CN110804662B - 一种基于sirt2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法 - Google Patents

一种基于sirt2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110804662B
CN110804662B CN201910942717.0A CN201910942717A CN110804662B CN 110804662 B CN110804662 B CN 110804662B CN 201910942717 A CN201910942717 A CN 201910942717A CN 110804662 B CN110804662 B CN 110804662B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sirt2
prrsv
pigs
susceptibility
pig
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910942717.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110804662A (zh
Inventor
郭春和
王勋
王小瑛
陈瑶生
刘小红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University filed Critical Sun Yat Sen University
Priority to CN201910942717.0A priority Critical patent/CN110804662B/zh
Publication of CN110804662A publication Critical patent/CN110804662A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110804662B publication Critical patent/CN110804662B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91091—Glycosyltransferases (2.4)
    • G01N2333/91142—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于SIRT2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法。本发明研究显示，猪体内SIRT2表达量与PRRSV感染息息相关，PRRSV感染后SIRT2 mNRA和蛋白水平升高，SIRT2干扰抑制PRRSV复制，SIRT2过表达促进病毒复制；当体内SIRT2表达量较高时，猪对PRRSV具有易感性，反之抗性。因此，SIRT2可以作为一种新型的判定PRRSV易感性或抗性的标志物，为鉴别猪对PRRSV易感性以及PRRSV抗性猪的筛选和培育奠定了坚实的基础，对猪蓝耳病的防控具有重要的意义，也有利于培育优良品系猪。

Description

一种基于SIRT2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及SIRT2基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用及基于SIRT2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveandrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起，是养猪业中最重要的传染病之一，几乎分布在所有的养猪国家，在全球对养猪业造成巨大的经济损失。2006年，我国大部分省份及越南爆发了猪高热病(Porcine high fever syndrome，PHFS)，给养猪业造成了巨大的经济损失，此病是由变异的PRRSV引起，命名为高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highlypathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)。HP-PRRSV特征为高热、高致病性及高死亡率。目前，农业部已将该病列入重大动物疫病强制免疫计划。
PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages，PAMs)，PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；(2)抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；(3)疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；(4)抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但高效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；(5)病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；(6)混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上加难。
由于遗传背景与生物抗病性有着紧密的联系，因此，基于基因手段筛选蓝耳病抗性猪的工作，对于该疾病的防控具有不可比拟的优势，重点在于找出易感性或易感相关的基因，不仅可以研究蓝耳病的感染机制，还为蓝耳病的治疗和预防提供新办法。如本发明人团队的研究成果201811126441.0显示，猪体内EXT1表达量与PRRSV感染息息相关，PRRSV感染Marc-145细胞后EXT1mNRA和蛋白水平升高，EXT1干扰促进PRRSV复制，EXT1过表达抑制病毒复制；当体内EXT1表达量较高时，猪对PRRSV具有抗性，反之易感。因此，EXT1可用于判定PRRSV易感性或抗性的标准，用于鉴别猪对PRRSV易感性以及PRRSV抗性猪的筛选和培育。
