CN112007143B

CN112007143B - 重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用

Info

Publication number: CN112007143B
Application number: CN202010839593.6A
Authority: CN
Inventors: 卢丹琪; 于雪; 何良格; 张勇; 林浩然
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2040-08-19
Also published as: CN112007143A

Abstract

本发明公开了重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。本发明发现重组副溶血弧菌鞭毛蛋白能够诱导相关免疫基因表达并参与相应免疫信号通路的激活，显著提高鱼类的免疫力，有望开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂，进而预防或治疗副溶血弧菌引起的鱼类病害；因此，重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力、制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂中的应用前景良好。

Description

重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性、嗜盐、嗜中温、杆状细菌，常见于热带、温带海洋，在世界各地的沿海生境和河口地区自然分布。经常从各种海产品中分离出来，包括鳕鱼、沙丁鱼、鲭鱼、比目鱼、蛤、章鱼、虾、蟹、龙虾、扇贝和牡蛎等。这种细菌被认为是导致人类胃肠炎、伤口感染和败血症的主要病因。食用生的或未煮熟的海鲜，特别是被副溶血性弧菌污染的贝类，可能导致急性胃肠炎的发展，其特征是腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部绞痛和低热，甚至可导致胃肠炎患者死亡。同时，对有肝病或免疫紊乱等潜在疾病的人也能构成生命威胁。同时，副溶血弧菌是水生动物弧菌病的主要病原菌，可引起与组织损伤有关的炎症。

石斑鱼是热带地区的重要的海水养殖经济鱼类，随着养殖规模不断变大，养殖环境逐渐恶化，鱼病干扰日趋严重，给石斑鱼的养殖造成了巨大的经济损失。副溶血弧菌传播速度快，致死率高，危害性大，是广东地区鱼、虾、贝类的主要病原菌。目前，针对副溶血弧菌引起的免疫疾病的主要手段还局限在抗生素水平。许多国家对普通抗生素的细菌耐药性已达到非常高的水平，这可能导致针对普通感染的现有治疗方案失效。因此，迫切需要开发替代生物防治剂。

研究表明，两种III型分泌系统(T3SSS1、T3SSS2)是副溶血弧菌的毒力因子；携带TDH和TRH的分离株具有致病性，这两个基因分别编码耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH)，被认为是副溶血性弧菌的主要毒力因子。此外，副溶血弧菌鞭毛蛋白是另外一种已被报道的毒力因子。它是副溶血弧菌鞭毛的主要组成部分，主要参与调控细菌运动并在细菌粘附及入侵宿主细胞的过程中起到主要作用。与多数弧菌种类相同，副溶血弧菌鞭毛蛋白由多种鞭毛蛋白基因编码的蛋白构成。在哺乳动物中，副溶血弧菌鞭毛蛋白作为TLR5和NLRC4的特异性识别配体，二者特异性结合并借助MyD88依赖的信号途径引起相关的炎症反应。在硬骨鱼中，TLR5也能够参与细菌鞭毛蛋白的识别以抵御副溶血弧菌的感染。本发明人先前的研究表明，斜带石斑鱼TLR5M(公开日为2019年6月28日、公开号为CN109943651A的中国发明专利)和TLR5S(公开日为2018年12月14日、公开号为CN108997491A的中国发明专利)均能够参与副溶血弧菌鞭毛蛋白的识别并激活MAPK/NF-kB信号通路，诱导IFNγ2，IL-6，TNFα表达。副溶血弧菌鞭毛蛋白由鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF六个组分组成，然而，副溶血弧菌众多鞭毛蛋白组分中，真正的功能组分还尚未确定。各组分在副溶血弧菌引起的免疫反应中的主要功能，及各组分功能之间的协调关系还需要进一步研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有鱼类抵御副溶血弧菌感染免疫防治方法的缺陷和不足，提供重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。

本发明的目的是提供重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。

本发明另一目的是提供重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂中的应用。

本发明另一目的是提供重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备预防或治疗鱼类病害的药物中的应用。

