BRPI0915844B1

BRPI0915844B1 - Composição compreendendo um (m)rna complexado e um mrna puro para provisão ou intensificação de uma resposta imunoestimulatória em um mamífero e usos da mesma

Info

Publication number: BRPI0915844B1
Application number: BRPI0915844-8A
Authority: BR
Inventors: Mariola Fotin-Mleczek; Sohnke Voss
Original assignee: Curevac Ag
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2021-07-13
Also published as: RU2545756C2; AU2009300113B2; WO2010037539A1; PT2331129E; US20110250225A1; BRPI0915844A2; HRP20140763T1; JP2014196306A; EP2331129B1; JP5931120B2; CA2730261C; CN102123733A; JP5859853B2; CA2730261A1; WO2010037408A1; SI2331129T1; RU2011116931A; DK2331129T3; AU2009300113A1; US9572874B2

Abstract

COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM (m)RNA COMPLEXADO E UM mRNA PURO PARA PROVISÃO OU INTENSIFICAÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNOESTIMULATÓRIA EM UM MAMÍFERO E USOS DA MESMA. A presente invenção refere-se a uma composição imunoestimulatória compreendendo a) um componente adjuvante, compreendendo ou consistindo em pleo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e b) pelo menos um mRNA livre, de acordo com pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno, alérgeno e/ou intensificar uma inata e, opcionalmente, uma resposta imune adaptativa em um mamífero. A composição imunoestimulatória da invenção pode ser uma composição farmacêutica ou uma vacina. A invenção, além disso, refere-se a um método de preparação da composição imunoestimulatória da invenção. A invenção também refere-se ao uso da composição imunoestimulatória da invenção ou seus componentes (para a preparação de uma composição farmacêutica ou uma vacina) para o tratamento de várias doenças. Finalmente, a invenção refere-se a kits contendo a composição imunoestimulatória da invenção, seus componentes e/ou a composição farmacêutica ou vacina.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma composiçãoimunoestimulatória compreendendo a) um componente adjuvante, compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e b) pelo menos um mRNA livre que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno, alérgeno e/ou anticorpo, no qual a composição imunoestimulatória é capaz de induzir ou intensificar um inato e, opcionalmente, uma resposta imune adaptativa em um mamífero. A composição imunoestimulatória da invenção pode ser uma composição farmacêutica ou uma vacina. A invenção adicionalmente se refere a um método de preparação da composição imunoestimulatória da invenção. A invenção também se refere ao uso da composição imunoestimulatória da invenção ou seus componentes (para a preparação de uma composição farmacêutica ou uma vacina) para o tratamento de várias doenças. Finalmente, a invenção se refere a kits contendo a composição imunoestimulatória da invenção, seus componentes e/ou a composição farmacêutica ou vacina.

[0002] Indução e/ou intensificação de respostas imunes dossistemas imunes inatos e/ou adaptativos desempenham um papel importante no tratamento e prevenção de numerosas doenças. Para tal proposta, o sistema imune é tipicamente modulado por, por exemplo, administração de um agente imunoestimulatório ou um adjuvante. Contudo, o sistema humano de vertebrados tais como humanos é muito complexo e finamente regulado. Ele consiste em muitos tipos de proteínas, células, órgãos, e tecidos, que interagem em uma rede elaborada e dinâmica. O sistema humano tipicamente protege estes organismos de infecção com defesas em camada de especificidade aumentada. Uma camada de defesa compreende barreiras físicas ou químicas e permite uma eliminação a priori de pelo menos algumas patogenias e antígenos. Uma camada adicional de defesa inclui o sistema humano inato e adaptativo.

[0003] O sistema humano inato como parte do sistema humano éo sistema dominante de defesa de hospedeiro em muitos organismos e compreende barreiras tais como barreiras humorais e químicas incluindo, por exemplo, inflamação, o sistema de complemento e barreiras celulares. O sistema humano inato é tipicamente baseado em um número pequeno de receptores, denominados receptores de reconhecimento padrão. Eles reconhecem modelos moleculares conservados que distinguem organismos estranhos, similares a vírus, bactéria, fungo e parasitas de células de seus hospedeiros. Tais modelos moleculares associados à patogenia incluem ácidos nucleicos virais, componentes de paredes bacterianas e fúngicas, proteínas flagelares, e mais.

[0004] A primeira família de receptores de reconhecimento padrãoestudada em detalhe foi a família de receptor similar à Toll-(TLR). TLRs são proteínas de transmembrana que reconhecem ligantes do meio extracelular ou do lúmen de endossomos. Em seguida a ligação de ligante eles transduzem o sinal via proteínas adaptadoras citoplásmicas que conduzem ao disparo de uma resposta de defesa de hospedeiro e determinando produção de peptídeos antimicrobiais, chemoquinas pró-inflamatórias e citoquinas, citoquinas antivirais, etc. (vide, por exemplo, Meylan, E., J. Tschopp, et al. (2006). "Intracellular receptores de reconhecimento padrão in the host response." Nature 442(7098): 39-44). Até aqui, pelo menos 10 membros de receptores similares à Toll (TLRs 1-10) foram identificados em humano e 13 (TLRs 1-13) em camundongos. Aqueles receptores similares à Toll (TLRs) em humano incluem TLR1-TLR2 (ligante conhecido: Triacil lipopeptídeo), TLR1-TLR6 (ligante conhecido: Diacil lipopeptídeo), TLR2 (ligante conhecido: Peptidoglican), TLR3 (ligante conhecido: dsRNA), TLR4 (ligante conhecido: LPS (lipopolissacarídeo) de bacterial Gram-negativa)), TLR5 (ligante conhecido: bacterialflagellin(s)), TLR7/8 (ligantes conhecidos: imidazoquinolinas, análogos de guanosina e ssRNA), TLR9 (ligantes conhecidos: CpG DNA de bactéria, vírus e protozoans e hemozoin de pigmento de malária (produto de digestão de hemoglobina)) e TLR10. Apósreconhecimento de patogenias microbiais, estes TLRs tipicamente disparam trajetórias de sinalização intracelular que resultam em indução de citoquinas inflamatórias (por exemplo, TNF-alfa, IL-6, IL-1- beta e IL-12), interferon tipo I (IFN-beta e múltipla IFN-alfa) e chemokinas (Kawai, T. e S. Akira (2006). "TLR signaling". Cell Death Differ 13(5): 816-25).

[0005] Como parte da resposta imune mais complexa devertebrados, o sistema humano se adapta com o tempo para reconhecer patogenias particulares ou antígenos mais eficientemente. Este processo de adaptação cria memórias imunológicas e permite proteção ainda mais efetiva durante encontros futuros com estas patogenias. Este processo de imunidade adaptativa ou adquirida forma a base para estratégias de vacinação. Em contraste ao sistema humano inato conforme descrito acima, o sistema humano adaptativo é específico de antígeno e requer o reconhecimento de antígenos "auto" específicos ou "não auto" específicos durante um processo denominado apresentação de antígeno. Além disso, células diferentes do sistema humano inato, que reconhecem e respondem a patogenias em um modo genérico, o sistema humano adaptativo confere imunidade de longa duração ou protetora ao hospedeiro e, desse modo, permitem uma resposta mais delineada à patogenias específicas, células infectadas por patogenia ou antígenos. A capacidade de quantificar estas respostas delineadas é mantida no corpo pelas assim denominadas "células de memória". Se um antígeno ou uma patogenia entra/infecta o corpo mais do que uma vez, estas células de memória específicas são usadas para eliminá-los rapidamente. O sistema humano adaptativo desse modo permite uma resposta imune mais forte, bem como uma memória imunológica, nos quais respostas imunes diferentes são possíveis em favor de doenças específicas. Por exemplo, no caso de infecções, cada patogenia é "remembrada" por um antígeno de assinatura, pelo que em caso de antígenos de tumor de doenças de câncer ou autoantígenos podem ser reconhecidos e neutralizados pelo sistema humano adaptativo.

[0006] Os componentes maiores do sistema humano adaptativonos vertebrados incluem predominantemente linfócitos no nível celular e anticorpos no nível molecular. Linfócitos como componentes celulares do sistema humano adaptativo incluem células B e células T que são derivadas de células troncos hematopoiéticas no tutano do osso. As células B são envolvidas na resposta humoral, pelo que as células T são envolvidas na resposta imune mediada por célula. Ambas as células B e células T transportam moléculas receptoras que reconhecem alvos específicos. As células T reconhecem um "não auto" alvo, tal como uma estrutura alvo patogênica, somente após antígenos (por exemplo, fragmentos pequenos de uma patogenia) terem sido processados e apresentados em combinação com um "auto" receptor denominado uma molécula complexa de histocompatibilidade maior (MHC). Em contraste, o receptor específico de antígeno de célula B é uma molécula de anticorpo na superfície de célula B, e reconhece patogenias como tal quando os anticorpos em sua superfície se ligam a um antígeno estranho específico. Este complexo antígeno/anticorpo é levado pela célula B e processado por proteólise em peptídeos. A célula B então revela estes peptídeos antigênicos em suas moléculas de classe II MHC de superfície. Esta combinação de MHC e antígeno atrai uma célula T auxiliadora de equiparação, que libera linfoquinas e ativa a célula B. À medida que a célula B ativada então começa a se dividir, sua descendência secreta milhões de cópias do anticorpo que reconhecem este antígeno. Estes anticorpos circulam no plasma do sangue e linfa, se ligam a patogenias ou células de tumor que expressam o antígeno e os marcam para destruição pela ativação de complemento ou para entrada e destruição por fagócitos. Como um componente celular do sistema humano adaptativo, células T citotóxicas (CD8+) podem também formar uma resposta de CTL. As células T citotóxicas (CD8+) podem reconhecer peptídeos de patogenias endógenas e autoantígenos ligados por moléculas tipo I MHC. Células CD8+-T efetuam sua função de morte por liberação de proteínas citotóxicas na célula.

[0007] Ambos os mecanismos básicos do sistema humano, isto é,o sistema humano inato, bem como o sistema humano adaptativo, podem, desse modo, formar alvos para tratamentos curativos e prevenção de numerosas doenças. Métodos apropriados, que são atualmente conhecidos na técnica, ou utilizam adjuvantes para induzir uma resposta imune inata ou utilizam antígenos, patogenias ou imunogens de modo a evocar uma resposta imune adaptativa, ou, em alguns casos raros, ambos.

[0008] Particularmente, uma resposta imune adaptativa pode serinduzida por administração de células ou de organismo hospedeiro em um antígeno estranho específico conforme descrito acima, ou na forma do peptídeo ou antígenos de proteína ou o antígeno pode ser codificado por um ácido nucleico, por exemplo, um cDNA ou um RNA mensageiro. De modo a induzir uma resposta imune adaptativa suficiente, uma estimulação não específica adicional do sistema humano inato é vantajosa, por exemplo, quando se proporciona um estímulo não específico paralelo ao sinal específico de antígeno. O estímulo não específico paralelo vira o sistema humano em um estado ativado, que aperfeiçoa uma resposta imune adaptativa. Os compostos capazes de proporcionar tal resposta imune não específica são tipicamente denominados "adjuvantes". Um número de compostos e composições foram propostos como adjuvantes na técnica anterior, por exemplo, adjuvante de Freund, óxidos de metal, por exemplo, alum (hidróxido de alumínio), quelatos inorgânicos ou sais dos mesmos, vários óleos similares à parafina, resinas sintéticas, alginatos, mucoides, compostos polissacarídeos, caseinatos, bem como compostos isolados de sangue e/ou coágulos de sangue, tais como, por exemplo, derivados de fibrina, etc. Estes adjuvantes tipicamente podem ser usados em combinação com outros compostos, tais como, por exemplo, proteínas, peptídeos, moléculas de DNA ou RNA ou outros compostos terapeuticamente ativos, dependendo do resultado a ser alcançado.

[0009] Contudo, moléculas de RNA mensageiro livre (mRNA),cDNAs ou ácidos nucleicos em geral, que podem codificar um antígeno específico ou qualquer outra proteína terapeuticamente ativa, adequada para uma terapia específica, tipicamente não mostra propriedades imunoestimulatórias significantes ou mesmo não. Não obstante, tais propriedades imunoestimulatórias podem ser conferidas à molécula de mRNA, ao cDNA ou ao ácido nucleico, quando complexados com um peptídeo ou proteína, tais como protamina ou uma proteína de ligação de ácido nucleico. Neste contexto, a molécula de mRNA ou o ácido nucleico pode ser formulado tal que um complexo é formado entre a molécula de mRNA ou o ácido nucleico e o peptídeo ou proteína, no qual complexos diferentes podem ser formados entre a molécula de mRNA ou o ácido nucleico e o peptídeo ou proteína. Complexos particularmente fortes (adjuvante) podem ocorrer, quando o ácido nucleico, que é usualmente negativamente carregado no pH neutro, é ligado por um peptídeo catiônico ou policatiônico ou proteína.

[00010] Contudo, quando se usa mRNA ou moléculas de ácido nucleico em métodos de vacinação, translações do mRNA ou molécula de ácido nucleico in vivo permanecem o fator mais importante e essencial para indução de uma resposta imune adaptativa, ou para expressão da proteína codificada em geral, por exemplo, no caso de uma proteína terapeuticamente ativa ou peptídeo. Consequentemente, o mRNA complexado ou moléculas de ácido nucleico terão que ser liberados do complexo com o peptídeo (catiônico) ou proteína subsequente à transfecção do complexo nas células para permitir translação eficiente do mRNA. Infelizmente, isto não ocorre em muitos casos. Mais tipicamente, a complexação da molécula de mRNA ou do ácido nucleico com um composto catiônico ou policatiônico pode ainda prevenir o ácido nucleico de translação ou pelo menos reduzir significantemente a taxa de translação in vivo devido a ligação forte do composto policatiônico à molécula de mRNA, cDNA ou molécula de ácido nucleico em geral. Consequentemente, é difícil obter uma boa propriedade imunoestimulatória da composição com relação ao sistema humano inato que toma estes compostos e assegurar em paralelo uma translação eficiente da molécula de mRNA, cDNA ou molécula de ácido nucleico em geral quando se usa tal formulação.

[00011] Uma possibilidade para envolver o problema acima pode ser a administração de um adjuvante e mRNA em formulações separadas. Isto, contudo, torna a administração muito mais complicada. É também preferido que o adjuvante e o mRNA de codificação de antígeno entrem na mesma célula para alcançar uma resposta imune ótima. Além disso, um adjuvante suporta beneficamente a indução de uma resposta imune adaptativa, se ele induz uma resposta imune inata na mesma célula, em que o antígeno é expresso pelo mRNA de codificação.

[00012] Outra possibilidade para envolver o problema acima pode ser a administração exclusiva de mRNA, cDNA ou ácido nucleico. Tal aproximação, embora vantajosa para a proposta de translação eficiente do mRNA, cDNA ou ácido nucleico in vivo, dispensa a ativação vantajosa do sistema humano inato induzido por um adjuvante conforme descrito acima.

[00013] Desse modo, nenhuma destas aproximações é de fato convincente e conduz a uma resposta imune inata paralelada por uma boa translação do mRNA administrado, cDNA ou ácido nucleico. Consequentemente, existe ainda a necessidade na técnica de se proporcionar uma composição imunoestimulatória ou método eficientes, que permitam induzir uma inata e opcionalmente resposta imune adaptativa, no qual a administração não seja prejudicada por uma translação ineficiente do mRNA devido a formação de um complexo com o coparticipante complexo, que confere propriedades imunoestimulatórias ao mRNA. Em outras palavras, é o objetivo da presente invenção proporcionar um método e uma composição imunoestimulatória que permite indução ou intensificação de uma inata e opcionalmente resposta imunoestimulatória adaptativa em um mamífero, assegurando, desse modo, uma propriedade adjuvante eficiente (imunoestimulatória) e uma translação eficiente do mRNA a ser administrado.

[00014] Este objetivo é solucionado pela matéria objeto da presente invenção, preferivelmente pelas reivindicações em anexo. Particularmente, a presente invenção soluciona o objetivo acima por uma composição imunoestimulatória compreendendo a) um componente adjuvante compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e b) pelo menos um mRNA livre que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno, alérgeno e/ou anticorpo, no qual a composição imunoestimulatória é capaz de induzir ou intensificar uma inata e opcionalmente uma resposta imune adaptativa em um mamífero.

[00015] No contexto da presente invenção, um mamífero pode ser selecionado de qualquer mamífero, preferivelmente de um mamífero selecionado do grupo compreendendo, sem ser limitado a estes, por exemplo, cabra, bovino, suíno, cão, gato, burro, macaco, chipanzé, um roedor tais como um camundongo, hamster, coelho, e, em particular, humano.

[00016] A vantagem principal da composição imunoestimulatória da invenção é que uma inata e opcionalmente uma resposta imune adaptativa pode ser eficientemente induzida em um mamífero, no qual a translação do pelo menos um mRNA livre que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, não é prejudicada pelo componente adjuvante, particularmente a complexação do pelo menos um (m)RNA com um composto catiônico ou policatiônico. Isto é particularmente devido ao fato que o componente adjuvante é formado pelo uso de um composto catiônico ou policatiônico para complexação, que tipicamente conduz a um complexo forte entre o RNA e o composto catiônico, que claramente libera o RNA, com o qual ele é complexado. Consequentemente, o mRNA livre é não mais rompido pelo composto catiônico, mesmo embora a administração do componente adjuvante e do mRNA livre juntos em uma formulação também conduza a uma transfecção significantemente aperfeiçoada e expressão in vivo do mRNA livre. A solução de acordo com a presente invenção utiliza a descoberta surpreendente dos inventores da presente invenção, que ambas as propriedades da composição imunoestimulatória, isto é, uma propriedade imunoestimulatória eficiente e uma translação eficiente do RNA, podem ser alcançadas em uma e a mesma formulação, se a formulação per se é preparada em duas etapas separadas. Esta solução é ainda mais convincente visto que ela permite mistura do componente adjuvante com qualquer mRNA livre sem perda de mRNA livre por complexação com o composto catiônico do componente adjuvante. A solução pode ser ainda armazenada por um tempo considerável sem condução a uma reação de equilíbrio entre o RNA complexado e o mRNA livre. Em outras palavras, não existe dissociação do componente adjuvante formado que conduz a uma ligação de mRNA livre pelo composto catiônico do componente adjuvante e para uma liberação de RNA ligado a partir do complexo.

[00017] Como um primeiro componente, a composição imunoestimulatória da invenção compreende um assim denominado "componente adjuvante", compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico.

[00018] O então denominado "componente adjuvante" é preparado de acordo com uma primeira etapa por complexação de pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante com um composto catiônico ou policatiônico em uma proporção específica para formar um complexo estável. Neste contexto, é importante que o composto catiônico ou policatiônico não livre ou somente uma quantidade muito pequena permaneça no componente adjuvante após complexação do (m)RNA. Consequentemente, a proporção do (m)RNA e do composto catiônico ou policatiônico no componente adjuvante é tipicamente selecionada em uma faixa que o (m)RNA é totalmente complexado e composto catiônico ou policatiônico não livre ou somente uma quantidade muito pequena permanece na composição. Preferivelmente a proporção do componente adjuvante, isto é, a proporção do (m)RNA para o composto catiônico ou policatiônico é selecionado de uma faixa de cerca de 6:1 (p/p) a cerca de 0,25:1 (p/p), mais preferivelmente de cerca de 5:1 (p/p) a cerca de 0,5:1 (p/p), ainda mais preferivelmente de cerca de 4:1 (p/p) a cerca de 1:1 (p/p) ou de cerca de 3:1 (p/p) a cerca de 1:1 (p/p), e, mais preferivelmente, a proporção de cerca de 3:1 (p/p) a cerca de 2:1 (p/p).

[00019] Além disso, a proporção do m(RNA) para o composto catiônico ou policatiônico no componente adjuvante pode também ser calculada na base da proporção de nitrogênio/fosfato (proporção de N/P) do complexo de RNA total. Por exemplo, 1 μg de RNA tipicamente contém cerca de 3 nmols de resíduos de fosfato, provido que o RNA exibe uma distribuição estatística de bases. Adicionalmente, 1 μg de peptídeo tipicamente contém cerca de x nmol de resíduos de nitrogênio, dependentes do peso molecular e do número de aminoácidos básicos. Quando exemplarmente calculado para (Arg)g (peso molecular 1424 g/mol, 9 átomos de nitrogênio), 1 μg de (Arg)9 contém cerca de 700 pmols (Arg)g e desse modo 700 x 9=6300 pmols de aminoácidos básicos = 6,3 nmols átomos denitrogênio. Para uma proporção de massa de cerca de 1:1 RNA/(Arg)9 uma proporção de N/P de cerca de 2 pode ser calculada. Quando exemplarmente calculado para protamina (peso molecular de cerca de 4250 g/mol, 21 átomos de nitrogênio, quando protamina de salmão é usada) com uma proporção de massa de cerca de 2:1 com 2 μg de RNA, 6 nmols de fosfato são para serem calculados para o RNA; 1 μg de protamina contém cerca de 235 pmols de moléculas de protamina e, desse modo, 235 x 21 = 4935 pmols de átomos de nitrogêniobásico = 4,9 nmols de átomos de nitrogênio. Para uma proporção de massa de cerca de 2:1 RNA/protamina uma proporção de N/P de cerca de 0,81 pode ser calculada. Para uma proporção de massa de cerca de 8:1 RNA/protamina uma proporção de N/P de cerca de 0,2 pode ser calculada. No contexto da presente invenção, uma proporção de N/P é preferivelmente na faixa de cerca de 0,1-10, preferivelmente em uma faixa de cerca de 0,3-4 e, mais preferivelmente, em uma faixa de cerca de 0,5-2 ou 0,7-2 com relação a proporção de RNA:peptídeo no complexo, e, mais preferivelmente, na faixa de cerca de 0,7-1,5.

[00020] No contexto da presente invenção, um composto catiônico ou policatiônico é preferivelmente selecionado de qualquer composto catiônico ou policatiônico adequado para complexação e, desse modo, estabilização de um ácido nucleico, particularmente o pelo menos um (m)RNA, por exemplo, por associação do pelo menos um (m)RNA com o composto catiônico ou policatiônico. Tal composto catiônico ou policatiônico per se não necessita exibir quaisquer propriedades de adjuvante, visto que uma propriedade de adjuvante, particularmente a capacidade de indução de uma resposta imune inata, é preferivelmente criada sob complexação do pelo menos um (m)RNA com o composto catiônico ou policatiônico. Quando complexação de pelo menos um (m)RNA com o composto catiônico ou policatiônico, o componente adjuvante é formado. Particularmente preferido, peptídeos catiônicos ou policatiônicos ou proteínas como componente P2 podem ser selecionados de protamina, nucleolina, espermina ou espermidina, poli-L-lisina (PLL), polipeptídeos básicos, poli-arginina, peptídeos de penetração de célula (CPPs), CPPs quiméricos, tal como Transportan, ou peptídeos de MPG, peptídeos de ligação de HIV, Tat, HIV-1 Tat (HIV), peptídeos derivados de Tat, oligoargininas, membros da família penetratin, por exemplo, Penetratin, peptídeos derivados de Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, etc., CPPs derivados de antimicrobial, por exemplo, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, peptídeos derivados de hCT, SAP, MAP, KALA, PpTG20, peptídeos ricos em prolina, L- oligômeros, peptídeos ricos em arginina, Calcitonin-peptídeos, FGF, Lactoferrin, poli-L-Lisina, poli-Arginina, histonas, peptídeos derivados ou análogos de VP22, HSV, VP22 (Herpes simplex), MAP, KALA ou domínios de transdução de proteína (PTDs, PpT620, peptídeos ricos em prolina, peptídeos ricos em arginina, peptídeos ricos em lisina, Pep-1, Calcitonin peptídeo(s), etc. Adicionalmente, proteínas catiônicas ou policatiônicas preferidas ou peptídeos podem ser selecionados das seguintes proteínas ou peptídeos tendo a seguinte fórmula total: (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x, no qual I + m + n +o + x = 8-15, e I, m, n ou o independentemente entre si pode ser qualquer número selecionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, provido que o teor total de Arg, Lys, His e Orn representa pelo menos 50% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo; e Xaa pode ser qualquer aminoácido selecionado de aminoácidos nativos (= que ocorrem naturalmente) ou aminoácidos não nativos, exceto de Arg, Lys, His ou Orn; e x pode ser qualquer número selecionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 provido que o teor total de Xaa não excede 50% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo. Oligoargininas particularmente preferidas neste contexto são, por exemplo, Arg?, Argg, Argg, Arg?, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, etc. Compostos catiônicos ou policatiônicos adicionalmente preferidos que podem ser usados para complexação de pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante acima podem incluir polissacarídeos catiônicos, por exemplo, quitosana, polibreno, polímeros catiônicos, por exemplo, poluetilenoimina (PEI), lipídeos catiônicos, por exemplo, DOTMA: [1- (2,3-sioleilóxi)propil)]-N,N,N-trimetilamônia cloreto, DMRIE, di-C14- amidina, DOTIM, SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleil fosfatidiletanol-amina, DOSPA, DODAB,DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecilamidoglicilspermin, DIMRI: Dimiristo-oxipropil dimetil hidroxietil amônia brometo, DOTAP: dioleoilóxi-3-(trimetilamônio)propano, DC-6-14: 0,0-ditetradecanoil-N- (a-trimetilamôniaacetil)dietanolamina cloreto, CLIP1: rac-[(2,3-dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)]-dimetilamônia cloreto, CLIP6: rac- [2(2,3-di-hexadeciloxipropil-oximetiloxi)etil]trimetulamônia, CLIP9: rac- [2(2,3-di-hexadeciloxipropil-oxissucciniloxi)etil]-trimetilamônia, oligofectamina, ou polímeros catiônicos ou policatiônicos, por exemplo, poliaminoácidos modificados, tais como (polímeros 3-aminoácido ou poliamidas reversas, etc., polietilenos modificados, tais como PVP (poli(N-etil-4-vinilpiridinium brometo)), etc., acrilatos modificados, tais como pDMAEMA (poli(metilacrilato de dimetilaminoetila)), etc., Amidoaminas modificadas tal como pAMAM (poli(amidoamina)), etc., polibeta-aminoéster modificado (PBAE), tal como diamina terminal modificada 1,4 butanediol diacrilato-co-5-amino-1-pentanol polímeros, etc., dendrímeros, tais como dendrímeros de polipropilamina ou dendrímeros à base de pAMAM, etc., poli-imina(s), tais como PEI: poli(etilenoimina), poli(propilenoimina), etc., polialilamina, polímeros à base de estrutura de açúcar, tais como polímeros à base de ciclodextrina, polímeros à base de dextrana, quitosana, etc., polímeros à base de silan, tais como copolímeros de PMOXA-PDMS, etc., Polímeros de bloco consistindo em uma combinação de um ou mais blocos catiônicos (por exemplo, selecionados de um polímero catiônico conforme mencionado acima) e de um ou mais blocos hidrofílicos ou hidrofóbicos (por exemplo, polietilenoglicol); etc. Associação ou complexação do (m)RNA modificado da composição imunoestimulatória da invenção com composto catiônico ou policatiônicos preferivelmente proporciona propriedades de adjuvante para o (m)RNA e confere um efeito de estabilização ao (m)RNA do componente adjuvante por complexação. O procedimento para estabilização do (m)RNA modificado é em geral descrito em EP-A- 1083232, a revelação do qual é incorporada por referência na presente invenção em sua totalidade. Particularmente preferidos como compostos catiônicos ou policatiônicos são compostos selecionado de grupo consistindo em protamina, nucleolina, espermina, espermidina, oligoargininas conforme definidos acima, tais como Arg7, Argg, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, etc.

[00021] No contexto da presente invenção, o pelo menos um (m)RNA do "componente adjuvante" da composição imunoestimulatória da invenção pode ser qualquer RNA, preferivelmente, sem ser limitado a, um RNA oligonucleotídeo curto, um RNA de codificação, um RNA imunoestimulatório, um siRNA, um RNA de antissenso, ou "riboswitches", ribozimas ou aptâmeros. Além disso, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante pode ser um RNA de fita simples ou duplo (que pode também ser relacionado como um RNA (molécula) devido a associação não covalente em dois RNAs de fita simples (moléculas)) ou um RNA de fita parcialmente duplo ou parcialmente simples, que são pelo menos parcialmente autocomplementares (ambos destas moléculas de RNA de fita parcialmente dupla ou de fita parcialmente simples são tipicamente formadas por uma molécula de RNA de fita simples mais longa ou mais curta ou por duas moléculas de RNA de fita simples, que são cerca de iguais em comprimento, no qual uma molécula de RNA de fita simples é em parte complementar a outra molécula de RNA de fita simples e ambas, desse modo, formam uma molécula de RNA de fita dupla nesta região, isto é, um RNA de fita parcialmente dupla ou parcialmente simples). Preferivelmente, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante pode ser um RNA de fita simples. Além disso, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante pode ser um RNA circular ou linear, preferivelmente um RNA linear. Mais preferivelmente, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante pode ser um RNA de fita simples (linear). O pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante pode ser um RNA ribossomal (rRNA), um RNA de transferência (tRNA), um RNA mensageiro (mRNA), ou um RNA viral (vRNA), mais preferivelmente um mRNA. A presente invenção permite que todos destes RNAs sejam parte do "componente adjuvante" da composição da invenção, ou sozinha ou em combinação. No contexto da presente invenção, um mRNA é tipicamente um RNA, que é composto de vários elementos estruturais, por exemplo, uma opcional região 5'-UTR, um local de ligação ribossomal à montante posicionado seguida por uma região de codificação, uma opcional região 3'-UTR, que pode ser seguida por uma calda poli-A (e/ou a calda poli-C). Um mRNA pode ocorrer como um mono-, di-, ou ainda multicistrônico RNA, isto é, um RNA que transporta as sequências de codificação de uma, duas ou mais proteínas ou peptídeos. Tais sequências de codificação em di-, ou ainda multicistrônico mRNA podem ser separadas por pelo menos uma sequência de IRES, por exemplo, conforme definido aqui.

[00022] Preferivelmente, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção compreende um comprimento de cerca de 5 a cerca de 20.000, ou 100 a cerca de 20.000 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 250 a cerca de 20.000 nucleotídeos, mais preferivelmente de cerca de 500 a cerca de 10.000, ainda mais preferivelmente de cerca de 500 a cerca de 5.000, mais preferivelmente um comprimento de cerca de 100 a 10.000 nucleotídeos, ou um comprimento de cerca de 100 a 5.000 nucleotídeos.

[00023] De acordo com uma primeira concretização, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser um RNA oligonucleotídeo curto. RNA oligonucleotídeos curtos no contexto da presente invenção podem compreender qualquer RNA conforme definido acima. Preferivelmente, o RNA oligonucleotídeo curto pode ser um RNA oligonucleotídeo de fita simples ou duplo, mais preferivelmente um RNA oligonucleotídeo de fita simples. Ainda mais preferivelmente, o RNA oligonucleotídeo curto pode ser um RNA oligonucleotídeo de fita simples linear. Também preferivelmente, os RNA oligonucleotídeos curtos conforme aqui usados podem compreender um comprimento conforme definido acima em geral para moléculas de RNA, mais preferivelmente um comprimento de 5 a 100, de 5 a 50, ou de 5 de 30, e ainda mais preferivelmente um comprimento de 20 a 100, de 5 a 80, ou de 20 de 60 nucleotídeos.

[00024] De acordo com uma segunda concretização, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser um RNA imunoestimulatório, isto é, um RNA derivado de um RNA imunoestimulatório, que dispara ou aumenta uma resposta imune (inata). Preferivelmente, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser um RNA de fita simples, de fita dupla ou parcialmente de fita dupla ou parcialmente de fita simples, mais preferivelmente um RNA de fita simples, e/ou um RNA circular ou linear, mais preferivelmente um RNA linear. Mais preferivelmente, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante pode ser um RNA (linear) de fita simples. Ainda mais preferivelmente, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante pode ser um UMA mensageiro ((linear) de fita simples) (mRNA). O pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode também ocorrer como um RNA oligonucleotídeo curto conforme definido acima. O pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode além disso ser selecionado de qualquer classe de moléculas de RNA encontradas na natureza ou sendo preparadas sinteticamente, e que podem induzir uma resposta imune inata. Neste contexto, é preferível que o componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção tipicamente induza uma resposta imune inata, pelo que o mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção pode induzir uma resposta imune adaptativa, particularmente se o mRNA livre codifica um antígeno ou alérgeno conforme descrito aqui ou qualquer molécula adicional, que é capaz de induzir uma resposta imune adaptativa. Particularmente, aquelas classes de moléculas de RNA, que podem induzir uma resposta imune inata, podem ser selecionadas de ligantes de receptores similares à Toll (TLRs). O pelo menos um RNA imunoestimulatório do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode, desse modo, compreender qualquer sequência de RNA conhecida para ser imunoestimulatória, incluindo, sem estar limitada a este, sequências de RNA representando e/ou codificando ligantes de TLRs, preferivelmente selecionados de membros de família humana TLR1 - TLR10 ou membros de família murina TLR1 - TLR13, mais preferivelmente de TLR7 e TLR8, ligantes para receptores intracelulares para RNA (tais como RIG-I ou MDA-5, etc.) (vide, por exemplo, Meylan, E., Tschopp, J. (2006). Receptores similares à Toll e RNA helicases: dois modos paralelos de disparar respostas antivirais. Mol. Cell 22, 561-569), ou qualquer outra sequência de RNA imunoestimulatório.

[00025] Tipicamente, o RNA imunoestimulatório usado como um pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode compreender um comprimento conforme definido acima em geral para moléculas de RNA do RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção. Preferivelmente, o RNA pode ter um comprimento de 1000 a 5000, de 500 a 5000, de 5 a 5000, ou de 5 a 1000, 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 ou de 5 a 30 nucleotídeos.

[00026] Tais sequências imunoestimulatórias podem compreender, por exemplo, um ácido nucleico de fórmula (I):GlXmGn,no qual:

[00027] G é guanosina, uracila ou um análogo de guanosina ou uracila;

[00028] X é guanosina, uracila, adenosina, timidina, citosina ou um análogo dos nucleotídeos acima mencionados;

[00029] I é um inteiro de 1 a 40,no qual quando I = 1 G é guanosina ou um análogo da mesma, quando I > 1 pelo menos 50% dos nucleotídeos são guanosina ou um análogo da mesma;

[00030] m é um inteiro e é pelo menos 3;no qual quando m = 3, X é uracila ou um análogo do mesmo,

[00031] quando m > 3, pelo menos 3 uracilas sucessivas ouanálogos de uracila ocorrem;

[00032] n é um inteiro de 1 a 40,no qual quando n = 1, G é guanosina ou um análogo da mesma,

[00033] quando n > 1, pelo menos 50% dos nucleotídeos sãoguanosina ou um análogo da mesma.

[00034] Tais sequências imunoestimulatórias podem tambémcompreender, por exemplo, um ácido nucleico de fórmula (II):ClXmCn,no qual:

[00035] C é citosina, uracila ou um análogo de citosina ou uracila;

[00036] X é guanosina, uracila, adenosina, timidina, citosina ou umanálogo dos nucleotídeos acima mencionados;

[00037] I é um inteiro de 1 a 40,no qual quando I = 1 C é citosina ou um análogo da mesma, quando I > 1 pelo menos 50% do nucleotídeos são citosina ou uma análogo da mesma;

[00038] m é um inteiro e é pelo menos 3;no qual quando m = 3 X é uracilou um análogo da mesma,

[00039] quando m > 3 pelo menos 3 uracilas sucessivas ouanálogos de uracila ocorrem; n é um inteiro de 1 a 40,no qual quando n = 1 C é citosina ou um análogo da mesma,

[00040] quando n > 1 pelo menos 50% dos nucleotídeos sãocitosina ou um análogo da mesma.

[00041] Os ácidos nucleicos de fórmula (I) ou (II), que podem ser usados para o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, são tipicamente moléculas de ácido nucleico relativamente curtas e tipicamente tem um comprimento de aproximadamente de 5 a 100 (mas pode também ser mais longo do que 100 nucleotídeos para concretizações específicas, por exemplo até 200 nucleotídeos), de 5 a 90 ou de 5 a 80 nucleotídeos, preferivelmente um comprimento de aproximadamente de 5 a 70, mais preferivelmente um comprimento de aproximadamente de 8 a 60 e, mais preferivelmente um comprimento de aproximadamente de 15 a 60 nucleotídeos, mais preferivelmente de 20 a 60, mais preferivelmente de 30 a 60 nucleotídeos. Se o ácido nucleico da invenção tem um comprimento máximo de, por exemplo, 100 nucleotídeos, m será tipicamente <=98. O número de nucleotídeos G no ácido nucleico de fórmula (I) é determinado por I ou n. I e n, independentemente entre si, são cada um inteiro de 1 a 40, no qual quando I ou n = 1 G é guanosina ou um análogo da mesma, e quando I ou n > 1 pelo menos 50% dos nucleotídeos são guanosina ou uma análogo da mesma. Por exemplo, sem implicar em qualquer limitação, quando I ou n = 4 G, ou G„ pode ser, por exemplo, uma GUGU, GGUU, UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG ou GGGG, etc.; quando I ou n = 5 Gi ou Gn pode ser, por exemplo, uma GGGUU, GGUGU, GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG, GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG, ou GGGGG, etc.; etc. Um nucleotídeo adjacente a Xm no ácido nucleico de fórmula (I) de acordo com a invenção é preferivelmente não uma uracila. Similarmente, o número de nucleotídeos C no ácido nucleico de fórmula (II) de acordo com a invenção é determinado por I ou n. I e n, independentemente entre si, são cada um inteiro de 1 a 40, no qual quando I ou n = 1 C é citosina ou um análogo da mesma, e quando I ou n > 1 pelo menos 50% dos nucleotídeos são citosina ou umanálogo da mesma. Por exemplo, sem implicar em qualquer limitação, quando I ou n = 4, Q ou Cn pode ser, por exemplo, uma 5 CUCU, CCUU, UCUC, UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC ou CCCC, etc.; quando I ou n = 5 Q ou Cn pode ser, por exemplo, uma CCCUU, CCUCU, CUCCU, UCCCU, UCCUC, UCUCC, UUCCC, CUCUC, CCCCU, CCCUC, CCUCC, CUCCC, UCCCC, ou CCCCC, etc.; etc. Um nucleotídeo adjacente a Xm no ácido nucleico de fórmula (II) de acordo com a invenção é preferivelmente não uma uracila. Preferivelmente, para fórmula (I), quando I ou n > 1, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 100% dos nucleotídeos são guanosina ou um análogo da mesma, conforme definido acima. Os nucleotídeos remanescentes a 100% (quando guanosina constitui menos do que 100% dos nucleotídeos) nas sequências de flanqueamento G, e/ou Gn são uracila ou um análogo do mesmo, conforme definido aqui acima. Também preferivelmente, I e n, independentemente entre si, são cada um inteiro de 2 a 30, mais preferivelmente um inteiro de 2 a 20 e ainda mais preferivelmente um inteiro de 2 a 15. O limite inferior de I ou n pode ser variado se necessário e é pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 2, mais preferivelmente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Esta definição se aplica correspondentemente à fórmula (II).

[00042] De acordo com uma concretização particularmente preferida, um ácido nucleico de acordo com qualquer das fórmulas (I) ou (II) acima, que pode ser usado para o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, pode ser selecionado de uma sequência consistindo ou compreendendo qualquer das seguintes sequências:- GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 1);- GGGGGUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 2);- GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 3);- GUGUGUGUGUGUUUUUUUUUUUUUUUUGUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO: 4);- GGUUGGUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUUGGUUGGUUGGUU (SEQ ID NO: 5); - GGGGGGGGGUUUGGGGGGGG - GGGGGGGGUUUUGGGGGGGG - GGGGGGGUUUUUUGGGGGGG - GGGGGGGUUUUUUUGGGGGG - GGGGGGUUUUUUUUGGGGGG - GGGGGGUUUUUUUUUGGGGG - GGGGGGUUUUUUUUUUGGGG - GGGGGUUUUUUUUUUUGGGG - GGGGGUUUUUUUUUUUGGGG - GGGGUUUUUUUUUUUUUGGG - GGGGÜUUUUUUUUUUUUUGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 17);GuuuuuuuuuuuuuuuuuuG (SEQ ID NO: 18);GGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGGGGGGGGGGGÜUUUGGGGGGGGGGGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGGGGGGGGGGUÜUUUUUGGGGGGGGGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGGGGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGGGGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGGGGGGGGUUUÜUUUUUUUGGGGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG GGGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGGG GGGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGGG GGGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGGG GGGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGGG GGGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGGG GGGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGGG GGGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGGG GGGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGGG GGGGGGUÜUUUUUUUUUUUGGGGG GGGGGGUUUUUUÜUUUUUUUGGGG GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUÜUUUUUUUUÜUUUG (SEQ ID NO: 45);GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 46);GGGUUUUUUÜUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 47);GGGGUUUUUUUUUUUUUUÜUUUUUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 48);GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG (SEQ ID NO: 49);GGGGGGUUUUUÜUUUUUÜUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG (SEQ ID NO: 50);GGGGGGGUUUUUUUUÜUUUUUÜUÜUÜUÜÜUÜUUUÜUUGGGGGG (SEQ ID NO: 51);GGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGG (SEQ ID NO: 52);GGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUÜUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 53);GGUUUGG (SEQ ID NO: 54);GGUΠUUGG (SEQ ID NO: 55);GGUUUUUGG (SEQ ID NO: 56);GGUUUUUUGG (SEQ ID NO: 57);GGUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 58);GGUUUUOTUUGG (SEQ ID NO: 59);GGUDUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 60);GGUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 61);GGUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 62);GGuuuuuuuuuuuuGG (SEQ ID NO: 63);GGUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 64);GGUÜUUUÜÜUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 65);GGUDUUUUUUUUUUUUUGG (SEQ ID NO: 66);GGGUUUGGG (SEQ ID NO: 67);GGGUUUUGGG (SEQ ID NO: 68);GGGUUUUUGGG (SEQ ID NO: 69);GGGUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 70);GGGUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 71);GGGUUUUÜUÜUGGG (SEQ ID NO: 72);GGGUUUGUUUUUGGG (SEQ ID NO: 73);GGGUUÜUUUÜUUUGGG (SEQ ID NO: 74);GGGUUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 75);GGGUuuuuuuuuuuuGGG (SEQ ID NO: 76);GGGUUÜUUUUUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 77);GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO: 78);GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUÜUUUUUUGGG (SEQ ID NO: 79);GGGUUUGGGUUUGGGUUGGGGGUUGGGUUUGGGGUUGGGUUUGGGUUUGGG (SEQ ID NO: 80); ou - cccuuuuuuuuuuuuuuucccuuuuuuuuuuuuuuucccuuuuuuuuuuuuuuuccc (SEQ ID NO: 81)* CCCUUUCCCUUUCCCUÜUCCCÜUÜCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUÜCCC (SEQ ID NO: 82) - CCCUUÜUUUUUUUUUUUUCCCCCCUUUUUUUÜUUUUUUUCCC (SEQ ID NO: 83)ou de uma sequência tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, ou ainda 95% de identidade de sequência com qualquer destas sequências

[00043] Neste contexto, o termo "identidade" no presente pedido significa que as sequências são comparadas em relação a uma sequência de referência e a identidade de percentagem é determinada por comparação das mesmas. Por exemplo, de modo a determinar a identidade de percentagem de duas sequências de ácido nucleico, as sequências podem primeiro ser dispostas relativas uma à outra (alinhamento) de modo a permitir comparação subsequente das sequências. Para esta finalidade, por exemplo, folgas podem ser introduzidas nas sequência da primeira sequência de ácido nucleico e os nucleotídeos podem ser comparados com a posição correspondente da segunda sequência de ácido nucleico. Quando uma posição na primeira sequência de ácido nucleico é ocupada com o mesmo nucleotídeo como em uma posição na segunda sequência, então as duas sequências são idênticas naquela posição. A identidade de percentagem entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas divididas pelas sequências. Se, por exemplo, uma identidade de sequência específica é assumida para um ácido nucleico particular em comparação com um ácido nucleico de referência tendo um comprimento definido, então esta identidade de percentagem é indicada relativamente em relação ao ácido nucleico de referência. Portanto, partindo-se, por exemplo, de uma sequência de ácido nucleico que tem 50% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico de referência tendo um comprimento de 100 nucleotídeos, que sequência de ácido nucleico pode representar uma sequência de ácido nucleico tendo um comprimento de 50 nucleotídeos que é totalmente idêntico com uma seção da sequência de ácido nucleico de referência tendo um comprimento de 50 nucleotídeos. Pode, contudo, também representar uma sequência de ácido nucleico tendo um comprimento de 100 nucleotídeos que tem 50% de identidade, isto é, neste caso ácidos nucleicos 50% idênticos com a sequência de ácido nucleico de referência sobre seu comprimento total. Alternativamente, esta sequência de ácido nucleico pode ser uma sequência de ácido nucleico tendo um comprimento de 200 nucleotídeos que, em uma seção da sequência de ácido nucleico tendo um comprimento de 100 nucleotídeos, é totalmente idêntica com a sequência de ácido nucleico de referência tendo um comprimento de 100 nucleotídeos. Outras sequências de ácido nucleico preenchem naturalmente estes critérios igualmente.

