CN114980750A

CN114980750A - 用于抑制细菌毒素以治疗水生动物早期死亡综合征的系统、方法和组合物

Info

Publication number: CN114980750A
Application number: CN202080076007.5A
Authority: CN
Inventors: E·西内瓦; T·特拉弗斯; T·维诺格拉多夫-沙阿; E·帕森斯; D·巴莱斯特罗斯; R·塞尔; S·佛拉特雷
Original assignee: Pebble Labs Inc
Current assignee: Pebble Labs Inc
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-08-30
Also published as: US20220313783A1; WO2021046401A1

Abstract

本发明涉及用于竞争性地抑制在动物系统中表达的细菌毒素，并且优选地，抑制由影响水生动物的病原菌产生的毒素的新型系统、方法和组合物。本发明一方面包括通过使用截短PirB^Vp肽作为竞争抑制剂来减少细胞毒性PirA^Vp/PirB^Vp二聚体复合物的形成来治疗虾类早期死亡综合征(EMS)的方法和组合物。

Description

用于抑制细菌毒素以治疗水生动物早期死亡综合征的系统、方法和组合物

本申请要求享有2020年9月5日提交的美国临时申请第62/896,034号的权益和优先权。上述申请的整个说明书和附图特此通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且其特此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年9月4日，名称为“90115-00491-序列表-AF.txt”，大小为22.9千字节。

技术领域

整体而言，本发明技术涉及用于竞争性地抑制在动物系统中表达的细菌毒素，并且优选地，抑制由影响水生动物的病原菌产生的毒素的新型系统、方法和组合物。

背景技术

急性肝胰腺坏死病(AHND)，也称为早期死亡综合征(EMS)，已成为影响虾养殖的最具破坏性的疾病之一。EMS已经严重影响了中国、越南、马来西亚、泰国、墨西哥等东西半球数个国家的水产养殖业。在一些情况下，EMS的爆发对虾养殖种群造成了80％的惊人损失。EMS是由弧菌(Vibrio)属菌种引起的，其可通过口腔传播。这些弧菌属菌种定植于虾的胃肠道并产生毒素，该毒素导致被称为肝胰腺的虾消化器官的组织破坏和功能障碍。EMS通常会在放养后20至30天内影响后期幼体虾，并经常导致高达100％的死亡率。目前，没有可用的方法来治疗EMS。预防EMS爆发或治疗EMS的传统策略实际上可能会加剧疾病传播。例如，尝试对池塘底部和水体进行全面消毒以杀死可能的EMS病媒实际上可能有助于EMS疾病的流行传播，而不是通过消除潜在的竞争性微生物种群来对其进行控制。

如上所述，副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(或弧菌属菌种)是EMS的致病菌株，并含有一个质粒，该质粒编码名为PirAB^Vp的两基因操纵子。PirA^Vp毒素和PirB^Vp毒素，在本文中通常分别称为PirA和PirB，在结构上类似于来自Photorhabidus的杀虫PirA毒素和杀虫PirB毒素。这两种毒素都在虾胃中产生，并通过破坏肝胰腺上皮细胞导致虾死亡。单独的PirA或PirB不会导致死亡，并且仅结合作为PirAB二元毒素时表现出动物毒性。因此，即使PirB被提议包含膜成孔结构域和受体结合结构域两者，单独的重组PirB毒素也不会导致虾病或虾死亡。如图1A所示，要成为活性毒素，PirA和PirB必须相互作用。虽然PirA/PirB的复合物形成已得到证实，但尚不完全清楚这两种毒素如何相互结合。在持续输送一个或多个抑制剂分子的益生菌的帮助下预防PirA/PirB相互作用可能是一种有价值且经济上可持续的EMS疾病预防策略。

发明内容

整体而言，本发明技术涉及用于控制致病因子的新策略。本发明的一个目的可以包括灭活由靶病原体产生的毒素，从而抑制宿主生物体中的细菌毒素和/或细菌的致病活性。在一方面，本发明技术可以包括用于通过使用基因工程改造供体微生物来治疗或预防早期死亡综合征(EMS)的新型系统、方法和组合物，其中该基因工程改造供体微生物为例如细菌，其表达能够结合到毒素蛋白的功能位点的经修饰的毒素肽或类似重组肽，并且该毒素蛋白可以竞争性地抑制和/或灭活导致EMS的致病性弧菌属菌种产生的毒素。

本发明还涉及基因修饰供体细菌的用途，该供体细菌可以被配置为产生可以竞争性地抑制真核系统中的毒素活性的经修饰的毒素肽。可以进一步改变这些经修饰的毒素肽以竞争性地抑制其相应的由致病因子产生的野生型毒素的活性。在一个优选实施例中，本发明可包括用于抑制由病原菌(例如致EMS的弧菌属菌种)产生的毒素的活性的组合物和方法。在一个优选方面，本发明涉及产生基因工程改造细菌，并且优选地产生虾共生、内共生或益生菌细菌，其被配置为竞争性地灭活弧菌属菌种产生的毒素，已知这些毒素是EMS的病原体。

在一方面，本发明可包括经修饰的PirB毒素，其被配置为抑制由致EMS的弧菌属菌种产生的PirA/PirB二聚体复合物(有时称为Pir或Pir二元毒素(PirA/PirB))的形成的活性。在一个优选方面，经修饰的PirB毒素可包括截短PirB肽，并且优选地包括编码蛋白质-蛋白质界面残基的截短PirB，即PirA和PirB之间的氨基酸残基263-438。在该优选方面，经修饰的PirB毒素可包括截短PirBΔ1-262肽，其可进一步与分泌信号结构域偶联，如Ybxl分泌信号。

在另一优选方面，经修饰的PirB毒素可包括截短PirB肽，并且优选地可包括截短PirBΔ1-262肽，该肽可以在位置276、367或395处包括一个或多个点突变，其增加截短PirBΔ1-262肽与PirA的结合亲和力。在该优选方面，截短PirBΔ1-262肽可包括一个或多个选自由以下组成的群组的点突变：F276S、A367T、P395Y或其任何组合。在另一优选实施例中，截短PirBΔ1-262肽可包括一个或多个选自由以下组成的群组的点突变的组合：F276S/A367T、F276S/P395Y、A367T/P395Y和F276S/A367T/P395Y。

在另一优选方面，经修饰的PirB毒素可包括被配置为竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物形成的PirB肽片段。在该优选方面，PirB肽片段可包括与PirA的结合界面的全部或部分。

在另一方面，本发明包括用于通过使用基因工程改造细菌来治疗或预防水生动物如虾EMS的系统、方法和组合物，其中该基因工程改造细菌表达一种或多种经修饰的PirB肽，该经修饰的PirB肽被配置为竞争性地抑制野生型PirA/PirB二聚体复合物的形成的活性，如上所述，二聚体复合物形成致病性二元细菌毒素。在该优选方面，本发明包括治疗水生动物EMS的方法，其包括将治疗有效量的截短PirB肽和/或截短PirB肽片段施用于水生动物，并且优选地施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的虾。在该方面，可以将治疗有效量的经修饰的PirB肽，如截短PirB肽和/或PirB肽片段直接施用于目标动物，或通过经工程改造以表达PirB肽片段的供体细菌施用。

本发明另一方面包括产生含有基因修饰细菌或其孢子的经处理的饲料或液体接种物，其被配置为表达经修饰的PirB肽，该经修饰的PirB肽被配置为竞争性地抑制由弧菌属种群产生的野生型PirA/PirB二聚体复合物的形成的活性，从而预防或治疗EMS的影响。可将经处理的饲料或液体接种物引入病原体易感或受病原体影响的种群，优选地引入水生动物，如在水产养殖中生长的虾。

本发明的另一方面包括通过基因修饰细菌表达经修饰的PirB肽，该基因修饰细菌可以作为预防性保护或疫苗以使虾对病原体产生的毒素进行免疫。因此，本发明的一方面可以包括使用基因修饰细菌来定植和连续表达经修饰的PirB肽，这些肽被配置为竞争性地抑制野生型PirA/PirB二聚体复合物的形成的活性，从而提供水生动物对EMS的个体或群体免疫，如在水产养殖系统中生长的虾种群。

本发明的其他方面可包括以下优选实施例中的一个或多个：

1.一种用于治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的组合物，其包含经修饰的PirB肽，其中所述经修饰的PirB肽竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述经修饰的PirB肽包含截短PirB肽。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述截短PirB肽包含PirBΔ1-262肽。

4.根据实施例2至3中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽包含根据SEQ IDNO.3的氨基酸序列。

5.根据实施例2至4中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽与分泌信号结构域偶联。

6.根据实施例2至5中任一项所述的组合物，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含与YbxI分泌信号偶联的截短PirB肽。

7.根据实施例2至5中任一项所述的组合物，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含根据SEQ ID NO.4的氨基酸序列。

8.根据实施例5至7中任一项所述的组合物，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQ ID NO.14的分泌信号。

9.根据实施例2至8中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽进一步包含具有选自由以下组成的群组的一个或多个突变的截短PirB肽：F276S、A367T、P395Y或其任何组合。

10.根据实施例2至8中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽进一步包含选自由以下组成的群组的截短PirB肽：SEQ ID NO.5-11。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PirA/PirB复合物包含二聚体复合物，其中PirA包含根据SEQ ID NO.1的序列，并且PirB包含根据SEQ ID NO.2的序列。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述EMS是由弧菌(Vibrio)属菌种引起的。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述水生生物包含虾。

14.一种治疗水生动物EMS的方法，其包含将治疗有效量的根据实施例1至11中任一项所述的经修饰的PirB肽施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的水生动物，其中所述经修饰的PirB肽竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水生生物包含虾。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据实施例1至11中任一项所述的截短PirB肽。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据实施例1至11中任一项所述的截短PirB肽，其中所述供体细菌被掺入经处理的饲料或液体接种物中。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述供体细菌包含益生菌供体细菌。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述益生菌供体细菌包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