本发明另一目的是提供一种提高鱼类免疫力的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现，重组副溶血弧菌鞭毛蛋白能够诱导相关免疫基因表达并参与相应免疫信号通路的激活，显著提高鱼类的免疫力，进而预防或治疗由副溶血弧菌引起的病害，有望开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂；因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。

重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂中的应用，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。

重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在制备预防或治疗鱼类病害的药物中的应用；所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。

优选地，编码副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的ORF片段的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～6所示。

优选地，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:7～12所示。

优选地，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaC。

优选地，所述鱼类病害为副溶血弧菌引起的病害。

优选地，所述鱼类为石斑鱼。

更优选地，所述石斑鱼为斜带石斑鱼。

本发明还提供了一种提高鱼类免疫力的方法，利用所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白刺激鱼的免疫细胞；所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE或FlaF中的任意一种或几种。

优选地，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白为FlaC。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用。本发明研究发现，重组副溶血弧菌鞭毛蛋白能够诱导相关免疫基因表达并参与相应免疫信号通路的激活，显著提高鱼类的免疫力，进而预防或治疗由副溶血弧菌引起的病害，有望开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂；因此，重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力、制备鱼类免疫增强剂或免疫佐剂、以及预防或治疗鱼类病害的药物中均有良好的应用价值。

附图说明

图1是副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF基因ORF片段的PCR凝胶电泳图，其中，M代表Marker。

图2是pET28a载体图谱。

图3是原核表达载体pET28a经XhoI酶切验证凝胶电泳图，其中，M代表Marker，1代表原核表达载体pET28a经XhoI酶切产物。

图4是重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF表达形式验证图，其中，M代表Marker，1代表对照组，2代表无IPTG诱导组，3代表经0.5mMIPTG诱导组，4代表超声波破碎后菌体组，5代表超声波破碎后菌液上清组。

图5是重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF蛋白纯化最佳洗脱条件验证图，其中，M代表Marker，1代表50mM咪唑浓度的洗脱液，2代表100mM咪唑浓度的洗脱液，3代表200mM咪唑浓度的洗脱液，4代表250mM咪唑浓度的洗脱液，5代表300mM咪唑浓度的洗脱液，6代表350mM咪唑浓度的洗脱液，7代表500mM咪唑浓度的洗脱液。

图6是副溶血弧菌FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF重组蛋白验证图；其中，Anti-His代表6x His标签抗体，VPFlaA、VPFlaB、VPFlaC、VPFlaD、VPFlaE、VPFlaF分别代表副溶血弧菌FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF重组蛋白。

图7是重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF对EcTLR5M表达量的影响结果图，其中，EcTLR5M代表斜带石斑鱼TLR5M，PBS代表磷酸盐缓冲液，PGN代表肽聚糖。

图8是重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF对EcTLR5M启动子活性的影响结果图，其中，EcTLR5M promoter代表斜带石斑鱼TLR5M启动子，relativeluciferase activity代表相对荧光活性，control代表对照组，VP Flagellin蛋白副溶血弧菌总鞭毛蛋白，VPFlaA、VPFlaB、VPFlaC、VPFlaD、VPFlaE、VPFlaF分别代表副溶血弧菌FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF重组蛋白。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF基因的克隆

1、实验方法

(1)副溶血弧菌DNA的提取

我们使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，中国)提取副溶血弧菌总DNA，操作步骤如下：

①取副溶血弧菌3mL，室温10000rpm离心1min，尽量吸去上清并向菌体中加入200μL缓冲液GA，震荡处理至菌体彻底悬浮。

②向管中加入20μL的蛋白酶K，混合均匀。

③加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min至溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

④加入220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时出现絮状沉淀，简短离心以去除内壁的水珠。

⑤将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃废液。

⑥向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液。

⑦向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液。重复一次。

⑧将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，弃废液。将CB3置于室温放置5min，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。

⑨将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加125μL洗脱缓冲液TE，室温放置3.5min，12000rpm离心，将溶液收集到离心管中。

