CN111973616A - 副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在提高鱼类免疫力中的应用 - Google Patents

副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在提高鱼类免疫力中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在提高鱼类免疫力中的应用。本发明研究表明，副溶血弧菌23S核糖体RNA及其保守序列VP13能识别TLR13并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞从而提高鱼体免疫力。可利用副溶血性弧菌23S核糖体RNA及其保守序列VP13刺激鱼类从而提高鱼类的天然免疫力，或用其制备提高鱼类免疫力的药物，从而预防鱼类病害。

Description

副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在提高鱼类免疫 力中的应用
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，更具体地，涉及副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在提高鱼类免疫力中的应用。
背景技术
副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐性细菌，在海洋环境中自然存在。常寄生于包括鳕鱼、沙丁鱼、鲭鱼、比目鱼、蛤、章鱼、虾、蟹、龙虾、扇贝和牡蛎在内的水生动物中。副溶血弧菌同时也是一种全球重要的海鲜病原传播体，被认为是导致人类胃肠炎、伤口感染和败血症的主要病因。在日本及中国台湾地区，食源性细菌诱发疾病的总数占很大比例。然而，西班牙和法国等国家只报告了零星的疫情。食用生的或未煮熟的海鲜，特别是被副溶血性弧菌污染的，可能导致急性胃肠炎的发展，其特征是腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部绞痛和低热，甚至可导致胃肠炎；甚至会对有肝病或免疫紊乱等潜在疾病的人构成生命威胁。同时，副溶血弧菌是水生动物弧菌病的主要病原菌，能够引起与组织损伤有关的炎症反应。
斜带石斑鱼是我国南方重要的海水养殖经济鱼类，随着养殖规模的不断扩大，养殖环境逐渐恶化，鱼病干扰日趋严重，给石斑鱼的养殖造成了困扰，同时也给我国渔业养殖造成了巨大的经济损失。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，传播速度快、致死率高、危害性大，是我国广东地区鱼、虾、贝类等水产经济作物的主要病原菌。目前，针对副溶血弧菌引起的免疫疾病的主要治疗手段还局限在抗生素水平。许多国家对普通抗生素的细菌耐药性已达到非常高的水平，这极有可能导致普通感染的现有治疗方案失效。因此，迫切需要开发替代生物防治剂。研究表明，两种III型分泌系统(T3SSS1、T3SSS2)是副溶血弧菌的毒力因子；携带TDH和TRH的分离株具有致病性，这两个基因分别编码溶血素耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH)，也被认为是副溶血性弧菌的主要毒力因子。此外，副溶血弧菌鞭毛蛋白是另外一种已被报道的毒力因子。但是，有研究表明，TDH和TRH基因敲除的菌株仍有毒性存在，这表明关于副溶血弧菌毒力因子的研究还不完全，尚待开发。在硬骨鱼中，当遭受外源细菌感染时，TLR13能够特异性识别细菌RNA以抵御病原菌的侵染。专利CN107557366A公开了一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因，然而，在鱼类遭受副溶血弧菌感染时TLR13能否参与该病原菌的抵御还不明确。此外，TLR13针对副溶血弧菌的特异性识别配体及介导的相应的免疫信号通路还有待于进一步研究。若是能激活、提高鱼类中天然免疫受体TLR13基因的表达，将有助于提高鱼类的免疫力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供副溶血弧菌23SrRNA及其保守序列VP13在提高鱼类免疫力中的应用
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明研究发现，副溶血弧菌23S核糖体RNA及其保守序列VP13能识别TLR13并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞从而提高鱼体免疫力。
因此，本发明首先提供副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在识别TLR13并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞和提高鱼类免疫力中的应用，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在制备提高鱼类免疫力的药物中的应用，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在制备预防鱼类病害药物中的应用，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种提高鱼类免疫力的方法，使用副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13刺激鱼的免疫细胞，通过识别TLR13并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞从而提高鱼类免疫力，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种用于提高鱼类免疫力的药物，含有副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，还包含药学上可接受的盐或载体。