20.一种治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的方法，其包括以下步骤：

-产生供体微生物以表达与启动子可操作地连接的编码经修饰的PirB肽的异源多核苷酸，所述经修饰的PirB肽被配置为竞争性地抑制由致EMS的细菌性病原体产生的PirA/PirB二聚体复合物的形成；

-将所述基因修饰供体微生物引入受所述致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的目标宿主；

-表达所述异源经修饰的PirB肽；以及

-抑制由致EMS的细菌性病原体产生的所述PirA/PirB二聚体复合物的形成。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述经修饰的PirB肽包含截短PirB肽。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述截短PirB肽包含PirBΔ1-262肽。

23.根据实施例21至22中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽包含根据SEQID NO.3的氨基酸序列。

24.根据实施例22至23中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽与分泌信号结构域偶联。

25.根据实施例22至24中任一项所述的方法，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含与YbxI分泌信号偶联的截短PirB肽。

26.根据实施例22至24中任一项所述的方法，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含根据SEQ ID NO.4的氨基酸序列。

27.根据实施例24至27中任一项所述的方法，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQ ID NO.14的分泌信号。

28.根据实施例22至27中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽进一步包含具有选自由以下组成的群组的一个或多个突变的截短PirB肽：F276S、A367T、P395Y或其任何组合。

29.根据实施例22至27中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽进一步包含选自由以下组成的群组的截短PirB肽：SEQ ID NO.5-11。

30.根据权利要求20所述的方法，其中所述PirA/PirB复合物包含二聚体复合物，其中PirA包含根据SEQ ID NO.1的序列，并且PirB包含根据SEQ ID NO.2的序列。

31.根据权利要求20所述的方法，其中所述致EMS的细菌性病原体包含弧菌属菌种。

32.根据权利要求20所述的方法，其中所述水生生物包含虾。

33.根据权利要求20所述的方法，其中所述供体微生物包含供体细菌。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述供体细菌包含枯草芽孢杆菌。

35.一种用于治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的组合物，其包含PirB肽片段，其中所述PirB肽片段竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述PirB肽片段包含编码与PirA结合界面的一部分的PirB肽片段。

37.根据实施例35至36中任一项所述的组合物，其中所述PirB肽片段包含选自由以下组成的群组的PirB肽片段：SEQ ID NO.16-19。

38.根据实施例35至36中任一项所述的组合物，其中所述PirB肽片段通过连接子结构域与分泌信号结构域偶联。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQ IDNO.14的分泌信号。

40.根据权利要求35所述的组合物，其中所述PirA/PirB复合物包含二聚体复合物，其中PirA包含根据SEQ ID NO.1的序列，并且PirB包含根据SEQ ID NO.2的序列。

41.根据权利要求35所述的组合物，其中所述EMS是由弧菌属菌种引起的。

42.根据权利要求35所述的组合物，其中所述水生生物包含虾。

43.一种基因修饰微生物，其表达与启动子可操作地连接的编码根据实施例35至40中任一项所述的截短PirB肽的异源多核苷酸。

44.一种基因修饰微生物，其表达与启动子可操作地连接的异源多核苷酸，其中所述异源多核苷酸编码选自由以下组成的群组的肽：SEQ ID NO.3-4和5-11。

45.根据实施例43至44中任一项所述的微生物，其中所述微生物包含供体细菌。

46.根据权利要求45所述的微生物，其中所述供体细菌包含枯草芽孢杆菌。

47.一种治疗水生动物EMS的方法，其包含将治疗有效量的根据实施例35至40中任一项所述的PirB肽片段施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的水生动物，其中所述PirB肽片段竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述水生生物包含虾。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据实施例35至40中任一项所述的PirB肽片段。

50.根据权利要求47所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据实施例35至40中任一项所述的PirB肽片段，其中所述供体细菌被掺入经处理的饲料或液体接种物中。

51.根据实施例49至50中任一项所述的方法，其中所述供体细菌包含益生菌供体细菌。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述益生菌供体细菌包含枯草芽孢杆菌。

53.一种治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的方法，其包括以下步骤：

-产生供体微生物以表达与启动子可操作地连接的编码PirB肽片段的异源多核苷酸，所述PirB肽片段被配置为竞争性地抑制由致EMS的细菌性病原体产生的PirA/PirB二聚体复合物的形成；

-表达所述异源PirB肽片段；以及抑制由致EMS的细菌性病原体产生的所述PirA/PirB二聚体复合物的形成。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述PirB肽片段包含编码与PirA结合界面的一部分的PirB肽片段。

55.根据实施例53至54中任一项所述的方法，其中所述PirB肽片段包含选自由以下组成的群组的PirB肽片段：SEQ ID NO.16-19。

56.根据实施例53至54中任一项所述的方法，其中所述PirB肽片段通过连接子结构域与分泌信号结构域偶联。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQ IDNO.14的分泌信号。

58.根据权利要求53所述的方法，其中所述PirA/PirB复合物包含二聚体复合物，其中PirA包含根据SEQ ID NO.1的序列，并且PirB包含根据SEQ ID NO.2的序列。

59.根据权利要求53所述的方法，其中所述致EMS的细菌性病原体包含弧菌属菌种。

60.根据权利要求53所述的方法，其中所述水生生物包含虾。

61.一种基因修饰微生物，其表达与启动子可操作地连接的编码根据实施例35至40中任一项所述的PirB肽片段的异源多核苷酸。

62.一种基因修饰微生物，其表达与启动子可操作地连接的异源多核苷酸，其中所述异源多核苷酸编码选自由以下组成的群组的肽：SEQ ID NO.16-19。

63.根据实施例61至62中任一项所述的细菌，其中所述微生物包含供体细菌。

64.根据实施例63所述的细菌，其中所述供体细菌包含枯草芽孢杆菌。

65.一种分离肽，其选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.3-4、5-11和16-19。

66.一种分离核苷酸序列，其编码选自由以下组成的群组的肽：SEQ ID NO.3-4、5-11和16-19。

67.一种分离核苷酸序列，其编码选自由以下组成的群组的经修饰的PirB肽：SEQID NO.12-13。

68.一种表达载体，其包含根据实施例66至67中任一项所述的核苷酸序列，其可操作地连接启动子。

69.一种微生物，其用根据实施例68所述的表达载体转化。

本发明的其他方面将从下面的详细附图和描述中彰显。

附图说明

图1示出了PirA/PirB的结构模型(A)和Δ1-262PirB^Vp PB-Sr的截短变体(B)，以及具有对PirA预测的增强的亲和力的Δ1-262PirB^Vp PB-Sr的截短变体的F276S/A367T/P395Y突变衍生物(C)。

图2示出了PB-Sr分泌肽的构建体设计。(A)设计用于在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中高效表达PB-Sr分泌变体的质粒图谱。(B)PB-Sr分泌变体的示意图。

图3示出了PirA^Vp/PirB^Vp的表达模式。pirA^Vp/pirB^Vp操纵子的表达(A)在副溶血性弧菌培养(C)的静止期受σS定向启动子(下划线，B)调节。PirA毒素在细菌生长(D)期间以高浓度积聚在弧菌细胞中。

图4示出了通过枯草芽孢杆菌BCG322(pAD-PB-Sr)表达PB-Sr降低了副溶血性弧菌的细胞毒性。副溶血性弧菌上清液对人体细胞的细胞毒性在副溶血性弧菌生长的静止期最大-条形图。枯草芽孢杆菌BCG322(pAD-PB-Sr)与副溶血性弧菌共同生长降低了细胞毒性。至少3个生物学重复的比率的平均值显示为带有标准误差的点。

图5示出了用BCG322-PB-Sr饲养虾降低了感染副溶血性弧菌期间的虾死亡率。阳性对照-用BCG322-pLuc饲养的虾。阴性对照-无副溶血性弧菌感染。

图6示出了PirB衍生肽214-WADNDSYNNANQDNVYDEVMGAR-236(SEQ ID NO.16)对PirA具有高亲和力，如柔性对接所示。基于PirB^Vp的肽(显示为深灰色表面)在与PirA^Vp柔性对接(显示为浅灰色卡通)之前(A)和之后(B)的构象变化的样本比较。

图7示出了PirB和PirA的结构。被认为参与或不参与PirB/PirA相互作用的区域分别为蓝色(深灰色)和红色(浅灰色)。N末端区域中推定的成孔结构域被认为由于形成后的构象变化而暴露。

具体实施方式

如上所述，EMS是虾养殖中由致病性弧菌属，即哈维氏弧菌和副溶血性弧菌引起的最具破坏性的疾病之一。受感染虾的死亡是由于PirA/PirB毒素复合物破坏虾肝胰腺上皮细胞所致。PirA毒素和PirB毒素两者的存在及其相互作用是毒性所必需的。如图1A所示，蛋白质结构分析显示PirB具有2个具有不同结构特征的结构域。N端结构域含有成孔元素，负责破坏宿主细胞膜；并且C端结构域参与受体结合和与PirA蛋白的相互作用。

在一个优选实施例中，本发明的组合物可包括经修饰的PirB毒素，并且优选地可包括编码PirB的C端结构域的全部或部分的截短PirB肽。在一个优选实施例中，截短PirB肽可以用作治疗组合物，用于治疗水生生物如虾的早期死亡综合征(EMS)。在该实施例中，截短PirB肽可包括缺失N端结构域，该结构域含有可包含残基1-262的成孔元素。该截短PirBΔ1-262肽(SEQ ID NO.3)可以作为PirB的竞争性抑制剂，其通过竞争性抑制肝胰腺细胞上的毒素特异性受体和/或通过抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成使PirA/PirB毒性失去活化作用。