[00044] A determinação da identidade de percentagem de duas sequências pode ser efetuada por meio de um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, mas não limitativo de um algoritmo matemático que pode ser usado para comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Tal algoritmo é integrado no programa NBLAST, com o qual sequências tendo uma identidade desejada com as sequências da presente invenção podem ser identificadas. De modo a obter um alinhamento com folga conforme descrito acima, o programa "Gapped BLAST" pode ser usado, conforme descrito em Altschul et al. (1997), Acid nucleics, 25:3389-3402. Quando se usa programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros de falta do programa particular (por exemplo, NBLAST) podem ser usados. As sequências podem adicionalmente serem alinhadas usando-se versão 9 de GAP (programa de alinhamento global) de "Genetic Computing Group", usando a matriz de falta (BLOSUM62) (valores -4 a +11) com uma penalidade de abertura de folga de -12 (para o primeiro zero de uma folga) e uma penalidade de extensão de folga de -4 (para cada zero sucessivo adicional na folga). Após o alinhamento, a identidade de percentagem é calculada por expressão do número de correspondências como uma percentagem dos ácidos nucleicos na sequência reivindicada. Os métodos descritos para determinação da identidade de percentagem de duas sequências de ácido nucleico podem também ser aplicados correspondentemente às sequências de aminoácido usando-se os programas apropriados.

[00045] Adicionalmente, tais sequências imunoestimulatórias podem também compreender, por exemplo, um ácido nucleico (molécula) de fórmula (III):(NuGXmGnNv)a,no qual:

[00046] G é guanosina (guanina), uridina (uracila) ou um análogo de guanosina (guanina) ou uridina (uracila), preferivelmente guanosina (guanina) ou um análogo da mesma;

[00047] X é guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina), ou um análogo destes nucleotídeos (nucleosídeos), preferivelmente uridina (uracila) ou um análogo da mesma;

[00048] N é uma sequência de ácido nucleico tendo um comprimento de cerca de 4 a 50, preferivelmente de cerca de 4 a 40, mais preferivelmente de cerca de 4 a 30 ou 4 a 20 ácidos nucleicos, cada N independentemente sendo selecionado de guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) ou um análogo destes nucleotídeos (nucleosídeos);

[00049] a é um inteiro de 1 a 20, preferivelmente de 1 a 15, mais preferivelmente de 1 a 10;

[00050] I é um inteiro de 1 a 40,no qual

[00051] quando I = 1, G é guanosina (guanina) ou um análogo da mesma,

[00052] quando I > 1, pelo menos 50% destes nucleotídeos(nucleosídeos) são guanosina (guanina) ou um análogo da mesma;

[00053] m é um inteiro e é pelo menos 3;no qual

[00054] quando m = 3, X é uridina (uracila) ou um análogo da mesma, e

[00055] quando m > 3, pelo menos 3 sucessivas uridinas (uracilas) ou análogos de uridina (uracila) ocorrem;

[00056] n é um inteiro de 1 a 40,

[00057] no qual

[00058] quando n = 1, G é guanosina (guanina) ou um análogo da mesma,

[00059] quando n > 1, pelo menos 50% destes nucleotídeos(nucleosídeos) são guanosina (guanina) ou um análogo da mesma;

[00060] u,v pode ser independentemente entre si um inteiro de 0 a 50, preferivelmente no qual quando u = 0, v > 1, ou quando v = 0, u > 1 ; no qual a sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (III) tem um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 150 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente de pelo menos 200 nucleotídeos e mais preferivelmente de pelo menos 250 nucleotídeos.

[00061] A estrutura (NuGXmGnNv)a de fórmula (III) de acordo com a presente invenção compreende o elemento GXmGn como uma estrutura de núcleo, que é preferivelmente conforme definido acima, e adicionalmente os elementos de borda Nu e/ou Nv, no qual o elemento total NuGXmGnNv pode ocorrer repetidamente, isto é, pelo menos uma vez, conforme determinado pelo inteiro a. Conforme surpreendentemente verificado pelos inventores uma molécula de acordo com fórmula (III), isto é, tendo a estrutura (NuGiXmGnNv)a conforme definida acima, conduz a uma resposta imune inata aumentada em um paciente, que é particularmente indicada por um aumento de liberação de IFNalfa, quando comparado a administração da estrutura de núcleo GXmGn como tal. Além disso, uma molécula compreendendo a estrutura de núcleo acima GXmGn pode ser amplificada em organismos bacteriais com um rendimento significantemente melhor, quando ele é limitado por um elemento repetitivo Nu e/ou Nv conforme definido na fórmula (III). Este desenho de molécula é particularmente vantajoso quando se prepara uma molécula de acordo com a estrutura (NuGXmGnNv)a de fórmula (III) conforme definido acima pelo uso de métodos de transcrição in vitro ao invés de métodos de síntese de fase sólida conforme conhecido na técnica, que são tipicamente limitados a um tamanho específico de ácidos nucleicos.

[00062] A estrutura de núcleo GXmGn de fórmula (III) é definidamais proximamente no seguinte:

[00063] G na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e defórmula (I) e (II)) é um nucleotídeo ou desoxinucleotídeo ou compreende um nucleosídeo, no qual o nucleotídeo (nucleosídeo) é guanosina (guanina) ou uridina (uracila) ou um análogo destes, mais preferivelmente guanosina (guanina) ou um análogo dos mesmos. Neste particular, guanosina (guanina) ou uridina (uracila) nucleotídeo (nucleosídeo) análogos são definidos como variantes que ocorrem não nativamente dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente (nucleosídeo) guanosina (guanina) e uridina (uracila). Consequentemente, guanosina (guanina) ou uridina (uracila) análogos são tipicamente nucleotídeos quimicamente derivatizados (nucleosídeo) com grupos funcionais que ocorrem não nativamente ou componentes, que são preferivelmente adicionados a, modificados ou anulados guanosina que ocorre naturalmente (guanina) ou uridina (uracila) nucleotídeo ou que substitui os grupos funcionais que ocorrem naturalmente ou componentes de uma guanosina que ocorre naturalmente (guanina) ou uridina (uracila) nucleotídeo. Consequentemente, cada grupo funcional ou componente da guanosina que ocorre naturalmente (guanina) ou uridina (uracila) nucleotídeo pode ser modificado ou anulado destes, a saber o componente de base, o componente de açúcar (ribose), qualquer grupo lateral funcional que ocorre naturalmente e/ou o componente de fosfato que forma a estrutura do oligonucleotídeo. As porções de fosfato podem ser substituídas por, por exemplo, fosforamidatos, fosforotioatos, peptídeo nucleotídeos, metilfosfonatos, etc., contudo, estruturas de fosfodiéster que ocorrem naturalmente ainda sendo preferidos no contexto da presente invenção. Adicionalmente, o componente de açúcar (ribose) é selecionado de uma desoxirribose, particularmente o ácido nucleico é um RNA conforme definido acima, no qual o componente de açúcar (ribose) é selecionado de uma desoxirribose.

[00064] Consequentemente, análogos de guanosina (guanina) ou uridina (uracila) incluem, sem implicação de qualquer limitação, qualquer guanosina que ocorre naturalmente ou que ocorre não naturalmente (guanina) ou uridina (uracila) que foi alterada quimicamente, por exemplo, por acilação, metilação, hidroxilação, etc., incluindo, por exemplo, 1-metil-guanosina (guanina), 2-metil-guanosina (guanina), 2,2-dimetil-guanosina (guanina), 7-metil-guanosina (guanina), di-hidro-uridina (uracil), 4-tio-uridina (uracila), 5- carboximetilaminometil-2-tio-uridina (uracila), 5-(carbóxi-hidroxilmetil)- uridina (uracila), 5-fluoro-uridina (uracila), 5-bromo-uridina (uracila), 5-carboximetilaminometil-uridina (uracila), 5-metil-2-tio-uridina(uracila), N-uridina (uracil)-5-ácido oxiacético metil éster, 5- metilaminometil-uridina (uracila), 5-metoxiaminometil-2-tio-uridina (uracil), 5'-metoxicarbonilmetil-uridina (uracila), 5-metoxiuridina (uracila), uridina (uracila)-5-ácido oxiacético metil éster, uridina (uracila)-5-ácido oxiacético (v). As preparações de tais análogos são conhecidas a um versado na técnica, por exemplo, das Patentes dos Estados Unidos 4.373.071. US 4.401.796. US 4.415.732. US 4.458.066. US 4.500.707. US 4.668.777. US 4.973.679. US 5.047.524. US 5.132.418. US 5.153.319. US 5.262.530 e 5.700.642, as descrições das quais são incorporadas por referência aqui em sua totalidade. No caso de um análogo conforme descrito acima, preferência é dada especialmente àqueles análogos que aumentam a imunogenicidade da molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) e/ou não interferem com uma modificação adicional que foi introduzida. Pelo menos uma guanosina (guanina) ou uridina (uracila) ou um análogo da mesma pode ocorrer nos elementos de estrutura de núcleo GI e/ou Gn, opcionalmente pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90% ou ainda 100% dos nucleotídeos dos elementos de estrutura de núcleo GI e/ou Gn são uma guanosina que ocorre naturalmente (guanina), uma uridina que ocorre naturalmente (uracila), e/ou um análogo da mesma e/ou exibem propriedades de um análogo deste conforme definido aqui. Preferivelmente, o elemento de estrutura de núcleo GI e/ou Gn contém pelo menos um análogo de uma guanosina que ocorre naturalmente (guanina) e/ou uma uridina que ocorre naturalmente (uracila) no todo. Mais preferivelmente, todos os nucleotídeos (nucleosídeos) destes elementos de estrutura de núcleo GI e/ou Gn são análogos, que podem - mais preferivelmente - serem análogos idênticas para o mesmo tipo de nucleotídeos (nucleosídeos) (por exemplo, toda guanosina (guanina) nucleotídeos são providos como 1-metil-guanosina (guanina)) ou eles podem ser distintos (por exemplo pelo menos dois análogos de guanosina diferentes substituem a guanosina nucleotídeo que ocorre naturalmente).

[00065] O número de nucleotídeos (nucleosídeos) de elemento de estrutura de núcleo G (Gl e/ou Gn) na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) é determinado por I e n. I e n, independentemente entre si, são cada um inteiro de 1 a 100, 1 a 90, 1 a 80, 1 a 70, 1 a 60, preferivelmente 1 a 50, ainda maispreferivelmente 1 a 40, e ainda mais preferivelmente 1 a 30, no qual o limite inferior destas faixas pode ser 1, mas alternativamente também 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou ainda mais. Preferivelmente, para cada inteiro, quando I e/ou n = 1, G é guanosina (guanina) ou um análogo da mesma, e quando I ou n >1, pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda100% dos nucleotídeos (nucleosídeos) de elemento de estrutura de núcleo G (Gl e/ou Gn) são guanosina (guanina) ou um análogo da mesma. Por exemplo, sem implicar em qualquer limitação, quando I ou n = 4, Gl e/ou Gn pode ser, por exemplo, uma GUGU, GGUU, UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG ou GGGG, etc.; quando I ou n = 5, Gl e/ou Gn pode ser, por exemplo, uma GGGUU, GGUGU, GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG,GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG, ou GGGGG, etc.; etc. Um nucleotídeo (nucleosídeo) de elementos de estrutura de núcleo G, e/ou Gn diretamente adjacente a Xm na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) é preferivelmente não uma uridina (uracila) ou um análogo da mesma. Mais preferivelmente nucleotídeos (nucleosídeos) de elementos de estrutura de núcleo Gl e/ou Gn diretamente adjacente a Xm na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) são pelo menos uma guanosina (guanina) ou um análogo da mesma, mais preferivelmente uma extensão de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou ainda 20 ou mais guanosinas (guaninas) ou um análogo das mesmas. Adicionalmente, um nucleotídeo de elementos de estrutura de núcleo GI e/ou Gn diretamente adjacente a N, por exemplo, Nu, e/ou Nv (ou Nw1 ou Nw2 conforme definido abaixo) na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) é preferivelmente não uma uridina (uracila) ou um análogo da mesma. Mais preferivelmente, nucleotídeos (nucleosídeos) de elementos de estrutura de núcleo GI e/ou Gn diretamente adjacente a N, por exemplo, Ny, e/ou Nv (ou Nwi ou Nw2 conforme definido abaixo) na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) são pelo menos uma guanosina (guanina) ou um análogo da mesma, mais preferivelmente uma extensão de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou ainda 20 ou mais guanosinas (guaninas) ou um análogo das mesmas.

[00066] Do mesmo modo preferivelmente, para fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)), quando I ou n > 1, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 100% dos nucleotídeos (nucleosídeos) dos elementos de estrutura de núcleo GI e/ou Gn são guanosina (guanina) ou um análogo da mesma, conforme definido acima. Os nucleotídeos remanescentes (nucleosídeos) para 100% nos elementos de estrutura de núcleo GI e/ou Gn (quando guanosina (guanina) constituem menos do que 100% dos mesmos nucleotídeos (nucleosídeos)) podem então serem uridina (uracila) ou um análogo da mesma, conforme definido aqui abaixo.

[00067] X, particularmente Xm, na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) é também um elemento de estrutura de núcleo e é um nucleotídeo ou desoxinucleotídeo ou compreende um nucleosídeo, no qual o nucleotídeo (nucleosídeo) é tipicamente selecionado de guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) ou um análogo das mesmas, preferivelmente uridina (uracila) ou um análogo da mesma. Neste particular, análogos de nucleotídeo (nucleosídeo) são definidos como variantes que ocorrem não nativamente de nucleotídeos que ocorrem naturalmente (nucleosídeos). Consequentemente, análogos são nucleotídeos quimicamente derivatizados (nucleosídeos) com grupos funcionais que ocorrem não nativamente, que são preferivelmente adicionados a ou anulados do nucleotídeo que ocorre naturalmente (nucleosídeo) ou que substitui os grupos funcionais que ocorrem naturalmente de um nucleotídeo (nucleosídeo). Consequentemente, cada componente do nucleotídeo que ocorre naturalmente pode ser modificado, a saber, o componente de base, o componente de açúcar (ribose ou desoxirribose) e/ou o componente de fosfato que forma a estrutura do oligonucleotídeo. As porções de fosfato podem ser substituídas, por exemplo, fosforamidatos, fosforotioatos, peptídeo nucleotídeos, metilfosfonatos, etc., no qual, contudo, a estrutura de fosfodiéster que ocorre naturalmente é ainda preferido. Preferivelmente, pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70% e ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de todos "X" nucleotídeos podem exibir propriedades de um análogo conforme definido aqui, se a sequência imunoestimulatória contém pelo menos um análogo no todo. Os análogos que substituem um tipo de nucleotídeo específico dentro do elemento de estrutura de núcleo "Xm" podem ser idênticos, por exemplo, todos citidina (citosina) nucleotídeos (nucleosídeos) que ocorrem no elemento de estrutura de núcleo "Xm" são formados por um análogo de citidina específico (citosina), por exemplo, 2-tio-citidina (citosina), ou eles podem ser distintos para um nucleotídeo específico (nucleosídeos), por exemplo, pelo menos dois análogos de citidina distintos (citosina) estão contidos dentro do elemento de estrutura de núcleo "Xm".

[00068] Análogos de guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) incluem, sem implicar em qualquer limitação, qualquer guanosina que ocorre naturalmente ou que ocorre não naturalmente (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina) ou citidina (citosina) que foram alteradas quimicamente, por exemplo, por acetilação, metilação, hidroxilação, etc., incluindo 1-metil-adenosina (adenina), 2- metil-adenosina (adenina), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenosina(adenina), N6-metil-adenosina (adenina), N6-isopentenil-adenosina (adenina), 2-tio-citidina (citosina), 3-metil-citidina (citosina), 4-acetil- citidina (citosina), 2,6-diaminopurina, 1-metil-guanosina (guanina), 2- metil-guanosina (guanina), 2,2-dimetil-guanosina (guanina), 7-metil- guanosina (guanina), inosina, 1-metil-inosina, di-hidro-uridina (uracila), 4-tio-uridina (uracila), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (uracila), 5-(carbóxi-hidroxilmetil)-uridina (uracila), 5-fluoro-uridina (uracila), 5- bromo-uridina (uracial), 5-carboximetilaminometil-uridina (uracila), 5- metil-2-tio-uridina (uracila), N-uridina (uracila)-5-ácido oxiacético metil éster, 5-metilaminometil-uridina (uracila), 5-metoxiaminometil-2-tio- uridina (uracila), 5'-metoxicarbonilmetil-uridina (uracila), 5-metóxi- uridina (uracila), uridina (uracila)-5-ácido oxiacético metil éster, uridina (uracila)-5-ácido oxiacético (v), queosina, beta-D-mannosil-queosina, wibutoxosina, e inosina. A proporção de tais análogos é conhecida a um versado na técnica, por exemplo, de US 4.373.071. US 4.401.796. US 4.415.732. US 4.458.066. US 4.500.707. US 4.668.777. US 4.973.679. US 5.047.524. US 5.132.418. US 5.153.319. US 5.262.530 e US 5.700.642. No caso de um análogo conforme descrito acima, preferência particular é dada àqueles análogos de nucleotídeos (nucleosídeos) que aumentam a imunogenicidade da molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) e/ou não interferem com uma modificação adicional que foi introduzida.

[00069] O número de elemento de estrutura de núcleo X na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) é determinado por m. m é um inteiro e é tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100, 100 a 150, 150 a 200, ou ainda mais, no qual quando m = 3, X é uridina (uracila) ou um análogo da mesma, e quando m > 3, pelo menos 3 ou mais uridinas diretamente sucessivas (uracilas) ou um análogo das mesmas ocorrem no elemento X de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)) acima. Tal sequência de pelo menos 3 ou mais uridinas diretamente sucessivas (uracilas) é referida a em conjunto com esta aplicação como uma sequência de "uridina monotônica (uracila)". Uma sequência de uridina monotônica (uracila) tipicamente tem um comprimento de pelo menos 3, 5 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100, 100 a 150, 150 a 200 uridinas (uracilas), ou opcionalmente análogos de uridina (uracila) conforme definido acima. Tal sequência de uridina monotônica (uracila) ocorre pelo menos uma vez no elemento de estrutura de núcleo X da molécula de ácido nucleico de fórmula (III) (e de fórmula (I) e (II)). É, portanto possível, por exemplo, para 1, 2, 3, 4, 5 ou mais sequências de uridinamonotônica (uracila) tendo pelo menos 3 ou mais uridinas (uracilas) ou análogos dos mesmos ocorram, cujas sequências de uridina monotônica (uracila) podem ser interrompidas no elemento de estrutura de núcleo X por pelo menos uma guanosina (guanina), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) ou um análogo das mesmas, preferivelmente 2, 3, 4, 5 ou mais. Por exemplo, quando m = 3, Xm é uma UUU. Quando m = 4, Xm pode ser, por exemplo, sem implicar em qualquer limitação, uma UUUA, UUUG, UUUC, UUUU, AUUU, GUUU ou CUUU, etc. Quando n = 10, Xm pode ser, por exemplo, sem implicar em qualquer limitação, uma UUUAAUUUUC, UUUUGUUUUA, UUUGUUUGUU, UUGUUUUGUU, UUUUUUUUUU, etc. Os nucleotídeos de Xm adjacentes a G, ou Gn da molécula de ácido nucleico de fórmula (III) preferivelmente compreende uridina (uracila) ou análogos da mesma. Quando m > 3, tipicamente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 100%, dos nucleotídeos de Xm são uridina (uracila) ou um análogo da mesma, conforme definido acima. Os nucleotídeos remanescentes de Xm para 100% (onde existe menos do que 100% de uridina (uracila) na sequência Xm) são então guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) ou um análogo das mesmas, conforme definido acima.

[00070] A sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (III) acima também contém elemento de borda N. O elemento de borda N é tipicamente uma sequência de ácido nucleico tendo um comprimento de cerca de 4 a 50, preferivelmente de cerca de 4 a 40, mais preferivelmente de cerca de 4 a 30 nucleotídeos (nucleosídeos), ainda mais preferivelmente de cerca de 4 a 20 nucleotídeos (nucleosídeos), no qual o limite inferior das mesmas faixas alternativamente também pode ser 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais. Preferivelmente, os nucleotídeos (nucleosídeos) de cada N são independentemente selecionados de guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) e/ou um análogo das mesmas. Em outras palavras, o elemento de borda N na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) de acordo com a presente invenção pode ser uma sequência, que pode ser composta de qualquer (aleatória) sequência, disponível na técnica, cada N independentemente selecionado de guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) e/ou um análogo dos mesmos nucleotídeos, ou de um homopolímero dos mesmos nucleotídeos (nucleosídeos), em cada caso provido, que tal uma sequência tem um comprimento de cerca de 4 a 50, preferivelmente de cerca de 4 a 40, mais preferivelmente de cerca de 4 a 30 nucleotídeos (nucleosídeos) e ainda mais preferivelmente de cerca de 4 a 30 ou 4 a 20 nucleotídeos (nucleosídeos) de acordo com a definição acima.

[00071] De acordo com uma concretização específica, N pode ser uma sequência de ácido nucleico dentro das definições acima, no qual a sequência tipicamente compreende não mais do que 2 nucleotídeos idênticos (nucleosídeos) conforme definido acima em uma posição diretamente vizinha, isto é, a sequência tipicamente compreende não extensões de mais do que dois nucleotídeos idênticos (nucleosídeos) selecionados de adenosina (adenina), citidina (citosina), uridina (uracila) e/ou guanosina (guanina), e/ou um análogo das mesmas (isto é, uma extensão de "aa", "cc", "uu", "gg" e/ou um análogo da mesma), mais preferivelmente não tal extensão, isto é, nucleotídeos não idênticos (nucleosídeos) conforme definido acima em uma posição diretamente vizinha. Adicionalmente ou alternativamente, N pode ser uma sequência de ácido nucleico dentro das definições acima, no qual a sequência tipicamente compreende um teor de adenosina (adenina) ou um análogo da mesma preferivelmente de cerca de 0 a 50%, 5 a 45%, ou 10 a 40%, mais preferivelmente de cerca de 15 a 35%, ainda mais preferivelmente de cerca de 20 a 30%, e mais preferivelmente de cerca de 25%; um teor de uridina (uracila) ou um análogo da mesma preferivelmente de cerca de 0 a 50%, 5 a 45%, ou 10 a 40%, mais preferivelmente de cerca de 15 a 35%, ainda mais preferivelmente de cerca de 20 a 30%, e mais preferivelmente de cerca de 25%; um teor de citidina (citosina) ou um análogo da mesma preferivelmente de cerca de 0 a 50%, 5 a 45%, ou 10 a 40%, mais preferivelmente de cerca de 15 a 35%, ainda mais preferivelmente de cerca de 20 a 30%, e mais preferivelmente de cerca de 25%; um teor de guanosina (guanina) ou um análogo da mesma preferivelmente de cerca de 0 a 50%, 5 a 45%, ou 10 a 40%, mais preferivelmente de cerca de 15 a 35%, ainda mais preferivelmente de cerca de 20 a 30%, e mais preferivelmente de cerca de 25%. Mais preferivelmente, N pode ser uma sequência de ácido nucleico dentro das definições acima, no qual a sequência tipicamente compreende um teor de cada adenosina (adenina), guanosina (guanina), citidina (citosina) e uridina (uracila) de cerca de 25%. Exemplos de tais sequências de N incluem, por exemplo, agcu, ague, augc, acgu, gcua, gcau, gacu, guca, cuag, caug, cagu, cgau, uagc, uacg, ucga, ucag, agcugcua, gcaucaug, caguucga, etc.,

[00072] O número de elemento de borda N na molécula de ácido nucleico de fórmula (III), isto é, sua repetição, é determinado por inteiros u e/ou v. Desse modo, N na molécula de ácido nucleico de fórmula (III) pode ocorrer como um elemento de borda (repetitivo) Nu e/ou Nv, no qual u e/ou v podem ser, independentemente entre si, uminteiro de 0 ou 1 a 100, mais preferivelmente de 0 ou 1 a 50, aindamais preferivelmente de 0 ou 1 a 40, e mais preferivelmente de 0 ou 1 a 30, por exemplo, 0 ou 1 a 5, 10, 20, 25, ou 30; ou de 5 a 10, 10 a 15,15 a 20, 20 a 25 ou 25 a 30. Mais preferivelmente, pelo menos umelemento de borda (repetitivo) Nu e/ou Nv, pode estar presente na fórmula (III), isto é, ou u ou v não são 0, mais preferivelmente, ambos elementos de borda (repetitivo) Nu e/ou Nv estão presentes, ainda mais preferivelmente nas definições acima.

[00073] Adicionalmente, a combinação de elementos de estrutura de núcleo e elementos de borda ao elemento NuGXmGnNv pode ocorrer como elementos repetitivos de acordo com a sequência imunoestimulatória de fórmula (III), (NuGlXmGnNv)a, conforme definido acima, no qual o número de repetições do elemento combinado de acordo com fórmula (III), (NuGiXmGnNv)a, é determinado pelo inteiro a. Preferivelmente, a é um inteiro de cerca de 1 a 100, 1 a 50, 1 a 20, mais preferivelmente um inteiro de cerca de 1 a 15, maispreferivelmente um inteiro de cerca de 1 a 10. Neste contexto, os elementos repetitivos NuGXmGnNv podem ser iguais ou diferentesentre si.

[00074] De acordo com uma concretização particularmente preferida, a sequência imunoestimulatória de fórmula (III) (NuGlXmGnNv)a, conforme definido acima, compreende uma estrutura de núcleo GXmGn, preferivelmente selecionada de pelo menos uma das seguintes sequências de SEQ ID NOs: 1-80 conforme definido acima:

[00075] além disso, sequências imunoestimulatórias conforme definidas aqui podem também compreender, por exemplo, um ácido nucleico (molécula) de fórmula (IIIa)(NuGlXmGnNv)a,no qual:

[00076] C é citidina (citosina), uridina (uracila) ou um análogo de citidina (citosina) ou uridina (uracila), preferivelmente citidina (citosina) ou um análogo das mesmas;

[00077] X é guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) ou um análogo dos nucleotídeos acima mencionados (nucleosídeos), preferivelmente uridina (uracila) ou um análogo das mesmas; N é cada uma sequência de ácido nucleico tendo independente entre si um comprimento de cerca de 4 a 50, preferivelmente de cerca de 4 a 40, mais preferivelmente de cerca de 4 a 30 ou 4 a 20 ácidos nucleicos, cada N independentemente sendo selecionado de guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina), ou um análogo dos mesmos nucleotídeos (nucleosídeos);

[00078] a é um inteiro de 1 a 20, preferivelmente de 1 a 15, mais preferivelmente de 1 a 10;

[00079] I é um inteiro de 1 a 40, no qual

[00080] quando I = 1, C é citidina (citosina) ou um análogo da mesma,

[00081] quando I > 1, pelo menos 50% dos mesmos nucleotídeos (nucleosídeos) são citidina (citosina), ou um análogo da mesma;

[00082] m é um inteiro e é pelo menos 3;no qual

[00083] quando m = 3, X é uridina (uracila), ou um análogo da mesma,

[00084] quando m > 3, pelo menos 3 uridinas sucessivas (uracilas) ou análogos de uridina (uracila) ocorrem;

[00085] n é um inteiro de 1 a 40, no qual

[00086] quando n = 1, C é citidina (citosina), ou um análogo damesma,

[00087] quando n > 1, pelo menos 50% do mesmos nucleotídeos (nucleosídeos) são citidina (citosina), ou um análogo da mesma.

[00088] u, v podem ser independentemente entre si um inteiro de 0 a 50, preferivelmente no qual quando u = 0, v > 1, ou

[00089] quando v = 0, u > 1; no qual a molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) tem um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 150 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente de pelo menos 200 nucleotídeos, e mais preferivelmente de pelo menos 250 nucleotídeos.

[00090] Para fórmula (IIIa), qualquer das definições dadas acima para elementos N (isto é, Nu e Nv) e X (Xm), particularmente a estrutura de núcleo conforme definido acima, bem como para inteiros a, I, m, n, u e v, similarmente se aplicam a elementos de fórmula (IIIa) correspondentemente, no qual na fórmula (IIIa) a estrutura de núcleo é definida por CXmCn. A definição de elementos de borda Nu e Nv é idêntica às definições dadas acima para Nu e Nv.

[00091] Mais particularmente, C na molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) é um nucleotídeo ou desoxinucleotídeo ou compreende um nucleosídeo, no qual o nucleotídeo (nucleosídeo) é tipicamente citidina (citosina) ou uridina (uracila) ou um análogo das mesmas. Neste particular, citidina (citosina) ou uridina (uracila) nucleotídeos análogos são definidos como variantes que ocorrem não nativamente de citidina que ocorre naturalmente (citosina) ou uridina (uracila) nucleotídeos. Consequentemente, citidina (citosina) ou uridina (uracila) análogas são nucleotídeos quimicamente derivatizados (nucleosídeos) com grupos funcionais que ocorrem não nativamente, que são preferivelmente adicionados a ou anulados da citidina que ocorre naturalmente (citosina) ou uridina (uracila) nucleotídeo (nucleosídeo) ou que substituem os grupos funcionais que ocorrem naturalmente de uma citidina (citosina) ou uridina (uracila) nucleotídeo (nucleosídeo). Consequentemente, cada componente da citidina que ocorre naturalmente (citosina) ou uridina (uracila) nucleotídeo pode ser modificada, a saber, o componente base, o componente de açúcar (ribose) e/ou o componente de fosfato que forma a estrutura do oligonucleotídeo. As porções de fosfato podem ser substituídas por, por exemplo, fosforamidatos, fosforotioatos, peptídeo nucleotídeos, metilfosfonatos, etc., no qual a estrutura de fosfodiéster que ocorre naturalmente é ainda preferida.

[00092] Consequentemente, análogos de citidina (citosina) ou uridina (uracila) incluem, sem implicar em qualquer limitação, qualquer citidina que ocorre naturalmente ou que ocorre não naturalmente (citosina) ou uridina (uracila) que foi alterada quimicamente, por exemplo, por acetilação, metilação, hidroxilação, etc., incluindo, por exemplo, 2-tio-citidina (citosina), 3-metil-citidina (citosina), 4-acetil- citidina (citosina), di-hidro-uridina (uracila), 4-tio-uridina (uracila), 5- carboximetilaminometil-2-tio-uridina (uracila), 5-(carbóxi-hidroxilmetila)- uridina (uracila), 5-fluoro-uridina (uracila), 5-bromo-uridina (uracila), 5- carboximetilaminometil-uridina (uracila), 5-metil-2-tio-uridina (uracila), N-uridina (uracila)-5-ácido oxiacético metil éster, 5-metilaminometil- uridina (uracila), 5-metoxiaminometil-2-tio-uridina (uracila), 5'- metoxicarbonilmetil-uridina (uracila), 5-metóxi-uridina (uracila), uridina (uracila)-5-ácido oxiacético metil éster, uridina (uracila)-5-ácido oxiacético (v). A preparação de tais análogos é conhecida a um versado na técnica, por exemplo, de US 4.373.071. US 4.401.796. US 4.415.732. US 4.458.066. US 4.500.707. US 4.668.777. US 4.973.679. US 5.047.524. US 5.132.418. US 5.153.319. US 5.262.530 e US 5.700.642, as descrições dos quais são incorporadas por referência aqui em sua totalidade. No caso de um análogo de nucleotídeo (nucleosídeo) conforme descrito acima, preferência é dada especialmente àqueles análogos que aumentam a imunogenicidade da molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) e/ou não interfere com uma modificação adicional que foi introduzida. Pelo menos uma citidina (citosina) ou uridina (uracila) ou um análogo das mesmas pode ocorrer nos elementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn, opcionalmente pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90% ou ainda 100% dos nucleotídeos (nucleosídeos) doselementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn são uma citidina que ocorre naturalmente (citosina), uma uridina que ocorre naturalmente (uracila), e/ou um análogo das mesmas e/ou exibe propriedades de um análogo da mesma conforme definido aqui. Preferivelmente, o elemento de estrutura de núcleo Q e/ou Cn contém pelo menos um análogo de uma citidina que ocorre naturalmente (citosina) e/ou uma uridina que ocorre naturalmente (uracila) no todo. Mais preferivelmente, todos os nucleotídeos (nucleosídeos) dos mesmos elementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn são análogos, que podem - mais preferivelmente - serem análogos idênticos para o mesmo tipo de nucleotídeos (nucleosídeos) (por exemplo, toda citidina (citosina) nucleotídeos são providos como 2-tio-citidina (citosina)) ou eles podem ser distintos (por exemplo, pelo menos dois análogos de citidina diferentes (citosina) substituem a citidina que ocorre naturalmente (citosina) nucleotídeo).

[00093] O número de nucleotídeos (nucleosídeos) de elemento de estrutura de núcleo C (Q e/ou Cn) na molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) é determinado por I e n. I e n, independentemente entre si, são cada um inteiro de 1 a 90, 1 a 80, 1 a 70, 1 a 60, preferivelmente 1 a 50, ainda mais preferivelmente 1 a 40, e ainda mais preferivelmente 1 a 30, no qual o limite inferior das mesmas faixas pode ser 1, mas alternativamente também 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou ainda mais. Preferivelmente, para cada inteiro, quando I e/ou n = 1, C é citidina (citosina) ou um análogo da mesma, e quando I ou n > 1, pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 100% dos nucleotídeos (nucleosídeos) de elemento de estrutura de núcleo C (Q e/ou Cn) são citidina (citosina) ou um análogo da mesma. Por exemplo, sem implicar em qualquer limitação, quando I ou n = 4, C, e/ou Cn pode ser, por exemplo, uma CUCU, CCUU, UCUC, UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC ou CCCC, etc.; quando I ou n = 5, Q e/ou Cn pode ser, por exemplo, uma CCCUU, CCUCU, CUCCU, UCCCU, UCCUC, UCUCC, UUCCC, CUCUC, CCCCU, CCCUC, CCUCC, CUCCC, UCCCC, ou CCCCC, etc.; etc. Um nucleotídeo (nucleosídeo) de elementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn diretamente adjacente a Xm na molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) é preferivelmente não uma uridina (uracila) ou um análogo da mesma. Mais preferivelmente nucleotídeos (nucleosídeos) de elementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn diretamente adjacentes a Xm na molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) são pelo menos uma citidina (citosina) ou um análogo da mesma, mais preferivelmente uma extensão de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 5 17, 18, 19 ou ainda 20 ou mais citidinas (citosinas) ou um análogo das mesmas. Adicionalmente, um nucleotídeo (nucleosídeo) de elementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn diretamente adjacente a N, por exemplo, Nu, e/ou Nv (ou Nwl ou Nw2 conforme definido abaixo) na molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) é preferivelmente não uma uridina (uracila) ou um análogo da mesma. Mais preferivelmente, nucleotídeos (nucleosídeos) de elementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn diretamente adjacentes a N, por exemplo, Nu, e/ou Nv (ou Nw1 ou Nw2 conforme definido abaixo) na molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) são pelo menos uma citidina (citosina) ou um análogo da mesma, mais preferivelmente uma extensão de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou ainda 20 ou mais citidinas (citosinas) ou um análogo das mesmas. Do mesmo modo preferivelmente, para fórmula (IIIa), quando I ou n > 1, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 100% dos nucleotídeos dos elementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn são citidina (citosina) ou um análogo da mesma, conforme definido acima. Os nucleotídeos remanescentes (nucleosídeos) para 100% nos elementos de estrutura de núcleo Q e/ou Cn (quando citidina (citosina) constitui menos do que 100% dos mesmos nucleotídeos (nucleosídeos)) podem então serem uridina (uracila) ou um análogo da mesma, conforme definido aqui antes.

[00094] X, particularmente Xm, como um elemento de estrutura de núcleo adicional na sequência imunoestimulatória de acordo com fórmula (IIIa), é preferivelmente conforme definido acima para fórmula (III). O número de elemento de estrutura de núcleo X na molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) é determinado por m. m é um inteiro e é tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100, 100 a 150, 150 a 200, ou ainda mais, no qual quando m = 3, X é uridina (uracila) ou um análogo da mesma, e quando m > 3, pelo menos 3 ou mais uridinas diretamente sucessivas (uracilas), ou um análogo das mesmas ocorrem no elemento X de fórmula (IIIa) acima. Tal sequência de pelo menos 3 ou mais uridinas diretamente sucessivas (uracilas) é referida em conjunto com esta aplicação como uma "sequência de uridina monotônica (uracila)". Uma sequência de uridina monotônica (uracila) tipicamente tem um comprimento de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100, 100 a 150, 150 a 200 uridinas (uracilas) ou opcionalmente análogos de uridina (uracila) conforme definido acima. Tal sequência de uridina monotônica (uracila) ocorre pelo menos uma vez no elemento de estrutura de núcleo X da molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa). É, portanto, possível, por exemplo, para 1, 2, 3, 4, 5 ou mais sequências de uridina monotônica (uracila) tendo pelo menos 3 ou mais uridinas (uracilas) ou análogos das mesmas ocorram, cujas sequências de uridina monotônica (uracila) podem ser interrompidas no elemento de estrutura de núcleo X por pelo menos uma guanosina (guanina), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) ou um análogo das mesmas, preferivelmente 2, 3, 4, 5 ou mais. Por exemplo, quando m = 3, Xm é uma UUU. Quando m = 4, Xm pode ser, por exemplo, sem implicar em qualquer limitação, uma UUUA, UUUG, UUUC, UUUU, AUUU, GUUU ou CUUU, etc. Quando n = 10, Xm pode ser, por exemplo, sem implicar em qualquer limitação, uma UUUAAUUUUC, UUUUGUUUUA, UUUGUUUGUU, UUGUUUUGUU, UUUUUUUUUU, etc. Os nucleotídeos (nucleosídeos) de Xm adjacentes a Q ou Cn da molécula de ácido nucleico de fórmula (IIIa) preferivelmente compreende uridina (uracila) ou análogos da mesma. Quando m > 3, tipicamente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 100%, dos nucleotídeos de Xm são uridina (uracila) ou um análogo da mesma, conforme definido acima. Os nucleotídeos remanescentes (nucleosídeos) de Xm para 100% (onde existe menos do que 100% de uridina (uracila) na sequência Xm) podem então serem guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) ou um análogo das mesmas, conforme definido acima.

[00095] Do mesmo modo, a sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (IIIa) acima contém um elemento de borda N, particularmente Nu e/ou Nv, no qual o elemento de borda N, particularmente Nu e/ou Nv, bem como inteiros x e y são conforme definidos acima.

[00096] O elemento NuCXmCnNv pode ocorrer como um elemento repetitivo de acordo com a sequência imunoestimulatória de fórmula (IIIa) (NuClXmCnNv)a, conforme definido acima, no qual o número de repetições do mesmo elemento de acordo com a fórmula (IIIa) (NuQXmCnNv)a é determinado pelo inteiro a. Preferivelmente, a é um inteiro de cerca de 1 a 100, 1 a 50, 1 a 20, mais preferivelmente um inteiro de cerca de 1 a 15, mais preferivelmente um inteiro de cerca de 1 a 10. Neste contexto, os elementos repetitivos NuCXmCnNv podem ser iguais ou diferentes entre si.

[00097] De acordo com uma concretização particularmentepreferida, a sequência imunoestimulatória de fórmula (IIIa) (NuQXmCnNv)a, conforme definido acima, compreende uma estrutura de núcleo CiXmCn, preferivelmente selecionada de pelo menos uma das seguintes sequências de SEQ ID NOs: 81-83 conforme definido acima:a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (III) (ou (IIIa)), particularmente cada elemento repetitivo simples NuGlXmCnNv (ou NuQXmCnNv) do mesmo, pode ser de fita simples, de fita dupla ou de fita parcialmente dupla, etc., conforme definido para fórmula (III) em geral.

[00098] Se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (III) (ou (IIIa)) é a uma molécula de ácido nucleico de fita simples, a sequência é tipicamente de fita simples sobre seu comprimento total.

[00099] Do mesmo modo, se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (III) (ou (IIIa)) é uma molécula de ácido nucleico de fita dupla, a sequência é tipicamente de fita dupla sobre seu comprimento total.

[000100] Se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (III) (ou (IIIa)) é uma molécula de ácido nucleico de fita parcialmente duplo, a sequência de ácido nucleico de uma molécula de ácido nucleico de ou fórmula (III) (ou (IIIa)) pode ser de fita simples na região fora da estrutura de núcleo GXmGn (ou CXmCn), e de fita dupla na região de referida estrutura de núcleo, a estrutura de núcleo GXmGn (ou CXmCn), preferivelmente sendo selecionada de pelo menos uma das acima definidas sequências de SEQ ID NOs: 1-83. Ainda mais preferivelmente, a estrutura de núcleo GXmGn (ou CXmCn) de (ou) fórmula (III) (ou (IIIa)) pode ser de fita dupla em tal região da estrutura de núcleo, no qual uma extensão de uridinas (uracilas) ocorre, mais preferivelmente sobre a extensão total de uridina (uracila) ou pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% da mesma.

[000101] Alternativamente ou adicionalmente, se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (III) ou (IIIa) é uma molécula de ácido nucleico de fita parcialmente dupla, outras partes (do que a estrutura de núcleo GXmGn) da sequência imunoestimulatória de acordo com fórmula (III) ou (IIIa) conforme definido acima pode ser de fita duplo. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico de uma molécula de ácido nucleico de ou fórmula (III) ou (IIIa) pode ser de fita dupla na região fora da estrutura de núcleo GlXmGn (ou ClXmCn), por exemplo, nos elementos de borda Nu e/ou Nv, e de fita simples na região de referida estrutura de núcleo, a estrutura de núcleo GlXmGn (ou ClXmCn), preferivelmente selecionada de pelo menos uma das acima definidas sequências de SEQ ID NOs: 1-83. Por exemplo, pelo menos um dos elementos de borda Nv e/ou Nv pode ser de fita dupla, pelo que os elementos remanescentes de ou fórmula (III) ou (IIIa), por exemplo, a estrutura de núcleo GlXmGn e/ou outros elementos, podem permanecer de fita simples.

[000102] Alternativamente ou adicionalmente, a sequência imunoestimulatória de acordo com fórmula (III) pode ser selecionada de uma mistura de uma molécula de fita simples de ácido nucleico de acordo com ou fórmula (III) ou (IIIa) e uma (parcialmente) molécula de ácido nucleico de fita duplo de acordo com ou fórmula (III) (ou (IIIa)), preferivelmente em uma proporção de cerca de 1:10 a 10:1, mais preferivelmente em uma proporção de 1:3 a 3:1.