优选地，所述鱼类为斜带石斑鱼。
优选地，所述鱼类病害病原菌为副溶血弧菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明研究表明，副溶血弧菌23S核糖体RNA及其保守序列VP13能识别TLR13并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞从而提高鱼体免疫力。因此可利用副溶血性弧菌23S核糖体RNA及其保守序列VP13刺激鱼类从而提高鱼类的天然免疫力，或用其制备提高鱼类免疫力的药物，从而预防鱼类病害。
附图说明
图1为副溶血弧菌总RNA凝胶电泳图。
图2为副溶血弧菌5S、16S、23S核糖体RNA基因克隆凝胶电泳图。
图3为副溶血弧菌5S、16S、23S核糖体RNA基因体外转录凝胶电泳图。
图4为副溶血弧菌总RNA刺激GS细胞时TLR13的表达。
图5为副溶血弧菌23S rRNA刺激GS细胞时TLR13的表达。
图6为副溶血弧菌VP13刺激GS细胞时TLR13的表达。
图7为副溶血弧菌RNA刺激敲降TLR13的GS细胞时细胞因子的表达。
图8为VPRNA刺激敲降TLR13的GS细胞时细胞因子的表达。
图9为VP13刺激敲降TLR13的GS细胞时细胞因子的表达。
图10为VP13能够与斜带石斑鱼TLR13直接结合。
图11为VPRNA和VP13刺激GS细胞能够增强IFNβ的荧光活性。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1副溶血弧菌总RNA的提取
1、副溶血弧菌的培养及复苏
(1)将保藏的甘油菌种从-80℃冰箱取出，待完全解冻后，涂布于TCBS细菌培养板(环凯，中国)，并于28℃恒温培养箱中培养至长出单菌落，约12-18h。
(2)挑取单菌落于5mL 2216E液体培养基中，过夜活化。2216E液体培养基配方如下：胰蛋白胨2.5g，酵母粉0.5g，氯化钠16.5g，去离子水500mL，调节PH至7.6-7.8。
(3)按照1:100的比例，将上述过夜活化菌株接种至30mL 2216E液体培养基扩培，培养至菌液OD＝0.6-0.8，大约2-3h。
(4)将上述扩培菌液平均分配到6个离心管中，在8000rpm/min,4℃条件下离心10min，弃上清并收集菌体。
(5)分别加入1mL TRIzol试剂，并用注射器反复抽吸混匀，12000rpm/min，4℃离心10min。
(6)将离心后上清转移至新的离心管，冰上静置5min后加入1/5体积的氯仿，涡旋震荡15s后于冰上静置3min。
(7)4℃，12000rpm/min离心15min，转水相至新的离心管并加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀，冰上静置30min。
(8)12000rpm/min，4℃离心10min，弃上清并加入1mL 75％预冷无水乙醇(由DEPC水配置)，混合均匀，7500rpm/min，4℃离心5min。
(9)弃上清，室温放置5-10min使无水乙醇充分挥发。
(10)加入30～50μL无RNase水溶解并测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳验证RNA提取质量，结果如图1所示，表明提取的RNA质量良好。
实施例2副溶血弧菌5S、16S、23S核糖体RNA基因克隆
1、副溶血弧菌DNA的提取
(1)我们使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，中国)提取副溶血弧菌总DNA，操作步骤如下：
(2)取副溶血弧菌1～5mL，室温10000rpm离心1min，充分吸掉上清并向菌体中加入200μL缓冲液GA，震荡处理至菌体彻底悬浮。
(3)向管中加入20μL的蛋白酶K，混合均匀。
(4)加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min至溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)加入220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时出现絮状沉淀，简短离心以去除内壁的水珠。
(6)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃废液。
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液。
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液。重复一次。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，弃废液。将CB3置于室温放置5min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心，将溶液收集到离心管中。
注：洗脱缓冲液的体积不少于50μL，以免影响回收效率。
2、副溶血弧菌核糖体RNA 5S、16S、23S核糖体RNA基因ORF片段扩增特异性引物，如下表1所示：
表1
Figure BDA0002586174280000051
