CN109371140B

CN109371140B - 一种基于ext1的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法

Info

Publication number: CN109371140B
Application number: CN201811126441.0A
Authority: CN
Inventors: 郭春和; 董文娟; 朱振邦; 张晓晓; 俞飘; 贺胜; 王小瑛; 刘小红; 陈瑶生
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109371140A

Abstract

本发明公开了EXT1在筛选抗蓝耳病猪中的应用及一种基于EXT1的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法。本发明研究显示，猪体内EXT1表达量与PRRSV感染息息相关，PRRSV感染Marc‑145细胞后EXT1 mNRA和蛋白水平升高，EXT1干扰促进PRRSV复制，EXT1过表达抑制病毒复制；当体内EXT1表达量较高时，猪对PRRSV具有抗性，反之易感。因此，EXT1可以作为一种新型的判定PRRSV易感性或抗性的标准，为鉴别猪对PRRSV易感性以及PRRSV抗性猪的筛选和培育奠定了坚实的基础，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有很好的临床应用价值，对猪蓝耳病的防控具有重要的意义，也有利于培育优良品系猪。

Description

一种基于EXT1的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及EXT1在筛选抗蓝耳病猪中的应用及一种基于EXT1的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductiveandrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起。早在1992年，世界动物卫生组织（OfficeInternational Des Epizooties，OIE）就将该病列为B类传染病。目前，PRRS是养猪业中最重要的传染病之一，几乎分布在所有的养猪国家，在全球对养猪业造成巨大的经济损失。2006年，我国大部分省份及越南爆发了猪高热病（Porcine high fever syndrome，PHFS），给养猪业造成了巨大的经济损失，此病是由变异的PRRSV引起，命名为高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndromevirus，HP-PRRSV）。HP-PRRSV特征为高热、高致病性及高死亡率。目前，农业部已将该病列入重大动物疫病强制免疫计划。

PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：（1）嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞（Porcinealveolar macrophages，PAMs），PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；（2）抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；（3）疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；（4）抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但高效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；（5）病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；（6）混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上加难。

另外，由于遗传背景与生物抗病性有着紧密的联系，因此，基于基因手段筛选蓝耳病抗性猪的工作，对于该疾病的防控具有不可比拟的优势，重点在于找出抗性或易感相关的基因，不仅可以研究蓝耳病的感染机制，还为蓝耳病的治疗和预防提供新办法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有猪蓝耳病防治技术的缺陷和不足，提供一种与猪蓝耳病抗性相关基因，本发明研究表明，PRRSV感染Marc-145细胞后促进EXT1表达，EXT1过表达抑制PRRSV复制，EXT1干扰促进PRRSV复制。表明EXT1的表达量与PRRSV的复制息息相关，有望成为一种新型的筛选抗蓝耳病猪的方法，对PRRSV抗性猪的培育具有很好的临床应用价值。

本发明的目的是提供EXT1在筛选抗蓝耳病猪中的应用。

本发明的另一目的是提供一种判定猪对蓝耳病抗性或易感性的方法。

本发明的再一目的是提供EXT1在提高猪对蓝耳病毒的抗性方面的应用，或在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。

本发明的再一目的是提供EXT1在培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现，PRRSV感染Marc-145细胞不同时间点促进EXT1表达，EXT1表达量显著升高。即EXT1表达量与PRRSV感染息息相关，与猪对蓝耳病易感性有密切的关系。且经siRNA干扰EXT1的表达后会促进PRRSV复制，EXT1过表达后抑制PRRSV复制。即猪体内EXT1表达量的对蓝耳病毒具有抗性；反之易感性更高。

因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

EXT1在作为检测诊断猪蓝耳病的标志物方面的应用。

EXT1在作为检测诊断猪是否感染蓝耳病毒的标志物方面的应用。

EXT1在筛选抗蓝耳病猪方面的应用。

EXT1在提高猪对蓝耳病毒的抗性方面的应用。

EXT1在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。

EXT1在筛选和/或培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。

EXT1表达激活剂（如过表达）在提高猪对蓝耳病毒抗性方面的应用。

EXT1表达激活剂在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。

猪的EXT1的Gene ID：100157655。所述蓝耳病毒包括经典毒株和高致病性毒株（HP-PRRSV）。

另外，本发明还提供一种鉴别猪对蓝耳病易感性的方法，具体是通过检测猪体内EXT1表达水平（表达量）来鉴别猪对蓝耳病毒是抗性或易感性。

鉴别的标准是：EXT1表达量高的猪对蓝耳病毒具有抗性；反之具有易感性。

具体操作时，EXT1表达量的高低以本领域技术中猪体内EXT1表达量的普遍水平为依据。这里所述的高低是相对的，根据EXT1表达量异常较高或较低，从而判定猪是否可能对PRRSV具有抗性，对PRRSV的易感性程度。

