M222S，S078N-S101D-
S240R-E271L，S024G-S078N-S101N-Q109G-L217Q-M222S，G097A-S101G-
Q109G-L217Q-M222S，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-N116L-
S128A-L217Q-M222S，G020K-S078N-S128L-E271L，G020K-N062E-S078N-
N116L-L217N，G097A-S101G-Q109G-S188D-L217Q-M222S，S024G-S078N-
G097S-S101N-Q109G-S128A，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101N-
N116L-S188D-M222S，G020K-S024G-N062E-G097S-S101Q-N116L-S128A-
M222S，G020K-N062E-S078N-G097A-S101G-Q109G-N116L-S128A-S188D-
L217Q，G020K-N062E-S101G-N116L-S128A-L217Q-M222S，S024G-G097A-
S101Q-S188D-M222S，S024G-S101G，I072V-S101Q-S128A，S078N-G097S-
S101N-Q109N，S024G-G097A-S101N-Q109N-S188D-L217Q-M222S，S078N-
S101Q-Q109N-S188D-L217Q-M222S，G020K-N043R-N062E-S128L-L217E，
N043R-G102A-S128L-S240R，G020K-N116L-N123G-T213A-M222S，G020K-
S101D-S128Q-T213A-M222S，S024G-G097A-S101Q-Q109G，G020K-S078N，
G020K-N062E-S101Q-N116L-S188D，G020K-N062E-S078N-G097S-S101N-
Q109G-N116L-S188D-L217Q-M222S，G020K-S024G-N062E-G097S-S101G-
N116L-S128A-L217Q-M222S，G020K-N062E-G097A-S101N-N116L-S128A-
L217Q-M222S，S078N-G097S-S101G-Q109N-M222S，S024G-G097A-S101Q-
Q109N，S024G-G097S-S101N-Q109N-S128A-S188D-L217Q-M222S，S078N-
S101N-Q109N-S188D-L217Q-M222S，S078N-S101D-S128L-L217E-S240R，
G020K-N062E-S101D-N116L-S128L，G097S-S101N-S188D-M222S，G020K-
S078N-S128L-S240R-E271L，G020K-N062E-N116L-S128I-T213A，G020K-
S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S188D-M222S，G020K-N062E-
S101Q-Q109G-N116L-L217Q-M222S，G020K-S024G-N062E-G097A-S101Q-
N116L-L217Q-M222S，G020K-N062E-S078N-G097S-S101Q-N116L-S128A-
S188D-M222S-A232T，G020K-S024G-N062E-S078N-G097S-S101Q-Q109N-
N116L-S128A-L217Q-M222S，G020K-N062E-G097A-S101Q-N116L-S188D-
M222S，S024G-S078N-G097S-S101N-Q109G-S128A-L217Q-M222S，S024G-
G097A-S101Q-Q109N-S128A-S188D-L217Q-M222S，G020K-N043R，G020K-
N043R-S078N-G102A-S128L，G097R-S101D，G020K-N062E-S078N-I107V-
N123G-S128I，G020K-N062E-S078N-N116L-N123G-T213A，G020K-N062E-
N116L-S128I-M222S，G020K-N043R-S240R.
（列表16），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N204S-G211Q，T022W-S024R-S101A-
P210I-T213A，G020R-S101A-G211Q，G020R-S024R-S101A-P210I-G211Q-
T213A，G020R-S101A-P210I-T213A，T022W-S024R-N043R-S101A-P210I，
G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q，T022R-S101T-S103N-V104L-
A232M-Q245R，G020R-T022A-S024R-R045T-S101A-T213A，T022R-S101G-
S103N-V104I-A232M-Q245R，G020R-T022W-S024R-S101A-N116L-G211Q-
T213A，G020R-T022W-N043R-S101A-N116L-G211Q，G020R-T022W-N043R-
R045T-S101A，T022W-N043R-R045T-S101A-P210I-T213A，G020R-S024R-
R045T-S101A-Q109R-P210I-G211Q-T213A，S024R-N043K-S101A-N204D-
P210I，G020R-S024R-R045T-S101A-P210I，S024R-N043R-R045T-S101A-
P210I-T213A，G020R-S024R-R045T-S101A-T213A，T022R-S101A-S103N-
V104I-A232T-Q245R，G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N204S-P210I-
G211Q，T022W-N043R-S101A-P210I-G211Q，G020R-S024R-N043K-R045T-
S101A-N116L-P210I，T022A-S101G-S103A-V104I-I107V-L217Q-A232V-
Q245R，S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A，T022R-S101A-S103G-
V104I-A232M-Q245R，T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R，S024R-
S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R，S024R-N043R-S101A-P210I-T213A，
T022K-S101N-S103A-V104I-A232T-Q245R，G020R-N043R-S101A-P210I-
G211Q，T022R-S101T-S103A-V104I-A232M-Q245R，S024R-V026A-N043R-
S101A-P210I-G211Q，T022A-S078N-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-
A232V-Q245R，T022K-S101T-S103G-V104I-A232L-Q245R，G020R-T022W-
S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q，G020R-S024R-S078G-G118D-Q245R，
T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-P129S-A232V-Q245R，T022A-G097A-
S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R，G020R-T022W-N043R-S101A-
G211Q-T213A，N018K-G020R-S024R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A，
G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A，T022R-S101N-S103A-V104L-
A232T-Q245R，G020R-S024R-S101A-T213A，T022R-S101N-S103G-V104I-
A232V-Q245R，G020R-T022W-S024R-S101A-G211Q-T213A，T022A-S024G-
S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，S024R-S078G-G118D-
P129E-Q245R-H249R，T022R-S101T-S103A-V104L-A232L-Q245R，G020R-
S024R-S101A-G211Q-T213A，T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-L217Q-
A232V-Q245R，G020R-T022W-N043R-V051A-S101A-P210I-G211Q，S024R-
S078G-G118D-Q245R，N043R-S101A-P210I，T022Y-S101G-S103N-V104I-
A232L-Q245R，G020R-T022W-N043R-S101A-T213A，G020R-S024R-S078D-
G118S-S188D-Q245R-H249R，T022Y-S101N-S103N-V104I-A232T-Q245R，
G020R-T022W-S024R-F050L-S101A-G211Q-T213A，N018S-T022W-S024R-
N043R-S101A-G211Q，T022A-S101G-S103A-V104I-S128A-P129S-L217Q-
A232V-Q245R，T022R-S101N-S103N-V104I-A232V-Q245R，T022A-S024G-
S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R，S101A-P210I-
G211Q-T213A，G020R-N043R-R045T-S101A-P210I-G211Q-T213A，T022R-
S101A-S103N-V104I-A232M-Q245S，G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-
G211Q，G020R-T022W-N043R-R045T-S101A-N116L-P210I，G020R-S024R-
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N116L-S128A-A232V-Q245R，G020R-S024R-S078N-S101N-Q109N-N116L，
G020R-S024R-S078N-S101A-Q109N-N116L-S128A，T022R-S024G-G097A-
S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R，T022R-G097S-S101G-
S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，T022R-G097A-S101Q-S103A-V104I-
S128A-A232V-Q245R，T022R-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-
S128A-A232V-Q245R，T022R-S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-N116L-
S128A-A232V-Q245R，G020R-S024R-S101G-Q109G-N116L-L217Q，G020R-
S024R-S078N-S101Q-Q109N-N116L，G020R-S024R-S101G-N116L-S128A-
L217Q，G020R-S024R-S101A-Q109G-N116L-S128A，T022R-S024G-S078N-
G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-L217Q-A232V-Q245R，T022R-S024G-
S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-N116L-S128A-A232V-Q245R，
G020R-N043R-G097A-S101N-S128A-L233I，T022R-S101Q-S103A-V104I-
A232V-Q245R，G020R-N043R-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A，T022R-
S078N-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R，G020R-S024R-G097S-S101N-
Q109G-N116L，T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-A232V-
Q245R，T022R-S024G-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R，G020R-S024R-
G097A-S101N-Q109G-S128A，G020R-N043R-S101Q-N116L-S128A-L217Q，
G020R-S024R-S078N-G097A-S101Q-Q109N-S128A，G020R-S024R-E089D-
S101A-Q109N-N116L，G020R-S024R-G097A-S101G-Q109G-S128A，G020R-
S024G-N043R-S101G-N116L-S128A-L217Q，G020R-N043R-S078N-S101Q-
Q109G-L217Q，G020R-S024G-N043R-G097A-S101N-Q109N-N116L-L217Q，
G020R-S024R-S078N-G097A-S101G-N116L-S128A，G020R-S024R-G097S-
S101A-Q109N-N116L，G020R-S024R-S078N-S101A-Q109G-S128A，G020R-
S024R-G097A-S101A-Q109G-N116L-S128A，G020R-N043R-G097A-S101Q-
N116L-S128A，G020R-N043R-G097S-S101Q-S128A-L217Q，G020R-S024R-
S078N-G097A-S101G-Q109G-N116L-L217Q，G020R-N043R-G097A-S101G-
Q109N-N116L-S128A，G020R-N043R-S078N-G097S-S101N-Q109N-L217Q，
G020R-S024R-G097S-A098E-S101A-N116L-S128A，G020R-S024R-S078N-
G097S-S101A-Q109G-S128A，T022R-S024G-S078N-G097S-S101G-S103A-
V104I-Q109N-N116L-L217Q-A232V-Q245R，G020R-S024R-S078N-G097A-
S101Q-Q109N-N116L-L217Q，T022R-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-
S128A-A232V-Q245R，G020R-S024R-S101A-Q109N-N116L-S128A-L217Q，
G020R-S024R-S101G-Q109G-N116L-S128A-L217Q，T022R-S078N-G097A-
S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，G020R-S024G-N043R-S101N-
N116L-S128A-L217Q，G020R-S024R-S078N-G097S-S101A-Q109N-N116L，
G020R-S024R-S078N-G097A-S101N-Q109N-N116L-S128A，G020R-S024R-
S078N-S101Q-Q109N-N116L-L217Q，T022R-S024G-S078N-S101N-S103A-
V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R，G020R-N043R-S101G-Q109N-N116L-
S128A-L217Q，T022R-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R，T022R-
G097A-S101N-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-Q245R，G020R-S024R-
G097A-S101A-S128A-L217Q，T022R-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-
V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，G020R-S024R-S078N-G097S-S101N-
Q109G-N116L-S128A-L217Q，T022R-S024G-S101G-S103A-V104I-N116L-
L217Q-A232V-Q245R，T022R-G097A-S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-
A232V-Q245R，G020R-N043R-S101Q-S128A-L217Q，G020R-S024R-S078N-
S101N-Q109G-S128A-L217Q，G020R-S024R-S078N-G097A-S101N-Q109N-
N116L-S128A-L217Q，T022R-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-N116L-
L217Q-A232V-Q245R，G020R-S024R-S078N-G097S-S101G-S128A-N204S-
L217Q，T022R-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-A232V-
Q245R，G020R-S024R-S078N-G097S-S101Q-Q109N-N116L-L217Q，G020R-
S024R-S078N-S099G-S101Q-Q109N-N116L-L217Q，T022R-S024G-G097A-
S101G-S103A-V104I-Q109G-N116L-L217Q-A232V-Q245R，T022R-S078N-
G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022R-G097A-
S101G-S103A-V104I-Q109G-N116L-L217Q-A232V-Q245R，G020R-S024R-
G097A-S101N-Q109N-S128A-L217Q，T022R-G097S-S101N-S103A-V104I-
S128A-L217Q-A232V-Q245R，G020R-S024R-K094R-S101N-N116L-S128A-
L217Q，T022R-S024G-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-
L217Q-A232V-Q245R，G020R-S024R-G097A-S101A-N116L-S128A-L217Q，
G020R-S024R-S078N-G097W-S101Q-Q109N-N116L-L217Q，T022R-G097S-
S101N-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022R-S101Q-
S103A-V104I-N116L-L217Q-A232V-Q245R，T022R-S024G-S078N-G097A-
S101Q-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022R-S078N-
G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R，
G020R-N043R-G097S-S101Q-Q109G-N116L-S128A-L217Q，T022R-S024G-
G097A-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022R-
G097S-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R，T022R-S024G-G097A-
S101Q-S103A-V104I-Q109G-N116L-L217Q-A232V-Q245R，T022R-S024G-
S078N-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022R-
S101Q-S103A-V104I-Q109G-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022R-
S078N-G097S-S101G-S103A-V104I-N116L-S128A-L217Q-A232V-Q245R，
T022R-S024G-T071A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-N116L-S128A-
A232V-Q245R，T022R-S024G-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-
A232V-Q245R，T022R-S101G-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R，
T022R-S024G-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，
T022R-S024G-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109N-N116L-S128A-L217Q-
A232V-Q245R，T022R-S101G-S103A-A232V-Q245R，T022R-S101G-S103A-
V104I-A232V-Q245R-E271A，T022R-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022R-
S101G-V104I-A232V-Q245R，T022R-S101G-S103A-V104I-Q245R，G020R-
N043R-E271A，G020R-S024R-I035T-S101A-N116L，G020R-N043R-P239G，
G020R-N043R-S242L，或G020R-N043R-V234F
（列表17），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ IDNO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022Y-S101N-S103A-V104I-A232T-Q245R，G020R-R045T-S101A-P210I-
G211Q-L267F，T022Y-S101N-S103N-V104L-A232M-Q245R，T022A-P052T-
S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R，T022A-S101G-S103N-V104L-
A232T-Q245R，T022Y-S101A-S103N-V104L-A232V-Q245R，T022A-S101A-
S103N-V104I-A232T-Q245R，T022Y-S101A-S103N-V104I-A232L-Q245R，
T022Y-S101G-S103A-V104I-A232T-Q245R，T022A-S024G-N076D-S078N-
G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R，T022A-S101N-S103N-
V104L-A232M-Q245R，T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-P129S-A232V-
Q245R，T022A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，S024R-S078D-
G118S-G159D-Q245R-H249R，T022K-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R，
T022R-S101T-S103N-V104I-A232T-Q245S，T022Q-S101N-S103N-V104I-
A232M-Q245R，S024R-S078G-G118D-Q245R-H249R，T022R-S101N-S103N-
V104L-A232V-Q245R，T022A-N076D-S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-
Q245R，G020R-S024R-S078G-G118D-S188D-Q245R-N248D，T022Y-S101N-
S103A-V104I-A232V-Q245R，T022Q-S101N-S103A-V104L-A232L-Q245R，
T022Q-S101N-S103N-V104I-A232L-Q245R，T022A-G097S-S101N-S103A-
V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022R-S101N-S103N-V104I-A232T-
Q245S，G020R-S078D-G118D-G159D-Q245R-H249R，T022R-S101N-S103A-
V104L-A232M-Q245R，T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109N-
S128A-A232V-Q245R，T022R-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245S，G020R-
T022W-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A，T022Q-S101T-S103N-V104I-
A232T-Q245R，G020R-S024R-N043R-S101A-N204D-T213A，T022A-S024G-
S101Q-S103A-V104I-Q109G-A232V-Q245R，G020R-S024R-S078D-G118D-
S188D-Q245R-N248D-H249R，S024R-N043R-S101A-P210I，T022A-N076D-
S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-A270V，G020R-S024R-S078D-G118S-
H249R，S024R-S078G-G118S，T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245S，
S024R-N043K-R045T-S101A，T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-
A232V-Q245R-T274A，T022A-S024G-N076D-S078N-S101G-S103A-V104I-
L217Q-A232V-Q245R，T022Q-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245W，S024R-
S078G-G118S-P129E-Q245R-H249R，T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-
V104I-A232V-Q245R，V026W，T022R-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245W，
G020R-S024R-S078D-G118S-N248D，G020R-R045T-S101A-N204S-P210I，
G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-N248D-H249R，T022Y-S101A-S103N-
V104I-A232V-Q245R，T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-
L217Q-A232V-Q245R，S024R-S101A-P210I-G211Q，T022R-S101N-S103N-
V104I-A232V-Q245S，T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109G-
A232V-Q245R，T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022A-
S024G-N076D-S101Q-S103A-V104I-Q109N-A232V-Q245R，G020R-S078G-
G118S-H249R，S078G-G118S-Q245R-H249R，T022A-G097A-S101N-S103A-
V104I-L217Q-A232V-Q245R，T022Y-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245R，
T022K-S101G-S103N-V104I-A232L-Q245R，T022A-S024G-G097S-S101N-
S103A-V104I-A232V-Q245R，S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R-
H249R，T022Q-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R，G020R-S024R-S078G-
G118D-G159D-Q245R-N248D，T022A-S024G-S101G-S103A-V104I-A232V-
Q245R，T022Q-S101G-S103A-V104L-A232T-Q245R，T022Q-S101T-S103A-
V104I-A232T-Q245R，T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，T022A-S024G-N076D-S078N-G097A-S101G-S103A-V104I-A232V-
Q245R，T022A-S101G-S103A-V104L-A232V-Q245R，T022A-S024G-S078N-
G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，T022A-S024G-N076D-
G097S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R，S024R-N043R-S101A-G211Q-
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S024R-R045T-S101A，T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-L217Q-
A232V-Q245R，T022Q-S101G-S103A-V104I-A232M-Q245S，T022W-S024R-
N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A，G020R-S078G-G118S，T022W-N043R-
G046C-S101A-P210I-G211Q，S101A-G211Q-T213A，T022A-N076D-S078N-
S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022A-S024G-N076D-G097S-S101Q-
S103A-V104I-A232V-Q245R，T022A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129S-
A232V-Q245R，T022R-S101T-S103N-V104I-A232L-Q245W，T022A-S101G-
S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V，S078G-G118D-Q245R，
T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238Y-Q245R-A270V，