3、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，割下预计大小条带，使用胶回收试剂盒(Omega)进行DNA回收，然后将纯化产物连接至pGEMT-easy载体。
4、将连接产物，转化至大肠杆菌DH5α后经LBAmp﹢培养板筛选，挑选阳性克隆测序。经拼接，得到副溶血弧菌核糖体5S、16S、23S核糖体RNA基因全长ORF片段，其扩增片段电泳结果如图2所示，副溶血弧菌核糖体5S、16S、23S核糖体RNA基因的ORF片段序列依次如SEQID NO:1～3所示，其长度分别为120bp，1471bp，2872bp。
5、经测序比对得到含有目的片段的质粒。
实施例3副溶血弧菌核糖体5S、16S、23S基因体外RNA合成
1、重组双链T7启动子线性化质粒的制备
(1)为了引入T7 RNA聚合酶启动子，首先将编码副溶血弧菌副溶血弧菌5S、16S、23S核糖体RNA基因的ORF序列克隆到pET28a(﹢)载体中，构建了带有双链T7启动子的表达载体pET28a-VP5S，pET28a-VP16S，pET28a-VP23S。构建上述重组表达载体所用引物及其序列如下表2所示：
表2
Figure BDA0002586174280000061
(2)用上述引物扩增带有T7 RNA聚合酶启动子的完整ORF编码序列，通过CloneExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞，中国)定向克隆到pET28a(﹢)载体。经测序验证，重组表达质粒含有预期的插入序列。
(3)为了获得带有双链T7启动子的PCR产物，以上述带有双链T7启动子的表达载体pET28a-VP5S，pET28a-VP16S，pET28a-VP23S为模板，进行PCR扩增，所用引物及其序列如下表3所示：
表3
Figure BDA0002586174280000062
(4)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，割下预计条带，使用胶回收试剂盒(Omega)进行DNA回收，DNA产物用RNase-free H2O溶解(浓度＞0.5μg/μL)。
(5)经测序，得到正确的PCR产物作为后续步骤的模板。
2、体外转录
本发明采用T7 High Yield RNA Transcription kit TR101(诺唯赞，中国)进行体外转录，具体操作步骤如下：
(1)按照步骤1进行体外转录PCR产物模板的制备。
(2)将T7 RNA Polymerase Mix外的组分震荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用。
(3)按照下表4配制反应体系：
表4
Figure BDA0002586174280000071
(4)用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育2h。
(5)在反应体系中加入1μL DNase I，37℃孵育15min，消化转录的DNA模板。
(6)合成的RNA经电泳分析、纯化后，可用于下游实验。
产物纯化(酚/氯仿纯化法)：
(7)加入160μL RNase-free H2O将产物稀释至180μL。
(8)加入20μL 3M的醋酸钠(pH 5.2)到稀释后的产物中，用移液器充分混匀。
(9)加入200μL的酚氯仿混合液(1:1)进行抽提，室温10000rpm离心5min，将上层溶液(水相)转至新的RNase-free EP管中。
(10)加入与水相等体积的氯仿抽提两次，收集上层水相。
(11)加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃孵育30min，4℃，15000rpm离心15min。
(12)弃上清并加入500μL预冷的70％乙醇洗涤RNA沉淀，4℃，15000rpm离心，弃上清。
(13)开盖干燥2min，加入20-50μL RNase-free H2O或其他缓冲液溶解RNA沉淀。
(14)-80℃保存。
(15)琼脂糖凝胶电泳验证体外转录效果，如图3所示，表明体外RNA合成成功。
实施例4副溶血弧菌弧菌各组分提取
1、副溶血弧菌总RNA的提取步骤参照实施例1。
2、副溶血弧菌总DNA的提取步骤参照实施例2。
3、副溶血弧菌总蛋白的提取
(1)取500mL培养至对数期的副溶血弧菌菌液，4℃，5000rpm/min离心20min，弃上清，收集菌体。
(2)用5mL预冷的0.15mol/L的NaCl溶液悬浮菌体，然后用1mol/L的HCl调整pH至2.0，在室温下磁力搅拌30min。
(3)4℃，5000rpm/min离心30min，将上清转移到新的离心管中，进一步4℃，14000rpm/min离心50min。
(4)上清液用1mol/L的NaOH调整pH至7.2，根据上清液的体积，在磁力搅拌下缓慢加入(NH42SO4至终浓度为2.67mol/L，4℃放置过夜。
(5)4℃，14,000rpm/min离心25min，收集沉淀，用5ml PBS悬浮蛋白沉淀，-80℃保存。
实施例5斜带石斑鱼TLR13特异性识别配体的筛选
1、细胞传代
(1)从培养箱中取出生长状态良好的GS细胞，倒掉培养基，加入1mL1×PBS洗去残留的培养基，弃废液。
(2)再加入1mL 1×PBS，洗去残留的培养基，弃废液。
(3)向瓶中加入600μL 37℃预热的胰蛋白酶溶液，使其没过细胞表面，室温孵育消化2min，使细胞变为圆球形。
(4)加入2mL L15培养基(含有10％FBS)终止消化，使用巴氏吸管吹打70-80次以将细胞分散为单个细胞。
(5)于显微镜下观察，确认大部分细胞分散为单细胞后，吸取300-500μL细胞悬液转移至新培养瓶中，并加入3-4mL完全培养基，于培养箱中培养，培养条件为：28℃，无CO2。