发明内容
本发明的目的是针对现有猪蓝耳病防治技术的不足，提供一种可用于判定PRRSV易感性或抗性、用于鉴别猪对PRRSV易感性以及PRRSV抗性猪的筛选和培育的靶标基因新选择，即SIRT2基因。本发明研究表明，PRRSV感染Marc-145细胞后促进SIRT2表达，SIRT2过表达促进PRRSV复制，SIRT2干扰抑制PRRSV复制。表明SIRT2的表达量与PRRSV的复制息息相关，有望成为一种新型的筛选抗蓝耳病猪的方法，对PRRSV抗性猪的培育具有很好的临床应用价值。
本发明的目的是提供SIRT2在筛选抗蓝耳病猪中的应用。
本发明的另一目的是提供一种判定猪对蓝耳病抗性或易感性的方法。
本发明的再一目的是提供SIRT2在提高猪对蓝耳病毒的抗性方面的应用，或在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。
本发明的再一目的是提供SIRT2在培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究发现，PRRSV感染Marc-145细胞不同时间点促进SIRT2表达，SIRT2表达量显著升高。即SIRT2表达量与PRRSV感染息息相关，与猪对蓝耳病易感性有密切的关系。且经siRNA干扰SIRT2的表达后会抑制PRRSV复制，SIRT2过表达后促进PRRSV复制。即猪体内SIRT2表达量高，对蓝耳病毒具有易感性；反之抗性更高。
因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
首先，SIRT2基因或SIRT2蛋白在作为检测诊断猪蓝耳病的标志物或制备猪蓝耳病检测试剂方面的应用方面的应用。
以及SIRT2基因或SIRT2蛋白在作为检测诊断猪是否感染蓝耳病毒的标志物或制备检测猪是否感染蓝耳病毒的试剂方面的应用。
根据细胞实验和动物实现结果显示，感染PRRSV的细胞以及攻毒猪的SIRT2基因表达都显著上升，因此，通过检测SIRT2基因的表达水平或SIRT2蛋白水平，即可判断检测对象是否感染蓝耳病毒或患蓝耳病。检测样本可以是血清、肺、淋巴结组织等。
另外，SIRT2基因或SIRT2蛋白在作为检测判断猪对蓝耳病毒是易感性或抗性的标志物，或制备检测判断猪对蓝耳病毒是易感性或抗性的试剂方面的应用。
以及SIRT2基因或SIRT2蛋白在筛选抗蓝耳病猪或制备抗蓝耳病猪筛选试剂方面的应用。
本发明选用了不同品种猪研究SIRT2在筛选抗蓝耳病猪中的应用。分别选取我国地方品种通城猪、梅山猪(对蓝耳病不易感)及国外品种长白猪、大白猪(对蓝耳病易感)为例，进行PRRSV攻毒，解剖后根据血清和肺、淋巴结组织中病毒滴度TCID50及PRRSV N蛋白表达水平确定通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力差别，根据SIRT2表达水平研究其与4种品种猪对PRRSV感染力关系。结果显示，本发明根据SIRT2基因或SIRT2蛋白水平来判断猪对蓝耳病毒的易感性或抗性，筛选抗性猪，是非常可靠准确的。检测样本优选为血清等。
最后，SIRT2基因在培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。
以及SIRT2表达抑制剂(如干扰)在提高猪对蓝耳病毒抗性方面的应用，SIRT2表达抑制剂在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。
通过SIRT2基因的siRNA干扰和过表达实验显示，通过调控SIRT2基因的表达，能够显著影响PRRSV的复制，能够操控细胞对蓝耳病毒的抗性和易感性。因此，通过干扰抑制SIRT2基因的从而构建抗蓝耳病猪品种，具有非常好的前景和操作基础。
本文中涉及的“SIRT2”的Gene ID：100125964。
所述蓝耳病毒包括经典毒株和高致病性毒株(HP-PRRSV)。
另外基于上述研究结果和结论，本发明还提供一种鉴别猪对蓝耳病抗性的方法，具体是通过检测猪体内SIRT2表达水平(表达量)来鉴别猪对蓝耳病毒是易感性或抗性。检测样本优选为血清等。
鉴别的标准是：SIRT2表达量越高的猪对蓝耳病毒的易感性越强；反之抗性越强。
具体操作时，SIRT2表达量的高低以本领域技术中猪体内SIRT2表达量的普遍水平为依据。这里所述的高低是相对的，根据SIRT2表达量异常较高或较低，从而判定猪是否可能对PRRSV具有易感性，对PRRSV的易感性程度。
更具体地，基于本发明实验的结果，鉴别的具体数据标准大致为：当SIRT2表达量高于3.6±0.5×10-1(相对于内参HPRT1)时，猪对病毒有易感性；表达量低于3.6±0.5×10-1(相对于内参HPRT1)时，抗性。
本发明对于SIRT2表达量的检测方法不作严格限制，可以是本领域内现有的基因表达量检测方法。
作为一种可优选的实施方案，本发明提供了一种检测猪SIRT2表达量的引物组，包括上游引物SIRT2-F和下游引物SIRT2-R，序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。
所述引物组在判定猪对蓝耳病抗性或易感性方面的应用，或在筛选抗蓝耳病猪中的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次研究发现了猪体内SIRT2表达量与PRRSV感染息息相关，SIRT2可作为一种新型的判定PRRSV抗性或易感性的方法；SIRT2表达量异常较高的猪对PRRSV具有易感性，反之抗性。
本发明的发现为筛选易感蓝耳病猪以及PRRSV抗病育种奠定基础，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有很好的临床应用价值，对猪蓝耳病的防控具有重要的意义，也有利于优良品系猪的培育。同时，本发明也为SIRT2提供了一种新的应用。
附图说明
图1为PRRSV感染Marc-145细胞不同时间点SIRT2蛋白表达水平。
图2为PRRSV毒株CHR6感染Marc-145细胞不同时间点SIRT2 mRNA表达水平。