T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R，
T022W-S024R-R045T-S101A-N116L-P210I-T213A，T022R-S101T-S103N-
V104I-A232L-Q245S，T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-S106L-P210I-
G211Q，T022A-E089G-G097A-S101Q-S103A-V104I-P129S-L217Q-A232V-
Q245R，T022A-S101A-S103G-V104I-A232L-Q245S，N043R-S101A-P210I-
T213A，N043R-R045T-S101A-T213A，S078G-G118D-H120N-H249R，T022Q-
S101T-S103N-V104I-A232L-Q245R-R275H，T022Y-S101A-S103A-V104I-
A232T-Q245S，T022K-S101N-S103N-V104I-A232M-Q245R，T022R-S101T-
S103N-V104L-A232V-Q245S，T022A-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-
A232V-Q245R，M119L，A098F-S099A-S101G-V104I，S078D-G118S-Q245R，
T022Y-S101N-S103A-V104I-A232L-Q245S，T022A-G097A-S101N-S103A-
V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，G020R-S078G-G118D-N248D-H249R，
T022R-S101A-S103N-V104I-A232T-Q245S，T022R-S101G-S103N-V104I-
A232L-Q245S，S024R-S078D-G118D-S188D-Q245R-H249R，S132H，A098Q-
S099G-S101G-V104L，N043R-S101A-P210I-G211Q-T213A，T022Q-S101G-
S103A-V104I-A232M-Q245W，T022A-S101Q-S103A-V104I-L126I-P129S-
A232V-Q245R，T022K-S101T-S103G-V104I-A232M-Q245S，T022W-N043R-
R045T-S101A-G211Q-T213A，T022Q-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245W，
D181T，G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-G159D-Q245R-H249R，G020R-
S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-Q245R，T022A-S101T-S103N-V104L-
A232L-Q245S，T022A-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245S，T022A-S024G-
G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022A-S024G-
N076D-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，T022Y-S101T-S103A-
V104L-A232M-Q245R，T022Q-S101T-S103N-V104L-A232T-Q245R，F050S，
T022Y-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245R，G020R-R045T-S101A-T213A，
T022K-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245W，S024R-S078G-G118D-P129E-
G159D-Q245R-H249R，T022Q-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245W，S049W，
T022A-S101A-S103N-V104L-A232L-Q245R，T022A-N076D-S101G-S103A-
V104I-I107V-P129G-A232V-Q245R-A270V，S099A-V104I，T022Q-S101A-
S103G-V104I-A232V-Q245W，T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-
N238Y-Q245R，T022A-S101G-S103A-V104I-L124V-L217Q-A232V-Q245R，
T022R-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，T022R-
G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R，R010A-T022R-
S024F-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-L267N-E271H，G020R-S024G-
N043R-S078N-S101G-Q109N-N116L-L217Q-M222S，G020R-N043R-E271H，
G020R-N043R-E271I，G020R-S024R-S101A-N116L-N269I，T022R-S101G-
S103A-V104I-A232V-Q245R-E271F，G020R-N043R-E271F，G020R-N043R-
N269I，G020R-S024R-S101A-N116L-E271H，T022R-S101G-S103A-V104I-
A232V-Q245R-E271H，G020R-I035T-N043R，G020R-S024R-S101A-A114T-
N116L，G020R-S024R-S101A-N116L-E271I，G020R-N043R-A114T，G020R-
N043R-L267N，G020R-S024R-S101A-N116L-L267N，G020R-S024R-V028A-
S101A-N116L，G020R-S024R-S101A-N116L-G258R，G020R-N043R-G258R，
G020R-S024R-S101A-N116L-S242L，G020R-S024R-S101A-N116L-P239G，
I008N-G020R-S024R-S101A-N116L，G020R-S024R-S101A-N116L-V234F，
T022R-S101G-S103A-V104I-A232V，G020R-S024R-S101A-N116L-E271A，
R010A-G020R-N043R，G020R-S024R-S101A-N116L-E271F，G020R-V028A-
N043R，I008N-G020R-N043R，或G020R-S024F-S101A-N116L
（列表18），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ IDNO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
G020R-S024R-S078D-G118D-G159D-H249R，G020R-S024R-S078G-G118S-
G159D-S188D-Q245R-N248D-H249R，T022A-S101T-S103G-V104I-A232T-
Q245S，T022A-S101T-S103G-V104I-A232T-Q245R，T022Q-S101G-S103N-
V104I-A232V-Q245W，T022W-N043R-S101A-T213A，T022A-N076D-S078N-
G097A-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，T022A-S024G-S078N-
S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，T022K-S101N-S103N-V104L-
A232T-Q245R，T022A-S024G-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，
G020R-S024R-N062E-S078G-G118D，G020R-S078G-G118D，T022Y-S101T-
S103G-V104L-A232T-Q245R，R010H-T022A-S101G-S103A-V104I-A232V-
Q245R-A272V，T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-Q245R-
A270V-A272V，T022A-N076D-S078N-G097S-S101Q-S103A-V104I-Q109G-
A232V-Q245R，G020R-S024R-S078D-G118S-P129E-Q245R，T022A-N076D-
S101G-S103A-V104I-A232V-N238Y-Q245R-A272V，T022K-S101N-S103N-
V104I-A232V-Q245W，T022Q-S101T-S103N-V104I-A232M-Q245S，T022A-
S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-Q245R，W113Y，T022A-
S101A-S103N-V104I-A232M-Q245S，T022A-S101Q-S103A-V104I-S128A-
A232V-Q245R，G020R-S024R-S078G-G118D-G159D-S188D-H249R，T022A-
S101N-S103G-V104I-A232T-Q245R，T022K-S101G-S103G-V104I-A232L-
Q245R，T022A-N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，
T022Q-S101T-S103N-V104I-A232V-Q245S，T022A-S024F-S101G-S103A-
V104I-N116L-Y209V-T213A-A232V，T022A-S101N-S103G-V104L-A232T-
Q245R，T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-A232V-N238Y-Q245R，
T022A-N076D-G097S-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022A-N076D-
S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022A-S101N-S103A-
V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R，S259W，A016S-T022A-S024F-S101G-
S103A-V104I-N116A-Y209V-G211Q-A232V，T022W-S101A-P210I-G211Q-
T213A，T022A-S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R，
V028T-A215V，S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R，T022Q-S101T-S103A-
V104I-A232V-Q245W，T022A-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-A232V-
Q245R，T022A-S024G-T071A-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-
Q245R，H120P，G020R-S024R-N062E-S078D-G118D-Q245R，T022A-N076D-
S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022Q-S101A-S103N-V104I-A232L-
Q245W，T022Q-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R，T022W-S024R-N043R-
R045T-S101A-N116L-P210I-G211Q，T022A-G097S-S101Q-S103A-V104I-
S128A-L217Q-A232V-Q245R，G020R-S078G-G118S-G159D-S188D-H249R，
A013S，A232N，T022A-N076D-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022A-
S024G-N076D-S078N-G097S-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R，I035T，
V051M，N123A，G020R-S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D，T022Y-S101A-
S103N-V104I-A232L-Q245W，T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-
A232V-Q245R-A270V，G020R-S078D-G118S，T022R-S101N-S103N-V104L-
A232M-Q245W，T022A-S024G-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-S128A-
L217Q-A232V-Q245R，T022A-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R，T022A-
N076D-G097A-S101Q-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022A-S024R-N076D-
S101G-S103A-V104I-I107V-P129E-A232V-Q245R，S024R-R045T-S101A-
P210I-G211Q，T022A-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-
Q245R，T022A-S024G-S078N-G097A-S101N-S103A-V104I-Q109N-A232V-
Q245R，G020R-S024R-S078G-G118D-P129E-G159D-H249R，G020R-S078G-
G118D-P129E-S188D-Q245R-H249R，P014W，G020R-S024R-S078G-G118S-
G159D-S188D-Q245R-N248D，T022R-S101G-S103N-V104I-A232M-Q245W，
T022R-A098V-S101G-S103N-V104L-A232T-Q245R，T022A-S101T-S103A-
V104I-A232V-Q245W，G020R-T022W-R045T-S101A-T213A，N043R-R045T-
S101A，T022K-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R，T022K-S101T-S103N-
V104I-A232L-Q245S，S056V，G020R-T022W-R045T-S101A-G211Q，G020R-
S024R-S078D-G118D-Q245R-N248D，G020R-S024R-S078D-G118S-G159D-
V244L-Q245R-N248D，T022A-G097A-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-
A232V-Q245R，T022A-N076D-G097S-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R，
G020R-T022W-R045T-S101A-N116L-P210I，T022Q-S101N-S103N-V104I-
A232M-Q245S，T022Y-S101G-S103N-V104I-A232V-Q245W，A114V，S141C，
T022A-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-A232V-Q245R，S056H，S078D-
G118D-Q245R，S024R-N043R-R045T-S101A-T213A，T022Y-S101T-S103G-
V104I-A232V-Q245S，T022A-S024G-G097S-S101Q-S103A-V104I-S128A-
L217Q-A232V-Q245R，N269W，S078G-G118S-G159D-Q245R-N248D-H249R，
T022W-S024R-R045T-S101A，T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-P129E-
A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V，T022A-S024R-S101G-S103A-V104I-
P129E-A232V-Q245R，T022A-S024R-N076D-S101G-S103A-V104I-I107V-
P129E-A232V-N238Y-Q245R-A270V-A272V，A122F，S024R-S078D-G118S-
P129E-G159D-Q245R-H249R，S099G，T022K-S101T-S103G-V104I-A232V-
Q245S，S009G-T022A-S078N-S101Q-S103A-V104I-Q109G-S128A-L217Q-
A232V-Q245R，A098Q，T022A-S101N-S103A-V104L-A232L-Q245R，T022A-
S101A-S103N-V104I-A232T-Q245W，T022A-S024G-N076D-G097A-S101N-
S103A-V104I-A232V-Q245R，S024R-S078G-G118D-G159D-H249R，T022A-
S024G-N076D-G097S-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，T022A-
S024G-N076D-S078N-S101Q-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，T022A-
S101Q-S103A-V104I-L124V-S128A-P129S-A232V-Q245R，T022R-S101N-
S103A-V104I-A232M-W241R-Q245W，R045T-S101A-P210I-G211Q，G020R-
S024R-S078G-G118S-P129E-Q245V-N248E，T022Q-S101T-S103N-V104I-
A232L-Q245W，T022A-S024G-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-L217Q-
A232V-Q245R，T022A-S024G-G097A-S101N-S103A-V104I-L217Q-A223S-
A232V-Q245R，T022K-S101T-S103A-V104I-A232T-Q245W，N043R-S101A-
G211Q，T022A-S101G-S103A-V104I-Q109N-S128A-A232V-Q245R，T022A-
G097A-S101G-S103A-V104I-S128A-L217Q-A232V-Q245R，G020R-S078G-
G118S-P129E-H249R，S024R-S078G-G118S-G159D-S188D-Q245R，N043R-
R045T-S101A-N204S-P210I-T213A，T022R-S101N-S103A-V104L-A232V-
Q245S，T022R-S101N-S103G-V104I-A232V-Q245S，T022K-S101T-S103N-
V104I-A232M-Q245S，T022A-N076D-S101N-S103A-V104I-L217Q-A232V-
Q245R，T022A-S024G-N076D-S078N-S101N-S103A-V104I-Q109G-S128A-
A232V-Q245R，G020R-T022W-R045T-S101A-P210I-T213A，T022A-N076D-
G097A-S101G-S103A-V104I-L217Q-A232V-Q245R，T022W-S101A-P210I，
T022A-G097A-S101N-S103A-V104I-L126I-P129S-A232V-Q245R，T022A-
S078D-S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，Q236L，T022Y-S101T-
S103N-V104I-A232V-Q245S，A200D，G020R-S078G-G118S-S188D-H249R，
T022A-S101G-S103N-V104I-A232T-Q245W，T022A-S024G-N076D-G097A-
S101N-S103A-V104I-S128A-A232V-Q245R，G157I，G020R-S024R-S078G-
G118S-P129E-G159D-S188D-Q245R，T022R-S078N-G097S-S101G-S103A-
V104I-Q109G-S128A-A232V-Q245R，R010A-G020R-S024R-S101A-N116L，
G020R-N043R-M222S
（列表19），并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括任何上文的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表1的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表2的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表3的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表4的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表5的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表6的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表7的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表8的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表9的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表10的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表11的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表12的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表13的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表14的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表15的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表16的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表17的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表18的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表19的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少85%的氨基酸同一性。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少90%的氨基酸同一性。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少95%的氨基酸同一性。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少98%的氨基酸同一性。
本发明还可包括迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少99%的氨基酸同一性。
本发明还可包括任何上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷是0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4、或-5。在一些实施例中，所述总净电荷通过选自下列的一个或多个取代获得：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、R275H/S、A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K、和/或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，并且其中所述蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还可包括分离的蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体具有至少一个、或甚至两个或更多个选自下列的带电的突变：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、和/或R275H/S，相对于SEQ ID NO:1的酶，优选地具有0、-1、-2、-3、-4或-5的电荷，优选0、-1、-2或-3，最优选-1或-2。所述蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体还能够包括本申请中所列的任何变体。
本发明还可包括分离的蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体具有一个或两个或更多个选自下列的带电的突变：A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K、和/或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，相对于SEQ ID NO:1的酶，优选地具有0、+1、+2、+3、+4或+5的电荷，优选+1、+2或+3，最优选+2。所述蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体还能够包括本申请中所列的任何变体。
在一些实施例中，任何上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，能够被掺入适合添加至水中以制备具有低离子强度或低洗涤剂浓度的洗涤液体的洗涤剂组合物中。因此，在本发明的一个优选方面，这些变体将形成洗涤剂组合物的一部分，所述洗涤剂组合物被加入水中，对于手洗或者机洗方法，通常在洗衣机内，以形成洗涤液体，其电导率为约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm、或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm。用于低离子强度或低洗涤剂浓度的优选的变体选自任何的上文的列表9、14、15或16，优选列表14或15，最优选列表15。
不受理论的束缚，据信通过在低离子强度、或包含低洗涤剂浓度的洗涤液体条件下确保分子电荷优化，这些以达到期望净电荷的突变提供了增强的总体蛋白酶性能-只有通过特定突变的仔细组合，其中这些突变是优选的，才能获得此类优选的蛋白酶。
在一些实施例中，任何上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，能够被掺入适合添加至水中以制备具有高离子强度或高洗涤剂浓度的洗涤液体的洗涤剂组合物中。因此，在本发明的一个优选方面，这些变体将形成洗涤剂组合物的一部分，所述洗涤剂组合物被加入水中，对于手洗或者机洗方法，通常在洗衣机内，以形成洗涤液体，其电导率为约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm、或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。用于高离子强度或高洗涤剂浓度的优选的变体选自任何的上文的列表1、17、18或19，优选列表17或18，最优选列表17。
优选地，这些蛋白酶形成洗涤剂组合物的一部分，其加入水中，对于手洗或者机洗方法，通常在洗衣机内，以形成洗涤液体，其电导率为高于约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm、或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。
不受理论的束缚，据信在高离子强度、或高洗涤剂浓度条件下，这些以达到期望净电荷的突变提供了增强的总体蛋白酶性能-只有通过特定突变的仔细组合，其中这些突变是优选的，才能获得此类优选的蛋白酶。
本发明还可包括任何上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体具有下列特性中的一个或多个：a）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8、或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；b）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8、或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；c）至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8、或甚至1.0至约5的测试方法4性能指数；和/或d）至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8、或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数；和/或e）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约15、1.1至约10、或甚至1.1至约7的测试方法7性能指数。下文的实例1中标题为“测试方法”的章节中明确描述了测试方法2、测试方法3、测试方法4、测试方法6、和测试方法7。
用于编码用于本发明中的多肽的核酸
本文描述了分离的、非天然存在的、或重组的核酸（本文中也称为“多核苷酸”），其可被统称为“用于编码用于本发明中的多肽的核酸”或“用于编码用于本发明中的多肽的多核苷酸”，其编码用于本发明中的多肽。用于编码用于本发明中的多肽的核酸（包括全部下文所述的），在用于本发明中的多肽的重组生产（例如，表达）中是有用的，通常通过包含编码所关注的多肽的序列或其片段的质粒表达载体的表达。如上文所讨论的，多肽包括了变体蛋白酶多肽，包括在用于清洁需要清洁的物品或表面（例如，物品的表面）的清洁应用和清洁组合物中有用的具有酶活性（例如，蛋白水解活性）的变体枯草杆菌蛋白酶多肽。
本文描述了分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的核酸，其包含编码上文标题为“用于本发明中的多肽”的部分和本文的其他地方描述的本发明的任何多肽（包括任何融合蛋白等）的核苷酸序列。本文还公开了分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的核酸，其包含编码两种或更多种上文和本文的其他地方描述的本发明的任何多肽的组合的核苷酸序列。