2、细胞铺板及刺激
(1)选取对数生长期的细胞，待细胞汇合度达到80-90％后，按照步骤1)消化细胞，制备细胞悬液。
(2)细胞计数，将大概1×104细胞/孔接种在96孔板中，于培养箱中培养，(培养条件为：28℃，无CO2)，24-36h后利用刺激剂进行刺激。
(3)将实施例1/2/3中所述的刺激物从-80℃取出。本研究使用的刺激剂包括副溶血弧菌5S、16S、23S核糖体RNA，脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、副溶血弧菌总RNA、副溶血弧菌总DNA、副溶血弧菌总鞭毛蛋白、副溶血弧菌23S核糖体RNA源的13-nt的保守序列VP13和其功能位点突变序列VP13 control，所述VP13和VP13 control的序列分别如SEQ ID NO:4～5所示，由(吉马，中国)合成。
(4)吸取适量的刺激剂刺激GS细胞。刺激终浓度为1μg/mL，1×PBS作为对照，刺激时间为12h。
3、细胞样品总RNA提取及反转录
使用Super
Figure BDA0002586174280000091
Cell Lysis Kit(Toyobo,日本)进行细胞总RNA的提取和cDNA模板的制备。按照制造商的指示，具体操作如下：
(1)去除培养基，每孔加入100μL 1×PBS洗涤细胞。
(2)去除PBS，每孔加入混匀的0.3μL gDNA Remover及49.7μL LysisSolution。用8道移液器(2-10μL)吹打30s，吹打后于室温消化4.5min。
(3)每孔加入混匀的0.5μL RNase Inhibitor及9.5μL Stop Solution。用8道移液器(2-10μL)吹打30s，吹打后于室温消化1.5min。
(4)吸取4μL细胞裂解液，加入16μL 5×RT Mastr Mix，混合均匀。按照以下程序进行PCR：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min；4℃，∞。
4、实时荧光定量PCR引物的设计
实时荧光定量PCR引物如表5所示：
表5
Figure BDA0002586174280000092
Figure BDA0002586174280000101
5、实时荧光定量PCR检测基因的表达
(1)参照Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒的说明书进行试验，每孔设置三个重复。
(2)将稀释好的cDNA样品加入384孔板，封板膜封板，于4℃，3700rpm条件下离心3-5min。
(3)将384孔板放入实时荧光定量PCR仪(Roche light cycler，LC480)中，按照以下程序进行反应：95℃，10min；45cycles(95℃，10s；57℃，20s；72℃，20s)；95℃，5s；65℃，1min；97℃，10s；40℃，10s。
(4)反应结束后，使用2-△△Ct法处理实验结果，并用GrapPad Prism 8.0软件进行作图分析，副溶血弧菌总RNA刺激结果如图4所示，副溶血弧菌总RNA刺激GS细胞能够促进TLR13的表达；经过RNaseA处理的副溶血弧菌总RNA刺激GS细胞不改变TLR13的表达。
副溶血弧菌VP5S rRNA、VP16S rRNA和VP23S rRNA刺激结果如图5所示，VP23SrRNA刺激GS细胞能够增强TLR13表达，而VP16S rRNA和VP5S rRNA则没有此增强效应。
VP13刺激GS细胞能够增强TLR13表达，其功能位点突变序列VP13 control则没有促进效应，结果如图6所示。
实施例6斜带石斑鱼TLR13基因敲降及基因表达检测
1、斜带石斑鱼TLR13基因敲降
(1)提前一天将GS细胞接种到96孔板中，每孔加入1μL已调整至合适数目的GS细胞(每孔细胞量约1×104)。各组均设置3个平行；次日待细胞长至50％～60％时即可转染，转染前将细胞培养基换为无血清的Opti-MEM培养液，稳定培养1h。
(2)将需要转染的TLR13-siRNA及Negative Control(浓度为0.72μg/mL，每孔0.3μL)加入5μL的Opti-MEM中，温柔混合。
(3)将Lipofectamine 3000reagent(每孔0.4μL)加入5μL的Opti-MEM中，混匀，室温放置5min。
(4)将以上两步骤中的混合液轻轻混匀，即为转染液，室温放置15min。
(5)于细胞培养板中，每孔加入转染液10μL，放置在27℃，无CO2的培养箱中孵育6h，换为含有10％FBS的L15细胞培养液。
(6)继续培养36h后收集细胞，提取RNA逆转录后用TLR13定量引物结合Real Time-qPCR分析基因表达情况，结果如图7所示，说GS细胞中TLR13表达量被成功敲降。
(7)斜带石斑鱼GS细胞TLR13基因敲降序列如下表6所示：
表6
Figure BDA0002586174280000111
2、细胞刺激
参照实施例5所述步骤刺激成功敲降TLR13的GS细胞，使用的刺激物为副溶血弧菌总RNA及VP13或VP13 control。
3、细胞样品总RNA提取及反转录
使用Super
Figure BDA0002586174280000112
Cell Lysis Kit(Toyobo，日本)进行细胞总RNA的提取和cDNA模板的制备。按照制造商的指示，具体操作如下：
(1)去除培养基，每孔加入100μL 1×PBS洗涤细胞。
(2)去除PBS，每孔加入混匀的0.3μL gDNA Remover及49.7μL LysisSolution。用8道移液器(2-10μL)吹打30s，吹打后于室温消化4.5min。