为了帮助本发明的经修饰的PirB肽更好地与野生型PirB(SEQ ID NO.2)竞争并结合PirA(SEQ ID NO.1)，防止活性PirA/PirB二元毒素形成及其与细胞膜的相互作用，它可以与分泌信号结构域偶联。例如，如图2B所示，截短PirBΔ1-262肽(SEQ ID NO.3)可以与分泌信号结构域直接偶联，或通过连接肽或其他化合物，如聚乙二醇(PEG)连接子与分泌信号结构域偶联。在一个优选实施例中，本发明的截短PirBΔ1-262肽可以与来自枯草芽孢杆菌的YbxI分泌信号(SEQ ID NO.14)偶联，形成可分泌的截短PirBΔ1-262肽(SEQ ID NO.14)，如下详述，其可以在供体细菌中表达并分泌到细胞外环境中，在该环境中它可以竞争性地抑制PirB与PirA的结合能力，从而防止活性PirA/PirB二元毒素的形成。

可以进一步引入特定点突变，其增加本发明的经修饰的PirB肽对PirA的结合亲和力，从而增加其对PirA/PirB二聚体复合物形成的竞争性抑制。例如，经修饰的PirB肽可包括截短PirB肽，并且优选地可包括截短PirBΔ1-262肽，该肽可以在位置276、367或395处包括一个或多个点突变，其增加截短PirBΔ1-262肽对PirA(SEQ ID NO.1)的结合亲和力。在一个优选方面，截短PirBΔ1-262(SEQ ID NO.3)肽可包括一个或多个选自由以下组成的群组的点突变：F276S(SEQ ID NO.5)、A367T(SEQ ID NO.6)、P395Y(SEQ ID NO.7)或其任何组合。在另一优选实施例中，截短PirBΔ1-262肽可包括置换突变的组合，其增加截短PirBΔ1-262肽对PirA(SEQ ID NO.1)的结合亲和力，PirA选自由以下组成的群组：F276S/A367T(SEQ ID NO.8)、F276S/P395Y(SEQ ID NO.9)、A367T/P395Y(SEQ ID NO.10)和F276S/A367T/P395Y(SEQ ID NO.11)。

本发明技术进一步包括治疗水生动物EMS的方法，并且优选地治疗虾EMS的方法，其包括将治疗有效量的经修饰的PirB肽施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的水生动物。优选实施例可包括施用治疗有效量的根据SEQ ID NO.3-11的截短PirBΔ1-262肽，其中截短PirB肽竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。可以将截短PirB肽直接施用于水生动物，如虾，例如通过注射。在替代实施例中，本发明的截短PirB肽可以通过经工程改造以表达截短PirB的供体细菌施用。例如，可以鉴定与目标宿主共生、内共生或益生菌(通常称为“益生菌”)的细菌菌株，该目标宿主可优选地包括水生动物宿主，更优选地包括水产养殖产生的虾宿主。示例性的内共生细菌可包括由Sayre等人在PCT/US2018/045687中鉴定的大肠杆菌或肠杆菌菌株Agl，或由Sayre等人在PCT/US2018/045687中鉴定的枯草芽孢杆菌菌株(BG322)，所有这些通过引用并入本文。

这些益生菌可以经基因修饰以包括与启动子可操作地连接的核苷酸序列，该启动子表达截短PirB肽，如根据SEQ ID NO.3-11的那些截短PirB肽。表达截短PirB肽的基因修饰益生菌可以优选地施用于水生动物，例如通过经处理的饲料或液体接种物方法-补充有来自益生菌的细菌或细菌孢子的此类饲料和接种物是本领域普通技术人员容易知道的。即使在水产养殖环境中存在高水平的弧菌感染，施用治疗有效量的表达截短PirB肽的基因修饰益生菌也可能在环境中持续存在，并提供持续的局部保护以免受弧菌毒素的侵害，并且无需重复施用。

本发明可以具体包括一种治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的方法，其包括以下步骤：产生供体微生物以表达与启动子可操作地连接的编码经修饰的PirB肽，并且优选地为根据SEQ ID NO.3-11的截短PirB肽的异源多核苷酸，这些肽被配置为竞争性地抑制由致EMS的细菌性病原体产生的PirA/PirB二聚体复合物的形成。优选地可包括如枯草芽孢杆菌的虾益生菌菌株的供体微生物可以被引入目标宿主，如水产养殖环境中的虾，该宿主被所述致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染。在该实施例中，供体微生物可以定植于虾中并表达所述异源修饰的PirB肽，并且优选地表达根据SEQ ID NO.3-11的截短PirB肽，其可以进一步分泌到细胞外，在此它可以抑制由目标宿主中致EMS的细菌性病原体产生的PirA/PirB二聚体复合物的形成。

在一个优选实施例中，本发明的组合物可包括经修饰的PirB肽，并且优选地可包括编码与PirA结合界面结构域的全部或部分的PirB肽片段。在一个优选实施例中，PirB肽片段可以用作用于治疗水生生物如虾的早期死亡综合征(EMS)的治疗组合物。在该实施例中，PirB肽片段可包括位于可与PirA相互作用的残基214和残基401之间的PirB片段。此类PirB肽片段可以作为PirB的竞争性抑制剂，其通过竞争性抑制肝胰腺细胞上的毒素特异性受体和/或通过抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成使PirA/PirB毒性失去活化作用。在一个具体实施例中，PirB肽片段可包括选自由以下组成的群组的肽：SEQ ID NO.16-19。在一个可选实施例中，PirB肽片段可以与分泌信号结构域直接偶联，或通过连接肽或其他化合物，如聚乙二醇(PEG)连接子与分泌信号结构域偶联。在一个优选实施例中，本发明的PirB肽片段可以与来自枯草芽孢杆菌的YbxI分泌信号(SEQ ID NO.14)偶联，形成可分泌的PirB肽片段，如下详述，其可以在供体细菌中表达并分泌到细胞外环境中，在该环境中它可以竞争性地抑制PirB与PirA的结合能力，从而防止活性PirA/PirB二元毒素的形成。

本发明技术进一步包括治疗水生动物EMS的方法，并且优选地治疗虾EMS的方法，其包括将治疗有效量的经修饰的PirB肽，并且优选地为PirB肽片段，施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的水生动物。优选实施例可包括施用治疗有效量的根据SEQ IDNO.16-19的PirB肽片段，其中PirB肽片段竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。

可以将PirB肽片段直接施用于水生动物，如虾，例如通过注射。在一个替代实施例中，本发明的PirB肽片段可以通过经工程改造以表达截短PirB的供体细菌施用。例如，可以鉴定出如虾的水生动物的益生菌细菌菌株。这些益生菌可以经基因修饰以包括与启动子可操作地连接的核苷酸序列，该启动子表达PirB肽片段，如根据SEQ ID NO.16-19的那些PirB肽片段。表达PirB肽片段的基因修饰益生菌可以优选地施用于水生动物，例如通过经处理的饲料或液体接种物方法-补充有来自益生菌的细菌或细菌孢子的此类饲料和接种物是本领域普通技术人员容易知道的。即使在水产养殖环境中存在高水平的弧菌感染，施用治疗有效量的表达PirB肽片段的基因修饰益生菌也可能在环境中持续存在，并提供持续的局部保护以免受弧菌毒素的侵害，并且无需重复施用。

本发明可以具体包括一种治疗水生生物早期死亡综合征(EMS)的方法，其包括以下步骤：产生供体微生物以表达与启动子可操作地连接的编码经修饰的PirB肽，并且优选地为根据SEQ ID NO.16-19的PirB肽片段的异源多核苷酸，这些肽被配置为竞争性地抑制由致EMS的细菌性病原体产生的PirA/PirB二聚体复合物的形成。优选地可包括如枯草芽孢杆菌的虾益生菌菌株的供体微生物可以被引入目标宿主，如水产养殖环境中的虾，该宿主被所述致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染。在该实施例中，供体微生物可以定植于虾中并表达所述异源修饰的PirB肽，并且优选地为表达根据SEQ ID NO.16-19的PirB肽片段，其可以任选地例如通过外膜囊泡(OMV)分泌或运输到细菌细胞外，例如，在此它可以抑制由目标宿主中致EMS的细菌性病原体产生的PirA/PirB二聚体复合物的形成。

如本文所用，术语“水产养殖”包括在受控条件下养殖水生生物。

如本文所用，术语“水生生物”和/或“水生动物”包括在淡水或盐水中生长的生物。水生生物/动物包括脊椎动物、无脊椎动物、节肢动物、鱼、软体动物，包括虾(例如，对虾、食用对虾、口虾、南美蓝对虾、西方白对虾、日本对虾、南美白对虾、斑节对虾、中国对虾、红虾、桃红对虾、印度对虾、墨吉对虾、加州对虾、短沟对虾、斑节对虾、盐水虾、淡水虾等)、螃蟹、牡蛎、扇贝、蛤蚌、软骨鱼(例如，海鲷、鳟鱼、鲈鱼、条纹鲈鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲑鱼、鲤鱼、斑马鱼、红鼓鱼等)、甲壳类动物等。虾还包括在水产养殖中饲养的虾。

术语“益生菌”是指可以定植于宿主并提供益处的微生物，例如细菌。术语“益生菌”还指可以在宿主中定植足够长的时间以递送治疗量或有效量的截短毒素肽的微生物，例如细菌。益生菌可以包括肠道、共生和内共生细菌，或可以永久或临时定植于动物，如水生生物，优选地为虾的天然存在的菌群。细菌载体的具体实例包括细菌(例如球菌和杆菌)、丝状藻类和腐屑。在宿主的所有生命周期中可以是内源的可转化细菌载体细胞的具体实施例可以包括本文列出的所有那些。附加实施例可以包括一种或多种附加的细菌菌株。

如本文所用，术语“经修饰的”可包括具有一个或多个突变或去除的氨基酸残基的肽。在其他实施例中，经修饰的肽可以包括截短肽，该截短肽可以包括具有一个或多个氨基酸残基的肽，氨基酸残基对应于已经被进一步去除或突变以在该结构域中产生功能丧失的特定的结构域。在其他实施例中，经修饰的肽可以包括肽片段，该肽片段可以包括肽序列的离散部分，该肽序列可以作为与其对应的野生型肽的竞争性抑制剂。