本文还描述了分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的核酸，其包含编码用于本发明中的具有蛋白水解活性的变体蛋白酶的多核苷酸序列，所述变体蛋白酶（例如，变体枯草杆菌蛋白酶）包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列差异不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过35个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述变体枯草杆菌蛋白酶的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号，如通过所述变体蛋白酶氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对所确定的。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表1的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表2的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表3的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表4的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表5的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表6的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表7的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表8的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表9的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表10的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表11的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表12的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表13的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表14的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表15的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表16的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表17的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表18的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表19的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码任何上文的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表1的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表2的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表3的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表4的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表5的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表6的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表7的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表8的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表9的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表10的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表11的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表12的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表13的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表14的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表15的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表16的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表17的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自列表18的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且具有蛋白水解活性，并且包含具有选自19的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少85%的氨基酸同一性。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少90%的氨基酸同一性。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少95%的氨基酸同一性。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少98%的氨基酸同一性。
本文描述了编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，如上文所列，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少99%的氨基酸同一性。
本发明还提供了编码任何上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷是0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4、或-5。在一些实施例中，所述总净电荷通过选自下列的一个或多个取代获得：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、R275H/S、A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K、或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，并且其中所述蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还提供了编码分离的蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述蛋白酶变体具有至少一个、或甚至两个或更多个选自下列的带电的突变：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、和/或R275H/S，相对于SEQ ID NO:1的酶，优选地具有0、-1、-2、-3、-4或-5的电荷，优选0、-1、-2或-3，最优选-1或-2。所述蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体还能够包括本申请中所列的任何变体。
本发明还提供了分离的蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体具有一个或两个或更多个选自下列的带电的突变：A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K、和/或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V和/或N269R，相对于SEQ ID NO:1的酶，优选地具有0、+1、+2、+3、+4或+5的电荷，优选+1、+2或+3，最优选+2。所述蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体还能够包括本申请中所列的任何变体。
如本文所指出的，适合的冷水蛋白酶变体，或枯草杆菌蛋白酶变体，是亲本蛋白酶的变体，所述亲本蛋白酶的序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少97%、至少99%或100%的同一性，所述蛋白酶变体具有一个或多个下列特性：
a）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8、或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；b）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8、或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；c）至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8、或甚至1.0至约5的测试方法4性能指数；和/或d）至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8、或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数；和/或e）至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约15、1.1至约10、或甚至1.1至约7的测试方法7性能指数。下文的实例1中标题为“测试方法”的章节中明确描述了测试方法2、测试方法3、测试方法4、测试方法6、和测试方法7。本文涉及的全部突变利用了如图1中所示的BPN’编号方案。在一些实施例中，本文涉及的变体是指采用BPN’编号方案，具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比较的氨基酸序列的变体。
在一些实施例中，上文的高离子强度冷水蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体，形成洗涤剂组合物的一部分，所述洗涤剂组合物被稀释于水中，通常在洗衣机内，以形成衣物洗涤液体，其电导率为约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm、或甚至约4mS/cm至约10mS/cm。
上述冷水蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体的电荷按相对于具有SEQID NO:2的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌（B.lentus）枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶野生型来表示。赋予单个负电荷的氨基酸为D和E，而那些赋予单个正电荷的为R、H、和K。任何对SEQ IDNO:2的改变电荷的氨基酸变化被用于计算所述冷水蛋白酶变体的电荷。例如，从一个野生型中性位置引入一个负电荷突变将向所述冷水蛋白酶变体加上-1的净电荷，而从一个野生型带正电的氨基酸残基（R、H或K）引入一个负电荷突变（D或E）将加上-2的净电荷。将来自就冷水蛋白酶变体相对于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌（B.lentus）枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶野生型而言不同的全部氨基酸残基的电荷变化求和，就得到了所述冷水蛋白酶变体的电荷变化。不受理论的束缚，据信：对于将在低电导率衣物洗涤剂溶液中使用的冷水蛋白酶，优选的电荷范围是-5、-4、-3、-2、-1、0、尤其是-2、-1，对于将在高电导率衣物洗涤剂溶液中使用的冷水蛋白酶，优选的电荷范围是+5、+4、+3、+2、+1、0，尤其是+2、+1。通过正确地选择电荷，能够获得出人意料地改进的水平的低温清洁效力。“低电导率衣物洗涤剂溶液”被定义为具有约0.1mS/cm至约3mS/cm、约0.3mS/cm至约2.5mS/cm、或甚至约0.5mS/cm至约2mS/cm的电导率。“高电导率衣物洗涤剂溶液”被定义为具有约3mS/cm至约30mS/cm、约3.5mS/cm至约20mS/cm、或甚至约4mS/cm至约10mS/cm的电导率。上文的例子旨在是非限制性的。一旦突变被合并以使低温效力最优化，酶的电荷还能够通过在另外的位置的突变被平衡。
在一些实施例中，本发明提供了分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的变体蛋白酶（例如，变体枯草杆菌蛋白酶），其具有蛋白分解的活性，所述变体蛋白酶包含与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列差异不超过50个、不超过45个、不超过40个、不超过35个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、或不超过8个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号，如通过所述变体蛋白酶氨基酸序列和解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对所确定的。
用于编码用于本发明中的多肽的核酸能够使用任何适合的合成、操纵、和/或分离技术、或它们的组合来产生。例如，本发明的多肽可使用标准的核酸合成技术，如本领域的技术人员所熟知的固相合成技术来制备。在此类技术中，至多50个或更多的核苷酸碱基片段通常被合成，然后被连接（例如，通过酶的或化学的连接方法，或聚合酶介导的重组方法）以形成基本上任何所期望的连续的核酸序列。用于编码用于本发明中的多肽的核酸的合成，还能够被本领域中已知的任何适合的方法促进（或者作为另外一种选择，通过其完成），所述方法包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法的化学合成（参见例如，Beaucage等人Tetrahedron Letters22:1859-69[1981]）；或Matthes等人描述的方法（参见，Matthes等人，EMBO J.3:801-805[1984]，如在自动化的合成方法中通常应用的。用于编码用于本发明中的多肽的核酸还能够使用自动化DNA合成仪来制备。定制的核酸能够从多种商业来源订购（例如，Midland Certified Reagent Company，Great American Gene Company、OperonTechnologies Inc.、和DNA2.0）。用于合成核酸的其他技术和相关原理是本领域已知的（参见，例如，Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.53:323[1984]；和Itakura等人，Science198:1056[1984]）。
如上文所述，在核酸的修饰中有用的重组DNA技术是本领域中为人们所熟知的。例如，诸如限制性内切核酸酶消化、连接、逆转录和cDNA制备、和聚合酶链反应（例如，PCR）的技术是已知的，并且被本领域的技术人员容易地使用。本发明的核苷酸还可通过使用一种或多种能够与编码本发明的变体蛋白酶多肽的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针或PCR扩增所述多核苷酸来筛选cDNA文库（例如，使用本领域中通常使用的诱变技术，包括本文所描述的那些，产生的cDNA文库）而获得。用于筛选和分离cDNA克隆的规程和PCR扩增规程是本领域的技术人员所熟知的，并且描述于本领域的技术人员已知的标准参考文献中。通过，例如，已知的诱变方法（例如，定点诱变、位点饱和诱变、和体外重组），用于编码用于本发明中的多肽的一些核酸能够通过改变天然存在的多核苷酸主链（例如，编码酶或亲本蛋白酶的）来获得。
用于制备本发明的经修饰的变体蛋白酶的方法
适用于产生用于编码用于本发明中的多肽的编码本发明的变体蛋白酶的经修饰的多核苷酸的多种方法是本领域中已知的，包括但不限于：例如，位点饱和诱变、分区诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变、定向进化、以及多种其他重组方法。用于制备经修饰的多核苷酸和蛋白质（例如，变体蛋白酶）的方法包括DNA改组方法，基于基因的非同源重组的方法，如ITCHY（参见，Ostermeier等人，7:2139-44[1999]）、SCRACHY（参见，Lutz等人98:11248-53[2001]）、SHIPREC（参见，Sieber等人，19:456-60[2001]）、和NRR（参见，Bittker等人，20:1024-9[2001]；Bittker等人，101:7011-6[2004]）、和依靠寡核苷酸的使用来插入随机和靶向的突变、缺失和/或插入的方法（参见，Ness等人，20:1251-5[2002]；Coco等人，20:1246-50[2002]；Zha等人，4:34-9[2003]；Glaser等人，149:3903-13[1992]）。
用于制备本发明的变体蛋白酶的载体、细胞、和方法
本文描述了包含至少一种本文所述的本发明的多核苷酸（例如，编码本文所述的本发明的变体蛋白酶的多核苷酸）的分离的或重组的载体、包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的分离的或重组的表达载体或表达盒、包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的分离的、基本上纯的、或重组的DNA构建体、包含至少一种本发明的多核苷酸的分离的或重组的细胞、包含具有至少一种本发明的多核苷酸的细胞的细胞培养物、包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的细胞培养物、和包含一个或多个此类载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物、或它们的任何组合或混合物的组合物。
在一些实施例中，本发明提供了包含至少一种本发明的载体（例如，表达载体或DNA构建体）的重组细胞，所述载体包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸。一些此类重组细胞是用此类至少一种载体转化或转染的。此类细胞通常被称为宿主细胞。一些此类细胞包括细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属（Bacillus）细胞，例如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）细胞。本发明还提供了包含至少一种本发明的变体蛋白酶的重组细胞（例如，重组宿主细胞）。
在一些实施例中，本发明提供了包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施例中，所述载体是编码本发明的变体蛋白酶的本发明的多核苷酸序列在其中可操作地连接至有效的基因表达所需要的一种或附加的核酸片段（例如，可操作地连接至编码本发明的变体蛋白酶的本发明的多核苷酸的启动子）的表达载体或表达盒。载体可包括转录终止子和/或选择性基因，如使得感染质粒的宿主细胞通过在包含抗菌剂的培养基中生长能够持续地在培养中维持的抗生素抗性基因。
表达载体可来源于质粒或病毒DNA，或者在替代实施例中，包含二者的元件。示例性的载体包括但不限于pXX、pC194、pJH101、pE194、pHP13（参见，Harwood和Cutting[编辑]，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus，John Wiley&Sons[1990]；就枯草芽孢杆菌（B.subtilis）而言适合的复制质粒包括在第92页所列的那些；亦参见，Perego，Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis，见Sonenshein等人，[编辑]Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry，Physiology and Molecular Genetics，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.[1993]，第615-624页）。
就所关注的蛋白质（例如，变体蛋白酶）在细胞中的表达和生产而言，包含编码经修饰的蛋白酶的多核苷酸的至少一个拷贝（并且优选包含多个拷贝）的至少一种表达载体在适合该蛋白酶的表达的条件下被转入所述细胞。在本发明的一些实施例中，编码所述变体蛋白酶的多核苷酸序列（以及包括在载体中的其他序列）被整合进宿主细胞的基因组，而在其他实施例中，包含编码所述变体蛋白酶的多核苷酸序列的质粒载体仍然作为自主的染色体外元件在细胞内。本发明提供了染色体外核酸元件以及被整合进宿主细胞基因组的引入的核苷酸序列。本文所述的载体对于本发明的变体蛋白酶的生产是有用的。在一些实施例中，编码所述变体蛋白酶的多核苷酸构建体存在于整合载体上，所述整合载体使得编码所述变体蛋白酶的多核苷酸能够向细菌染色体中整合并任选地扩增。整合的位点的例子是本领域的技术人员所熟知的。在一些实施例中，编码本发明的变体蛋白酶的多核苷酸的转录，是通过就所选择的前体蛋白酶而言是野生型启动子的启动子完成的。在一些其他实施例中，所述启动子对于所述前体蛋白酶而言是异源的，但在宿主细胞中是功能性的。具体地，适合用于微生物宿主细胞中的启动子的例子包括但不限于：例如，amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）麦芽糖淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）（BAN）淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）碱性蛋白酶基因、克劳氏芽孢杆菌（B.clausii）碱性蛋白酶基因、短小芽孢杆菌（B.pumilis）木糖苷酶基因、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）cryIIIA、和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）α-淀粉酶基因的启动子。附加的启动子包括但不限于A4启动子，以及噬菌体λPR或PL启动子，和大肠杆菌（E.coli）lac、trp或tac启动子。
本发明的变体蛋白酶能够在是任何适合的革兰氏阳性微生物的宿主细胞，包括细菌和真菌中被生产。例如，在一些实施例中，所述变体蛋白酶在真菌和/或细菌来源的宿主细胞中被生产。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌属（Bacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、埃希氏菌属（Escherichia）或曲霉属（Aspergillus）。在一些实施例中，所述变体蛋白酶由芽孢杆菌属（Bacillus）宿主细胞生产。可用于本发明的变体蛋白酶的生产的芽孢杆菌属（Bacillus）宿主细胞的例子包括但不限于地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、迟缓芽孢杆菌（B.lentus）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、迟缓芽孢杆菌（B.lentus）、短芽孢杆菌（B.brevis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）、嗜碱芽孢杆菌（B.alkalophilus）、凝结芽孢杆菌（B.coagulans）、环状芽孢杆菌（B.circulans）、短小芽孢杆菌（B.pumilis）、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）、克劳氏芽孢杆菌（B.clausii）、和巨大芽孢杆菌（B.megaterium），以及芽孢杆菌属（Bacillus）内的其他生物。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）宿主细胞被用于生产变体蛋白酶。美国专利5,264,366和4,760,025（RE34,606）描述了能够被用于生产本发明的变体蛋白酶的多种芽孢杆菌属（Bacillus）宿主菌株，尽管其他适合的菌株也能够被使用。
能够被用于生产本发明的变体蛋白酶的多种工业细菌菌株包括非重组的（即，野生型）芽孢杆菌属（Bacillus sp.）菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，所述宿主菌株是重组菌株，其中编码所关注的多肽的多核苷酸已被引入该宿主。在一些实施例中，所述宿主菌株是枯草芽孢杆菌（B.subtilis）宿主菌株，具体地是重组的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）宿主菌株。很多枯草芽孢杆菌（B.subtilis）菌株是已知的，包括但不限于：例如，1A6（ATCC39085）、168（1A01）、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243（ATCC39，087）、ATCC21332、ATCC6051、MI113、DE100（ATCC39，094）、GX4931、PBT110、和PEP211菌株（参见，例如，Hoch等人，Genetics73:215–228[1973]；亦参见，美国专利4,450,235和4,302,544、和EP0134048，上述每一文献全文以引用方式并入本文）。枯草芽孢杆菌（B.subtilis）作为表达宿主细胞的使用是本领域中为人们所熟知的（参见，例如，Palva等人，Gene19:81-87[1982]；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.，165:796–804[1986]；和Wang等人，Gene69:39–47[1988]）。
在一些实施例中，芽孢杆菌属（Bacillus）宿主细胞是在至少一种下列基因中包括突变或缺失的芽孢杆菌属（Bacillus）：degU、degS、degR和degQ。优选地，所述突变是在degU基因中，更优选所述突变是degU（Hy）32（参见，例如，Msadek等人，J.Bacteriol.172:824-834[1990]；和Olmos等人，Mol.Gen.Genet.253:562–567[1997]）。一种适合的宿主菌株是携带degU32（Hy）突变的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。在一些实施例中，所述芽孢杆菌属（Bacillus）宿主包含scoC4（参见，例如，Caldwell等人，J.Bacteriol.183:7329-7340[2001]）；spoIIE（参见，例如，Arigoni等人，Mol.Microbiol.31:1407-1415[1999]）；和/或oppA或opp操纵子的其他基因（参见，例如，Perego等人，Mol.Microbiol.5:173-185[1991]）中的突变或缺失。实际上，预期导致与oppA中的突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本发明的改变的芽孢杆菌属（Bacillus）菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独地发生，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，能够用于生产本发明的变体蛋白酶的改变的芽孢杆菌属（Bacillus）宿主细胞菌株是在一个或多个上文提及的基因中已经包括突变的芽孢杆菌属（Bacillus）宿主菌株。此外，可使用包含内源蛋白酶基因的突变和/或缺失的芽孢杆菌属（Bacillus）宿主细胞。在一些实施例中，所述芽孢杆菌属（Bacillus）宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，所述芽孢杆菌属（Bacillus）宿主细胞包含5种蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，所述芽孢杆菌属（Bacillus）宿主细胞包含9种蛋白酶基因的缺失（参见，例如，美国专利申请公布2005/0202535，该文献以引用方式并入本文）。
宿主细胞是使用本领域已知的任何适合的方法，用编码至少一种本发明的变体蛋白酶的至少一种核酸转化的。无论核酸是被整合进载体或是在质粒DNA的不存在下被使用，其通常被引入微生物中，在一些实施例中，优选大肠杆菌（E.coli）细胞或感受态芽孢杆菌属（Bacillus）细胞。用于利用质粒DNA构建体或载体将核酸（例如，DNA）引入芽孢杆菌属（Bacillus）细胞或大肠杆菌（E.coli）细胞和将此类质粒DNA构建体或载体转入此类细胞的方法是为人们所熟知的。在一些实施例中，质粒随后被从大肠杆菌（E.coli）细胞分离，并被转入芽孢杆菌属（Bacillus）细胞。然而，使用居间的微生物如大肠杆菌（E.coli）并不是必需的，在一些实施例中，DNA构建体或载体被直接引入芽孢杆菌属（Bacillus）宿主。
本领域的技术人员非常了解用于将本发明的核酸或多核苷酸引入芽孢杆菌属（Bacillus）细胞的适合的方法（参见，例如，Ferrari等人，“Genetics，”见Harwood等人[编辑]，Bacillus，Plenum Publishing Corp.[1989]，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.157:718-726[1984]；Hoch等人，J.Bacteriol.93:1925-1937[1967]；Mann等人，Current Microbiol.13:131-135[1986]；Holubova，Folia Microbiol.30:97[1985]；Chang等人，Mol.Gen.Genet.168:11-115[1979]；Vorobjeva等人，FEMS Microbiol.Lett.7:261-263[1980]；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.51:634[1986]；Fisher等人，Arch.Microbiol.139:213-217[1981]；和McDonald，J.Gen.Microbiol.130:203[1984]）。实际上，此类方法如转化，包括原生质体转化和聚合、转导、和原生质体融合是为人们所熟知的，并且适合用于本发明中。转化的方法被用于将包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞中。用以转化芽孢杆菌属（Bacillus）细胞的本领域已知的方法包括诸如质粒标记补救转化的方法，其涉及由携带部分地同源的内生质粒的感受态细胞摄入供体质粒（参见Contente等人，Plasmid2:555-571[1979]；Haima等人，Mol.Gen.Genet.223:185-191[1990]；Weinrauch等人，J.Bacteriol.154:1077-1087[1983]；和Weinrauch等人，J.Bacteriol.169:1205-1211[1987]）。在该方法中，引入的供体质粒在模拟了染色体转化的过程中与内生的“助手”质粒的同源区域重组。
除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸的DNA构建体或载体直接转化了宿主细胞（即，在引入宿主细胞之前，媒介细胞没有被用于扩增（或者加工）所述DNA构建体或载体）。本发明的DNA构建体或载体向宿主细胞中的引入包括了用于将核酸序列（例如，DNA序列）引入宿主细胞而没有插入质粒或载体的本领域已知的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在附加的实施例中，DNA构建体或载体与质粒一起被共转化，而没有被插入该质粒中。在另外的实施例中，选择性标记通过本领域中已知的方法被从经改变的芽孢杆菌属（Bacillus）菌株删除（参见，Stahl等人，J.Bacteriol.158:411-418[1984]；和Palmeros等人，Gene247:255-264[2000]）。
在一些实施例中，本发明的转化的细胞在常规的营养培养基中被培养。适合的具体的培养条件，如温度、pH等是本领域的技术人员已知的，并且被很好地描述于科学文献中。在一些实施例中，本发明提供了包含本发明的至少一种变体蛋白酶或至少一种核酸的培养物（例如，细胞培养物）。还提供了包含本发明的至少一种核酸、载体、或DNA构建体的组合物。