(3)每孔加入混匀的0.5μL RNase Inhibitor及9.5μL Stop Solution。用8道移液器(2-10μL)吹打30s，吹打后于室温消化1.5min。
(4)吸取4μL细胞裂解液，加入16μL 5×RT Mastr Mix，混合均匀。按照以下程序进行PCR：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min；4℃，∞。
4、实时荧光定量PCR检测基因的表达
(1)斜带石斑鱼GS细胞验证炎症因子的定量引物序列如下表7所示：
表7
Figure BDA0002586174280000121
(2)参照Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒的说明书进行试验，每孔设置三个技术重复。、
(3)将样品加入384孔反应板，封板膜封板，于4℃3700rpm条件下离心3-5min。
(4)将反应板放入实时荧光定量PCR仪(Roche light cycler，LC480)中，按照以下程序进行反应：95℃，10min；45cycles(95℃，10s；57℃，20s；72℃，20s)；95℃，5s；65℃，1min；97℃，0s；40℃，10s。
(5)反应结束后，使用2-△△Ct法处理实验结果，并用GrapPad Prism 8.0软件进行作图分析，副溶血弧菌总RNA刺激结果如图8所述，副溶血弧菌总RNA刺激敲降TLR13的GS细胞能够抑制TLR13相关炎症因子如IL-6，IL-12，IL-1β，TNFα的表达；经过RNaseA处理副溶血弧菌总RNA没有抑制效应。
VP13刺激结果如图9所示，VP13刺激敲降了TLR13的GS细胞能够抑制TLR13相关炎症因子如IL-6，IL-12，IL-1β，TNFα的表达，VP13 control则没有此效应。
实施例7斜带石斑鱼TLR13与VP13作用方式探究
采用PierceTM Magnetic RNA-Protein PμLl-Down Kit(赛默飞，美国)进行RNA-protein免疫共沉淀实验。具体操作步骤如下：
1、磁珠的处理
(1)取出磁珠，轻轻涡旋使磁珠充分重悬。
(2)用移液器吸取50μL磁珠至RNase-free的EP管中。
(3)将装有磁珠的RNase-free EP管置于磁力架上，使得磁珠收集在管子的一端。
(4)去上清，取2倍体积(100μL)0.1NaOH，50mM NaCl(Nuclease-free)洗涤磁珠，置于磁力架上，使得磁珠收集在管子的一端。重复两次。
(5)去上清，用100mM NaCl(nuclease-free)洗涤磁珠，置于磁力架上，使得磁珠收集在管子的一端。
(6)去上清，用50μL 20mM Tris(PH＝7.5)洗涤磁珠，置于磁力架上，使得磁珠收集在管子的一端。重复一次。
2、RNA与生物素磁珠连接
(1)去上清，加入50μL 1×RNA Capture Buffer。
(2)将生物素标记的RNA(VP13和VP13 control)加入预处理的磁珠中，用移液器轻吸混匀。
(3)室温搅动孵育15-30min。
3、蛋白与生物素标记RNA结合
(1)将步骤3)中连接有RNA的磁珠置于磁力架上，使得磁珠收集在管子的一端，去上清。
(2)用50μL的20mM Tris(PH＝7.5)洗涤磁珠，置于磁力架上，使得磁珠收集在管子的一端。重复一次。
(3)用ΜLtrapure Water将10×protein RNA Binding Buffer稀释成1×。
(4)在磁珠中加上100μL 1×protein RNA Binding Buffer，混匀。
(5)加入如下表8所述RNA-protein Binding反应体系：
表8
Figure BDA0002586174280000131
(6)将上述混合物轻轻涡旋，4℃搅动处理30-60min。置于磁力架上，使得磁珠收集在管子的一端，将上清转移到新的RNase-free EP管中用作后续分析。
(7)用100μL 1×Wash Buffer洗涤RNA-protein-bound磁珠，重复两次。
(8)加入50μL Elution Buffer到磁珠中，涡旋混匀，37℃搅动15-30min。
(9)将上述洗脱产物置于磁力架上，使得磁珠收集在管子的一端，将上清转移到新的RNase-free EP管中用作后续分析。
(10)将上述洗脱样品于100℃煮10min。
5、蛋白免疫印迹
(1)通过SDS-PAGE分离连接有RNA的蛋白，80V，20min使得蛋白迁移到统一水平线上；120V，55-60min彻底分开蛋白。
(2)200mA电流湿转1h 30min，将蛋白转移到PVDF膜上。
(3)用含5％BSA的TBS-T室温封闭2h。
(4)按照1:5000的比例加入Anti-His antibody，4℃孵育过夜。
(5)次日，用TBS-T洗膜5次，每次5min。
(6)用含有5％BSA的TBS-T稀释Goat-anti-Mouse IgG(H+L)，稀释比例为1:5000，室温孵育1h。
(7)用TBS-T洗膜5次，每次5min。
(8)用ECL发光液孵育样品膜，并用Alliance MINI HD9 system检测，目的蛋白大小为130KDa，其结果如图10所示，VP13能够与TLR13直接结合发挥作用，且VP13 control的单点突变并不影响二者结合。
实施例9TLR13对IFNβ通路的影响
前面的实施例证明VPRNA和VP13是TLR13的配体，能够激活TLR13的信号通路，我们采用双荧光素酶报告实验探索VPRNA和VP13对于TLR13信号通路的影响。具体操作步骤如下：
(1)按照实施例5中所示步骤进行细胞悬液制备，并将细胞均匀分配到24孔细胞培养板中，培养条件为：37℃，5％CO2。
(2)将300ng TLR13-pcDNA4.0或者pcDNA4.0与200ng IFNβ-Luc及5ng TKRenillia vectors共转染到HEK293T细胞。
(3)转染24h后，分别用VPRNA(1μg/mL)和VP13(10μg/mL)(VP13-1：带有生物素标记的VP13和VP13-2：不带有生物素标记的VP13)刺激上述HEK293T细胞，刺激时间为18h。
(4)吸掉培养基，并用PBS洗涤细胞两次，每孔加入50μL 1×Passive LysisBuffer，室温温和震荡裂解细胞15min。
(5)取20μL细胞裂解液于96孔酶标板中，于Promega双荧光检测酶标仪中设定程序：加入50μL LARII溶液以检测萤火虫荧光素酶活性，加入50μL Stop&Glo溶液以淬灭萤火虫荧光素酶荧光、激活并检测海肾荧光素酶荧光活性。
(6)萤火虫荧光素酶荧光强度与海肾荧光素酶荧光强度比值表示各样品启动活性强度，通过Prism 8.0进行数据分析，结果如图11A、B所示，副溶血弧菌VP13和VPRNA刺激过表达TLR13的HEK293T细胞能够增强IFNβ的荧光活性，VP13 control则不影响IFNβ的荧光活性。
上述结果表明，副溶血性弧菌23S核糖体RNA及其保守序列VP13可识别TLR13并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞从而提高鱼体免疫力中，可利用副溶血性弧菌23S核糖体RNA及其保守序列VP13提高鱼类的免疫力，制备预防鱼类病害的药物。
序列表
<110> 中山大学
<120> 副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在提高鱼类免疫力中的应用
<141> 2020-07-15
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)
<400> 1
tgcttggcga ccatagcgtt ttggacccac ctgactccat tccgaactca gaagtgaaac 60
gaaatagcgc cgatggtagt gtggggtttc cccatgtgag agtaggacat cgccaggctt 120
<210> 2
<211> 1471
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)
<400> 2
attgaagagt ttgatcatgg ctcagattga acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt 60
cgagcggaaa cgagttatct gaaccttcgg ggaacgataa cggcgtcgag cggcggacgg 120
gtgagtaatg cctaggaaat tgccctgatg tgggggataa ccattggaaa cgatggctaa 180
taccgcatga tgcctacggg ccaaagaggg ggaccttcgg gcctctcgcg tcaggatatg 240
cctaggtggg attagctagt tggtgaggta agggctcacc aaggcgacga tccctagctg 300
gtctgagagg atgatcagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc 360
agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg cgtgtgtgaa 420
gaaggccttc gggttgtaaa gcactttcag tcgtgaggaa ggtagtgtag ttaatagctg 480
cattatttga cgttagcgac agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta 540
atacggaggg tgcgagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcatgc aggtggtttg 600
ttaagtcaga tgtgaaagcc cggggctcaa cctcggaatt gcatttgaaa ctggcagact 660
agagtactgt agaggggggt agaatttcag gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgaa 720
ggaataccgg tggcgaaggc ggccccctgg acagatactg acactcagat gcgaaagcgt 780
ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt ctacttggag 840
gttgtggcct tgagccgtgg ctttcggagc taacgcgtta agtagaccgc ctggggagta 900
cggtcgcaag attaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 960
ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatccaga gaactttcca 1020
gagatggatt ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1080
tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt gtttgccagc 1140
gagtaatgtc gggaactcca gggagactgc cggtgataaa ccggaggaag gtggggacga 1200
cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg gcgcatacag 1260
agggcggcca acttgcgaaa gtgagcgaat cccaaaaagt gcgtcgtagt ccggattgga 1320
gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat cgtggatcag aatgccacgg 1380
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggctgcaaaa 1440
gaagtaggta gtttaacctt cggggggacg c 1471
<210> 3
<211> 2891
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)
<400> 3
ggttaagtga ctaagcgtac acggtggatg ccttggcagt cagaggcgat gaaagacgta 60
gtaacttgcg ataagcccag attaggtagt aacaaccatt tgagtctggg atttctgaat 120
ggggaaaccc acgtgcataa gcacgtatcc ttacctgaat acatagggta aggaggcgaa 180
ccgggggaac tgaaacatct aagtaccccg aggaaaagaa atcaaccgag attccgaaag 240
tagcggcgag cgaaattgga ctagccctta agctttacac gcgttagacg aacggtctgg 300
gaagtccgac gatacagggt gatagtcccg tagttgacga cgtgtgttca gtgaaatcga 360
gtagggcggg acacgtgata tcctgtctga atatgggggg accatcctcc aaggctaaat 420
actactgact gaccgatagt gaaccagtac cgtgagggaa aggcgaaaag aacccctgtg 480
aggggagtga aatagaacct gaaaccgtgt acgtacaagc agtaggagca ggctttgtcc 540
tgtgactgcg taccttttgt ataatgggtc agcgacttat attcagtggc aaggttaacc 600
atctagggga gccgtaggga aaccgagtct taactgggcg ttcagtctct ggatatagac 660
ccgaaaccag gtgatctagc catgggcagg ttgaaggttg agtaacatca actggaggac 720
cgaaccgact aatgttgaaa aattagcgga tgacttgtgg ctaggggtga aaggccaatc 780
aaacctggag atagctggtt ctccccgaaa gctatttagg tagcgcctcg gacgaatact 840
actgggggta gagcactgtt aaggctaggg ggtcatcccg acttaccaac cctttgcaaa 900
ctccgaatac cagtaagtac tatccgggag acacacggcg ggtgctaacg tccgtcgtgg 960
agagggaaac aacccagacc gccagctaag gtcccaaatt actactaagt gggaaacgat 1020
gtgggaaggc tcagacagcc aggatgttgg cttagaagca gccatcattt aaagaaagcg 1080
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gaagctgcgg caatgtgctt ttgcacattg ggtaggggag cgttctgtaa gcggttgaag 1200
gtgtgtggta acgcatgctg gacgtatcag aagtgcgaat gctgacatga gtaacgataa 1260
agggggtgaa aaacctcctc gccggaagac caagggttcc tgtccaacgt taatcggggc 1320
agggtaagtc gacccctaag gcgaggccga aaggcgtagt cgatgggaaa cgggttaata 1380
ttcccgtact tcttacaatt gcgatggggg gacggagaag gctaggtggg cctggcgacg 1440
gttgtccagg ttcaagtgcg taggcttaag agttaggtaa atccggctct ttttaaggct 1500
gagacacgac gtcgagcatc tacggatgtg aagtcattga tgccatgctt ccaggaaaag 1560
cctctaagct tcagattgta aggaatcgta ccccaaaccg acacaggtgg tcgggtagag 1620
aataccaagg cgcttgagag aactcgggtg aaggaactag gcaaaatggt accgtaactt 1680
cgggagaagg tacgctctcg acggtgaagt ccctcgcgga tggagctatt gagagtcgca 1740
gataccaggt ggctgcaact gtttattaaa aacacagcac tgtgcaaaat cgtaagatga 1800
cgtatacggt gtgacgcctg cccggtgccg gaaggttaat tgatggggtt agacttcggt 1860
cgaagctctt gatcgaagcc ccggtaaacg gcggccgtaa ctataacggt cctaaggtag 1920
cgaaattcct tgtcgggtaa gttccgacct gcacgaatgg cgtaatgatg gccacgctgt 1980
ctccacccga gactcagtga aattgaaatc gctgtgaaga tgcagtgtac ccgcggctag 2040
acggaaagac cccgtgaacc tttactacaa cttggcactg aacattgacc ctacatgtgt 2100
aggataggtg ggaggctttg aagcacgtac gccagtatgt gtggagccgt ccttgaaata 2160
ccacccttgt agtgttgatg ttctaacgtc gaccccttat cggggttgcg gacagtgcct 2220
ggtgggtagt ttgactgggg cggtctcctc ccaaagagta acggaggagc acgaaggtgg 2280
gctaatcacg gttggacatc gtgaggttag tgcaatggca taagcccgct tgactgcgag 2340
aatgacaatt cgagcaggtg cgaaagcagg tcatagtgat ccggtggttc tgaatggaag 2400
ggccatcgct caacggataa aaggtactcc ggggataaca ggctgatacc gcccaagagt 2460
tcatatcgac ggcggtgttt ggcacctcga tgtcggctca tcacatcctg gggctgaagt 2520
cggtcccaag ggtatggctg ttcgccattt aaagtggtac gcgagctggg tttagaacgt 2580
cgtgagacag ttcggtccct atctgccgtg ggcgttggaa gattgaaggg ggctgctcct 2640
agtacgagag gaccggagtg gacgaacctc tggtgttcgg gttgtgtcgc cagacgcatt 2700
gcccggtagc taagttcgga atcgataacc gctgaaagca tctaagcggg aagcgagccc 2760
tgagatgagt cttccctgat actttaagta tcctaaaggg ttgtcggaga ctacgacgtt 2820
gataggtcag gtgtgtaagt gctgtgaggc attgagctaa ctgatactaa ttgcccgtga 2880
ggcttaacca t 2891
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)
<400> 4
acggaaagac ccc 13
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)
<400> 5
acgggaagac ccc 13

Claims (8)

1.副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在识别TLR13并激活其介导的细胞因子受体系统信号通路、活化免疫细胞和提高鱼类免疫力中的应用，其特征在于，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
2.副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在制备提高鱼类免疫力的药物中的应用，其特征在于，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
3.副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13在制备预防鱼类病害药物中的应用，其特征在于，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种提高鱼类免疫力的方法，其特征在于，使用副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13刺激鱼的免疫细胞，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
5.一种用于提高鱼类免疫力的药物，其特征在于，含有副溶血弧菌23S rRNA和/或其保守序列VP13，所述副溶血弧菌23S rRNA的序列如SEQ ID NO:3所示，其保守序列VP13序列如SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的盐或载体。
7.根据权利要求1～3任一所述的应用或权利要求4所述的方法或权利要求5或6所述的药物，其特征在于，所述鱼类为斜带石斑鱼。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鱼类病害病原菌为副溶血弧菌。
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