图3为活体猪对照组与攻毒组肺组织SIRT2的免疫组化。
图4为SIRT2经SIRT2抑制剂SirReal2处理后接毒，PRRSV N蛋白表达水平。
图5为SIRT2经SIRT2抑制剂Thiomyristoyl处理后接毒，PRRSV N蛋白表达水平。
图6为SIRT2经siRNA干扰后，SIRT2 mRNA表达水平。
图7为SIRT2经siRNA干扰后接毒，PRRSV N蛋白表达水平。
图8为SIRT2经siRNA干扰后接毒，不同时间点PRRSV N蛋白表达水平。
图9为SIRT2经siRNA干扰后接毒，不同时间点PRRSV N基因mRNA表达水平。
图10为SIRT2过表达后，SIRT2 mRNA表达水平。
图11为SIRT2过表达后接毒，PRRSV N蛋白表达水平。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
实施例1 SIRT2基因体外调节PRRSV复制的研究
用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞，以MOI＝0.1接毒PRRSV毒株(CHR6)，在2％胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养，培养不同时间点收集细胞，对SIRT2基因做Western-blot检测；结果如图1所示，PRRSV感染Marc-145细胞后，SIRT2蛋白表达量显著升高。对SIRT2基因做qRT-PCR检测，结果如图2所示，PRRSV毒株(CHR6)感染Marc-145细胞后，SIRT2 mRNA表达量显著升高。
实施例2 SIRT2免疫组化
1、实验方法
(1)实验分组
大白猪攻毒组：6头4周龄蓝耳、圆环、伪狂、猪瘟抗原阴性仔猪，肌肉注射攻毒，攻毒剂量2×105TCID50，攻毒时间35天，35天后安乐死解剖。
大白猪对照组：6头4周龄蓝耳、圆环、伪狂、猪瘟抗原阴性仔猪，肌肉注射PBS，剂量2ml，饲养35天，35天后安乐死解剖。
(2)将大白猪对照组与攻毒组肺组织切块，脱水26h后，石蜡包埋，切片，置于烘箱内，过夜烤干，石蜡切片脱蜡，切片抗原修复，30％双氧水消除内源性过氧化物酶，封闭，免疫反应(一抗二抗结合)，DAB显色，苏木精复染，封片，镜检。
2、结果如图3所示，攻毒猪肺组织切片显示，SIRT2的表达量显著高于对照组。
实施例3 SIRT2抑制剂与干扰
1、使用SIRT2抑制剂SirReal2及Thiomyristoyl(购自CSN pharm公司)，依据不同浓度分别在两个6孔板中处理培养至细胞密度80％以上的Marc-145细胞，2h后，在培养基中加入PRRSV，再培养36h，收集细胞通过Western-blot实验验证SIRT2抑制剂对PRRSV复制影响。
2、结果如图4、5所示，SIRT2抑制剂SirReal2、Thiomyristoyl处理后显著抑制PRRSV N蛋白表达。
3、将设计好的SIRT2siRNA及1对Negative Control送Thermo Fisher Scientific公司合成，使用LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂(购自Thermo Fisher Scientific公司)。在21个35mm培养皿中用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至60-70％密度，分别将siRNA(3对siRNA和1个对照)及LipofectamineTM RNAiMAX用
Figure BDA0002223353890000061
ReducedSerum Medium稀释，稀释后按1:1比例混合并室温培养5min，然后加入到换有新鲜DMEM培养液的Marc-145细胞上37℃、5％CO2培养箱中培养6h，弃上清，PBS洗1遍，用含10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养48h，收集细胞通过qRT-PCR实验验证SIRT2干扰效果。另外的35mm培养皿培养48h后，在培养基中加入PRRSV，再培养12、24、36h，收集细胞通过qRT-PCR、Western-blot实验验证SIRT2干扰后对PRRSV复制影响。
4、结果如图6所示，SIRT2经siRNA干扰后，相对于对照组，siRNA显著地抑制了SIRT2 mRNA表达。结果如图7所示，siRNA干扰后显著抑制PRRSV N蛋白表达。
SIRT2干扰后，结果如图8所示，相对于对照组，siRNA处理后，PRRSV接毒12、24、36h，Western-blot显示N蛋白水平显著下降。SIRT2干扰后，PRRSV接毒12、24、36、48h，结果如图9所示，相对于对照组，siRNA处理后，qRT-PCR显示PRRSV N蛋白水平显著下降。
综上所述，SIRT2经抑制剂处理和经siRNA干扰后抑制PRRSV复制。
实施例4 SIRT2过表达
1、构建pcDNA3.1-SIRT2过表达载体，在2个6孔板中用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至60-70％密度，使用LipofectamineTM2000(购自Thermo FisherScientific公司)分别将pcDNA3.1-SIRT2和pcDNA3.1空载体转入Marc-145细胞，在37℃、5％CO2培养箱中培养6h，弃上清，PBS洗1遍，用含10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养24h，收集细胞检测过表达效果。另外一个6孔板培养24h后，在培养基中加入PRRSV，再培养36h，收集细胞检测SIRT2过表达后对PRRSV复制影响。
2、结果如图10所示，SIRT2过表达后，SIRT2 mRNA显著升高。结果如图11所示，过表达后N蛋白水平显著升高。
综上所述，SIRT2过表达后促进PRRSV复制。
实施例5 SIRT2在筛选易感蓝耳病猪中的应用
1、选取我国地方品种通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪作为实验对象，验证本发明利用SIRT2筛选抗蓝耳病猪的方法。