在一些实施例中，用编码至少一种本发明的变体蛋白酶的至少一种多核苷酸转化的宿主细胞，在允许本发明的蛋白酶的表达的条件下，在适合的营养培养基中被培养，之后所得到的蛋白酶被从培养物回收。用于培养细胞的培养基包括适合该宿主细胞生长的任何常规的培养基，如包含适当的补充剂的基本或复合培养基。适合的培养基可购自商业供应商或根据公布的配方制备（参见，例如，美国典型培养物保藏中心（American Type CultureCollection）的目录）。在一些实施例中，由所述细胞生产的蛋白酶通过常规方法被从培养基回收，所述方法包括但不限于：例如，通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞、通过盐（例如，硫酸铵）使上清液或滤液的蛋白质组分沉淀、层析法纯化（例如，离子交换、凝胶过滤、亲和等）。适用于回收或纯化变体蛋白酶的任何方法可用于本发明中。
在一些实施例中，由重组宿主细胞生产的变体蛋白酶被分泌至培养基中。编码有利于纯化的结构域的核酸序列可被用于帮助可溶性蛋白质的纯化。包含编码变体蛋白酶的多核苷酸序列的载体或DNA构建体还可包含编码有利于纯化的结构域的核酸序列，以帮助所述变体蛋白酶的纯化（参见，例如，Kroll等人，DNA Cell Biol.12:441-53[1993]）。此类有利于纯化的结构域包括但不限于：例如，金属螯合肽如允许在固定的金属上的纯化的组氨酸-色氨酸模块（参见，Porath，Protein Expr.Purif.3:263-281[1992]）、允许在固定的免疫球蛋白上的纯化的蛋白质A结构域、和在FLAGS延伸/亲和纯化体系中利用的结构域（例如，可得自Immunex Corp.，Seattle，WA的蛋白质A结构域）。在纯化结构域和异源蛋白质之间包括可裂解的接头序列如因子XA（Factor XA）或肠激酶（例如，可得自Invitrogen，SanDiego，CA的序列），也可用于帮助纯化。
用于检测和测量酶，如本发明的变体蛋白酶的酶活性的测定法是为人们所熟知的。用于检测和测量蛋白酶（例如，本发明的变体蛋白酶）的活性的多种测定法也是本领域的普通技术人员已知的。具体地，基于酸可溶的肽从酪蛋白或血红蛋白的释放测量蛋白酶活性的测定法是可用的，所述释放被测量为在280nm的吸光度或利用福林法比色测量，这是本领域的技术人员所熟知的。其他示例性的测定法涉及显色底物的溶解（参见，例如，Ward，“Proteinases，”见Fogarty（编辑），Microbial Enzymes andBiotechnology，AppliedScience，London，[1983]，第251-317页）。其他示例性的测定法包括但不限于丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺（suc-AAPF-pNA）和2，4，6-三硝基苯磺酸钠盐测定法（TNBS测定法）。本领域的技术人员已知的大量附加的参考文献提供了适合的方法（参见，例如，Wells等人，Nucleic Acids Res.11:7911-7925[1983]；Christianson等人，Anal.Biochem.223:119-129[1994]；和Hsia等人，Anal Biochem.242:221-227[1999]）。
多种方法能够被用于测定成熟蛋白酶（例如，本发明的成熟的变体蛋白酶）在宿主细胞中生产的水平。此类方法包括但不限于：例如，利用特异性针对所述蛋白酶的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）、荧光免疫测定法（FIA）、和荧光激活细胞分选法（FACS）。这些以及其他的测定法是本领域中为人们所熟知的（参见，例如，Maddox等人，J.Exp.Med.158:1211[1983]）。
在一些其他实施例中，本发明提供了用于制备或生产本发明的成熟的变体蛋白酶的方法。成熟的变体蛋白酶不包括信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞，例如，枯草杆菌属（Bacillus）细胞（例如，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）细胞）中制备或生产本发明的变体蛋白酶。在一些实施例中，本发明提供了生产本发明的变体蛋白酶的方法，所述方法包括在有利于所述变体蛋白酶的生产的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，所述载体包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸。一些此类方法还包括从培养物回收所述变体蛋白酶。
在一些实施例中，本发明提供了生产本发明的变体蛋白酶的方法，所述方法包括：（a）将包含编码本发明的变体蛋白酶的核酸的重组表达载体引入细胞（例如，细菌细胞，如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）细胞）的群体；和（b）在有利于由该表达载体编码的变体蛋白酶的生产的条件下，在培养基中培养上述细胞。一些此类方法还包括：（c）从所述细胞或从所述培养基分离变体蛋白酶。
织物和家居护理产品
在一些实施例中，所述蛋白酶变体，更具体地，本发明的枯草杆菌蛋白酶变体，能够被用于包含助剂材料和蛋白酶变体的组合物中，其中所述组合物是织物和家居护理产品。
在一些实施例中，所述织物和家居护理产品组合物包含至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表1-19的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
本发明还提供了任何上文的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述织物和家居护理产品组合物包含迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述GG36蛋白酶是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且包含具有选自列表1-19的氨基酸取代组合的氨基酸序列，并且其中所述蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
在一些实施例中，所述织物和家居护理产品组合物包含任何上文所列的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷是0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4、或-5。在一些实施例中，所述总净电荷通过选自下列的一个或多个取代获得：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、R275H/S、A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K、或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，并且其中所述蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号。
在一些实施例中，所述织物和家居护理产品组合物的枯草杆菌蛋白酶变体是来源于可商购获得的亲本枯草杆菌蛋白酶（例如， 或来自Novozymes A/S）；和 PURAFASTTM、PRIME、或来自GenencorInternational的和可得自Henkel/Kemira的那些，也就是BLAP（序列显示在US5,352,604的图29中并具有下列突变：S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文中称为BLAP）和BLAP X（具有S3T+V4I+V205I的BLAP）。
在一些实施例中，所述织物和家居护理产品组合物包含至少一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体的亲本具有蛋白分解活性，其中所述变体蛋白酶包含与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列差异不超过50个、不超过40个、不超过35个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、或不超过8个氨基酸残基的氨基酸序列，其中氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号，如通过所述变体蛋白酶氨基酸序列和解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的比对所确定的。
清洁和/或处理组合物
在一些组合物中，包含清洁和/或处理组合物的消费品包含至少一种蛋白酶变体（尤其是枯草杆菌蛋白酶变体）和至少一种助剂材料。在一些实施例中，掺入了这些助剂，例如，以帮助或增强清洁性能，用于处理待清洁的底物，或者如在掺入香料、色素、染料等的情况下，用以改变清洁组合物的美观。应当理解，是在本发明的变体蛋白酶之外附加的。这些附加组分的准确性质及其掺入的量将依赖于所述组合物的物理形式和其所用于的清洁操作的性质。所述清洁和/或处理的助剂材料可选自包括但不限于下列的列表中的一种或多种：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他的酶、酶稳定系统、螯合剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光增白剂、织物调理剂、织物软化剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色斑、银护理剂、抗变色和/或防锈剂、碱源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、和pH值控制剂，包含香料、调色剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、附加的酶、酶稳定剂、催化物质、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成形过酸、聚合分散剂、粘土污垢去除/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构增弹剂、织物软化剂、水溶助长剂、溶剂以及它们的混合物的包封物（参见，例如，美国专利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，上述专利全部以引用方式并入本文）。具体的清洁组合物材料的实例详细例示于下文中。在清洁和/或处理助剂材料在其中与本发明的变体蛋白酶在清洁组合物中不相容的实施例中，则使用了使所述清洁助剂材料和蛋白酶保持分离（即，彼此不接触），直到这两种组分适合混合为止的方法。此类分离方法包括本领域中已知的任何适合的方法（例如，软胶囊、封装、片剂、物理分离等）。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物还包含至少一种附加的非免疫等价的蛋白酶，所述非免疫等价的蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶（EC3.4.21.62）；胰蛋白酶样或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶；金属蛋白酶以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物还包含至少一种附加的非免疫等价的蛋白酶，所述非免疫等价的蛋白酶选自：来源于枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、短小芽孢杆菌（B.pumilus）和吉氏芽孢杆菌（B.gibsonii）的枯草杆菌蛋白酶（EC3.4.21.62）；来源于纤维菌属（Cellulomonas）的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；来源于解淀粉芽孢杆菌的金属蛋白酶；以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物还包含至少一种附加的酶，所述附加的酶选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣多糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物还包含至少一种附加的酶，所述附加的酶选自第一洗涤酯酶；α淀粉酶；细菌清洁纤维素酶；以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物还包含下列中的至少一种：包含了包括香料微胶囊的香料的封装物；包含选自碱的、酸的、疏水的、直接的和聚合的染料、和具有550nm至650nm的峰值吸收波长的染料缀合物以及它们的混合物的材料的调色剂；包含选自阴离子去污表面活性剂、非离子去污表面活性剂、阳离子去污表面活性剂、两性离子去污表面活性剂和两性去污表面活性剂以及它们的混合物的材料的去污表面活性剂；包含选自沸石、磷酸盐以及它们的混合物的材料的助洗剂；包含选自硅酸钠、硅酸钾以及它们的混合物的材料的硅酸盐；包含选自冷水可溶性增白剂及其混合物的材料的增白剂；包含选自马来酸盐/丙烯酸盐随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物以及它们的混合物的材料的羧酸盐聚合物；包含选自对苯二甲酸酯共聚物及其混合物的材料的去污聚合物；包含选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧甲基纤维素、烷基羧甲基纤维素以及它们的混合物的材料的去垢性聚合物；包含选自亚铵阳离子、亚胺聚离子、亚铵两性离子、改性的胺、改性的氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮以及它们的混合物的材料的漂白剂催化剂；包含选自十二烷酰基羟基苯磺酸盐、癸酰基羟基苯磺酸盐、癸酰基羟基苯甲酸或其盐、3，5，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺（TAED）、壬酰氧基苯磺酸盐（NOBS）和它们的混合物的材料的漂白活化剂；包含选自无机过氧化氢合物盐、包括碱金属盐如过硼酸的钠盐（通常为一水合物或四水合物）、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐以及它们的混合物的材料的过氧化氢源；螯合剂，其包含包含选自DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）、HEDP（羟基乙烷二膦酸）、DTPMP（二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)）、乙二胺二琥珀酸（EDDS）、1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸二钠盐水合物、所述螯合剂的衍生物的材料；以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物包含织物调色剂，所述织物调色剂选自染料、包含至少一种阳离子-碱性染料和蒙皂石粘土的染料-粘土缀合物、以及它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理组合物包含织物调色剂，所述织物调色剂选自小分子染料和聚合物染料以及任选地带有蒙皂石粘土的它们的混合物。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/处理组合物以单个的或多个-隔室的单位剂量被提供。在一些实施例中，所述组合物是多个-隔室的单位剂量，其中所述蛋白酶变体是在与过氧化氢和/或螯合剂和/或附加的酶不同的隔室中。
在一些实施例中，包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/处理组合物包含一种或多种下列成分（以总的组合物重量计）：约0.0005重量%至约0.1重量%、约0.001重量%至约0.05重量%、或甚至约0.002重量%至约0.03重量%的所述蛋白酶变体；以及下列中的一种或多种：约0.00003重量%至约0.1重量%的织物调色剂；约0.001重量%至约5重量%的香料胶囊；约0.001重量%至约1重量%的冷水可溶性增白剂；约0.00003重量%至约0.1重量%的漂白催化剂；约0.00003重量%至约0.1重量%的第一洗涤酯酶；约0.00003重量%至约0.1重量%的细菌清洁纤维素酶；和/或约0.05重量%至约20重量%Guerbet非离子表面活性剂。
在一些实施例中，所述清洁和/或处理组合物是液体衣物洗涤剂、餐具洗涤剂。
所述清洁和/或处理旨在以任何适当的形式被提供，包括流体或固体。所述清洁和/或处理可以是以单位剂量小袋的形式，尤其是当其处于液体形式时，并且通常所述清洁和/或处理是至少部分地、或甚至完全地被水可溶的小袋封闭的。此外，在包含至少一种蛋白酶变体的清洁和/或处理的一些实施例中，所述清洁和/或处理可具有上文详述的参数和/或特性的任何组合。除非另外指明，本文提供的组分或组合物水平是就该组分或组合物的活性水平而言提供的，并且是不计可能存在于可商购获得的来源中的杂质，例如残余的溶剂或副产物的。酶组分重量是以总的活性蛋白质计的。除非另外指明，所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于总组合物计算。在示例性的洗涤剂组合物中，酶的水平是通过以占总的组合物的重量计的纯酶表示的，并且除非另外指明，所述洗涤剂成分是以占总的组合物的重量表示的。
本发明的清洁组合物被有利地用于下列用途，例如洗衣用途、硬质表面清洁、盘碟洗涤用途、以及化妆品用途（如清洁假牙、牙齿、毛发和皮肤）。此外，由于在低温溶液中提高的效果的独特优势，本发明的酶理想地适合衣物洗涤用途。此外，本发明的酶可用于颗粒状的和液体的组合物中。
本发明还提供了包含所描述的蛋白酶变体和助剂材料的清洁添加剂产品。在一些实施例中，使用了低温溶液清洁用途。在一些实施例中，本发明提供了包括至少一种本发明的酶的清洁添加剂产品，当期望附加的漂白效果时，其理想地适合被包括在洗涤方法中。此类例子包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施例中，所述添加剂产品是其最简单的形式，一种或多种蛋白酶。在一些实施例中，所述添加剂是被包装在用于添加至清洁过程的剂型中的。在一些实施例中，所述添加剂被包装在用于添加至使用过氧化物源并期望增加漂白效果的清洁过程的剂型中。任何适合的单剂量单位形式可用于本发明，包括但不限于丸剂、片剂、软胶囊、或其他单剂量单位如预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，包括了填料或载体材料以提高此类组合物的体积。合适的填料或载体材料包括但不限于多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石、粘土等等。用于液体组合物的适合的填料或载体材料包括但不限于水或低分子量初级和次级醇，包括多元醇和二醇。上述醇的例子包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，所述组合物包含约5%至约90%的此类材料。酸性填料可用于降低pH。作为另外一种选择，在一些实施例中，所述清洁添加剂包括助剂成分，如下文所更加详细地描述的。
本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要单独的或与其他蛋白酶和/或附加的酶组合的有效量的至少一种所述蛋白酶变体，更具体地，本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体。所需要的酶的水平是通过一种或多种蛋白酶变体，更具体地，本发明的枯草杆菌蛋白酶变体的添加而达到的。通常本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量百分比、约0.0001至约10、约0.001至约1、或甚至约0.01至约0.1重量百分比的至少一种本发明的变体蛋白酶。
本文的清洁组合物通常被配制为使得在用于含水清洁操作期间，洗涤水将具有约5.0至约11.5或甚至约7.5至约10.5的pH。液体产品制剂通常被配制为具有约3.0至约9.0或甚至约3至约5的净pH。颗粒状的衣物洗涤产品通常被配制为具有约9至约11的pH。将pH调节在可取使用程度的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，并且是本领域的技术人员所熟知的。
适合的“低pH清洁组合物”通常具有约3至约5的净pH，并且通常不含在此类pH环境中水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括了包含至少一个环氧乙烷部分或甚至约1至约16个分子的环氧乙烷的烷基硫酸钠表面活性剂。此类清洁组合物通常包含足够量的pH调节剂，例如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，以提供具有约3至约5的净pH的此类清洁组合物。此类组合物通常包含至少一种酸稳定的酶。在一些实施例中，所述组合物是液体，而在其他实施例中，它们是固体。此类液体组合物的pH通常被测量为净pH。此类固体组合物的pH按照所述组合物的10%固体溶液被测量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，全部的pH测量在20℃进行，除非另外指明。
在一些实施例中，当所述变体蛋白酶被用于颗粒状的组合物或液体中时，就所述变体蛋白酶而言，处于封装的颗粒形式以使所述变体蛋白酶在储存期间免受该颗粒状组合物的其他组分的影响是合乎期望的。此外，封装还是控制变体蛋白酶在清洁过程中的可用性的方法。在一些实施例中，封装增强了所述变体蛋白酶和/或附加的酶的性能。就这一点而言，本发明的变体蛋白酶是被本领域中已知的任何适合的包封材料封装的。在一些实施例中，所述包封材料通常封装了针对本发明的变体蛋白酶的催化剂的至少一部分。典型地，该胶囊包封材料是水溶性的和/或水分散性的。在一些实施例中，所述包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度（Tg）。玻璃化转变温度被更加详细地描述在WO97/11151中。所述包封材料通常选自由下列物质：碳水化合物、天然或合成树胶、甲壳质和脱乙酰壳多糖、纤维素及纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡、以及它们的组合。当所述包封材料为碳水化合物时，其通常选自单糖、低聚糖、多糖、以及它们的组合。在一些典型的实施例中，所述包封材料是淀粉（参见，例如，EP0922499；US4,977,252；US5,354,559、和US5,935,826）。在一些实施例中，所述包封材料是由塑料如热塑性塑料、丙烯腈、异丁烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈以及它们的组合物制成的微球；可使用的可商购获得的微球包括但不限于（Stockviksverken，Sweden）、和PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和（PQCorp.，Valley Forge，PA）。
如本文所述，用于本发明中的变体蛋白酶可特别地用于清洁工业，包括但不限于衣物洗涤和盘碟洗涤剂。这些应用将酶置于各种环境胁迫条件下。由于它们在各种条件下的稳定性，本发明的组合物提供了优于许多目前使用的包含酶的产品的优点。
实际上，存在多种洗涤条件，包括不同的洗涤剂配方、洗涤水体积、洗涤水温度、以及洗涤时间长短，这也是洗涤中使用的蛋白酶所面临的条件。此外，在不同地理区域中使用的洗涤剂配方的相关组分在洗涤水中具有不同的浓度。例如，欧洲的洗涤剂在洗涤水中通常具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂在洗涤水中通常具有大约667ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其是美国，洗涤剂在洗涤水中通常具有975ppm的洗涤剂组分。
低洗涤剂浓度体系包括在洗涤水中存在小于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。日本洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度体系，因为它们在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。
中洗涤剂浓度体系包括在洗涤水中存在800ppm至2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。北美洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度体系，因为它们在洗涤水中具有大约975ppm的洗涤剂组分。巴西洗涤剂在洗涤水中通常具有大约1500ppm的洗涤剂组分。
高洗涤剂浓度体系包括在洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度体系，因为它们在洗涤水中具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫的磷酸盐助洗剂洗涤剂，并且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可以为中洗涤剂浓度和高洗涤剂浓度，因为它们在洗涤水中的洗涤剂组分范围为1500ppm至6000ppm。如上述所提到的，巴西洗涤剂在洗涤水中通常具有大约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其他高泡沫磷酸盐助剂洗涤剂地区，不限于其他拉丁美洲国家，可具有在洗涤水中存在最多约6000ppm的洗涤剂组分的高洗涤剂浓度体系。
按照前述，显而易见的是，世界各地的典型洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度多种多样，从小于约800ppm的洗涤剂组合物（“低洗涤剂浓度地区”），例如在日本约667ppm，至约800ppm到约2000ppm之间（“中洗涤剂浓度地区”），例如在美国约975ppm和在巴西约1500ppm，至大于约2000ppm（“高洗涤剂浓度地区”），例如在欧洲约4500ppm至约5000ppm和在高泡沫磷酸盐助剂洗涤剂地区约6000ppm，。
典型的洗涤溶液的浓度是由实验测定的。例如，在美国，典型的洗衣机容纳约64.4升体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液中获得约975ppm的洗涤剂浓度，必须将约62.79克洗涤剂组合物加入到64.4升的洗涤溶液中。这个量是由消费者使用洗涤剂提供的量杯量取加入到洗涤水中的典型量。
作为进一步的例子，不同地区使用不同的洗涤温度。在日本，洗涤水的温度通常是低于在欧洲使用的洗涤水的温度。例如，在北美和日本洗涤水的温度通常介于约10和约30℃之间（例如，约20℃），而在欧洲的洗涤水的温度通常介于约30和约60℃之间（例如，约40℃）。然而，为了节约能源，很多消费者都切换到使用冷水洗涤。此外，在一些更远的地区，冷水是通常用于衣物洗涤以及餐具洗涤。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”利用了适合在约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合，和在10℃至40℃内的所有范围的温度洗涤的“冷水洗涤剂”。
作为进一步的例子，不同地区通常具有不同的水硬度。水的硬度通常以术语格令/每加仑描述，混有Ca2+/Mg2+。硬度是水中的钙（Ca2+）和镁（Mg2+）的量的量度。在美国大多数水是硬水，但硬度的程度不同。中硬（60-120ppm）至硬（121-181ppm）水含60至181ppm（ppm换算为格令每美制加仑是ppm#除以17.1等于格令/每加仑）的硬度矿物。
| 水 | 格令/每加仑 | ppm |
| 软 | 小于1.0 | 小于17 |
| 微硬 | 1.0至3.5 | 17至60 |
| 中硬 | 3.5至7.0 | 60至120 |
| 硬 | 7.0至10.5 | 120至180 |
| 非常硬 | 大于10.5 | 大于180 |
欧洲水的硬度通常大于约10.5（例如约10.5至约20.0）格令/每加仑，混有Ca2+/Mg2 +（例如约15格令/每加仑，混有Ca2+/Mg2+）。北美水的硬度通常大于日本水的硬度，但小于欧洲水的硬度。例如，北美水的硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令或约6格令之间。日本水的硬度通常低于北美水的硬度，通常小于约4，例如约3格令/每加仑，混有Ca2+/Mg2+。
因此，在一些实施例中，本发明提供了包含在至少一组洗涤条件（例如，水温、水硬度、和/或洗涤剂浓度）下表现出惊人的洗涤性能的变体蛋白酶的消费品或清洁和/或处理组合物。在一些实施例中，本发明的变体蛋白酶在洗涤性能上与其他枯草杆菌蛋白酶是相当的。在一些实施例中，与目前可商购获得的枯草杆菌蛋白酶相比，本发明的变体蛋白酶显示出增强的洗涤性能。因此，在本发明的一些实施例中，本文提供的变体蛋白酶表现出提高的氧化稳定性、提高的热稳定性、提高的在各种条件下的清洗能力、和/或提高的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可（同样是单独地或与助剂和稳定剂组合地）用于不包括洗涤剂的清洁组合物中。
在本发明的一些实施例中，所述清洁组合物包含按所述组合物的重量计约0.00001%至约10%水平的至少一种所规定的变体蛋白酶，而其余部分包含按组合物的重量计的助剂材料（例如，约99.999%至约90.0%）。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物包含按所述组合物的重量计约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%水平的至少一种变体蛋白酶，而所述清洁组合物的其余部分（例如，按重量计约99.9999%至约90.0%、约99.999%至约98%、约99.995%至约99.5%）包含清洁助剂材料。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种附加的洗涤剂酶，其提供了清洁性能和/或织物护理和/或盘碟洗涤有益效果。适宜酶的例子包括但不限于：半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶（melanase）、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶、或它们的任何组合或混合物。在一些实施例中，使用了酶的组合（即，“鸡尾酒”），其包含常规的适用的酶如蛋白酶、脂肪酶、角质膜和/或纤维素酶，连同淀粉酶一起被使用。
除所述蛋白酶变体，更具体地，本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体之外，任何其他适合的蛋白酶也可用于本发明的组合物中。适用的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些蛋白酶。在一些实施例中，使用了微生物的蛋白酶。在一些实施例中，包括了化学或基因修饰的突变体。在一些实施例中，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子包括枯草杆菌蛋白酶，尤其是来源于芽孢杆菌属（Bacillus）的那些（例如，枯草杆菌蛋白酶，迟缓芽孢杆菌（lentus），解淀粉芽孢杆菌（amyloliquefaciens）、枯草菌溶素（subtilisin Carlsberg）、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168）。附加的例子包括美国专利RE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936、和6,482,628中描述的那些突变体蛋白酶，全部这些专利以引用方式并入本文。附加的蛋白酶的例子包括但不限于胰蛋白酶（例如，猪或牛来源的）和WO89/06270中描述的镰孢属（Fusarium）蛋白酶。在一些实施例中，可商购获得的蛋白酶可用于本发明中，包括但不限于MAXACALTM、MAXAPEMTM、 PURAMAXTM、EXCELLASETM、和PURAFASTTM（Genencor）；DURAZYMTM、 和（Novozymes）；BLAPTM和BLAPTM变体（Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien，Duesseldorf，Germany）、和KAP（嗜碱芽孢杆菌（B.alkalophilus）枯草杆菌蛋白酶；Kao Corp.，Tokyo，Japan）。多种蛋白酶描述于WO95/23221、WO92/21760、美国专利公布2008/0090747、和美国专利5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、US RE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936、和6,482,628、以及多个其他专利中。在一些另外的实施例中，金属蛋白酶可用于本发明中，包括但不限于描述于WO07/044993中的中性金属蛋白酶。