更具体地，基于本发明实验的结果，鉴别的具体数据标准大致为：当EXT1表达量高于3.7±0.5×10^-2（相对于内参HPRT1）时，猪对病毒有抗性；表达量低于3.7±0.5×10^-2（相对于内参HPRT1）时，易感。

本发明对于EXT1表达量的检测方法不作严格限制，可以是本领域内现有的基因表达量检测方法。

作为一种可优选的实施方案，本发明提供了一种检测猪EXT1表达量的引物组，包括上游引物EXT1-F和下游引物EXT1-R，序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。

所述引物组在判定猪对蓝耳病抗性或易感性方面的应用，或在筛选抗蓝耳病猪中的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

本发明选用了不同品种猪研究EXT1在筛选抗蓝耳病猪中的应用。分别选取我国地方品种通城猪、梅山猪（对蓝耳病不易感）及国外品种长白猪、大白猪（对蓝耳病易感）为例，进行PRRSV攻毒，解剖后根据血清和肺、淋巴结组织中病毒滴度TCID50及PRRSV N蛋白表达水平确定通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力差别，根据EXT1表达水平研究其与4种品种猪对PRRSV感染力关系。结果显示，本发明所述利用EXT1筛选抗蓝耳病猪的方法是可靠的、准确的。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次研究发现了猪体内EXT1表达量与PRRSV感染息息相关，EXT1可作为一种新型的判定PRRSV抗性或易感性的方法；EXT1表达量异常较高的猪对PRRSV具有抗性，反之易感。

本发明的发现为筛选抗蓝耳病猪以及PRRSV抗病育种奠定基础，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有很好的临床应用价值，对猪蓝耳病的防控具有重要的意义，也有利于优良品系猪的培育。同时，本发明也为EXT1提供了一种新的应用。

附图说明

图1为PRRSV感染Marc-145细胞不同时间点EXT1蛋白表达水平。

图2为PRRSV毒株CHR6感染Marc-145细胞不同时间点EXT1 mRNA表达水平。

图3为PRRSV毒株TJM感染Marc-145细胞不同时间点EXT1 mRNA表达水平。

图4为PRRSV-EGFP感染Marc-145细胞不同时间点EXT1 mRNA表达水平。

图5为EXT1经siRNA干扰后，EXT1 mRNA表达水平。

图6为EXT1经siRNA干扰后，硫酸乙酰肝素HS mRNA表达水平。

图7为EXT1经siRNA干扰后接毒，PRRSV N基因mRNA表达水平。

图8为EXT1经siRNA干扰后接毒，PRRSV N蛋白表达水平。

图9为EXT1过表达后，EXT1 mRNA表达水平。

图10为EXT1过表达后，硫酸乙酰肝素HS mRNA表达水平。

图11为EXT1过表达后接毒，PRRSV N蛋白表达水平。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。

实施例1 EXT1基因体外调节PRRSV复制的研究

用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞，以MOI=0.1接毒PRRSV三种不同毒株（CHR6、TJM、PRRSV-EGFP），在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养，培养不同时间点收集细胞，对EXT1基因做Western-blot检测，结果如图1所示，PRRSV感染Marc-145细胞后，EXT1蛋白表达量显著升高。对EXT1基因做qRT-PCR检测，结果如图2、3、4所示，PRRSV三种不同毒株（CHR6、TJM、PRRSV-EGFP）感染Marc-145细胞后，EXT1 mRNA表达量显著升高。

实施例2 EXT1干扰

1、将设计好的EXT1 siRNA及1对Negative Control （对照）送Thermo FisherScientific公司合成，使用Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂 (购自Thermo FisherScientific公司)。在2个6孔板中用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至60-70%密度，分别将siRNA（3对siRNA和1个对照）及Lipofectamine™ RNAiMAX用Opti-MEM®Reduced Serum Medium稀释，稀释后按1:1比例混合并室温培养5 min，然后加入到换有新鲜DMEM培养液的Marc-145细胞上37℃、5% CO2培养箱中培养6 h，弃上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养48 h，收集细胞通过qRT-PCR实验验证EXT1干扰效果。另外一个6孔板培养48 h后，在培养基中加入PRRSV，再培养24、36 h，收集细胞通过qRT-PCR、Western-blot实验验证EXT1干扰后对PRRSV复制影响。