[000103] De acordo com uma concretização muito particularmente preferida, a sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (III) pode ser selecionada de, por exemplo, qualquer das seguintes sequências:de SEQ ID NO: 84:UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG ou de SEQ ID NO: 85:UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG AUCGCUUCGA GAACCUGGAU CC AAAAA AAAAA AAAAA CCC ACGCAAGGAU CUUCAUGUGC ou de SEQ ID NO: 114 (R820: (NIOO)2)GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUUGCAUAUCUCAGAGUAUUG GCCCCCGUGUAGGUUAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUAC GGUACUGGUGACAGACCUAGGUCGUCAGUUGACCAGUCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGUU AGAUGUUACACUCUAUUAGAUCou de SEQ ID NO: 115 (R719: (NIOO)Õ)GGGAGAAAGCUCAAGCOUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUUGCAUAUCUCAGAGUAUUG GCCCCCGUGUAGGUUAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUAC GGUACUGGUGACAGACCUAGGUCGDCAGUUGACCAGUCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGUU AGAUGUUACACUCUAUUAGAUCUCGGAUUACAGCUGGAAGGAGCAGGAGUAGUGUUCUUGCUCUAAGUA CCGAGUGUGCCCAAUACCCGAUCAGCUUAUUAACGAACGGCUCCUCCUCUUAGACUGCAGCGUAAGUGC GGAAUCUGGGGAUCAAAUUACUGACUGCCUGGAUUACCCUCGGACAUAUAACCUUGUAGCACGCUGUUG CUGUAUAGGUGACCAACGCCCACUCGAGUAGACCAGCUCUCÜUAGUCCGGACAAUGAUAGGAGGCGCGG UCAAUCUACUUCUGGCUAGUUAAGAAUAGGCUGCACCGACCUCUAUAAGUAGCGUGUCCUCUAGou de SEQ ID NO: 116 (R720: (NIOO)IO)GGGAGAÃAGCUCAAGCUUGGAGCAAÜGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUUGCAUAUCUCAGAGUAUUG GCCCCCGUGUAGGUUAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAUUCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUAC GGUACUGGUGACAGACCUAGGUCGUCAGUUGACCAGÜCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGUU AGAUGUUACACUCUAUUAGAUCUCGGAUUACAGCUGGAAGGAGCAGGAGUAGUGUUCUUGCUCUAAGUA CCGAGUGUGCCCAAUACCCGAUCAGCUUAUUAACGAACGGCUCCUCCUCUUAGACUGCAGCGUAAGUGC GGAAUCUGGGGAUCAAAUUACUGACüGCCUGGAUUACCCUCGGACAUAUAACCUUGUAGCACGCUGUUG CUGUAUAGGUGACCAACGCCCACUCGAGUAGACCAGCUCUCUUAGUCCGGACAAUGAUAGGAGGCGCGG UCAAUCUACUUCUGGCUAGUUAAGAAUAGGCUGCACCGACCUCUAUAAGUAGCGUGUCCUCUAGAGCUA CGCAGGUUCGCAAUAAAAGCGUUGAUUAGUGUGCAUAGAACAGACCUCUUAUUCGGUGAAACGCCAGAA UGCUAAAUUCCAAUAACUCUUCCCAAAACGCGUACGGCCGAAGACGCGCGCUUAUCUUGUGUACGUUCU CGCACAUGGAAGAAUCAGCGGGCAUGGUGGUAGGGCAAUAGGGGAGCUGGGUAGCAGCGAAAAAGGGCC CCUGCGCACGUAGCUUCGCUGUUCGUCUGAAACAACCCGGCAUCCGUUGUAGCGAUCCCGUUAUCAGUG UUAUUCUÜGUGCGCACUAAGAUUCAUGGUGUAGUCGACAAÜAACAGCGUCUUGGCAGAUUCUGGUCACG UGCCCUAÜGCCCGGGCUUGUGCCUCUCAGGUGCACAGCGAUACUUAAAGCCUUCAAGGUACUCGACGUG GGUACCGAUUCGUGACACUUCCUAAGAUUAUUCCACUGUGUUAGCCCCGCACCGCCGACCUAAACUGGU CCAAUGUAUACGCAUUCGCUGAGCGGAUCGAUAAUAAAAGCUUGAAUUou de SEQ ID NO: 117 (R821: (N4OU2ON4O)2)GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUU UUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAÜCCACAGCUGAUGAAAG ACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCC AGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCou de SEQ ID NO: 118 (Seq. R722: (N4OU2ON4O)Õ)GGGAGAÃAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUU UUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAG ACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUtπjUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCC AGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUU UUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCA CUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUÜUÜUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAG AACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGÜCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUÜU UUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAou de SEQ ID NO: 119 (R723: (N40U20N40M:GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGÜAGGCÜGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUU UUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAG ACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCC AGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUU UUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCA CUGCGGCÜAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUÜUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAG AACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUÜU UUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAGAACGA ACUGACCUGACGCCUGAACUUAUGAGCGUGCGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCUCCCAACAAA UGUCGAÜCAAUAGCUGGGCUGUUGGAGACGCGUCAGCAAAUGCCGUGGCUCCAUAGGACGUGUAGACUU CUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCCGGGACCACAAAUAAUAUUCUUGCUUGGUUGGGCGCAAGGGCC CCGUAUCAGGUCAUAAACGGGUACAUGUUGCACAGGCUCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCGCUGA GUUAUUCCGGUCUCAAAAGACGGCAGACGUCAGUCGACAACACGGUCUAAAGCAGUGCUACAAUCUGCC GUGUUCGUGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGAACCUACACGGCGUGCACUGUAGUUCGCAAUUCAUAG GGUACCGGCUCAGAGUUAUGCCUUGGUUGAAAACUGCCCAGCAUACUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCAU AUUCCCAUGCUAAGCAAGGGAUGCCGCGAGUCAUGUUAAGCUUGAAUU

[000104] De acordo com uma concretização muito particularmente preferida, a sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (IIIa) pode ser selecionada de, por exemplo, qualquer das seguintes sequências:IÜAGCGAAGCU CUUGGACCUA CC UUUUU UUUUU UUUUU CCC UGCGUUCCUA GAAGUACACG (SEQ ID NO: 86)ouUAGCGAAGCU CUUGGACCUA CC UUUUU UUUUU UUUUU CCC UGCGUUCCUA GAAGUACACG AUCGCUUCGA GAACCÜGGAU GG AAAAA AAAAA AAAAA GGG ACGCAAGGAU CUUCAUGUGC (SEQ ID NO: 87)

[000105] De acordo com uma concretização preferida, a sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula III (ou (IIIa)), conforme definida acima, pode ser modificada com uma sequência poli(X) (elemento de modificação). Tais sequências imunoestimulatórias podem compreender, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a fórmula (IV):poli(IV)s(NuQXmCnNv)apoli(IV)t,no qual

[000106] a molécula de ácido nucleico de fórmula (IV) do mesmo modo tem um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 150 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente de pelo menos 200 nucleotídeos e, mais preferivelmente, de pelo menos 250 nucleotídeos.

[000107] Em uma sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (IV), os elementos G, X e N, particularmente, a estrutura de núcleo GlXmGn, e os elementos Nu e Nv, bem como os inteiros a, I, m, n, u e v são conforme definido acima para fórmula (III). No contexto da presente invenção, um elemento de modificação poli(IV), particularmente poli(IV)s e/ou poli(IV)t, de uma sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (IV), é tipicamente uma sequência de ácido nucleico de fita simples, de fita dupla ou parcialmente de fita dupla, por exemplo, uma sequência de DNA ou RNA conforme definido acima em geral. Preferivelmente, o elemento de modificação poli(IV), particularmente poli(IV)s e/ou poli(IV)t, é uma extensão homopolimérica de ácidos nucleicos, no qual X pode ser qualquer nucleotídeo ou desoxinucleotídeo ou compreende um nucleosídeo conforme definido acima para X de uma sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (III) ou (IIIa). Preferivelmente, X pode ser selecionado independentemente para cada poli(IV), particularmente poli(IV)s e/ou poli(IV)t, de um nucleotídeo ou desoxinucleotídeo, ou compreende um nucleosídeo, no qual o nucleotídeo (nucleosídeo) é selecionado de guanosina (guanina), uridina (uracila), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina), inosina, ou um análogo dos mesmos nucleotídeos, por exemplo, de uma extensão de fita simples de citidinas (citosinas) (poli(C)), de guanosina (guanina)s (poli(G)), de adenosina (adenina)s (poli(A)), de uridinas (uracilas) (poli(U)), de inosinas (poli(lll)), etc. ou de uma extensão de fita dupla homopolimérica de inosinas e citidinas (citosinas) (poli(lll:C)), de adenosina (adenina) e uridinas (uracilas) (poli(A:U)), etc., no qual a sequência homopolimérica, particularmente poli(lll:C) e/ou poli(A:U), pode ser acoplada à sequência (NuGXmGn Nv)a da molécula de ácido nucleico de acordo com a fórmula (IV) via qualquer de suas fitas, por exemplo, ou usando a sequência de poli-C, poli-I, poli-A ou poli-U. O comprimento de elemento de modificação poli(IV), particularmente poli(IV)s e/ou poli(IV)t, da sequência imunoestimulatória de fórmula (IV) é determinado por inteiros s e/ou t, no qual s e/ou t, independentes entre si, podem ser um inteiro de cerca de 5 a 100, preferivelmente cerca de 5 a 70, mais preferivelmente cerca de 5 a 50, ainda mais preferivelmente cerca de 5 a 30, e, mais preferivelmente, cerca de 5 a 20.

[000108] De acordo com uma concretização particularmente preferida, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a fórmula (IV) conforme definido acima, pode especificamente compreender, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a fórmula (IVa),poli(X) (Nu G,XmGn Nv)a,

[000109] ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a fórmula (IVb),poli(X) (Nu G,XmGn Nv)a poli(X), no qual

[000110] qualquer das mesmas moléculas de ácido nucleico de fórmulas (IVa) ou (IVb) do mesmo modo têm um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 150 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente de pelo menos 200 nucleotídeos e mais preferivelmente de pelo menos 250 nucleotídeos. Similarmente, todas as outras definições se aplicam conforme colocado para a fórmula (IV) ou (III) acima. Do mesmo modo, referidas fórmulas (IV), (IVa) e (IVb) podem ser definidas na base de uma fórmula de acordo com a fórmula (IIIb), isto é, introduzindo a estrutura de núcleo CXmCn.

[000111] Mais preferivelmente, poli(X) em uma sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) pode ser selecionado de um poli(IV) conforme definido acima, mais preferivelmente de poli(l:C) e/ou de poli(A:U). Estes elementos de modificação poli(X), particularmente poli(l:C) e/ou poli(A:U), podem ser acoplados à sequência de acordo com a fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb), via qualquer de suas fitas, por exemplo, ou usando as sequência poli- C, poli-G, poli-l, poli-A ou poli-U.

[000112] Similarmente conforme definido acima para fórmula (III) ou (IIIa), a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) pode ser uma molécula de ácido nucleico de fita simples, de fita dupla ou parcialmente de fita dupla, conforme definido acima.

[000113] Se a sequência imunoestimulatória de acordo com a fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) é uma molécula de ácido nucleico de fita simples, a sequência é tipicamente de fita simples sobre seu comprimento total.

[000114] Do mesmo modo, se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) é uma molécula de ácido nucleico de fita dupla, a sequência é tipicamente de fita dupla sobre seu comprimento total.

[000115] Se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) é a parcialmente de molécula de ácido nucleico de fita dupla, a sequência de ácido nucleico de uma molécula de ácido nucleico de ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) pode ser de fita simples na região fora da estrutura de núcleo GlXmGn, e de fita dupla na região de referida estrutura de núcleo, a estrutura de núcleo GlXmGn, preferivelmente sendo selecionada de pelo menos uma das sequências acima definidas de SEQ ID NOs: 1-80 ou SEQ ID NOs: 81 a 83. Ainda mais preferivelmente, a estrutura de núcleo GlXmGn (ou ClXmCn) de ou fórmula (III) (ou (IIIa)) pode ser de fita dupla em tal região da estrutura de núcleo, no qual a extensão de uridinas (uracilas) ocorre, mais preferivelmente sobre a extensão de uridina (uracila) ou pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98 ou 99% da mesma.

[000116] Alternativamente ou adicionalmente, se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) é uma molécula de ácido nucleico parcialmente de fita dupla, outras partes (do que a estrutura de núcleo GlXmGn) da sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) conforme definido acima podem ser de fita dupla. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico de uma molécula de ácido nucleico de ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) pode ser de fita dupla na região fora da estrutura de núcleo GXmGn, por exemplo, nos elementos de borda Nu e/ou Nv, e/ou no elemento de modificação poli(X), por exemplo poli(X)s e ou poli(X)t, (tal como, por exemplo, uma sequência poli(l:C) ou poli(A:U)), e, por exemplo, de fita simples na região de referida estrutura de núcleo, a estrutura de núcleo GXmGn, preferivelmente sendo selecionada de pelo menos uma das sequências acima definidas de SEQ ID NOs: 1-83. Por exemplo, pelo menos um dos elementos de borda Nu e/ou Nv, e/ou pelo menos um dos elementos de modificação poli(IV), por exemplo, poli(IV)s e ou poli(IV)t, podem ser de fita dupla, pelo que os elementos remanescentes de ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb), por exemplo, a estrutura de núcleo GXmGn e/ou outros elementos, pode permanecer de fita simples.

[000117] Alternativamente ou adicionalmente, uma mistura de uma molécula de ácido nucleico de fita simples de acordo com ou fórmula (IV), (IVa)) e/ (IVb) e uma molécula de ácido nucleico (parcialmente) de fita dupla de acordo com ou fórmula (IV), (IVa)) e/ (IVb), preferivelmente em uma proporção de cerca de 1:10 a 10:1, mais preferivelmente em uma proporção de 1:3 a 3:1.

[000118] De acordo com uma concretização particularmente preferida, a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (IV), (IVa) e/ou (IVb) pode ser selecionada de, por exemplo, qualquer das seguintes sequências:- CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG (SEQ ID NO: 88)- CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG (SEQ ID NO: 89) IIIIIIIIII IIIIIIIIII- CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG (SEQ ID NO: 90) AAAAA AAAAA AAAAA- CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG (SEQ ID NO: 91) GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG CC AAAAA AAAAA AAAAA CCC - CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG (SEQ ID NO: 92)- CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG CC AAAAA AAAAA AAAAA CCC ACGCAAGGAU CUUCAUGUGC UAGCGAAGCU CUUGGACCUA (SEQ ID NO: 93) AUCGCUUCGA GAACCUGGAU- CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG CC AAAAA AAAAA AAAAA CCC ACGCAAGGAU CUUCAUGUGCUAGCGAAGCU CUUGGACCUA (SEQ ID NO: 94) AUCGCUUCGA GAACCUGGAU

[000119] Uma sequência imunoestimulatória de acordo com fórmula (III) (ou (IIIa)) conforme definido acima pode também ser modificada pela inserção de uma haste ou uma alça de haste, por exemplo, conduzindo a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a fórmula (Va),(Nuhaste1 GXmGnhaste2 Nv)a,ou a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a fórmula (Vb), (Nu GlXmGn Nv)a hastel Nw1 haste2 Nw2, no qual

[000120] a molécula de ácido nucleico de ou fórmula (Va) e/ou (Vb) tem um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 150 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente de pelo menos 200 nucleotídeos e, mais preferivelmente, de pelo menos 250 nucleotídeos. Do mesmo modo, as referidas fórmulas (Va) e (Vb) podem ser definidas na base de fórmula (IIIb), isto é, por introdução da estrutura de núcleo ClXmCn.

[000121] Particularmente, as sequências imunoestimulatórias de ou fórmula (Va) e/ou (Vb) representam variantes de fórmula (III) conforme definido acima. Em um ácido nucleico de acordo com qualquer das fórmulas (Va) e/ou (Vb), os elementos de borda N, isto é Nu e/ou Nv, que limitam a estrutura de núcleo GlXmGn, são adicionalmente aumentadas por pelo menos uma haste ou estrutura de alça de haste, preferivelmente consistindo em elementos simples de alça de haste hastel e haste2. Nas sequências imunoestimulatórias de acordo com qualquer das fórmulas (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima, os elementos G, X e N, particularmente, a estrutura de núcleo GlXmGn, e os inteiros a, I, m, n, u e v são conforme definido acima. Mais preferivelmente inteiro a = 1. Opcionalmente u e/ou v pode ser 0. Adicionalmente, elementos Nw1 e Nw2, adjacentes aos elementos de alça de haste hastel e haste2, representam elementos de borda adicionais, que são definidos conforme descrito acima para elementos de borda Nu e/ou Nv. Particularmente, o elemento de borda N em geral é conforme descrito acima para N na fórmula (III) acima, e inteiros w1 e w2 são independentemente selecionados entre si e são definidos conforme acima na fórmula (III) para inteiros u e/ou v.

[000122] Neste contexto, uma haste ou estrutura de alça de haste é um emparelhamento de base intramolecular que pode ocorrer no DNA de fita simples ou, mais comumente, no RNA. A estrutura é também conhecida como um grampo de cabelo ou alça de grampo de cabelo. Isto ocorre quando duas regiões da mesma molécula, por exemplo, elementos de alça de haste haste1 e haste2, usualmente elementos de sequência palindrômico nas sequências de ácido nucleicos formam pares bases entre si, conduzindo a um alça não emparelhado (uma helicoidal dupla que termina em). O alça não emparelhado desse modo tipicamente representa uma região do ácido nucleico, que não mostra nenhuma ou quase identidade ou homologia com a sequência de ou haste1 ou haste2 e não é, desse modo, capaz de emparelhamento base com qualquer dos mesmos elementos de alça de haste. A estrutura em forma de pirulito é um bloco de construção chave de muitas estruturas secundárias de RNA. A formação de uma estrutura de alça de haste é, desse modo, dependente da estabilidade das regiões de alça e helicoidais resultantes, no qual o primeiro pré- requisito é tipicamente a presença de uma sequência que pode dobrar de volta em si para formar uma helicoidal dupla emparelhada. A estabilidade de elementos de alça de haste emparelhados é determinada pelo comprimento, o número de desequirapações ou saliências que eles contêm (um número pequeno de desequiparações é tipicamente tolerável, especialmente em uma helicoidal longa), e a composição base da região emparelhada. Por exemplo, emparelhamentos entre guanosina (guanina) e citidina (citosina) pode ser mais preferido em tais sequências, visto que eles têm três ligações de hidrogênio e são mais estáveis comparado a emparelhamentos de adenosina (adenina)-uridina (uracila), que têm somente dois. No RNA, emparelhamentos de guanosina (guanina)-uridina (uracila) que caracterizam duas ligações de hidrogênio podem, desse modo, ser favoráveis. A estabilidade do alça também influencia a formação da estrutura de alça de haste. "Circuitos fechados" (isto é, somente a alça não contendo elementos de alça de haste haste1 e haste2) que são menos do eu três bases longas são estericamente menos preferíveis. Contudo, hastes, isto é, formações que não mostram (definido) alça, mas apenas uma região não emparelhada entre haste1 e haste2 pode também serem incluídas. No contexto da presente invenção, comprimento de alça ótimo tende a ser cerca de 4-100 bases de comprimento, mais preferivelmente 4 a 50 ou ainda 4 a 30 ou ainda 4 a 20 bases.

[000123] Consequentemente, no contexto de uma sequência imunoestimulatória de acordo com qualquer das fórmulas (Va) e/ou (Vb), elementos de alça de haste haste1 e haste2 tipicamente representam partes de uma haste ou estrutura de alça de haste, no qual a haste ou estrutura de alça de haste podem ser formadas pelos elementos de alça de haste haste1 e haste2, e um alça pode ser formado por uma sequência, que está localizada entre estes elementos de alça de haste. A haste ou alça de haste podem ter a forma de uma helicoidal na região emparelhada de base. Cada elemento de alça de haste haste1 e haste2 é preferivelmente um ácido nucleico conforme definido acima, mais preferivelmente um RNA, e mais preferivelmente um RNA de fita simples, no qual qualquer dos nucleotídeos (nucleosídeos) ou análogos conforme definido acima para elemento de estrutura de núcleo X pode ser usado como nucleotídeos (nucleosídeos) para ou haste1 e/ou haste2. Adicionalmente, elemento de alça de haste haste1 representa uma sequência de elemento de alça palindrômica de haste1 haste2. Ambas sequências são, portanto, preferivelmente capazes de emparelharem por base entre si e, desse modo, juntos formarem base para uma haste ou alça de haste.

[000124] Portanto, elementos de alça de haste haste1 ou haste2 podem ser selecionados por par de qualquer sequência de ácido nucleico, provido que elementos de alça de haste haste1 ou haste2 são palindrômicos entre si, isto é, que uma sequência é igual à outra leitura de sequência (complementar) de volta ou mostra uma identidade ou homologia a esta sequência de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%, e mais preferivelmente de pelo menos 99% para outra sequência, quando da leitura posterior. Tais sequências palindrâmicas haste1 e haste2 podem ser formadas cada por uma sequência de ácido nucleico tendo um comprimento de cerca de 5 a 50, mais preferivelmente cerca de 5 a 40 e mais preferivelmente cerca de 5 a 30 ácido nucleicos, selecionados de adenosina (adenina), guanosina (guanina), citidina (citosina), uridina (uracila), timidina (timina), ou um análogo das mesmas conforme definido aqui.

[000125] Sequências exemplares para elementos de alça de haste haste1 e haste2 podem incluir, por exemplo a) para haste1: UAGCGAAGCUCUUGGACCUA (SEQ ID NO: 95)para haste2:UAGGUCCAAGAGCUUCGCUA (SEQ ID NO: 96) b) para hastel:UAGGUCCAAGAGCUUCGCUA (SEQ ID NO: 96)para haste2:UAGCGAAGCUCUUGGACCUA (SEQ ID NO: 95)c) para haste1:GCCGCGGGCCG (SEQ ID NO: 97)para haste2:CGGCCCGCGGC (SEQ ID NO: 98) d) para haste1:CGGCCCGCGGC (SEQ ID NO: 98) para haste2:GCCGCGGGCCG (SEQ ID NO: 97) e) para haste1:GACACGGUGC (SEQ ID NO: 99)para haste2:GCACCGUGCA (SEQ ID NO: 100)f) para haste1:GCACCGUGCA (SEQ ID NO: 100) para haste2:GACACGGUGC (SEQ ID NO: 99) g) para haste1:ACCUAGGU (SEQ ID NO: 101) para haste2:ACCUAGGU (SEQ ID NO: 101) h) para haste1:UGGAUCCA (SEQ ID NO: 102) para haste2:UGGAUCCA (SEQ ID NO: 102)i) para haste1:CCUGC (SEQ ID NO: 103) para haste2:GCAGG (SEQ ID NO: 104) j) para hastel:GCAGG (SEQ ID NO: 105)para haste2:CCUGC (SEQ ID NO:106) etc.

[000126] De acordo com uma primeira alternativa, a estrutura de núcleo GlXmGn pode estar localizada dentro da estrutura de alça de haste, isto é, a estrutura de núcleo GlXmGn pode estar localizada entre elementos de alça de haste haste1 e haste2, preferivelmente, desse modo, formando um alça. Tal molécula de ácido nucleico é determinada pela fórmula (Va), tendo a composição (Nu haste1 G[XmGnhaste2 Nv)a, conforme definido acima. Quando u e/ou v = 0, e a = 1 a fórmula (Va) pode conduzir a uma molécula de ácido nucleico específica "haste1 GlXmGn haste2", que é também incorporada pela presente invenção.

[000127] De acordo com outra alternativa, a estrutura de núcleo GlXmGn pode estar localizada fora da estrutura de alça de haste, no qual do mesmo modo elementos de alça de haste haste1 e haste2 podem ser separados entre si por uma sequência, preferivelmente um elemento de borda N, por exemplo, Nw1 ou Nw2, que então pode formar uma estrutura de alça sob emparelhamento base de elementos de alça de haste haste1 e haste2. Adicionalmente, elementos de alça de haste 1 e/ou 1, adjacentes à estrutura de núcleo GlXmGn podem ser separados da estrutura de núcleo GlXmGn por um elemento de borda adicional, por exemplo, Nw1 ou Nw2. De acordo com a presente invenção, tal ácido nucleico é determinado pela fórmula (Vb), tendo a composição (NuGXmGn Nv)a haste1 Nw1 haste2 Nw2, conforme definido acima.

[000128] A sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (Va) e/ou (Vb) pode ser de fita simples, ou parcialmente de fita dupla. Se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (Va) e/ou (Vb) é uma molécula de ácido nucleico de fita simples, a sequência é tipicamente de fita simples sobre seu comprimento total. Se a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (Va) e/ou (Vb) é a parcialmente de molécula de ácido nucleico de fita dupla, a molécula de ácido nucleico de ou fórmula (Va) e/ou (Vb) preferivelmente pode ser de fita simples na região dos elementos de alça de haste haste1 e haste2 e nas regiões do alça formado por ou a estrutura de núcleo GlXmGn ou por qualquer outro elemento, por exemplo, Nw1 ou Nw2. Elementos posicionados fora dos elementos de alça de haste haste1 e haste2 e nas regiões do alça formado por ou a estrutura de núcleo GlXmGn ou por qualquer outro elemento, por exemplo, Nw1 ou Nw2, pode então ser, independente entre si, de fita simples ou dupla. Alternativamente ou adicionalmente uma mistura de uma molécula de ácido nucleico de fita simples ou parcialmente de fita dupla de acordo com ou fórmula (Va) ou (Vb) e a (parcialmente) de molécula de ácido nucleico de fita dupla de acordo com ou fórmula (Va) ou (Vb), preferivelmente em uma proporção de cerca de 1:10 a 10:1, mais preferivelmente em uma proporção de 1:3 a 3:1.

[000129] De acordo com uma concretização muito particularmente preferida, a sequência imunoestimulatória de acordo com ou fórmula (Va) e/ou (Vb), respectivamente, pode ser selecionada de, por exemplo, qualquer das seguintes sequências:- UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UAGGUCCAAG AGCUUCGCUA(SEQ ID NO: 107)- UAGCGAAGCU CUUGGACCUA GG UUUUU UUUUU UUUUU GGG UGCGUUCCUA GAAGUACACG GCCGCGGGCCG UGCGUUCCUA GAAGUACACG CGGCCCGCGGCUGCGUUCCUA GAAGUACACG (SEQ ID NO: 108) (hastel e haste2 são sublinhadas, a estrutura de núcleo GXmGn é escrita em negrito);

[000130] A sequência imunoestimulatória de fórmula (I), (II), (III),(IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb), conforme definido acima, é tipicamente um ácido nucleico, que pode ser na forma de qualquer DNA ou RNA, preferivelmente, sem estar limitado a estes, um DNA circular ou linear ou RNA, um DNA de fita simples ou dupla ou RNA (que pode também estar relacionado a um DNA ou RNA devido a associação não covalente de dois DNAs de fita simples ou RNAs) ou um DNA de fita parcialmente dupla ou RNA (que é tipicamente formado por uma mais longa e pelo menos mais curta molécula de DNA de fita simples ou RNA ou por pelo menos duas moléculas de DNA de fita simples ou RNA, que são cerca de igual em comprimento, no qual uma ou mais das moléculas de DNA de fita simples ou RNA são em parte complementares a uma ou mais moléculas de DNA de fita simples ou RNA e, desse modo, formam um RNA de fita dupla nesta região), por exemplo, um DNA (parcialmente) de fita simples ou RNA, misturados com regiões de um DNA (parcialmente) de fita dupla ou RNA. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico de fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima pode ser na forma de um DNA de fita simples ou dupla, ou RNA, mais preferivelmente um DNA parcialmente de fita dupla ou RNA. É também preferido que a sequência imunoestimulatória de fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima é na forma de uma mistura de um DNA nucleico de fita simples e de fita dupla ou RNA.

[000131] É particularmente vantajoso se a sequência imunoestimulatória de fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima é uma molécula de ácido nucleico de fita parcialmente dupla, visto que tal (parcialmente de fita dupla) sequência imunoestimulatória de acordo com fórmula (I), (II), (III),(IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima), pode positivamente estimular a resposta imune inata em um paciente a ser tratado pelo endereçamento de receptores de PAMP-(modelo molecular associado a patogenia) para o RNA de fita simples (TLR-7 e TLR-8), bem como os receptores de PAMP para RNA de fita dupla (TLR-3, RIG-I e MDA-5). Receptores TLR-3, TLR-7 e TLR-8 estão localizados no endossomo e são ativados por RNA tomado pelo endossomo. Em contraste, RIG-I e MDA-5 são receptores citoplásmicos que são ativados por RNA, que foi diretamente tomado no citoplasma ou que foram liberados dos endossomos (liberação de endossomal ou escape endossomal). Consequentemente, qualquer sequência imunoestimulatória de fita parcialmente dupla de fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima é capaz de ativar cascatas de sinal diferentes de imunoestimulação e, desse modo, conduz a uma resposta imune inata ou intensifica tal resposta significantemente.

[000132] Moléculas de ácido nucleico de ou fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima, podem ser preparadas usando-se qualquer método conhecido na técnica, incluindo métodos sintéticos tais como, por exemplo, síntese de fase sólida, bem como métodos in vitro tais como reações de transcrição in vitro. Preferivelmente, uma transcrição in vitro é usada para preparação das sequências imunoestimulatórias. Conforme surpreendentemente verificado pelos inventores da presente invenção, moléculas de ácido nucleico de ou fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima mostram uma ainda melhor estimulação do sistema humano inato, quando preparadas por uma transcrição in vitro devido a seu 5'-fosfato, quando comparado a moléculas de ácido nucleico de ou fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) preparadas por métodos sintéticos. Tal estimulação do sistema humano inato é, sem estar ligado a esta, contribuído para a ativação do receptor RIG-1. Consequentemente, moléculas de ácido nucleico de ou fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb) conforme definido acima são particularmente preferidas, quando preparadas por uma reação de transcrição in vitro.

[000133] Além disso, (classes de) moléculas de RNA, que podem ser usadas para o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, pode incluir qualquer outro RNA capaz de induzir uma resposta imune. Sem estar limitado a isto, tal RNA imunoestimulatório pode incluir RNA ribossomal (rRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA mensageiro (mRNA), e RNA viral (vRNA).

[000134] De acordo com uma terceira concretização, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser um siRNA. Um siRNA é de interesse particularmente em conjunto com o fenômeno de interferência de RNA. Atenção foi dada ao fenômeno de interferência de RNA no curso de pesquisa imunológica. Nos anos recentes, um mecanismo de defesa à base de RNA foi descoberto, que ocorre ambos no reino dos fungos e no reino de planta e animal e age como um "sistema humano do genoma". O sistema foi originalmente descrito em várias espécies independentemente de um outro, primeiro em C. elegans, antes de ser possível identificar os mecanismos subjacentes dos processos como sendo idênticos: resistência de vírus mediada por RNA em plantas, PTGS (silenciamento de gene pós-transcricional) em plantas, e interferência de RNA em eucariotes são consequentemente baseados em um procedimento comum. A técnica in vitro de interferência de RNA (RNAi) é baseada em moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA), que disparam a supressão específica de sequência de expressão de gene (Zamore (2001) Nat. Struct. Biol. 9: 746-750; Sharp (2001) Genes Dev. 5:485-490: Hannon (2002) Nature 41: 244-251). Na transfecção de células de mamífero com dsRNA longo, a ativação de proteína kinase R e RnaseL traz cerca de efeitos não específicos, tais como, por exemplo, uma resposta de interferon (Stark et al. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264; He e Katze (2002) Viral Immunol. 15: 95-119). Recentemente, moléculas de dsRNA foram tambémusadas in vivo (McCaffrey et al. (2002), Nature 418: 38-39; Xia et al. (2002), Nature Biotech. 20: 1006-1010; Brummelkamp eta/. (2002),Cancer Cell 2: 243-247). Desse modo, um siRNA usado para o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser um RNA imunoestimulatório, e tipicamente compreende uma sequência de RNA (de fita simples ou) de fita dupla, preferivelmente uma sequência de RNA de fita dupla, com cerca de 8 a 30 nucleotídeos, preferivelmente 17 a 25 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente de 20 a 25 e, mais preferivelmente, de 21 a 23 nucleotídeos. Em princípio, todas as seções tendo um comprimento de 17 a 29, preferivelmente de 19 a 25, mais preferivelmente de 21 a 23 pares base que ocorrem na região de codificação de uma sequência de RNA conforme mencionado acima pode servir uma sequência alvo para tal siRNA. Igualmente, siRNAs podem também serem direcionados contra sequências de nucleotídeo de uma proteína, particularmente de proteínas regulatórias, que regulam negativamente indução de uma resposta imune (inata ou adaptativa), que não ocorre na região de codificação, em particular na 5' região de não codificação do RNA, por exemplo, portanto, contra regiões de não codificação de um RNA tendo uma função regulatória. A sequência alvo do si RNA, usada como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, pode, portanto, ocorrer na região transladada e/ou não transladada da sequência de nucleotídeo de tal proteína conforme definido acima e/ou na região de seus elementos de controle. A sequência alvo de um siRNA conforme definido acima pode também ocorrer na região de sobreposição de sequência não transladada e transladada; em particular, a sequência alvo pode compreender pelo menos um nucleotídeo à montante do trio de partida da região de codificação do RNA.

[000135] De acordo com uma quarta concretização, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser um RNA de antissenso. No contexto da presente invenção, um RNA de antissenso é preferivelmente uma molécula de RNA (de fita simples) transcrita fora da codificação, preferivelmente do que gabarito, fita de um DNA, de modo que (preferivelmente) a sequência de mRNA de antissenso (total) é complementar ao RNA de sentido (mensageiro). Um RNA de antissenso conforme definido aqui tipicamente forma um duplex entre as moléculas de RNA de sentido e de RNA de antissenso e é, desse modo, capaz de bloquear transcrição da fita de codificação. Um RNA de antissenso usado como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser direcionado contra as sequências de nucleotídeo, por exemplo, um (que ocorre naturalmente) mRNA ou sequência genômica que codifica uma proteína ou peptídeo, que pode ser selecionado de qualquer proteína ou sequência de peptídeo adequada para esta proposta. Preferivelmente, o RNA de antissenso usado aqui como pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção compreende um comprimento conforme definido acima em geral para moléculas de RNA, mais preferivelmente um comprimento de 1000 a 5000, de 500 a 5000, de 5 a 5000, ou de 5 a 1000, 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 ou de 5 a 30 nucleotídeos.

[000136] De acordo com uma quinta concretização, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser um RNA de codificação. Tal RNA de codificação pode ser qualquer RNA conforme definido acima. Preferivelmente, tal RNA de codificação pode ser um RNA de fita simples ou de fita dupla, mais preferivelmente um RNA de fita simples, e/ou um RNA circular ou linear, mais preferivelmente um RNA linear. Ainda mais preferivelmente, o RNA de codificação pode ser um RNA (linear) de fita simples. Mais preferivelmente, o RNA de codificação pode ser um RNA mensageiro ((linear) de fita simples) (mRNA). O RNA de codificação usado como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode adicionalmente codificar uma proteína ou um peptídeo, que pode ser selecionado, sem estar restrito a este, por exemplo, de proteínas terapeuticamente ativas ou peptídeos, de antígenos, por exemplo, antígenos de tumor, antígenos patogênicos (por exemplo, selecionado de proteínas patogênicas conforme definido acima ou de antígenos de animal, antígenos virais, antígenos de protozoários, antígenos bacteriais, antígenos alérgicos), antígenos autoimunes, ou antígenos adicionais, de alérgenos, de anticorpos, de proteínas imunoestimulatórias ou peptídeos, de receptores de célula T específicas de antígeno, ou de qualquer outra proteína ou peptídeo adequado para uma aplicação específica (terapêutica), no qual o RNA de codificação usado como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser transportado em uma célula, um tecido ou um organismo e a proteína pode ser expressa subsequentemente nesta célula, tecido ou organismo. a) Proteínas terapeuticamente ativas

[000137] Neste contexto, proteínas terapeuticamente ativas codificadas por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória pode ser selecionado de quaisquer proteínas recombinantes que ocorrem naturalmente ou isoladas conhecidas a um versado na técnica. Sem estar restrito a isto, proteínas terapeuticamente ativas podem compreender proteínas capazes de estimularem ou inibirem a transdução de sinal na célula, por exemplo, citoquinas, anticorpos, etc. Proteínas terapeuticamente ativas podem, desse modo, compreender citoquinas de classe I da família de citoquinas, tendo 4 resíduos de cisteína posicionalmente conservados (CCCC) e compreendendo um motivo de sequência conservado Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS), no qual X é a um aminoácido não conservado. Citoquinas de classe I da família de citoquinas compreendem a GM-CSF subfamília, por exemplo, IL-3, IL- 5, GM-CSF, the IL-6-subfamília, por exemplo, IL-6, IL-11, IL-12, ou a IL-2-subfamília, por exemplo, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, etc., ou as citoquinas IL-1 alfa, IL-1beta, IL-10 etc. Proteínas terapeuticamente ativas podem também compreender citoquinas de classe II da família de citoquinas, que também compreende 4 resíduos de cisteína positionalmente conservados (CCCC), mas nenhum motivo de sequência conservado Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS). Citoquinas de classe II da família de citoquinas compreendem, por exemplo, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, etc. Proteínas terapeuticamente ativas podem adicionalmente compreenderem citoquinas da família de fatores de necrose de tumor, por exemplo, TNF-alfa, TNF-beta, etc., ou citoquinas da família de chemoquinas, que compreendem 7 helicoidais de transmembrana e interagem com G-proteína, por exemplo, IL-8, MIP-1, RANTES, CCR5, CXR4, etc., ou receptores específicos de citoquina, tais como TNF-Rl, TNF-RII, CD40, OX40 (CD134), Fas,.