此外，任何适合的脂肪酶可用于本发明中。适合的脂肪酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。本发明涵盖了化学或基因修饰的突变体。有用的脂肪酶的例子包括柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa）脂肪酶（参见，例如，EP258068、和EP305216）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶（参见，例如，EP238023）、假丝酵母属（Candida）脂肪酶，如南极假丝酵母（C.antarctica）脂肪酶（例如，南极假丝酵母（C.antarctica）脂肪酶A或B；参见，例如，EP214761）、假单胞菌属（Pseudomonas）脂肪酶，如产碱假单胞菌（P.alcaligenes）脂肪酶和类产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）脂肪酶（参见，例如，EP218272）、洋葱假单胞菌（P.cepacia）脂肪酶（参见，例如，EP331376）、斯氏假单胞菌（P.stutzeri）脂肪酶（参见，例如，GB1,372,034）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）脂肪酶、芽孢杆菌属（Bacillus）脂肪酶（例如，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）脂肪酶[Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta1131:253-260[1993]）；嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）脂肪酶[参见，例如，JP64/744992]；和短小芽孢杆菌（B.pumilus）脂肪酶[参见，例如，WO91/16422]）。
此外，许多克隆的脂肪酶可用于本发明的一些实施例中，包括但不限于卡门柏青霉（Penicillium camembertii）脂肪酶（参见，Yamaguchi等人，Gene103:61-67[1991]）、白地霉（Geotricum candidum）脂肪酶（参见，Schimada等人，J.Biochem.，106:383-388[1989]）、和多种根霉属（Rhizopus）脂肪酶如德氏根霉（R.delemar）脂肪酶（参见，Hass等人，Gene109:117-113[1991]）、雪白根霉（R.niveus）脂肪酶（Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.56:716-719[1992]）和米根霉（R.oryzae）脂肪酶。
其他类型的分解脂肪的酶如角质酶也可用于本发明的一些实施例中，包括但不限于来源于门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）的角质酶（参见、WO88/09367）、和来源于茄病镰刀菌（Fusarium solani pisi）的角质酶（参见、WO90/09446）。
附加的适合的脂肪酶包括可商购获得的脂肪酶如M1LIPASETM、LUMA FASTTM、和LIPOMAXTM（Genencor）；和ULTRA（Novozymes）；和LIPASE PTM“Amano”（AmanoPharmaceutical Co.Ltd.，Japan）。
在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含按附加的脂肪酶占所述组合物的重量计约0.00001%至约10%水平的脂肪酶，而其余部分为按组合物的重量计的清洁助剂材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含按脂肪酶占所述组合物的重量计约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%水平的脂肪酶。
在本发明的一些实施例中，任何适合的淀粉酶可用于本发明中。在一些实施例中，可使用适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶（例如，α和/或β）。适合的淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。在一些实施例中，包括了化学或基因修饰的突变体。可用于本发明中的淀粉酶包括但不限于从地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）获得的α-淀粉酶（参见，例如，GB1,296,839）。可用于本发明中的可商购获得的淀粉酶包括但不限于 和BANTM（Novozymes）、以及POWERASETM、和P（Genencor）。
在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含按附加的淀粉酶占所述组合物的重量计约0.00001%至约10%水平的淀粉酶，而其余部分为按组合物的重量计的清洁助剂材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含按淀粉酶占所述组合物的重量计约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%水平的淀粉酶。
在一些其他实施例中，任何适合的纤维素酶可用于本发明的清洁组合物中。适合的纤维素酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。在一些实施例中，包括了化学或基因修饰的突变体。适合的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉（Humicola insolens）纤维素酶（参见，例如，美国专利4,435,307）。尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的纤维素酶（参见，例如，EP0495257）。可用于本发明中的可商购获得的纤维素酶包括但不限于（Novozymes）、和KAC-500（B）TM（Kao Corporation）。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟的野生型或变体纤维素酶的部分或片段被掺入，其中N末端的部分是被删除的（参见，例如，美国专利5,874,276）。在一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含按附加的纤维素酶占所述组合物的重量计约0.00001%至约10%水平的纤维素酶，而其余部分为按组合物的重量计的清洁助剂材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含按纤维素酶占所述组合物的重量计约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%水平的脂肪酶纤维素酶。
适合用于洗涤剂组合物中的任何甘露聚糖酶也可用于本发明中。适合的甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。在一些实施例中，包括了化学或基因修饰的突变体。可用于本发明中的多种甘露聚糖酶是已知的（参见，例如，美国专利6,566,114、美国专利6,602,842、和美国专利6,440,991，全部这些专利以引用方式并入本文）。在一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含按附加的甘露聚糖酶占所述组合物的重量计约0.00001%至约10%水平的甘露聚糖酶，而其余部分为按组合物的重量计的清洁助剂材料。在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含按甘露聚糖酶占所述组合物的重量计约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%水平的甘露聚糖酶。
在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源（例如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐）联合用于本发明的组合物中。在一些替代性实施例中，氧化酶与氧气联合地被使用。两种类型的酶均被用于“溶液漂白”（即，用于避免当织物在洗涤液体中一起被洗涤时，纺织品染料从染色的织物向其他织物的转移），优选连同增强剂一起（参见，例如，WO94/12621和WO95/01426）。适合的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些。在一些实施例中，包括了化学或基因修饰的突变体。在一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含按附加的过氧化物酶和/或氧化酶占所述组合物的重量计约0.00001%至约10%水平的过氧化物酶和/或氧化酶，而其余部分为按组合物的重量计的清洁助剂材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含按过氧化物酶和/或氧化酶占所述组合物的重量计约0.0001%至约10%、约0.001%至约5%、约0.001%至约2%、约0.005%至约0.5%水平的过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施例中，可使用的附加的酶包括但不限于过水解酶（参见，例如，WO05/056782）。此外，在一些实施例中，本文涵盖了上文提及的酶的混合物，具体地，一种或多种附加的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、和/或至少一种纤维素酶。实际上，预期这些酶的多种混合物将可用于本发明中。还预期所述变体蛋白酶和一种或多种附加的酶的变化的水平均可独立地达到约10%，所述清洁组合物的其余部分是清洁助剂材料。通过考虑待清洁的表面、物品、或织物，以及就使用过程中（例如，通过所述洗涤剂的使用）的清洁条件而言所期望的组合物形式，容易地作出清洁助剂材料的具体选择。
在一些实施例中，有效量的本文提供的一种或多种变体蛋白酶被包括在对于需要移除蛋白质性的污渍的多种表面的清洁有用的组合物中。此类清洁组合物包括用于诸如清洁硬质表面、织物、和餐具的应用的清洁组合物。实际上，在一些实施例中，本发明提供了织物清洁组合物，而在其他实施例中，本发明提供了非织物的清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供了适用于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理（包括牙粉、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物）、皮肤、和毛发清洁组合物。本发明旨在涵盖了任何形式的洗涤剂组合物（即，液体、颗粒状、条棒状、半固体、凝胶、乳液、片剂、胶囊的等）。
以举例的方式，下文更加详细地描述了本发明的变体蛋白酶可用于其中的多种清洁组合物。在本发明的清洁组合物在其中被配制为适合用于洗衣机洗涤方法中的组合物的一些实施例中，本发明的组合物优选地包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗化合物、以及一种或多种清洁助剂材料，所述清洁助剂材料优选地选自有机聚合化合物、漂白剂、附加的酶、泡沫抑制剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮和抗再沉淀剂和腐蚀抑制剂。在一些实施例中，衣物洗涤组合物还包含软化剂（即，作为附加的清洁助剂材料）。本发明的组合物还可以以固体或液体形式用于洗涤剂添加剂产品。此类添加剂产品旨在补充和/增强常规洗涤剂组合物的性能，并可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施例中，本文的衣物洗涤剂组合物的密度的范围是约400至约1200克/升，而在其他实施例中，它的范围是约500至约950克/升组合物，在20℃测量。
在被配制为用于人工盘碟洗涤方法中的组合物的实施例中，本发明的组合物优选的包含至少一种表面活性剂和优选的至少一种附加的清洁助剂材料，所述清洁助剂材料选自有机聚合化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、助水溶物和附加的酶。
在一些实施例中，多种清洁组合物，如美国专利6,605,458中提供的那些，可与本发明的变体蛋白酶一起使用。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是紧密的颗粒状织物清洁组合物，而在其他实施例中，所述组合物是在被染色的织物的洗涤中有用的颗粒状织物清洁组合物，在另外的实施例中，所述组合物是通过洗涤能力提供软化的颗粒状织物清洁组合物，在附加的实施例中，所述组合物是重垢型液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，如美国专利6,610,642和6,376,450中所描述的那些。此外，本发明的变体蛋白酶可用于在欧洲或日本的洗涤条件下特别地具有实用性的颗粒状衣物洗涤剂组合物中（参见，例如，美国专利6,610,642）。
在一些替代性实施例中，本发明提供了包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的硬质表面清洁组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是硬质表面清洁组合物，如美国专利6,610,642、6,376,450、和6,376,450中所描述的那些。
在另外的实施例中，本发明提供了包含至少一种本文提供的变体蛋白酶盘碟洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是硬质表面清洁组合物，如美国专利6,610,642和6,376,450中的那些。在一些另外的实施例中，本发明提供了包含至少一种本文提供的变体蛋白酶盘碟洗涤组合物。在一些其他实施例中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物包括口腔清洁组合物，如美国专利6,376,450、和6,376,450中的那些。前述美国专利6,376,450、6,605,458、6,605,458、和6,610,642中包含的化合物和清洁助剂材料的配方和描述可与本文提供的变体蛋白酶一起使用。
本发明的清洁组合物被配制成任何适宜的形式并且通过配制人员所选的任何方法制备，其非限制性例子描述于美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392、和5,486,303中，这些专利均以引用方式并入本文。当期望低pH清洁组合物时，此类组合物的pH通过诸如单乙醇胺的材料或诸如HCl的酸性材料的添加而被调节。
本文所公开的清洁组合物可用于清洁部位（例如，表面、物品、盘碟、或织物）。典型地，使至少一部分部位与纯态或洗涤液体稀释态的本发明的清洁组合物的实施例相接触，然后任选地洗涤和/或漂洗该部位。为了本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械搅拌。在一些实施例中，所述清洁组合物在溶液中的典型使用浓度为约500ppm至约15,000ppm。当洗涤溶剂为水时，水温典型地在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述部位包括织物时，水与织物的质量比率典型地为约1:1至约30:1。
下文给出了关于适合的清洁和/或处理助剂的更多细节：织物调色剂。尽管掺入附加的织物调色染料不是优选的，除噻吩偶氮染料之外，所述组合物还可包含一种或多种附加的织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土缀合物、和颜料。适合的染料包括与在合成纤维如聚酯和/或尼龙上的沉积相比，更多地沉积在棉纺织品上的那些。另外的适合的染料包括与棉纺织品相比，更多地沉积在合成纤维如聚酯和/或尼龙上的那些。
适宜的染料包括小分子染料和聚合物染料。适宜的小分子染料包括选自下列的小分子染料：属于直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红颜色索引（C.I.）类别的染料、或它们的混合物。小分子染料的例子包括选自下列染料索引（英国染色师学会（Society of Dyers and Colourists），Bradford，UK）成员的那些：直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159、选自下列染料索引（英国染色师学会（Society of Dyers andColourists），Bradford，UK）成员的那些：酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71。Direct Violet（直接紫）小分子染料可以是优选的。选自酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113以及它们的混合物的染料可以是优选的。
适合的聚合物染料包括选自下列的聚合物染料：包含共价键合色原体的聚合物（染料-聚合物缀合物）和具有共聚合到聚合物主链中的色原体的聚合物以及它们的混合物，和选自下列的聚合物染料：以商品名（Milliken，Spartanburg，SouthCarolina，USA）售卖的织物-实体着色剂、由至少一种活性染料和一种聚合物形成的染料-聚合物缀合物，所述聚合物选自：包含选自羟基结构、伯胺结构、仲胺结构、硫醇结构以及它们的混合物的化学结构的聚合物。在另一方面，合适的聚合物染料包括选自下列的聚合物染料：（Milliken，Spartanburg，South Carolina，USA）Violet CT、与活性蓝共轭的羟甲基纤维素（CMC）、活性紫或活性红染料如与C.I.活性蓝19共轭的CMC，由Megazyme，Wicklow，Ireland以产品名AZO-CM-CELLULOSE，产品代码S-ACMC出售、烷氧基化的三苯甲烷聚合着色剂、烷氧基化的噻吩聚合着色剂以及它们的混合物。优选的附加的调色染料包括见于WO08/87497A1中的增白剂。这些增白剂可特征在于以下结构（I）:
其中R1和R2能够独立地选自：a）[(CH2CR′HO)x(CH2CR"HO)yH]，其中R’选自：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、以及它们的混合物；其中R”选自：H、CH2O(CH2CH2O)zH、以及它们的混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z=0至5；
b)R1=烷基、芳基或芳烷基，并且R2=[(CH2CR′HO)x(CH2CR"HO)yH]其中R’选自：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、以及它们的混合物；其中R”选自：H、CH2O(CH2CH2O)zH、以及它们的混合物；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z=0至5
c)R1=[CH2CH(OR3)CH2OR4]并且R2=[CH2CH(O R3)CH2O R4]其中R3选自：H、(CH2CH2O)zH、以及它们的混合物；并且其中z=0至10；
其中R4选自：（C1-C16）烷基、芳基、以及它们的混合物；并且
d)其中R1和R2可独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油基甲基醚、异丁基缩水甘油基醚、异丙基缩水甘油基醚、叔丁基缩水甘油基醚、2-乙基己基缩水甘油基醚和缩水甘油基十六烷基醚的氨基加成产物，接着加成1至10个烯化氧单元。
优选的可被掺入本发明的组合物的附加的织物调色剂可被下列结构表征（II）：
其中R’选自：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、以及它们的混合物；其中R”选自：H、CH2O(CH2CH2O)zH、以及它们的混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z=0至5
另外的优选的附加的调色染料可被下列结构表征（III）：
上述染料通常是具有每分子平均3-10个EO基，优选5个EO基的化合物的混合物。
另外的附加的调色染料是USPN200834511A1（Unilever）中描述的那些。优选的剂是“溶剂紫13”。
适宜的染料粘土共轭物选自：包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土粘土、以及它们的混合物。在另一方面，合适的染料粘土共轭物选自：一种阳离子/碱性染料，它选自C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性褐1至23、CI碱性黑1至11，以及一种粘土，它选自蒙脱石粘土、锂蒙脱石粘土、滑石粉粘土、以及它们的混合物。在另一个方面，适宜的染料粘土共轭物包括选自以下的染料粘土共轭物：蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595共轭的，蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015共轭的，蒙脱石碱性紫V3C.I.42555共轭的，蒙脱石碱性绿G1C.I.42040共轭的，蒙脱石碱性红R1C.I.45160共轭的，蒙脱石C.I.碱性黑2共轭的，锂蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595共轭的，锂蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015共轭的，锂蒙脱石碱性紫V3C.I.42555共轭的，锂蒙脱石碱性绿G1C.I.42040共轭的，锂蒙脱石碱性红R1C.I.45160共轭的，锂蒙脱石C.I.碱性黑2共轭的，皂碱性蓝B7C.I.42595共轭的，皂碱性蓝B9C.I.52015共轭的，皂碱性紫V3C.I.42555共轭的，皂碱性绿G1C.I.42040共轭的，皂碱性红R1C.I.45160共轭的，皂C.I.碱性黑2共轭的以及它们的混合物。
适宜的颜料包括选自下列的颜料：黄烷士酮、蓝蒽酮、包含1至4个氯原子的氯化蓝蒽酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3，4，9，10-四羧酸二酰亚胺酯，其中所述酰亚胺基团可为未取代的或者被C1-C3烷基或苯基或杂环基取代，并且其中苯基和杂环基可另外带有不提供水中溶解度的取代基、吡唑嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二嗪颜料、每个分子可包含最多2个氯原子的铜酞菁、多氯铜酞菁或每个分子包含最多14个溴原子的多溴铜酞菁、以及它们的混合物。尤其优选的是颜料蓝15至20，尤其是颜料蓝15和/或16。其他适合的颜料包括选自下列的那些：群青蓝（C.I.颜料蓝29）、群青紫（C.I.颜料紫15）、以及它们的混合物。适宜的调色剂更详细地描述于US7,208,459B2中。
包封物。所述组合物可包含胶囊包封。在一个方面，包封物包含核心、具有内表面和外表面的外壳，所述外壳包封所述核心。所述核心可包含任何衣物洗涤护理助剂，尽管通常所述核心可包含选自下列的材料：香料；增白剂；染料；驱虫剂；硅氧烷；蜡；风味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂（在一个方面中为石蜡）；酶；抗菌剂；漂白剂；感觉剂；以及它们的混合物；并且所述外壳可包含选自下列的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选地包含其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料（在一个方面中，所述氨基塑料可包括聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯，在一个方面中所述聚脲可包括聚亚甲二羟甲脲和/或三聚氰胺甲醛）；聚烯烃；多糖（在一个方面中所述多糖可包括藻酸酯和/或脱乙酰壳多糖）；明胶；紫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物；水不溶性无机物；硅氧烷；以及它们的混合物。优选的包封物包含香料。优选的包封物包括外壳，其可包含三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。公开了包含核心材料和外壳的优选的包封物，所述外壳至少部分地围绕所述核心材料。所述包封物的至少75%、85%或甚至90%可具有0.2MPa至10MPa的破裂强度，和以总的初始包封的有益剂计0%至20%、或甚至小于10%或5%的有益剂泄漏。优选的是在其中所述包封物的至少75%、85%或甚至90%可具有（i）1微米至80微米、5微米至60微米、10微米至50微米、或甚至15微米至40微米的粒度、和/或（ii）至少75%、85%或甚至90%的所述包封物可具有30nm至250nm、80nm至180nm、或甚至100nm至160nm的颗粒壁厚度的那些。甲醛清除剂可被用于所述包封物，例如，加入胶囊悬浮液中和/或在所述包封物被加入组合物中之前、期间或之后加入此类组合物中。适合的胶囊能够按照USPA2008/0305982A1和/或USPA2009/0247449A1的教导制得。作为另外一种选择，适合的胶囊可购自Appleton，Wisconsin USA的Appleton Papers Inc.。
在一个优选的方面，所述组合物可包含沉积助剂，优选是在包封物之外。优选的沉积助剂选自阳离子和非离子的聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉，阳离子羟乙基纤维素，聚乙烯醇缩甲醛，刺槐豆胶，甘露聚糖，木葡聚糖，罗望子胶，聚对苯二甲酸乙二醇酯和含有甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯的聚合物，任选地具有一种或多种选自丙烯酸和丙烯酰胺的单体。
香料。优选的本发明的组合物包含香料。通常所述组合物包含香料，所述香料包含一种或多种香料原材料，选自WO08/87497中描述的组。然而，在衣物洗涤护理组合物中有用的任何香料均可被使用。将香料掺入本发明的组合物的优选的方法，是通过包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或改性的聚乙烯醇的包封的香料颗粒。在一个方面，所述包封物包含（a）包含一种或多种水溶性羟基化合物的至少部分水溶性的固体基质，优选淀粉；和（b）被固体基质所包封的香料油。在另外的方面，香料可以是与聚胺预先复合的，优选聚乙烯亚胺，以便形成席夫碱。
聚合物。本发明的组合物可包含一种或多种聚合物。例子是任选地改性的羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
所述组合物可包含一种或多种两亲性清洁聚合物，例如具有下列通式结构的化合物：双((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-双((C2H5O)(C2H4O)n)，其中n=20至30，以及x=3至8，或其硫酸化或磺化的变体。在一个方面，这种聚合物是硫酸化或磺化的，以提供两性离子的污垢悬浮聚合物。
所述组合物优选地包含两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物，其具有平衡的亲水性和疏水性，使得它们从织物和表面移除油脂微粒。优选的两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物包括核心结构和多个连接到该核心结构的烷氧基化物基团。这些可包括烷氧基化聚亚烷基亚胺，优选地具有内部的聚环氧乙烷部分和外部的聚环氧丙烷部分。通常这些可以以0.005至10重量%、一般0.5至8重量%的量被掺入本发明的组合物。
烷氧基化聚羧酸酯如由聚丙烯酸酯制得的那些可用于本文中，以提供附加的油脂去除性能。此类物质描述于WO91/08281和PCT90/01815中。化学上，这些材料包含聚丙烯酸酯，其每隔7-8个丙烯酸酯单位具有一个乙氧基侧链。侧链为式-(CH2CH2O)m(CH2)nCH3，其中m为2-3并且n为6-12。所述侧链与聚丙烯酸酯“主链”通过酯键连接以提供“梳型聚合物”结构。分子量可变化，但是通常在约2000至约50,000的范围内。此类烷氧基化聚羧酸酯的含量按本文组合物的重量计为约0.05%至约10%。
助表面活性剂和其他助剂成分的混合物尤其适合与两亲性接枝共聚物一起被使用。优选的两亲性接枝共聚物包含（i）聚乙二醇主链；和（ii）以及至少一个侧基部分，其选自聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、以及它们的混合物。优选的两亲性接枝共聚物是SokalanHP22，购自BASF。适合的聚合物包括无规接枝共聚物，优选为聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。所述聚环氧乙烷主链的分子量优选为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比率为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。通常这些以0.005至10重量%、更通常0.05至8重量%的量被掺入本发明的组合物。所述组合物优选包含一种或多种羧酸酯聚合物，如马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一个方面，所述羧酸酯聚合物是具有4,000Da至9,000Da、或6,000Da至9,000Da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。通常这些以0.005至10重量%、或0.05至8重量%的量被掺入本发明的组合物。
所述组合物优选包含一种或多种去垢性聚合物。例子包括具有下列分子式（IV）、（V）或（VI）之一限定的结构的去垢性聚合物：
（IV）-[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d
（V）-[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e
（VI）-[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f
其中：
a、b和c为1至200；
d、e和f为1至50；
Ar为1，4-取代的亚苯基；
sAr为在5位用SO3Me取代的1，3-取代的亚苯基；
Me为Li、K、Mg/2、Ca/2、Al/3、铵、一烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵，其中烷基为C1-C18烷基或C2-C10羟烷基、或它们的混合物；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H或C1-C18正烷基或异烷基；并且
R7为直链或支链的C1-C18烷基，或直链或支链的C2-C30烯基，或具有5个至9个碳原子的环烷基，或C8-C30芳基，或C6-C30芳烷基。
适宜的去垢性聚合物为聚酯去垢性聚合物如Repel-o-tex聚合物，包括由Rhodia提供的Repel-o-tex SF，SF-2和SRP6。其他适宜的去垢性聚合物包括Texcare聚合物，包括由Clariant提供的Texcare SRA100，SRA300，SRN100，SRN170，SRN240，SRN300和SRN325。其他适宜的去垢性聚合物为Marloquest聚合物，如Sasol提供的Marloquest SL。
所述组合物优选包含一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧甲基纤维素、烷基羧甲基纤维素的那些。优选地，纤维素聚合物选自包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物的组。在一个方面，所述羧甲基纤维素具有0.5至0.9的羧甲基取代度和100,000Da至300,000Da的分子量。
酶。优选地，所述组合物包含一种或多种酶。优选的酶提供清洁性能和/或织物护理有益效果。适宜的酶的例子包括但不限于半纤维素酶，过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶、或它们的混合物。典型的组合是可包含例如与淀粉酶结合的蛋白酶和脂肪酶的酶组合。当存在于所述组合物中时，上述附加酶可以按所述组合物重量计约0.00001%至约2%，约0.0001%至约1%或甚至约0.001%至约0.5%酶蛋白的含量存在。
蛋白酶。优选地，所述组合物包含一种或多种蛋白酶。适合的蛋白酶包括金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，包括中性或碱性微生物丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶（EC3.4.21.62）。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些蛋白酶。在一个方面，此类合适的蛋白酶可源自微生物。适宜的蛋白酶包括化学或基因修饰的上述适宜蛋白酶的突变体。在一个方面，适宜的蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶，如碱性微生物蛋白酶和/或胰蛋白酶型蛋白酶。适宜中性或碱性蛋白酶的例子包括：