2、结果如图5所示，EXT1经siRNA干扰后，相对于对照组，siRNA显著地抑制了EXT1mRNA表达。EXT1是硫酸乙酰肝素HS合成酶，EXT1干扰后，我们分析HS表达量。结果如图6所示，siRNA si-b干扰后显著抑制HS表达。

EXT1干扰后，PRRSV接毒24 h，结果如图7所示，相对于对照组，siRNA处理后，PRRSVN蛋白mRNA水平显著升高。EXT1干扰后，PRRSV接毒24、36 h，结果如图8所示，相对于对照组，siRNA处理后，Western-blot显示PRRSV N蛋白水平显著升高。

综上所述，EXT1经siRNA干扰后促进PRRSV复制。

实施例3 EXT1过表达

1、构建pcDNA3.1-EXT1过表达载体，在2个6孔板中用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至60-70%密度，使用Lipofectamine™ 2000 （购自Thermo FisherScientific公司）分别将pcDNA3.1-EXT1和pcDNA3.1空载体转入Marc-145细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养6 h，弃上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养24 h，收集细胞检测过表达效果。另外一个6孔板培养24 h后，在培养基中加入PRRSV，再培养36、48h，收集细胞检测EXT1过表达后对PRRSV复制影响。

2、结果如图9所示，EXT1过表达后，EXT1 mRNA显著升高。EXT1是硫酸乙酰肝素HS合成酶，EXT1过表达后，我们分析HS表达量。结果如图10所示，过表达后HS表达显著升高。EXT1过表达后，PRRSV接毒，结果如图11所示，相对于对照组，PRRSV感染36、48 h后，N蛋白表达水平显著降低。

综上所述，EXT1过表达后抑制PRRSV复制。

实施例4 EXT1在筛选抗蓝耳病猪中的应用

1、选取我国地方品种通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪作为实验对象，验证本发明利用EXT1筛选抗蓝耳病猪的方法。

其中，已知通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，即具有抗性；而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。

2、实验方法

选择通城猪、梅山猪、长白猪、大白猪各6头，每3头1组，即分成2组，其中1组进行PRRSV攻毒，另外1组不做任何处理（对照），分别在攻毒前1 d和攻毒后第7、14、21、28 d采血，对照组同步采血，第28 d处死，采集肺、淋巴结组织。

取一部分血清进行TCID50测定，剩余血清及肺、淋巴结组织提取RNA、反转，对EXT1及PRRSV N蛋白进行qRT-PCR检测，并对肺组织做病理切片。

根据TCID50、PRRSV N蛋白表达水平及肺组织病理切片确定通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力，根据EXT1表达水平研究其与4种品种猪对PRRSV感染力关系。

3、根据结果可判断，通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。

同时，EXT1表达水平检测结果显示，通城猪和梅山猪体内EXT1表达水平显著高于长白猪和大白猪。

另外，基于大量实验结果显示，鉴别猪对蓝耳病毒感病性的具体数据标准大致为：当EXT1表达量高于3.7±0.5×10^-2（相对于内参HPRT1）时，猪对病毒有抗性；表达量低于3.7±0.5×10^-2（相对于内参HPRT1）时，易感。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种基于EXT1的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物EXT1-F(forward primer EXT1-F)

<400> 1

cggactggag ctgaaagtgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物EXT1-R(reverse primer EXT1-R)

<400> 2

cctaaactgc aagcctccga 20

Claims

1.检测EXT1基因表达水平的试剂在制备检测诊断猪蓝耳病的产品方面的应用。

2.检测EXT1基因表达水平的试剂在制备检测诊断猪是否感染蓝耳病毒的产品方面的应用。

3.检测EXT1基因表达水平的试剂在筛选抗蓝耳病猪方面的应用。

4.检测EXT1基因表达水平的试剂在制备筛选抗蓝耳病猪的产品方面的应用。

5.EXT1在制备用于提高猪对蓝耳病毒的抗性药物方面的应用。

6.EXT1在培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。

7.EXT1表达激活剂在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。

8.一种筛选抗蓝耳病猪的方法，其特征在于，是通过检测猪体内EXT1表达水平来鉴别猪对蓝耳病毒是抗性或易感性。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，鉴别的标准是：EXT1表达量高的猪对蓝耳病毒具有抗性；反之具有易感性。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，鉴别的具体标准为：当EXT1相对于内参HPRT1的表达量高于3.7±0.5×10^-2时，猪对病毒有抗性；相对于内参HPRT1的表达量低于3.7±0.5×10^-2时，易感。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，检测猪体内EXT1表达水平的引物组包括上游引物EXT1-F和下游引物EXT1-R，序列分别如SEQ ID NO .1～2所示。