[000138] Proteínas terapeuticamente ativas codificadas por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória podem também ser selecionadas de qualquer das proteínas dadas no seguinte: 0ATL3, 0FC3, 0PA3, 0PD2, 4-1 BBL, 5T4, 6Cquina, 707-AP, 9D7, A2M, AA, AAAS, AACT, AASS, ABAT, ABCA1, ABCA4, ABCB1, ABCB11, ABCB2, ABCB4, ABCB7, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCD1, ABCD3, ABCG5, ABCG8, ABL1, ABO, ABR ACAA1, ACACA, ACADL, ACADM, ACADS, ACADVL, ACAT1, ACCPN, ACE, ACHE, ACHM3, ACHM1, ACLS, ACPI, ACTA1, ACTC, ACTN4, ACVRL1, AD2, ADA, ADAMTS13, ADAMTS2, ADFN, ADH1B, ADH1C, ADLDH3A2, ADRB2, ADRB3, ADSL, AEZ, AFA, AFD1, AFP, AGA, AGL, AGMX2, AGPS, AGS1, AGT, AGTR1, AGXT, AH02, AHCY, AHDS, AHHR, AHSG, AIC, AIED, AIH2, AIH3, AIM-2, AIPL1, AIRE, AK1, ALAD, ALAS2, ALB, HPG1, ALDH2, ALDH3A2, ALDH4A1, ALDH5A1, ALDH1A1, ALDOA, ALDOB, ALMS1, ALPL, ALPP, ALS2, ALX4, AMACR, AMBP, AMCD, AMCD1, AMCN, AMELX, AMELY, AMGL, AMH, AMHR2, AMPD3, AMPD1, AMT, ANC, ANCR, ANK1, ANOP1, AOM, AP0A4, AP0C2, AP0C3, AP3B1, APC, aPKC, APOA2, APOA1, APOB, APOC3, APOC2, APOE, APOH, APP, APRT, APS1, AQP2, AR, ARAF1, ARG1, ARHGEF12, ARMET, ARSA, ARSB, ARSC2, ARSE, ART-4, ARTC1/m, ARTS, ARVD1, ARX, AS, ASAH, ASAT, ASD1, ASL, ASMD, ASMT, ASNS, ASPA, ASS, ASSP2, ASSP5, ASSP6, AT3, ATD, ATHS, ATM, ATP2A1, ATP2A2, ATP2C1, ATP6B1, ATP7A, ATP7B, ATP8B1, ATPSK2, ATRX, ATXN1, ATXN2, ATXN3, AUTS1, AVMD, AVP, AVPR2, AVSD1, AXIN1, AXIN2, AZF2, B2M, B4GALT7, B7H4, BAGE, BAGE-1, BAX, BBS2, BBS3, BBS4, BCA225, BCAA, BCH, BCHE, BCKDHA, BCKDHB, BCL10, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCPM, BCR, BCR/ABL, BDC, BDE, BDMF, BDMR, BEST1, beta-Catenin/m, BF, BFHD, BFIC, BFLS, BFSP2, BGLAP,BGN, BHD, BHR1, BING-4, BIRC5, BJS, BLM, BLMH, BLNK, BMPR2, BPGM, BRAF, BRCA1, BRCA1/m, BRCA2, BRCA2/m, BRCD2, BRCD1, BRDT, BSCL, BSCL2, BTAA, BTD, BTK, BUB1, BWS, BZX, C0L2A1, C0L6A1, C1NH, C1QA, C1QB, C1QG, CIS, C2, C3, C4A, C4B, C5, C6, C7, C7orf2, C8A, C8B, C9, CA125, CA15-3/CA 27-29, CA195, CA19-9, CA72-4, CA2, CA242, CA50, CABYR, CACD, CACNA2D1, CACNA1A, CACNA1F, CACNA1S, CACNB2, CACNB4, CAGE, CA1, CALB3, CALCA, CALCR, CALM, CALR, CAM43, CAMEL, CAP-1, CAPN3, CARD15, CASP-5/m, CASP-8, CASP-8/m, CASR, CAT, CATM, CAV3, CB1, CBBM, CBS, CCA1, CCAL2, CCAL1, CCAT, CCL-1, CCL-11, CCL-12, CCL-13, CCL-14, CCL-15, CCL-16, CCL-17, CCL-18, CCL-19, CCL-2, CCL-20, CCL-21, CCL-22, CCL-23, CCL-24, CCL-, CCL-27, CCL-3, CCL-4, CCL-5, CCL-7, CCL-8, CCM1, CCNB1, CCND1, CCO, CCR2, CCR5, CCT, CCV, CCZS, CD1, CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD27L, cD3, CD30, CD30, CD30L, CD33, CD36, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD44v, CD44v6, CD52, CD55, CD56, CD59, CD80, CD86, CDAN1, CDAN2, CDAN3, CDC27, CDC27/m, CDC2L1, CDH1, CDK4, CDK4/m,CDKN1C, CDKN2A, CDKN2A/m, CDKN1A, CDKN1C, CDL1, CDPD1, CDR1, CEA, CEACAM1, CEACAM5, CECR, CECR9, CEPA, CETP, CFNS, CFTR, CGF1, CHAC, CHED2, CHED1, CHEK2, CHM, CHML, CHR39C, CHRNA4, CHRNA1, CHRNB1, CHRNE, CHS, CHS1, CHST6, CHX10, CIAS1, CIDX, CKN1, CLA2, CLA3, CLA1, CLCA2, CLCN1, CLCN5, CLCNKB, CLDN16, CLP, CLN2, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6, CLN8, C1QA, C1QB, C1QG, C1 R, CLS, CMCWTD, CMDJ, CMD1A, CMD1B, CMH2, MH3, CMH6, CMKBR2, CMKBR5, CML28, CML66, CMM, CMT2B, CMT2D, CMT4A, CMT1A, CMTX2, CMTX3, C- MYC, CNA1, CND, CNGA3, CNGA1, CNGB3, CNSN, CNTF, COA- 1/m, COCH, COD2, COD1, COH1, COL10A, COL2A2, COL11A2, COL17A1, COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL4A6, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL7A1, COL8A2, COL9A2, COL9A3, COL11A1, COL1A2, COL23A1, COL1A1, COLQ, COMP, COMT, CORD5, CORD1, COX10, COX-2, CP, CPB2, CPO, CPP, CPS1, CPT2, CPT1A, CPX, CRAT, CRB1, CRBM, CREBBP, CRH, CRHBP, CRS, CRV, CRX, CRYAB, CRYBA1, CRYBB2, CRYGA, CRYGC, CRYGD, CSA, CSE, CSF1 R, CSF2RA,CSF2RB, CSF3R, CSF1R, CST3, CSTB, CT, CT7, CT-9/BRD6,CTAA1, CTACK, CTEN, CTH, CTHM, CTLA4, CTM, CTNNB1, CTNS, CTPA, CTSB, CTSC, CTSK, CTSL, CTS1, CUBN, CVD1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CYB5, CYBA, CYBB, CYBB5, , CYFRA 21-1, CYLD, CYLD1, CYMD, CYP11B1, CYP11 B2, CYP1 7, CYP17A1, CYP19, CYP19A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP21A2, CYP27A1, CYP27B1, CYP2A6, CYP2C, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D, CYP2D6, CYP2D7P1, CYP3A4, CYP7B1, CYPB1, CYP11B1, CYP1A1, CYP1B1, CYRAA, D40,DADI, DAM, DAM-10/MAGE-B1, DAM-6/MAGE-B2, DAX1, DAZ, DBA, DBH, DBI, DBT, DCC, DC-CK1, DCK, DCR, DCX, DDB 1, DDB2, DDIT3, DDU, DECR1, DEK-CAN, DEM, DES, DF,DFN2, DFN4, DFN6, DFNA4, DFNA5, DFNB5, DGCR, DHCR7, DHFR, DHOF, DHS, DIA1, DIAPH2, DIAPH1, DIH1, DIOI, DISCI, DKC1, DLAT, DLD, DLL3, DLX3, DMBT1, DMD, DM1, DMPK, DMWD, DNAI1, DNASE1, DNMT3B, DPEP1, DPYD, DPYS, DRD2, DRD4, DRPLA, DSCR1, DSG1, DSP, DSPP, DSS, DTDP2, DTR, DURS1, DWS, DYS, DYSF, DYT2, DYT3, DYT4, DYT2, DYT1, DYX1, EBAF, EBM, EBNA, EBP, EBR3, EBS1, ECA1, ECB2, ECE1, ECGF1, ECT, ED2, ED4, EDA, EDAR, ECA1, EDN3, EDNRB, EEC1, EEF1A1L14, EEGV1, EFEMP1, EFTUD2/m, EGFR, EGFR/Herl, EGI, EGR2, EIF2AK3, elF4G, EKV, ElE, ELA2, ELF2, ELF2M, ELK1, ELN, ELONG, EMD, EML1, EMMPRIN, EMX2, ENA-78, ENAM, END3, ENG, EN01, ENPP1, ENUR2, ENUR1, EOS, EP300, EPB41, EPB42, EPCAM, EPD, EphA1, EphA2, EphA3, EphrinA2, EphrinA3, EPHX1, EPM2A, EPO,EPOR, EPX, ERBB2, ERCC2 ERCC3,ERCC4, ERCC5, ERCC6, ERVR, ESR1, ETFA, ETFB, ETFDH, ETM1, ETV6-AML1, ETV1, EVC, EVR2, EVR1, EWSR1, EXT2, EXT3, EXT1, EYA1, EYCL2, EYCL3, EYCL1, EZH2, F10, F11, F12, F13A1, F13B, F2, F5, F5F8D, F7, F8, F8C, F9, FABP2, FACL6, FAH, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCF, FasL, FBN2, FBN1, FBP1, FCG3RA,FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCHL, FCMD, FCP1, FDPSL5, FECH, FEO, FEOM1, FES, FGA, FGB, FGD1, FGF2, FGF23, FGF5, FGFR2, FGFR3, FGFR1, FGG, FGS1, FH, FIC1, FIH, F2, FKBP6, FLNA, FLT4, FM03,FM04, FMR2, FMR1, FN, FN1/m, FOXC1, FOXE1, FOXL2, FOXOIA, FPDMM, FPF, Fra-1, FRAXF, FRDA, FSHB, FSHMD1A, FSHR, FTH1, FTHL17, FTL, FTZF1, FUCA1, FUT2, FUT6, FUT1, FY, G250, G250/CAIX, G6PC, G6PD, G6PT1, G6PT2, GAA, GABRA3, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GALC, GALE, GALKl, GALNS, GALT, GAMT, GAN, GAST, GASTRIN17, GATA3, GATA, GBA, GBE, GC, GCDH, GCGR, GCH1, GCK, GCP-2, GCS1, G-CSF, GCSH, GCSL, GCY, GDEP,GDF5, GDI1, GDNF, GDXY, GFAP, GFND, GGCX, GGT1, GH2, GH1, GHR, GHRHR, GHS, GIF, GINGF, GIP, GJA3, GJA8, GJB2, GJB3, GJB6, GJB1, GK, GLA, GLB, GLB1, GLC3B, GLC1B, GLC1C, GLDC, GLB, GLP1, GLRA1, GLUD1, GM1 (fuc-GM1), GM2A, GM-CSF, GMPR, GNAI2, GNAS, GNAT1, GNB3, GNE, GNPTA, GNRH, GNRH1, GNRHR, GNS, GnT-V, gp100, GP1BA, GP1BB, GP9, GPC3, GPD2, GPDS1, GPI, GP1BA, GPN1LW, GPNMB/m, GPSC, GPX1, GRHPR, GRK1, GROa, GROp, GROy, GRPR, GSE, GSM1, GSN, GSR, GSS, GTD, GTS, GUCA1A, GUCY2D, GULOP, GUSB, GUSM, GUST, GYPA, GYPC, GYS1, GYS2, H0KPP2, H0MG2, HADHA, HADHB, HAGE, HAGH, HAL, HAST-2, HB 1, HBA2, HBA1, HBB, HBBP1, HBD, HBE1, HBG2, HBG1, HBHR, HBP1, HBQ1, HBZ, HBZP, HCA, HCC-1, HCC-4, HCF2, HCG, HCL2, HCL1, HCR, HCVS, HD, HPN, HER2, HER2/NEU, HER3, HERV-K-MEL, HESX1, HEXA, HEXB, HF1, HFE, HF1, HGD, HHC2, HHC3, HHG, HK1 HLA-A, HLA-A*0201-R170I, HLA-Al1/m, HLA-A2/m, HLA-DPB1 HLA-DRA, HLCS, HLXB9, HMBS, HMGA2, HMGCL, HMI, HMN2, HMOX1, HMS1 HMW-MAA, HND, HNE, HNF4A, HOAC, HOMEOBOX NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM- TES-85, HOXA1 HOXD13, HP, HPC1, HPD, HPE2, HPE1, HPFH, HPFH2, HPRT1, HPS1, HPT, HPV-E6, HPV-E7, HR, HRAS, HRD, HRG, HRPT2, HRPT1, HRX, HSD11B2, HSD1 7B3, HSD17B4, HSD3B2, HSD3B3, HSN1, HSP70-2M, HSPG2, HST-2, HTC2, HTC1, hTERT, HTN3, HTR2C, HVBS6, HVBS1, HVEC, HV1S, HYAL1, HYR, I-309, IAB, IBGC1, IBM2, ICAM1, ICAM3, iCE, ICHQ, ICR5, ICR1, ICS 1, IDDM2, IDDM1, IDS, IDUA, IF, IFNa/b, IFNGR1, IGAD1, IGER, IGF- 1R, IGF2R, IGF1, IGH, IGHC, IGHG2, IGHG1, IGHM, IGHR, IGKC, IHG1, IHH, IKBKG, IL1, IL-1 RA, IL10, IL-11, IL12, IL12RB1, IL13, IL- 13Ra2, IL-15, IL-16, IL-1 7, IL18, IL-1 a, IL-1 a, IL-1b, IL-1p, IL1RAPL1, IL2, IL24, IL-2R, IL2RA, IL2RG, IL3, IL3RA,IL4, IL4R,IL4R, IL-5, IL6, IL-7, IL7R, IL-8, IL-9, receptor de laminin imaturo, IMMP2L, INDX, INFGR1, INFGR2, INFa, IFN, INFy, INS, INSR, INVS, IP-10, IP2, IPF1, IP1, IRF6, IRS1, ISCW, ITGA2, ITGA2B, ITGA6, ITGA7, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITIH1, ITM2B, IV, IVD, JAG1, JAK3, JBS, JBTS1, JMS, JPD, KAL1, KAL2, KALI, KLK2, KLK4, KCNA1, KCNE2, KCNE1, KCNH2, KCNJ1, KCNJ2, KCNJ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ1, KCS, KERA, KFM, KFS, KFSD, KHK, ki-67, KIAA0020, KIAA0205,KIAA0205/m, KIF1B, KIT, KK-LC-1, KLK3, KLKB1, KM-HN-1, KMS, KNG, KNO, K-RAS/m, KRAS2, KREV1, KRT1, KRT10, KRT12, KRT13, KRT14, KRT14L1, KRT14L2, KRT14L3,KRT16, KRT16L1, KRT16L2, KRT17, KRT18, KRT2A, KRT3, KRT4, KRT5, KRT6 A, KRT6B, KRT9, KRTHB1, KRTHB6, KRT1, KSA, KSS, KWE, KYNU, L0H19CR1, L1CAM, LAGE, LAGE-1, LALL, LAMA2, LAMA3, LAMB3, LAMB1, LAMC2, LAMP2, LAP, LCA5, LCAT, LCCS, LCCS 1, LCFS2, LCS1, LCT, LDHA, LDHB, LDHC, LDLR, LDLR/FUT, LEP, LEWISY, LGCR, LGGF-PBP, LGI1, LGMD2H, LGMD1A, LGMD1B, LHB, LHCGR, LHON, LHRH, LHX3, LIF, LIG1, LIMM, LIMP2, LIPA, LIPA, LIPB, LIPC, LIVIN, L1CAM, LMAN1, LMNA, LMX1 B, LOLR, LOR, LOX, LPA, LPL, LPP, LQT4, LRP5, LRS 1, LSFC, LT- B , LTBP2, LTC4S, LYL1, XCL1, LYZ, M344, MA50, MAA, MADH4, MAFD2,MAFD1, MAGE, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGEB1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1,MAGE-HI, MAGEL2, MGB1, MGB2, MAN2A1, MAN2B1, MANBA, MANBB, MAOA, MAOB, MAPK8IP1, MAPT, MART-1, MART-2, MART2/m, MAT1A, MBL2, MBP, MBS1, MC1 R, MC2R, MC4R, MCC, MCCC2, MCCC1, MCDR1, MCF2, MCKD, MCL1, MC1R, MCOLN1, MCOP, MCOR, MCP-1, MCP- 2, MCP-3, MCP-4, MCPH2, MCPH1, MCS, M-CSF, MDB, MDCR, MDM2, MDRV, MDS 1, ME1, ME1/m, ME2, ME20, ME3, MEAX, MEB, MEC CCL-28, MECP2, MEFV, MELANA, MELAS, MEN1 MSLN, MET, MF4, MG50, MG50/PXDN, MGAT2, MGAT5, MGC1 MGCR, MGCT, MGI, MGP, MHC2TA, MHS2, MHS4, MIC2, MIC5, MIDI, MIF, MIP, MIP-5/HCC-2, MITF, MJD, MKI67, MKKS, MKS1, MLH1, MLL, MLLT2, MLLT3, MLLT7, MLLT1, MLS, MLYCD, MMA1a, MMP 11, MMVP1, MN/CA IX-Antígeno, MNG1, MN1, MOC31, MOCS2, MOCS1, MOG, MORC, MOS, MOV18, MPD1, MPE, MPFD, MPI, MPIF-1, MPL, MPO, MPS3C, MPZ, MRE11A, MROS, MRP1, MRP2, MRP3, MRSD, MRX14, MRX2, MRX20, MRX3, MRX40, MRXA, MRX1, MS, MS4A2, MSD, MSH2, MSH3, MSH6, MSS, MSSE, MSX2, MSX1, MTATP6, MTC03, MTC01, MTCYB, MTHFR, MTM1, MTMR2, MTND2, MTND4, MTND5, MTND6, MTND1, MTP, MTR, MTRNR2, MTRNR1, MTRR,MTTE, MTTG, MTTI, MTTK, MTTL2, MTTL1, MTTN, MTTP, MTTS1, MUC1,MUC2, MUC4, MUC5AC, MUM-1, MUM-1/m, MUM-2, MUM-2/m, MUM-3, MUM-3/m, MUT, mutante p21 ras, MUTYH, MVK, MX2, MXI1, MY05A, MYB, MYBPC3, MYC, MYCL2, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYMY, MY015A, MY01G, MY05A, MY07A, MYOC, Myosin/m, MYP2, MYP1, NA88-A, N-acetilglucosaminiltransferase-V, NAGA, NAGLU, NAMSD, NAPB, NAT2, NAT, NBIA1, NBS1, NCAM, NCF2, NCF1, NDN , NDP, NDUFS4, NDUFS7, NDUFS8, NDUFV1, NDUFV2, NEB, NEFH, NEM1, Neo-PAP, neo-PAP/m, NEU1, NEUROD1, NF2, NF1, NFYC/m, NGEP, NHS, NKS1, NKX2E, NM, NME1, NMP22, NMTC, NODAL, NOG, NOS3, NOTCH3, NOTCH1, NP, NPC2, NPC1, NPHL2, NPHP1, NPHS2, NPHS1, NPM/ALK, NPPA, NQOI, NR2E3, NR3C1, NR3C2, NRAS, NRAS/m, NRL, NROB1, NRTN, NSE, NSX, NTRK1, NUMA1, NXF2, NY-C01, NY- ES01, NY-ESO-B, NY-LU-12, ALDOA, NYS2, NYS4, NY-SAR-35, NYS1, NYX, OA3, OA1, OAP, OASD, OAT, OCA1, OCA2, OCD1, OCRL, OCRL1, OCT, ODDD, ODT1, OFC1, OFD1, OGDH, OGT, OGT/m, OPA2, OPA1, OPD1, OPEM, OPG, OPN, OPN1LW, OPN1MW, OPN1SW, OPPG, OPTB1, TTD, ORM1, ORP1, OS-9, OS- 9/m, OSM LIF, OTC, OTOF, OTSC1, OXCT1, OYTES1, PI 5, PI 90 MINOR BCR-ABL, P2RY12, P3, P16, P40, P4HB, P-501, P53, P53/m, P97, PABPN1, PAFAH1B1, PAFAH1P1, PAGE-4, PAGE-5, PAH, PAI- 1, PAI-2, PAK3, PAP, PAPPA, PARK2, PART-1, PATE, PAX2, PAX3, PAX6, PAX7, PAX8, PAX9, PBCA, PBCRA1, PBT, PBX1, PBXP1, PC, PCBD, PCCA, PCCB, PCK2, PCK1, PCLD, PCOS1, PCSK1, PDB1, DCN, PDE6A, PDE6B, PDEF, PDGFB, PDGFR, PDGFRL, PDHA1, PDR, PDX1, PECAM1, PEE1, PEOI, PEPD, PEX10, PEX12, PEX13, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX1, PF4, PFBI, PFC, PFKFB1, PFKM, PGAM2, PGD, PGK1, PGK1P1, PGL2, PGR, PGS, PHA2A, PHB, PHEX, PHGDH, PHKA2, PHKA1, PHKB, PHKG2, PHP, PHYH, PI, PI3, PIGA, PIM1-KINASE, PIN1, PIP5K1B, PITX2, PITX3, PKD2, PKD3, PKD1, PKDTS, PKHD1, PKLR, PKP1, PKU1, PLA2G2A, PLA2G7, PLAT, PLEC1, PLG, PLI, PLOD, PLP1, PMEL17, PML, PML/RARa, PMM2, PMP22, PMS2, PMS1, PNKD, PNLIP, POF1, POLA, POLH, POMC, PON2, PON1, PORC, POTE, POU1F1, POU3F4, POU4F3, POU1F1, PPAC, PPARG, PPCD, PPGB, PPH1, PPKB, PPMX, PPOX, PPP1R3A, PPP2R2B, PPT1, PRAME, PRB, PRB3, PRCA1, PRCC, PRD, PRDX5/m, PRF1, PRG4, PRKAR1A, PRKCA, PRKDC, PRKWNK4, PRNP, PROC, PRODH, PROM1, PROP1, PROS1, PRST, PRP8, PRPF31, PRPF8, PRPH2, PRPS2, PRPS1, PRS, PRSS7, PRSS1, PRTN3, PRX, PSA, PSAP, PSCA, PSEN2, PSEN1, PSG1, PSGR, PSM, PSMA, PSORS1, PTC, PTCH, PTCH1, PTCH2, PTEN, PTGS1, PTH, PTHR1, PTLAH, PTOS1, PTPN12, PTPNI I, PTPRK, PTPRK/m, PTS, PUJO, PVR, PVRL1, PWCR, PXE, PXMP3, PXR1, PYGL, PYGM, QDPR, RAB27A, RAD54B, RAD54L, RAG2, RAGE, RAGE-1, RAG1, RAP1, RARA, RASA1, RBAF600/m, RB1, RBP4, RBP4, RBS, RCA1, RCAS1, RCCP2, RCD1, RCV1, RDH5, RDPA, RDS, RECQL2, RECQL3, RECQL4, REG1A, REHOBE, REN, RENBP, RENS1, RET, RFX5,RFXANK, RFXAP, RGR, RHAG, RHAMM/CD168, RHD, RHO,Rip-1, RLBP1, RLN2, RLN1, RLS, RMD1, RMRP, ROM1, ROR2, RP, RP1, RP14, RP1 7, RP2, RP6, RP9, RPD1, RPE65, RPGR, RPGRIP1, RP1, RP10, RPS19, RPS2, RPS4X, RPS4Y, RPS6KA3, RRAS2, RS1, RSN, RSS, RU1, RU2, RUNX2,RUNXI, RWS, RYR1, S-100, SAA1, SACS, SAG, SAGE, SALL1, SARDH, SART1, SART2 , SART3, SAS, SAX1, SCA2, SCA4, SCA5, SCA7, SCA8, SCA1, SCC, SCCD, SCF, SCLC1, SCN1A, SCN1B, SCN4A, SCN5A, SCNN1A, SCNN1B, SCNN1G, SC02, SCP1, SCZD2, SCZD3, SCZD4, SCZD6, SCZD1, SDF-1a/p, SDHA, SDHD, SDYS, SEDL, SERPENA7, SERPINA3, SERPINA6, SERPINA1, SERPINC1, SERPIND1, SERPINE1, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SFTPA1, SFTPB, SFTPC, SFTPD, SGCA, SGCB, SGCD, SGCE, SGM1, SGSH, SGY-1, SH2D1A, SHBG, SHFM2, SHFM3, SHFM1, SHH, SHOX, SI, SIAL, SIALYL LEWISX , SIASD, S11, SIM1, SIRT2/m, SIX3, SJS1, SKP2, SLC10A2, SLC12A1, SLC12A3, SLC17A5, SLC19A2, SLC22A1L, SLC22A5, SLC25A13, SLC25A15, SLC25A20, SLC25A4, SLC25A5,SLC25A6, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC2A1, SLC2A2, SLC2A4, SLC3A1, SLC4A1, SLC4A4, SLC5A1, SLC5A5, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC7A7, SLC7A9, SLC11A1, SLOS, SMA, SMADl, SMAL, SMARCBl, SMAX2, SMCR, SMCY, SM1, SMN2, SMN1, SMPD1, SNCA, SNRPN, SOD2, SOD3, SOD1, SOS1, SOST, SOX9, SOX10, Spl7, SPANXC, SPG23, SPG3A, SPG4, SPG5A, SPG5B, SPG6, SPG7, SPINK1, SPINK5, SPPK, SPPM, SPSMA, SPTA1, SPTB, SPTLC1, SRC, SRD5A2, SRPX, SRS, SRY, ShCG, SSTR2, SSX1, SSX2 (HOM-MEL-40/SSX2), SSX4, ST8, STAMP-1, STAR, STARP1, STATH, STEAP, STK2, STK11, STn/KLH, STO, STOM, STS, SUOX, SURF1, SURVIVIN-2B, SYCP1, SYM1, SYN1, SYNS1, SYP, SYT/SSX, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAAL6, TACSTD1, TACSTD2, TAG72, TAF7L, TAF1, TAGE, TAG-72, TALI, TAM, TAP2, TAP1, TAPVR1, TARC, TARP, TAT, TAZ, TBP, TBX22, TBX3, TBX5, TBXA2R, TBXAS1, TCAP, TCF2, TCF1, TCIRG1, TCL2, TCL4, TCL1A, TCN2, TCOF1, TCR, TCRA, TDD, TDFA, TDRD1, TECK, TECTA, TEK, TEL/AML1, TELAB1, TEX15, TF, TFAP2B, TFE3, TFR2, TG, TGFA, TGF-p, TGFBI, TGFB1, TGFBR2, TGFBRE, TGFp, TGFpRII, TGIF, TGM-4, TGM1, TH, THAS, THBD, THC, THC2, THM, THPO, THRA, THRB, TIMM8A, TIMP2, TIMP3, TIMP1, TITF1, TKCR, TKT, TLP, TLR1, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLX1, TM4SF1, TM4SF2, TMC1, TMD, TMIP, TNDM, TNF, TNFRSF11A, TNFRSF1A, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, TNFa, TNFp, TNNI3, TNNT2, TOC, TOP2A, TOPI, TP53, TP63, TPA, TPBG, TPI, TPI/m, TPI1, TPM3, TPM1, TPMT, TPO, TPS, TPTA, TRA, TRAG3, TRAPPC2, TRC8, TREH, TRG, TRH, TRIM32, TRIM37, TRP1, TRP2, TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, TRPS1, TS, TSC2, TSC3, TSC1, TSG101, TSHB, TSHR, TSP-180, TST, TTGA2B, TTN, TTPA, TTR, TU M2-PK, TULP1, TWIST, TYH, TYR, TYROBP, TYROBP, TYRP1, TYS, UBE2A, UBE3A, UBE1, UCHL1, UFS, UGT1A, ULR, UMPK, UMPS, UOX, UPA, UQCRC1, UR05, UROD, UPK1B, UROS, USH2A, USH3A, USH1A, USH1C, USP9Y, UV24, VBCH, VCF, VDI, VDR, VEGF, VEGFR-2, VEGFR-1, VEGFR-2/FLK-1, VHL, VIM, VMD2, VMD1, VMGLOM, VNEZ, VNF, VP, VRNI, VWF, VWS, FOI, WBS2, WFS2, WFS1, WHCR, WHN, WISP3, WMS, WRN, WS2A, WS2B, WSN, WSS, WT2, WT3, WT1, WTS, WWS, XAGE, XDH, XIC, XIST, XK, XM, XPA, XPC, XRCC9, XS, ZAP70, ZFHX1 B, ZFX, ZFY, ZIC2, ZIC3, ZNF145, ZNF261, ZNF35, ZNF41, ZNF6,ZNF198, ZWS1.

[000139] As proteínas terapeuticamente ativas podem adicionalmente ser selecionadas de fatores apoptóticos ou proteínas relacionadas a apoptose incluindo AIF, Apaf, por exemplo, Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, oder APO-2 (L), APO-3 (L), Apopain, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-xs, bik, CAD, Calpain, Caspase, por exemplo, Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase- 6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-10, Caspase-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, citocromo C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PKcs, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas (Fas-ligante CD95/fas (receptor)), FLICE/MACH, FLIP, fodrin, fos, G- Actin, Gas-2, gelsolin, granzyme A/B, ICAD, ICE, JNK, lamin A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NFkappaB, NuMa, p53, PAK-2, PARP, perform, PITSLRE, PKCdelta, pRb, presenilin, prICE, RAIDD, Ras, RIP, sphingomyelinase, thymidinkinase de herpes simplex, TRADD, TRAF2, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, transglutaminase, etc.

[000140] Uma proteína terapeuticamente ativa que pode ser codificada por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, pode também ser uma proteína adjuvante. Neste contexto, uma proteína adjuvante é preferivelmente para ser compreendido como qualquer proteína que é capaz de induzir uma resposta imune inata conforme aqui definido. Preferivelmente, tal resposta imune inata compreende ativação de um receptor de reconhecimento de modelo, tal como, por exemplo, um receptor selecionado da família de receptor similar à Toll (TLR), incluindo, por exemplo, um receptor similar a Toll selecionado de receptores similares à Toll TLR1 humano a TLR10 ou de murina TLR1 a TLR13. Preferivelmente, uma resposta imune inata é induzida em um mamífero conforme definido acima. Mais preferivelmente, a proteína adjuvante é selecionada de adjuvantes de proteína humana ou de adjuvantes de proteína patogênica, em particular de adjuvantes de proteína bacterial. Em adição, proteínas humanas que codificam mRNA envolvidas nos efeitos adjuvantes podem ser usadas também.

[000141] Adjuvantes de proteína humana que podem ser codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, tipicamente compreendem qualquer proteína humana que é capaz de induzir uma resposta imune inata (em um mamífero), por exemplo, como uma reação da ligação de um ligante de TLR exógeno a um TLR. Mais preferivelmente, adjuvantes de proteína humana codificados por pelo menos um (m)RNA modificado da composição imunoestimulatória da invenção são selecionados do grupo consistindo em, sem estar limitados a estes, citoquinas que induzem ou aumentam uma resposta imune inata, incluindo IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21CCL21, GM-CSF e TNF-alfa; citoquinas que são liberadas de macrófagos, incluindo IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-alfa; de componentes do sistema de complemento incluindo C1q, MBL, Ou, C1s, C2b, Bb, D, MASP-1, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C1qR, C1INH, C4bp, MCP, DAF, H, I, P e CD59; de proteínas que são componentes das redes de sinalização dos receptores de reconhecimento padrão incluindo TLR e IL-1 R1, pelo que os componentes são ligantes dos receptores de reconhecimento padrão incluindo IL-1 alfa, IL-1 beta, Beta-defensin, proteínas de choque de calor, tais como HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 e HSP90, gp96, Fibrinogen, repetição Typlll de domínio extra A de fibronectin; os receptores, incluindo IL-1 Rl, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11; os transdutores de sinal incluindo componentes da sinalização Small-GTPases (RhoA, Ras, Rac1, Cdc42 etc.), componentes da sinalização PIP (PI3K, Src-Kinases, etc.), componentes da sinalização dependente de MyD88 (MyD88, IRAKI, IRAK2, etc.), componentes da sinalização dependente de MyD88 (TICAM1, TICAM2 etc.); fatores de transcrição ativados incluindo, por exemplo, NF-KB, c-Fos, c-Jun, c-Myc; e genes alvos induzidos incluindo, por exemplo, IL-1 alfa, IL-1 beta, Beta-Defensin, IL-6, IFN gama, IFN alfa e IFN beta; de moléculas co-estimulatórias, incluindo CD28 ou CD40-ligante ou PD1; domínios de proteína, incluindo LAMP; proteínas de superfície de célula; ou adjuvantes de proteína humana incluindo CD80, CD81, CD86, trif, flt-3 ligante,thymopentin, Gp96 ou fibronectin, etc., ou qualquer espécie homóloga de qualquer dos adjuvantes de proteína humana acima.

[000142] Adjuvantes de proteína patogênica que podem ser codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, tipicamente compreendem qualquer proteína patogênica (adjuvante) que é capaz de induzir uma resposta imune inata (em um mamífero), mais preferivelmente selecionado de proteínas patogênicas (adjuvante) derivadas de bactéria, protozoário, vírus, ou fungos, animais, etc., e ainda mais preferivelmente de adjuvantes de proteína patogênica selecionados do grupo consistindo em, sem estar limitado a estes, proteínas bacteriais, proteínas de protozoário (por exemplo profilina, proteína similar à Toxoplasma gondii), proteínas virais, ou proteínas de fungo, proteínas animal, etc.

[000143] Neste contexto, proteínas bacteriais (adjuvante) que podem ser codificadas por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção podem compreender qualquer proteína bacterial que é capaz de induzir uma resposta imune inata (preferivelmente em um mamífero) ou mostrar um caráter adjuvante. Mais preferivelmente, tais proteínas bacteriais (adjuvante) são selecionadas do grupo consistindo em proteínas de choque de calor bacteriais ou chaperons, incluindo Hsp60, Hsp70, Hsp90, HsplOO; OmpA (Proteína de membrana externa) de bactéria gram- negativa; porins bacterial, incluindo OmpF; toxinas bacteriais, incluindo toxina pertussis (PT) de Bordetella pertussis, toxina pertussis de adenilato ciclase CyaA e CyaC de Bordetella pertussis, PT-9K/129G mutante de toxina pertussis, toxina pertussis de adenilato ciclase CyaA e CyaC de Bordetella pertussis, toxina tetanus, toxina da cólera (CT), subunidade B da toxina da cólera, CTK63 mutante de toxina da cólera, CTE112K mutante de CT, Escherichia coli enterotoxina instável no calor (LT), subunidade B de enterotoxina instável no calor (LTB), Escherichia coli mutantes de enterotoxina instáveis de comida com toxicidade reduzida, incluindo LTK63, LTR72; modulin solúvel em fenol; proteína de ativação de neutrófilo (HP-NAP) de Helicobacter pylori, Proteína tensoativa D; Proteína A de superfície externa lipoproteína de Borrelia burgdorferi, Ag38 (38 kDa antígeno) de Mycobacterium tuberculosis, proteínas de bacterial fimbriae; Enterotoxina CT de Vibrio cholerae, Pilin de pili de bactéria gram negativa, e Proteína A tensoativa ; etc., ou qualquer espécie homóloga de qualquer das proteínas bacteriais (adjuvante) acima.

[000144] Proteínas bacteriais (adjuvante), que podem ser codificadas por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, podem também ser selecionadas de adjuvantes de proteína bacterial, ainda mais preferivelmente selecionadas do grupo consistindo em, sem estar limitada a estes, flagelos bacterianos, incluindo flagelos de organismos incluindo Agrobacterium, Aquifex, Azospirillum, Bacillus, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Burkholderia, Campylobacter, Caulobacte, Clostridium, Escherichia, Helicobacter, Lachnospiraceae, Legionella, Listeria, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodobacter, Roseburia, Salmonella, Serpulina, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Wolinella, Yersinia, mais preferivelmente flagelos das espécies, sem estar limitado a estas, Agrobacterium tumefaciens, Aquifex pyrophilus, Azospirillum brasilense, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bartonella bacilliformis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Caulobacter crescentus, Clostridium botulinum cepa Bennett clone 1, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Lachnospiraceae bacterium, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeroguinosa, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti, Rhodobacter sphaeroides, Roseburia cecicola, Roseburis hominis, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Serpulina hyodysenteriae, Serratia marcescens, Shigella boydii, Treponema phagedenis, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Wolinella succinogenes e Yersinia enterocolitica.Flagelos bacterianos, que podem ser codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, ainda mais preferivelmente compreende uma sequência selecionada do grupo compreendendo qualquer das seguintes sequências conforme referida a seus números de acesso:

[000145] Proteínas de protozoário, que podem também sercodificadas por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser selecionadas de qualquer proteína de protozoário mostrando caráter adjuvante, mais preferivelmente, do grupo consistindo em, sem estar limitado a estas, Tc52 de Trypanosoma cruzi, PFTG de Trypanosoma gondii, Proteínas de choque de calor de protozoário, LeIF de Leishmania spp, proteína similar à profilin de Toxoplasmagondii, etc.

[000146] Proteínas virais, que podem ser codificadas por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser selecionadas de qualquer proteína viral mostrando caráter adjuvante, mais preferivelmente, do grupo consistindo em, sem estar limitado a estas, glicoproteína de fusão de Vírus Sincitial Respiratório (F-proteína), proteína envelope de vírus MMT, proteína de vírus de leucemia de camundongo, proteína Hemaglutinin de vírus de sarampo tipo selvagem, etc.

[000147] Proteínas fúngicas, que podem ser codificadas por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser selecionadas de qualquer proteína fúngica mostrando caráter adjuvante, mais preferivelmente, do grupo consistindo em, sem estar limitado a estas, proteína imunoestimulatória fúngica (FIP; LZ-8), etc.

[000148] Finalmente, adjuvantes de proteína patogênica, que podem ser codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, pode finalmente serem selecionados de qualquer proteína patogênica adicional mostrando caráter adjuvante, mais preferivelmente, do grupo consistindo em, sem estar limitado a estas, hemocianina de Keyhole limpet (KLH), OspA, etc.b) Antígenos

[000149] O pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória pode alternativamente codificar um antígeno. De acordo com a presente invenção, o termo "antígeno" se refere a uma substância que é reconhecida pelo sistema humano e é capaz de disparar uma resposta imune específica de antígeno, por exemplo, pela formação de anticorpos como parte de uma resposta imune adaptativa ou células T específicas de antígeno. Neste contexto, a primeira etapa de uma resposta imune adaptativa é a ativação de células T específicas de antígeno "naive" por células que apresentam antígeno. Isto ocorre nos tecidos linfoides e órgãos através dos quais células T "naive" estão constantemente passando. Os três tipos de célula que podem servir como células de apresentação de antígeno são células dendríticas, macrófagos, e células B. Cada uma das mesmas células tem uma função distinta na indução de respostas imunes. Células dendríticas de tecido retiram antígenos por fagocitose e macropinocitose e são estimuladas por infecção para migrarem para o tecido linfoide local, onde elas se diferenciam nas células dendríticas maturas. Os macrófagos ingerem antígenos particulados tais como bactéria e são induzidos por agentes infecciosos para expressar moléculas de classe II MHC. A capacidade única de células B ligarem e internalizarem antígenos de proteína solúveis via seus receptores pode ser importante para induzir células T. Pela apresentação do antígeno nas moléculas MHC conduz-se a ativação de células T que induzem sua proliferação e diferenciação em células T efetuadoras. A função mais importante das células T efetuadoras é a morte de células infectadas por células T citotóxicas CD8 e a ativação de macrófagos por células TH1 que juntas compõem imunidade mediada por célula, e a ativação de células B por ambas células TH2 e TH1 para produzirem classes diferentes de anticorpo, desse modo, acionando a resposta imune humoral. As células T reconhecem um antígeno por seus receptores de célula T que não reconhecem e ligam antígeno diretamente, mas, ao invés, reconhecem fragmentos de peptídeo curtos, por exemplo, de antígenos de proteína de patógenos, que são ligados a moléculas MHC nas superfícies de outras células.

[000150] As células T caem nas duas classes maiores que têm funções efetuadoras diferentes. As duas classes são distinguidas pela expressão das proteínas de superfície de célula CD4 e CD8. Estes dois tipos de células T diferem na classe de molécula MHC que elas reconhecem. Existem duas classes de molécula MHC- MHC classe MHC e MHC classe II- que diferem em sua estrutura e modelo de expressão em tecidos do corpo. As células T CD4 se ligam à molécula MHC classe II e células T CD8 à molécula MHC classe I. MHC classe I e MHC classe II têm distribuições distintas entre células que refletem as funções efetuadoras diferentes das células T que as reconhecem. As moléculas MHC classe I apresentam peptídeos de patógenos, comumente vírus para células T CD8, que se diferenciam em células T citotóxicas que são especializadas em matar qualquer célula que elas especificamente reconhecem. Quase todas as células expressam moléculas de MHC classe I, embora o nível de expressão constitutiva varie de um tipo de célula para o próximo. Mas não somente peptídeos patogênicos de vírus são apresentados por moléculas MHC classe I, também antígenos de Timor similares a autoantígenos são apresentados por elas. Moléculas MHC classe I ligam peptídeos de proteínas degradadas no citosol e transportados no retículo endoplasmático. Desse modo, moléculas MHC classe I na superfície de células infectadas com vírus ou outras patógenos citosólicas revelam peptídeos dos mesmos patógenos. As células T CD8 que reconhecem complexos de peptídeo de MHC classe I são especializadas em matar quaisquer células que revelam peptídeos estranhos e, desse modo, enchem o corpo de células infectadas com vírus e outros patógenos citosólicos. A função principal das células T CD4 T (células T auxiliadoras CD4) que reconhecem moléculas MHC classe II é ativar outras células efetuadoras do sistema humano. Desse modo, moléculas MHC classe II são normalmente encontradas nos linfócitos B, células dendríticas, e macrófagos, células que participam nas respostas imunes, mas não em outras células de tecido. Macrófagos, por exemplo, são ativados para matar as patógenos intravesicular que eles abrigam, e células B para secretarem imunoglobulinas contra moléculas estranhas. Moléculas MHC classe II são impedidas de se ligarem a peptídeos no retículo endoplasmático e, desse modo, moléculas MHC classe II ligam peptídeos de proteínas que são degradados em endossomos. Elas podem capturar peptídeos de patógenos que entraram no sistema vesicular de macrófagos, ou de antígenos internalizados por células dendríticas imaturas ou os receptores de imunoglobulina de células B. Patógenos que se acumulam em grandes números dentro do macrófago e vesículas de célula dendrítica tendem a estimular a diferenciação de células TH1, pelo que os antígenos extracelulares tendem a estimularem a produção de células TH2. As células TH1 ativam as propriedades microbicidas de macrófagos e induzem células B a produzirem anticorpos IgG que são muito efetivos de patógenos extracelulares para ingestão por células fagocíticas, pelo que as células TH2 iniciam a resposta humoral por ativação das células B "naive" a secretarem IgM, e induzem a produção de anticorpos fracamente opostos tais como IgGI e lgG3 (camundongo) e lgG2 e lgG4 (humano), bem como IgA e IgE (camundongo e humano).

[000151] No contexto da presente invenção, antígenos conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção tipicamente compreendem qualquer antígeno que caia dentro da definição acima, mais preferivelmente antígenos de proteína e peptídeo, por exemplo, antígenos de tumor, antígenos de alergia, autoantígenos autoimune, antígenos patogênicos, etc. De acordo com a invenção, antígenos conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção podem ser antígenos gerados fora da célula, mais tipicamente antígenos não derivados do organismo hospedeiro (por exemplo, um humano) (isto é, não autoantígenos), mas preferivelmente derivados de células hospedeiras fora do organismo hospedeiro, por exemplo, antígenos virais, antígenos bacteriais, antígenos fúngicos, antígenos protozoológicos, antígenos animais (preferivelmente selecionados de animais ou organismos conforme aqui descritos), antígenos de alergia, etc. Antígenos de alergia são tipicamente antígenos, que causam uma alergia em um humano e podem ser derivados de ou um humano ou outras fontes. Antígenos conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode ser, além disso, antígenos gerados dentro da célula, do tecido ou do corpo, por exemplo, por secreção de proteínas, sua degradação, metabolismo, etc. Tais antígenos incluem antígenos derivados de organismo hospedeiro (por exemplo, um humano), por exemplo, antígenos de tumor, ou autoantígenos, tais como autoantígenos autoimunes, etc., mas também (não auto) antígenos conforme definido acima, que foram originalmente derivados de células hospedeiras fora do organismo hospedeiro, nas que são fragmentados ou degradados dentro do corpo, tecido ou célula, por exemplo, por (protease) degradação, metabolismo, etc. Antígenos patogênicos particularmente compreendem, por exemplo, antígenos de influenza, incluindo hemaglutinina (HA), neuroamidase (NA), matriz proteína 1 (M1), proteína de canal de íon M2 (M2), nucleoproteína(NP), etc; ou, por exemplo, antígenos de vírus sincitial respiratório (RSV), incluindo F-proteína, G-proteína, etc.

[000152] Antígenos conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção podem, além disso, compreenderem fragmentos de tais antígenos conforme mencionado aqui, particularmente de antígenos de proteína ou peptídeo. Fragmentos de tais antígenos no contexto da presente invenção podem compreender fragmentos preferivelmente tendo um comprimento de cerca de 6 a cerca de 20 ou ainda mais aminoácidos, por exemplo, fragmentos conforme processados e apresentados por moléculas MHC classe I, preferivelmente tendo um comprimento de cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos, por exemplo 8, 9, ou 10, (ou ainda 11, ou 12 aminoácidos), ou fragmentos conforme processados e apresentados por moléculas MHC classe II, preferivelmente tendo um comprimento de cerca de 13 ou mais aminoácidos, por exemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou ainda mais aminoácidos, no qual estes fragmentos podem ser selecionados de qualquer parte da sequência de aminoácido. Estes fragmentos são tipicamente reconhecidos por células T na forma de um complexo consistindo no fragmento de peptídeo e uma molécula MHC, isto é, os fragmentos são tipicamente não reconhecidos em sua forma "naive".

[000153] Os fragmentos de antígenos conforme definidos aqui podem também compreenderem epítopes dos mesmos antígenos. Epítopes (também denominados "determinantes de antígeno") são tipicamente fragmentos localizados na superfície externa de antígenos ("naive") de proteína ou peptídeo conforme definidos aqui, preferivelmente tendo 5 a 15 aminoácidos, mais preferivelmente tendo 5 a 12 aminoácidos, ainda mais preferivelmente tendo 6 a 9 aminoácidos, que podem ser reconhecidos por anticorpos, isto é, em sua forma "naive".

[000154] Uma classe de antígenos conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção compreende antígenos de tumor. "Antígenos de tumor" são preferivelmente localizados na superfície da célula (tumor). Antígenos de tumor podem também ser selecionados de proteínas, que são sobre-expressas em células de tumor comparadas a uma célula normal. Além disso, antígenos de tumor também incluem antígenos expressos em células que não são (foram) (ou originalmente não) degeneradas, mas são associados com o tumor suposto. Os antígenos que são conectados com vasos de suprimento de tumor ou (re)formação dos mesmos, em particular aqueles antígenos que são associados com neovascularização, por exemplo, fatores de crescimento, tais como VEGF, bFGF etc., são também incluídos aqui. Os antígenos conectados com um tumor, além disso, incluem antígenos de células ou tecidos, tipicamente embutindo o tumor. Adicionalmente, algumas substâncias (usualmente proteínas ou peptídeos) são expressas em pacientes que sofrem (conhecimento ou não conhecimento) de uma doença de câncer e elas ocorrem em concentrações aumentadas nos fluidos do corpo de referidos pacientes. Estas substâncias são também referidas como "antígenos de tumor"; contudo, elas não são antígenos no significado estringente de uma resposta imune induzindo substância. A classe de antígenos de tumor pode ser dividida em antígenos específicos de tumor (TSAs) e antígenos associados a tumor (TAAs). TSAs podem ser apresentados por células de tumor e nunca por células "saudáveis" normais. Elas tipicamente resultam de uma mutação específica de tumor. TAAs, que são mais comuns, são usualmente apresentados por ambos, células de tumor e saudáveis. Estes antígenos são reconhecidos e a célula de apresentação de antígeno pode ser destruída pelas células T citotóxicas. Adicionalmente, antígenos de tumor podem também ocorrer na superfície do tumor na forma de, por exemplo, um receptor que sofreu mutação. Neste caso, eles podem ser reconhecidos por anticorpos.

[000155] Exemplos de antígenos de tumor conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção são mostrados nas tabelas 1 e 2 abaixo. Estas tabelas ilustram antígenos específicos (proteína) (isto é, "antígenos de tumor") com relação à doença de câncer que eles estão associados. De acordo com a invenção, os termos "doenças de câncer" e "doenças de tumor" são usados sinonimamente aqui.Tabela 1: Antígenos expressos em doença de câncer doenças de câncer

[000156] Em uma concretização preferida de acordo com a presente invenção, os antígenos de tumor conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção são selecionados do grupo consistindo em 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alfa-5-beta-1-integrin, alfa- 5-beta-6-integrin, alfa-actinin-4/m, alfa-metilacil-coenzima A racemase, ART-4, ARTCI/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta-eatenin/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, calreticulin, CAMEL, CASP-8/m, cathepsin B, cathepsin L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, proteína similar à coactosin, colágeno XXIII, COX- 2, CT-9/BRD6, Cten, cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsin, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA- A2/m, HNE, homeobox NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor laminin imatura, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE- C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE- E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mammaglobin A, MART-1/melan-A, MART-2, MART-2/m, proteína matriz 22, MC1R, M- CSF, ME1/m, mesotelin, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-antígeno, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, miosin classe l/m, NA88-A, N-acetilglucosaminiltransferase-V, Neo-PAP, Neo- PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO- 1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m,osteocalcin, osteopontin, p15, p190 minor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-Kinase, Pin-1, Pml/PARalfa, POTE, PRAME, PRDX5/m, prostein, proteinase-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivin, survivin-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG- 72, TARP, TEL-AML1, TGFbeta, TGFbetaRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, tirosinase, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1, e WT1.

[000157] Em uma concretização particularmente preferida, os antígenos de tumor conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção são selecionados do grupo consistindo em MAGE-A1 (por exemplo, MAGE-A1 de acordo com número de acesso M77481), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A6 (por exemplo, MAGE-A6 de acordo com número de acesso NM_005363), MAGE-C1, MAGE-C2, melan-A (por exemplo, melan-A, de acordo com número de acesso NM_005511), GP100 (por exemplo, GP100, de acordo com número de acesso M77348), tirosinase (por exemplo, tirosinase, de acordo com número de acesso NM_000372), survivin (por exemplo, survivin, de acordo com número de acesso AF077350), CEA (por exemplo, CEA, de acordo com número de acesso NM_004363), Her-2/neu (por exemplo, Her-2/neu, de acordo com número de acesso M11730), WT1 (por exemplo, WT1, de acordo com número de acesso NM_000378), PRAME (por exemplo, PRAME, de acordo com número de acesso NM_006115), EGFRI (receptor de fator de crescimento epidermal 1) (por exemplo, EGFRI (receptor de fator de crescimento epidermal 1), de acordo com número de acesso AF288738), MUC1, mucin-1 (por exemplo, mucin-1, de acordo com número de acesso NM_002456), SEC61G (por exemplo, SEC61G, de acordo com número de acesso NM_014302), hTERT (por exemplo, hTERT, número de acesso NM_198253), 5T4 (por exemplo, 5T4, de acordo com número deacesso NM_006670), NY-Eso-1 (por exemplo, NY-Eso1, de acordo com número de acesso NM_001327), TRP-2 (por exemplo, TRP-2, de acordo com número de acesso NM_001922), STEAP, PCA, PSA, PSMA, etc.

[000158] De acordo com uma concretização adicionalmente particularmente preferida, os antígenos de tumor conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode formar um coquetel de antígenos, por exemplo, em uma composição ativa (imunoestimulatória) ou um kit de partes (no qual preferivelmente cada antígeno está contido em uma parte do kit), preferivelmente para indução de uma resposta imune (adaptativa) para o tratamento de câncer de próstata (PCa), preferivelmente de cânceres de próstata neoadjuvantes e/ou refratário de hormônio, e doenças ou distúrbios relacionados a estes. Para esta proposta, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção é preferivelmente pelo menos um RNA, mais preferivelmente pelo menos um mRNA, que pode codificar pelo menos um, preferivelmente dois, três ou ainda quatro (preferivelmente diferente) antígenos do seguinte grupo de antígenos:• PSA (Antígeno Específico de Próstata) = KLK3 (Kallikrein- 3),• PSMA (Antígeno de Membrana Específico de Próstata),• PSCA (Antígeno de Célula de Haste de Próstata),• STEAP (Seis Antígenos Epiteliais de Transmembrana da Próstata).

[000159] De acordo com outra concretização particularmente preferida, os antígenos de tumor conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode formar um coquetel de antígenos, por exemplo, em uma composição ativa (imunoestimulatória) ou um kit de partes (no qual preferivelmente cada antígeno está contido em uma parte do kit), preferivelmente para indução de uma resposta imune (adaptativa) para o tratamento de cânceres de pulmão de célula não pequena (NSCLC), preferivelmente selecionados dos três subtipos principais de carcinoma de pulmão de célula escamosa, adenocarcinoma e carcinoma de pulmão de célula grande, ou de distúrbios relacionado a estes. Para esta proposta, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção é preferivelmente pelo menos um mRNA, que pode codificar pelo menos um, preferivelmente dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze (preferivelmente diferente) antígenos do seguinte grupo de antígenos:•hTERT,•WT1,• MAGE-A2,•5T4,•MAGE-A3,•MUC1,•Her-2/neu,• NY-ESO-1,•CEA,•Survivin,•MAGE-C1, e/ou•MAGE-C2,no qual

[000160] qualquer combinação destes antígenos é possível.

[000161] De acordo com uma concretização adicionalmente particularmente preferida, os antígenos de tumor conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode formar um coquetel de antígenos, por exemplo, em uma composição ativa (imunoestimulatória) ou um kit de partes (no qual preferivelmente cada antígeno está contido em uma parte do kit), preferivelmente para indução de uma resposta imune (adaptativa) para o tratamento de cânceres de pulmão de célula não pequena (NSCLC), preferivelmente selecionados dos três subtipos principais de carcinoma de pulmão de célula escamosa, adenocarcinoma e carcinoma de pulmão de célula grande, ou de distúrbios relacionados a estes. Para esta proposta, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção é preferivelmente pelo menos um RNA, mais preferivelmente pelo menos um mRNA, que pode codificar pelo menos dois (preferivelmente diferente) antígenos,a) no qual pelo menos um, preferivelmente pelo menos dois, três, quatro, cinco ou ainda seis destes pelo menos dois antígenos é (são) selecionado(s) de:•5T4•NY-ESO-1,•MAGE-A2,•MAGE-A3,•MAGE-C1, e/ou•MAGE-C2, eb) no qual o(s) antígeno(s) adicional(is) é (são) selecionado(s) de pelo menos um antígeno conforme aqui definido, preferivelmente em qualquer das combinações aqui mencionadas, grupos ou subgrupos de antígenos, por exemplo, o(s) antígeno(s) adicional(is) é (são) selecionado(s) de, por exemplo:• hTERT,• WT1,• MAGE-A2,• 5T4,• MAGE-A3,• MUC1,• Her-2/neu,• NY-ESO-1,• CEA,• Survivin,• MAGE-C1, e/ou• MAGE-C2.

[000162] Nas concretizações acima, cada das proteínas acima definidas, por exemplo, proteínas terapeuticamente ativas, anticorpos, antígenos, etc., conforme definidos aqui, podem ser codificados por um (monocistrônico) RNA, preferivelmente um (monocistrônico) mRNA. Em outras palavras, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode compreender pelo menos dois (monocistrônicos) RNAs, preferivelmente mRNAs, no qual cada um destes pelo menos dois (monocistrônicos) RNAs, preferivelmente mRNAs, pode codificar, por exemplo, apenas uma (preferivelmente diferente) proteína, por exemplo, um antígeno, preferivelmente selecionado de uma das combinações de antígeno acima mencionadas.

[000163] De acordo com outra concretização particularmente preferida, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode compreender (pelo menos) um RNA bi- ou ainda multicistrônico, preferivelmente mRNA, isto é (pelo menos) um RNA que conduz, por exemplo, duas ou ainda mais das sequências de codificação de pelo menos duas (preferivelmente diferentes) proteínas, por exemplo, antígenos, preferivelmente selecionados de uma das seguintes combinações de antígeno acima mencionadas. Tais sequências de codificação, por exemplo, das menos duas (preferivelmente diferentes) proteínas, por exemplo, antígenos, do RNA (pelo menos) bi- ou ainda multicistrôcico podem ser separadas por pelo menos uma sequência IRES (local de entrada ribossomal interno), conforme definido abaixo. Desse modo, o termo "codificando pelo menos duas (preferivelmente diferentes) proteínas" pode significar, sem estar limitado a estes, que o RNA (pelo menos) um (bi- ou ainda multicistrônico), preferivelmente um mRNA, pode codificar, por exemplo, pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze ou mais (preferivelmente diferentes) proteínas, por exemplo, antígenos do(s) grupo(s) acima mencionado(s) de antígenos, ou seus fragmentos ou variantes, proteínas terapeuticamente ativas, anticorpos, proteínas adjuvantes, etc. Mais preferivelmente, sem estar ligado a estes, o (pelo menos) um RNA (bi- ou ainda multicistrônico), preferivelmente mRNA, pode codificar por exemplo pelo menos dois, três, quatro, cinco ou seis ou mais (preferivelmente diferentes) proteínas, por exemplo, antígenos do(s) grupo(s) mencionado(s) acima de antígenos, ou seus fragmentos ou variantes dentro das definições acima. Neste contexto, uma assim denominada sequência IRES (local de entrada ribossomal interno) conforme definida aqui pode funcionar como um local de ligação de ribossomo único, mas pode também servir para proporcionar um RNA bi- ou ainda multicistrônico conforme definido aqui que codifica para várias proteínas, que são para serem transladadas por ribossomos independentemente entre si. Exemplos de sequências IRES que podem ser usados de acordo com a invenção são aquelas de picornavírus (por exemplo, FMDV), pestivírus (CFFV), poliovírus (PV), encefalomiocardite vírus (ECMV), vírus de doença de pé e boca (FMDV), vírus da hepatite C (HCV), vírus de febre suína clássica (CSFV), vírus de leucoma de camundongo (MLV), vírus de imunodeficiência de símio (SIV) ou vírus de paralisia de gafanhoto (CrPV).

[000164] De acordo com uma concretização adicionalmente particularmente preferida, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode compreender uma mistura de pelo menos um RNA monocistrônico, preferivelmente mRNA, conforme aqui definido, e pelo menos um RNA bi- ou ainda multicistrônico, preferivelmente mRNA, conforme aqui definido. O pelo menos um RNA monocistrônico e/ou o pelo menos um RNA bi- ou ainda multicistrônico, preferivelmente codifica proteínas diferentes, por exemplo, antígenos, ou seus fragmentos ou variantes, os antígenos preferivelmente sendo selecionados de um dos grupos ou subgrupos acima mencionados de antígenos, mais preferivelmente em uma das combinações acima mencionadas. Contudo, o pelo menos um RNA monocistrônico e o pelo menos um RNA bi- ou ainda multicistrônico pode preferivelmente também codificar (em parte) proteínas idênticas conforme aqui definido, por exemplo, antígenos selecionados de um dos grupos ou subgrupos acima mencionados de antígenos, preferivelmente em uma das combinações acima mencionadas, provido que o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção como um todo proporciona pelo menos duas (preferivelmente diferentes) proteínas, por exemplo, antígenos, conforme aqui definido. Tal concretização pode ser vantajosa, por exemplo, por um tempo dependente, por exemplo, disparado, administração de um ou vários do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, por exemplo como uma composição farmacêutica, a um paciente em necessidade do mesmo. Os componentes de tal composição farmacêutica da presente invenção, particularmente os RNAs complexados diferentes que codificam as pelo menos duas (preferivelmente diferentes) proteínas, podem estar, por exemplo, contidos em (partes diferentes de) um kit de composição de partes ou podem ser, por exemplo, administrados separadamente como componentes de composições farmacêuticas diferentes de acordo com a presente invenção.

[000165] Uma classe adicional de antígenos conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção compreende antígenos de alergia. Tais antígenos de alergia podem ser selecionados de antígenos derivados de fontes diferentes, por exemplo, de animais, plantas, fungos, bactéria, etc. Alérgenos neste contexto incluem, por exemplo, gramas, pólens, moldes, fármacos, ou numerosos gatilhos ambientais, etc. Antígenos de alergia tipicamente pertencem a classes diferentes de compostos, tais como ácidos nucleicos e seus fragmentos, proteínas ou peptídeos e seus fragmentos, carboidratos, polissacarídeos, açúcares, lipídeos, fosfolipídeos, etc. De interesse particular no contexto da presente invenção são antígenos, que são codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, isto é, antígenos de proteína ou peptídeo e seus fragmentos ou epítopes, ou ácidos nucleicos e seus fragmentos, particularmente ácidos nucleicos e seus fragmentos, que codificam tais antígenos de proteína ou peptídeo e seus fragmentos ou epítopes.

[000166] Particularmente preferidos, antígenos derivados de animais, que são codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, podem incluir antígenos derivados de, sem estar limitado a estes, insetos, tal como ácaro (por exemplo, ácaros de poeira doméstica), mosquito, abelha (por exemplo, abelha de mel, mangangá), barata, carrapato, traça (por exemplo, traça de seda), maruim, percevejo, pulga, vespa, lagarta, mosca de fruto, gafanhoto migratório, gafanhoto, formiga afídia, de crustáceos, tais como camarões, caranguejo, krill, lagosta, pitu, lagostim, scampi, de pássaros, tais como pato, ganso, gaivota, peru, avestruz, galinha, de peixes, tais como enguia, arenque, carpa, pargo, bacalhau, linguado gigante, bagre, beluga, salmão, linguado, cavalinha, molusco, formas de moluscos, tais como vieira, polvo, haliote, caracol, búzio, lula, marisco, mexilhão, de aranhas, de mamíferos, tais como vaca, coelho, ovelha, leão, jaguar, leopardo, rato, porco, búfalo, cão, lóris, hamster, porquinho-da-índia, veado, cavalo, gato, camundongo, jaguatirica, serval, de artrópode, tal como aranha, ou peixe-rei, de vermes, tal como nematodos, de espécie trichinella, ou nematelminto, de anfíbios, tais como rãs, ou de tunicata, etc.

[000167] Antígenos derivados de plantas, que são codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, pode incluir antígenos derivados de, sem estar limitado a estes, fruitas, tais como kiwi, abacaxi, mamão, limão, laranja, mandarin, melão, morango, maçã, maçã cereja, manga, maracujá, ameixa, abricó, nectarina, pêra, framboesa, uva, de vegetais, tais como alho, cebola, alho-poró, feijão-soja, aipo, couve- flor, nabo, páprica, grão-de-bico, funcho, alface, cenoura, inhame, feijão, ervilha, oliva, tomate, batata, lentilha, alface, abacate, salsa, rábano silvestre, chirimóia, beterraba, espinafre, de condimentos, tais como mostarda, coentro, açafrão, pimenta, anis, de colheita, tais como aveia, trigo-sarraceno, cevada, arroz, trigo, milho, colza, gergelim, de nozes, tais como castanha-de-cajú, nogueira, noz-manteiga, pistache, amêndoa, avelã, amendoim, castanha-do-pará, noz pecã, castanha, de árvores, tais como amieiro, carpino, cedro, bétula, aveleira, faia, freixo, alfeneiro, carvalho, árvore plana, cipreste, palma, de flores, tais como ambrósia americana, cravo, forsítia, girassol, lupino, camomila, lilás, flor da paixão, de gramas tais como grama "quack", agróstide comum, capim-cevadinha, grama da Bermuda, grama vernal doce, grama de centeio, ou de outras plantas, tais como papoula de ópio, parietária, espécie de tanchagem, tabaco, aspargos, artemísia, agrião, etc.

[000168] Antígenos derivados de fungos, que são codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, podem incluir antígenos derivados de, sem estar limitado a estes, por exemplo, Altemia sp., Aspergillus sp., Beauveria sp., Candida sp., Cladosporium sp., Endothia sp., Curcularia sp., Embellisia sp., Epicoccum sp., Fusarium sp., Malassezia sp., Penicillum sp., Pleospora sp., Saccharomyces sp., etc.

[000169] Antígenos derivados de bactéria, que são codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, podem incluir antígenos derivados de, sem estar limitado a estes, por exemplo, Bacillus tétano, Staphylococcus aureus, Streptomyces griseus, etc..c) Anticorpos

[000170] De acordo com uma concretização adicional, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode codificar um anticorpo. De acordo com a presente invenção, tal anticorpo pode ser selecionado de qualquer anticorpo, por exemplo, quaisquer anticorpos recombinantemente produzidos ou que ocorrem naturalmente, conhecidos na técnica, em particular anticorpos adequados para proposta terapêutica, diagnóstica ou científica, ou anticorpos que foram identificados em relação a doenças de câncer específicas. Aqui, o termo "anticorpo" é usado em seu sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonal e policlonal (incluindo anticorpos agonísticos, antagonistas, e de bloqueio ou de neutralização) e espécie de anticorpo com especificidade poliepitópica. De acordo com a invenção, "anticorpo" tipicamente compreende qualquer anticorpo conhecido na técnica (por exemplo, anticorpos de IgM, IgD, IgG, IgA e IgE), tais como anticorpos que ocorrem naturalmente, anticorpos gerados por imunização em um organismo hospedeiro, anticorpos que foram isolados e identificados de anticorpos que ocorrem naturalmente ou anticorpos gerados por imunização em um organismo hospedeiro e recombinantemente produzidos por métodos biomoleculares conhecidos na técnica, bem como anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos biespecíficos, intracorpos, isto é, anticorpos expressos em células e opcionalmente localizados em compartimentos de célula específicos, e fragmentos e variantes dos anticorpos antes mencionados. Em geral, um anticorpo consiste em uma cadeia leve e uma cadeia pesada ambas tendo domínios variáveis e constantes. A cadeia leve consiste em um domínio variável N-terminal, VL, e um domínio constante C-terminal, Q. Em contraste, a cadeia pesada do anticorpo IgG, por exemplo, é compreendida de um domínio variável N-terminal VH, e três domínios constantes CH1, CH2 e CH3. Anticorpos de cadeia simples podem ser codificados pelo RNA do (m)RNA modificado da invenção também, preferivelmente por um RNA de fita simples, mais preferivelmente por um mRNA.

[000171] De acordo com uma primeira alternativa, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode codificar um anticorpo policlonal. Neste contexto, o termo, "anticorpo policlonal" tipicamente significa misturas de anticorpos direcionados a antígenos específicos ou imunogenes ou epítopos de uma proteína que foram gerados por imunização de um organismo hospedeiro, tal como um mamífero, por exemplo, incluindo cabra, gado, suíno, cão, gato, burro, macaco, um roedor tais como um camundongo, hamster e coelho. Anticorpos policlonais não são geralmente idênticos, e, desse modo, usualmente reconhecem epítopos diferentes ou regiões do mesmo antígeno. Desse modo, em tal caso, tipicamente uma mistura (uma composição) de RNAs diferentes será usada como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, cada RNA codificando um anticorpo específico (monoclonal) sendo direcionado a antígenos específicos ou imunogenes ou epítopos de uma proteína.

[000172] De acordo com uma alternativa adicional, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode codificar um anticorpo monoclonal. O termo "anticorpo monoclonal" aqui tipicamente se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para mutações naturalmente possíveis que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados a um local antigênico simples. Além disso, em contraste a preparações de anticorpo convencionais (policlonal) que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados a determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a um determinante simples no antígeno. Por exemplo, anticorpos monoclonais conforme definido acima podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNArecombinante, por exemplo, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567. "Anticorpos monoclonais" podem também serem isolados de bibliotecas de fago geradas usando-se as técnicas descritas em McCafferty et al, Nature, 348:552-554 (1990), porexemplo. De acordo com Kohler e Milstein, um imunogene (antígeno) de interesse é injetado em um hospedeiro tal como um camundongo e linfócitos de célula B produzidos em resposta ao imunogene são coletados após um período de tempo. As células B são combinadas com células de mieloma obtidas de camundongo e introduzidas em um meio que permite que as células B se fundam com as células de mieloma, produzindo hibridomas. Estas células fundidas (hibridomas) são então colocados em poços separados de placas de microtitulação e crescidas para produzir anticorpos monoclonais. Os anticorpo monoclonais são testados para determinar que eles são adequados para detecção do antígeno de interesse. Após serem selecionados, os anticorpos monoclonais podem ser crescidos em culturas de célula ou por injeção dos hibridomas em camundongos. Contudo, para a proposta da presente invenção, as sequências de peptídeo destes anticorpos monoclonais têm que ser sequenciadas e as sequências de RNA que codificam estes anticorpos podem ser usadas como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, que pode ser preparado de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica.

[000173] Para proposta terapêutica em humanos, o anticorpo monoclonal não humano ou anticorpos policlonais, tais como anticorpos de murina podem também serem codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção. Contudo, tais anticorpos são tipicamente somente de uso limitado, visto que eles geralmente induzem uma resposta imune por produção de anticorpos humanos direcionados aos referidos anticorpos não humanos, no corpo humano. Portanto, um anticorpo não humano particular pode somente ser administrado uma vez ao humano. Para solucionar este problema, anticorpos quiméricos, humanizados não humanos e humanos são também considerados codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção. Anticorpos "quiméricos" que podem ser codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, são preferivelmente anticorpos em que os domínios constantes de um anticorpo descrito acima são substituídos por sequências de anticorpos de outros organismos, preferivelmente sequências humanas. Anticorpos "humanizados" (não humanos), que podem ser também codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, são anticorpos em que os domínios constantes e variáveis (exceto para os domínios hipervariáveis) descritos acima de um anticorpo são substituídos por sequências humanas. De acordo com outra alternativa, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode codificar anticorpos humanos, isto é, anticorpos tendo somente sequências humanas. Tais anticorpos humanos podem ser isolados de tecidos humanos ou de organismos hospedeiros imunizados não humanos que são transgene para o local de gene IgG humano, e sequências de RNA podem ser preparadas de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica. Adicionalmente, anticorpos humanos podem ser providos pelo uso de um mostrador de fago.

[000174] Em adição, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode codificar anticorpos biespecíficos. Anticorpos "biespecíficos" no contexto da invenção são preferivelmente anticorpos que agem como um adaptador entre um alvo efetuador e um alvo respectivo por dois domínios Fa/b diferentes, por exemplo, para a proposta de recrutamento de moléculas efetuadoras tais como toxinas, fármacos, citoquinas etc., células efetuadoras alvos tais como CTL, células NK, macrófagos, granulócitos, etc. (vide para revisão: Kontermann R.E., Acta Pharmacol. Sin, 2005, 26(1): 1-9). Anticorpos biespecíficosconforme descrito aqui são, em geral, configurados para reconhecer dois domínios Fa/b diferentes, por exemplo, dois antígenos diferentes, imunogenes, epítopos, fármacos, células (ou receptores em células), ou outras moléculas (ou estruturas) conforme descrito acima. Biespecificidade significa aqui que as regiões de ligação de antígeno dos anticorpos são específicas para dois epítopos diferentes. Desse modo, antígenos diferentes, imunogenes ou epítopos, etc. podem ser trazidos próximos juntos, o que, opcionalmente, permite uma interação direta dos dois componentes. Por exemplo, células diferentes tais como células efetuadoras e células alvos podem ser ligadas via um anticorpo biespecífico. Envolvidos, mas não limitado pela presente invenção são anticorpos ou fragmentos destes que ligam, por um lado, um antígeno solúvel conforme descrito aqui, e, por outro lado, um antígeno ou receptor na superfície de uma célula de tumor.

[000175] De acordo com a invenção, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode também codificar intracorpos, no qual estes intracorpos podem ser anticorpos conforme definido acima. Visto que estes anticorpos são anticorpos expressos intracelulares, isto é, anticorpos que são codificados por ácidos nucleicos localizados em áreas específicas da célula e também expressos ali, tais anticorpos podem ser denominados intracorpos.

[000176] Anticorpos conforme codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode preferivelmente compreender anticorpos de comprimento total, isto é, anticorpos compostos das cadeias pesada total e leve total, conforme descrito acima. Contudo, derivados de anticorpos tais como fragmentos de anticorpo, variantes ou adutos podem também serem codificados por pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção.

[000177] O pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção pode também codificar fragmentos de anticorpo selecionados de Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Facb, pFc', Fd e fragmentos de Fv dos anticorpos antes mencionados (comprimento total). Em geral, fragmentos de anticorpo são conhecidos na técnica. Por exemplo, um fragmento de Fab ("fragmento, ligação de antígeno") é composto de uma domínio constante e um domínio variável de cada uma da cadeia pesada e cadeia leve. Os dois domínios variáveis ligam o epítopo nos antígenos específicos. As duas cadeias são ligadas via uma ligação de dissulfeto. Um fragmento de scFv ("fragmento variável de cadeia simples"), por exemplo, tipicamente consiste nos domínios variáveis das cadeias leve e pesada. Os domínios são ligados por uma ligação artificial, em geral uma ligação de polipeptídeo tal como um peptídeo composto de 15-25 resíduos de glicina, prolina e/ou serina.

[000178] Como um segundo componente, a composição imunoestimulatória da invenção compreende pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa ou peptídeo conforme aqui definido, pelo menos um antígeno conforme aqui definido, por exemplo, antígenos de tumor, antígenos patogênicos (por exemplo selecionado de proteínas patogênicas conforme definido acima ou de antígenos de animal, antígenos virais, antígenos de protozoário, antígenos bacteriais, antígenos alérgicos, antígenos autoimunes, ou antígenos adicionais, pelo menos um alérgeno conforme aqui definido, pelo menos um anticorpo conforme aqui definido, pelo menos um receptor de célula T específico de antígeno conforme aqui definido, ou pelo menos uma outra proteína ou peptídeo adequados para uma aplicação específica (terapêutica) conforme aqui definido. Este segundo componente é adicionado (de acordo com uma segunda etapa de preparação da composição imunoestimulatória da invenção) ao "componente adjuvante" acima preparado para formar a composição imunoestimulatória da invenção. Antes da adição, o pelo menos um mRNA livre não é complexado e não suportará preferivelmente qualquer reação de complexação detectável ou significante sob a adição do componente adjuvante. Isto é devido a forte ligação do composto catiônico ou policatiônico do acima descrito pelo menos um (m)RNA no componente adjuvante. Em outras palavras, quando o pelo menos um mRNA livre, que codifica a proteína terapeuticamente ativa é adicionado ao "componente adjuvante", preferivelmente composto catiônico ou policatiônico não livre ou substancialmente não livre está presente, que pode formar um complexo com o pelo menos um mRNA livre. Consequentemente, uma translação eficiente do pelo menos um mRNA livre da composição da invenção é possível in vivo.

[000179] O pelo menos um mRNA livre, que é o segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção, é um RNA mensageiro, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa ou peptídeo conforme aqui definido, pelo menos um antígeno conforme aqui definido, por exemplo antígenos de tumor, antígenos patogênicos (por exemplo, selecionados de proteínas patogênicas conforme definido acima ou de antígenos de animal, antígenos virais, antígenos de protozoário, antígenos bacteriais, antígenos alérgicos), antígenos autoimunes, ou antígenos adicionais, pelo menos um alérgeno conforme aqui definido, pelo menos um anticorpo conforme aqui definido, pelo menos um receptor de célula T específica de antígeno conforme aqui definido, ou pelo menos uma outra proteína ou peptídeo adequados para uma aplicação específica (terapêutica) conforme aqui definido. Neste contexto, um mRNA é em geral definido conforme acima para o componente adjuvante como um RNA, que é composto de vários elementos estruturais, por exemplo, uma região opcional 5'-UTR, um local de ligação ribossomal posicionado à montante seguido por uma região de codificação, uma região ótima opcional 3'-UTR, que pode ser seguida por uma calda poli-A (e/ou uma calda poli-C). O pelo menos um mRNA livre pode ocorrer como um RNA mono, di, ou ainda multicistrônico, isto é, um RNA que conduz as sequências de codificação de uma, duas ou mais proteínas. Tais sequências de codificação em mRNA di, ou ainda multicistrônico podem ser separadas por pelo menos uma sequência IRES, por exemplo, conforme aqui definido.

[000180] O pelo menos um mRNA livre, provido como um segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção, pode codificar pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa. No contexto da presente invenção, tal proteína terapeuticamente ativa preferivelmente pode ser qualquer proteína ou peptídeo, adequado para a proposta terapêutica, mais preferivelmente pode ser selecionado de qualquer proteína recombinante ou isolada conhecida a um técnico no assunto e ainda mais preferivelmente pode ser selecionada de qualquer proteína terapeuticamente ativa conforme definido acima para o componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção. Tais proteínas terapeuticamente ativas conforme definido acima incluem, sem estar limitado a estes, por exemplo, proteínas, capazes de estimular ou inibir a transdução de sinal na célula, por exemplo, citoquinas, anticorpos, etc., fatores apoptóticos ou proteínas relacionadas à apoptose, proteínas adjuvantes, por exemplo, selecionadas de adjuvantes de proteína humana ou de adjuvantes de proteína patogênica, em particular de adjuvantes de proteína bacterial, etc.

[000181] O pelo menos um mRNA livre, provido como um segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção, pode, além disso, codificar pelo menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Neste contexto, o pelo menos um mRNA livre, provido como um segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção, pode codificar qualquer anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido acima para o componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção.

[000182] Finalmente, o pelo menos um mRNA livre, provido como um segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção, pode também codificar pelo menos um antígeno conforme definido acima. Neste contexto, um (tumor) antígeno ou, em geral, o termo "antígeno" é definido conforme descrito acima para o componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e tipicamente se refere a uma substância que é reconhecida pelo sistema humano e é capaz de disparar uma resposta imune específica de antígeno, por exemplo, por formação de anticorpos como parte de uma resposta imune adaptativa. De acordo com uma concretização preferida, o pelo menos um mRNA livre, provido como um segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção, pode codificar qualquer antígeno conforme definido acima para o componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção. De acordo com uma concretização ainda mais preferida, tais antígenos podem ser selecionados de antígenos de tumor conforme definido acima para o componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, por exemplo, antígenos específicos de tumor (TSAs) e antígenos associados a tumor (TAAs), conforme definido acima, etc.

[000183] O pelo menos um mRNA livre, que é provido como um segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção, pode ser idêntico ou diferente ao pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, dependente dos requerimentos específicos de terapia. Ainda mais preferivelmente, o pelo menos um mRNA livre, que é provido como um segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção, é idêntico ao pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção.

[000184] A proporção do primeiro componente (isto é, o componente adjuvante compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico) e o segundo componente (isto é, o pelo menos um mRNA livre) pode ser selecionado na composição imunoestimulatória da invenção de acordo com os requerimentos específicos de uma terapia particular, por exemplo, uma terapia de câncer, etc. Tipicamente, a proporção de componente adjuvante e o pelo menos um mRNA livre (componente adjuvante : mRNA livre) da composição imunoestimulatória da invenção é selecionada tal que uma estimulação significante do sistema humano inato é induzida devido ao componente adjuvante. Em paralelo, a proporção é selecionada tal que uma quantidade significante do pelo menos um mRNA livre pode ser provida in vivo conduzindo a uma translação eficiente e concentração da proteína expressa in vivo., por exemplo, o pelo menos um anticorpo, antígeno e/ou proteína terapeuticamente ativa, etc., conforme definido acima. Preferivelmente a proporção de componente adjuvante : mRNA livre na composição imunoestimulatória da invenção é selecionada da faixa de cerca de 5:1 (p/p) a cerca de 1:10 (p/p), mais preferivelmente de uma faixa de cerca de 4:1 (p/p) a cerca de 1:8 (p/p), ainda maispreferivelmente de uma faixa de cerca de 3:1 (p/p) a cerca de 1:5 (p/p) ou 1:3 (p/p), e mais preferivelmente a proporção de componente adjuvante: mRNA livre na composição imunoestimulatória da invenção é selecionada de uma proporção de cerca de 1:1 (p/p).

[000185] Adicionalmente ou alternativamente, a proporção do primeiro componente (isto é, o componente adjuvante compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico) e o segundo componente (isto é, o pelo menos um mRNA livre) pode ser calculada na base da proporção de nitrogênio/fosfato (proporção N/P) do complexo de RNA total. No contexto da presente invenção, uma proporção N/P é preferivelmente na faixa de cerca de 0,1-10, preferivelmente em uma faixa de cerca de 0,3-4, e, mais preferivelmente, em uma faixa de cerca de 0,5-2 ou 0,7-2 relacionada à proporção de RNA:peptídeo no complexo, e, mais preferivelmente, na faixa de cerca de 0,7-1,5.

[000186] Adicionalmente ou alternativamente, a proporção do primeiro componente (isto é, o componente adjuvante compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico) e o segundo componente (isto é, o pelo menos um mRNA livre) pode também ser selecionado na composição imunoestimulatória da invenção na base da proporção molar de ambos RNAs a cada outro, isto é, o (m)RNA do componente adjuvante, sendo complexado com um composto catiônico ou policatiônico) e o pelo menos um mRNA livre do segundo componente. Tipicamente, a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para o pelo menos um mRNA livre do segundo componente pode ser selecionada tal que a proporção molar supre as definições acima (p/p) e/ou N/P. Mais preferivelmente, a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para o pelo menos um mRNA livre do segundo componente pode ser selecionada, por exemplo, de uma proporção molar de cerca de 0,001:1, 0,01:1, 0,1:1, 0,2:1, 0,3:1, 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1:0,9, 1:0,8, 1:0,7, 1:0,6, 1:0,5, 1:0,4, 1:0,3, 1:0,2, 1:0,1, 1:0,01, 1:0,001, etc, ou de qualquer faixa formada por quaisquer dois dos valores acima, por exemplo, uma faixa selecionada de cerca de 0,001:1 a 1:0,001, incluindo a faixa de cerca de 0,01:1 a 1:0,001, 0,1:1 a 1:0,001, 0,2:1 a 1:0,001, 0,3:1 a 1:0,001, 0,4:1 a 1:0,001, 0,5:1 a 1:0,001, 0,6:1 a 1:0,001, 0,7:1 a 1:0,001, 0,8:1 a 1:0,001, 0,9:1 a 1:0,001, 1:1 a 1:0,001, 1:0,9 a 1:0,001, 1:0,8 a 1:0,001, 1:0,7 a 1:0,001, 1:0,6 a 1:0,001, 1:0,5 a 1:0,001, 1:0,4 a 1:0,001, 1:0,3 a 1:0,001, 1:0,2 a 1:0,001, 1:0,1 a 1:0,001, 1:0,01 a 1:0,001, ou a faixa de cerca de 0,01:1 a 1:0,01, 0,1:1 a 1:0,01, 0,2:1 a 1:0,01, 0,3:1 a 1:0,01, 0,4:1 a 1:0,01, 0,5:1 a 1:0,01, 0,6:1 a 1:0,01,0,7:1 a 1:0,01, 0,8:1 a 1:0,01, 0,9:1 a 1:0,01, 1:1 a 1:0,01, 1:0,9 a1:0,01, 1:0,8 a 1:0,01, 1:0,7 a 1:0,01, 1:0,6 a 1:0,01, 1:0,5 a 1:0,01,1:0,4 a 1:0,01, 1:0,3 a 1:0,01, 1:0,2 a 1:0,01, 1:0,1 a 1:0,01, 1:0,01 a 1:0,01, ou incluindo uma faixa de cerca de 0,001:1 a 1:0,01, 0,001:1 a 1:0,1, 0,001:1 a 1:0,2, 0,001:1 a 1:0,3, 0,001:1 a 1:0,4, 0,001:1 a 1:0,5, 0,001:1 a 1:0,6, 0,001:1 a 1:0,7, 0,001:1 a 1:0,8, 0,001:1 a 1:0,9, 0,001:1 a 1:1, 0,001 a 0,9:1, 0,001 a 0,8:1, 0,001 a 0,7:1, 0,001 a 0,6:1, 0,001 a 0,5:1, 0,001 a 0,4:1, 0,001 a 0,3:1, 0,001 a 0,2:1, 0,001 a 0,1:1, ou uma faixa de cerca de 0,01:1 a 1:0,01, 0,01:1 a 1:0,1, 0,01:1 a 1:0,2, 0,01:1 a 1:0,3, 0,01:1 a 1:0,4, 0,01:1 a 1:0,5, 0,01:1 a 1:0,6, 0,01:1 a 1:0,7, 0,01:1 a 1:0,8, 0,01:1 a 1:0,9, 0,01:1 a 1:1, 0,001 a 0,9:1, 0,001 a 0,8:1, 0,001 a 0,7:1, 0,001 a 0,6:1, 0,001 a 0,5:1, 0,001 a 0,4:1,0,001 a 0,3:1,0,001 a 0,2:1,0,001 a 0,1:1, etc.

[000187] Ainda mais preferivelmente, a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para o pelo menos um mRNA livre do segundo componente pode ser selecionada, por exemplo, de uma faixa de cerca de 0,01:1 a 1:0,01. Mais preferivelmente, a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para o pelo menos um mRNA livre do segundo componente pode ser selecionada, por exemplo, de uma proporção molar de cerca de 1:1. Qualquer das definições acima com relação a proporção (p/p) e/ou N/P pode também se aplicar.

[000188] De acordo com a presente invenção, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção conforme definido acima, que codifica uma proteína, por exemplo, uma proteína terapeuticamente ativa, anticorpo e/ou antígeno, pode também codificar fragmentos e/ou variantes das proteínas antes mencionadas, no qual os fragmentos e/ou variantes podem ter uma identidade de sequência para uma das antes mencionadas proteínas de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 85%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, e mais preferivelmente pelo menos 99% sobre o comprimento total das (codificação) sequências de ácido nucleico que codificam estas proteínas. No contexto da presente invenção um fragmento de tal proteína é para ser compreendido como uma proteína truncada deste, isto, é uma sequência de aminoácido, que é N-terminalmente, C-terminalmente e/ou intrassequencialmente truncada comparada à sequência de aminoácido da proteína original (nativa). Especialmente, fragmentos incluindo um epítopo antigênico são preferidos. Neste contexto, fragmentos e epítopos são preferivelmente conforme especificamente definidos acima para antígenos.

[000189] Uma "variante" no contexto da presente invenção refere-se a uma proteína conforme definido acima, por exemplo, uma proteína terapeuticamente ativa, proteína adjuvante, antígeno ou anticorpo conforme definido acima (ou que codifica mRNA ou sequência de (m)RNA), no qual ácidos nucleicos do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção ou ácidos nucleicos do pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, que codifica, por exemplo, uma proteína terapeuticamente ativa, anticorpo e/ou antígeno, etc., são trocados. Desse modo, uma proteína terapeuticamente ativa, proteína adjuvante, antígeno ou anticorpo é gerado, tendo uma sequência de aminoácido que difere da sequência original em uma ou mais mutações, tais como um aminoácido(s) substituído(s), inserido(s) e/ou anulado(s). Preferivelmente, os fragmentos e/ou variantes têm a mesma função biológica ou atividade específica comparada às proteínas nativas de comprimento total, por exemplo, proteínas terapeuticamente ativas, antígenos ou anticorpos. Tal "função biológica" inclui, por exemplo, a capacidade de ligação específica (por exemplo, de antígenos particulares), atividade catalítica destas proteínas, por exemplo, de proteínas terapeuticamente ativas, etc. Neste contexto, o termo "função biológica" de anticorpos conforme descrito aqui também compreende neutralização de antígenos, ativação de complemento ou opsonização. Desse modo, anticorpos tipicamente reconhecem ou epítopos nativos na superfície de célula ou antígenos livres. Anticorpos conforme definidos acima podem interagir com antígenos de apresentação de célula e mecanismos de defesa diferentes iniciados. Por um lado, o anticorpo pode iniciar mecanismos de sinalização na célula alvo que conduz a autodestruição da célula (apoptose). Por outro lado, ele pode marcar a célula de tal modo que outros componentes ou células efetuadoras do sistema humano do corpo podem reconhecer e atacar. Os maquinismos de ataque são referidos como citotoxicidade mediada por complemento dependente de anticorpo (CMC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). ADCC envolve um reconhecimento do anticorpo por células imunes que engajam as células marcadas de anticorpo e ou através de sua ação direta, ou através do recrutamento de outros tipos de célula, conduzem à morte de célula etiquetada. CMC é um processo onde uma a cascata de proteínas de complemento diferentes torna-se ativada, usualmente quando vários anticorpos estão em proximidade entre si, ou resultando em lise da célula ou atraindo outras células imunes a esta localização para função da célula efetuadora. Na neutralização de um antígeno, o anticorpo pode se ligar a um antígeno e neutralizar o mesmo. Tal reação de neutralização, por sua vez, conduz em geral a bloqueio do anticorpo. Desse modo, o anticorpo pode ligar somente um antígeno, ou, em caso de um anticorpo biespecífico, dois antígenos. Em particular, fragmentos de scFv de anticorpo são úteis para reações de neutralização porque eles não contêm as funcionalidades do domínio constante de um anticorpo. Na ativação de complemento, o sistema complexo de proteínas de complemento pode ser ativado via ligação de um anticorpo que é independente da parte de Fc de um anticorpo. Produtos finais da cascata de complemento resultam em lise da célula e geração de um meio inflamatório. Na opsonização, patógenos ou outras partículas não celulares são tornadas acessíveis a fagócitos via ligação do domínio constante de um anticorpo. Alternativamente, células reconhecidas como estranhas podem ser formadas em camadas via citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em particular, células NK podem revelar funções de lise por ativação de receptores Fc.

[000190] De modo a determinar a percentagem na qual duas sequências são idênticas, particularmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção, e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, as sequências podem ser alinhadas de modo a serem subsequentemente comparadas entre si. Portanto, como um exemplo, por exemplo, folgas podem ser inseridas na sequência da primeira sequência (por exemplo, (m)RNA ou mRNA) e o componente na posição correspondente da segunda sequência (por exemplo, (m)RNA ou mRNA), podem ser comparadas. Se uma posição na primeira sequência (por exemplo, sequência de (m)RNA ou mRNA) é ocupada pelo mesmo componente como é o caso em uma posição na segunda sequência (por exemplo, (m)RNA ou mRNA), as duas sequências são idênticas nesta posição. A percentagem na qual duas sequências de (m)RNA (ou mRNA) são idênticas é uma função do número de posições idênticas dividido pelo número total de posições. O mesmo, naturalmente também se aplica consequentemente às sequências de DNA ou às sequências de aminoácido codificadas.

[000191] A percentagem na qual duas sequências, tal como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, ou sua sequência de aminoácido codificada são idênticas pode ser determinada usando-se um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, mas não limitativo, de um algoritmo matemático que pode ser usado é o algoritmo de Karlin et. al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 ou Altschul et al. (1997), Acid nucleics Res, 25:3389-3402. Tal algoritmo é integrado no programa BLAST ou NBLAST. Sequências que são idênticas às sequências do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção ou do pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção (ou para as regiões de codificação destes) a uma certa extensão podem ser identificadas por estes programas.

[000192] Sequências de RNA correspondentes a pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção que codifica sequências de aminoácido, que têm (a) substituições conservativas comparadas ao fisiológico, isto é, sequência nativa e não modificada em particular caem no termo "variantes". Substituições em que aminoácidos codificados que se originam da mesma classe são trocadas por uma outra são denominadas substituições conservativas. Em particular, estas são aminoácidos codificados, cadeias laterais alifáticas codificadas, cadeias laterais positivamente ou negativamente carregadas, grupos aromáticos nas cadeias laterais ou aminoácidos codificados, as cadeias laterais das quais podem entrar nas pontes de hidrogênio, por exemplo, cadeias laterais que têm uma função hidroxila. Isto significa que, por exemplo, um aminoácido tendo uma cadeia lateral polar é substituído por outro aminoácido tendo, do mesmo modo, cadeia lateral polar, ou, por exemplo, um aminoácido caracterizado por uma cadeia lateral hidrofóbica é substituído por outro aminoácido tendo, do mesmo modo, cadeia lateral hidrofóbica (por exemplo, serina (treonina) por treonina (serina) ou leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Inserções e substituições são possíveis, em particular, naquelas posições de sequência que não causam modificação da estrutura tridimensional ou não afetam a região de ligação do domínio catalítico. Modificações da estrutura tridimensional por inserção(ões) ou anulação(ões) podem facilmente serem determinadas, por exemplo, usando-se espectro CD (espectro de dicroísmo circular) (Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al, (ed.), Elsevier, Amsterdam).

[000193] Aquelas sequências de RNA correspondentes a pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção ou ao pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, que codificam sequência de aminoácidos conforme definido acima, podem ocorrer como um mono, di, ou ainda multicistrônico RNA, isto é, um RNA que conduz as sequências de codificação de uma, duas ou mais proteínas conforme definido acima, por exemplo, proteínas terapeuticamente ativas, proteínas adjuvantes, (proteína) antígenos ou anticorpos conforme definido acima. Se uma sequência de RNA correspondente ao pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção dentro da definição acima codifica pelo menos uma proteína conforme definido acima, por exemplo, duas, três ou mais de uma proteína terapeuticamente ativa, proteína adjuvante, antígeno ou anticorpo conforme definido acima, cada uma destas proteínas pode ser selecionada da mesma ou de uma (preferivelmente) proteína diferente conforme definido acima. Em qualquer caso, cada proteína codificada pela sequência de RNA correspondente ao pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode ser selecionada independentemente.

[000194] De acordo com outra concretização particularmente preferida, a composição imunoestimulatória da invenção da presente invenção pode compreender como o pelo menos um mRNA livre ou como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante pelo menos uma sequência de RNA bi ou ainda multicistrônica conforme definido acima. Cada sequência de codificação nestas sequências de RNA bi ou ainda multicistrônicas conforme definido acima podem ser separadas por pelo menos uma assim denominada sequência IRES (local de entrada ribossomal interno). Neste contexto, uma sequência IRES pode funcionar como um local de ligação de ribossomo único, mas ela pode também servir para proporcionar uma sequência de RNA bi ou ainda multicistrônica conforme definido acima que codifica várias proteínas que são para serem transladadas por ribossomos independentemente de uma outra. Exemplos de sequências IRES que podem ser usadas de acordo com a invenção são aquelas de picornavírus (por exemplo, FMDV), pestivírus (CFFV), poliovirus (PV), vírus da encefalomiocardite (ECMV), vírus de doença do pé e boca (FMDV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da febre suína clássica (CSFV), vírus de leukoma de camundongo (MLV), vírus da imunodeficiência de símio (SIV) ou vírus da paralisia de gafanhoto (CrPV).

[000195] De acordo com uma concretização particularmente preferida, a composição imunoestimulatória da presente invenção pode também compreender como o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre, uma mistura de sequências de RNA diferentes, no qual a mistura compreende, por exemplo, pelo menos um RNA monocistrônico que codifica uma proteína conforme definido acima, e/ou pelo menos um mRNA bi- ou ainda multicistrônico que codifica as mesmas ou proteínas diferentes conforme definido acima, por exemplo, uma proteína terapeuticamente ativa, uma proteína adjuvante, um antígeno e/ou um anticorpo conforme definido acima.

[000196] De acordo com outra concretização específica, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser providos como um "RNA estabilizado", preferivelmente um mRNA estabilizado, isto é, como um RNA que é essencialmente resistente a degradação in vivo por várias aproximações (por exemplo, por uma exo- ou endonuclease). É conhecido na técnica que instabilidade e (rápida) degradação de mRNA ou de RNA in vivo em geral pode representar uma sério problema na aplicação de composições à base de RNA. Esta instabilidade de RNA é tipicamente devido a enzimas de degradação de RNA, "RNAases" (ribonucleases), no qual contaminação com tais ribonucleases pode as vezes degradar completamente RNA na solução. Consequentemente, a degradação natural de RNA no citoplasma de células é muito finamente regulada e contaminações de RNase podem ser geralmente removidas por tratamento especial antes do uso de referidas composições, em particular com pirocarbonato de dietila (DEPC). Um número de mecanismos de degradação natural são conhecidos neste particular na técnica anterior, que podem ser utilizados também. Por exemplo, a estrutura terminal é tipicamente de importância crítica para um mRNA in vivo. Como um exemplo, na extremidade 5' de mRNAs que ocorrem naturalmente existe usualmente uma assim denominada "estrutura de capa" (uma nucleotídeo guanosina modificado), e na extremidade 3’ é tipicamente uma sequência de até 200 nucleotídeos adenosina (a assim denominada calda poli-A).

[000197] De acordo com uma concretização particularmente preferida, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, particularmente se provido como um mRNA, pode, portanto, ser estabilizado contra degradação por RNases pela adição de uma assim denominada estrutura de "5' capa". Preferência particular é dada neste particular a um m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A ou G(5')ppp(5')G como a estrutura 5' capa". Contudo, tal modificação é introduzida somente se uma modificação, particularmente conforme aqui definido, não foi já introduzida na extremidade 5' do pelo menos um (m)RNA e/ou mRNA conforme definido acima, ou se a modificação não interfere com as propriedades imunogênicas do pelo menos um (m)RNA e/ou mRNA conforme definido acima.

[000198] De acordo com outra concretização particularmente preferida, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode conter, especialmente se o RNA está na forma de um mRNA, uma calda poli-A em seu 3' terminal of tipicamente cerca de 10 a 200 nucleotídeos adenosina, preferivelmente cerca de 10 a 100 nucleotídeos adenosina, mais preferivelmente cerca de 20 a 100 nucleotídeos adenosina, ou ainda mais preferivelmente cerca de 40 a 80 nucleotídeos adenosina.

[000199] De acordo com uma concretização adicionalmente particularmente preferida, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode conter, especialmente se o RNA está na forma de um mRNA, uma calda poli-C em seu 3' terminal de tipicamente cerca de 10 a 200 nucleotídeos citosina, preferivelmente cerca de 10 a 100 nucleotídeos citosina, mais preferivelmente cerca de 20 a 70 nucleotídeos citosina, ou ainda mais preferivelmente cerca de 20 a 60 ou ainda 10 a 40 nucleotídeos citosina.

[000200] De acordo com outra concretização, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção pode, além disso, ser GC-modificado ou modificado em outra forma. Algumas modificações do RNA podem ser, dependendo do tipo de RNA, mais adequadas para um RNA em geral, ou, por exemplo, no caso de GC-modificado (m)RNA ou sequências de mRNA, serem mais adequadas para um RNA de codificação, preferivelmente um (m)RNA e/ou mRNA conforme definido acima. Tais modificações adicionais conforme aqui definido preferivelmente condizem a um (m)RNA e/ou mRNA estabilizado conforme definido acima.

[000201] De acordo com uma concretização específica, tal RNA estabilizado pode ser preparado por modificação do teor de G/C da região de codificação das sequências de RNA aqui mencionadas, por exemplo, uma sequência de RNA correspondente ao pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou ao pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção.

[000202] Em uma concretização particularmente preferida da presente invenção, o teor de G/C da região de codificação do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção é alterado, preferivelmente aumentado, comparado ao teor de G/C da região de codificação do RNA não modificado correspondente (no seguinte "RNA nativo"). Neste contexto, a sequência de aminoácido codificada desta sequência de RNA de G/C aumentado correspondente ao pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção não é preferivelmente alterado comparado ao correspondente RNA nativo. Tal alteração da sequência GC pode ser denominada na seguinte estabilização GC.

[000203] Esta estabilização G/C do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção é baseada no fato que a sequência de qualquer região de RNA a ser transladada é importante para translação eficiente daquele RNA. Desse modo, a sequência de vários nucleotídeos é importante. Em particular, sequências tendo um teor aumentado de G (guanosina)/C (citosina) são mais estáveis do que sequências tendo um teor aumentado de A (adenosina)/U (uracila). De acordo com a invenção, os códons do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção ou do pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção são, portanto, variados comparados a sua sequência nativa de RNA, enquanto a retenção da sequência de aminoácido transladada, tal que elas incluem uma quantidade aumentada de nucleotídeos G/C. Com relação ao fato que vários códons para um ou o mesmo aminoácido (assim denominado degeneração do código genético), os códons mais favoráveis para a estabilidade podem ser determinados (assim denominados uso de códon alternativo).

[000204] Dependendo do aminoácido a ser codificado pelo o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, existem várias possibilidades de modificação de G/C da sequência de RNA, comparada a sua sequência nativa. No caso de aminoácidos que são codificados por códons que contêm exclusivamente nucleotídeos G ou C, nenhuma modificação de G/C do códon é necessária. Desse modo, os códons para Pro (CCC ou CCG), Arg (CGC ou CGG), Ala (GCC ou GCG) e Gly (GGC ou GGG) não requerem modificação de G/C, visto que nenhum A ou U está presente.

[000205] Em contraste, códons que contêm nucleotídeos A e/ou U podem ser G/C-modificados por substituição de outros códons que codificam para os mesmos aminoácidos, mas não contêm A e/ou U. Exemplos destes são:

[000206] os códons para Pro podem ser G/C-modificados de CCU ou CCA para CCC ou CCG;

[000207] os códons para Arg podem ser G/C-modificados de CGU ou CGA ou AGA ou AGG para CGC ou CGG;

[000208] os códons para Ala podem ser G/C-modificados de GCU ou GCA para GCC ou GCG;

[000209] os códons para Gly podem ser G/C-modificados de GGU ou GGA para GGC ou GGG.

[000210] Em outros casos, embora A ou U nucleotídeos não possam ser eliminados dos códons, é, contudo, possível diminuir o teor de A e U pelo uso de códons que contêm um teor baixo de A e/ou U nucleotídeos. Exemplos destes são:

[000211] os códons para Phe podem ser G/C-modificados de UUU para UUC;

[000212] os códons para Leu podem ser G/C-modificados de UUA, UUG, CUU ou CUA para CUC ou CUG;

[000213] os códons para Ser podem ser G/C-modificados de UCU ou UCA ou AGU para UCC, UCG ou AGC;

[000214] os códons para Tyr podem ser G/C-modificados de UAUpara UAC;

[000215] os códons para Cys podem ser G/C-modificados de UGUpara UGC;

[000216] os códons para His podem ser G/C-modificados de CAUpara CAC;

[000217] os códons para Gln podem ser G/C-modificados de CAApara CAG;

[000218] os códons para Ile podem ser G/C-modificados de AUU ou AUA para AUC;

[000219] os códons para Thr podem ser G/C-modificados de ACU ou ACA para ACC ou ACG;

[000220] os códons para Asn podem ser G/C-modificados de AAUpara AAC;

[000221] os códons para Lys podem ser G/C-modificados de AAApara AAG;

[000222] os códons para Val podem ser G/C-modificados de GUU ou GUA para GUC ou GUG;

[000223] os códons para Asp podem ser G/C-modificados de GAU para GAC;

[000224] os códons para Glu podem ser G/C-modificados de GAApara GAG;

[000225] o códon de parada UAA pode ser G/C-modificado paraUAG ou UGA.

[000226] No caso dos códons para Met (AUG) e Trp (UGG), poroutro lado, não existe possibilidade de modificação de sequência.

[000227] As substituições listadas acima podem ser usadas ou individualmente ou em todas as combinações possíveis para aumentar o teor de G/C do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção comparado a seu RNA nativo particular (isto é, a sequência não modificada). Desse modo, por exemplo, todos os códons para Thr que ocorrem na sequência nativa podem ser G/C-modificados para ACC (ou ACG). Preferivelmente, contudo, por exemplo, combinações das possibilidades de substituição acima são usadas:

[000228] substituição de todos os códons que codificam para Thr na sequência não-modificada (RNA nativo) a ACC ou (ACG), e

[000229] substituição de todos os códons originalmente que codificam para Ser para UCC ((ou UCG ou AGC);

[000230] substituição de todos os códons que codificam para Ile na sequência original para AUC e

[000231] substituição de todos os códons originalmente que codificam para Lys para AAG, e

[000232] substituição de todos os códons que codificam originalmente para Tyr para UAC, e

[000233] substituição para todos os códons que codificam para Val na sequência de origem para GUC (ou GUG), e

[000234] substituição de todos os códons originalmente que codificam para Glu para GAG, e

[000235] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Ala para GCC (ou GCG), e

[000236] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Arg para CGC (ou CGG), e

[000237] substituição de todos os códons que codificam para Val na sequência original para GUC (ou GUG), e

[000238] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Glu para GAG, e

[000239] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Ala para GCC (ou GCG), e

[000240] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Gly para GGC (ou GGG), e

[000241] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Asn para AAC, e

[000242] substituição de todos os códons que codificam para Val nasequência original para GUC (ou GUG), e

[000243] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Phe para UUC, e

[000244] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Cys para UGC, e

[000245] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Leu para CUG (ou CUC), e

[000246] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Gln para CAG, e

[000247] substituição de todos os códons originalmente quecodificam para Pro para CCC (ou CCG); etc.

[000248] Preferivelmente, o teor de G/C da região de codificação deuma sequência de RNA correspondente ao pelo menos um (m)RNA docomponente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção é aumentado por pelo menos 7%, mais preferivelmente por pelo menos 15%, particularmente preferivelmente por pelo menos 20%, comparado ao teor de G/C da região de codificação do RNA nativo que codifica para uma proteína. De acordo com uma concretização específica pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 90%, 95% ou ainda 100% dos códons substituíveis na região de codificação para uma proteína ou a sequência total da sequência nativa de RNA são substituídos, aumentando, desse modo, o GC/teor de referida sequência.

[000249] Neste contexto, é particularmente preferível aumentar o G/C teor do RNA nativo do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, ao máximo (isto é, 100% dos códons substituíveis do RNA nativo), em particular na região que codifica uma proteína.

[000250] De acordo com a invenção, uma modificação adicionalmente preferida do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção é baseada na descoberta que a eficiência de translação é também determinada por uma frequência diferente na ocorrência de tRNAs em células. Desse modo, se assim denominados "códons raros" estão presentes uma sequência nativa de RNA a uma extensão aumentada, o G/C-estabilizado correspondente ou sequência nativa de RNA podem ser transladados a um grau significantemente mais pobre do que no caso onde códons que codificam rRNAs relativamente "frequentes" estão presentes.

[000251] De acordo com a invenção, a região no pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, que codifica uma proteína, é preferivelmente GC-estabilizada comparada à região correspondente do respectivo RNA nativo tal que pelo menos um códon da sequência nativa que codifica para um tRNA que é relativamente raro na célula é trocado por um códon que codifica para um tRNA que é relativamente frequente na célula e conduz o mesmo aminoácido como o tRNA relativamente raro. Por esta modificação, as sequências nativas de RNA são GC-estabilizadas tal que códons para qual frequentemente ocorrem tRNAs são disponíveis são inseridos. Em outras palavras, de acordo com the invenção, por esta modificação todos os códons da sequência nativa que codifica para um tRNA que é relativamente na célula podem em cada caso serem trocados para um códon que codifica para um tRNA que é relativamente frequente na célula e que, em cada caso, conduz o mesmo aminoácido como o tRNA relativamente raro.

[000252] Os tRNAs que ocorrem relativamente frequentemente na célula e que, em contraste, ocorrem relativamente raramente são conhecidos a um técnico no assunto;conforme, por exemplo, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11 (6): 660-666. Os códons que usam o aminoácido particular o tRNA que ocorre mais frequentemente, por exemplo, o códon Gly, que usa o tRNA que ocorre mais frequentemente na célula (humana), são particularmente preferidos.

[000253] De acordo com the invenção, é particularmente preferível ligar o sequencial G/C teor que é aumentado, em particular maximizado, na C-estabilizada sequência de RNA do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, com os códons "frequentes" sem modificação da sequência de aminoácido da proteína codificada pela região de codificação do RNA nativo. Esta concretização preferida permite provisão de particularmente eficientemente transladada e GC-estabilizada sequência de RNA do pelo menos um (m)RNA da composição imunoestimulatória da invenção do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção.

[000254] A determinação da GC modificação necessária (e/ou possível) do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, conforme descrito acima (teor de G/C aumentado; troca de tRNAs), pode ser efetuada usando-se o programa de computador conforme explanado em WO 02/098443 - a revelação da qual é incluída em seu escopo total na presente invenção. Usando-se este programa de computador, a sequência de nucleotídeo de qualquer RNA desejado de codificação conforme definido acima pode ser GC-estabilizado com o auxílio do código genético ou a natureza degenerativa deste tal que um teor de G/C máximo resulta. Em combinação com o uso de códons que codificam para tRNAs que ocorrem maus frequentemente possível na célula, a sequência de aminoácido codificada GC-estabilizada sequência de RNA do pelo menos um (m)RNA do componenteadjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composiçãoimunoestimulatória da invenção é preferivelmente não adicionalmente modificada comparada a sua sequência nativa de RNA. Alternativamente, é também possível modificar somente o teor de G/C ou somente o isso de códon comparado à sequência original. O código fonte em Visual Basic 6.0 (ambiente de desenvolvimento usado: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 com Servicepack 3) é também descrito em WO 02/098443.

[000255] De acordo com outra concretização específica, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode ser provido como um RNA estabilizado, que é essencialmente resistente a degradação in vivo (por exemplo, por uma exo- ou endonuclease), por modificação da estrutura de fosfato desta (destas) sequência(s) de RNA conforme aqui definido. Nucleotídeos que podem ser preferivelmente usados neste particular contêm um fosforotioato-estrutura de fosfato modificado, preferivelmente pelo menos um dos oxigênios de fosfato contidos na estrutura de fosfato sendo substituído por um átomo de enxofre. Uma sequência de RNA estabilizada conforme aqui definida, pode adicionalmente incluir, por exemplo: análogos de fosfato não iônicos, tais como, por exemplo, fosfanatos de alquila e arila, em que o oxigênio fosfanato carregado é substituído por um grupo alquila ou arila, ou fosfodiésteres e alquilfosfotriésteres, em que o resíduo de oxigênio carregado está presente na forma alquilatada. Em mais detalhes, as porções de fosfato podem preferivelmente serem substituídas por, por exemplo, fosforamidatos, fosforotioatos, peptídeos nucleotídeos, metilfosfonatos etc.

[000256] De acordo com outra concretização, uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode, do mesmo modo, ser modificada (e preferivelmente estabilizada) por introdução de nucleotídeos modificados contendo modificações de sua ribose ou porções bases na sequência de RNA. Geralmente, uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode conter qualquer nucleotídeo nativo (= que ocorre naturalmente), por exemplo, guanosina, uracila, adenosina, timidina e/ou citosina, ou um análogodos mesmos. Neste particular, análogos de nucleotídeo são definidos como variantes que ocorrem não nativamente de nucleotídeos que ocorrem naturalmente. Consequentemente, análogos são nucleotídeos quimicamente derivatizados com grupos funcionais que ocorrem não nativamente, que são preferivelmente adicionados a ou anulados do nucleotídeo que ocorre naturalmente ou que substitui os grupos funcionais que ocorrem naturalmente. Consequentemente, cada componente do nucleotídeo que ocorre naturalmente pode ser modificado, a saber, o componente base, o componente de açúcar (ribose) e/ou o componente de fosfato que forma a estrutura da sequência de RNA a ser modificada. Análogos de guanosina, uracila, adenosina, e citosina incluem, sem implicar em qualquer limitação, qualquer guanosina, uracila, adenosina, timidina ou citosina que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente que foram alteradas quimicamente, por exemplo, por acetilação, metilação, hidroxilação, etc., incluindo 1-metil- adenosina, 1-metil-guanosina, 1-metil-inosina, 2,2-dimetil-guanosina, 2,6-diaminopurina, 2'-amino-2'-deoxiadenosina, 2'-amino-2'-deoxicitidina, 2'-amino-2'-deoxiguanosina, 2'-amino-2'-deoxiuridina, 2- amino-6-cloropurinarribosídeo, 2-aminopurinar-ribosídeo, 2'-ara- adenosina, 2'-aracitidina, 2'-Arauridina, 2'-azido-2'-deoxiadenosina, 2'- azido-2'-deoxicitidina, 2'-azido-2'-deoxiguanosina, 2'-5azido-2'-deoxiuridina, 2-cloroadenosina, 2'-flúor-2'-deoxiadenosina, 2'-flúor-2'- deoxicitidina, 2'-flúor-2'-deoxiguanosina, 2'-flúor-2'-deoxiuridina, 2'- fluorotimidina, 2-metil-adenosina, 2-metil-guanosina, 2-metil-tio-N6- isopenenil-adenosina, 2'-0-metil-2-aminoadenosina, 2'-0-metil-2'- deoxiadenosina, 2'-0-metil-2'-deoxicitidina, 2'-0-metil-2'-deoxiguanosina, 2'-0-metil-2'-deoxiuridina, 2'-0-metil-5-metiluridina, 2'- O-metilinosina, 2'-0-metilpseudouridina, 2-tiocitidina, 2-tio-citosina, 3- metil-citosina, 4-acetil-citosina, 4-tiouridina, 5-(carbóxi-hidroximetil)- uracila, 5,6-di-hidrouridina, 5-aminoalilcitidina, 5-aminoalil-deóxi- uridina, 5-bromouridina, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracila, 5- carboximetilamonometil-uracila, 5-cloro-ara-citosina, 5-flúor-uridina, 5- lodouridina, 5-metoxicarbonilmetil-uridina, 5-metóxi-uridina, 5-metil-2- tio-uridina, 6-azacitidina, 6-azauridina, 6-cloro-7-deaza-guanosina, 6- cloropurinarribosídeo, 6-mercapto-guanosina, 6-metil-mercaptopurin- ribosídeo, 7-deaza-2'-deóxi-guanosina, 7-deaza-adenosina, 7-metil- guanosina, 8-aza-adenosina, 8-bromo-adenosina, 8-bromo-guanosina, 8-mercapto-guanosina, 8-oxoguanosina, benzimidazol-ribosídeo, beta- D-manosil-queosina, di-hidro-uracila, inosina, N1-metiladenosina, N6- ([6-amino-hexil]carbamoilmetil)-adenosina, N6-isopentenil-adenosina, N6-metil-adenosina, N7-metil-xantosina, metil éster de ácido N-uracil- 5- oxiacético, Puromicin, Queosina, ácido uracil-5- oxiacético, metil éster de ácido uracil-5- oxiacético, Wibutoxosina, Xantosina, e Xilo- adenosina. A preparação de tais análogos é conhecida a um técnico no assunto, por exemplo, das Patentes dos Estados Unidos 4.373.071, US 4.401.796, US 4.415.732, US 4.458.066, US 4.500.707, US 4.668.777, US 4.973.679, US 5.047.524, US 5.132.418, US 5.153.319, US 5.262.530 e 5.700.642. No caso de um análogo conforme descrito acima, preferência particular é dada de acordo com a invenção àqueles análogos que aumentam a imunogenicidade de uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, e/ou não interferem com uma modificação adicional do RNA que foi introduzido.

[000257] Uma sequência de RNA da composição imunoestimulatória da invenção conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode conter modificações de estrutura. Uma modificação de estrutura em conjunto com a presente invenção é uma modificação em que fosfatos da estrutura dos nucleotídeos contidos no RNA são quimicamente modificados. Tais modificações de estrutura tipicamente incluem, sem implicar em qualquer limitação, modificações do grupo consistindo em metilfosfanatos, fosforamidatos e fosforotioatos (por exemplo, citidina- 5'-0-(1-tiofosfato)).

[000258] A sequência de RNA da composição imunoestimulatória da invenção conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode adicionalmente ou alternativamente também conter modificações de açúcar. Uma modificação de açúcar em conjunto com a presente invenção é uma modificação química do açúcar dos nucleotídeos presentes e tipicamente incluem, sem implicar em qualquer limitação, modificações de açúcar selecionadas do grupo consistindo em 2'-deóxi-2'-flúor- oligoribonucleotídeo (2'-flúor-2'-deoxicitidina-5'-tri fosfato, 2'-flúor- 2'-deoxipiridi na-5' -trifosfato), 2' -deóxi-2'-deaminaoligoribonucleotídeo (2'-amino-2'-deoxicitidina-5'-trifosfato, 2'-amino-2'- deoxiuridina-5-trifosfato), 2'-0-alquil oligoribonucleotídeo, 2'-deóxi-2'-C-alquil oligoribonucleotídeo (2'-0-metilcitidina-5'-trifosfato, 2'-metiluridina-5'-trifosfato), 2'-C-alquil oligoribonucleotídeo, eisômeros destes (2'-aracitidina-5'-trifosfato, 2'-arauridina-5'-trifosfato), ou azidotrifosfato (2'-azido-2'-deoxicitidina-5'-trifosfato, 2'-azido-2'-deoxiuridina-5-trifosfato).

[000259] A sequência de RNA da composição imunoestimulatória da invenção conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode adicionalmente ou alternativamente também conter pelo menos uma modificação de base, que é preferivelmente adequada para aumentar a expressão da proteína codificada pela sequência de RNA, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante, significantemente conforme comparado com a sequência de RNA não-alterada, isto é, natural (= nativa). Significante neste caso significa um aumento na expressão da proteína comparada com a expressão da sequência de RNA nativo por pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, 40%, 50% ou 60%, mais preferivelmente por pelo menos 70%, 80%, 90%, ou ainda 100%, e mais preferivelmente por pelo menos 150%, 200%, ou ainda 300%. Em conjunto com a presente invenção, um nucleotídeo tendo uma modificação base é preferivelmente selecionado do grupo dos nucleotídeos modificados de base consistindo em 2-amino-6-cloropurinarribosídeo-5'-trifosfato, 2-aminoadenosina-5'-trifosfato, 2-tiocitidina-5'-trifosfato, 2-tiouridina-5'- trifosfato, 4-tiouridina-5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina-5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina-5'-trifosfato, 5-bromocitidina-5'-trifosfato, 5-bromouridina-5 '-trifosfato, 5-iodocitidina-5'-trifosfato, 5-iodouridina-5'- trifosfato, 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 5-metiluridina-5'-trifosfato,6-azacitidina-5'-trifosfato, 6-azauridina-5'-trifosfato, 6-chloropurineribosídeo-5'-trifosfato, 7-deazaadenosina-5'-trifosfato, 7-deazaguanosi na-5'-trifosfato, 8-aza-adenosina-5'-trifosfato, 8-azidoadenosina-5'-trifosfato, benzimidazol-ribosídeo-5'-trifosfato, N1 -metiladenosina-5'-trifosfato, N1 -metilguanosina-5'-trifosfato, N6-metiladenosina-5 '-trifosfato, 06-metilguanosina-5'-trifosfato,pseudouridina-5'-trifosfato, ou puromicin-5'-trifosfato, xantosina-5'-trifosfato. Preferência particular é dada aos nucleotídeos para modificações bases selecionados do grupo de nucleotídeos de base modificada consistindo em 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 7- deazaguanosina-5'-trifosfato, 5-bromocitidina-5'-trifosfato, epseudouridina-5'-trifosfato.

[000260] De acordo com uma concretização particularmente específica, uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção compreende entre 0,1% e 100% de (modificados) nucleotídeos selecionados de (modificados) nucleotídeos conforme definido acima com relação aos não modificados, isto é, sequência de RNA nativo, no qual preferivelmente entre 0,1 % e 100% de cada nucleotídeo queocorre não modificado ATP, GTP, CTP, UTP (e/ou TTP) de uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou of o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, ou de seu DNA- gabarito correspondente, pode ser modificado usando-se um modificado nucleotídeo correspondente conforme definido acima, mais preferivelmente entre 0,1% e 20%, entre 10% e 30%, entre 20% e 40%, entre 30% e 50%, entre 40% e 60%, entre 50% e 70%, entre 60% e 80%, entre 70% e 90%, ou entre 80% e 100% ou pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente 100% de cada nucleotídeo que ocorre nativamente não-codificado ATP, GTP CTP, UTP (e/ou TTP) do não modificado RNA.

[000261] Em uma concretização adicionalmente preferida da presente invenção, o teor de A/U no ambiente do local de ligação de ribossomo de uma (opcionalmente já GC-estabilizado) sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, é aumentado comparado ao teor de A/U no ambiente do local de ligação de ribossomo de sua sequência de RNA nativo particular. Esta modificação (um teor aumentado de A/U ao redor do local de ligação de ribossomo) aumenta a eficiência de ligação de ribossomo para a sequência de RNA. Uma ligação efetiva dos ribossomos ao local de ligação de ribossomo (sequência de Kozak: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO: 122), a AUG forma o códon de partida) por sua vez tem o efeito de uma translação eficiente da sequência de RNA conforme aqui definido.

[000262] De acordo com uma concretização adicional da presente invenção, uma sequência de RNA conforme aqui definida, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou the pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode ser adicionalmente modificada com relação a elementos de sequência potencialmente de desestabilização. Particularmente, a região de codificação e/ou a 5' e/ou 3' região não transladada da sequência de RNA conforme aqui definido pode ser adicionalmente modificada comparada à sequência de RNA nativo particular tal que ele não contém elementos de sequência de desestabilização, a sequência de aminoácido codificada da sequência de RNA conforme aqui definido preferivelmente não sendo modificado comparada a seu RNA nativo particular. É sabido que, por exemplo, em sequências de elementos de sequência de desestabilização de RNAs eucarióticos (DSE) ocorrem, ao qual proteínas de sinal ligam e regulam degradação enzimática de RNA in vivo. Para estabilização adicional da sequência de RNA conforme aqui definida, opcionalmente na região que codifica para uma proteína, uma ou mais de tais modificações adicionais comparadas à região correspondente do RNA nativo pode, portanto, ser efetuada, de modo que nenhum ou substancialmente nenhum elementos de sequência de desestabilização estão contidos aqui. De acordo com a invenção, DSEs presentes nas regiões não transladadas (3'- e/ou 5'-UTR) podem também ser eliminadas de uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou do pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, por tais modificações adicionais.

[000263] Tais sequências de desestabilização são, por exemplo, sequências ricas em AU (AURES), que ocorrem nas seções 3'-UTR 5 de numerosos RNAs instáveis (Caput et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 to 1674). Uma sequência de RNA conforme aqui definida, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, é portanto preferivelmente (adicionalmente) modificado comparado ao RNA nativo tal que o RNA modificado não contem tais sequências de desestabilização. Isto também se aplica àqueles motivos de sequência que são reconhecidos por endonucleases possíveis, por exemplo, a sequência GAACAAG, que está contida no segmento 3'-UTR do gene que codifica o receptor transferrin (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 to 1980). Estes motivos de sequência são também preferivelmente removidos de acordo com a invenção na sequência de RNA conforme aqui definida, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção.

[000264] Também preferivelmente de acordo com a invenção, uma sequência de RNA conforme aqui definida, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, tem, em uma forma adicionalmente modificada pelo menos um IRES conforme definido acima e/ou pelo menos um sequência de estabilização 5' e/ou 3', por exemplo, para aumentar ligação de ribossomo ou permitir expressão de proteínas codificadas diferentes, por exemplo, anticorpos, proteínas terapeuticamente ativas ou antígenos, conforme definido acima, localizados em um pelo menos um (bi ou ainda multicistrônico) RNA conforme definido acima.

[000265] De acordo com a invenção, uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, além disso preferivelmente pode ter pelo menos uma sequência de estabilização 5' e/ou 3'. Estas sequências de estabilização nas regiões não transladadas 5' e/ou 3' têm o efeito de aumentar a meia-vida do RNA conforme aqui definido no citosol. Estas sequências de estabilização podem ter 100% de homologia de sequência para sequências que ocorrem naturalmente que ocorrem em vírus, bactéria e eucariotes, mas podem também serem parcialmente ou completamente sintéticos. As sequências não transladadas (UTR) do gene globin, por exemplo, de Homo sapiens ou Xenopus laevis podem ser mencionadas como um exemplo de sequências de estabilização que podem ser usados na presente invenção para uma sequência de RNA estabilizada adicional conforme aqui definido, preferivelmente uma adicional estabilizada pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou uma adicional estabilizada pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção. Outro exemplo de uma sequência de estabilização tem a fórmula geral (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO: 123), que está contida no 3'UTR do RNA todo estável que codifica para globin, (l)-colágeno, 15-lipoxigenase ou para tirosina hidroxilase (cf. Holcik et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Tais sequências de estabilização podem naturalmente serem usadas individualmente ou em combinação com uma outra e também em combinação com outras sequências de estabilização conhecidas a um técnico no assunto. Uma sequência de RNA conforme aqui definida, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, está, portanto, preferivelmente presente como RNA estabilizado por globin UTR (regiões não-transladadas).

[000266] Quaisquer das modificações acima podem ser aplicadas a uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, e adicionalmente para qualquer RNA conforme usado no contexto da presente invenção e podem ser, se adequado ou necessário, combinadas entre si em qualquer combinação, provido quem estas combinações de modificações não interferem entre si no respectivo RNA modificado. Um técnico no assunto será capaz de fazer esta escolha consequentemente.

[000267] De acordo com the invenção, uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode ser preparada usando-se qualquer DNA natural ou sintético ou sequência de RNA disponível na técnica como um gabarito, isto é, qualquer ácido (desóxi)ribonucleico adequado. Tal DNA natural ou sintético ou sequências de RNA podem ser obtidas de qualquer fonte sintética ou que ocorre naturalmente, que é disponível a um técnico no assunto, por exemplo, pode ser derivada de uma biblioteca de proteína ou peptídeo ou pode ser transcrita de uma biblioteca de ácido nucleico, tal como uma biblioteca de cDNA, ou pode ser obtida de qualquer tecido vivo ou morto, de uma amostra obtida de, por exemplo, uma fonte humana, animal ou bacterial. Alternativamente, uma sequência de RNA conforme aqui definida, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode ser preparada sinteticamente por métodos conhecidos a um técnico no assunto, por exemplo, por síntese de fase sólida ou qualquer outro método adequado para preparação de sequência de ácido nucleicos, particularmente sequências de RNA. Além disso, substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos ou bases netas sequências são preferivelmente efetuadas usando-se uma matriz de DNA para preparações do RNA conforme aqui definido, ou por técnicas da mutagênese direcionada de local bem conhecidas, ou com uma estratégia de ligação de oligonucleotídeo (vide, por exemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001). A(s) modificação(ões) de uma sequência de RNA conforme aqui definida, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, pode(m) também ser introduzida(s) no RNA por meio de métodos adicionais conhecidos a um técnico no assunto. Métodos adequados são, por exemplo, métodos de síntese usando-se (automáticos ou semiautomáticas) dispositivos de síntese de oligonucleotídeo, métodos bioquímicos, tais como, por exemplo, métodos de transcrição in vitro, etc. Neste particular pode preferivelmente ser usado no caso de sequências (relativamente curtas), cujo comprimento geralmente não excede de 50 a 100 nucleotídeos, métodos de síntese usando-se (automáticos ou semiautomáticos) dispositivos de síntese de oligonucleotídeo, bem como métodos de transcrição in vitro. No caso de sequências (relativamente longas), por exemplo, sequências tendo um comprimento de mais do que 50 a 100 nucleotídeos, métodos bioquímicos são preferivelmente adequados, tais como, por exemplo, métodos de transcrição in vitro. Contudo, ainda moléculas de RNA modificadas por base mais alongas podem ser sintetizadas sinteticamente por acoplamento de vários fragmentos sintetizados covalentemente.

[000268] Conforme definido acima, a composição imunoestimulatória da invenção compreende a) um componente adjuvante e b) pelo menos um mRNA livre. De acordo com outra concretização, a composição imunoestimulatória da invenção pode compreender um adjuvante adicional, isto é, um adjuvante que está contido na composição imunoestimulatória da invenção adicional ao componente adjuvante definido acima. Neste contexto, um adjuvante pode ser compreendido como qualquer composto, que é adequado para suportar administração e opcionalmente distribuição da composição imunoestimulatória da invenção de acordo com a invenção. Além disso, tal adjuvante pode, sem estar ligado a estes, iniciar ou aumentar uma resposta imune do sistema humano inato, isto é, uma resposta imune não específica. Em outras palavras, quando administrada, a composição imunoestimulatória da invenção tipicamente induz uma resposta imune inata devido ao componente adjuvante, compreendendo ou consistindo em o pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico conforme definido acima. Contudo, tal resposta imune inata pode ser intensificada por adição de um adjuvante adicional, conforme definido em seguida. Tal adjuvante adicional pode ser selecionado de qualquer adjuvante conhecido a um técnico no assunto adequado para o presente caso, isto é, suportando a indução de uma resposta imune inata em um mamífero, exceto de compostos catiônico ou policatiônico conforme definido acima de modo a prevenir complexação de o pelo menos um mRNA livre. Preferivelmente, o adjuvante pode ser selecionado do grupo consistindo em, sem estar limitado a estes, incluindo quitosana, TDM, MDP, muramil dipeptídeo, pluronics, solução de alum, hidróxido de alumínio, ADJUMER® (polifosfazeno); alumínio fosfato gel; glucans de algas; algammulin; gel de hidróxido de alumínio (alum); gel de hidróxido de alumínio altamente de adsorção de proteína; gel de hidróxido de alumínio de baixa viscosidade; AF ou SPT (emulsão de esqualeno (5%), Tween 80 (0,2%), Pluronic L121 (1,25%), salina tamponada por fosfato, pH 7,4); AVRIDINE® (propanodiamina); BAY R1005® ((N-(2-deóxi-2-L-leucilamino-b-D- glucopiranosil)-N-octadecil-dodecanoil-amida hidroacetato);CALCITRIOL® (1-alfa,-di-hidróxi-vitamina D3); gel de fosfato de cálcio; CAPTM (nanopartículas de fosfato de cálcio); cólera holotoxin, cólera- toxin-Al-proteína-A-D-proteína de fusão de fragmento, subunidade B da cólera toxin; CRL 1005 (copolímero de bloco P1205); lipossomos contendo citoquina; DDA (dimetildioctadecilamônia brometo); DHEA (deidroepiandrosterona); DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina); DMPG (dimiristoilfosfatidilglicerol); DOC/alum complexo (sal de sódio ácido deoxicólico); adjuvantes completos de Freund; adjuvantes incompletos de Freund; gama inulin; Gerbu adjuvante (mistura de: i) N- acetilglucosaminil-(P1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina(GMDP), ii) dimetildioctadecilamônia cloreto (DDA), iii) zinc-L-prolina sal complexo (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-acetilglucosaminil-(b1- 4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina); imiquimod (l-(2-metipropil)- lH-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina); ImmTher® (N-acetilglucosaminil- N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glicerol dipalmitato); DRVs (imunolipossomos preparados de vesículas de dehidratação- rehidratação); interferon-gama; interleukin-1beta; interleukin-2;interleukin-7; interleukin-12; ISCOMS®; ISCOPREP 7.0.3. ®;lipossomos; LOXORIBINE® (7-alil-8-oxoguanosina); LT adjuvante oral (E.coli enterotoxin-protoxin instável); microesferass e micropartículas de qualquer composição; MF59®; (emulsão de esqualeno-água);MONTANIDE ISA 51® (adjuvante de Freund incompleto purificado); MONTANIDE ISA 720® (adjuvante de pole metabolizável); MPL® (3-Q- desacil-4'-monofosforil lipídeo A); MTP-PE e MTP-PE lipossomos ((N- acetil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- (hidroxifosforilóxi))-etilamida, sal de monossódio); MURAMETIDE® (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCHs); MURAPALMITINE® e D-MURAPALMITINE® (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-gliceroldipalmitoíla);NAGO (neuraminidase-galactose oxidase); nanoesferas ou nanopartículas de qualquer composição; NISVs (vesículas tensoativos não iônicas); PLEURAN® (P-glucan); PLGA, PGA e PLA (homo- e copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico;microesferas/nanoesferas); PLURONIC L121®; PMMA (metacrilato de polimetila); PODDS® (microesferas proteinadas); derivados depolietileno carbamato; poli-rA: poli-rU (complexo de ácido poliadenílico -ácido poliuridílico); polysorbate 80 (Tween 80); proteína cochleates (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULON® (QS- 21); Quil-A (Quil-A saponin); S-28463 (4-amino-otec-dimetil-2-etoximetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol); SAF-1® ("Formulação de adjuvante Syntex"); Sendai proteolipossomos e matrizes de lipídeo contendo Sendai; Span-85 (sorbitan trioleato); Specol (emulsão de Marcol 52, Span 85 e Tween 85); esqualeno ou Robane® (2,6,10,15,19,23-hexametiltetracosan e 2,6,10,15,19,23-hexametil- 2,6,10,14,18,22-tetracosa-hexano); esteariltirosina (octadeciltirosina cloridrato); Theramid® (N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D- isoGlu-L-Ala-dipalmitoxipropilamida); Theronyl-MDP (Termurtide® ou [thr 1]-MDP; N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina); partículas de Ty (Ty-VLPs ou partículas similares à vírus); Walter-Reed lipossomos (lipossomos contendo lipídeo A adsorvido em hidróxido de alumínio), e lipopeptídeos, incluindo Pam3Cys, em particular sais de alumínio, tais como Adju-phos, Alhydrogel, Rehydragel; emulsões, incluindo CFA, SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin; copolímeros, incluindo Optivax (CRL1005), LI 21, Poloaxmer4010), etc.; lipossomos, incluindo Stealth, cochleates, incluindo BIORAL; adjuvantes derivados de planta, incluindo QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; adjuvantes adequados para coestimulação incluindo Tomatine, biopolímeros, incluindo PLG, PMM, Inulin,; adjuvantes derivados de micróbio, incluindo Romurtide, DETOX, MPL, CWS, Mannose, CpG sequências de ácido nucleico, CpG7909, ligantes de TLR 1-10 humano, ligantes de murina TLR 1-13, ISS-1018, IC31, Imidazoquinolinas, Ampligen, Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs, cólera toxin, toxina instável ao calor, Pam3Cys, Flagellin, GPI anchor, LNFPIII/Lewis X, peptídeos antimocrobiais, UC-1V150, proteína de fusão RSV, cdiGMP; e adjuvantes adequados como antagonistas incluindo CGRP neuropeptídeo. Adjuvantes adequados podem, além disso, serem selecionados de ácidos nucleicos modificados de lipídeo ou de qualquer das sequências imunoestimulatórias de fórmula (I), (II), (III), (IIIa), (IV), (IVa), (IVb), (Va) e/ou (Vb), conforme definido acima.

[000269] De acordo com uma concretização adicional, a presente

[000270] Como um primeiro ingrediente, a composição farmacêutica da invenção compreende a composição imunoestimulatória da invenção conforme definido acima, isto é um a) componente adjuvante, compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA, complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e b) pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, no qual a composição imunoestimulatória é capaz de induzir ou intensificar uma resposta imune inata e opcionalmente adaptativa em um mamífero. Consequentemente, a composição farmacêutica da invenção tipicamente suporta uma resposta imune inata e opcionalmente uma resposta imune adaptativa do sistema humano de um paciente a ser tratado.

[000271] Além disso, a composição farmacêutica da invenção pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou veículo. No contexto da presente invenção, um veículo farmaceuticamente aceitável tipicamente inclui a base líquida ou não líquida da composição farmacêutica da invenção. Se a composição farmacêutica da invenção é provida na forma líquida, o veículo tipicamente será água livre de pirogênio; soluções salinas isotônicas ou tamponadas (aquosas), por exemplo, fosfato, citrato etc, soluções tamponadas. Particularmente para injeção da composição farmacêutica da invenção, água ou preferivelmente um tampão, mais preferivelmente um tampão aquoso, pode ser usado, contendo um sal de sódio, preferivelmente pelo menos 50 mM de um sal de sódio, um sal de cálcio, preferivelmente pelo menos 0,01 mM de um sal de cálcio, e, opcionalmente, um sal de potássio, preferivelmente pelo menos 3 mM de um sal de potássio. De acordo com uma concretização preferida, os sais de sódio, cálcio e, opcionalmente, sais de potássio podem ocorre na forma de seus halogenetos, por exemplo, cloretos, iodetos, ou brometos, na forma de seus hidróxidos, carbonatos, carbonatos de hidrogênio, ou sulfatos, etc. Sem estar limitado a estes, exemplos de sais de sódio incluem, por exemplo, NaCl, NaI, NaBr, Na2C03, NaHC03, Na2S04, exemplos dos sais de potássio opcionais incluem, por exemplo, KCl, KI, KBr, K2C03, KHC03, K2S04, e exemplos de sais de cálcio incluem, por exemplo, CaCh, Cah, CaBr2, CaC03, CaS04, Ca(OH)2. Além disso, ânions orgânicos dos cátions antes mencionados podem estar contidos no tampão. De acordo com uma concretização mais preferida, o tampão adequado para proposta de injeção conforme definido acima, pode conter sais selecionados de sódio cloreto (NaCl), cloreto de cálcio (CaCh) e, opcionalmente, cloreto de potássio (KCl), no qual ânions adicionais podem estar presentes nos cloretos. CaCh pode também ser substituído por outro sal similar a KCl. Tipicamente, os sais no tampão de injeção estão presentes em uma concentração de pelo menos 50 mM de cloreto de sódio (NaCl), pelo menos 3 mM de cloreto de potássio (KCl), e pelo menos 0,01 mM de cloreto de cálcio(CaCh). O tampão de injeção pode ser hipertônico, isotônico ou hipotônico com referência ao meio de referência específico, isto, é o tampão pode ter um teor de sal mais alto, idêntico ou mais baixo com referência ao meio de referência específico, no qual preferivelmente tais concentrações dos sais antes mencionados podem ser usadas, que não conduzem a dano de células devido a osmose ou outros efeitos de concentração. Os meios de referência são, por exemplo, líquidos que ocorrem em métodos ”in vivo'', tais como sangue, linfa, líquidos citosólicos, ou outros líquidos corpóreos, ou, por exemplo, líquidos que podem ser usados como meio de referência em métodos "in vitro'', tais como tampões ou líquidos comuns. Tais tampões comuns ou líquidos são conhecidos a um técnico no assunto. Solução de Ringer ou Ringer-Lactate é particularmente preferida como uma base líquida.

[000272] Contudo, uma ou mais cargas sólidas ou líquidas mais compatíveis ou compostos de encapsulamento podem ser usados também para a composição farmacêutica da invenção, que são adequadas para administração a um paciente a ser tratado. O termo "compatível", conforme usado aqui significa que estes constituintes da composição farmacêutica da invenção são capazes de serem misturados com uma sequência de RNA conforme aqui definido, preferivelmente o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, de tal maneira que nenhuma interação ocorre que reduziria substancialmente a eficiência farmacêutica da composição farmacêutica da invenção sob condições típicas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis, cargas e diluentes devem, naturalmente, terem pureza suficientemente alta e toxicidade suficientemente baixa para torná-los adequados para administração a uma pessoa a ser tratada. Alguns exemplos de compostos que podem ser usados como veículos farmaceuticamente aceitáveis, cargas ou constituintes destes são açúcares, tais como, por exemplo, lactose, glicose e sucrose; amidos, tais como, por exemplo, amido de milho ou amido de batata; celulose e seus derivados, tais como, por exemplo, sódio carboximetilcelulose, etilcelulose, acetato de celulose; tragacanth em pó; malte; gelatina; sebo; deslizantes sólidos, tais como, por exemplo, ácido esteárico, estearato de magnésio; sulfato de cálcio; óleos vegetais, tais como, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de teobroma; polióis, tais como, por exemplo, polipropileno glicol, glicerol, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ácido algínico.

[000273] A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada oralmente, parenteralmente, por spray de inalação, topicamente, retamente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente, ou via um reservatório implantado. O termo parenteral conforme aqui usado inclui subcutâneo, intravenoso, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepático, intralesional, intracranial, transdermal, intradermal, intrapulmonal, intraperitoneal, intracardial, intra-arterial, e injeção sublingual ou técnicas de infusão.

[000274] Preferivelmente, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por injeção parenteral, mais preferivelmente por subcutâneo, intravenoso, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepático, intralesional, intracranial, transdermal, intradermal, intrapulmonal, intraperitoneal, intracardial, intra-arterial, e injeção sublingual ou via técnicas de infusão. Formas injetáveis estéreis da composição farmacêutica da invenção podem ser suspensão aquosa ou oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na técnica usando-se agentes de dispersão ou de umedecimento adequados. A preparação injetável estéril pode também ser uma solução injetável estéril ou suspensão em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanediol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Em adição, óleos fixados estéreis, óleos fixados são convencionalmente empregados como um meio solvente ou de suspensão. Para esta proposta, qualquer óleo fixado brando pode ser empregado incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, tais como ácido oleico e seus derivados de glicerídeo são úteis na preparação de injetáveis, como são óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como óleo de oliva ou óleo de rícino, especialmente em suas versões polioxietilatadas. Estas soluções de óleo ou suspensões podem também conter um diluente de álcool de cadeia longa ou dispersante, tais como carboximetil celulose ou agentes dispersantes similares que são comumente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos comumente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes de emulsificação ou intensificadores de biodisponibilidade que são comumente usados na fabricação de formas de dosagem sólida, líquida farmaceuticamente aceitáveis, ou outras formas de dosagem, podem também ser usadas para a proposta de formulação da composição farmacêutica da invenção.

[000275] A composição farmacêutica da invenção conforme definido acima pode também ser administrada oralmente em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não limitada a, cápsulas, comprimidos, suspensões aquosas ou soluções. No caso de comprimidos para uso oral, veículos comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tal como estearato de magnésio são também tipicamente adicionados. Para administração oral em forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são requeridas para uso oral, o ingrediente ativo, isto é, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção e/ou o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção que forma parte da composição farmacêutica da invenção conforme definido acima, é combinado com agentes de emulsificação e suspensão. Se desejado, certos agentes de adoçamento, de aromatização ou de coloração podem também serem adicionados.

[000276] A composição farmacêutica da invenção pode também ser administrada topicamente, especialmente quando o alvo de tratamento inclui áreas ou órgãos prontamente acessíveis por aplicação tópica, por exemplo, incluindo doenças da pele ou de qualquer outro tecido epitelial acessível. Formulações tópicas adequadas são prontamente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos. Para aplicações tópicas, a composição farmacêutica da invenção pode ser formulada em um unguento adequado, contendo a composição imunoestimulatória da invenção, particularmente seus componentes conforme definido acima, suspensos ou dissolvidos em um ou mais veículos. Veículos para administração tópica incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, a composição farmacêutica da invenção pode ser formulada em uma loção adequada ou creme. No contexto da presente invenção, veículos adequados incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, sorbitan monoestearato, polissorbato 60, cera de cetil ésteres, cetearil álcool, 2-octildodecanol, benzil álcool e água.

[000277] A composição farmacêutica da invenção tipicamente compreende uma "quantidade segura e efetiva" dos componentes da composição farmacêutica da invenção, particularmente de o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e/ou do pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção. Conforme aqui usado, uma "quantidade segura e efetiva" significa uma quantidade do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e/ou do pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, que é suficiente para induzir significantemente uma modificação positiva de uma doença ou distúrbio conforme aqui definido. Ao mesmo tempo, contudo, uma "quantidade segura e efetiva" é pequena bastante para evitar sérios efeitos colaterais, isto é, permite um relacionamento sensível entre vantagem e risco. A determinação destes limites tipicamente ocorre dentro do escopo do julgamento médico sensível. Uma "quantidade segura e efetiva" dos componentes da composição farmacêutica da invenção, particularmente do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e/ou do pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, aqui variará, além disso, em conjunto com a condição particular a ser tratada e também com a idade e condição física do paciente a ser tratado, o peso corpóreo, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármaco, a atividade do (m)RNA específico ou mRNA conforme aqui definido empregado, a severidade da condição, a duração do tratamento, a natureza da terapia acompanhante do veículo farmaceuticamente aceitável usado particular, e fatores similares, dentro do conhecimento e experiência do médico acompanhante. A composição farmacêutica da invenção pode ser usada para ser humano e também para proposta médica veterinária, preferivelmente para proposta médica humana, como uma composição farmacêutica em geral ou como uma vacina.

[000278] De acordo com uma concretização específica, a composição farmacêutica da invenção pode ser provida como uma vacina. Tal vacina da invenção é tipicamente composta similar a composição farmacêutica da invenção e preferivelmente suporta pelo menos uma resposta imune inata do sistema humano de um paciente a ser tratado. Adicionalmente, a vacina da invenção, além disso, pode também induzir uma resposta imune adaptativa, preferivelmente, se o (pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e/ou preferivelmente o) pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção codifica qualquer dos antígenos acima mencionados (ou anticorpos), que induzem uma resposta imune adaptativa.

[000279] A vacina da invenção pode também compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, adjuvante, e/ou veículo conforme definido acima para a composição farmacêutica da invenção. No contexto específico da vacina da invenção, a escolha de um veículo farmaceuticamente aceitável é determinada em princípio pela maneira na qual a vacina da invenção é administrada. A vacina da invenção pode ser administrada, por exemplo, sistemicamente ou localmente. As rotas para administração sistêmica em geral incluem, por exemplo, rotas transdermal, oral, parenteral, incluindo rotas de injeções subcutâneas, intravenosas, intramuscular, intra-arterial, intradermal e intraperitoneal e/ou rotas de administração intranasal. Rotas para administração local em geral incluem, por exemplo, rotas de administração tópica, mas também injeções intradermal, transdermal, subcutânea, ou injeções intramuscular ou intralesional, intracranial, intrapulmonal, intracardial, e injeções sublingual. Mais preferivelmente, vacinas podem ser administradas por uma rota intradermal, subcutânea ou intramuscular. As vacinas da invenção são, portanto, preferivelmente formuladas na forma líquida (ou as vezes na forma sólida). A quantidade adequada da vacina da invenção a ser administrada pode ser determinada por experimentos de rotina com modelos de animal. Tais modelos incluem, sem implicar em qualquer limitação, coelho, ovelha, camundongo, rato, cão e modelos de primata não humano. Formas de dose unitária preferidas para injeção incluem soluções estéreis de água, salina fisiológica ou misturasdos mesmos. O pH de tais soluções deve ser ajustado a cerca de 7,4. Veículos adequados para injeção incluem hidrogéis, dispositivos para liberação controlada ou retardada, ácido poliláctico e matrizes de colágeno. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados para aplicação tópica incluem aqueles que são adequados para uso em loções, cremes, géis e similares. Se a vacina da invenção é para ser administrada oralmente, comprimidos, cápsulas e similares são a forma de dose unitária preferida. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de formas de dose unitárias que podem ser usadas para administração oral são bem conhecidas na técnica anterior. A escolha desta dependerá das considerações secundárias tais como sabor, custos e armazenabilidade, que não são críticas para a proposta da presente invenção, e podem ser feitas sem dificuldade por um técnico no assunto.