(a)枯草杆菌蛋白酶（EC3.4.21.62），包括来源于芽孢杆菌属（Bacillus）的那些，如US6,312,936B1、US5,679,630、US4,760,025、US7,262,042和WO09/021867中所描述的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌（B.alkalophilus）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）和吉氏芽孢杆菌（Bacillusgibsonii）。
(b)胰蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型蛋白酶，如胰蛋白酶（例如源自猪或牛），包括WO89/06270中所述的镰孢属（Fusarium）蛋白酶，以及WO05/052161和WO05/052146中所述的来源于纤维单胞菌属（Cellumonas）的胰凝乳蛋白酶。
(c)金属蛋白酶，包括WO07/044993A2中所述的来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
优选的蛋白酶包括来源于吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）或迟缓芽孢杆菌的那些。
适合的可商购获得的蛋白酶包括以商品名 和由Novozymes A/S（Denmark）出售的那些，以商品名 由Genencor International出售的那些，以商品名和由Solvay Enzymes出售的那些，得自Henkel/Kemira的那些即BLAP（序列示于US5,352,604图29中，具有突变S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文称为BLAP）、BLAP R（具有S3T+V4I+V199M+V205I+L217D的BLAP）、BLAP X（具有S3T+V4I+V205I的BLAP）和BLAP F49（具有S3T+V4I+A194P+V199M+V205I+L217D的BLAP）-均得自Henkel/Kemira；和得自Kao的KAP（具有突变A230V+S256G+S259N的嗜碱芽孢杆菌（Bacillusalkalophilus）枯草杆菌蛋白酶）。
淀粉酶。所述组合物优选可包含淀粉酶。适宜的α-淀粉酶包括源自细菌或真菌的淀粉酶。包括化学或基因修饰的突变体（变体）。优选的碱性α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属（Bacillus）菌株，如地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、或其它芽孢杆菌属（Bacillus sp.），如芽孢杆菌属（Bacillus sp.）NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513、DSM9375（USP7,153,818）、DSM12368、DSMZ no.12649、KSM AP1378（WO97/00324）、KSM K36或KSM K38（EP1,022,334）。优选的淀粉酶包括：
(a)描述于WO94/02597、WO94/18314、WO96/23874和WO97/43424中的变体，尤其是相对于WO96/23874中如SEQ ID No.2所列的酶，在下列一个或多个位置具有取代基的变体:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。
(b)描述于USP5,856,164以及WO99/23211、WO96/23873、WO00/60060和WO06/002643中的变体，尤其是相对于WO06/002643中如SEQ ID No.12所列的AA560酶，在下列位置具有一个或多个取代基的变体：
26、30、33、82、37、106、118、128、133、149、150、160、178、182、186、193、203、214、231、256、257、258、269、270、272、283、295、296、298、299、303、304、305、311、314、315、318、319、339、345、361、378、383、419、421、437、441、444、445、446、447、450、461、471、482、484，优选还包含D183*和G184*缺失的变体。
(c)与WO06/002643中的SEQ ID No.4表现出至少90%同一性的变体，来自芽孢杆菌属（Bacillus）SP722的野生型酶，尤其是在183和184位具有缺失的变体，以及WO00/60060中描述的变体，上述文献以引用方式并入本文。
(d)变体表现出与来自芽孢杆菌属707（Bacillus sp.707）的野生型酶（US6,093,562中的SEQ ID NO:7），尤其是包含一个或多个下列突变：M202、M208、S255、R172、和/或M261的那些，至少95%的同一性。优选地，所述淀粉酶包含M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、M202W、S255N和/或R172Q中的一个或多个。尤其优选的是包含M202L或M202T突变的那些。
(e)WO09/149130中描述的变体，优选表现出与WO09/149130中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus Stearophermophilus）的野生型酶或其截短的版本，至少90%的同一性的那些。
适合的可商购获得的α-淀粉酶包括 和（Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark）、AT9000Biozym Biotech TradingGmbH Wehlistrasse27b A-1200Wien Austria、 和（Genencor International Inc.，Palo Alto，California）和（Kao，14-10Nihonbashi Kayabacho，1-chome，Chuo-ku Tokyo103-8210，Japan）。在一个方面，适合的淀粉酶包括 和STAINZYME以及它们的混合物。
脂肪酶。本发明优选地包括一种或多种脂肪酶，包括“第一循环脂肪酶”如美国专利6,939,702B1和US PA2009/0217464中描述的那些。优选的脂肪酶是第一洗涤脂肪酶。在本发明的一个实施例中，所述组合物包含第一洗涤脂肪酶。第一洗涤脂肪酶包括是具有满足下列的氨基酸序列的多肽的脂肪酶：（a）与来源于柔毛腐质酶（Humicola lanuginosa）菌株DSM4109的野生型脂肪酶具有至少90%的同一性；（b）与所述野生型脂肪酶相比，在具有带正电的氨基酸的E1或Q249的15A内的三维结构的表面包含电中性的或带负电的氨基酸取代；和（c）包含附加在C末端的肽；和/或（d）包含附加在N末端的肽和/或（e）满足下列限制：i）在所述野生型脂肪酶的位置E210包含带负电的氨基酸；ii）在对应于所述野生型脂肪酶的位置90-101的区域中包含带负电的氨基酸；和iii）在对应于所述野生型脂肪酶的N94的位置包含中性或带负电的氨基酸和/或在对应于所述野生型蛋白酶的位置90-101的区域中具有负的或中性的净电荷。优选的是包含T231R和N233R突变中的一个或多个的来自疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的野生型脂肪酶的变体。野生型序列是Swissprot登录号为Swiss-ProtO59952（来源于疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）（柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa）））的269种氨基酸（氨基酸23-291）。优选的脂肪酶将包括以商品名和和出售的那些。
内葡聚糖酶。其他优选的酶包括微生物来源的内葡聚糖酶，其表现出内切-β-1，4-葡聚糖酶活性（E.C.3.2.1.4），包括芽孢杆菌属（Bacillus）成员内源性的细菌多肽（其具有与US7,141,403B2中氨基酸序列SEQ ID NO:2有至少90%、94%、97%和甚至99%的同一性的序列）以及它们的混合物。适宜的内葡聚糖酶以商品名和（Novozymes A/S（Bagsvaerd，Denmark））出售。
果胶裂解酶。其它优选的酶包括以商品名 出售的果胶酸裂合酶和以商品名出售的甘露聚糖酶（均得自Novozymes A/S（Bagsvaerd，Denmark）），和（Genencor International Inc.（Palo Alto，California））。
漂白剂。所述组合物包含一种或多种漂白剂可以是优选的。不同于漂白催化剂的合适漂白剂包括光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成形过酸以及它们的混合物。通常，当使用漂白剂时，本发明的组合物可包含按本发明的组合物的重量计约0.1%至约50%或甚至约0.1%至约25%的漂白剂或漂白剂的混合物。合适漂白剂的例子包括：
(1)光漂白剂，例如磺化酞菁锌、磺化酞菁铝、氧杂蒽染料以及它们的混合物；
(2)预制的过酸：适合的预制的过酸包括但不限于选自预制的过氧酸或其盐的化合物，通常为过羧酸和盐、过碳酸和盐、过碘酸和盐、过氧单硫酸和盐，例如以及它们的混合物。适合的例子包括过氧羧酸或其盐、或过氧磺酸或其盐。适合用于本文中的典型的过氧羧酸盐具有对应于下列化学式的化学结构：
其中：R14选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R14基团能够是直链或支链的、取代或未取代的；当所述过酸是疏水的时，具有6至14个碳原子、或8至12个碳原子，而当所述过酸是亲水的时，具有小于6个碳原子或甚至小于4个碳原子，并且Y是实现电荷中性的任何适合的抗衡离子，Y优选地选自氢、钠或钾。R14优选地为直链或支链的、取代或未取代的C6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、它们的任何一种盐，或它们的任何组合。尤其优选的过氧酸是苯二甲酰亚氨基-过氧-链烷酸，具体地，ε-苯二甲酰亚氨基过氧己酸（PAP）。优选地，过氧酸或其盐具有在30℃至60℃范围内的熔点。
预成形的过氧酸或其盐也可以为过氧磺酸或其盐，通常具有符合以下化学式的化学结构：
其中：R15选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R15基团可以为直链或支链的、取代或未取代的；并且Z为达到电中性的任何适宜的抗衡离子，Z优选选自氢、钠或钾。R15优选地为直链或支链的、取代或未取代的C4-14，优选C6-14烷基。优选地，此类漂白组分可以以0.01至50%、更优选0.1%至20%的量存在于本发明的组合物中。
(3)过氧化氢源，例如无机过氢化合物盐，包括以下碱金属盐如钠盐：过硼酸盐（通常为一水合物或四水合物）、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐以及它们的混合物。在本发明的一个方面，无机过氢化合物盐选自由下列物质组成的组：过硼酸钠盐、过碳酸钠盐以及它们的混合物。当被使用时，无机过氧化氢合物盐通常以占总的清洁和/或处理0.05至40重量%、或1至30重量%的量存在，并且通常以可以是被包被的结晶的盐形式被掺入此类清洁和/或处理中。合适的涂层包括：无机盐如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或它们的混合物，或有机物如水溶性或可分散聚合物、蜡、油或脂肪皂；和
(4)具有R-(C=O)-L的漂白活化剂，其中R为烷基，任选支链烷基，当漂白活化剂疏水时，其具有6至14个碳原子或者8至12个碳原子，而当漂白活化剂亲水时，其具有小于6个碳原子或甚至小于4个碳原子；并且L为离去基团。合适的离去基团的例子为苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。合适的漂白活化剂包括十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸及其盐、3，5，5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺（TAED）和壬酰基氧基苯磺酸盐（NOBS）。合适的漂白活化剂还公开于WO98/17767中。虽然可采用任何适宜的漂白活化剂，但是在本发明的一个方面中，本主题组合物可包含NOBS、TAED、或它们的混合物。
(5)漂白催化剂。本发明的组合物还可包括一种或多种能够从过氧酸和/或其盐接收氧原子并将氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适宜的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子和聚离子；亚胺两性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-膦酰亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮和α氨基酮以及它们的混合物。适合的α氨基酮是，例如，WO2012/000846A1、WO2008/015443A1、和WO2008/014965A1中所描述的。适合的混合物是如USPA2007/0173430A1中所描述的。
不受理论的束缚，发明人相信，以上述方式调节亲电性和疏水性，能够将漂白剂成分基本上仅递送至更疏水并且包含富电污垢的织物区域上，所述富电污垢包含可见发色团，易被高度亲电的氧化剂漂白。
在一个方面，所述漂白催化剂具有对应的以下通式的结构：
其中R13是选自：2-乙基己基、2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基。
(6)所述组合物可优选地包含催化金属复合物。一类优选的含金属的漂白催化剂是这样的催化剂体系，该体系包含具有确定漂白催化活性的过渡金属阳离子，如铜阳离子、铁阳离子、钛阳离子、钌阳离子、钨阳离子、钼阳离子或锰阳离子；包含具有很低的或者没有漂白催化活性的辅助金属阳离子，如锌阳离子或铝阳离子；以及包含对于催化的和辅助的金属阳离子有确定稳定性常数的螯合剂，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐。这种催化剂被公开于U.S.4,430,243中。
如果需要，本发明组合物可借助锰化合物进行催化。上述化合物和用量是本领域熟知的，并且包括例如公开于U.S.5,576,282中的基于锰的催化剂。
可用于本发明的钴漂白催化剂是已知的，并且描述于例如U.S.5,597,936、U.S.5,595,967中。上述钴催化剂易于通过已知的方法制备，例如美国专利5,597,936和5,595,967中所提出的方法。
本文的组合物还可适宜地包含配体的过渡金属配合物，所述配体例如为bispidone（WO05/042532A1）和/或大多环刚性配体（缩写为“MRL”）。作为实施项，而不是作为限制，可调节本文的组合物和方法，使得在含水洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL物质，并且在洗涤液体中将典型地提供约0.005ppm至约25ppm，约0.05ppm至约10ppm，或甚至约0.1ppm至约5ppm的MRL。
本发明过渡金属漂白催化剂中合适的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适宜的MRL包括5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。
通过已知步骤易于制备合适的过渡金属MRL，例如在WO00/32601和U.S.6,225,464中所提出的。
如果存在的话，过氧化氢/过酸和/或漂白活化剂的源通常以按所述清洁和/或处理计约0.1至约60重量%、约0.5至约40重量%、或甚至约0.6至约10重量%的量存在于所述组合物中。一种或多种疏水过酸或其前体可与一种或多种亲水过酸或其前体联合使用。
通常，过氧化氢源和漂白活化剂将一起被掺入。可选择过氧化氢源与过酸或漂白活化剂的量，使得可用氧（来自过氧化物源）与过酸的摩尔比为1∶1至35∶1，或甚至2∶1至10∶1。
表面活性剂。所述组合物优选包含表面活性剂或表面活性剂体系。表面活性剂能够选自非离子的、阳离子的、阴离子的、两性的、两性的、两亲性的、两性离子的、半极性非离子的表面活性剂以及它们的混合物。优选的组合物包含表面活性剂/表面活性剂体系的混合物。优选的表面活性剂体系包含一种或多种阴离子表面活性剂，最优选与助表面活性剂组合，最优选非离子的和/或两性的和/或两性离子的表面活性剂。优选的表面活性剂体系包含阴离子和非离子表面活性剂，优选以90∶1至1∶90的重量比。在一些情况下，至少1∶1的阴离子对非离子表面活性剂的重量比是优选的。然而，低于10∶1的比率可以是优选的。当存在时，总的表面活性剂水平优选为按所述组合物的重量计0.1%至60%、1%至50%或甚至5%至40%。
所述组合物优选包含阴离子去污表面活性剂，优选硫酸盐和/或磺酸盐表面活性剂。优选的例子包括烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐和烷基烷氧基化硫酸盐。优选的磺酸盐是C10-13烷基苯磺酸盐。适宜的烷基苯磺酸盐（LAS）可通过可商购获得的直链烷基苯（LAB）的磺化获得；适宜的LAB包括低级2-苯基LAB，如以商品名由Sasol供应的那些，或以商品名由Petresa供应的那些，其它适宜的LAB包括高级2-苯基LAB，如以商品名由Sasol供应的那些。适宜的阴离子去污表面活性剂是烷基苯磺酸盐，其通过DETAL催化方法获得，然而其它合成途径如HF也是适宜的。在一个方面，使用了LAS的镁盐。
优选的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，通常为C8-18烷基硫酸盐，或主要地为C12烷基硫酸盐。另外的优选的烷基硫酸盐是烷基烷氧基化硫酸盐，优选C8-18烷基烷氧基化硫酸盐。烷氧基化的基团优选地为乙氧基化的基团。通常所述烷基烷氧基化硫酸盐具有0.5至30或20、或0.5至10的平均烷氧基化度。尤其优选的是具有0.5至10、0.5至7、0.5至5或甚至0.5至3的平均乙氧基化度的C8-18烷基乙氧基化硫酸盐。
所述烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的，取代的或未取代的。当表面活性剂是支化的时，所述表面活性剂将优选地包括中链支化的硫酸盐或磺酸盐表面活性剂。支化基团优选包括C1-4烷基基团，通常为甲基和/或乙基基团。
所述组合物优选包含非离子去污表面活性剂。适宜的非离子表面活性剂选自：C8-C18烷基乙氧基化物，如得自Shell的非离子表面活性剂；C6-C12烷基酚烷氧基化物，其中所述烷氧基化单元可以是乙烯氧基单元、丙烯氧基单元、或它们的混合物；C12-C18醇和C6-C12烷基酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，如得自BASF的C14-C22中链支化的醇；C14-C22中链支化的烷基烷氧基化物，通常具有1至30的平均烷氧基化度；烷基多醣，在一个方面，烷基多苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；以及它们的混合物。
合适的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
在一个方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一个方面C8-18烷基烷氧基化醇，例如C8-18烷基乙氧基化醇，所述烷基烷氧基化醇可具有1至80，优选1至50、最优选1至30、1至20、或1至10的平均烷氧基化度。在一个方面，所述烷基烷氧基化醇可以是具有1至10、1至7、更多的1至5或3至7、或甚至低于3或2的平均乙氧基化度的C8-18烷基乙氧基化醇。
所述烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的，并且是取代的或未取代的。
合适的非离子表面活性剂包括以商品名得自BASF的那些。
合适的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季铵化合物、烷基三元锍化合物、以及它们的混合物。
合适的阳离子去污表面活性剂为具有以下通式的季铵化合物：
(R)(R1)(R2)(R3)N+X-
其中，R为直链或支链的、取代或未取代的C6-18烷基或链烯基部分，R1和R2独立地选自甲基或乙基部分，R3为羟基、羟甲基或羟乙基部分，X为提供电中性的阴离子，合适的阴离子包括：卤离子如氯离子；硫酸根；和磺酸根。合适的阳离子去污表面活性剂为单-C6-18烷基单羟乙基二甲基氯化铵。高度适宜的阳离子去污表面活性剂是单-C8-10烷基单-羟乙基双-甲基季铵氯化物，单-C10-12烷基单-羟乙基双-甲基季铵氯化物和单-C10烷基单-羟乙基双-甲基季铵氯化物。
合适的两性/两性离子表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱。
胺中和的阴离子表面活性剂-本发明的阴离子表面活性剂和助剂阴离子助表面活性剂可以以酸的形式存在，并且所述酸的形式可被中和，以形成就在本发明的洗涤剂组合物中使用而言合乎期望的表面活性剂盐。用于中和的典型试剂包括碱性金属抗衡离子如氢氧化物，例如氢氧化钠或氢氧化钾。用于中和本发明的阴离子表面活性剂以及处于它们的酸的形式的助剂阴离子表面活性剂或助表面活性剂包括氨、胺、或链烷醇胺。链烷醇胺是优选的。合适的非限制性例子包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、和本领域中已知的其它直链或支链的链烷醇胺，例如，高度优选的链烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。可部分完成或全部完成胺中和，例如可用钠或钾中和部分阴离子表面活性剂并且可用胺或链烷醇胺中和部分阴离子表面活性剂。
助洗剂。所述组合物优选包含一种或多种助洗剂或助洗剂体系。当使用助洗剂时，本发明的组合物将通常包含至少1%、2%至60%的助洗剂。所述组合物包含低水平的磷酸盐和/或沸石，例如1至10或5重量%可以是优选的。所述组合物可甚至基本上不含强效助洗剂；基本上不含强效助洗剂是指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。
螯合剂。所述组合物优选包含螯合剂和/或晶体生长抑制剂。合适的分子包括铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。合适的分子包括氨基羧酸酯、氨基膦酸酯、琥珀酸酯，它们的盐、以及它们的混合物。本发明使用的合适的螯合剂的非限制性例子包括乙二胺四乙酸盐、N-(羟乙基)乙二胺三乙酸盐、次氮基三乙酸盐、乙二胺四丙酸盐、三亚乙基四胺六乙酸盐、二亚乙基三胺五乙酸盐、乙醇二甘氨酸、乙二胺四亚甲基膦酸盐、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)（DTPMP）、乙二胺二琥珀酸盐（EDDS）、羟基乙烷二膦酸（HEDP）、甲基甘氨酸二乙酸（MGDA）、二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）、它们的盐、以及它们的混合物。用于本发明的螯合剂的其他非限制性例子见于美国专利7445644、7585376和2009/0176684A1中。其他用于本文的合适螯合剂是市售的DEQUEST系列，以及来自Monsanto，DuPont，and Nalco，Inc的螯合剂。
染料转移抑制剂（DTI）。所述组合物可包含一种或多种染料转移抑制剂。在本发明的一个实施例中，本发明人出人意料地发现，在指定的染料之外还包含聚合物的染料转移抑制剂的组合物给出了改善的性能。这是令人吃惊的，因为这些聚合物阻止了染料的沉积。合适的染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基唑烷酮和聚乙烯基咪唑或它们的混合物。适合的例子包括来自Ashland Aqualon的PVP-K15、PVP-K30、ChromaBond S-400、ChromaBond S-403E和Chromabond S-100，和来自BASF的Sokalan HP165、Sokalan HP50、Sokalan HP53、Sokalan HP59、HP56K、HP66。其他适合的DTI如WO2012/004134中所描述的。当存在于受试组合物中时，染料转移抑制剂可以按所述组合物重量计约0.0001%至约10%，约0.01%至约5%或甚至约0.1%至约3%的含量存在。
荧光增白剂。所述组合物优选包含一种或多种荧光增白剂。可用于本发明的商用光学增白剂可分成几亚类，它们包括但不限于二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸、甲基花青、5，5-二氧化硫芴、唑类、5元和6元环杂环衍生物、以及其它杂项剂。尤其优选的增白剂选自：2(4-苯乙烯基-3-磺苯基)-2H-萘酚[1，2-d]三唑钠、4，4′-双二苯乙烯-2-2-二磺酸二钠、4，4′-双二苯乙烯-2-2′二磺酸二钠、和4，4′-双(2-磺基苯乙烯基)联苯。此类增白剂的其他例子公开于由John Wiley&Sons，New York（1982）出版的M.Zahradnik的“The Productionand Application of Fluorescent Brightening Agents”中。用于本组合物的光学增白剂的具体非限制性例子是在美国专利4,790,856和美国专利3,646,015中鉴定的那些。
优选的增白剂具有下列结构：
合适的荧光增白剂含量包括约0.01重量%、约0.05重量%、约0.1重量%、或甚至约0.2重量%的较低含量至0.5重量%或甚至0.75重量%的较高含量。
在一个方面，增白剂可被加载至粘土上，以形成颗粒。
优选的增白剂是完全地或主要地（通常至少50重量%、至少75重量%、至少90重量%、至少99重量%）处在α-结晶形式。高度优选的增白剂包括C.I.荧光增白剂260，优选具有下列结构：
这能够是尤其有用的，因为它在冷水中溶解良好，例如在低于30或25或甚至20℃。
优选地，增白剂以微粉化的微粒形式被掺入所述组合物中，最优选地具有3至30微米、3微米至20微米、或3至10微米的重均原生粒度。
所述组合物可包含β-结晶形式的C.I.荧光增白剂260，并且（i）α-结晶形式的C.I.荧光增白剂260与（ii）β-结晶形式的C.I.荧光增白剂260的重量比可以是至少0.1、或至少0.6。
BE680847涉及制备α-结晶形式的C.I.荧光增白剂260的方法。
硅酸盐。所述组合物可优选地还包含硅酸盐，例如硅酸钠或硅酸钾。所述组合物可包含0重量%至小于10重量%的硅酸盐，至9重量%，或至8重量%，或至7重量%，或至6重量%，或至5重量%，或至4重量%，或至3重量%，或甚至至2重量%，以及优选地高于0重量%，或0.5重量%，或甚至1重量%的硅酸盐。适宜的硅酸盐为硅酸钠。
分散剂。所述组合物可优选地还包含分散剂。合适的水溶性有机物包括均聚或共聚酸或其盐，其中多元羧酸包含至少两个相隔不超过两个碳原子的羧基。
酶稳定剂。所述组合物可优选地包含酶稳定剂。可使用任何常规的酶稳定剂，例如通过钙和/或镁离子的水溶性源在最终的清洁和/或处理（其向酶提供了此类离子）中的存在。就含水的组合物包含蛋白酶的情况而言，可逆的蛋白酶抑制剂，例如硼化合物，包括硼酸盐、或优选地4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸以及它们的衍生物，或诸如甲酸钙、甲酸钠和1,2-丙二醇的化合物，能够被添加，以进一步改善稳定性。
溶剂体系。本发明的组合物中的溶剂体系能够是单独包含水或包含有机溶剂的不含水或优选地含水的混合物的溶剂体系。优选的有机溶剂包括1,2-丙二醇、乙醇、甘油、二丙二醇、甲基丙烷二醇以及它们的混合物。也可使用其它低级醇，C1-C4链烷醇胺，如单乙醇胺和三乙醇胺。可不含溶剂体系，例如本发明的无水固体实施例中可不含溶剂体系，但该溶剂体系的含量更通常在约0.1%至约98%，优选至少约1%至约50%，更通常约5%至约25%的范围内。
在本发明的一些实施例中，所述组合物是处于结构化的液体的形式。此类结构化的液体能够是内部结构化的，从而结构由主要成分（例如表面活性剂物质）形成，和/或能够是通过使用次级成分（例如聚合物、粘土和/或硅酸盐物质）提供三维基质结构而外部结构化的，以用作例如增稠剂。所述组合物可包含结构剂，优选0.01重量%至5重量%，0.1重量%至2.0重量%的结构剂。US2006/0205631A1、US2005/0203213A1、US7294611、US6855680中给出了适合的结构剂的例子。结构剂通常选自甘油二酯和甘油三酯、乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、纤维素基材料、微纤维纤维素、疏水改性的碱溶胀性乳液如Polygel W30（3VSigma）、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、氢化蓖麻油、氢化蓖麻油衍生物如其非乙氧基化的衍生物以及它们的混合物，具体地，选自氢化蓖麻油、氢化蓖麻油衍生物、微纤维纤维素、羟基官能团的结晶性材料、长链脂肪醇、12-羟基硬脂酸、粘土以及它们的混合物。优选的结构剂描述于美国专利6,855,680中，其详细定义了合适的羟基官能团的结晶性材料。优选的是氢化蓖麻油。有用的结构剂的非限制性例子包括。此类结构剂具有有着一系列纵横比的螺纹样结构化体系。其它适宜的结构剂和制备它们的方法描述于WO2010/034736中。
本发明的组合物可包含高熔点脂肪族化合物。可用于本文的高熔点脂肪族化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物以及它们的混合物。不期望将此类低熔点化合物包括在此部分中。高熔点化合物的非限制性例子可见于1993年“International Cosmetic Ingredient Dictionary”第五版；和1992年“CTFACosmetic Ingredient Handbook”第二版中。当存在时，所述高熔点脂肪族化合物优选以按所述组合物的重量计0.1至40%、优选1%至30%、更优选1.5%至16%的含量包括在所述组合物中，就提供改善的调理有益效果，如向湿润发发施用期间的光滑感、在干燥毛发上的柔软性和润湿感而言为1.5%至8%。
阳离子聚合物。本发明的组合物可包含阳离子聚合物。所述组合物中阳离子聚合物的浓度通常在0.05%至3%，在另一个实施例中在0.075%至2.0%，在另一个实施例中在0.1%至1.0%的范围内。在组合物欲使用的pH值下（该pH一般在pH3至pH9范围内，在一个实施例中介于pH4和pH8之间），合适的阳离子聚合物将具有至少0.5meq/gm的阳离子电荷密度，在另一个实施例中至少0.9meq/gm，在另一个实施例中至少1.2meq/gm，在另一个实施例中至少1.5meq/gm，但在一个实施例中，还小于7meq/gm，并且在另一个实施例中小于5meq/gm。本文中聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数与所述聚合物分子量的比率。此类合适的阳离子聚合物的平均分子量通常介于10,000和1千万之间，在一个实施例中，介于50,000和5百万之间，并且在另一个实施例中，介于100,000和3百万之间。
适用于本发明组合物的阳离子聚合物包含含氮阳离子部分，诸如季铵或质子化氨基阳离子部分。可使用任何阴离子抗衡离子来与阳离子聚合物缔合，只要所述聚合物保持可溶于水中、组合物中、或组合物的凝聚层相中，并且只要所述抗衡离子在物理和化学上与所述组合物的基本组分相容，或者不会不适当地损害产品的性能、稳定性或美观性。这样的抗衡离子的非限制性例子包括卤素离子（例如氯离子、氟离子、溴离子、碘离子）、硫酸根和甲酯硫酸根。
上述聚合物的非限制性例子描述于Estrin、Crosley和Haynes编的CTFA CosmeticIngredient Dictionary，第3版，（The Cosmetic，Toiletry，and Fragrance Association，Inc.，Washington，D.C.（1982））。
用于所述组合物的其它适用的阳离子聚合物包括多糖聚合物、阳离子瓜耳胶衍生物、包含四价氮的纤维素醚、合成聚合物、醚化纤维素的共聚物、瓜尔胶和淀粉。当使用时，本文的阳离子聚合物溶于组合物或者溶于组合物中的复合凝聚层相，该凝聚层相是由本文上述的阳离子聚合物与阴离子表面活性剂、两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合聚集体也能与组合物中的其它带电物质形成。
适合的阳离子聚合物描述于美国专利3,962,418；3,958,581；和美国专利公布2007/0207109A1中。
非离子聚合物。本发明的组合物可包括非离子聚合物作为调理剂。分子量大于1000的聚亚烷基二醇可用于本发明。可用的是具有以下通式的那些：
其中R95选自：H、甲基、以及它们的混合物。组合物中可包括调理剂，具体地讲硅氧烷。可用于本发明组合物中的调理剂典型包括水不溶性、水可分散性、非挥发性、可形成乳化液体颗粒的液体。用于组合物的适宜的调理剂是通常特征为硅氧烷（例如硅氧烷油、阳离子硅氧烷、硅橡胶纯胶料、高折射硅氧烷和硅氧烷树脂）、有机调理油（例如烃油、聚烯烃和脂肪族酯）或它们的组合物的那些调理剂，或在本文含水表面活性剂基质中形成液体分散颗粒的那些调理剂。上述调理剂应该在物理和化学上与组合物的基本组分相容，并且不会不适当地破坏产品的稳定性、美观性或性能。
调理剂在组合物中的浓度应足以提供所需的护发有益效果。此类浓度可随调理剂、所期望的调理性能、调理剂颗粒的平均尺寸、其它组分的类型和浓度以及其它类似因素而不同。
硅氧烷调理剂的浓度通常在约0.01%至约10%的范围内。适宜硅氧烷调理剂和硅氧烷的任选悬浮剂的非限制性例子描述于美国重新公布的专利34,584、美国专利5,104,646；5,106,609；4,152,416；2,826,551；3,964,500；4,364,837；6,607,717；6,482,969；5,807,956；5,981,681；6,207,782；7,465,439；7,041,767；7,217,777；美国专利申请2007/0286837A1；2005/0048549A1；2007/0041929A1；英国专利849,433；德国专利DE10036533，它们均以引用方式并入本文；Chemistry and Technology of Silicones，New York:Academic Press（1968）；General Electric Silicone Rubber Product Data SheetsSE30、SE33、SE54和SE76；Silicon Compounds，Petrarch Systems，Inc.（1984）；以及Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，第15卷，第2版，第204-308页，JohnWiley&Sons，Inc.（1989）。
有机调理油。本发明组合物还可包括约0.05%至约3%的至少一种作为调理剂的有机调理油，所述调理油可单独使用，或与其它调理剂如硅氧烷（上文所述）组合使用。适用的调理油包括烃油、聚烯烃和脂肪酯。还适用于本文组合物中的是由Procter&Gamble公司在美国专利5,674,478和5,750,122中所述的调理剂。在美国专利4,529,586、4,507,280、4,663,158、4,197,865、4,217,914、4,381,919和4,422,853中描述的那些调理剂也适用于本文。
卫生剂。本发明的组合物还可包含递送卫生和/或恶臭有益效果的组分，例如一种或多种蓖麻酸锌、百里酚、季铵盐如聚乙烯亚胺（如来自BASF的）及其锌复合物、银和银化合物，尤其是被设计为缓慢释放Ag+或纳米银分散体的那些。
益生菌。所述组合物可包含益生菌，例如WO2009/043709中描述的那些。
增泡剂。如果期望是高度起泡的，所述组合物可优选地包含增泡剂。适合的例子是C10-C16链烷醇酰胺或C10-C14烷基硫酸盐，其优选地以1%-10%的水平掺入。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺是典型的一类这种增泡剂的例子。与高起泡辅助表面活性剂，如以上提到的氧化胺、甜菜碱和磺基甜菜碱一起使用这种增泡剂也是有利的。如果需要，能够以通常0.1%-2%的水平加入水溶性镁和/或钙盐如MgCl2、MgSO4、CaCl2、CaSO4等，以提供附加的泡沫并提高油脂移除性能。
抑泡剂。用于减少或抑制泡沫形成的化合物可被掺入本发明的组合物。泡沫抑制在如美国专利4,489,455和4,489,574所述的所谓的“高浓度清洁过程”中和在前加载式洗衣机中能够是尤其重要的。可使用广泛的材料作为抑泡剂，并且抑泡剂是本领域的技术人员熟知的。参见例如KirkOthmer Encyclopedia of Chemical Technology，第三版，第7卷，第430至447页（John Wiley&Sons，Inc.，1979）。抑泡剂的例子包括单羧脂肪酸及其可溶性盐、高分子量烃类如石蜡、脂肪酸酯（例如脂肪酸甘油三酯）、一元醇的脂肪酸酯、脂族C18-C40酮（例如硬脂酮）、N-烷基化氨基三嗪、优选地具有低于约100℃的熔点的含蜡烃、硅氧烷抑泡剂、和二级醇。抑泡剂在美国专利2,954,347；4,265,779；4,265,779；3,455,839；3,933,672；4,652,392；4,978,471；4,983,316；5,288,431；4,639,489；4,749,740；和4,798,679；4,075,118；欧洲专利申请89307851.9；EP150,872；以及DOS2,124,526中进行了描述。
对于用于自动洗衣机的任何洗涤剂组合物，形成的泡沫不应溢流出洗衣机。当使用时，存在的抑泡剂的量优选为“抑泡量”。“抑泡量”是指所述组合物的配制人员能够选择这种将足以控制泡沫的泡沫控制剂的量而产生在自动洗衣机中使用的低度起泡的衣物洗涤剂。本文的组合物将一般包含0%至10%的抑泡剂。当用作抑泡剂时，存在的单羧脂肪酸及其中的盐的量将通常为按所述洗涤剂组合物的重量计至多5%。优选地，利用0.5%至3%的脂肪族单羧酸盐抑泡剂。硅氧烷抑泡剂通常以按所述洗涤剂组合物的重量计至多2.0%的量被使用，但是可使用更高的量。磷酸单十八烷醇酯抑泡剂一般以按所述组合物的重量计0.1%至2%范围的量被使用。烃抑泡剂通常以0.01%至5.0%范围的量被使用，但是可使用更高的量。醇抑泡剂通常以按所述成品组合物的重量计0.2%-3%被使用。
珠光剂。如WO2011/163457中所述的珠光剂可被掺入本发明的组合物。
香料。所述组合物优选包含香料，优选在0.001至3重量%的范围内，最优选0.1至1重量%。在由CFTA Publications出版的CTFA（Cosmetic,Toiletry and FragranceAssociation）1992International Buyers Guide和由Schnell Publishing Co.出版的OPD1993Chemicals Buyers Directory80周年版本中提供了许多适合的香料的例子。通常有多种香料组分存在于本发明的组合物中，例如四种、五种、六种、七种或更多。在香料混合物中，优选15至25重量%是顶香。顶香是由Poucher（Journal of the Society of CosmeticChemists6（2）:80[1995]）定义的。优选的顶香包括玫瑰红氧化物、柑橘油、乙酸芳樟酯、薰衣草、芳樟醇、二氢月桂烯醇和顺式-3-己醇。
制备和使用清洁组合物的方法
本发明还提供了制备如上文所述的组合物的方法，所述方法包括获取至少一种上文所述的变体和将它与助剂材料或其混合物混合。
本发明的清洁组合物被配制为任何适合的形式，例如固体、粉末、液体、片剂或凝胶，并且所述变体与助剂的混合可通过配制人员所选择的任何适合的方法，（参见，例如，美国专利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392、5,486,303、4,515,705、4,537,706、4,515,707、4,550,862、4,561,998、4,597,898、4,968,451、5,565,145、5,929,022、6,294,514和6,376,445）。
本发明的清洁组合物可以以单位剂量形式被提供，包括片剂、胶囊、小药囊、小袋、和多隔室小袋。在一些实施例中，所述单位剂量形式被设计为提供多隔室小袋（或其他单位剂量形式）中的成分的受控的释放。适合的单位剂量和受控释放形式是本领域中已知的（关于适合在单位剂量和受控释放形式中使用的材料，参见，例如，EP2100949、WO02/102955、美国专利4,765,916和4,972,017、和WO04/111178）。在一些实施例中，所述单位剂量形式通过用水溶性膜或水溶性小袋包裹的片剂提供。用于单位剂量的多种形式提供在EP2100947中，并且是本领域中已知的。在优选的多隔室小袋中，所述蛋白酶变体是在与下列中的一种或多种分隔的隔室中：另外的蛋白酶变体、第一洗涤脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、漂白组分、pH调节剂、织物调色染料、光学增白剂和非离子表面活性剂、或它们的混合物。
使用方法
本发明还提供了处理表面，尤其是织物的方法，包括使所述表面与包含至少一种上文所列的变体和助剂材料的含水液体接触。通常，通过将本发明的组合物添加至水中，所述蛋白酶变体和助剂材料被添加至水中，以形成洗涤液体。将在本发明的方法中被处理的表面可以是任何用于清洁的织物或家居护理表面，如盘碟、衣物、硬质表面、隐形眼镜等。在一些实施例中，所述表面的至少一部分与本发明的清洁组合物的至少一种实施例（处于纯的形式或优选地稀释在洗涤液体中）接触，并且所述表面被洗涤并任选地被清洗。为了本发明的目的，“洗涤”包括但不限于浸泡、擦洗、机械洗涤。在一些实施例中，本发明的清洁组合物以在溶液中约500ppm至约15,000ppm的浓度被使用。在所述洗涤溶剂是水的一些实施例中，水的温度通常是约5℃至90℃范围。
所述清洁组合物可包括自动化盘碟洗涤剂组合物和/或手洗盘碟洗涤剂组合物，并且将被清洁的物品或物体是盘碟或餐具物品。所述清洁组合物可包括衣物洗涤剂组合物（例如，粉末衣物洗涤剂组合物或液体衣物洗涤剂组合物），并且将被清洁的物品是织物物品。在一些其他实施例中，所述清洁组合物是衣物洗涤预处理组合物。所述清洁组合物可包括硬质表面清洁剂。
在一些实施例中，所述清洁组合物以在溶液（例如，含水的洗涤液体）中约500ppm至约15,000ppm的浓度被使用。当所述表面、物品或物体包括织物时，水对织物的质量比通常是约1∶1至约30∶1。
本发明还提供了在洗衣机中清洁衣物或织物物品的方法，所述方法包括提供洗衣机，将足够清洁所述衣物或织物物品的量的包含至少一种本发明的变体枯草杆菌蛋白酶的衣物洗涤剂组合物置于洗衣机中（例如，通过将所述组合物置于洗衣机中适当的或可能的洗涤剂隔室或分配器中），将衣物或织物物品置入洗衣机中，和使洗衣机运行以便清洁所述衣物或织物物品（例如，按照制造商的说明书）。本发明的方法包括本文所述的任何衣物洗涤剂组合物，其包含但不限于至少一种本文提供的任何变体枯草杆菌蛋白酶。
实验
在下列的例子中更详细地描述了本发明，这些例子不旨在以任何方式限制受权利要求书保护的本发明的范围。
在下文实验方面的公开中，使用了下列缩写：PI（性能指数），ppm（份每一百万份）；M（摩尔）；mM（毫摩尔每升）；μM（微摩尔每升）；nM（纳摩尔每升）；mol（摩尔）；mmol（毫摩尔）；μmol（微摩尔）；nmol（纳摩尔）；gm（克）；mg（毫克）；μg（微克）；pg（皮克）；L（升）；ml和mL（毫升）；μl和μL（微升）；cm（厘米）；mm（毫米）；μm（微米）；nm（纳米）；U（单位）；V（伏特）；MW（分子量）；sec（秒）；min（分钟）；h和hr（小时）；℃（摄氏度）；QS（足量的）；ND（未完成）；rpm（转每分钟）；GH（德国硬度）；H2O（水）；dH2O（去离子水）；HCl（盐酸）；aa（氨基酸）；bp（碱基对）；kb（千碱基对）；kD（千道尔顿）；cDNA（拷贝或互补DNA）；DNA（脱氧核糖核酸）；ssDNA（单链DNA）；dsDNA（双链DNA）；dNTP（脱氧核苷三磷酸）；RNA（核糖核酸）；MgCl2（氯化镁）；NaCl（氯化钠）；w/v（重量对体积）；v/v（体积对体积）；w/w（重量对重量）；g（重力）；OD（光密度）；ppm（份每一百万份）；杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）；SOC（2%胰化蛋白胨,0.5%酵母提取物,10mM NaCl,2.5mM KCl）；极品肉汤（TB；12g/l胰化蛋白胨、24g/l甘油、2.31g/lKH2PO4、和12.54g/lK2HPO4）；OD280（280nm的光密度）；OD600（600nm的光密度）；A405（405nm的吸光度）；Vmax（酶催化的反应的最大初速度t）；PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）；PBS（磷酸盐缓冲液[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液,pH7.2]）；PBST（PBS+0.25%-20）；PEG（聚乙二醇）；PCR（聚合酶链式反应）；RT-PCR（逆转录PCR）；SDS（十二烷基硫酸钠）；Tris（三(羟甲基)氨基甲烷）；HEPES（N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙烷磺酸]）；HBS（HEPES缓冲液）；Tris-HCl（三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸）；Tricine（N-[三-(羟甲基)-甲基]-甘氨酸）；CHES（2-(N-环己胺)乙烷-磺酸）；TAPS（3-{[三-(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸）；CAPS（3-(环己胺)-丙烷-磺酸；DMSO（二甲基亚砜）；DTT（1,4-二硫代-DL-苏糖醇）；SA（芥子酸（s,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸）；TCA（三氯乙酸）；Glut和GSH（还原型谷胱甘肽）；GSSG（氧化型谷胱甘肽）；TCEP（三[2-羧乙基]磷化氢）；Ci（居里）；mCi（毫居里）；μCi（微居里）；HPLC（高压液相色谱）；RP-HPLC（反相高压液相色谱）；TLC（薄层色谱）；MALDI-TOF（基质辅助激光解吸/离子化--飞行时间质谱）；Ts（甲苯磺酰基）；Bn（苄基）；Ph（苯基）；Ms（甲磺酰基）；Et（乙烷基）,Me（甲基）；Taq水生栖热菌（Thermus aquaticus）DNA聚合酶）；Klenow（DNA聚合酶I大（Klenow）片段）；EGTA（乙二醇-二(β-氨基乙醚)N,N,N′,N′-四乙酸）；EDTA（乙二胺四乙酸）；bla（β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因）；MJ Research（MJ Research,Reno,NV）；Baseclear（Baseclear BV,Inc.,Leiden,the Netherlands）；PerSeptive（PerSeptive Biosystems,Framingham,MA）；ThermoFinnigan（ThermoFinnigan,San Jose,CA）；Argo（Argo BioAnalytica,MorrisPlains,NJ）；Seitz EKS（SeitzSchenk Filtersystems GmbH,Bad Kreuznach,Germany）；Pall（Pall Corp.,East Hills,NY and Bad Kreuznach,Germany）；Spectrum（SpectrumLaboratories,Dominguez Rancho,CA）；Molecular Structure（Molecular StructureCorp.,Woodlands,TX）；Accelrys（Accelrys,Inc.,San Diego,CA）；Chemical Computing（Chemical Computing Corp.,Montreal,Canada）；New Brunswick（New BrunswickScientific,Co.,Edison,NJ）；CFT（Center for Test Materials,Vlaardingen,theNetherlands）；P&G and Procter&Gamble（Procter&Gamble,Inc.,Cincinnati,OH）；GEHealthcare（GE Healthcare,Chalfont St.Giles,United Kingdom）；DNA2.0（DNA2.0,Menlo Park,CA）；OXOID（Oxoid,Basingstoke,Hampshire,UK）；Megazyme（MegazymeInternational Ireland Ltd.,Bray Business Park,Bray,Co.,Wicklow,Ireland）；Finnzymes（Finnzymes Oy,Espoo,Finland）；Kelco（CP Kelco,Wilmington,DE）；Corning（Corning Life Sciences,Corning,NY）；（NEN（NEN Life Science Products,Boston,MA）；Pharma AS（Pharma AS,Oslo,Norway）；Dynal（Dynal,Oslo,Norway）；Bio-Synthesis（Bio-Synthesis,Lewisville,TX）；ATCC（American Type Culture Collection,Rockville,MD）；Gibco/BRL（Gibco/BRL,Grand Island,NY）；Sigma（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）；Pharmacia（Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ）；NCBI（National Center forBiotechnology Information）；Applied Biosystems（Applied Biosystems,Foster City,CA）；BD Biosciences and/or Clontech（BD Biosciences CLONTECH Laboratories,PaloAlto,CA）；OperonTechnologies（Operon Technologies,Inc.,Alameda,CA）；MWG Biotech（MWG Biotech,High Point,NC）；Oligos Etc（Oligos Etc.Inc,Wilsonville,OR）；Bachem（Bachem Bioscience,Inc.,King of Prussia,PA）；Difco（Difco Laboratories,Detroit,MI）；Mediatech（Mediatech,Herndon,VA；Santa Cruz（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）；Oxoid（Oxoid Inc.,Ogdensburg,NY）；Worthington（WorthingtonBiochemical Corp.,Freehold,NJ）；GIBCO BRL或Gibco BRL（Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD）；Millipore（Millipore,Billerica,MA）；Bio-Rad（Bio-Rad,Hercules,CA）；Invitrogen（Invitrogen Corp.,San Diego,CA）；NEB（New England Biolabs,Beverly,MA）；Sigma（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）；Pierce（PierceBiotechnology,Rockford,IL）；Takara（Takara Bio Inc.Otsu,Japan）；Roche（Hoffmann-La Roche,Basel,Switzerland）；EM Science（EM Science,Gibbstown,NJ）；Qiagen（Qiagen,Inc.,Valencia,CA）；Biodesign（Biodesign Intl.,Saco,Maine）；Aptagen（Aptagen,Inc.,Herndon,VA）；Sorvall（Sorvall brand，来自Kendro LaboratoryProducts,Asheville,NC）；Molecular Devices（Molecular Devices,Corp.,Sunnyvale,CA）；R&D Systems（R&D Systems,Minneapolis,MN）；Siegfried Handel（Siegfried HandelAG,Zofingen,Switzerland）；Stratagene（Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA）；Marsh（Marsh Biosciences,Rochester,NY）；Geneart（Geneart GmbH,Regensburg,Germany）；Bio-Tek（Bio-Tek Instruments,Winooski,VT）；（Biacore（Biacore,Inc.,Piscataway,NJ）；PeproTech（PeproTech,Rocky Hill,NJ）；SynPep（SynPep,Dublin,CA）；New Objective（New Objective brand；Scientific Instrument Services,Inc.,Ringoes,NJ）；Waters（Waters,Inc.,Milford,MA）；Matrix Science（Matrix Science,Boston,MA）；Dionex（Dionex,Corp.,Sunnyvale,CA）；Monsanto（Monsanto Co.,St.Louis,MO）；Wintershall（Wintershall AG,Kassel,Germany）；BASF（BASF Co.,Florham Park,NJ）；Huntsman（Huntsman Petrochemical Corp.,Salt Lake City,UT）；Shell Chemicals（Shell Chemicals,Inc.,London,UK）；Stepan（Stepan,Northfield,IL）；Clariant（Clariant,Sulzbach,Germany）；Industrial Zeolite（Industrial Zeolite Ltd.,Grays,Essex,UK）；Jungbunzlauer（Jungbunzlauer,Basel,Switzerland）；Solvay（Solvay,Brussels,Belgium）；3V Sigma（3V Sigma,Bergamo,Italy）；Innospec（Innospec,Ellesmere Port,UK）；Thermphos（Thermphos,Vlissiggen-Ost,the Netherlands）；CibaSpecialty（Ciba Specialty Chemicals,Basel,Switzerland）；Dow Corning（DowCorning,Barry,UK）；Enichem（Enichem Iberica,Barcelona,Spain）；Fluka Chemie AG（Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland）；Gist-Brocades（Gist-Brocades,NV,Delft,theNetherlands）；Dow Corning（Dow Corning Corp.,Midland,MI）；Mettler-Toledo（Mettler-Toledo Inc,Columbus,OH）；RB（Reckitt-Benckiser,Slough,UK）；和Microsoft（Microsoft,Inc.,Redmond,WA）。
如本文所用，在一些列表中，显示了开头的“0”，以提供针对每一位点的三数字名称（例如，“001”与“1”是相同的，因此“A001C”是与“A1C”相同的）。在一些列表中，没有包括开头的“0”。此外，如本文所用，“X”是指任何氨基酸。
在示例性的本文提供的组合物中，酶的水平是通过以占总的组合物的重量计的纯酶表示的，并且除非另外指明，所述洗涤剂成分是以占总的组合物的重量表示的。缩略组分鉴别的含义如下：
缩写成分
LAS：直链C11-13烷基苯磺酸钠。
NaC16-17HSAS：C16-17高度可溶解的烷基硫酸钠
TAS：牛油烷基硫酸钠。
CxyAS：C1x-C1y烷基硫酸钠。
缩写成分
CxyEz：与平均z摩尔的环氧乙烷缩合的C1x-C1y主要地直链的伯醇。
CxyAEzS：与平均z摩尔的环氧乙烷缩合的C1x-C1y烷基硫酸钠。例子中更多的分子名称。
非离子：混合的乙氧基化的/丙氧基化的脂肪醇，例如，Plurafac LF404是具有3.8的平均乙氧基化度和4.5的平均丙氧基化度的醇。
QAS：具有2=C12-C14的R2.N+(CH3)2(C2H4OH)。
硅酸盐：无定形硅酸钠（SiO2∶Na2O比率=1.6-3.2∶1）。
偏硅酸盐：偏硅酸钠（SiO2∶Na2O比率=1.0）。
沸石A：分子式为Na12(A1O2SiO2)1227H2O的水合铝硅酸盐。
SKS-6：分子式为δ-Na2Si2O5的结晶层状硅酸盐。
硫酸盐：无水硫酸钠。
STPP：三聚磷酸钠。
MA/AA：4∶1的丙烯酸酯/马来酸酯的无规共聚物，平均分子量为约70,000至80,000。
AA：聚丙烯酸钠聚合物，平均分子量为约4,500。
聚羧酸酯：包含羧化的单体的混合物的共聚物，羧化的单体例如具有2,000-80,000之间的分子量的丙烯酸酯、马来酸酯和丙烯酸甲酯，如可从BASF商购获得的Sokolan，它是丙烯酸的共聚物，分子量4,500。
BB1：3-(3,4-二氢异喹啉)丙磺酸盐；
BB21-(3,4-二氢异喹啉)-癸烷-2-硫酸盐
PB1：一水合过硼酸钠
PB4：标称分子式为NaBO3.4H2O的四水合过硼酸钠。
过碳酸盐：标称分子式为2Na2CO3.3H2O2的过碳酸钠。
TAED：四乙酰基乙二胺。
NOBS：壬酰羟苯磺酸钠。
DTPA：亚乙基三胺五醋酸。
HEDP：1,1-羟基乙烷二磷酸。
DETPMP：二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸酯，由Monsanto以商品名Dequest2060销售。
EDDS：其钠盐形式的乙二胺-N,N′-二琥珀酸,（S,S）异构体
二胺：二甲氨基丙胺；1,6-己二胺；1,3-丙二胺；2-甲基-1,5-戊二胺；1,3-戊二胺；1-甲基-二氨基丙烷。
DETBCHD5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6,6,2]十六烷,二氯化物,Mn（II）盐
PAAC：五胺乙酸钴（III）盐。
石蜡：由Wintershall以商品名Winog70销售的石蜡油。
链烷磺酸盐：一些氢原子在其中已被磺酸基团取代的石蜡油或蜡。
醛糖氧化酶：由Novozymes A/S以商品名Aldose Oxidase销售的氧化酶
半乳糖氧化酶：来自Sigma的半乳糖氧化酶
缩写成分
nprE：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中表达的中性金属蛋白酶的重组体形式（参见，例如，WO07/044993）
PMN：来自解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacients）的纯化的中性金属蛋白酶。
淀粉酶：适合的淀粉分解酶，例如WO94/18314、WO96/05295中描述的由Genencor以商品名Ox销售的那些；和DURAMYLTM，全部购自Novozymes A/S。
脂肪酶：适合的脂肪分解酶，如由Novozymes A/S以商品名 Ultra销售的那些和由Gist-Brocades销售的LipomaxTM。
纤维素酶：适合的纤维素分解酶，如由Novozymes A/S以商品名和/或销售的那些。
果胶裂解酶：适合的果胶裂解酶，如可购自Novozymes A/S的以商品名和销售的那些。
PVP：具有60,000的平均分子量的聚乙烯吡咯烷酮
PVNO：聚乙烯吡啶-N-氧化物，具有50,000的平均分子量。
PVPVI：乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物，具有20,000的平均分子量。
增白剂1：4,4′-二(2-磺基苯乙烯基)联苯二钠。
聚硅氧烷消泡剂：以硅氧烷-氧化烯共聚物作为分散剂的聚二甲基硅氧烷泡沫控制剂，具有10∶1至100∶1的所述泡沫控制剂对所述分散剂的比率。
抑泡剂：12%的硅氧烷/二氧化硅、18%的硬脂醇、70%的颗粒形式的淀粉。
SRP1：阴离子封端的聚酯。
PEG X：聚乙二醇，分子量为x。
：乙烯基吡咯烷酮均聚物（平均分子量160,000）
ED-：来自Huntsman的封端的聚乙二醇
2001
AS：来自Enichem的支化的醇烷基硫酸盐
MME PEG：来自Fluka Chemie AG的聚乙二醇单甲醚（分子量2000）。
（2000）
DC3225C：硅氧烷抑泡剂，硅氧烷油和二氧化硅的混合物，购自DowCorning。
TEPAE：四亚乙基五胺乙氧基化物
BTA：苯并三唑。
甜菜碱相关联：(CH3)3N+CH2COO-
糖：工业级D-葡萄糖或食品级糖
CFAA：C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TPKFA：C12-C14拔顶的全切取脂肪酸。
缩写成分
粘土：通式为Al2O3SiO2·xH2O的水合硅酸铝。类型：高岭石、蒙脱石、凹凸棒石、伊利石、膨润土、多水高岭土。
pH：20℃时在1%的蒸馏水溶液中测定。
就北美（NA）和西欧（WE）的重垢洗衣液（HDL）而言，可商购获得的洗涤剂中存在的酶的热灭活通过将预先称重的液体洗涤剂（在玻璃瓶中）置于95℃水浴中2小时进行。用于NA和WE的洗碗机用（ADW）洗涤剂的热灭活的孵育时间为8小时。未经热处理的和经热处理的洗涤剂均在将洗涤剂溶解后5分钟内进行分析，以准确测定灭活百分比。酶活性通过AAPF测定法检测。
就对热灭活的洗涤剂中酶活性的检测而言，洗涤剂的工作液从热灭活的原液制得。适当量的水硬度（例如，6gpg或12gpg）和缓冲液被加入洗涤剂溶液中，以匹配所期望的条件。溶液通过旋涡振荡或颠倒瓶子混合。下文的表A提供了关于一些洗涤剂组合物的信息。在一些实验中，附加的和/或其他的可商购获得的洗涤剂被用于下列的例子中。
表A提供了根据本发明制备的适用于洗涤织物的颗粒状的衣物洗涤剂组合物。
1无规接枝共聚物为聚乙酸乙烯酯接枝的环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。所述聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比率为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。
2聚氮丙啶（MW=600），每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲烷氧基化油脂清洁聚合物为聚氮丙啶（MW=600），每个-NH具有24个乙氧基化基团，并且每个-NH具有16个丙氧基化基团
4具有下列结构的可逆蛋白酶抑制剂：
5乙氧基化的噻吩调色染料描述于US7,208,459B2。
在表A中，所有的酶水平均表示为%酶原料，除了（本发明的）冷水蛋白酶是表示为%添加至产品的活性蛋白质以外。
表B提供了适用于顶部加载式自动洗衣机（洗涤剂组合物7-9）和前加载式洗衣机（洗涤剂组合物10-11）的颗粒状衣物洗涤剂组合物。被测试的GG36蛋白酶变体和/或本发明的冷水蛋白酶被分别地添加至这些制剂中。
在表B中，表面活性剂成分可以从任何适当的供应商获得，包括但不限于BASF（例如，）、Shell Chemicals、Stepan、Huntsman、和Clariant（例如，）。沸石可以从类似Industrial Zeolite的来源获得。柠檬酸和柠檬酸钠可以从类似Jungbunzlauer的来源获得。过碳酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠和碳酸氢三钠可以从类似Solvay的来源获得。丙烯酸盐/马来酸盐共聚物可以从类似BASF的来源获得。羧甲基纤维素和疏水改性的羧甲基纤维素可以从类似CPKelco的来源获得。C.I.荧光增白剂260能够从3V Sigma获得（例如，2M/G、2MG/LTExtra、或Ecobright）。S,S-乙二胺二琥珀酸四钠可以从类似Innospec的来源获得。对苯二甲酸共聚物可以从Clariant获得（例如，REPELOTEX SF2）。此外，1-羟乙烷-1,1-二膦酸可以从Thermphos获得。基于过氧亚胺正离子的漂白增强剂具有下列结构，其中R1=2-丁基辛基，并且依照US2006/0089284A1来制备。
酶 和可以从Novozymes获得。四磺酸酞菁锌可以从CibaSpecialty Chemicals获得（例如，BMC）。抑泡剂颗粒可以从Dow Corning获得。在这些洗涤剂组合物中，无规接枝共聚物为聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。所述聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比率为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。
表C-E提供了适合用于洗衣机的附加的颗粒状洗涤剂组合物（洗涤剂36a-n）。被测试的GG36蛋白酶变体或本发明的冷水蛋白酶被分别地添加至这些制剂中。
关于表C、D、E中的洗涤剂组合物36a–n的说明：
表面活性剂成分可得自BASF（Ludwigshafen，Germany）（）；ShellChemicals（London，UK）；Stepan（Northfield，Illinois，USA）；Huntsman（Huntsman，SaltLake City，Utah，USA）；Clariant（Sulzbach，Germany）
沸石可得自工业沸石（UK）Ltd（Grays，Essex，UK）。
柠檬酸和柠檬酸钠可得自Jungbunzlauer（Basel，Switzerland）。
过碳酸钠，碳酸钠，碳酸氢钠和倍半碳酸钠能得自Solvay，Brussels，Belgium。
丙烯酸酯/马来酸酯共聚物能得自BASF，Ludwigshafen，Germany。
羧甲基纤维素和疏水改性的羧甲基纤维素可得自CPKelco（Arnhem，TheNetherlands）。
C.I.荧光增白剂260可得自3V Sigma，Bergamo，Italy as2M/G，
2MG/LT Extra，或Ecobright.
S,S-乙二胺二琥珀酸四钠可得自Innospec（Ellesmere Port，UK）。
对苯二甲酸共聚物能得自商品名为Repelotex SF2。
1-羟乙烷-1,1-二膦酸可得自Thermphos（Vlissingen-Oost，The Netherlands）。
基于过氧亚胺正离子的漂白增强剂具有下列结构，其中R1=2-丁基辛基，并且依照US2006/0089284A1来制备。
酶和能得自Novozymes，Bagsvaerd，Denmark。
四磺酸酞菁锌能得自Ciba Specialty Chemicals，Basel，Switzerland，如BMC。抑泡剂颗粒可得自Dow Corning（Barry，UK）。
无规接枝共聚物是聚乙烯基乙酸酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和众多聚醋酸乙烯酯侧链。所述聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比率为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。
实例1
测定和测试方法
本实例描述了本发明的开发中使用的多种测试方法和测定法。从协议中提供的任何偏差在相关的实例中指明。
所述测定的进行使用了Biomek FX机器人（Beckman Coulter）或多通道移液器（例如，Rainin PipetLite，Mettler-Toledo）和SpectraMAX MTP阅读器（340型；MolecularDevices）。
A.测试方法
测试方法1
下文提供了用以判断一种染料或颜料材料是否是用于本发明的目的的织物调色剂的方案：
1)将tergotometer洗涤试验仪的两个瓶装满800mL的Newcastle upon Tyne，UK，自来水（总硬度～12格令每美国加仑，由Northumbrian Water，Pity Me，Durham，Co.Durham，UK提供）。
2)将瓶装入到洗涤试验仪中，试验期间水温控制在30℃，搅拌设置在40rpm
3)向每个瓶中加入4.8g IEC-B洗涤剂（IEC60456Washing Machine ReferenceBase Detergent Type B），该洗涤剂由wfk（Brüggen-Bracht，Germany）提供。
4)两分钟后，第一瓶中加入2.0mg活性着色剂。
5)一分钟后，向每个瓶中加入50g平整棉背心（由Warwick Equest，Consett，County Durham，UK提供），该背心被切成5cm×5cm的样品。
6)10分钟后，排干筒罐，并且用冷水（16℃）重新注满，所述水具有14.4英制克拉克的硬度和3∶1的钙与镁摩尔比。
7)漂洗2分钟后，移出织物。
8)使用相同的处理，将步骤3-7再重复三个循环。
9)收集并室内挂干所述织物12小时。
10)使用配有D65光源和UVA截止滤光器的Hunter Miniscan光度计分析样品，以获得Hunter a（红-绿轴）和Hunter b（黄-蓝轴）的值。
11)每套织物计算Hunter a和Hunter b的平均值。如果用着色剂处理的评估织物显示其a轴或b轴上的色调平均差值大于0.2个单位，就认为它是本发明所用的织物调色剂。
测试方法2
对于测试方法2，使用颗粒状洗涤剂组合物10（参见上文的表D）运行了下文提供的BMI微样品测定法。衣物洗涤剂被溶解于具有12gpg的硬度的水中并调节至16℃的温度，添加了所关注的蛋白酶变体酶。然后按照所描述的BMI微样品测定法测定了蛋白酶变体酶的性能。通过将所述蛋白酶变体酶的性能与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌（B.lentus）GG36枯草杆菌蛋白酶的进行比较，确定了性能指数，在所有情况下，酶的剂量是在0.1-5ppm范围。具有1.1或更高的性能指数的蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶。
测试方法3
对于测试方法3，使用颗粒状衣物洗涤剂组合物7（参见上文的表D）运行了下文提供的BMI微样品测定法。衣物洗涤剂被溶解于具有6gpg的硬度的水中并调节至16℃的温度，添加了所关注的GG36蛋白酶变体酶。然后按照所描述的BMI微样品测定法测定了GG36蛋白酶变体酶的性能。通过将所述GG36蛋白酶变体酶的性能与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌（B.lentus）GG36枯草杆菌蛋白酶的进行比较，确定了性能指数，在所有情况下，酶的剂量是在0.1-5ppm范围。具有1.1或更高的性能指数的GG36蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶。
测试方法4
对于测试方法4，使用颗粒状衣物洗涤剂组合物7（参见上文的表D）运行了BMI微样品测定法。衣物洗涤剂被溶解于具有6gpg的硬度的水中并调节至16℃的温度，添加了所关注的GG36蛋白酶变体酶。然后按照所描述的BMI微样品测定法测定了GG36蛋白酶变体酶的性能。通过将所述GG36蛋白酶变体酶的性能与参考酶GG36-A158E的进行比较，确定了性能指数，所述GG36-A158E参考酶由带有谷氨酸在位置158对丙氨酸的单个取代（即，A158E突变）的SEQ ID NO:2的迟缓芽孢杆菌（B.lentus）枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶氨基酸序列序列组成，在所有情况下，酶的剂量是在0.1-5ppm范围。具有1.0或更高的性能指数的GG36蛋白酶变体酶被视为是冷水蛋白酶。
测试方法6
对于测试方法6，使用表1-2中的洗涤剂36a–36n之一运行了BMI微样品测定法。所述洗涤剂溶解在具有表1-2中所指明的硬度的水中并调节温度至16℃。然后按照所描述的BMI微样品分析测定不同的酶的性能。通过将所述变体的性能与SEQ ID NO:2的酶的进行比较，确定了性能指数，在所有情况下，酶的剂量是在0.1-5PPM范围。具有性能指数为1.1或更高的酶被认为是冷水蛋白酶。
测试方法7
对于测试方法7，使用表1中的洗涤剂之一运行了BMI微样品测定法。所述洗涤剂溶解在具有表1中所指明的硬度和缓冲剂的水中并调节温度至16℃或25℃。然后按照所描述的BMI微样品分析测定不同的酶的性能。通过将所述变体的性能与SEQ ID NO:2的酶的进行比较，确定了性能指数，在所有情况下，酶的剂量是在0.1-5ppm范围。具有性能指数为1.1或更高的酶被认为是冷水蛋白酶。
B.测定法
用于蛋白质含量测定的TCA测定法
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）培养物在加湿通风、37℃、250-300rpm震荡下生长2-3天。通过离心和/或过滤，从含酶的培养上清液中去除细胞。使用TCA沉淀测定法测定了蛋白酶/蛋白质/酶的浓度。培养物上清液的等分试样（20-25ul）被转移至包含100μL/孔的0.25NHCl的96孔平底微量滴定板（MTP；Costar9017中等结合透明聚苯乙烯平板）。“基线”读数是通过5秒钟的混合之后在405nm的光散射/吸收读数测定的。100μL/孔的30%（w/v）三氯乙酸（TCA）加入到含HCl的板上，并在室温孵育10分钟以有利于蛋白沉淀。在5秒钟的混合之后，测定了这个“测试”板在405纳米的光散射/吸收。样品中浊度/光散射的增加与培养物上清液中沉淀蛋白质的总量相关。通过从“测试”读数（在加入TCA后获得）中减去“基线”读数（在加入HCl后获得）来计算以提供目前总蛋白的相对量度。对于已知浓度的GG36标准品，测定了关联蛋白质沉淀与蛋白质浓度的转换因子。上述转换因子能够被用于所有的变体，因为沉淀与浓度是线性关系。如果需要，能通过校准TCA读数和与已知比活性的克隆的AAPF蛋白酶测定（见下文）建立标准曲线。然而，就从50至500份每一百万份（ppm）蛋白质（其中1ppm相当于1mg/L）的蛋白质浓度而言，TCA结果是线性的，因此能够直接用其对酶的性能作图，以便选择具有所期望的性能的变体。
AAPF蛋白酶测定法
为了测定所述丝氨酸蛋白酶变体，更具体地，枯草杆菌蛋白酶变体的蛋白酶活性，对N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对-硝基苯胺（suc-AAPF-pNA）的水解进行了测量。所使用的试剂溶液是：100mMTris/HCl，pH8.6，包含0.005%-80（Tris稀释缓冲液）；100mMTris缓冲液，pH8.6，包含1mM CaCl2和0.005%-80（Tris/Ca缓冲液）；和160mM溶于DMSO的suc-AAPF-pNA（suc-AAPF-pNA原液）（Sigma:S-7388）。将1ml suc-AAPF-pNA原液添加至100ml Tris/Ca缓冲液中并充分混合至少10秒，以制备suc-AAPF-pNA工作液。通过将10μl经稀释的蛋白酶溶液添加到96孔MTP的每个孔中，然后立即加入190μl1mg/ml suc-AAPF-pNA工作液进行检测。混合溶液5秒，然后于25℃下，在MTP读取器中以动力学模式（5分钟内25次读数）读取405nm处的吸光度变化。蛋白酶活性表示为AU（活性=ΔOD·min-1ml-1）。
BMI微样品测定（BMI测定）
从Center for Testmaterials BV（Vlaardingen,The Netherlands）获得了96孔微量滴定板（MTP；Corning3641）中的5.5毫米圆直径的预先清洗并穿孔的血液、奶和墨水（BMI）污染的微样品（EMPA116）。
通过就洗涤剂组合物104和105而言在适当水平的水硬度（3:1Ca:Mg.-CaCl2:MgCl2·6H2O）的Milli-Q水中、就表1中所述的洗涤剂组合物101、102、103、106和107而言在pH10.3的2mM碳酸钠缓冲液中，混合至少30分钟，制备了表1中的洗涤剂。离心并过滤了上述洗涤剂以移除沉淀，并在用于在16℃进行的测定之前，在冰上冷却了30分钟。
相对于纯化的GG36的标准品，酶的浓度被平衡至所期望的20-50ppm范围的固定浓度。使用AAPF作为底物，GG36的比活性被用于将基线扣除的TCA值转换为以ppm计的酶浓度。一旦以ppm形式测定了酶浓度，为了获得期望的原液酶浓度，用一个简单公式来计算需要加入到固定的缓冲液体积（300-600μL）中的每种变体的体积：
x=（目标ppm）（vb）/（y-目标ppm）
其中x=酶体积，y=酶浓度，vb=缓冲液体积
带有Versispan8通道臂的Perkin-Elmer Janus机器人用于分配可变体积的酶，使用电导性吸头从源板（用于TCA酶浓度测定的带有合并收获的变体的Axygen半深孔板）转移至填充缓冲液的目的板。样品通过向上和向下移液混合三次。通过测量平衡了的板和与之相比的源板的AAPF活性，验证了酶稀释的准确性，以确认已进行了正确的稀释。
平衡后，5-15μL的酶溶液被加入到填充了洗涤剂的BMI微样品板至终体积为～200μL。在某些情况下，所述酶样品没有经过平衡，相反是全部从原液板相同地稀释的，以提供0.1至5ppm的工作范围。对于每个测试，从剂量反应曲线中测量从超过这个范围的给定洗涤剂的清洁活性来测定优化的目标浓度。
MTP用箔（BIO-RAD）密封并在IEMS培养箱/摇床（Thermo/Labsystems）上孵育15-30分钟，培养箱/摇床预设为16℃，转速1400rpm，放在设定为4℃的冷室中或在25℃的工作台上。之后孵育，120μL的上清液转移至新鲜的MTP（Corning9017）并使用SpectraMax阅读器在600纳米读数。通过从每个数值中减去空白对照（不含酶）得到真实的吸收值读数。
对每个变体计算性能指数（PI）。所述性能指数是在固定的酶浓度下，由变体酶清洁产生的上清液的吸收值和有GG36清洁产生的吸收值的比值。PI值通过将变体的吸收值除以在给定板上的对照的吸收值而计算出来。如果在文库筛选中获得了相同变体的多个版本，则对它们的PI值进行平均，以得到单个代表性的值。通过变体与标准品（例如，GG36）的比较，大于1（PI＞1）的性能指数（PI）表明优异的清洗，而PI为1（PI=1）表明变体的性能与标准品相同，而小于1的PI（PI＜1）表明变体的性能比标准品差。
*（3:1Ca:Mg）浓度为详细的文字。
性能指数
性能指数比较了变体（测量值）和标准品酶（理论值）在相同蛋白质浓度的性能。此外，利用标准品蛋白酶的性能剂量反应曲线的参数，能够计算所述理论值。
实例2
GG36的变体和组合文库的构建
本实例描述了使用pHPLT-GG36枯草芽孢杆菌（B.subtilis）表达质粒在枯草芽孢杆菌（B.subtilis）中构建的GG36变体和文库的冷水清洁。所述枯草芽孢杆菌（B.subtilis）表达质粒包含如下所示的GG36表达盒、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）LAT启动子（Plat）、和来自pUB110的附加的元件（McKenzie等人，Plasmid，15:93-103，1986）包括复制酶基因（reppUB）、新霉素/卡那霉素抗性基因（neo）以及博莱霉素抗性标记（bleo）（美国专利6，566，112中的图4）。WO2011140364中提供了pHPLT-GG36质粒图谱。GG36表达盒序列提供于下文中。
GG36的DNA序列（信号序列以小写字母显示，前肽以小写加下划线的文本表示，GG36成熟序列以大写字母表示）提供如下：
gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaag tagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacg attcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgagctcgatccagcgatttcttatattga agaggatgcagaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAA(SEQ ID NO:3)
GG36的蛋白质序列（信号序列以小写字母显示，前肽以小写加下划线的文本表示，GG36成熟蛋白酶序列以大写字母表示）提供如下：
vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhefet ipvlsvelspedvdaleldpaisyieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQID NO:4).
通过延伸PCR（WO2011140364）、QuickChange诱变（Stratagene）构建了DNA文库和变体，或者在DNA2.0,Inc.或GeneArt合成了它们。pHPLT–GG36质粒被用于GG36变体基因的克隆或用于诱变反应。为了在枯草芽孢杆菌（B.subtilis）中有效地转化所述文库和变体，按照制造商的说明书（GE Healthcare），用Illustra Templiphi kit利用滚环扩增技术扩增了1微升的连接的文库产物或诱变反应物，以产生用于转入枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的多聚体DNA。上述滚环扩增的产物被稀释了100倍，然后被用于转化枯草芽孢杆菌（B.subtilis）细胞（基因型：aprE、ΔnprE、amyE::xylRPxylAcomK-phleo）。转化混合物的一份等分试样被铺于包含1.6%脱脂乳和10μg/mL新霉素的LB平板上，并于37℃孵育过夜。然后，带有色圈的菌落被接种至120μl包含10μg/mL新霉素的Luria肉汤培养基中，用于质粒DNA的提取（QIAprep Spin Miniprep试剂盒，Qiagen）。提取的质粒被测序，以确认所期望的突变的存在。变体在枯草芽孢杆菌（B.subtilis）细胞（基因型：ΔaprE、ΔnprE、amyE::xylRPxylAcomK-phleo）中表达，如实例1中所述（TCA测定法），并使用如实例1中所述的BMI微样品清洁测定法对其进行了进一步表征。在下列的表中，洗涤剂组合物（“洗涤剂”）对应于上文的表1中所示的那些。此外，如文，氨基酸位置按照BPN’编号列出。
本文所公开的量纲和值不应被理解为严格限定于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，每个此类量纲旨在表示所引用的值和围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
Claims (19)
1.一种清洁和/或处理组合物，包含清洁和/或处理助剂材料和分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式并且所述枯草杆菌蛋白酶变体是迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的变体，所述变体与所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少95％的氨基酸同一性并且包含具有选自下列的位置处氨基酸取代组合的氨基酸序列：
T022R+S101G+S103A+V104I+A232V+Q245R，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中对应氨基酸位置的编号来编号，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的取代的存在是根据SEQ ID NO:2所示的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，其中所述分离的枯草杆菌蛋白酶变体的总净电荷相对于所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷是-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4、或-5。
3.根据权利要求2所述的清洁和/或处理组合物，其中所述分离的枯草杆菌蛋白酶变体的总净电荷相对于所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷是0、+1、+2、+3、+4、或+5。
4.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，其中所述变体的总净电荷相对于所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷是+1、0、-1、-2、-3、或-4。
5.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，其中所述变体的总净电荷相对于所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷是0、-1、-2、-3、或-4。
6.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，其中所述分离的枯草杆菌蛋白酶变体的总净电荷通过选自下列的一个或多个取代获得：A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E、或R275H/S。
7.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，其中所述分离的枯草杆菌蛋白酶变体的总净电荷通过选自下列的一个或多个取代获得：A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、S024R/K、G025R、D032I、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/I、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K、或E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V。
8.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，还包含选自下列的至少一种添加物：半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、或它们的任何组合。
9.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，还包含蛋白酶。
10.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，还包含氧化酶。
11.根据权利要求1所述的清洁和/或处理组合物，还包含淀粉酶。
12.一种制备根据前述权利要求中任一项所述的组合物的方法，包括将助剂材料与蛋白酶变体混合。
13.一种处理表面的方法，包括使所述表面与包含根据权利要求1至11中任一项所述的组合物的含水洗涤液体接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述表面为织物。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述含水洗涤液体具有0.1至3mS/cm的电导率。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述含水洗涤液体具有0.3至2.5mS/cm的电导率。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述含水洗涤液体具有高于3并且不超过30mS/cm的电导率。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述含水洗涤液体具有3.5至20mS/cm的电导率。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合物是根据权利要求1所述的组合物。
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