术语“操纵子”是指由连接基因构成的单元。

如本文所用，弧菌属是革兰氏阴性、兼性厌氧菌属，呈弯曲杆状，弧菌属菌种表示属于弧菌属的一个物种。在一些实施例中，弧菌属可以包含以下弧菌属菌种中的任何一种或多种及其所有可能的组合：适应弧菌、产气弧菌、夏季弧菌、河口弧菌、溶藻胶弧菌、阿尔伯弧菌、阿尔法克弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、食琼胶弧菌、artabrorum、大西洋弧菌、非典型弧菌、远青弧菌、巴西弧菌、牛弧菌、卡尔维湾弧菌、坎普氏弧菌、干酪弧菌、沙氏弧菌、霍乱弧菌、辛辛那提弧菌、溶珊瑚弧菌、大牡蛎弧菌、嗜环弧菌、魔鬼弧菌、双氮养弧菌、吉雄氏弧菌、费氏弧菌、河流弧菌、强壮弧菌、弗利斯弧菌、高卢弧菌、产气弧菌、巨大弧菌、鲍鱼肠弧菌、哈维氏弧菌、肝弧菌、海马弧菌、西班牙弧菌、霍利斯弧菌、鱼肠道弧菌、印度弧菌、卡那罗弧菌、慢弧菌、海滨弧菌、火神弧菌、地中海弧菌、麦氏弧菌、拟态弧菌、贻贝弧菌、需钠弧菌、纳瓦拉弧菌、新生儿弧菌、海神弧菌、海蛹弧菌、黑美人弧菌、奥氏弧菌、东方弧菌、潘氏弧菌、副溶血性弧菌、杀扇贝弧菌、杀对虾弧菌、伯麦罗氏弧菌、黑海弧菌、解蛋白弧菌、轮虫弧菌、红色弧菌、留萌弧菌、杀鲑弧菌、大菱鲆弧菌、灿烂弧菌、幸存弧菌、始仔弧菌、塔斯曼尼亚弧菌、塔氏弧菌、创伤弧菌、沃丹弧菌和徐氏弧菌。

如本文所用，短语“宿主”或“目标宿主”是指携带致病性病原体的生物体或群体，或易受致病性病原体影响的生物体或群体。“宿主”或“目标宿主”还可以包括能够携带致病性病原体的生物体或群体。

如本文所用，术语“控制”和/或“生物控制”是指减少和/或调节病原体/疾病进展和/或传播。

如本文所用，短语“饲料”是指作为饲养方案的一部分引入或在水生动物的情况下直接应用于水中的动物消耗性材料。“经处理的饲料”是指用细菌或细菌孢子处理或含有细菌或细菌孢子的饲料，其被配置为表达经修饰的毒素肽，如本文中通常描述的经修饰的PirB肽。“饲料”也可以是水生动物或虾养殖池/水产养殖接种物。

如本文所用，术语“核酸”是指核糖核苷酸或脱氧核苷酸的聚合物。通常，“核酸”或“核酸剂”聚合物以单链或双链形式存在，但也已知可形成包含三链或更多链的结构。术语“核酸”包括天然存在的核酸聚合物以及包含已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。示例性类似物包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。“DNA”、“RNA”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”在本文中可互换使用。

术语“重组的”在用于例如细胞或核酸、蛋白质或载体时，表示细胞、生物体、核酸、蛋白质或载体已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或表示细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可以表达在细胞的天然(非重组或野生型)形式中未发现的基因，或表达以其他方式异常表达、过度表达、低表达或根本不表达的天然基因。

术语“基因修饰的”、“生物转化的”、“转基因的”、“转化的”、“转化”和“转染”在含义上与“重组”相似。“转化”、“转基因的”和“转染”是指将多核苷酸转移到宿主生物的基因组或细胞中。此类多核苷酸的转移可导致多核苷酸的基因稳定遗传或使多核苷酸留在染色体外(未整合到细胞的染色体中)。基因稳定遗传可能潜在地要求转基因生物或细胞在一种或多种条件下持续一段时间，这些条件需要一些或全部转移的多核苷酸的转录以使转基因生物或细胞存活和/或生长。转化到细胞中但未整合到宿主染色体中的多核苷酸作为表达载体留在细胞内。为了使表达载体留在细胞或细胞的后代中，可能需要在某些生长或环境条件下培养细胞。进一步地，为了发生表达，生物体或细胞可能需要在某些条件保存。含有重组多核苷酸的宿主生物或细胞可称为“转基因的”或“转化的”生物或细胞，或简称为“转化体”，和重组生物或细胞。

术语“载体”是指可以将DNA、RNA、蛋白质或多肽引入宿主的一些方式。待引入宿主的多核苷酸、蛋白质和多肽在本质上可以是治疗性或预防性的；可以编码，或者是抗原；在本质上可以是调控性的；等等。载体有多种类型，包括病毒、质粒、噬菌体、粘粒和细菌。“表达载体”是能够在选定的宿主细胞或生物体中复制的核酸。表达载体可以作为自主结构复制，或者可以替代地全部或部分整合到宿主细胞染色体或细胞器的核酸中，或者它可以用作将外源DNA递送至细胞的穿梭，并且因此与宿主细胞基因组一起复制。因此，表达载体是能够在选定的宿主细胞、细胞器或生物体中复制的多核苷酸，例如质粒、病毒、人工染色体、核酸片段，并且表达载体上的某些基因(包括目的基因)在细胞、细胞器或生物体内转录和翻译成多肽或蛋白质；或本领域已知的任何合适的构建体，其包含“表达盒”。相反，如本文实例中所述，“盒”是包含本发明表达载体的一部分的多核苷酸。盒的使用有助于表达载体的组装。表达载体是复制子，如质粒、噬菌体、病毒、嵌合病毒或粘粒，并且其包含与表达控制序列可操作地连接的所需多核苷酸序列。

当表达控制序列控制和调节该多核苷酸序列的转录和/或翻译时，多核苷酸序列“可操作地连接”到表达控制序列(例如，启动子和任选地，增强子)。如本文所用，短语“基因产物”是指RNA分子或蛋白质。此外，术语“基因”有时可以指基因序列、该基因的经转录和可能经修饰的mRNA或该mRNA的经翻译蛋白质。如本文所用，术语“启动子”是指可能位于转录起始上游的DNA区域，并且可能涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以启动转录。启动子可以可操作地连接到用于在细胞中表达的编码序列，或者启动子可以可操作地连接到编码信号序列的核苷酸序列，该信号序列可以可操作地连接到用于在细胞中表达的编码序列。用于基因抑制盒的合适启动子的实例包括但不限于Pupp、T7启动子、bla启动子、U6启动子、pol II启动子、Ell启动子和CMV启动子等。任选地，基因促进盒和基因抑制盒的每个启动子序列可以是可诱导的和/或组织特异性的。

如本文所用，术语“表达”或“编码序列的表达”(例如基因或转基因)是指核酸转录单位(包括例如基因组DNA或cDNA)的编码信息被转化为细胞的可操作、不可操作或结构部分的过程，通常包括蛋白质的合成。基因表达可能会受到外部信号的影响；例如，将细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的试剂。基因表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方进行调节。调节基因表达的发生是，例如，通过控制作用于转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(如mRNA)的降解，或通过特定蛋白质分子制成后的活化、失活、区室化或降解，或通过它们的组合。基因表达可以通过本领域已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平上测量，包括但不限于Northern印迹、RT-PCR、Western印迹或体外、原位或体内蛋白质活性测定。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”用于指氨基酸残基的聚合物。这些术语特别旨在涵盖天然存在的生物分子，以及重组或合成，例如通过固相合成产生的那些生物分子。

根据具体实施例，异源截短毒素蛋白(如经修饰的PirB肽)或供体的载体是细菌。在其他实施例中，供体是藻细胞。根据本发明的教导，可以使用各种藻类，因为它们是多种宿主的重要饮食部分，这些宿主适时地以微生物以及小型水生动物如轮虫为食。可根据本教导使用的藻类的实例包括但不限于蓝绿藻和绿藻。具体而言，集星藻(Actinastrumhantzschii)、卷曲纤维藻(Ankistrodesmus falcatus)、螺旋纤维藻(Ankistrodesmusspiralis)、线虫隐毛藻(Aphanochaete elegans)、正衣藻(Chlamydomonas sp.)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、染色小球藻(Chlorella variegate)、色球藻(Chlorococcum hypnosporum)、短刺顶棘藻(Chodatellabrevispina)、锐新月藻(Closterium acerosum)、拟新月藻(Closteriopsis acicularis)、蓝藻(Coccochloris peniocystis)、华美十字藻(Crucigenia lauterbomii)、四足十字藻(Crucigenia tetrapedia)、椭圆冠星藻(Coronastrum ellipsoideum)、葡萄鼓藻(Cosmarium botrytis)、角丝鼓藻(Desmidium swartzii)、空球藻(Eudorina elegans)、巨型胶囊藻(Gloeocystis gigas)、小球多芒藻(Golenkinia minutissima)、绿藻(Goniummulticoccum)、微绿球藻(Nannochloris oculata)、马氏隐卵囊藻(Oocystis marssonii)、小风毛菊卵囊藻(Oocystis minuta)、微小狸卵囊藻(Oocystis pusilla)、德克萨斯四集藻(Palmella texensis)、实球藻(Pandorina morum)、Paulschulzia pseudovolvox、具孔盘星藻(Pediastrum clathratum)、二角盘星藻(Pediastrum duplex)、单角盘星藻(Pediastrum simplex)、浮球藻(Planktosphaeria gelatinosa)、多突藻(Polyedriopsisspinulosa)、Pseudococcomyxa adhaerans、新月并联藻(Quadrigula closterioides)、辐球藻(Radiococcus nimbatus)、栅藻(Scenedesmus basiliensis)、草原水绵(Spirogyrapratensis)、角星鼓藻(Staurastrum gladiosum)、四角藻(Tetraedron bitridens)、小箍藻(Trochiscia hystrix)、鏈状焦腥藻(Anabaena catenula)、螺旋焦腥藻(Anabaenaspiroides)、膨胀色球藻(Chroococcus turgidus)、地衣形筒孢藻(Cylindrospermumlicheniforme)、Bucapsis sp.(U.Texas No.1519)、旋狸木氏藻(Lyngbya spiralis)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻(Nostoclinckia)、藤黄颤藻(Oscillatoria lutea)、窝形席藻(Phormidiumfaveolarum)、钝顶螺旋藻(Spinilina platensis)。供体微生物也可以是酵母细胞。