其中，已知通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，即具有抗性；而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。
2、实验方法
选择通城猪、梅山猪、长白猪、大白猪各6头，每3头1组，即分成2组，其中1组进行PRRSV攻毒，另外1组不做任何处理(对照)，分别在攻毒前1d和攻毒后第7、14、21、28d采血，对照组同步采血，第28d处死，采集肺、淋巴结组织。
取一部分血清进行TCID50测定，剩余血清及肺、淋巴结组织提取RNA、反转，对SIRT2及PRRSV N蛋白进行qRT-PCR检测，并对肺组织做病理切片。
根据TCID50、PRRSV N蛋白表达水平及肺组织病理切片确定通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力，根据SIRT2表达水平研究其与4种品种猪对PRRSV感染力关系。
3、SIRT2表达水平检测结果显示，通城猪和梅山猪体内SIRT2表达水平显著低于长白猪和大白猪。
根据结果可判断，通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。判断结果与真实情况相符。
另外，基于大量实验结果显示，鉴别猪对蓝耳病毒感病性的具体数据标准大致为：当SIRT2表达量高于3.6±0.5×10-1(相对于内参HPRT1)时，猪对病毒有易感性；表达量低于3.6±0.5×10-1(相对于内参HPRT1)时，猪对病毒有抗性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种基于SIRT2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 上游引物SIRT2-F
<400> 1
ggaccgtcgc agagtcatc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物SIRT2-R
<400> 2
agtgacagat ggtcggcttg 20

Claims (4)

1.检测SIRT2基因表达水平的试剂在制备检测判断猪对蓝耳病毒是易感性或抗性的产品方面的应用，其特征在于，所述易感性或抗性的判断标准是SIRT2表达量越高的猪对蓝耳病毒的易感性越强；反之抗性越强。
2.检测SIRT2基因表达水平的试剂在筛选抗蓝耳病猪或制备抗蓝耳病猪筛选试剂方面的应用，其特征在于，所述筛选的标准是SIRT2表达量越高的猪对蓝耳病毒的易感性越强；反之抗性越强。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂为SEQ ID NO.1-2所示的引物。
4.一种筛选抗蓝耳病猪的方法，其特征在于，是通过检测猪体内SIRT2表达水平来鉴别猪对蓝耳病毒是易感性或抗性；鉴别的标准是：SIRT2表达量越高的猪对蓝耳病毒的易感性越强；反之抗性越强。
CN201910942717.0A 2019-09-30 2019-09-30 一种基于sirt2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法 Active CN110804662B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910942717.0A CN110804662B (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一种基于sirt2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910942717.0A CN110804662B (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一种基于sirt2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110804662A CN110804662A (zh) 2020-02-18
CN110804662B true CN110804662B (zh) 2021-07-13

Family

ID=69488181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910942717.0A Active CN110804662B (zh) 2019-09-30 2019-09-30 一种基于sirt2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110804662B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101353657A (zh) * 2008-09-02 2009-01-28 浙江大学 猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及用途
US9572874B2 (en) * 2008-09-30 2017-02-21 Curevac Ag Composition comprising a complexed (M)RNA and a naked mRNA for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
CN109207577A (zh) * 2018-07-31 2019-01-15 中山大学 Marco在筛选抗蓝耳病猪中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015073531A1 (en) * 2013-11-13 2015-05-21 The Texas A & M University System Micro-rnas that modulate lymphangiogenesis and inflammatory pathways in lymphatic vessel cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101353657A (zh) * 2008-09-02 2009-01-28 浙江大学 猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及用途