[000280] A vacina da invenção pode adicionalmente conter uma ou mais substâncias auxiliares de modo a aumentar adicionalmente sua imunogenicidade. Uma ação sinergística do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e/ou do pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, conforme definido acima, e de uma substância auxiliar, que pode ser opcionalmente contudo na vacina da invenção conforme descrito acima, é preferivelmente alcançada, desse modo. Dependendo dos vários tipos de substâncias auxiliares, vários mecanismos podem levar em consideração neste particular. Por exemplo, compostos que permitem a maturação de células dendríticas (DCs), por exemplo, lipopolissacarídeos, TNF-alfa ou ligante CD40, formam uma primeira classe de substâncias auxiliares adequadas. Em geral, é possível usar como substância auxiliar qualquer agente que influencia o sistema humano na maneira de um "sinal de perigo" (LPS, GP96, etc.) ou citoquinas, tal como GM-CFS, que permite que uma resposta imune produzida por adjuvante de estimulação imune de acordo com a invenção seja intensificada e/ou influenciada em uma maneira alvo. Substâncias auxiliares particularmente preferidas são citoquinas, tais como monoquinas, linfoquinas, interleucinas ou chemoquinas, que promovem adicionalmente a resposta imune inata, tal como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL- 13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-1 7, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL- 24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, INF-alfa, IFN-beta, INF-gama, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta ou TNF-alfa, fatores de crescimento, tal como hGH.

[000281] Aditivos adicionais que podem ser incluídos na vacina da invenção são emulsificantes, tais como, por exemplo, Tween®; agentes de umedecimento, tais como, por exemplo, sódio lauril sulfato; agentes de coloração; agentes de concedimento de sabor, veículos farmacêuticos; agentes de formação de comprimido; estabilizadores; antioxidantes; conservantes.

[000282] A vacina da invenção pode também adicionalmente conter qualquer composto adicional, que é conhecido para ser de estimulação imune devido a sua afinidade de ligação (como ligantes) a receptores similares à Toll humanos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, ou devido a sua afinidade de ligação (como ligantes) a receptores similares à Toll de murina TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 ou TLR13.

[000283] Outra classe de compostos, que podem ser adicionados a uma vacina da invenção neste contexto, pode ser ácidos nucleicos de CpG, em particular CpG-RNA ou CpG-DNA. Um CpG-RNA ou CpG- DNA pode ser CpG-DNA de fita simples (ss CpG-DNA), um CpG-DNA (dsDNA) de fita duplo, um CpG-RNA (ss CpG-RNA) de fita simples ou um CpG-RNA (ds CpG-RNA) de fita duplo. O ácido nucleico de CpG é preferivelmente na forma de CpG-RNA, mais preferivelmente na forma de CpG-RNA (ss CpG-RNA) de fita simples. O ácido nucleico de CpG preferivelmente contém pelo menos uma ou mais sequência(s) de dinucleotídeo (mitogênicas) de citosina/guanina (motivo(s) de CpG). De acordo com uma primeira alternativa preferida, pelo menos um motivo de CpG contido nestas sequências, isto é, a C (citosina) e a G (guanina) do motivo de CpG, é não metilatado. Todas as citosinas adicionais ou guaninas opcionalmente contidas nestas sequências podem ser ou metilatadas ou não metilatadas. De acordo com uma alternativa adicionalmente preferida, contudo, a C (citosina) e a G (guanina) do motivo de CpG pode também estar presente na forma metilatada.

[000284] De acordo com um objetivo preferido da presente invenção, a composição imunoestimulatória da invenção, preferivelmente os componentes da composição imunoestimulatória da invenção, isto é, o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, junto com o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica ou uma vacina, preferivelmente todos conforme aqui definido, para a profilaxia, tratamento e/ou melhora de qualquer das doenças e distúrbios conforme aqui definidos.

[000285] Consequentemente, a composição imunoestimulatória da invenção, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção, ou o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, junto com o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser usados para (a preparação de um medicamento para) a profilaxia, tratamento e/ou melhora de, por exemplo, câncer ou doenças de tumor, preferivelmente selecionadas de melanomas, melanomas malignos, carcinomas de cólon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas renais, tumores gastrointestinais, gliomas, tumores de próstata, câncer de bexiga, tumores retais, câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de fígado, carcinomas mamários (= câncer de seio), câncer uterino, câncer cervical, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), hepatomas, vários tumores induzidos por vírus tais como, por exemplo, carcinomas induzidos por vírus de papiloma (por exemplo, carcinoma cervical = câncer cervical), adenocarcinomas, tumores induzidos por vírus da herpes (por exemplo, linfoma de Burkitt, linfoma de célula B induzido por EBV), tumores induzidos por hepatite B (carcinomas de hepatocélula), linfomas induzidos por HTLV-1- e HTLV-2, neuroma acústico, carcinomas de pulmão (= câncer de pulmão = carcinoma bronquial), carcinomas de pulmão de célula pequena, câncer faringeal, carcinoma anal, glioblastoma, carcinoma retal, astrocitoma, tumores de cérebro, retinoblastoma, basalioma, metástase de cérebro, meduloblastomas, câncer vaginal, câncer pancreático, câncer testicular, síndrome de Hodgkin, meningiomas, doença de Schneeberger, tumor de hipófise, Micose fungoides, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, câncer laringeal, câncer renal, timoma, corpus carcinoma, câncer de osso, linfomas de não Hodgkin, câncer uretral, síndrome de CUP, tumores de cabeça/pescoço, oligodendroglioma, câncer vulval, câncer intestinal, carcinoma de cólon, carcinoma esofageal (= câncer de esôfago), envolvimento de verruga, tumores do intestino delgado, craniofaringeomas, carcinoma ovariano, tumores genitais, câncer ovariano (= carcinoma ovariano), carcinoma pancreático (= câncer pancreático), carcinoma endometrial, metástase de fígado, câncer peniano, câncer de língua, câncer de bexiga, leucemia, plasmocitoma, câncer de próstata (= tumores próstata), etc.

[000286] Além disso, a composição imunoestimulatória da invenção, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção, ou o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, juntos com o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser usados para (a preparação de um medicamento para) a profilaxia, tratamento, e/ou melhora de, por exemplo, doenças infecciosas, preferivelmente doenças infecciosas (viral, bacterial ou protozoológica). Tais doenças infecciosas, preferivelmente para doenças infecciosas (viral, bacterial ou protozoológica), são tipicamente selecionadas de influenza, malária, SARS, febre amarela, AIDS, Lyme borreliose, Leishmaníase, anthrax, meningite, doenças infecciosas virais tais como AIDS, Condiloma acuminata, verrugas vazadas, febre de Dengue, febre de três dias, vírus Ebola, meningoencefalite de verão e de frio (FSME), gripe, herpes zóster, hepatite, herpes simplex tipo I, herpes simplex tipo II, Herpes zóster, influenza, encefalite japonesa, febre Lassa, vírus Marburg, sarampo, doença de pé e boca, mononucleose, cachumba, infecção de vírus Norwalk, febre glandular de Ffeiffer, varíola, pólio (coxiadura da infância), pseudo-crupe, doença do quinto, raiva, verrugas, febre de West Nile, catapora, vírus citomegálico (CMV), doenças de infecções bacteriais tais como aborto (inflamação da próstata), anthrax, apendicite, borreliose, botulismo, Camfilobacter, Chlamidia trachomatis (inflamação da uretra, conjuntivite), cólera, difteria, donavanose, epiglotite, febre de tifo, gangrena de gás, gonorreia, febre de coelho, Heliobacter pylori, coqueluche, adenite climática, osteomuelite, doença de Legionnaire, leprose, listeriose, pneumonia, meningite, meningite bacterial, anthrax, otites média, homine Mycoplasma, sepsisa neonatal (Corioamnionite), noma, paratifo, praga, síndrome de Reiter, febre manchada de Rocky Mountain, paratifo de Salmonella, tifo de Salmonella, escarlatina, sífilis, tétano, doença de tsutsugamushi, tuberculose, tufo, vaginite (colpite), cancro macio, e doenças infecciosas causadas por parasitas, protozoários ou fungos, tais como amebíase, bilharziose, doença de Chagas, Echinococcus, solitária de peixe, envenenamento de peixe (Ciguatera), solitária de raposa, pé de atleta, solitária canina, candidose, manchas de fungos de levedura, sarna, Leishmaniose cutânea, lambliase (giardiasis), piolhos, malária, microscopia, oncocercose (cegueira de rio), doenças fúngicas, solitária bovina, esquistosomíase, solitária suína, toxoplasmose, tricomoníase, tripanosomíase (doença do sono), Leishmaniose visceral, dermatite de babador/toalha ou solitária miniatura.

[000287] Do mesmo modo, a composição imunoestimulatória da invenção, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção, ou o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, juntos com o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser usados para (a preparação de um medicamento para) a profilaxia, tratamento, e/ou melhora de, por exemplo, doenças autoimunes. Doenças autoimunes podem ser amplamente divididas em sistêmicas e específicas de órgão ou distúrbios autoimunes localizados, dependendo das características clínico-patológicas principais de cada doença. Doenças autoimunes podem ser divididas nas categorias de síndromes sistêmicas, incluindo eritematose de lúpus sistêmica (SLE), síndrome de Sjogren, escleroderma, Artrite Reumatoide e polimiosite ou síndromes locais que podem ser endocrinológicas (diabetes Tipo I (Diabetes mellitus Tipo 1), tiroidite de Hashimoto, doença de Addison, etc.), dermatológica (pênfigo vulgaris), hematológica (anemia hemolítica autoimune), neural (esclerose múltipla) ou podem envolvide virtualmente qualquer massa circunscrita de tecido corpóreo. As doenças autoimunes a serem tratadas podem ser selecionadas do grupo consistindo em doenças autoimunes tipo I ou doençasautoimunes tipo II ou doenças autoimunes tipo III ou doençasautoimunes tipo IV, tais como, por exemplo, esclerose múltipla (MS), artrite reumatoide, diabetes, diabetes tipo I (Diabetes mellitus Tipo 1), poliartrite crônica, doença de Basedow, formas autoimunes de hepatite crônica, colite ulcerosa, doenças de alergia tipo I, doenças de alergia tipo II, doenças de alergia tipo III, doenças de alergia tipo IV, fibromialgia, perda de cabelo, doença de Bechterew, doença de Crohn, Miastenia gravis, neurodermite, Polimialgia reumática, esclerose sistêmica progressiva (PSS), síndrome de Reiter, artrite reumática, psoríase, vasculite, etc, ou diabetes tipo II. Enquanto o modo exato de porque o sistema humano induz uma reação imune contra autoantígenos não foi elucidado, existem várias descobertas com relação a etiologia. Consequentemente, a auto-reação pode ser devido a uma derivação de célula T. Um sistema humano normal requer a ativação de células B por células T antes das primeiras poderem produzir anticorpos em grandes quantidades. Este requerimento de uma célula T pode ser contornado em exemplos raros, tal como infecção por organismos que produzem superantígenos, que são capazes de iniciarem ativação policlonal de células B, ou ainda de células T, por ligação diretamente à subunidade S dos receptores de célula T em um modo nãoespecífico. Outra explanação deduz doenças autoimunes de uma Imitação Molecular. Um antígeno exógeno pode compartilhar similaridades estruturais com certos antígenos de hospedeiro; desse modo, qualquer anticorpo produzido contra este antígeno (que imita os autoantígenos) pode também, na teoria, se ligar aos antígenos de hospedeiro e amplificar a resposta imune. A forma mais colidente de imitação molecular é observada no Grupo A beta-hemolítico streptococci, que compartilha antígenos com miocárdio humano, e é responsável pelas manifestações cardíacas de febre reumática.

[000288] Adicionalmente, a composição imunoestimulatória da invenção, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção, ou o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, juntos com o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser usados para (a preparação de um medicamento para) a profilaxia, tratamento, e/ou melhora de alergias ou doenças alérgicas, isto é, doenças relacionadas a alergias. Alergia é uma condição que tipicamente envolve uma hipersensibilidade anormal, imunológica adquirida a certos antígenos estranhos ou alérgenos, tais como antígenos de energia conforme definido acima. Tais antígenos de alergia ou alérgenos podem ser selecionados de antígenos de alergia conforme definido acima, antígenos derivados de fontes diferentes, por exemplo, de animais, plantas, fungos, bactéria, etc. Alérgenos neste contexto incluem, por exemplo, gramas, pólens, moldes, fármacos ou numerosos disparadores ambientais, etc. Alérgenos normalmente resultam em uma resposta local ou inflamatória sistêmica a estes antígenos ou alérgenos e conduzem a uma imunidade no corpo contra estes alérgenos. Sem estar ligado a teoria, vários mecanismos de doença diferentes são supostos serem envolvidos no desenvolvimento de alergias. De acordo com um esquema de classificação por P. Gell e R. Coombs a palavra alergia" foi restrita a hipersensibilidades tipo I, que são causadas pelo mecanismo clássico de IgE. A hipersensibilidade Tipo I é caracterizada por ativação excessiva de células troncos e basófilos por IgE, resultando em uma resposta de inflamação sistêmica que pode resultar em sintomas como benignos como um ruído, para choque anafilático de ameaça de vida e morte. Tipos bem conhecidos de alergias incluem, sem estar limitado a estes, asma alérgica (conduzindo a inchação da mucosa nasal), conjuntivite alérgica (conduzindo a vermelhidão e prurido da conjuntiva), rinite alérgica ("febre de feno"), anafilaxia, angiodema, dermatite atópica (eczema), urticária (erupções), eosinofilia, alergias respiratórias, alergias a ferrões de inseto, alergias de pele (conduzindo a e incluindo várias brotoejas, tais como eczema, erupções (urticária) e (contato) dermatite), alergias a alimento, alergias a remédio, etc. Com relação a presente invenção, a composição imunoestimulatória da invenção, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção, ou o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, juntos com o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, podem ser usados para o tratamento de tais distúrbios alérgicos ou doenças, preferivelmente por desensibilização da reação imune que dispara uma resposta imune específica. Tal desensibilização pode ser efetuada por administração de uma quantidade efetiva do alérgeno ou antígeno alérgicos codificados por um RNA da composição imunoestimulatória da invenção, preferivelmente o pelo menos um mRNA livre, para induzir uma leve reação imune. A quantidade do alérgeno ou antígeno alérgico pode então ser elevada etapa por etapa em administrações subsequentes até que o sistema humano do paciente seja tratado tolere uma quantidade específica de alérgeno ou antígeno alérgico.

[000289] No contexto do acima, a invenção, além disso, se refere também ao uso da composição imunoestimulatória da invenção, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção, ou o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, juntos com o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção, para a profilaxia, tratamento, e/ou melhora de doenças ou distúrbios conforme aqui mencionado. Ela também inclui, em particular, o uso da composição imunoestimulatória da invenção, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção, ou o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante da composição imunoestimulatória da invenção complexado com um composto catiônico ou policatiônico, juntos com o pelo menos um mRNA livre da composição imunoestimulatória da invenção para inoculação ou o uso destes componentes como um inoculante. De acordo com uma concretização particularmente preferida da presente invenção, tal método para profilaxia, tratamento, e/ou melhora das doenças ou distúrbios acima mencionados, ou um método de inoculação para prevenção das doenças acima mencionadas, tipicamente compreende administração da composição farmacêutica descrita a um paciente em necessidade do mesmo(por exemplo, que sofre de qualquer das doenças acima ou mostrando sintomas destas), em particular a um ser humano, preferivelmente em uma "quantidade segura e efetiva" e em uma das formulações acima conforme descrito acima para composições farmacêuticas da invenção. O modo de administração também pode ser conforme descrito acima para composições farmacêuticas da invenção ou vacinas.

[000290] A presente invenção se refere também a um método de transcrição in vitro para a preparação de o pelo menos um (m)RNA, a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou o pelo menos um mRNA livre, respectivamente, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, ambos conforme definido acima, compreendendo as seguintes etapas:a) preparação/provisão de um ácido (desóxi)ribonucleico como um gabarito para o pelo menos um (m)RNA da invenção, a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou o pelo menos um mRNA livre, respectivamente, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, ambos conforme descritos acima;b) adição do ácido (desóxi)ribonucleico a um meio de transcrição in vitro compreendendo um RNA polimerase, um tampão adequado, uma mistura de nucleotídeo, a mistura de nucleotídeo opcionalmente compreendendo um ou mais nucleotídeos com nucleosídeos quimicamente modificados selecionados dos nucleosídeos quimicamente modificados conforme definido acima como substituição (parcialmente ou completamente) para um ou mais dos nucleosídeos que ocorrem naturalmente A, G, U e/ou C, e opcionalmente um ou mais nucleosídeos que ocorrem naturalmente A, G, U e/ou C se não todos dos nucleosídeos que ocorrem naturalmente A, G, U e/ou C são para serem substituídos, e opcionalmente um inibidor de RNase;c) incubação do ácido (desóxi)ribonucleico no meio de transcrição in vitro e transcrição in vitro do ácido (desóxi)ribonucleico; ed) opcionalmente purificação e remoção dos nucleotídeos não incorporados do meio de transcrição in vitro.

[000291] Um ácido (desóxi)ribonucleico conforme descrito na etapa a) do método de transcrição in vitro da invenção pode ser qualquer ácido nucleico conforme descrito acima que pode ser usado como um gabarito para a preparação de o pelo menos um (m)RNA a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e/ou o pelo menos um mRNA livre, respectivamente, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo. Para esta proposta tipicamente sequências de DNA são usadas, por exemplo, DNA genômico ou fragmentos destes, ou plasmídeos, ou sequências de RNA (correspondentes a estes), por exemplo, sequências de mPNA, preferivelmente na forma linearizada. A reação de transcrição in vitro pode usualmente ser efetuada usando-se um vetor tendo um local de ligação de RNA polimerase. Para esta finalidade pode ser usado quaisquer vetores conhecidos na técnica, por exemplo, vetores comercialmente disponíveis (vide acima). Preferência é dada, por exemplo, àqueles vetores que têm um local de ligação de SP6 ou um T7 ou T3 à montante e/ou à jusante do local de clonagem. Consequentemente, a sequência de ácidos (desóxi)ribonucleicos usada pode ser transcrita mais tarde, conforme desejado, dependendo do RNA polimerase escolhido. Uma sequência de ácido (desoóxi)ribonucleico usada para transcrição in vitro e codificação para uma proteína conforme definido acima, por exemplo, uma proteína terapeuticamente ativa, um antígeno ou um anticorpo, é tipicamente clonada em um vetor, por exemplo, via um local de clonagem múltiplo do vetor usado. Antes da transcrição, o plasmídeo é tipicamente clivado com enzimas de restrição no local em que a extremidade futura 3' de o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante conforme definido acima ou o pelo menos um mRNA livre conforme definido acima é para ser localizado, usando-se uma enzima de restrição adequada, e o fragmento é purificado. Isto previne o futuro pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante conforme definido acima ou o pelo menos um mRNA livre conforme definido acima, de sequências contendo vetor, e um comprimento definido pode ser obtido.

[000292] Alternativamente, é também possível preparar o ácido (desóxi)ribonucleico como gabarito de transcrição por reação de cadeia de polimerase (PCR). Para esta finalidade, um dos iniciadores usados para PCR tipicamente contêm a sequência de um local de ligação de RNA polimerase. É adicionalmente preferido para a extremidade 5' do iniciador ter um comprimento de aproximadamente 10 a 50 nucleotídeos adicionais, mais preferivelmente 15 a 30 nucleotídeos adicionais, e, mais preferivelmente, de aproximadamente 20 nucleotídeos.

[000293] Antes da reação de transcrição in vitro, o ácido (desoóxi)ribonucleico, por exemplo, o DNA específico ou gabarito de RNA é tipicamente purificado e livre de RNase de modo a assegurar um alto rendimento. Purificação pode ser efetuada por qualquer processo conhecido na técnica, por exemplo, com um gradiente de cloreto de césio ou processo de troca de íon.

[000294] De acordo com a etapa b) do método de transcrição in vitro, o ácido (desóxi)ribonucleico é adicionado a um meio de transcrição in vitro. Um meio de transcrição in vitro adequado primeiro contém um ácido (desóxi)ribonucleico conforme preparado sob a etapa a), por exemplo, aproximadamente de cerca de 0,1 a cerca de 10 μg, preferivelmente aproximadamente de cerca de 1 a cerca de 5 μg, mais preferivelmente cerca de 2,5 μg, e, mais preferivelmente, aproximadamente cerca de 1 μg, de tal ácido nucleico. Um meio de transcrição in vitro adequado adicionalmente opcionalmente contém um agente de redução, por exemplo, DTT, mais preferivelmente aproximadamente de cerca de 1 a cerca de 20 μl de cerca de 50 mM de DTT, ainda mais preferivelmente aproximadamente cerca de 5 μl de cerca de 50 mM de DTT. O meio de transcrição in vitro contém adicionalmente nucleotídeos (AMP, GMP, UMP e/ou CMP), por exemplo, uma mistura de nucleotídeo. No caso da presente invenção os nucleotídeos preferivelmente compreendem nucleosídeos quimicamente modificados conforme definido acima. Tais (quimicamente modificados) nucleotídeos podem servir como substituição para um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente AMP, GMP, UMP e/ou CMP, e, opcionalmente, um ou mais nucleotídeos que ocorrem naturalmente AMP, GMP, UMP e/ou CMP, se não todos dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente AMP, GMP, UMP e/ou CMP são par serem substituídos. Os nucleotídeos AMP, GMP, UMP e/ou CMP estão tipicamente presentes na mistura de nucleotídeo em uma concentração de tipicamente aproximadamente de 0,1 a 10 mM por nucleotídeo, preferivelmente de 0,1 a 1 mM por nucleotídeo, preferivelmente aproximadamente 4 mM no total. Nucleotídeos modificados (quimicamente) conforme descrito acima (aproximadamente 1 mM por nucleotídeo, preferivelmente aproximadamente 4 mM no total), são tipicamente adicionados em tal quantidade que o nucleotídeo nativo é substituído completamente pelo(s) (modificado(s)) nucleotídeo(s) compreendendo um nucleosídeo quimicamente modificado conforme definido acima. É, contudo, também possível usar misturas de um ou mais nucleotídeos modificados conforme definido acima e um ou mais nucleotídeos que ocorrem naturalmente ao invés de um nucleotídeo particular, isto é, um ou mais nucleotídeos quimicamente modificados conforme descrito acima podem ocorrer como uma substituição para um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente AMP, GMP, UMP e/ou CMP, e, opcionalmente, adicionalmente um ou mais nucleotídeos que ocorrem naturalmente AMP, GMP, UMP e/ou CMP pode estar contidos, se não todos os nucleotídeos que ocorrem naturalmente AMP, GMP, UMP e/ou CMP são para serem substituídos. Por adição seletiva da base desejada para o meio de transcrição in vitro, o teor, isto é, a ocorrência e quantidade da modificação de nucleotídeo desejada no pelo menos um (m)RNA transcrito da invenção a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou o pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, pode, portanto, ser controlada. Um meio de transcrição in vitro do mesmo modo contém um RNA polimerase, por exemplo, T7-RNA polimerase (por exemplo, Kit T7-Opti mRNA, CureVac, Tubingen, Germany), T3-RNA polimerase ou SP6, tipicamente aproximadamente de 10 a 500 U, preferivelmente aproximadamente de 25 a 250 U, mais preferivelmente aproximadamente de 50 a 150 U, e, mais preferivelmente, aproximadamente 100 U de RNA polimerase. O meio de transcrição in vitro é adicionalmente preferivelmente mantido livre de RNase de modo a evitar degradação do (m)RNA transcrito. Um meio de transcrição in vitro adequado, portanto, opcionalmente contém em adição um inibidor de RNase.

[000295] Em uma etapa c) do método de transcrição in vitro da invenção, o ácido (desóxi)ribonucleico da etapa b) é incubado e transcrito no meio de transcrição in vitro, tipicamente por aproximadamente 30 a 120 minutos, preferivelmente por aproximadamente 40 a 90 minutos e, mais preferivelmente, por aproximadamente 60 minutos, a aproximadamente 30 a 45°C, preferivelmente a 37 a 42°C. A temperatura de incubação é governada pelo RNA polimerase que é usado, por exemplo, no caso de T7 RNA polimerase ser aproximadamente 37°C. O ácido nucleico obtido pela transcrição é preferivelmente o pelo menos um (m)RNA a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou o pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, ambos conforme aqui definido.

[000296] Subsequente a incubação de acordo com a etapa c) do método acima, purificação da reação pode opcionalmente ocorrer na etapa d) do método de transcrição in vitro de acordo com a invenção. Para esta finalidade, qualquer processo adequado conhecido na técnica pode ser usado, por exemplo, processos de purificação cromatográficos, por exemplo, cromatografia de afinidade, filtração de gel, etc. Por meio da purificação não incorporada, isto é, excesso, nucleotídeos pode ser removidos do meio de transcrição in vitro. Qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, métodos de purificação cromatográficos, por exemplo, cromatografia de afinidade, filtração de gel, etc., pode ser usado para isto. Por tal purificação, um RNA transcrito limpo de uma sequência de RNA conforme aqui definido, por exemplo, de um pelo menos um (m)RNA, a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou do pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, podem ser obtidos. Por exemplo, após a transcrição da mistura de reação contendo o RNA transcrito pode tipicamente ser digerido com DNase de modo a remover o gabarito de DNA ainda contido na mistura de reação. O RNA transcrito pode ser subsequentemente ou alternativamente precipitado com LiCl. Purificação do RNA transcrito pode ocorrer via HPLC de fase reversa de par de íon (IP RP). Isto torna possível em particular separar fragmentos mais longos e mais curtos de um outro efetivamente. Preferivelmente, neste contexto a purificação ocorre via um método para purificação do RNA em uma escala preparativa, que é distinguida em que o RNA conforme aqui definido, particularmente o pelo menos um (m)RNA a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou o pelo menos um mRNA livre, que codificam pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, é purificado por meio de HPLC usando-se uma fase revidesa porosa como a fase estacionária (PURE Messenger). Por exemplo, para a purificação na etapa d) do método de transcrição in vitro da invenção, uma fase reversa pode ser empregada como a fase estacionária para a purificação de HPLC. Para a cromatografia com fases reversas, um composto não polar tipicamente serve como fase estacionária, e um solvente polar, tal como misturas de água, que é usualmente empregada na forma de tampões, com acetonitrila e/ou metanol, serve como a fase móvel para a eluição. Preferivelmente, a fase reversa porosa tem um tamanho de partícula de 8,0 ± 2 μm, preferivelmente ±1 μm, mais preferivelmente +/- 0,5 μm. O material de fase reversa pode ser na forma de contas. A purificação pode ser efetuada em uma maneira particularmente favorável com uma fase reversa porosa tendo este tamanho de partícula, opcionalmente na forma de contas, particularmente bons resultados de separação sendo obtidos. A fase reversa empregada é preferivelmente porosa, visto que com fases reversas estacionárias que não são porosas, tais como são descritas, por exemplo, por Azarani A. e Hecker K.H., pressões que são muito altas são construídas, de modo que purificação preparativa do RNA conforme aqui definido, particularmente o pelo menos um (m)RNA a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou o pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, é possível, se no todo, somente com grande dificuldade. A fase reversa preferivelmente tem um tamanho de poro de 200 Â a 5.000 Â, em particular um tamanho de poro de 300 Â a 4.000 Â. Tamanhos de poro particularmente preferidos para as fases reversas são 200 Â - 400 Â, 800 Â - 1.200 Â e 3.500 Â- 4.500 Â. Com uma fase reversa tendo estes tamanhos de poro, resultados particularmente bons são alcançados em relação à purificação do RNA conforme aqui definido na etapa d) do processo . O material para a fase reversa é preferivelmente um poliestireno-divinilbenzeno, e poliestireno- divinilbenzenos não alquilatados pode ser empregado em particular. Fases estacionárias com poliestireno-divinilbenzeno são conhecidas per se. Para a purificação na etapa d) do método, os poliestirene- divinilbenzenos que são conhecidos per se e já empregados para métodos de HPLC e são comercialmente obtidos podem ser usados. Um poliestireno-divinilbenzeno poroso não alquilatado que em particular tem um tamanho de partícula de 8,0 ± 0,5 μm e um tamanho de poro de 250 A - 300 A, 900 A - 1.100 A ou 3.500 A - 4.500 A é muito particularmente preferivelmente usado para a purificação na etapa d) do método. As vantagens descritas acima podem ser alcançadas em uma maneira particularmente favorável com este material para as fases reversas. A purificação de HPLC pode ser efetuada pelo método de par de íon, um íon tendo uma carga positiva sendo adicionada à fase móvel como um íon contador ao RNA negativamente carregado. Um par de íon tendo um caráter lipofílico que é diminuído pela fase estacionária não polar do sistema de fase reversa, é formado dessa maneira. Nas práticas, as condições precisas para o método de par de íon devem ser operadas empiricamente para cada problema de separação concreta. O tamanho do íon contador, sua concentração e o pH da solução contribui grandemente para o resultado da separação. Em uma maneira favorável, sais de alquilamônia, tais como trietilamônia acetato e/ou compostos de tetraalquilamônia, tal como tetrabutilamônia, são adicionados à fase móvel. Preferivelmente, 0,1 M de trietilamônia acetato é adicionado e o pH é ajustado a cerca de 7. A escolha de fase móvel depende da natureza da separação desejada. Isto significa que a fase móvel encontrada para uma separação específica, tal como pode ser conhecida, por exemplo, da técnica anterior, não pode ser transferida prontamente para outro problema de separação com prospecto adequado de sucesso. As condições de eluição ideais, em particular a fase móvel usada, devem ser determinadas para cada problema de separação por experimentos empíricos. A mistura de um solvente aquoso e um solvente orgânico pode ser empregada como a fase móvel para eluição do RNA conforme aqui definido, particularmente o pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou o pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, pelo método de HPLC. Neste contexto, é favorável se um tampão que tem, em particular, um pH de cerca de 7, por exemplo 6,5 - 7,5, por exemplo, 7,0, é usado como o solvente aquoso; preferivelmente, o tampão trietilamônia acetato é usado, particularmente preferivelmente um tampão de trietilamônia acetato 0,1 M que, conforme descrito acima, também age como um íon contador a RNA conforme aqui definido no método de par de íon. O solvente orgânico empregado na fase móvel pode ser acetonitrila, metanol ou uma mistura destes dois, muito particularmente preferivelmente acetonitrila. A purificação do RNA conforme aqui definido na etapa d) do método usando um método de HPLC conforme descrito, particularmente purificação de o pelo menos um (m)RNA, a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou de o pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, é efetuado em uma maneira particularmente favorável com estes solventes orgânicos. A fase móvel é particularmente preferivelmente uma mistura de trietilamônia acetato 0,1 M, pH 7, e acetonitrila. Ela tem emergido para ser, do mesmo modo, particularmente favorável se a fase móvel contém 5,0 vol.% a 20,0 vol.% de solvente orgânico, baseado na fase móvel, e o restante para compor 100 vol.% é o solvente aquoso. É muito particularmente favorável para o método de acordo com a invenção se a fase móvel contém 9,5 vol.% a 14,5 vol.% de solvente orgânico, baseado na fase móvel, e o restante para compor 100 vol.% é o solvente aquoso. Eluição do RNA conforme aqui definido, particularmente o pelo menos um (m)RNA a ser complexado com um composto catiônico ou policatiônico, ou o pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, pode subsequentemente ser efetuadoisocraticamente ou por meio de uma separação de gradiente. No caso de uma separação isocrática, eluição do RNA conforme aqui definido é efetuada com um agente de eluição simples ou uma mistura de vários agentes de eluição que permanece constante, está sendo possível para os solventes descritos acima em detalhe a serem empregados como o agente de eluição.

[000297] O presente pedido de patente também proporciona um método de transfecção e opcionalmente administração da composição imunoestimulatória da invenção ou seus componentes conforme definido acima, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção, conforme definido acima, compreendendo as seguintes etapas:(a) coleta de células de sangue, células apresentando antígeno profissional (APCs), especialmente células dendríticas (DCs), e(b) transfecção das células de sangue, células apresentando antígeno profissional (APCs), especialmente células dendríticas (DCs), in vitro com a composição imunoestimulatória da invenção ou seus componentes, a composição farmacêutica da invenção ou a vacina da invenção.

[000298] No contexto da presente invenção, "células de sangue" são preferivelmente compreendidas de acordo com a invenção como significando uma mistura ou uma população enriquecida a substancialmente pura de células de sangue vermelhas, granulócitos, células mononucleares (PBMCs) e/ou plaquetas de sangue de sangue total, soro de sangue ou outra fonte, por exemplo, da baço ou nodos de linfa, somente uma pequena proporção de APCs profissional estando presentes. Preferivelmente, células de sangue na presente invenção são tipicamente caracterizadas em que elas contêm uma pequena proporção de células apresentando antígeno profissional bem diferenciado (APCs), especialmente células dendríticas (DCs). As células de sangue conforme usadas de acordo com a presente invenção podem ser preferivelmente células de sangue frescas, isto é, o período entre coleta das células de sangue (especialmente retirada de sangue) e transfecção sendo somente curta, por exemplo, menos do que 12 horas, preferivelmente menos do que 6 horas, particularmente preferivelmente menos do que 2 horas e, muito particularmente, preferivelmente menos do que 1 hora. Contudo, as células de sangue conforme usadas de acordo com a presente invenção podem também ser células de sangue obtidas sob retirada de sangue antes da necessidade, por exemplo, uma operação ou um tratamento conforme aqui definido, e que são armazenadas subsequentemente até uso.

[000299] As células de sangue podem ser coletadas de um animal ou paciente humano por métodos padrões, por exemplo. Desse modo, sangue total pode facilmente ser obtido por punção de um vaso adequado. O soro é obtido maneira conhecida por coagulação dos constituintes de sangue sólidos. PBMCs podem ser mencionados como um exemplo de uma população enriquecida parcial de células de sangue. Estas são convencionalmente isoladas por um método primeiro descrito por Boyum (Nature 204, 793-794, 1964; Scan. J. Lab. Clin. Invest. Suppl. 97, 1967). Isto é geralmente feito por retirada de sangue do indivíduo e adição do mesmo, por exemplo, a uma solução de densidade 1,077 g/ml (25°C), convencionalmente contendo Ficoll e sódio diatrizoato, para a centrifugação de gradiente de densidade. Durante centrifugação cuidadosa à temperatura ambiente, as PBMCs coletam no Ficoll/interface de sangue, pelo que as células de sangue vermelhas e as células de sangue brandas restantes sãosedimentadas. A interface com as PBMCs é recuperada econvencionalmente lavada com um tampão adequado, por exemplo, PBS estéril. As PBMCs são preferivelmente submetidas a um tratamento isotônico curto com uma solução aquosa de, por exemplo, cloreto de amônia. Finalmente, as PBMCs são lavadas adicionalmente uma ou mais vezes com um tampão tal como PBS (estéril). As células obtidas podem então opcionalmente serem armazenadas sob condições adequadas, convencionalmente a -70°C, até uso adicional.

[000300] De acordo com uma concretização preferida, as células de sangue imediatamente antes da transfecção são células de sangue frescas, isto é, existe somente um período curto entre a coleta de células de sangue (especialmente retirada de sangue) na etapa (a) e a transfecção de acordo com a etapa (b), por exemplo, menos do que 12 horas, preferivelmente menos do que 6 horas, particularmentepreferivelmente menos do que 2 horas, e, muito particularmente, preferivelmente menos do que 1 hora.

[000301] No contexto da presente invenção, células dendríticas (DCs), conforme usado no método da invenção acima mencionado de transfecção e, opcionalmente, administração, são tipicamente células apresentando antígeno potente (APCs) que tipicamente possuem a capacidade de estimular células T "naive". Elas compreendem um sistema de leucócitos amplamente distribuídos em todos os tecidos, especialmente naquele que proporciona uma interface ambiental. DCs possuem uma linhagem hematopoiética heterogênea, em que subconjuntos de tecidos diferentes foram mostrados possuírem uma morfologia diferencial, fenótipo e função. A capacidade de estimular proliferação de célula T "naive" parece ser compartilhada entre estes vários subconjuntos de DC. Foi sugerido que os assim denominados subconjuntos derivados de mieloide e linfoide de DCs realizam função estimulatória específica ou tolerogênica, respectivamente. DCs são derivadas de progenitores de tutano de osso e circulam no sangue como precursores imaturos para migração têm tecidos periféricos. Dentro de tecidos diferentes, DCs se diferenciam e se tornam ativas na tomada e processamento de antígenos, e sua apresentação subsequente na superfície de célula ligada a moléculas de histocompatibilidade (MHC) maiores. Sob estimulação apropriada, DCs suportam maturação adicional e migram para tecidos linfoides secundários onde elas apresentam antígenos para células T e induzem uma resposta imune. DCs estão recebendo interesse clínico e científico aumentado devido a seu papel chave em respostas de hospedeiro anticâncer e uso potencial como adjuvantes biológicos em vacinas de tumor, bem como seu envolvimento na imunobiologia de tolerância e autoimunidade. As células dendríticas (DCs), contudo, pode também ser usadas no contexto da presente invenção, se nenhuma ou uma resposta imune inferior é requerida ou considerada. Tais células dendríticas (DCs), conforme definido acima, podem ser isoladas de tecidos diferentes conforme mencionado acima, ou de sangue, particularmente de amostras de sangue conforme descrito acima.

[000302] Preferivelmente, as células de sangue, células de apresentação de antígeno profissional (APCs), especialmente células dendríticas (DCs), usadas para o método da invenção de transfecção e opcionalmente administração da composição farmacêutica ou da vacina de acordo com a invenção se originam do paciente atual que será tratado com a composição farmacêutica da presente invenção (células autólogas). A composição farmacêutica ou a vacina de acordo com a invenção, portanto, preferivelmente contém células autólogas de sangue, células de apresentação de antígeno profissional (APCs), especialmente células dendríticas (DCs).

[000303] A transfecção das células de sangue, células de apresentação de antígeno profissional (APCs), especialmente células dendríticas (DCs), é, do mesmo modo, efetuada por métodos comuns, por exemplo, por meio de eletroporação ou métodos químicos, especialmente lipofecção, preferivelmente somente por administração da composição da invenção sem reagentes de transfecção adicionais.

[000304] O RNA conforme aqui definido, particularmente o pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e o pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, usados para a transfecção in vitro de acordo com a etapa (b) é preparado por métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto, especialmente por síntese química ou, particularmente preferivelmente, por meio de métodos moleculares que já foram mencionados acima.

[000305] Conforme definido acima, pode existir a necessidade de transfectar as células de sangue, células de apresentação de antígeno profissional (APCs), especialmente células dendríticas (DCs), usadas para o método da invenção de transfecção e opcionalmente administração, com um RNA conforme aqui definido, particularmente a composição imunoestimulatória da invenção ou seus componentes, ou a composição farmacêutica da invenção ou vacina. Além disso, administração de tais células tranfectadas a um paciente, em tecidos vivos e/ou organismos in vivo, particularmente retransplante no organismo hospedeiro no caso de células autólogas, pode ser considerada também e efetuada como uma etapa opcional c) do método acima mencionado. Neste contexto, um organismo (ou um ser) tipicamente significa mamíferos, selecionados de, sem estar restrito a estes, o grupo compreendendo humanos, e animais, incluindo, por exemplo, porco, cabra, gado bovino, suíno, cão, gato, burro, macaco ou roedores, incluindo camundongo, hamster e coelho. Além disso, tecidos vivos conforme mencionado acima, são preferivelmente derivados destes organismos. A administração das células transfectadas àqueles tecidos vivos e/ou organismos pode ocorrer via qualquer rota de administração adequada, por exemplo, sistemicamente, e incluem, por exemplo, intra- ou transdermal, oral, parenteral, incluindo injeções subcutâneas, intramusculares ou intravenosas, rotas tópicas e/ou intranasais conforme definido acima.

[000306] De acordo com outra concretização, a presente invenção também proporciona um método para a preparação da composição imunoestimulatória da invenção, compreendendo as seguintes etapas: a) preparação de um "componente adjuvante"compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA conforme definido acima, complexado com um composto catiônico ou policatiônico, conforme definido acima, preferivelmente por mistura do pelo menos um (m)RNA conforme definido acima em uma proporção específica com o composto catiônico ou policatiônico, conforme definido acima; eb) preparação da composição imunoestimulatória dainvenção por adição em uma proporção específica conforme definido acima do pelo menos um mRNA livre conforme definido acima ao componente adjuvante preparado de acordo com a etapa a), no qual o pelo menos um mRNA livre conforme definido acima, codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo conforme definido acima.

[000307] O assim denominado "componente adjuvante" é preparado de acordo com uma etapa a) do método da invenção de preparação por complexação do pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante com um composto catiônico ou policatiônico preferivelmente em uma proporção específica para formar um complexo adequado. Conforme definido acima, é importante que nenhum composto catiônico ou policatiônico livre ou somente uma quantidade neclectavelmente pequena permanece no componente adjuvante após complexação do (m)RNA. Consequentemente, a proporção do (m)RNA e do composto catiônico ou policatiônico no componente adjuvante é tipicamente selecionada tal que o (m)RNA é totalmente complexado e no composto catiônico ou policatiônico livre ou somente uma quantidade neclectavelmente pequena permanece na composição. Preferivelmente a proporção do componente adjuvante, isto é, a proporção do (m)RNA para o composto catiônico ou policatiônico é selecionada em uma faixa de cerca de 6:1 (p/p) a cerca de 0,25:1 (p/p), mais preferivelmente de cerca de 5:1 (p/p) a cerca de 0,5:1 (p/p), ainda mais preferivelmente de cerca de 4:1 (p/p) a cerca de 1:1 (p/p), ou de cerca de 3:1 (p/p) a cerca de 1:1 (p/p), e, maispreferivelmente, uma proporção de cerca de 3:1 (p/p) a cerca de 2:1 (p/p).

[000308] Adicionalmente ou alternativamente, a proporção do primeiro componente (isto é, o componente adjuvante compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico) e o segundo componente (isto é, o pelo menos um mRNA livre) pode ser calculada na base da proporção de nitrogênio/fosfato (proporção de N/P) do complexo de RNA total. No contexto da presente invenção, uma proporção de N/P está preferivelmente na faixa de cerca de 0,1-10, preferivelmente em uma faixa de cerca de 0,3-4 e, mais preferivelmente, em uma faixa de cerca de 0,5-2 ou 0,7-2 com relação a proporção de RNA:peptídeo no complexo, e, mais preferivelmente, na faixa de cerca de 0,7-1,5.

[000309] Adicionalmente ou alternativamente, a proporção do primeiro componente (isto é, o componente adjuvante compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico) e o segundo componente (isto é, o pelo menos um mRNA livre) pode também ser selecionada na composição imunoestimulatória da invenção na base da proporção molar de ambos RNAs entre si, isto é, o (m)RNA do componente adjuvante, sendo complexado com um composto catiônico ou policatiônico) e o pelo menos um mRNA livre do segundo componente. Tipicamente, a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para o pelo menos um mRNA livre do segundo componente pode ser selecionada tal que a proporção molar satisfaz as definições acima (p/p) e/ou N/P. Mais preferivelmente, a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para o pelo menos um mRNA livre do segundo componente pode ser selecionada, por exemplo, de uma proporção molar conforme definida acima, por exemplo, uma proporção molar de cerca de 0,001:1, 0,01:1, 0,1:1, 0,2:1, 0,3:1, 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1:0,9, 1:0,8, 1:0,7, 1:0,6, 1:0,5, 1:0,4, 1:0,3, 1:0,2, 1:0,1, 1:0,01, 1:0,001, etc. ou de qualquer faixa formada por quaisquer dois dos valores acima, por exemplo, uma faixa selecionada de cerca de 0,001:1 a 1:0,001, 0,01:1 a 1:0,001, 0,1:1 a 1:0,001, 1:1 a 1:0,001, 0,001:1 a 1:0,01, 0,001:1 a 1:0,1, 0,001:1 a 1:1,0,01:1 a 1:0,01, 0,1:1 a 1:0,1, 1:1, etc.

[000310] Ainda mais preferivelmente, a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para o pelo menos um mRNA livre do segundo componente pode ser selecionada, por exemplo, de uma faixa de cerca de 0,01:1 a 1:0,01. Mais preferivelmente, a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para o pelo menos um mRNA livre do segundo componente pode ser selecionada, por exemplo, de uma proporção molar de cerca de 1:1. Nesta concretização particular, qualquer das definições acima com relação a proporção de (p/p) e/ou N/P podem também se aplicar.

[000311] No contexto do método da presente invenção, o composto catiônico ou policatiônico é preferivelmente selecionado de um composto catiônico ou policatiônico conforme definido acima, adequado para complexação e, desse modo, estabilização de um ácido nucleico, particularmente um (m)RNA, por exemplo, por associação do ácido nucleico com o composto catiônico ou policatiônico. A associação ou complexação do (m)RNA modificado da composição imunoestimulatória da invenção com compostos catiônicos ou policatiônicos conforme definido acima preferivelmente proporciona propriedades adjuvantes para o (m)RNA e confere um efeito de estabilização ao (m)RNA do componente adjuvante por complexação. O procedimento para estabilização do (m)RNA modificado é, em geral, descrito em EP-A-1083232, a revelação do qual é incorporada por referência na presente invenção em sua totalidade, mas também pode ser efetuado por qualquer procedimento adequado conhecido na técnica.

[000312] De acordo com a etapa b) do método da invenção de preparação conforme descrito acima, a composiçãoimunoestimulatória da invenção é obtida por adição em uma proporção específica de um pelo menos um mRNA livre conforme definido acima ao componente adjuvante preparado de acordo com a etapa a), no qual o pelo menos um mRNA livre conforme definido acima codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, conforme definido acima. Conforme adicionalmente descrito acima, a proporção do componente adjuvante (compreendendo pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico) e o segundo componente (pelo menos um mRNA livre) na composição imunoestimulatória da invenção pode ser selecionado de acordo com os requerimentos específicos de uma terapia particular, por exemplo, um câncer ou terapia anti-tumor, uma terapia de gene, uma terapia antialergia (desensibilização), vacinação profilática ou terapêutica, etc. Tipicamente, a proporção do componente adjuvante e o segundo componente da composição imunoestimulatória da invenção é selecionada tal que uma estimulação significante do sistema humano inato é induzida ao componente adjuvante. Em paralelo, a proporção é selecionada tal que uma quantidade significante de o pelo menos um mRNA livre pode ser provido in vivo conduzindo a uma translação eficiente da proteína expressa in vivo. Preferivelmente a proporção de componente adjuvante: mRNA livre na composição imunoestimulatória da invenção é selecionada de uma faixa conforme definido acima, por exemplo, de cerca de 5:1 (p/p) a cerca de 1:10 (p/p), mais preferivelmente de uma faixa de cerca de 4:1 (p/p) a cerca de 1:8 (p/p), ainda mais preferivelmente de uma faixa de cerca de 3:1 (p/p) a cerca de 1:5 (p/p), ou 1:3 (p/p), e, maispreferivelmente, a proporção de componente adjuvante: mRNA livre na composição imunoestimulatória da invenção é selecionado da proporção de cerca de 1:1 (p/p).

[000313] Opcionalmente, componentes adicionais conforme definido acima podem ser adicionados à composição imunoestimulatória da invenção, em uma ou mais etapas adicionais.

[000314] De acordo com uma concretização final, a presente invenção também proporciona kits, particularmente kits de partes, compreendendo como componentes somente ou em combinação, a composição imunoestimulatória da invenção ou seus componentes, isto é, o pelo menos um (m)RNA, complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e o pelo menos um mRNA livre, que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, respectivamente, e/ou uma composição farmacêutica da invenção ou vacina, e, opcionalmente, instruções técnicas com informação na administração e dosagem destes componentes. Tais kits, preferivelmente kits de partes, podem ser aplicados, por exemplo, para qualquer das aplicações ou usos acima mencionados.Figuras

[000315] As seguintes figuras são pretendidas para ilustrar a invenção adicionalmente. Elas não são pretendidas para limitar a matéria objeto da invenção.

[000316] Figura 1: representa os resultados da expressão deluciferase após injeção intradermal de mRNA que codifica luciferase in vivo, no qual uma composição compreendendo uma quantidade de 10 μg de mRNA livre que codifica luciferase (Pp Luc) com ou sem combinação com LacZ-mRNA (wt LacZ) complexado com protamina (2:1 e 1:1) foram preparados e injetados intradermalmente no pavilhão do ouvido. Conforme pode ser visto, complexos de LacZ- mRNA:protamina, que foram formulados em uma proporção de 1:1 ou 2:1, respectivamente, não tinham influência negativa na expressão de luciferase, isto é, nenhuma protamina livre estava presente na solução ou somente uma quantidade muito pequena, que não tinha nenhuma influência negativa na translação. Consequentemente, nenhuma formação complexa entre protamina e ppLuc mRNA foi possível, que indica a estabilidade dos complexos de LacZ-mRNA:protamina já formados.

[000317] Figura 2: mostra os resultados de uma reação devacinação no modelo E.G7-OVA para proposta terapêutica. Para o experimento, 300.000 células de tumor E.G7-OVA foram implantadas em camundongos C57 BL/6 e os camundongos foram vacinados 8 vezes dentro de 2 semanas com a composição imunoestimulatória da invenção compreendendo 20 μg de mRNA enriquecido com GC que codifica para Gallus gallus Ovalbumin.

[000318] Em um primeiro experimento, ou um RNA foi usado, que foi totalmente complexado com protamina em uma proporção de 3:1 ou um RNA, no qual o RNA complexado foi misturado com RNA livre em uma proporção de 1:1, 1:4 e 1:8 (p/p). Conforme pode ser visto na figura 2, RNA livre, bem como protamina sozinha não exibem qualquer efeito no crescimento do tumor em comparação ao controle de tampão (solução de Ringer-lactato). Surpreendentemente, uma vacinação com um RNA complexado com protamina em uma proporção de 3:1 (RNA:protamina) reduz significantemente o crescimento do tumor. Adição de RNA livre intensifica a resposta do tumor ainda adicionalmente, no qual uma proporção de mais do que 1:8 (RNA complexado: RNA livre), por exemplo, 1: 4, ou ainda 1:1, foicomprovado ser particularmente vantajoso.

[000319] Figura 3: descreve os resultados de uma reação devacinação no modelo E.G7-OVA para proposta terapêutica similar ao Experimento na figura 2. Para este segundo experimento ou um RNA foi usado, que foi totalmente complexado com protamina em uma proporção de 3:1 ou um RNA de acordo com um protocolo aperfeiçoado, no qual o RNA complexado foi misturado com RNA livre em uma proporção de RNA:protamina 3:1 + RNA livre (1:1)).Conforme pode ser visto na Figura 3, a combinação de RNA complexado e RNA livre, particular nas proporções descritas, conduz a uma defesa de tumor aperfeiçoada.

[000320] Figura 4: mostra a análise estatística (matemática) doexperimento de acordo com Figura 3. A figura 4 particularmente mostra que as diferenças entre os grupos são significantes. A análise estatística (matemática) foi efetuada com o Software GraphPad Prism e os valores p foram determinados usando-se o teste de Mann Whitney. A análise destaca os resultados mostrados na figura 3.

[000321] Figura 5: representa os resultados da detecção depropriedades imunoestimulatórias e a estimulação de hPBMC com mRNA (CAP-GgOva(GC)-muag-A70-C30). Para este experimento 2 x 105 hPBMCs foram semeados em 200 μl de meio por poço em placas de 96 poços e 50 μl da composição da invenção, compreendendo 10 μg de mRNA que codifica para Gallus gallus ovalbumin foram adicionados para estimular liberação de citoquina durante a noite a 37°C. A secreção de citoquinas (TNFalfa e IL6) em hPBMCs com composições compreendendo RNA livre e complexado, mostrou uma elevação significante em uma detecção ELISA indicando boas propriedades imunoestimulatórias.

[000322] Figura 6: descreve os resultados da indução de umaresposta imune humoral in vivo, no qual camundongos C57 BL/6 foram vacinados 8 vezes com cada 16 μg de mRNS enriquecido com mRNA (CAP-GgOva(GC)-muag-A70-C30) que codifica para Gallus gallus Ovalbumina ou um RNA de controle "irrelevante" (pB-Luc RNA).Conforme pode ser visto na figura 6, a combinação de um RNAcomplexado com um RNA livre, particularmente em uma proporção de(1:1) conduz a uma resposta imune humoral elevada comparada àvacinação com um RNA totalmente complexado.

[000323] Figura 7: mostra a sequência de mRNA de acordo comSEQ ID NO:120, que exibe um comprimento de 1365 nuclotídeos e foi denominada "CAP-GgOva(GC)-muag-A70-C30". A sequência de mRNA CAP-GgOva(GC)-muag-A70-C30 continha os seguintes elementos de sequência:

[000324] sequência GC-otimizada para um melhor uso de códon e estabilização muag (alfa-globin-3'-UTRmutada) 70 x adenosina na extremidade 3'-terminal (calda poli-A), 30 x citosina na 0065 extremidade 3'- terminal (calda poli-C).

[000325] O ORF é indicado em letras itálicas, muag (alfa-globin-3'- UTR mutado é indicado com uma linha tracejada, a calda poli-A é sublinhada com uma linha simples e a calda poli-Cl é sublinhada com uma linha dupla.

[000326] Figura 8: representa a sequência de mRNA de acordocom SEQ ID NO: 121, que exibe um comprimento de 1816 nucleotídeos e foi denominada "T7TS-Ppluc(wt)-A70". A sequência de codificação (CDS) da sequência de mRNA total é indicada em letras itálicas, a calda poli-A é sublinhada com uma linha simples.

[000327] Figura 9: mostra a análise estatística da expressão deluciferase em camundongos Balb/c.

[000328] A análise estatística foi efetuada com o Software GraphPad Prism e os valores p foram determinados usando-se o teste de Mann Whitney. Os resultados na figura 9 mostram que o RNA complexado de acordo com a invenção (2:1 (50%) + livre (50%) exibe a mesma expressão quando comparado ao RNA não revestido e RNA que é complexado na proporção de 4:1 com protamina. Conforme pode ser visto, diferenças entre os grupos relevantes não são significantes (ns).

[000329] Desse modo, uma estimulação imune pode ser eficientemente provida com o RNA complexado da invenção no qual o nível de expressão é mantido comparado ao RNA não revestido que é complexado ma proporção de 4:1 com protamina (vide figura 10).

[000330] Figura 10: representa a análise estatística de indução deIL-12 em camundongos Balb/c. A análise estatística foi efetuada com o Foftware GraphPad Prism e os valores p foram determinados usando- se o teste de Mann Whitney. Os resultados mostram que a diferença entre o RNA complexado da invenção (2:1 (50% + livre (50%)) e o grupo 4:1 (100%) que compreende a mesma quantidade de RNA e protamina é significante. Desse modo, uma estimulação imune pode ser eficientemente provida com o RNA complexado da invenção no qual o nível de expressão é mantido comparado ao RNA não revestido e RNA que é complexado na proporção de 4:1 com protamina (vide também figura 9).

[000331] Figura 11: mostra a indução de anticorpos de lgG2acontra o antígeno de Influenza hemagglutinin (HA). Portanto, camundongos foram vacinados 2 vezes com 20 μg de mRNA enriquecido com GC que codifica para hemagglutinin (HA) não- revestida ou formulada com protamina cloridrato (Prot. Val) ou protamina sulfato (Prot. Leo) conforme indicado. Conforme pode ser visto na figura 11, a combinação de um RNA complexado com RNA livre conduz a uma resposta imune humoral elevada comparada à vacinação com um RNA totalmente complexado. Comparado ao RNA não revestido, o RNA complexado conduz a titulações de anticorpo lgG2a mais altas, um indicador da resposta acionada por Th1. A complexação de RNA com protamina cloridrato (Protamina Valeant) tem um efeito mais forte do que a complexação com protamina sulfato.

[000332] Figura 12: ilustra a indução de anticorpos específicos de1gG2a contra o antígeno de Influenza HA por 15 semanas após imunização. Portanto, camundongos foram vacinados 2 vezes com 20 μg de mRNA enriquecido com GC que codifica para hemaglutinin (HA) não-revestida ou complexada com protamina (RNA:Protamina 2:1 +RNA livre (1:1) (p/p)) e anticorpos de lgG2a foram medidos nos pontos de tempo indicados. Soro de pontos de tempo diferentes após imunização foram analisados por ELISA. As titulações de anticorpos específico de hemaglutinin do subtipo lgG2a são plotadas para os grupos tratados com tampão (80% RiLa), de HA mRNA não revestido ou complexado.

[000333] Figura 13: representa a indução de anticorpos contra oantígeno de influenza HA por ensaio de HAI. Portanto, camundongos foram vacinados 2 vezes com 20 μg de mRNA enriquecido com GC que codifica para hemaglutinin (HA) não revestida ou formulada com protamina(RNA:Protamina 2:1 + RNA livre (1:1) (p/p)) e o ensaio de HAI foirealizado nos pontos de tempo indicados.

[000334] Figura 14: mostra a sequência de mRNA que codifica oantígeno patogênico hemaglutinin (HA) de vírus influenza.Exemplos:

[000335] Os seguintes exemplos são pretendidos para ilustrar a invenção adicionalmente. Eles não são pretendidos para limitar a matéria objeto da invenção.Exemplo 1: Preparação de construção de mRNA que codifica Pp luciferase (Photinuspyralis)

[000336] Para os seguintes experimentos uma sequência de DNA que codifica Pp luciferase {Photinus pyralis) e correspondendo ao respectivo mRNA que codifica sequências de Pp luciferase conforme usadas aqui foi preparada e usada para experimentos de transfecção subsequente e vacinação. Desse modo, a sequência de DNA correspondente à Pp Luciferase nativa que codifica mRNA foi modificada com uma etiqueta poli-A (A70) conduzindo a SEQ ID NO: 121 (vide figura 8). A construção final tinha um comprimento de 1816 nucleotídeos e foi denominada "T7TS-Ppluc(wt)-A70".Exemplo 2: Preparação de construção de mRNA que codifica Gallus gallus Ovalbumin

[000337] Para os seguintes experimentos, uma sequência de DNA adicional" que codifica Gallus gallus Ovalbumin e correspondendo às respectivas sequências de mPNA foi preparada e usada para experimentos de transfecção subsequente e vacinação. Desse modo, a sequência de DNA correspondente à Gallus gallus Ovalbumin nativo que codifica mRNA foi GC-otimizada para um melhor uso de códon e estabilização. Em seguida, a sequência de DNA correspondente a sequência de codificação de Gallus gallus Ovalbumin mRNA foi transferida em uma construção RNAtiva, que foi modificada com uma etiqueta poli-A e uma etiqueta poli-C (A70-C30). A construção final tinha um comprimento de 1365 nuclotídeos e foi denominada "CAP- GgOva(GC)-muag-A70-C30". Ela contém os seguintes elementos de sequência:sequência GC-otimizada para um melhor uso de códon e estabilização muag (alfa-globin-3'-UTR mutado)70 x adenosina na extremidade 3'-terminal (calda poli-A),30 x citosina na extremidade 3'- terminal (calda poli-C).

[000338] A sequência de mRNA correspondente é mostrada na figura 7 (vide SEQ ID NO: 120).Exemplo 3: Experimentos de transcrição in vitro

[000339] O DNA de plasmídeo recombinante foi linearizado e subsequentemente transcrito in vitro usando-se o T7 RNA polimerase. O DNA gabarito foi então degradado por digestão de DNAsel. O RNA foi recuperado por precipitação de LiCl e adicionalmente limpo por extração de HPLC (PUREMessenger®, CureVac GmbH, Tubingen, Germany).Exemplo 4: Produção da composição da invenção:

[000340] O mRNA usado nos experimentos abaixo foi complexado com protamina por adição de protamina ao mRNA nas proporções indicadas (1:1-1:4) (p/p). Após incubação por 10 minutos, o RNA livre foi adicionado.Exemplo 5: Expressão de luciferase após injeção intradermal de mRNA que codifica luciferase in vivo

[000341] Neste experimento a influência de composições compreendendo complexos prontamente preparados de mRNA:protamina e/ou mRNA livre na translação foi investigada. Portanto, uma composição compreendendo uma quantidade de 10 μg de mRNA livre que codifica luciferase 20 (Pp Luc) com ou sem combinação com LacZ-mRNA complexado com protamina (2:1 e 1:1) foi preparada e injetada intradermalmente no pavilhão do ouvido.

[000342] O mRNA que codifica Pp Luciferase foi preparado conforme descrito acima. A composição a ser administrada continha ou nenhum RNA complexão adicionalmente, lacZ-mRNA:protamina em uma concentração de 2:1 ou lacZ-mRNA:protamina em uma concentração de 1:1. Como um controle, uma composição foi administrada não contendo mRNA que codifica Pp Luciferase (Photinus pyralis). Protamina foi usada como um controle. De modo a preparar estas composições, lacZ-mRNA foi formulada em uma primeira etapa com protamina em quantidades diferentes e proporções (2:1 e 1:1 (p/p)) e adicionadas como um primeiro componente. Em seguida, Pp Luc mRNA livre foi adicionado 10 minutos mais tarde à composição.

[000343] Após 24 horas o pavilhão de ouvido foi removido e congelado em nitrogênio líquido. Para homogeneização, as amostras foram colocadas em um TissueLyser por 3 minutos a 30 s-1. Em seguida 800 μl de tampão lysis (25 mM de Tris-HCI pH (7,5 - 7,8); 2 mM de EDTA; 10% de (p/v) de Glicerol; 1% de (p/v) Triton-X-100; 2 mM de DTT; 1 mM de PMSF) é adicionado e amostras são colocadas novamente no TissueLyser por 6 minutos a 30 s-1. Amostras são centrifugadas por 10 minutos a 13500 rpm e 4°C. O sobrenadante é removido e armazenado a -80°C até medição de luciferase. Os sobrenadantes foram misturados com Tampão de Luciferin (25 mM de Clycylglycin, 15 mM de MgS04, 5 mM de ATP, 62,5 μM de Luciferin) e a luminescência foi medida com um luminômetro (Lumat LB 9507; Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany).

[000344] Como um resultado (vide figura 1), complexos de LacZ- mRNA:protamina, que foram formulados em uma proporção de 1:1 ou 2:1, respectivamente, não tinham influência negativa na expressão de luciferase, isto é, nenhuma protamina livre estava presente na solução ou somente uma quantidade muito pequena, que não tinha influência negativa na translação. Consequentemente, nenhuma formação de complexo entre protamina e ppLuc mRNA foi possível, que indica a estabilidade dos complexos já formados de LacZ-mRNA:protamina.Exemplo 6: Vacinação no modelo E.G7-OVA para proposta terapêutica Método Geral:

[000345] 300000 células de tumor E.G7-OVA foram implantadas emcamundongos C57 BL/6. Nas seguintes 3 semanas os camundongos foram vacinados 8 vezes dentro de 3 semanas com a composição da invenção compreendendo 20 μg de mRNA enriquecido com GC que codifica para Gallus gallus Ovalbumine. O tamanho do tumor foi medido 18 dias após a implantação das células de tumor.A) Primeiro Experimento

[000346] 300000 células de tumor E.G7-OVA tumor células foramimplantadas em camundongos C57 BL/6. Dentro das seguintes duas semanas os camundongos foram vacinados 8 vezes com cada 20 μg de mRNS enriquecido com GC que codifica Gallus gallus Ovalbumine. Para este experimento, ou um RNA foi usado, que foi totalmente completado com protamina em uma proporção de 3:1 ou um RNA, no qual o RNA complexado foi misturado com RNA livre em uma proporção de 1:1, 1:4 e 1:8 (p/p).

[000347] Os resultados são mostrados na figura 2. Conforme pode ser visto na figura 2, RNA livre, bem como protamina sozinha não exibe qualquer pouco efeito no crescimento do tumor em comparação ao controle de tampão (solução de Ringer-lactato). Surpreendentemente, uma vacinação com uma protamina complexada RNA em uma proporção de 3:1 (RNA:protamina) reduz significantemente o crescimento do tumor. A adição de RNA livre intensifica a resposta de tumor ainda adicionalmente, no qual uma proporção de mais do que 1:8 (RNA complexado: RNA livre), por exemplo, 1: 4 ou ainda 1:1, foi comprovada ser particularmentevantajosa.B) Segundo Experimento

[000348] 300000 células de tumor E.G7-OVA foram implantadas emcamundongos C57 BL/6. Dentro das seguintes três semanas oscamundongos foram vacinados 8 vezes com cada 20 μg de mRNA enriquecido de GC que codifica Gallus gallus Ovalbumine. Para este experimento, ou um RNA foi usado, que foi totalmente complexado com protamina em uma proporção de 3:1, ou um RNA de acordo com um protocolo aperfeiçoado, no qual o RNA complexado foi misturado com RNA livre em uma proporção de RNA:Protamin 3:1 + RNA livre (1:1)).

[000349] Os resultados deste experimento são representados na figura 3. Conforme pode ser visto na figura 3, a combinação de RNA complexado e RNA livre, particular nas proporções descritas, conduzem a uma defesa aperfeiçoada do tumor.

[000350] A análise estatística (matemática) foi efetuada com o Software GraphPad Prism. Os valores p foram determinados usando- se o teste de Mann Whitney (vide figura 4).Exemplo 7: Detecção de propriedades imunoestimulatórias, eestimulação de hPBMC com mRNA

[000351] Para este experimento hPBMC foram isolados por centrifugação em Ficoll (20 minutos a 2000 rpm) e subsequentemente lavados duas vezes em PBS. hPBMC foram então resuspensos em FCS, 10% de DMSO a uma densidade de 5 x 107/ml. 1 ml de alíquotas foram congelados e armazenados a -80°C.

[000352] Antes do experimento, hPBMc foram descongelados por resuspensão em PBS, seguido por dias lavagens em PBS. hPBMC foram então suspensos em X-Vivo 15, 1% de glutamina, 1% de Pen/Strep a uma densidade de 1 x 106/ml. Após semeadura de hPBMCs a 2 x 105 por poço em placas de 96 poços, 50 μl da composição da invenção compreendendo 8 μg de mRNA que codifica para Gallus gallus ovalbumine foram adicionados para estimular liberação de citoquina durante a noite a 37°C.

[000353] Portanto, PBMCs humanos foram incubados por 20 horas com RNA, que codifica Gallus gallus Ovalbumin (OVA), complexado com protamina (3:1) mais 50% de RNA livre (formulado como segue: RNA:protamina 3:1 + RNA livre (1:1) (p/p)). A secreção de citoquinas (TNFalfa e IL6) foi medida e detectada no sobrenadante usando Standard ELISA.

[000354] Para a quantificação de TNFalfa e IL6 (ELISA) Maxisorb placas foram revestidas durante a noite (4°C) com anticorpo de captura (1 μg/ml) e subsequentemente bloqueadas com 1% de BSA por 1 hora à temperatura ambiente (RT). Após três lavagens com 0,05% de Tween, 50 μl (TNFa) ou 50 μl de sobrenadante (IL-6) hPBMC, ajustado com tampão de bloqueio 15 a 100 μl, foram adicionados aos poços. A ligação foi permitida proceder por duas horas (RT). A placa foi então lavada e 100 μl de peroxidase de rábano silvestre conjugada por streptavidin foi adicionada. Após a incubação por 30 minutes e lavagem, um substrato colorimétrico (TMB, Perbio Science) foi adicionado. As densidades óticas foram medidas a 450 nm usando-se uma leitora de placa ELISA. Todas as incubações foram realizadas á temperatura ambiente e as etapas de lavagem incluem pelo menos 3 etapas usando-se PBS/Tween20 (0,05% v/v).

[000355] 100 μl/poço de uma mistura de Strept-HRP (diluído 1/1000)e anticorpo de detecção biotinilatado (0,5 pg/ml) foram adicionados. Incubação por uma hora à temperatura ambiente foi seguida por três lavagens com 0,05% Tween. Finalmente, 100 μl/poço de substrato Amplex Red HRP (50 pM), 0,014% de H202 foram adicionados. Fluorescência foi medida em uma leitora de placa Spectramax Gemini (Ex 540 nm, Em 590 nm, corte 590 nm).

[000356] The resultados são mostrados na figura 5. Conforme pode ser visto na figura 5, as composições compreendendo RNA complexado e RNA livre exibem uma propriedade imunoestimulatória que é refletida por uma secreção significante de TNFalfa e IL-6 em hPBMCs.Exemplo 8: Indução de uma resposta imune humoral

[000357] Camundongos C57 BL/6 foram vacinados 8 vezes com cada 16 μg de mRNA enriquecido com GC que codifica para Gallus gallus Ovalbumine ou um RNA de controle "irrelevante" (pB-Luc RNA). Desse modo, o RNA foi ou formulado totalmente com protamina em uma proporção de 2:1 ou a proporção foi de acordo com um protocolo aperfeiçoado RNA:Protamina 2:1 + freie RNA (1:1) (p/p))). 2 semanas após a última vacinação amostras de sangue foram coletadas e expressão de anticorpos específicos de Ovalbumin foi determinada.

[000358] Para a detecção de anticorpos específicos de antígeno placas MaxiSorb (Nalgene Nunc 5 International) foram revestidas com Antígeno (Ovalbumine, proteína recombinante). Após bloqueio com 1 xPBS, 0,05% Tween e 1 % de BSA as placas foram incubadas com soro dos camundongos por 4 horas à temperatura ambiente. Subsequentemente o anticorpo secundário acoplado a biotin foi adicionado. Após lavagem a placa foi incubada com peroxidise de rábano silvestre e a atividade de enzima foi determinada por medição da conversão do substrato (2,2'-azino-bis(3-10 etil-benztiazolina-6- sulfonsaure) (OD 450 nm). As densidades óticas foram medidas a 450 nm usando-se uma leitora de placa Tecan ELISA.

[000359] Os resultados são mostrados na figura 6. Conforme pode ser visto na figura 6, a combinação de um RNA complexado com um RNA livre conduz a uma resposta imune humoral elevada comparada à vacinação com um RNA complexado total.Exemplo 9: Análise estatística da expressão de luciferase em camundongos Balb/c.

[000360] Neste experimento a influência de estratégiasde formulação diferentes na translação de luciferase foi investigada. Por grupo 2 camundongos foram injetados em 4 locais diferentes intradermalmente com(1) uma composição compreendendo 50% deprotamina complexada (2:1) Luc-RNA em combinação com 50% de RNA livre,(2) uma composição compreendendo Luc-RNAcomplexado com protamina na proporção 4:1,(3) 100% de Luc-RNA livre , ou(4) tampão Ringer-Lactato como controle.

[000361] Cada amostra compreende 10 μg de mRNA que codifica para luciferase (Luc-RNA, isto é, a construção acima descrita "T7TS- Ppluc(wt)-A70" de acordo com SEQ ID NO: 121) em 50 μl de tampão Ringer-Lactato. O primeiro e o segundo grupos compreendem também a mesma quantidade de protamina, mas eles eram diferentemente formulados. A composição imunoestimulatória de grupo (1) foi preparada de acordo com a invenção.

[000362] Os resultados são mostrados na figura 9. A figura 9 mostra a análise estatística da expressão de luciferase em camundongos Balb/c. A análise estatística foi efetuada com o Software GraphPad Prism e os valores p foram determinados usando-se o teste de Mann Whitney. Os resultados na figura 9 mostram que o RNA complexado de acordo com a invenção (2:1 (50%) + livre (50%), grupo (1)) exibe a mesma expressão quando comparado a RNA não revestido e RNA que é complexado na proporção de 4:1 com protamina (grupos (2) e (3)). Conforme pode ser visto, diferenças entre os grupos relevantes não são significantes (ns). Desse modo, uma estimulação imune pode ser eficientemente provida com a composição imunoestimulatória da invenção no qual nível de expressão é mantido comparado a RNA não revestido e RNA que é complexado na proporção de 4:1 com protamina (vide também figura 10).Exemplo 10: Análise estatística de indução de IL-12 em camundongos Balb/c:

[000363] Para este experimento 40 μg de mRNA que codifica para Luciferase (Luc-RNA, isto é, a construção acima descrita "T7TS- Ppluc(wt)-A70" de acordo com SEQ ID NO: 121) nas seguintes composições:(1) 2:1 (50%) + livre (50%) compreende 20 μg de Luc-RNA complexado com protamina (2:1) (p/p) e 20 μg de Luc-RNA livre (isto é, uma composição imunoestimulatória da invenção),(2) 4:1 (100%) compreende 40 μg de Luc-RNAcomplexado com protamina (4:1) (p/p),(3) 40 μ de Luc-RNA livre,(4) 10 μg de protamina, e(5) 800 μl de RiLa (todas as amostras foram dissolvidasem tampão Ringer-Lactato a um volume final de 800 μl) foram intravenosamente injetados na veia de calda de camundongos Balb/c (4 camundongos por grupo). Após 4 horas, sangue foi tomado por punção das veias retro-orbitais e soro foi usado para citoquina (IL-12) ELISA. O ELISA foi efetuado conforme descrito pelo exemplo 7.

[000364] Os resultados são mostrados na figura 10. A figura 10 representa a análise estatística de indução de IL-12 em camundongos Balb/c de acordo com o exemplo 10. A análise estatística foi efetuada com o Software GraphPad Prism e os valores p foram determinados usando-se o teste de Mann Whitney. Os resultados mostram que a diferença entre a composição imunoestimulatória da invenção (2:1 (50%) + livre (50%)) e o grupo 4:1 (100%), que compreende a mesma quantidade de RNA e protamina, é, de fato, significante. Desse modo, uma estimulação imune pode ser eficientemente provida com a composição imunoestimulatória da invenção no qual o nível de expressão é mantido comparado a RNA não revestido e RNA, que é complexado na proporção de 4:1 com protamina (vide também figura 9).Exemplo 11: Indução de uma resposta imune humoral contra um antígeno viralVacinação:

[000365] Camundongos BALB/c foram vacinados duas vezes com 20 μg de mRNA enriquecido por GC que codifica para hemaglutinin (HA) de Influenza A/Puerto Rico/8/34 (PR8) ou tampão de injeção (80% de Ringer Lactato). Desse modo, o RNA foi ou formulado totalmente com protamina em uma proporção de 2:1 ou a proporção foi de acordo com a invenção RNA:Protamin 2:1 + RNA livre (1:1) (p/p). Paraformulações, duas protaminas diferentes foram testadas, cloridrato de protamina (Protamin Valeant) e protamina sulfato (Protamin LEO).Detecção de Anticorpos Específicos:

[000366] Em pontos de tempo diferentes após última vacinação amostras de sangue foram coletadas e expressão de anticorpos específicos de hemaglutinin foi determinada por ELISA (figura 11 e 12) ou ensaio de inibição de hemaglutinação (HAI) (figura 13).Detecção de Anticorpos Específicos de Antígeno por ELISA:

[000367] Para a detecção de anticorpos específicos de antígeno por ELISA, placas MaxiSorb (Nalgene Nunc International) foram revestidas com antígeno (PR8 inativado). Após bloqueio com IxPBS, 0,05% Tween e 1% de BSA, as placas foram incubadas com soro dos camundongos por 4 horas à temperatura ambiente. Subsequentemente o anticorpo secundário acoplado a biotin foi adicionado. Após lavagem a placa foi incubada com peroxidise de rábano silvestre e a atividade de enzima foi determinada por medição da conversão do substrato (2,2'-azino-bis(3-etil-benztiazolina-6-ácido sulfônico) (OD 405 nm). As densidades óticas foram medidas a 405 nm usando-se uma leitora de placa Tecan ELISA. Os resultados de análise de soro obtidos duas semanas após imunização são mostrados na figura 11. Conforme pode ser visto na figura 11, a combinação de um RNA complexado com RNA livre conduz a uma resposta imune humoral elevada comparado à vacinação com um RNA totalmente complexado. Comparado a RNA não revestido, RNA complexado conduz a titulações de anticorpo lgG2a mais altas, um indicador da resposta acionada por Th1.

[000368] A complexação de RNA com protamina cloridrato (Protamine Valeant) tem um efeito mais forte do que complexação com protamina sulfato.

[000369] Na figura 12, soros de pontos de tempo diferentes após imunização foram analisados por ELISA. As titulações de anticorpo específico de hemaglutinin do subtipo lgG2a são plotadas para os grupos tratados com tampão (80% RiLa), mRNA não-revestido ou complexado de HA. A complexação foi feita com Protamin Valeant seguindo o protocolo aperfeiçoado de RNA:Protamin 2:1 + RNA livre (1:1) (p/p).Detecção de Anticorpos Específicos de Antígeno por Ensaio de HAI:

[000370] Soros de camundongos imunizados foram também analisados por ensaio de HAI. Em um ensaio de HAI, os anticorpos que neutralizam o vírus bloqueiam a interação da hemaglutinin viral e o ácido siálico na célula hospedeira ácida são detectados.

[000371] Os soros foram inativados a 56 °C por 10 minutos para destruir inibidores de complemento e HAI. Os soros foram adicionalmente incubados com caulim por 20 minutos e pré-adsorvidos em células de sangue vermelhas de galinha por 30 minutos para remover fatores não específicos que influenciam hemaglutinação. Amostras de soro pré-tratadas foram adicionadas a uma placa de fundo em U de 96 poços em diluição em série e duplicatas. 25 μl contendo 4 unidades de hemaglutinação de PR8 inativado em PBS e 50 μl de 0,5% de células de sangue videmelhas de galinha foram então adicionadas e incubadas à temperatura ambiente por 45 minutos. Titulações de HAI de ponto final foram definidas como a recíproca da diluição de soro mais alta que inibiu completamente hemaglutinação das células de sangue videmelhas. As titulações de soro de ponto de tempo diferentes após imunização são plotadas para os grupos tratados com tampão (80% RiLa), mRNA não revestido ou complexado de HA. A complexação foi feita com Protamin Valeant e o protocolo aperfeiçoado RNA:Protamin 2:1 + RNA livre (1:1) (p/p). Uma titulação de 40 é assumida para ser protetora em caso de infecção de influenza. Os camundongos imunizados com HA RNA complexado mostram uma titulação de HAI de mais do que 40, pelo que o HA mRNA não revestido conduz a titulações na média mais baixa do que a titulação protetora de 40.

Claims

1. Composição imunoestimuladora, caracterizada pelo fato de que compreendea) um componente adjuvante, compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m) RNA complexado com um composto policatiônico que é um peptídeo ou proteína policatiônica, em que a razão N / P no componente adjuvante está na faixa de 0,3-4, como um primeiro componente, eb) como segundo componente, pelo menos um mRNA livre que codifica pelo menos um antígeno,em que a composição imunoestimuladora é capaz de provocar ou aprimorar uma resposta imune inata e adaptativa em um mamífero e em que a razão molar do (m) RNA de o componente adjuvante a) para pelo menos um mRNA livre do segundo componente b) está na faixa de 0,1: 1 a 1: 0,01.

2. Composição imunoestimulatória de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante é selecionado de um RNA oligonucleotídeo curto, um RNA de codificação, incluindo um mRNA, um RNA imunoestimulatório, um siRNA, um RNA de antissenso, ou "riboswitches", ribozimas ou aptâmeros.

3. Composição imunoestimulatória de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante é um mRNA.

4. Composição imunoestimulatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um mRNA livre e o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante são idênticos entre si.

5. Composição imunoestimulatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um mRNA livre e o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante são diferentes entre si.

6. Composição imunoestimulatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a proporção de N/P do m(RNA) para o componente adjuvante está na faixa de 0,5 a 2, preferencialmente 0,7 a 2 ou mais preferencialmente de 0,7 a 1,5.

7. Composição imunoestimulatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a proporção molar do (m)RNA do componente adjuvante para pelo menos um mRNA livre do segundo componente b) pode ser selecionado de cerca de 1:1.

8. Composição imunoestimulatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um mRNA livre e/ou o pelo menos um (m)RNA do componente adjuvante são GC-estabilizados.

9. Composição imunoestimulatória de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o teor de G/C da região de codificação do RNA GC-estabilizado é aumentado comparado com o teor de G/C da região de codificação do RNA nativo, a sequência de aminoácido codificada do (m)RNA GC-estabilizado não sendo alterada comparada com a sequência de aminoácido codificada do (m)RNA nativo modificado.

10. Composição imunoestimulatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o composto catiônico ou policatiônico é selecionado de protamina, nucleolina, espermina ou espermidina, poli-L-lisina (PLL),polipeptídeos básicos, poliarginina, peptídeos de penetração de célula (CPPs), CPPs quiméricos, incluindo Transportan, ou peptídeos MPG, peptídeos de ligação de HIV, Tat, peptídeos derivados de HIV-1 Tat (HIV), Tat, oligoargininas, membros da família penetratin, incluindo Penetratin, peptídeos derivados de antennapedia (de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, CPPs derivados de antimicrobial incluindo Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, peptídeos derivados de hCT, SAP, MAP, KALA, PpTG20, peptídeos ricos em prolina, L- oligômeros, peptídeos ricos em arginina, Calcitonin-peptídeos, FGF, Lactoferrin, poli-L-Lisina, poli-Arginina, histonas, VP22 peptídeos derivados ou análogos, HSV, VP22 (Herpes simplex), MAP, KALA ou domínios de transdução de proteína incluindo PTDs, PpT620, peptídeos ricos em prolin, peptídeos ricos em arginina, peptídeos ricos em lisina, Pep-1, e Calcitonin peptídeo(s), ou de proteínas ou peptídeos tendo a seguinte fórmula total:(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)ü;(Xaa)x, no qual I + m + n + o + x = 8-15, e I, m, n ou o independentemente entre si podem ser qualquer número selecionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, provido que o teor total de Arg, Lys, His e Orn representa pelo menos 50% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo; e Xaa pode ser qualquer aminoácido selecionado de aminoácidos nativos (= que ocorrem naturalmente) ou aminoácidos não nativos, exceto de Arg, Lys, His ou Orn; e x pode ser qualquer número selecionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 provido que o teor total de Xaa não excede 50% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo, ou de oligoargininas incluindo Argy, Args, Argo, Argy, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, ou de polissacarídeos catiônicos, incluindo quitosana, polibreno, polímeros catiônicos, polietilenoimina (PEI), lipídeos catiônicos, DOTMA: [1-(2,3-sioleilóxi)propil)]-N,N,N-cloreto detrimetilamônia, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE (Dioleil fosfatidiletanol-amina), DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS(Dioctadecilamidoglicilspermin), DIMRI: Dimiristo-oxipropil dimetil hidroxietil amônia brometo, DOTAP: dioleoilóxi-3-(trimetilamô-nio)propano, DC-6-14: 0,0-ditetradecanoil-N-(a-trimetilamonioacetil)dietanolamina cloreto, CLIP1: rac-[(2,3-dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)]-dimetilamônia cloreto, CLIP6: rac- [2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetilóxi)etil]trimetilamônia, CLIP9: rac- [2(2,3-dihexadeciloxipropil-oxisuccinilóxi)etil]-trimetilamônia, oligofectamina, ou de polímeros catiônicos ou policatiônicos, incluindo poliaminoácidos modificados, incluindo polímeros B-aminoácido ou poliamidas reversas, polietilenos modificados, incluindo PVP (poli(N- etil-4-vinilpiridinium brometo)), acrilatos modificados, incluindopDMAEMA (poli(metilacrilato de dimetilaminoetila)), Amidoaminas modificadas incluindo pAMAM (poli(amidoamina)), polibeta-aminoéster modificado (PBAE), incluindo diamina terminal modificada 1,4 butanodiol diacrilato-co-5-amino-1-pentanol políleros, dendrímeros, incluindo polipropilamina dendrímeros ou dendrímeros à base de pAMAM, poli-imina(s), incluindo PEI: poli(etilenoimina),poli(propilenoimina), polialilamina, polímeros à base de estrutura de açúcar, incluindo polímeros à base de ciclodextrina, polímeros à base de dextrana, Quitosana, polímeros à base de estrutura de silano, incluindo copolímeros PMOXA-PDMS, polímeros de bloco consistindo em uma combinação de um ou mais blocos catiônicos (selecionados de um polímero catiônico conforme definido acima) e de um ou mais blocos hidrofílicos ou hidrofóbicos (incluindo polietilenoglicol).

11. Composição imunoestimulatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um mRNA livre codifica um antígeno, selecionado de antígenos de tumor, incluindo 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIPHPG1, alfa5beta1-Integrin, alfa5beta6-Integrin, alfa-metilacil-coenzima A racemase, ART-4, B7H4, BAGE-1, BCL-2, BING-4, CA 15-3/CA 2729, CA 19-9, CA 72-4, CA125, calreticulin, CAMEL, CASP-8, cathepsin B, cathepsin L, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA,CLCA2, CML28, proteína similar àcoactosin, Colágeno XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10/MAGE-B1, DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, EZH2, FGF- 5, FN, Fra-1, G250/CAIX, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, HAGE, HAST-2, hepsin, Her2/neu/ErbB2, HERV-K-MEL, HNE, homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminin imaturo, kallikrein 2, kallikrein 4, Ki67, KIAA0205, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, Livin, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE- A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE- B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE- D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE- H1, MAGEL2, mammaglobin A, MART-1/Melan-A, MART-2, proteína matriz 22, MC1R, M-CSF, Mesothelin, MG50/PXDN, MMP 11, MN/CA IX-antígeno, MRP-3, MUC1, MUC2, NA88-A, N-acetilglucos- aminiltransferase-V, Neo-PAP, NGEP, NMP22, NPM/ALK, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OS-9, osteocalcin, osteopontin, p15, p15, p190 minor bcr-abl, p53, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-Kinase, Pinl, POTE, PRAME, prostein, proteínaase-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, RAGE-1, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivin, survivin-2B, TA-90, TAG-72, TARP, TGFb, TGFbRII, TGM-4, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, Tirosinase, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1, WT1; ou é selecionado de antígenos mutantes expressos em doenças de câncer, incluindo alfa-actinin-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-Catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP- 5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA- 1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM- 3/m, Myosin classe l/m, neo-PAP/m, NFYQm, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRK/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, TPI/m.

12. Composição imunoestimulatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um mRNA livre codifica:a) pelo menos um, dois, três ou quatro (diferentes) antígenos do seguinte grupo de antígenos:• PSA (Antígeno Específico de Próstata) = KLK3 (Kallikrein-3),• PSMA (Antígeno de Membrana Específico de Próstata), • PSCA (Antígeno de Célula Tronco de Próstata),• STEAP (Antígeno Epitelial de Transmembrana Seis daPróstata), oub) pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze (diferentes) antígenos do seguinte grupo de antígenos:• hTERT,• WT1,• MAGE-A2,• 5T4,• MAGE-A3,• MUC1,• Her-2/neu,• NY-ESO-1, • CEA,• Survivin,• MAGE-C1, e/ou• MAGE-C2,em que qualquer combinação destes antígenos é possível.

13. Composição imunoestimuladora, caracterizada pelo fato de que compreende um componente adjuvante, compreendendo ou consistindo de pelo menos um (m)RNA, complexado com um composto policatiônico que é um peptídeo ou proteína policatiônica, como um primeiro componente e, como um segundo componente, pelo menos um mRNA livre que codifica pelo menos um antígeno,em que a composição imunoestimuladora é capaz de provocar ou melhorar uma resposta imune inata e adaptativa em um mamífero eem que a composição imunoestimuladora é preparada por um método compreendendo as seguintes etapas:a) preparar o componente adjuvante, compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m) RNA complexado com um composto policatiônico que é um peptídeo ou proteína policatiônica, misturando o pelo menos um (m) RNA com o composto catiônico ou policatiônico que é um peptídeo ou proteína policatiônica, de modo que a razão N / P no componente adjuvante esteja na faixa de 0,3-4; e b) preparar a composição imunoestimuladora adicionando pelo menos um mRNA livre em uma razão específica ao componente adjuvante preparado de acordo com a etapa a) de modo que a razão molar do (m) RNA do componente adjuvante ao pelo menos um mRNA livre do segundo componente está na faixa de 0,1: 1 a 1: 0,01.

14. Composição imunoestimuladora de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de ser para uso na profilaxia, tratamento e/ou melhoria de uma doença, compreendendo:a) um componente adjuvante, compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m) RNA, complexado com um composto policatiônico que é um peptídeo ou proteína policatiônica, como um primeiro componente, eb) como um segundo componente, pelo menos um mRNA livre que codifica pelo menos um antígeno em que a composição imunoestimuladora é capaz de provocar ou aprimorar uma resposta imune inata e opcionalmente adaptativa em um mamífero e em que o uso compreende administrar a composição a um paciente em necessidade em uma quantidade segura e eficaz.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição imunoestimulatória como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável, adjuvante, e/ou veículo.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é uma vacina.

17. Método para preparação de uma composição imunoestimulatória como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende as seguintes etapas:a) preparar um componente adjuvante compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA, complexado com um composto catiônico ou policatiônico, por mistura em uma proporção específica de pelo menos um (m)RNA e um composto catiônico ou policatiônico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; eb) preparar a composição inventiva imunoestimulatória por adição em uma proporção específica de pelo menos um mRNA livre conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para o componente adjuvante preparado de acordo com a etapa a), em que o pelo menos um mRNA livre codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

18. Uso de uma composição imunoestimulatória como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou um componente adjuvante, compreendendo ou consistindo em pelo menos um (m)RNA complexado com um composto catiônico ou policatiônico, e pelo menos um mRNA livre que codifica pelo menos uma proteína terapeuticamente ativa, antígeno e/ou anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição farmacêutica para profilaxia, tratamento e/ou melhora de qualquer das doenças e distúrbios selecionados de doenças de câncer ou tumor, doenças autoimune, doenças infecciosas, doenças infecciosas virais, bacteriais ou protozoológicas ou alergia ou doenças alérgicas.

19. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a composição imunoestimulatória como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e/ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 16, e, opcionalmente, instruções técnicas com informação sobre a administração e dosagem da composição imunoestimulatória e/ou da composição farmacêutica.