在进一步的实施例中，包括被配置成表达截短毒素肽的基因修饰的细菌的组合物可配制成“经处理的饲料”，其可包括可进一步被配置成分散到环境中的水分散性颗粒或粉末。在又一实施例中，本发明的组合物还可包含可湿性粉剂、喷雾剂、乳液、胶体、水溶液或有机溶液、粉剂、丸剂或胶体浓缩物。组合物的干燥形式可以配制成在润湿后立即溶解，或者可替代地，以控释、持续释放或其他时间依赖性方式溶解。可替代地或附加地，组合物可包含水溶液。此类水溶液或悬浮液可以作为在施用之前稀释的浓缩原液提供，或者可替代地，作为可立即施用的稀释溶液提供。此类组合物可以以多种方式配制。通过与各种惰性材料混合，如无机矿物(有机硅或硅衍生物、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(玉米芯粉、大米壳、核桃壳等)，它们可以用作可湿性粉剂、颗粒或粉剂。含有基因修饰的细菌的制剂或组合物可以包括粘展剂助剂、稳定剂、其他杀虫添加剂或表面活性剂。液体制剂可用作泡沫、悬浮液、可乳化浓缩物等。成分可以包括生物制剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。

本发明的组合物，其可以包括表达异源修饰的毒素蛋白的基因修饰的供体细菌，可用于生物控制动物或其他宿主中的病原体。此类应用包括向宿主施用有效量的组合物，该组合物从供体表达足够的异源修饰的毒素蛋白，如经修饰的PirB肽，或两者的组合，其可以被转运出供体并通过靶病原体被吸收，从而干扰毒素的结合和/或活性，例如通过抑制PirB/PirA二聚体复合物，从而控制病原体和/或病原体对宿主的致病作用。

本发明的组合物可用于在体内控制病原体基因表达及其本文所述的作用。此类应用包含向目标宿主，如虾施用有效量的组合物，该组合物抑制宿主携带的病原体产生的毒素的结合或活性，减少或消除宿主的疾病状态。因此，无论使用何种应用方法，可以以治疗有效量应用以抑制其作用的表达异源截短毒素蛋白的基因修饰的共生供体细菌的量将根据如要控制的特定宿主、病原体的类型、在某些情况下要处理的水源、环境条件以及组合物的施用方法、速率和量等因素变化。用于环境、系统或叶面施用的组合物的浓度将根据特定制剂的性质、施用方式、环境条件和杀生物活性程度而广泛变化。

根据一些实施例，以治疗有效量提供异源修饰的毒素蛋白，如经修饰的PirB肽，以降低或抑制毒素致病活性。如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是指产生足以抑制目标毒素的活性或致病作用的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多，例如60％、70％、80％、90％或甚至高达100％的异源截短毒素蛋白的供体细菌的量。所有范围都包括具体陈述的范围之间的范围。

如本文所用，术语“基因”或“多核苷酸”是指单个核苷酸或任何长度的核酸残基的聚合物。多核苷酸可以含有脱氧核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物，并且可以是双链或单链的。多核苷酸可以包含经修饰的核酸(例如甲基化的)、核酸类似物或非天然存在的核酸，并且可以被非核酸残基中断。例如，多核苷酸包括任何序列的基因、基因片段、cDNA、分离的DNA、mRNA、tRNA、rRNA和分离的RNA、重组多核苷酸、引物、探针、质粒和载体。定义中包括无论是自然修饰的还是通过干预修饰的核酸聚合物。附加地，对核苷酸序列的提及也涵盖并具体地包括其相应的氨基酸序列，反之亦然。

如本文所用，术语“大约”或“约”是指±10％＞。每当在本文中指示数字范围时，该数字范围都意图包含所指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语第一指示数字与第二指示数字“之间的变动范围/范围”以及从第一指示数字“到”第二指示数字的“变动范围/范围”在本文中可互换使用，并且意指包括该第一指示数字和第二指示数字以及在其之间的所有分数和整数。

术语“包含(comprises、comprising)”、“包括(includes、including)”、“具有”及其词形变化意为“包括但不限于”。术语“由……组成”是指“包括且限于”。术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可以包括附加的成分、步骤和/或部分，但前提是附加的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新特性。

如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一种”和“所述”包括复数引用。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。在整个本申请中，本发明的各种实施例可以以范围格式呈现。应当理解的是，采用范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被理解为对本发明范围的僵化限制。因此，对范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围的描述，如1至6应被认为具有具体公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。

如本文所用，术语“系统”和/或“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于化学、药理学、生物、生物化学和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和程序，或通过已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。如本文所用，术语“治疗”包括消除、实质上抑制、减缓或逆转病状的进展，实质上改善病状的临床或美学症状或实质上防止病状的临床或美学症状的出现。

如本文所用，“共生的”或“共生体”通常是指作为宿主共生体的细菌。它还可能包括在宿主的整个生命周期中持续存在的细菌，无论是在内部还是在外部，并且可能进一步水平传递给宿主的后代或卵子。共生体还可以包括在宿主细胞外，甚至在宿主的组织、淋巴或分泌物中定植的细菌。内共生体通常是指内部共生体的一个亚群。

本文描述的本发明可以在没有本文未具体公开的任何元素的情况下适当地实施。因此，例如，在本文中的每一种情况下，术语“包含”、“主要由……组成”和“由……组成”中的任一个可由其他两个术语中的任一个替换。

如本文所用，“抑制(inhibits、inhibition)”是指蛋白质相互作用相对于正常野生型水平或对照水平的降低。抑制可导致响应于本发明的本发明的经修饰的PirB肽抑制的蛋白质结合，如PirB和PirA结合降低小于10％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

本发明利用分子生物学领域的常规技术。公开本发明的一般使用方法的基本文献包括格林和萨姆布鲁克(Green and Sambrook)，第4版，2012，冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)；Kriegler，基因转移和表达：实验手册(Gene Transfer andExpression：A Laboratory Manual)(1993)；Ausubel等人编著，现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)，1994年至今，约翰·威利父子(JohnWiley&Sons)。除非另有说明，否则按照常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可参见例如Beniamin Lewin，基因IX(Genes IX)，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)出版，2007(ISBN 0763740632)；Krebs等人(编著)，分子生物学百科全书(The Encyclopedia ofMolecular Biology)，布莱克威尔科学公司(Blackwell ScienceLtd.)出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编著)分子生物学与生物技术：综合案头参考(Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive DeskReference)，VCH出版公司(VCH Publishers，Inc.)出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

除非另有说明，否则本文所用的术语“治疗(treating)”是指逆转、减轻、抑制该术语所适用的疾病或病症的进展，或预防该疾病或病症或该疾病或病症的一种或多种症状。如本文所用，除非另有说明，否则术语“治疗(treatment)”是指上文所定义的“治疗”的治疗行为。

现在通过参考以下实例将更容易理解总体上描述的本发明，所述实例仅出于说明本发明的实施例的某些方面的目的而包含在内。如本领域技术人员从上文教导和以下实例中将认识到的，其他技术和方法可以满足权利要求并且可以在不脱离要求保护的发明的范围的情况下采用，因此实例不旨在限制本发明。实际上，虽然本发明已参照其优选实施例进行了具体展示和描述，但本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的发明范围的情况下，可以在形式和细节上作出各种改变。

实例

实例1：表达截短PirB^Vp的构建体的设计。

为了防止活性PirA^Vp/PirB^Vp二元毒素的形成(参见图1A的模型)，本发明人使用了表达Δ1-262PirB^Vp截短变体的枯草芽孢杆菌。(图1B；SEQ ID NO.3，也被称为PirB^Vp-Sr)。为了设计PirB^Vp-Sr，我们使用了已发布的PirA^Vp/PirB^Vp二聚体模型来选择最佳截断位点。截断应抑制PirB^Vp与细胞膜的相互作用和毒素孔的形成，但不应影响PirA^Vp的结合。PirB^Vp-Sr氨基酸序列被工程改造为包括N端分泌肽，在该实施例中为YbxI，以允许PirB^Vp-Sr-YbxI释放到细菌环境中(参见图2，氨基酸序列SEQ ID NO.4，DNA序列SEQ ID NO.13)。在该配置中，经工程改造的PirB^Vp-Sr可以在枯草芽孢杆菌中表达并分泌到细菌环境中，在那里它可以与副溶血性弧菌表达的PirA^Vp相互作用，从而减轻PirA^Vp/PirB^Vp的细胞毒性和虾EMS诱导的疾病。

为了选择合适的启动子，本发明人研究了pirA^Vp/pirB^Vp操纵子的表达模式(图3A)。pirA^Vp/pirB^Vp转录起始点通过预测存在驱动pirA^Vp/pirB^Vp转录的强σ^S定向启动子建立(图3B)。众所周知，当营养物质有限时，基因的σ^S定向转录发生在细菌生长的后期。与此一致，本发明人发现当细菌细胞浓度高时，pirA^Vp/pirB^Vp的表达在弧菌生长的稳定期显著增加(图3C)。因此，在静止期，PirA蛋白在弧菌细胞中的积累量非常高(图3D)。为了抵消毒性，PirB^Vp(PB-Sr)抗毒素的表达在质粒pAD43-25的强Pupp启动子下进行工程改造，该启动子在芽孢杆菌生长的所有阶段都具有活性。编码PirB^Vp-Sr-YbxI序列的DNA片段(SEQ ID NO.4)被排序并克隆到pAD43-25枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体中。将最终表达构建体pAD-PB-Sr转化到枯草芽孢杆菌BCG322的感受态细胞中(参见图2，表1)。

实例2：芽孢杆菌的PirB^Vp-Sr表达降低副溶血性弧菌的细胞毒性。

如上所述，为了发挥作用，PB-Sr必须分泌到培养基中以与野生型PirB^Vp竞争并与PirA^Vp结合，从而阻止活性PirA^Vp/PirB^Vp二元毒素的形成及其与细胞膜的相互作用。预计所有这些事件都会显着降低PirAB^Vp对虾细胞的细胞毒性。由于无法获得虾细胞培养物，因此本发明人使用HeLa人细胞培养物研究了PirAB^Vp细胞毒性。通过在某些时间点采集样品，然后在含有HeLa细胞的细菌无细胞培养基中孵育，制备BCG322(pAD-PB-Sr)和副溶血性弧菌的混合培养物。通过从破坏的细胞释放到周围环境中的乳酸脱氢酶(LDH)来测定细胞毒性。在该实例中，BCG322(pAD-luc)作为对照菌株。如图4所示，未发现总体细胞毒性较高，这是可以预料的，因为人类细胞不是PirAB^Vp的天然靶标。然而，在该测定中很容易检测到细胞毒性。此外，与对照相比，BCG322(pAD-PB-Sr)与副溶血性弧菌的共同生长降低了两倍的无细胞培养基的细胞毒性，这表明与YbxI分泌信号肽偶联的截短PirB^Vp的表达降低了弧菌的细胞毒性。

实例3：在副溶血性弧菌的实验性感染过程中，芽孢杆菌导向的PB-S表达降低了虾的死亡率。

为了证明降低的细胞毒性可以为致EMS的病原体副溶血性弧菌提供预防性保护，给虾喂食BCG322(pAD-PB-Sr)和对照菌株BCG322(pAD-luc)三天，以允许细菌定植在虾的肠道中。基于没有死亡率或其他可观察到的病理，确定BCG322(pAD-PB-Sr)可安全地用作虾食品补充剂。如图5所示，样本虾种群受到副溶血性弧菌的攻击，并对它们的死亡率进行了评分。攻击后24小时后，用BCG322(pAD-PB-Sr)喂养的虾组的虾死亡率降低了2倍，这表明通过与截短PirB^Vp竞争灭活PirAB^Vp毒素可能是提供虾预防性保护防止其受PirAB^Vp诱导的EMS感染的可行策略。

实例3：PirB^Vp-Δ1-262截断突变体中突变体的计算鉴定。

如下表1所示，PirAB^Vp相互作用的亲和力较低。一方面，它使目前的竞争抑制策略更容易-低亲和力复合物很容易被竞争者破坏。另一方面，如果竞争性抑制剂(如PB-Sr)的亲和力也很低，则系统可能不够稳健，无法提供足够的竞争性结合谱。为了提高目标“竞争者”PB-Sr分子的亲和力，本发明人在计算机上进行了定向合理设计以鉴定一种或多种突变，这些突变会增加PB-Sr对PirA的结合亲和力。

如前所述，PirB^Vp-Δ1-262截断突变体包括残基263-438，这些残基主要是形成β折叠片层结构域，而该结构域又包含与PirA^Vp的主要结合界面(图1B)。在PirB^Vp-Δ1-262的界面表面上识别了三个主要接触区域。对于这些接触区域中的每一个，基于对结构域的折叠自由能影响最小的预测，选择单个突变。然后根据预测的对PirA^Vp的结合亲和力对单突变进行排序。下表2中给出了每个接触区域中的顶部单个突变体(F276S、A367T和P395Y)以及它们预测的PirA^Vp结合亲和力。值得注意的是，这三个单突变体的预测结合亲和力比未修饰的截断突变体强约4至5倍。表2中还提供了三个双突变体和一个三突变体组合的预测结合亲和力，其表明点突变具有组合效应。具体地，预测PirB^Vp-Δ1-262的F276S/A367T/P395Y三突变体与PirA^Vp的结合力强约两个量级(与完整的WT PirB^Vp相比)，使其成为对抗完整的PirA^Vp/PirB^Vp复合物形成的非常有效的预测竞争者(图1C)。

实例4：基于PirB^Vp的肽竞争者的计算设计。

小肽可以成为破坏蛋白质-蛋白质相互作用的重要工具。它们可以很容易地由细菌细胞大量合成，并且可以被设计为高活性药物。为了选择和发展高活性肽治疗化合物，从PirB^Vp中选择了数种肽，这些肽是其与PirA^Vp结合界面的一部分，用于进一步分析(参见表3)。这些基于PirB^Vp的肽的预测结合亲和力是在执行柔性对接后确定的，表3也提供了这些。本发明人选择在结合亲和力估计之前执行每个基于PirB^Vp的肽与PirA^Vp的柔性主链对接，因为衍生肽在不是完整蛋白质的一部分时可能采用不同的构象。

如图6所示，将蛋白质结构中一种肽的构象(左)与柔性主链对接后的预测构象(右)进行比较。注意，对接预测肽的构象变化会导致与PirA^Vp更广泛的相互作用界面。根据表3中的肽，预测肽214-WADNDSYNNANQDNVYDEVMGAR-236(SEQ ID NO.16)与PirA^Vp的结合力强约两个量级(与完整的WT PirB^Vp相比)，使其成为对抗完整的PirA^Vp/PirB^Vp复合物形成的预测竞争者。

实例5：材料和方法

PirB^Vp-Tr竞争者的合理设计：如图1A所示，PirA^Vp/PirB^Vp二聚体复合物的已发表结构模型被用作合理设计PirB^Vp-Tr变体的基础。该二聚体模型是使用PirA^Vp(SEQ IDNO.1)和PirB^Vp(SEQ ID NO.2)的晶体结构之间的实验约束对接来建立的。对于PirB^Vp，来自残基1-262的α螺旋结构域包含成孔区，而来自残基263-438的大部分β折叠片层结构域包含与PirA^Vp的相互作用界面。基于该信息，本发明人使用了仅包含PirB^Vp相互作用结构域的截断突变体PirB^Vp-Δ1-262(氨基酸序列SEQ ID NO.3；DNA序列SEQ ID NO.12)。在二聚体模型中用PirB^Vp-Δ1-262突变体替换完整的PirB^Vp后，使用CPORT算法的在线服务器识别PirA^Vp和PirB^Vp-Δ1-262之间的蛋白质-蛋白质界面残基。该方法在两种蛋白质之间的界面表面发现了三个主要的接触区域。然后使用来自FoldX(用于估计折叠自由能)和PRODIGY(用于估计蛋白质-蛋白质结合亲和力)的预测的组合来识别这三个接触区域的突变，这些突变将增强PirB^Vp-Δ1-262的PirA^Vp结合亲和力，同时不影响其折叠的稳定性。

基于PirB^Vp的肽竞争者的合理设计：从PirB^Vp中选择了数个涉及与PirA^Vp结合界面的肽序列。由于肽不一定要保持与它们衍生的蛋白质相同的构象，因此使用CABS-dock算法将每个肽柔性对接到PirA^Vp结合界面上。该方法允许对PirB^Vp衍生肽的主链构象进行增强采样，而PirA^Vp的主链保持受限，并且仅允许对侧链旋转异构体进行采样。使用PRODIGY估计了排名靠前的蛋白质-肽复合物的结合亲和力。

副溶血性弧菌AHPND菌株：目标弧菌菌株是在墨西哥爆发AHPND期间从养虾场中分离出来的。副溶血性弧菌在含有2.5％NaCl的LBS(LB培养基(BD))中生长，并在30℃(200rpm)下孵育28小时。使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒(凯杰公司(Qiagen))获得细菌DNA。通过全基因组测序和使用AP1和AP2引物的PCR证实了副溶血性弧菌AHPND导致具有pirA/pirB操纵子的质粒的存在。

构建体设计：细菌菌株和质粒列于下表1。PB-Sr蛋白和DNA序列如下所示。通过Genscript将在强蜡状芽孢杆菌启动子Pupp控制下表达PirB^Vp-Δ1-262的pAD-PB-Sr质粒进行排序。对于表达质粒，使用pAD43-25作为载体主链。

PirA^Vp/PirB^Vp表达模式：为了确定副溶血性弧菌的总RNA，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(凯杰公司)从在细菌生长曲线的不同时间点采集的样品中分离细胞。使用带有AP1和AP2寡核苷酸的

Universal One-Step RT-qPCR Kit(NEB)试剂盒进行RT-qPCR。

PpirA^Vp启动子的映射：本发明人使用5′RACE System试剂盒(英杰公司(Invitrogen))对副溶血性弧菌的总RNA提取的过夜培养物进行5′RACE(cDNA末端的快速扩增)测定。使用GSP1引物通过Superscript II酶进行逆转录，该引物属于pirA^Vp或pirB^Vp基因。在SNAP柱上纯化cDNA，并用末端脱氧核苷酸转移酶添加polyC尾。然后，使用与polyC尾和pir-特异性引物杂交的引物进行PCR。PCR扩增产物用PCR纯化试剂盒纯化。通过DNA测序确定pirA^Vp/pirB^Vp操纵子转录起始点。

PirA抗体生产：通过Genscript对肽抗原、pirA的片段CVQRDETYHLQRPDN(SEQ IDNO.20)的抗体进行排序。GenScript使用其专有的OptimumAntigenTM设计工具和专有的助剂。将半胱氨酸自动添加到肽的N端以与KLH结合。

SDS-PAGE和Western印迹。在15％SDS-PAGE上分离细菌上清液和副溶血性弧菌细胞的粗提物。对于Western印迹分析，使用Transblot装置(伯乐公司(BioRad))将通过SDS-PAGE解析的样品转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在5％封闭溶液中孵育10分钟，并用抗PirA抗体处理4小时。使用抗兔HPR二次抗体进行可视化。

虾死亡率。南美白对虾(凡纳滨对虾)后期幼体在佛罗里达州海洋学研究所的Zeigler保存设施中获得和保存。将虾(0.8克体重-1.2克体重)转移到装有过滤海水的10加仑水箱中(每个水箱10只虾)。每次实验处理使用5个水箱。提供恒定曝气和商业饮食，保持以下条件：盐度30ppt，pH 8.0；温度28±1.0℃。实验设计包括以下实验组：(i)阴性对照，未感染(仅海水)，(ii)在副溶血性弧菌感染攻击前施用芽孢杆菌BCG322(pAD PB-Sr)，和(iii)阳性对照，在副溶血性弧菌感染攻击前施用感染的芽孢杆菌BCG322(pAD-luc)。治疗包括以10⁹CFU/mL的剂量施用副溶血性弧菌浸泡颗粒(1mL/g)。

PirA^Vp/PirB^Vp细胞毒性。使用LDH细胞毒性检测试剂盒确定毒性。芽孢杆菌(BCG322(pAD PB-Sr)和BCG322(pAD-luc))的过夜培养物以每10分钟4600rpm的转速离心。将颗粒重新悬浮在14mL的LBS中以获得OD～1。0.5ml过夜副溶血性弧菌与10ml洗涤过的芽孢杆菌培养物混合。将细菌混合物在30℃下曝气培养3小时、5小时、8小时、17小时和24小时。收集培养基并通过测定乳酸脱氢酶活性测试细胞毒性。乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的细胞质酶，其在细胞膜成孔毒素损伤细胞质膜期间从细胞释放到周围的细胞培养上清液中。通过将黄色四唑盐转化为红色甲臜产物的偶联反应测定周围细胞培养基中的LDH活性。LDH酶活性的量在酶标仪上测定读数为490/492nm吸光度；其与培养物中受损细胞的数量相关。

表格

表1菌株、质粒和寡核苷酸。

表2.计算选择的PB-Sr(PirB^Vp-Δ1-262)变体对PirA^Vp的亲和力增强

表3.计算选择的PirB^Vp衍生肽用作PirB^Vp/PirA^Vp相互作用的竞争者。

参考文献

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序列表

SEQ ID NO.1

氨基酸

PirA

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.2

氨基酸

PirB-WT

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.3

氨基酸

PirB^VpΔ1-262

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.4

氨基酸

PirB^VpΔ1-262-YbxI

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.5

氨基酸

PirB^VpΔ1-262-F276S

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.6

氨基酸

PirB^VpΔ1-262-A367T

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.7

氨基酸

PirB^VpΔ1-262-P395Y

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.8

氨基酸

PirB^VpΔ1-262-F276S/A367T

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.9

氨基酸

PirB^VpΔ1-262-F276S/P395Y

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.10

氨基酸

PirB^VpΔ1-262-A367T/P395Y

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.11

氨基酸

PirB^VpΔ1-262-F276S/A367T/P395Y

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.12

DNA

PirB^VpΔ1-262

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.13

DNA

PirB^Vp PB-Sr-YbxI

副溶血性弧菌

SEQID NO.14

氨基酸

YbxI

枯草芽孢杆菌

SEQ ID NO.15

DNA

YbxI

枯草芽孢杆菌

SEQ ID NO.16

氨基酸

PirB肽214-236

副溶血性弧菌

SEQ ID No.17

氨基酸

PirB肽214-226

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.18

氨基酸

PirB肽386-401

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.19

氨基酸

PirB肽392-401

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.20

氨基酸

pirA的表位片段

副溶血性弧菌

SEQ ID NO.21

DNA

Ap4-F1

人工的

SEQ ID NO.22

DNA

Ap3R

人工的

SEQ ID NO.23

DNA

用于引物的Vp-gyrB

人工的

SEQ ID NO.24

DNA

Vp-gyrB-rev

人工的

序列表

<110> 美国卵石实验室公司（PEBBLE LABS USA, INC.）

<120> 用于抑制细菌毒素以治疗水生动物早期死亡综合征的系统、方法和组合物

<130> LHB2267528P

<140> 202080076007.5

<141> 2020-09-04

<150> 62/896,034

<151> 2019-09-05

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 1

Met Ser Asn Asn Ile Lys His Glu Thr Asp Tyr Ser His Asp Trp Thr

1 5 10 15

Val Glu Pro Asn Gly Gly Val Thr Glu Val Asp Ser Lys His Thr Pro

20 25 30

Ile Ile Pro Glu Val Gly Arg Ser Val Asp Ile Glu Asn Thr Gly Arg

35 40 45

Gly Glu Leu Thr Ile Gln Tyr Gln Trp Gly Ala Pro Phe Met Ala Gly

50 55 60

Gly Trp Lys Val Ala Lys Ser His Val Val Gln Arg Asp Glu Thr Tyr

65 70 75 80

His Leu Gln Arg Pro Asp Asn Ala Phe Tyr His Gln Arg Ile Val Val

85 90 95

Ile Asn Asn Gly Ala Ser Arg Gly Phe Cys Thr Ile Tyr Tyr His

100 105 110

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 2

Met Thr Asn Glu Tyr Val Val Thr Met Ser Ser Leu Thr Glu Phe Asn

1 5 10 15

Pro Asn Asn Ala Arg Lys Ser Tyr Leu Phe Asp Asn Tyr Glu Val Asp

20 25 30

Pro Asn Tyr Ala Phe Lys Ala Met Val Ser Phe Gly Leu Ser Asn Ile

35 40 45

Pro Tyr Ala Gly Gly Phe Leu Ser Thr Leu Trp Asn Ile Phe Trp Pro

50 55 60

Asn Thr Pro Asn Glu Pro Asp Ile Glu Asn Ile Trp Glu Gln Leu Arg

65 70 75 80

Asp Arg Ile Gln Asp Leu Val Asp Glu Ser Ile Ile Asp Ala Ile Asn

85 90 95

Gly Ile Leu Asp Ser Lys Ile Lys Glu Thr Arg Asp Lys Ile Gln Asp

100 105 110

Ile Asn Glu Thr Ile Glu Asn Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Lys Asp Asp

115 120 125

Tyr Ile Gly Leu Val Thr His Tyr Leu Ile Gly Leu Glu Glu Asn Phe

130 135 140

Lys Arg Glu Leu Asp Gly Asp Glu Trp Leu Gly Tyr Ala Ile Leu Pro

145 150 155 160

Leu Leu Ala Thr Thr Val Ser Leu Gln Ile Thr Tyr Met Ala Cys Gly

165 170 175

Leu Asp Tyr Lys Asp Glu Phe Gly Phe Thr Asp Ser Asp Val His Lys

180 185 190

Leu Thr Arg Asn Ile Asp Lys Leu Tyr Asp Asp Val Ser Ser Tyr Ile

195 200 205

Thr Glu Leu Ala Ala Trp Ala Asp Asn Asp Ser Tyr Asn Asn Ala Asn

210 215 220

Gln Asp Asn Val Tyr Asp Glu Val Met Gly Ala Arg Ser Trp Cys Thr

225 230 235 240

Val His Gly Phe Glu His Met Leu Ile Trp Gln Lys Ile Lys Glu Leu

245 250 255

Lys Lys Val Asp Val Phe Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro

260 265 270

Ala Val Gly Phe Pro Ser Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr

275 280 285

Glu Asp Glu Ile Pro Gln Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg

290 295 300

Arg Asn Arg Ile Val Lys Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His

305 310 315 320

Tyr Tyr Asn Arg Val Gly Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu

325 330 335

Val Val Glu Leu Gly Lys Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser

340 345 350

Ile Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala Asn

355 360 365

Gly Pro Glu Ala Ile Asp Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg

370 375 380

Thr Phe Val Val Gly Glu Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln

385 390 395 400

Leu Glu Gly His Phe Ile Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser

405 410 415

Asp Lys Val Ala Ala Phe Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp

420 425 430

Glu Phe Gly Thr Glu Lys

435

<210> 3

<211> 176

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 3

Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Val Gly Phe Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys

35 40 45

Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly

50 55 60

Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu Val Val Glu Leu Gly Lys

65 70 75 80

Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala

85 90 95

Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp

100 105 110

Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg Thr Phe Val Val Gly Glu

115 120 125

Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln Leu Glu Gly His Phe Ile

130 135 140

Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

165 170 175

<210> 4

<211> 199

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 4

Met Lys Lys Trp Ile Tyr Val Val Leu Val Leu Ser Ile Ala Gly Ile

1 5 10 15

Gly Gly Phe Ser Val His Ala Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser

20 25 30

Pro Ala Val Gly Phe Pro Ser Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly

35 40 45

Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu

50 55 60

Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile

65 70 75 80

His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly

85 90 95

Glu Val Val Glu Leu Gly Lys Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln

100 105 110

Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala

115 120 125

Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp

130 135 140

Arg Thr Phe Val Val Gly Glu Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu

145 150 155 160

Gln Leu Glu Gly His Phe Ile Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly

165 170 175

Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro

180 185 190

Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

195

<210> 5

<211> 176

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 5

Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Val Gly Ser Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys

35 40 45

Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly

50 55 60

Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu Val Val Glu Leu Gly Lys

65 70 75 80

Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala

85 90 95

Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp

100 105 110

Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg Thr Phe Val Val Gly Glu

115 120 125

Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln Leu Glu Gly His Phe Ile

130 135 140

Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

165 170 175

<210> 6

<211> 176

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 6

Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Val Gly Phe Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys

35 40 45

Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly

50 55 60

Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu Val Val Glu Leu Gly Lys

65 70 75 80

Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala

85 90 95

Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Thr Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp

100 105 110

Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg Thr Phe Val Val Gly Glu

115 120 125

Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln Leu Glu Gly His Phe Ile

130 135 140

Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

165 170 175

<210> 7

<211> 176

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 7

Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Val Gly Phe Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys

35 40 45

Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly

50 55 60

Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu Val Val Glu Leu Gly Lys

65 70 75 80

Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala

85 90 95

Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp

100 105 110

Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg Thr Phe Val Val Gly Glu

115 120 125

Asn Ser Gly Lys Tyr Ser Val Arg Leu Gln Leu Glu Gly His Phe Ile

130 135 140

Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

165 170 175

<210> 8

<211> 176

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 8

Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Val Gly Ser Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys

35 40 45

Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly

50 55 60

Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu Val Val Glu Leu Gly Lys

65 70 75 80

Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala

85 90 95

Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Thr Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp

100 105 110

Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg Thr Phe Val Val Gly Glu

115 120 125

Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln Leu Glu Gly His Phe Ile

130 135 140

Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

165 170 175

<210> 9

<211> 176

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 9

Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Val Gly Ser Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys

35 40 45

Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly

50 55 60

Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu Val Val Glu Leu Gly Lys

65 70 75 80

Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala

85 90 95

Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp

100 105 110

Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg Thr Phe Val Val Gly Glu

115 120 125

Asn Ser Gly Lys Tyr Ser Val Arg Leu Gln Leu Glu Gly His Phe Ile

130 135 140

Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

165 170 175

<210> 10

<211> 176

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 10

Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Val Gly Phe Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys

35 40 45

Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly

50 55 60

Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu Val Val Glu Leu Gly Lys

65 70 75 80

Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala

85 90 95

Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Thr Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp

100 105 110

Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg Thr Phe Val Val Gly Glu

115 120 125

Asn Ser Gly Lys Tyr Ser Val Arg Leu Gln Leu Glu Gly His Phe Ile

130 135 140

Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

165 170 175

<210> 11

<211> 176

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 11

Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Val Gly Ser Pro Ser

1 5 10 15

Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr Glu Asp Glu Ile Pro Gln

20 25 30

Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg Arg Asn Arg Ile Val Lys

35 40 45

Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His Tyr Tyr Asn Arg Val Gly

50 55 60

Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu Val Val Glu Leu Gly Lys

65 70 75 80

Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ala

85 90 95

Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Thr Asn Gly Pro Glu Ala Ile Asp

100 105 110

Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg Thr Phe Val Val Gly Glu

115 120 125

Asn Ser Gly Lys Tyr Ser Val Arg Leu Gln Leu Glu Gly His Phe Ile

130 135 140

Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser Asp Lys Val Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp Glu Phe Gly Thr Glu Lys

165 170 175

<210> 12

<211> 531

<212> DNA

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 12

gttcacagta atttaatttc atattcacct gctgttggtt ttcctagtgg taatttcaac 60

tatattgcta caggtacgga agatgaaata cctcaaccat taaaaccaaa tatgtttggg 120

gaacgtcgaa atcgtattgt aaaaattgaa tcatggaaca gtattgaaat acattattac 180

aatcgcgtag gtcgacttaa actaacttat gaaaatgggg aagtggtaga actaggcaag 240

gctcataaat atgacgagca ttaccaatct attgagttaa acggcgctta cattaaatat 300

gttgatgtta ttgccaatgg acctgaagca attgatcgaa tcgtatttca tttttcagat 360

gatcgaacat ttgttgttgg tgaaaactca ggcaagccaa gtgtgcgttt gcaactggaa 420

ggtcatttta tttgtggcat gcttgcggat caagaaggtt ctgacaaagt tgccgcgttt 480

agcgtggctt atgaattgtt tcatcccgat gaatttggta cagaaaagta g 531

<210> 13

<211> 600

<212> DNA

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 13

atgaaaaaat ggatatatgt tgtgcttgtg ctgagtattg cagggatcgg cggcttctcc 60

gtccacgcag ttcacagtaa tttaatttca tattcacctg ctgttggttt tcctagtggt 120

aatttcaact atattgctac aggtacggaa gatgaaatac ctcaaccatt aaaaccaaat 180

atgtttgggg aacgtcgaaa tcgtattgta aaaattgaat catggaacag tattgaaata 240

cattattaca atcgcgtagg tcgacttaaa ctaacttatg aaaatgggga agtggtagaa 300

ctaggcaagg ctcataaata tgacgagcat taccaatcta ttgagttaaa cggcgcttac 360

attaaatatg ttgatgttat tgccaatgga cctgaagcaa ttgatcgaat cgtatttcat 420

ttttcagatg atcgaacatt tgttgttggt gaaaactcag gcaagccaag tgtgcgtttg 480

caactggaag gtcattttat ttgtggcatg cttgcggatc aagaaggttc tgacaaagtt 540

gccgcgttta gcgtggctta tgaattgttt catcccgatg aatttggtac agaaaagtag 600

<210> 14

<211> 23

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 14

Met Lys Lys Trp Ile Tyr Val Val Leu Val Leu Ser Ile Ala Gly Ile

1 5 10 15

Gly Gly Phe Ser Val His Ala

20

<210> 15

<211> 69

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 15

atgaaaaaat ggatatatgt tgtgcttgtg ctgagtattg cagggatcgg cggcttctcc 60

gtccacgca 69

<210> 16

<211> 23

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 16

Trp Ala Asp Asn Asp Ser Tyr Asn Asn Ala Asn Gln Asp Asn Val Tyr

1 5 10 15

Asp Glu Val Met Gly Ala Arg

20

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 17

Trp Ala Asp Asn Asp Ser Tyr Asn Asn Ala Asn Gln Asp

1 5 10

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 18

Phe Val Val Gly Glu Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln Leu

1 5 10 15

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 19

Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln Leu

1 5 10

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)

<400> 20

Cys Val Gln Arg Asp Glu Thr Tyr His Leu Gln Arg Pro Asp Asn

1 5 10 15

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Ap4-F1 引物

<400> 21

gtggtaatag attgtacaga a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Ap3R 引物

<400> 22

gtggtaatag attgtacaga a 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于引物的Vp-gyrB

<400> 23

cgagcatgcg ctaagtgttg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Vp-gyrB-rev

<400> 24

taacgctgac ggcttagacc 20

Claims

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述截短PirB肽包含PirB Δ1-262肽。

4.根据权利要求2至3中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽包含根据SEQ IDNO.3的氨基酸序列。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽与分泌信号结构域偶联。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的组合物，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含与YbxI分泌信号偶联的截短PirB肽。

7.根据权利要求2至5中任一项所述的组合物，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含根据SEQ ID NO.4的氨基酸序列。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQID NO.14的分泌信号。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽进一步包含具有选自由以下组成的群组的一个或多个突变的截短PirB肽：F276S、A367T、P395Y或其任何组合。

10.根据权利要求2至8中任一项所述的组合物，其中所述截短PirB肽进一步包含选自由以下组成的群组的截短PirB肽：SEQ ID NO.5-11。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述水生生物包含虾。

14.一种治疗水生动物EMS的方法，其包含将治疗有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的经修饰的PirB肽施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的水生动物，其中所述经修饰的PirB肽竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水生生物包含虾。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据权利要求1至11中任一项所述的截短PirB肽。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据权利要求1至11中任一项所述的截短PirB肽，其中所述供体细菌被掺入经处理的饲料或液体接种物中。

-表达所述异源经修饰的PirB肽；以及

23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽包含根据SEQ IDNO.3的氨基酸序列。

24.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽与分泌信号结构域偶联。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含与YbxI分泌信号偶联的截短PirB肽。

26.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中与分泌信号结构域偶联的所述截短PirB肽包含根据SEQ ID NO.4的氨基酸序列。

27.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQID NO.14的分泌信号。

28.根据权利要求22中27中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽进一步包含具有选自由以下组成的群组的一个或多个突变的截短PirB肽：F276S、A367T、P395Y或其任何组合。

29.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述截短PirB肽进一步包含选自由以下组成的群组的截短PirB肽：SEQ ID NO.5-11。

32.根据权利要求20所述的方法，其中所述水生生物包含虾。

37.根据权利要求35至36中任一项所述的组合物，其中所述PirB肽片段包含选自由以下组成的群组的PirB肽片段：SEQ ID NO.16-19。

38.根据权利要求35至36中任一项所述的组合物，其中所述PirB肽片段通过连接子结构域与分泌信号结构域偶联。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQ ID NO.14的分泌信号。

43.一种基因修饰微生物，其表达与启动子可操作地连接的编码根据权利要求35至40中任一项所述的截短PirB肽的异源多核苷酸。

45.根据权利要求43至44中任一项所述的微生物，其中所述微生物包含供体细菌。

47.一种治疗水生动物EMS的方法，其包含将治疗有效量的根据权利要求35至40中任一项所述的PirB肽片段施用于受致EMS的细菌性病原体感染或易受其感染的水生动物，其中所述PirB肽片段竞争性地抑制PirA/PirB二聚体复合物的形成。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述水生生物包含虾。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据权利要求35至40中任一项所述的PirB肽片段。

50.根据权利要求47所述的方法，其中所述施用包含施用治疗有效量的供体细菌，所述供体细菌经工程改造以表达根据权利要求35至40中任一项所述的PirB肽片段，其中所述供体细菌被掺入经处理的饲料或液体接种物中。

51.根据权利要求49至50中任一项所述的方法，其中所述供体细菌包含益生菌供体细菌。

55.根据权利要求53至54中任一项所述的方法，其中所述PirB肽片段包含选自由以下组成的群组的PirB肽片段：SEQ ID NO.16-19。

56.根据权利要求53至54中任一项所述的方法，其中所述PirB肽片段通过连接子结构域与分泌信号结构域偶联。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述分泌信号结构域包含根据SEQ ID NO.14的分泌信号。

60.根据权利要求53所述的方法，其中所述水生生物包含虾。

61.一种基因修饰微生物，其表达与启动子可操作地连接的编码根据权利要求35至40中任一项所述的PirB肽片段的异源多核苷酸。

63.根据权利要求61至62中任一项所述的细菌，其中所述微生物包含供体细菌。

64.根据权利要求63所述的细菌，其中所述供体细菌包含枯草芽孢杆菌。

67.一种分离核苷酸序列，其编码选自由以下组成的群组的经修饰的PirB肽：SEQ IDNO.12-13。

68.一种表达载体，其包含根据权利要求66至67中任一项所述的核苷酸序列，其可操作地连接启动子。

69.一种微生物，其用根据权利要求68所述的表达载体转化。