注：洗脱缓冲液的体积不少于50μL，以免影响回收效率。

(2)利用表1中的特异性引物扩增副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF基因ORF片段：

表1

(3)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，割下预计条带，使用胶回收试剂盒(Omega)进行DNA回收，然后将纯化产物连接至pGEMT-easy载体。

(4)将连接产物，转化至大肠杆菌DH5α后经LB^Amp﹢培养板筛选，挑选阳性克隆测序，拼接。

2、实验结果

编码副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的ORF片段的PCR凝胶电泳图如图1所示，其中，编码副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的ORF片段的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～6所示，核苷酸序列的大小依次为1125bp，1134bp，1152bp，1134bp，1122bp，1131bp；重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:7～12所示，氨基酸序列的大小依次为376aa，378aa，384aa，398aa，384aa，377aa；预测蛋白的大小依次为39.78KDa，40.16KDa，40.81KDa，42.56KDa，40.84KDa，40.56Kda。

实施例2重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF原核表达载体的构建

1、实验方法

(1)为了引入His融合标签，首先将编码副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的ORF片段克隆到pET28a(﹢)载体(pET28a载体图谱如图2所示)中，构建了His融合标签的原核表达载体pET28a-flaA，pET28a-flaB，pET28a-flaC，pET28a-flaD，pET28a-flaE，pET28a-flaF。构建上述原核表达载体所用引物及其序列如表2所示。

(2)用表2所示引物扩增带有融合标签His的完整ORF编码序列，通过CloneExpressII One Step Cloning Kit(诺唯赞，中国)定向克隆到pET28a(﹢)载体。

表2

2、实验结果

原核表达载体pET28a经XhoI酶切验证凝胶电泳图如图3所示，经测序验证，重组表达载体含有预期的插入序列。

实施例3重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的原核表达

1、实验方法

(1)将实施例2中得到的序列正确的原核表达载体pET28a-flaA，pET28a-flaB，pET28a-flaC，pET28a-flaD，pET28a-flaE，pET28a-flaF转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经LB^Kan﹢培养板37℃过夜培养。

(2)挑取单菌落于5mL LB^Kan﹢液体培养基中，37℃，200rpm过夜活化。

(3)以1:100的比例接种至50mL新鲜的LB^Kan﹢液体培养基中，37℃，200rpm培养2.5h使得OD600＝0.6-0.7。

(4)加入IPTG至终浓度为0.5mM，25℃，200rpm诱导培养4h。

(5)取500μL菌液，4℃，10000rpm离心收集菌体，用40μL的PBS重悬菌体，加入5×SDS上样缓冲液，100℃处理10min，随后通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。

(6)将剩余菌液，4℃，10000rpm离心收集菌体，加入20mL Binding Buffer进行菌体重悬，使用低温均质机破碎菌体(800W，5.5min)。4℃，10000rpm离心15min，分别收集破碎上清和沉淀。

(7)取40μL破碎上清液，加入5×SDS上样缓冲液(20μL)，100℃处理10min，随后通过SDS-PAGE分析蛋白表达形式，剩余上清液于-80℃暂存。

(8)用20mL Binding Buffer进行菌体重悬，取40μL菌悬液，加入5×SDS上样缓冲液(20μL)，100℃处理10min，随后通过SDS-PAGE分析蛋白表达形式。

2、实验结果

重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF表达形式验证图如图4所示，可以看出，重组副溶血弧菌蛋白，包括FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF能够在0.5mM IPTG的诱导下产生，且均能够以可溶性和包涵体两种形式存在；其中，可溶性形式具有功能活性。

实施例4重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的纯化

1、实验方法

1)对能够成功表达重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的菌体进行破碎，收集上清，经0.45μm滤膜过滤去除杂质，通过His-trap蛋白纯化柱对目的蛋白进行纯化。纯化步骤如下：

①蛋白纯化柱的平衡

(1)用注射器抽取5mL ddH₂O清洗蛋白纯化柱。

(2)用注射器抽取5mL Elution Buffer过柱。

(3)用注射器抽取10mL Binding Buffer平衡柱子。

②加入过滤后上清，密封，轻柔混合均匀，4℃静置2.5h，期间小心混合均匀。

③用注射器抽取5mL Wash Buffer洗涤蛋白纯化柱。

④用注射器分别抽取咪唑浓度为50mM、100mM、200mM、250mM、300mM、350mM、500mM的Elution Buffer对目的蛋白进行洗脱。

⑤取40μL上述不同咪唑浓度Elution Buffer的目的蛋白洗脱液，加入5×SDS上样缓冲液(20μL)，100℃处理10min，随后通过SDS-PAGE分析最佳的洗脱液咪唑浓度。

⑥用注射器抽取10mL ddH₂O清洗蛋白纯化柱，以1mL 20％无水乙醇封柱。

2)蛋白超滤

①将上述目的蛋白洗脱液加入到超滤管中，4℃，4000/7500rpm离心10min。

②弃废液，向超滤管内缓慢加入2mL 1×PBS，4℃，4000/7500rpm离心10min。

③重复步骤②两次。

④向超滤管中加入250μL 1×PBS，用200μL枪头轻轻吹打混匀，避免气泡生成。

⑤所得的重组蛋白经蛋白冻干机处理成粉末状，-80℃保存。

⑥采用Westrn Blot验证重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF纯化效果。

2、实验结果

重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF蛋白纯化最佳洗脱条件验证图如图5所示，可以看出，各个重组鞭毛蛋白的最佳洗脱条件是不同的，其中FlaA的最佳洗脱条件是350mM咪唑浓度洗脱液；FlaB的最佳洗脱条件是500mM咪唑浓度洗脱液；FlaC的最佳洗脱条件是250mM咪唑浓度洗脱液；FlaD和FlaE的最佳洗脱条件是300mM咪唑浓度洗脱液；FlaE的最佳洗脱条件是50mM咪唑浓度洗脱液。

将最佳洗脱浓度条件下的重组蛋白洗脱液进行纯化和超滤，副溶血弧菌FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF重组蛋白验证如图6所示，可以看出，本发明得到了较纯的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF。实施例5重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF的活性检测

1、对EcTLR5M表达量的影响

(1)实验方法

1)细胞传代

①从培养箱中取出生长状态良好的GS细胞，倒掉培养基，加入1mL 1×PBS洗去残留的培养基，弃废液。

②再加入1mL 1×PBS，洗去残留的培养基，弃废液。

③往瓶中加入600μL 37℃预热的胰蛋白酶溶液，使其没过细胞表面，室温孵育消化2min，使细胞变为圆球形。

④加入2mL完全培养基终止消化，使用巴氏吸管将细胞吹打分散为单个细胞。

⑤于显微镜下观察，确认细胞大部分分散为单细胞后，吸取400μL细胞悬液转移至新培养瓶中，并加入3.5mL完全培养基，于培养箱中培养，培养条件为：28℃，无CO₂。

2)细胞铺板及刺激

①选取对数生长期的细胞，待细胞汇合度达到85％后，按照步骤1)消化细胞，制备细胞悬液。

②细胞计数，将大概1×10⁴细胞/孔接种在96孔板中，于培养箱中培养(培养条件为：28℃，无CO₂)30h后利用刺激剂进行刺激。

③将冻干处理的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF从-80℃取出，用50μL的1×PBS将其稀释成蛋白悬浮液，并用Nanodrop 2000测量蛋白浓度。

④吸取适量的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF悬浮液刺激GS细胞，刺激终浓度为1μg/mL，1×PBS作为对照，刺激时间为12h。

3)细胞样品总RNA提取及反转录

使用SuperCell Lysis Kit(Toyobo，日本)进行细胞总RNA的提取和cDNA模板的制备。按照制造商的指示，具体操作如下：

①去除培养基，每孔加入100μL 1×PBS洗涤细胞。

②去除PBS，每孔加入混匀的0.3μL gDNA Remover及49.7μL Lysis Solution。用8道移液器(6μL)吹打30s，吹打后于室温消化4.5min。

③每孔加入混匀的0.5μL RNase Inhibitor及9.5μL Stop Solution。用8道移液器(6μL)吹打30s，吹打后于室温消化1.5min。

④吸取4μL细胞裂解液，加入16μL 5×RT Mastr Mix，混合均匀。按照以下程序进行PCR：37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min；4℃，∞。

4)实时荧光定量PCR检测基因的表达

利用表3所示的实时荧光定量PCR引物进行实时荧光定量PCR检测，具体步骤如下：

①参照Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒的说明书进行试验，每孔设置三个技术重复。

②将样品加入384孔反应板，封板膜封板，于4℃，3700rpm条件下离心4min。

③将反应板放入实时荧光定量PCR仪(Roche light cycler，LC480)中，按照以下程序进行反应：95℃，10min；45cycles(95℃，10s；57℃，20s；72℃，20s)；95℃，5s；65℃，1min；97℃，0s；40℃，10s。

④反应结束后，使用2^-△△Ct法处理实验结果，并用GrapPad Prism 8.0软件进行作图分析。

表3

(2)实验结果

重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF对免疫相关基因EcTLR5M表达量的影响结果如图7所示，可以看出，在副溶血弧菌鞭毛蛋白各组分中，FlaC能够显著增强EcTLR5M的表达，FlaD也具有增强效应，但是作用没有FlaC明显；表明FlaC作为主要的副溶血弧菌鞭毛蛋白组分参与斜带石斑鱼的免疫调节。

2、对EcTLR5M启动子活性的影响

(1)实验方法

1)细胞传代

①从培养箱中取出生长状态良好的HEK 293T细胞，倒掉培养基，加入1mL1×PBS洗去残留的培养基，弃废液。

②再加入1mL 1×PBS，洗去残留的培养基，弃废液。

③往瓶中加入500μL 37℃预热的胰蛋白酶溶液，使其没过细胞表面，室温孵育消化1min，使细胞变为圆球形。

⑤于显微镜下观察，确认细胞大部分分散为单细胞后，吸取400μL细胞悬液转移至新培养瓶中，并加入3.5mL完全培养基，于培养箱中培养，培养条件为：37℃，5％CO₂。

⑥选取对数生长期的细胞，待细胞汇合度达到85％后，按照上述步骤消化细胞，制备细胞悬液。

⑦细胞计数，将大概2×10⁵细胞/孔接种在48孔板中，于培养箱中培养(培养条件为：37℃，5％CO₂)24h后进行细胞转染。

2)细胞转染

①参照jetPRIME transfection reagent(DNA tansfection)试剂盒说明书进行细胞转染。具体操作如下：

②转染时每孔加入50ng报告基因(pGL4/pGL4-EcTLR5M-pro)，5ng pRL-TK质粒。

③用20μL jet PRIME Buffer稀释50ng报告基因和5ng pRL-TK质粒，涡旋10s，混合均匀。

④上述混合液中加入0.4μL/孔jetPRIME reagent，涡旋10s，混合均匀，于室温孵育10min。

⑤将上述转染混合液按照20μL/孔的比例加入到细胞培养液中，于培养箱中培养，(培养条件为：37℃，5％CO₂)。

⑥转染后4h，更换新的完全培养基。(可选做)

⑦于培养箱中培养，培养条件为：37℃，5％CO₂，培养时间为24h。

3)细胞铺板及刺激

②细胞计数，将大概2×10⁵细胞/孔接种在48孔板中，于培养箱中培养(培养条件为：37℃，5％CO₂)30h后，利用刺激剂进行刺激。

④吸取适量的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF悬浮液刺激GS细胞，刺激终浓度为1μg/mL，1×PBS作为对照，刺激时间为6h。

4)双荧光素酶报告实验

①按照步骤3)进行HEK 293T细胞转染和细胞刺激后收集细胞。

②细胞收样：去除培养基并用200μL 1×PBS洗涤一次。

③去除1×PBS，每孔加入200μL 1×Passive Lysis Buffer，室温震荡裂解15min。

④吸取20μL细胞裂解液于48孔酶标板中，设定双荧光检测酶标仪参数(Promega，USA)，每孔先后加入50μL LARII溶液和50μL Stop&Glo溶液进行荧光活性检测。

⑤获得萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性强度比值，并用GrapPad Prism 8.0软件进行作图分析。

(2)实验结果

重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD、FlaE、FlaF对EcTLR5M启动子活性的影响结果如图8所示，可以看出，在副溶血弧菌鞭毛蛋白各组分中，FlaC能够显著增强EcTLR5M启动子报告基因活性，FlaE/F也具有增强效应，但是作用没有FlaC明显；表明FlaC作为主要的副溶血弧菌鞭毛蛋白各组分参与斜带石斑鱼的免疫调节。

经初步鉴定，FlaC能够诱导相关免疫基因表达并参与相应免疫信号通路的激活，有望开发为天然鱼类免疫增强剂或免疫佐剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 重组副溶血弧菌鞭毛蛋白在提高鱼类免疫力中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcgatta acgttaatac taacgtttct gcgatgaccg cacagcgtta cctaaaccac 60

gcggctgaag gtcaacaaaa atcaatggag cgtttgtctt cgggttataa aatcaatagc 120

gcgaaagatg atgctgcagg tctacagatt tcaaaccgtt tgaacgctca aagccgtggc 180

ctagacatgg cggtgaaaaa cgcgaacgac ggtatctcca ttgcacaggt tgctgaaggt 240

gcaatgaatg aatctaccaa catcctacag cgtatgcgtg acctatcgct tcaatctgcg 300

aacggttcta actcaaaagc agaacgtgta gcgatccaag aagaagtaac agcgctaaac 360

gacggactaa accgtatcgc tgaaacaacc tctttcggtg gtaacaaact gcttaacggt 420

acgtacggta ctcaatcttt ccaaatcggt gcggactctg gcgaagctgt aatgctttct 480

atgggcagcc tacgttctga tacttcagca atgggtggta agagctactc agcagaagaa 540

ggtaaagatg catcttggac agttggtgat aaaactgagc ttaaaatgag ctacaccaac 600

aaacaaggtg aagagaaaga acttaccatc aaggctaagc aaggcgacga catcgagcag 660

ctagcaactt acatcaacgg tcaaagcgaa gatgtaaaag cgtctgttgg tgaagacggc 720

aagctacaag tatttgcttc tactcagaaa gtaaatggtg aagttgagtt ctctggcaac 780

ctagctggcg agatcggttt tggtgatgcg aaagacgtaa cggttaaaga catcgacgta 840

acaacggttg caggctctca agaagctgta gcagttatcg acggtgcact taaatcagta 900

gacagccaac gtgcgtcact aggtgctttc cagaaccgtt tcaaccacgc aatcagcaac 960

ctagacaaca ttaacgaaaa cgttaatgca tctaacagcc gtattaaaga tactgattac 1020

gcgaaagaaa caacagcgat gactaagtcg caaattcttc agcaagcaag tacttcaatc 1080

ctggctcaag cgaagcagtc accatctgca gcgctaagct tgttgggcta a 1131

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcagtga atgtaaacac taacgtatca gcgatgaccg cgcagcgtta cctaaacaac 60

gcaaactcag cacaacaaac ctcaatggag cgtttgtctt caggtttcaa aatcaacagc 120

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ctggatgtgg ctgttcgcaa cgcgaacgac ggtatctcta ttgcacaaac tgctgaaggt 240

gcaatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctgtctct acaatcagca 300

aacggctcaa actcgaaagc agagcgcgtt gcgattcaag aagaagtgac agcactaaac 360

gacgaactaa accgtatcgc agaaaccaca tcttttggtg gtaacaagct actaaacggc 420

acacatggtg cgaaatcgtt ccaaatcggt gctgataacg gtgaagcagt aatgcttgag 480

cttaaagaca tgcgctcaga caacaaaatg atgggcggtg tgagctacca agctgaaagc 540

ggtaaaggca aagactggaa cgttgcacaa ggcaaaaacg acctaaaaat cagcctaaca 600

gacagctttg gtcaagagca agaaatcaac atcaacgcga aagcgggcga tgacatcgaa 660

gagctagcaa cgtacatcaa tggtcaaaca gacctagtga aagcgtcagt agaccaagat 720

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agcaacttgg acaacattaa cgagaacgtg aacgcgtcga agagccgtat caaagatacc 1020

gacttcgcga aagaaacgac ggcaatgacc aagtcacaaa ttctatcgca agcgtcaagc 1080

tcaatccttg cgcaagcgaa acaagcgcca aactcagcgc taagtcttct aggttaa 1137

<210> 3

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctgtaa cagttagtac taacgtctcc gcgatgaccg cgcagcgtta cttaaataaa 60

gcgaccaacg agctgaatac ctcgatggag cgtctatcat caggtcacaa aattaacagt 120

gcaaaagacg atgcagcagg tctgcagatc tctaaccgtc taacggcaca gtctcgtggt 180

cttgatgtgg caatgcgtaa cgcgaacgat ggtatctcta tcgctcaaac ggctgaaggt 240

gcgatgaacg aagcaacgtc agtgatgcag cgtatgcgtg acttggctat ccagtcatca 300

aacggtacta actctccagc tgagcgtcag gcaatcaacg aagaatcaat ggcgttggtt 360

gacgaactga accgtatcgc agaaaccaca tcattcggtg gtcgtcgtct attgaacggc 420

tcattcggtg aagcggcatt ccaaatcggt gcgagctctg gtgaagcgat gatcatgggt 480

ctaactagta ttcgtgcaga tgacactcgt atgggcggtg tgacattctt ctctgaagta 540

ggaaaaggta aagattgggg tgttgatcca actaaagccg atctaaaaat cacgcttcct 600

ggcatgggtg aagacgaaga tggtaatgtt gatgatctag aaatcaatat caacgcgaaa 660

gcgggtgatg acatcgaaga gctagcaacg tacatcaatg gtcaatcaga catgatcaac 720

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gacatctcga tctctggtgg tcttgcttct gagctaggcc taagcgatca gccagtaaga 840

acatcagtac aagatattga tatgacaacg gttcaaggtt ctcagaacgc gatttctgta 900

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cgtctgagcc acagcatcaa caacttggca aatatccaag aaaacgttga cgcgtcgaac 1020

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tcactattgc agtag 1155

<210> 4

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcagtga atgtaaacac taacgtatca gcgatgaccg ctcagcgtta cctaaacaac 60

gcaaactcag cacaacaaac ctcaatggag cgtttgtctt caggtttcaa aatcaacagc 120

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ctggatgtgg ctgttcgcaa cgcgaacgac ggtatctcta ttgcacaaac tgctgaaggt 240

gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctgtctct acaatcagca 300

aacggctcaa actcgaaagc agagcgcgtt gcgattcaag aagaagtgac agcactaaac 360

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ggtaaaggca aagactggaa cgttgcacaa ggcaaaaacg acctaaaaat cagcctaact 600

gacagctttg gtcaagagca agaaatcaac atcaacgcga aagcgggcga tgacatcgaa 660

gagctagcaa cgtacatcaa cggtcaaaca gacctagtga aagcgtcagt agaccaagat 720

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ggtctatctg gtgaactagg cctaggcgac gacaagaaaa acgttacggt tgatactatc 840

gacgtaactt cggttggcgg cgcacaagaa tcagtcgcga tcattgatgc ggcactgaaa 900

tacgtagaca gccaccgtgc agagctgggt gcattccaga accgtttcaa ccatgcaatc 960

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gacttcgcga aagaaacgac ggcaatgacc aagtcacaaa ttctatcgca agcgtcaagc 1080

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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gaattggatc gtgtggcaat cacgacgaca ttcgcggata aaaacctctt taatggctct 420

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accattaacc ggagtgtttt ggaatcaaaa gggcgaattc gagatacaga ctttgctcgg 1020

gagtcgacag aaatggtgcg ctcgcaggtg ctgcaggatg cgacaactgc attactcgct 1080

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<210> 6

<211> 1134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggctatca ccgttaatac caatgttgca gcacttgtcg cacaacgtca tttgaccagt 60

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gcaaaagatg acgcggcagg cctgcaaatc tccaatcgtc tgcaatcaca aatgcgtggt 180

ttggatgtgg cggttcgtaa cgctaatgat ggcatctcca tcatgcaaac cgcagaaggc 240

gcgatgaatg aggtgacgaa catcatgcaa cgtatgcgtg atttgtcgct tcagtcggct 300

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aatctagata acatccacga aaacttagcg gcatcgaaca gtcgtattca agatactgat 1020

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<210> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 8

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ser Ala Met Thr Ala Gln Arg

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Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met Glu Arg Leu

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ser Ala Met Thr Ala Gln Arg

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu

35 40 45

Gln Ile Ser Asn Arg Leu Gln Ser Gln Met Arg Gly Leu Asp Val Ala

50 55 60

Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Met Gln Thr Ala Glu Gly

65 70 75 80

Ala Met Asn Glu Val Thr Asn Ile Met Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser

85 90 95

Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Gln Ala Glu Arg Thr Ala Leu

100 105 110

Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg Ile Ala Glu

115 120 125

Thr Thr Ser Phe Gly Gly Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Phe Gly Lys

130 135 140

Ser Ser Phe Gln Ile Gly Ala Ala Ser Gly Glu Ala Val Gln Ile Glu

145 150 155 160

Leu Lys Ser Met Arg Thr Asp Gly Leu Glu Met Gly Gly Phe Ser Tyr

165 170 175

Val Ala Gln Gly Arg Ala Asp Ser Asp Trp Gln Val Lys Glu Asn Ala

180 185 190

Asn Asp Leu Thr Met Ser Phe Thr Asn Arg Ser Gly Glu Thr Glu Lys

195 200 205

Ile Gln Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Ala Thr

210 215 220

Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Lys Val Thr Ala Ser Val Asn Glu Lys

225 230 235 240

Gly Gln Leu Gln Ile Phe Met Ala Gly Glu Glu Thr Ala Gly Thr Ile

245 250 255

Ser Phe Ser Gly Asp Leu Ala Ser Glu Leu Gly Met Ser Leu Lys Gly

260 265 270

Tyr Asp Ala Val Asn Asn Leu Asn Ile Thr Thr Val Gly Gly Ala Gln

275 280 285

Gln Ala Val Ala Val Leu Asp Thr Ala Met Lys Phe Val Asp Ser Gln

290 295 300

Arg Ala Glu Leu Gly Ala Tyr Gln Asn Arg Phe Asn His Ala Ile Asn

305 310 315 320

Asn Leu Asp Asn Ile His Glu Asn Leu Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ile

325 330 335

Gln Asp Thr Asp Tyr Ala Lys Glu Thr Thr Gln Met Val Lys Gln Gln

340 345 350

Ile Leu Gln Gln Val Ser Thr Thr Ile Leu Ala Gln Ala Lys Gln Ala

355 360 365

Pro Asn Leu Ala Leu Thr Leu Leu Gly

370 375

Claims

1.重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaC在制备斜带石斑鱼免疫增强剂或免疫佐剂中的应用，其特征在于，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaC的ORF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

2.包含表达重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaC的ORF片段的核苷酸序列的表达载体在制备预防由副溶血弧菌引起的斜带石斑鱼病害的药物中的应用，其特征在于，所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaC的ORF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。