US9572874B2 (en) * 2008-09-30 2017-02-21 Curevac Ag Composition comprising a complexed (M)RNA and a naked mRNA for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
CN109207577A (zh) * 2018-07-31 2019-01-15 中山大学 Marco在筛选抗蓝耳病猪中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecular cloning and characterization of porcine sirtuin genes;Jin D等;《COMPARATIVE BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY B-BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY》;20090831;第153卷;第348-358页 *
苏姜猪组织中SIRT2基因表达分布研究;王利红等;《江苏农业科学》;20190729;第47卷(第13期);第1.2.3部分及表1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110804662A (zh) 2020-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Generation of pigs resistant to highly pathogenic-porcine reproductive and respiratory syndrome virus through gene editing of CD163
Jackwood et al. Identification and pathogenicity of a natural reassortant between a very virulent serotype 1 infectious bursal disease virus (IBDV) and a serotype 2 IBDV
KR101640062B1 (ko) 돼지 토크 테노 바이러스 백신 및 진단
KR20150133695A (ko) 바이러스 제조를 위한 세포주 및 이의 사용 방법
Bayoumi et al. Molecular characterization and genetic diversity of the infectious laryngotracheitis virus strains circulating in Egypt during the outbreaks of 2018 and 2019
CN110592172A (zh) 利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点
CN110878377A (zh) 非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量pcr鉴别诊断试剂盒
CN113846112A (zh) 核苷酸序列、fiber2蛋白及表达方法、鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗
CN108101967B (zh) Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、制备方法及其应用
Xie et al. Establishment and characterization of a telomerase‐immortalized porcine bronchial epithelial cell line
CN110423782A (zh) 一株Marc-145稳定细胞株的构建及应用
CN110607280A (zh) Emc3基因的应用及其定点敲除方法
CN107090438B (zh) 抗血清I型MDV gI蛋白的单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN110804662B (zh) 一种基于sirt2的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法
EP1973931B1 (en) Chicken virus vaccine and diagnostic
CN109207577B (zh) Marco在筛选抗蓝耳病猪中的应用
CN109364249B (zh) 以manf为靶点的物质在制备治疗肝内胆管癌产品中的应用
CN109371140B (zh) 一种基于ext1的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法
CN110462030B (zh) 强毒性肠道病毒71的稳定生产及其利用
CN113637709B (zh) Kif5b基因作为靶点在抑制口蹄疫病毒复制中的应用
CN115678985A (zh) March5在鉴别猪对蓝耳病毒易感性及制备药物中的应用
CN116410991B (zh) 水泡性口炎病毒和新型冠状病毒的重组核酸分子、重组载体和重组病毒及其应用
CN116536431A (zh) 泛素结合酶ube2l6在防治猪蓝耳病及鉴定抗蓝耳病猪中的应用
CN117568288B (zh) 一种高效拯救禽冠状病毒的方法及其应用
CN104450781A (zh) 一种过表达ciapin1蛋白的细胞系及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant