WO2013162274A1 - 신규한 ｄ형 젖산 생산균주 및 그의 용도 - Google Patents

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WO2013162274A1
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lactobacillus
ldh
lactic acid
seq
strain
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양은빈
이태희
김선혜
양영렬
리홍선
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)

Definitions

  • the present invention relates to a novel D-type lactic acid producing strain and its use, and more particularly, the present invention inhibits the activity of L-type lactic acid dehydrogenase (L-LDH) in L-type lactic acid producing strain, D-lactic acid dehydrogenase (D-LDH) method of producing a modified D-lactic acid-producing strain comprising introducing the activity, the mutated D-lactic acid-producing strain prepared by the above method and and the culturing the strain and D-type lactic acid from the culture It relates to a method for producing D-type lactic acid comprising the step of recovering the same.
  • L-LDH L-type lactic acid dehydrogenase
  • D-LDH D-lactic acid dehydrogenase
  • Lactic acid is widely used in industrial fields such as food, medicine, cosmetics, etc. Recently, the lactic acid is used as a monomer of polylactic acid, and the demand thereof is greatly increased.
  • Lactic acid production methods include conventional chemical synthesis and biological fermentation based on carbohydrates. Commercially, the latter method is preferred because in case of producing lactic acid by chemical synthesis method, in addition to the problems of cost increase due to oil price increase or environmental pollution, Lase mixed with D-type L and L-type Lactic acid by 50% This is due to the drawback of inert D- or L-lactic acid in the form of racemic mixtures. At this time, the mixture composition ratio of the D- and L-type lactic acid is not adjustable, and when the polylactic acid is prepared from the lactate in the form of a racemic mixture, it becomes an amorphous polymer having a low melting point, and thus there are many limitations in developing the application.
  • Lactobacillus sp. Bacillus sp., Rhizopus sp., Streptococcus sp., Enterococcus sp. Is mainly producing L-lactic acid.
  • Leuconostoc sp. Microorganisms and Lactobacillus vulgaricus are known to produce D-lactic acid.
  • D-lactic acid is characterized in that it is not metabolized in the body, so that it can be used not only for biosynthetic materials in the medical field, but also as an optically active herbicide by esterification and chlorination, if the herbicide has optical activity. It is confirmed that the drug effect is much improved and the same effect is obtained even with a small application amount, and the demand for type D lactic acid is increasing.
  • sc-polylactic acid stereocomplex-PLA
  • sc-polylactic acid has a much higher melting point and pyrolysis temperature compared to conventional polylactic acid, and thus can be used as a high heat resistant plastic raw material, which is pure L type polylactic acid and pure D type polylactic acid. Produced by mixing. As a result, D-lactic acid is required as the monomer of D-type polylactic acid, and the demand thereof is gradually increased.
  • Such optically pure D-lactic acid is preferably a biological fermentation method using optical specific substrate selectivity of microbial enzymes, but general wild type D-lactic acid producing microorganisms existing in nature can be used for industrial purposes in terms of optical purity and productivity. There is still a disadvantage in this.
  • Representative D-type lactic acid producing microorganism is Lb. plantarum, Lb. pentosus, Lb. fermentum and Lb delbrueckii , but generally do not produce lactic acid with high productivity and high yield, and have the disadvantage of containing 20-40% of L-type lactic acid as optical impurities.
  • mutant lactic acid bacteria treated with EMS ethyl methanesulfonate
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • the present inventors have focused on the fact that the mother strain of lactic acid fermentation that has been industrially stable is microorganisms based on L-lactic acid production, and that these microorganisms generally have better lactic acid productivity and yield than microorganisms producing D-lactic acid.
  • a gene encoding L-lactate dehydrogenase (L-LDH) is inactivated by a type lactic acid producing microorganism and a gene encoding a foreign type D-lactate dehydrogenase (D-LDH) As a result, it was confirmed that the D-lactic acid can be produced in high yield, and completed the present invention.
  • One object of the present invention is a modified D-lactic acid producing strain comprising the step of attenuating or inactivating the activity of L-type lactate dehydrogenase in the L-type lactate producing strain, and introducing or enhancing the activity of the D-type lactate dehydrogenase It is to provide a manufacturing method.
  • Another object of the present invention is to provide a modified D-type lactic acid producing strain prepared by the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing D-type lactic acid using the mutated D-lactic acid producing strain.
  • D-lactic acid-producing strain of the present invention is produced by mutating L-type lactic acid-producing strain excellent in lactic acid productivity, excellent productivity of D-type lactic acid, to improve the productivity of various products using D-type lactic acid as a raw material It can be widely used.
  • 1 is a graph showing the results of analyzing the ratio of D-type lactic acid and L-lactic acid produced in 10 wild-type lactic acid bacteria.
  • the present invention weakens or inactivates the activity of L-lactate dehydrogenase (L-LDH) in L-lactic acid producing strain, It provides a method for producing a mutated D-lactic acid producing strain by introducing or enhancing the activity of l-lactate dehydrogenase (D-LDH).
  • L-LDH L-lactate dehydrogenase
  • the method for producing a mutated D-lactic acid producing strain of the present invention (a) by attenuating or inactivating the activity of L-lactate dehydrogenase (L-LDH) in L-lactic acid producing strain, Obtaining a mutated lactic acid producing strain; (b) introducing or enhancing the activity of D-lactate dehydrogenase (D-LDH) into the mutated lactic acid producing strain.
  • L-LDH L-lactate dehydrogenase
  • the L-lactic acid-producing strain expresses only the polynucleotide encoding L-LDH alone, and simultaneously expresses the strain producing L-lactic acid or the polynucleotide encoding L-LDH and the polynucleotide encoding D-LDH simultaneously.
  • It can be a strain that produces L-type and D-type lactic acid together; Methods for attenuating or inactivating the activity of L-LDH can be performed by replacing, deleting, inserting or adding one or several nucleotides at one or more positions of the polynucleotide encoding L-LDH; Methods for introducing or enhancing the activity of D-LDH include introducing a polynucleotide encoding D-LDH into the chromosome of a mutated lactic acid producing strain, or mutated D to exhibit improved activity on the chromosome of the mutated lactic acid producing strain.
  • a method of introducing a polynucleotide encoding a -LDH variant a method of introducing a promoter exhibiting improved activity upstream of a D-LDH encoding polynucleotide present in a chromosome of a mutated lactic acid producing strain, a mutant lactic acid producing strain
  • Polynucleotides that encode mutated D-LDH variants to exhibit improved linked activity A method of introducing a Tide, a method of introducing an expression vector comprising a polynucleotide encoding D-LDH into a mutated lactic acid producing strain, encoding a mutated D-LDH variant to exhibit
  • a method of introducing an expression vector comprising a promoter exhibiting improved activity to the mutated lactic acid producing strain and a polynucleotide encoding a mutated D-LDH variant to exhibit improved activity operably linked to the promoter can be done.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • L-type lactic acid producing strain refers to a strain that self-expresses a polynucleotide encoding L-LDH and produces L-type lactic acid using the generated L-LDH, L-lactic acid and D-lactic acid are simultaneously produced by expressing not only the polynucleotide encoding the polynucleotide encoding L-LDH, but also the polynucleotide encoding L-LDH and the polynucleotide encoding D-LDH. It includes a strain.
  • the L-lactic acid producing strain is not particularly limited as long as it can produce L-type lactic acid, preferably Lactobacillus brevis , Lactobacillus pentosus , Lactobacillus pentosus , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus jensenii , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus paraplantarum , Lactobacillus fermentum , Lactobacillus paracaseis , Lactobacillus alactocillus paracasei Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus johnsonii , Lactobacillus casei ( Lactobacillus case ), and the like, and more preferably, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus cassia, and the like. And most preferably lactobacillus It can be a paraparasai.
  • the method of attenuating or inactivating the activity of L-LDH from the L-lactic acid producing strain may be performed using a method known in the art. For example, one or several, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, most at one or more positions of a polynucleotide encoding L-LDH inherent in the L-lactic acid producing strain
  • a method of inhibiting the expression of polynucleotides encoding L-LDH or producing inactivated L-LDH by substituting, deleting, inserting or adding 2 to 5 nucleotides may be used. Any method capable of producing a result of weakening or inactivating L-LDH activity from the lactic acid producing strain may be used without particular limitation.
  • the L-LDH that is the target of weakening or inactivation may be L-LDH produced intrinsically in the L-lactic acid-producing strain, so that the amino acid sequence of the L-LDH or the sequence of the polynucleotide encoding the same.
  • the polynucleotide sequence encoding the LDH of Lactobacillus paracasei (SEQ ID NO: 25) and the polynucleotide sequence encoding the LDH1 (SEQ ID NO: 26), the polynucleotide encoding LDH1 of the Lactobacillus casei SEQ ID NO: 27 and the polynucleotide sequence encoding LDH2 (SEQ ID NO: 28), the polynucleotide sequence encoding LGG_02523 from Lactobacillus rhamnosus (SEQ ID NO: 29), and the polynucleotide sequence encoding the LGG_00606 enzyme (SEQ ID NO: 30). ), Etc.
  • mutated lactic acid producing strain refers to an L-type lactate producing strain that has weakened or inactivated L-LDH activity.
  • the mutated lactic acid producing strain may be a mutant strain that attenuates or inactivates the activity of L-LDH by artificially inducing a mutation to a normal L-type lactic acid producing strain, or does not cause artificial mutation, Mutations can also result in mutant strains in which L-LDH activity is attenuated or inactivated.
  • the method of introducing or enhancing the activity of D-LDH into the mutated lactic acid producing strain is not particularly limited, but the method of introducing a polynucleotide encoding D-LDH into the chromosome of the mutated lactic acid producing strain, mutated lactic acid production
  • a method of introducing a polynucleotide encoding a mutated D-LDH variant a method of introducing an expression vector comprising a polynucleotide encoding a D-LDH into a mutated lactic acid producing strain, an improvement in a mutated lactic acid producing strain
  • expression vector refers to a DNA product containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to allow expression of the polynucleotide encoding the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the expression vector used in the present invention is not particularly limited as long as it is replicable in a host, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used expression vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or cosmid vector
  • pBR, pUC, and pBluescriptII systems are used as plasmid vectors.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • the vector used in the embodiment of the present invention is pG + host6, which is a vector used for a wide range of hosts in Gram-positive bacteria.
  • This vector is characterized by having an ampicillin resistance gene for use in E. coli, an origin of replication for E. coli, an erythromycin resistance gene for Gram-positive bacteria, and a replication origin for Gram-positive bacteria.
  • the Gram-positive bacteria replication origin contains a heat-sensitive mutation that does not replicate at temperatures higher than 37 °C and this feature allows the gene insertion through homologous base sequence in Gram-positive bacteria (US Patent 20060025190).
  • the term "transformation” refers to a series of operations in which a vector containing a polynucleotide encoding a target protein is introduced into a host cell to express the polynucleotide in the host cell, thereby producing an expression product mRNA or protein. it means.
  • the polynucleotide to be introduced into the host cell may be in any form as long as it can be introduced into and expressed in the host cell.
  • the polynucleotide is a structure that includes all elements necessary for self-expression (promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site, translation termination signal, etc. operably linked to the polynucleotide).
  • the expression cassette may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which may be in the form of an expression vector capable of self-replicating.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell.
  • the D-LDH used in the present invention is not particularly limited thereto, but preferably may be derived from a strain that produces a large amount of D-type lactic acid, and more preferably, Lactobacillus plantarum or Lactobacillus delbruecki. Or the like, and most preferably, a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 derived from Lactobacillus delbruecki or a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 derived from Lactobacillus plantarum. .
  • amino acids may comprise a substituted, deleted, inserted, added or inverted amino acid sequence, which may maintain or enhance the activity of the D-LDH.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or 32 it may comprise an amino acid sequence having at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, particularly preferably at least 97% homology.
  • the amino acid sequence of the enzyme showing the activity of the polypeptide is not particularly limited thereto.
  • Substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of minosan may include naturally occurring mutant sequences or artificially mutated sequences such as those based on differences in individuals or species of microorganisms containing the D-LDH activity. .
  • homology refers to an identity between two different amino acid sequences or nucleotide sequences, which is a BLAST that calculates parameters such as score, identity, similarity, and the like. It can be determined by methods well known to those skilled in the art using 2.0, but is not particularly limited thereto.
  • the strain producing L-lactic acid is known to have a better overall yield of lactic acid than the strain producing D-lactic acid
  • the present inventors have transformed the strain producing L-lactic acid into a strain producing D-lactic acid.
  • a good strain of l-type lactic acid To produce a good strain of l-type lactic acid.
  • Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus strains have excellent overall productivity of lactic acid, L-lactic acid ratio It was confirmed that this overwhelming superiority, and tried to construct these strain strains (Fig. 1).
  • ⁇ ldh1-ldhA (Lb.db) and ⁇ ldh-ldhD (Lb.pl), which are the cassettes for deleting the ldh and ldh1 genes Ldh and ldh1 derived from Lactobacillus paracasei and simultaneously inserting D-LDH Were prepared and introduced into the heat-sensitive vector pG + host6, to prepare two vectors of pG + host6- ⁇ ldh1-ldhA (Lb.db) and pG + host6- ⁇ ldh-ldhD (Lb.pl).
  • Example 3 ).
  • each vector was introduced into Lactobacillus paracasei from which the L-LDH gene was deleted, thereby producing a transformant in which L-LDH activity was attenuated or inactivated and D-LDH activity was enhanced (Example 4).
  • the production rate of D-type lactic acid was produced at a concentration of 41.6 g / L and the L-type lactic acid was not produced, and the production yield of the produced D-lactic acid was Was confirmed to be superior to the production yield of D-type lactic acid produced in known D-type lactic acid producing strain (Example 5).
  • the production yield can be produced D-type lactic acid.
  • the present invention is prepared by the above method, in the L-lactic acid producing strain showing the activity of L-LDH, the activity of the L-LDH is weakened or inactivated To provide a D-type lactic acid producing strain that is modified to exhibit or enhance the activity of D-LDH.
  • the mutated D-lactic acid producing strain may be a strain in which the polynucleotide encoding the D-LDH is substituted at the polynucleotide position encoding the L-LDH in the chromosome of the L-type lactic acid producing strain and overexpressed.
  • the mutated D-lactic acid producing strain is not particularly limited thereto, but preferably, the polynucleotide (SEQ ID NO: 27) and the LDH2 encoding polynucleotide (SEQ ID NO: 28) are lactobacillus del, respectively.
  • Strains substituted with a polynucleotide encoding and a polynucleotide encoding LDHD (SEQ ID NO: 32) from Lactobacillus plantarum;
  • the polynucleotide encoding the LDH of Lactobacillus paracasei (SEQ ID NO: 25) and the polynucleotide encoding the LDH1 (SEQ ID NO: 26), respectively, the polynucleotide encoding the LDHA (SEQ ID NO: 31) derived from Lactobacillus delbrueki, and lactose.
  • the polynucleotide encoding (SEQ ID NO: 26) is substituted with a polynucleotide encoding LDHA (SEQ ID NO: 31) derived from Lactobacillus delbruecki and a polynucleotide encoding LDHD (SEQ ID NO: 32) derived from Lactobacillus plantarum, respectively.
  • D-type lactic acid is produced by using each transformant having a polynucleotide encoding a polynucleotide encoding LDHD (SEQ ID NO: 32) derived from polynucleotide and Lactobacillus plantarum, and the yield, productivity, production amount of D-type lactic acid, etc.
  • the inventors have found that the polynucleotide encoding the LDH of Lactobacillus paracasei (SEQ ID NO: 25) and the polynucleotide encoding the LDH1 (SEQ ID NO: 26) exhibit the highest level in terms of yield, productivity, and production of type D lactic acid.
  • Transformants (Lb.paracasei ldh) substituted with polynucleotides encoding LDHA (SEQ ID NO: 31) derived from Lactobacillus delbruecki and polynucleotides encoding LDHD (SEQ ID NO: 32) derived from Lactobacillus plantarum, respectively.
  • KCCM Lactobacillus paracasei CC02-0095 and abbreviated as “KCCM”, the Korean Culture Center of Microorganisms, an international depository under the Treaty of Budapest on April 2, 2012. Was deposited with accession number KCCM11273P.
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing the mutated D-type lactic acid producing strain to obtain a culture; And, (b) provides a method for producing D-type lactic acid, comprising the step of recovering D-type lactic acid from the culture.
  • the mutated D-lactic acid producing strain provided by the present invention was produced to produce D-type lactic acid by mutating the L-type lactic acid producing strain excellent in lactic acid productivity. Therefore, when culturing the mutated D-type lactic acid producing strain, since the D-type lactic acid produced in the cultured strain may accumulate in the strain or in the culture medium, the D-type lactic acid accumulated in the culture strain or in the culture medium. By recovering D-type lactic acid can be produced.
  • the term "culture” means all the activities performed to grow microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the culture is performed for the purpose of producing D-type lactic acid from the mutated D-lactic acid producing strain
  • the specific method of performing the culture can produce D-type lactic acid from the mutated D-lactic acid producing strain
  • limit especially, if possible, it can carry out using all the methods well known in the art, Preferably it can be performed using a batch culture method, a fed-batch culture method, or a continuous culture method.
  • the medium used for the cultivation preferably meets the requirements of the specific strain in an appropriate manner while controlling the temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, amino acids, vitamins and the like.
  • Carbon sources that can be used include mixed sugars of glucose and xylose as the main carbon source, and sugars and carbohydrates such as sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut Oils such as oils and fats, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that can be used include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation product, skim soy cake or its degradation product Can be. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • the medium may include, as personnel, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate and corresponding sodium-containing salts.
  • Personnel that may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate and calcium carbonate may be used.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors to the culture medium may be used.
  • the above-mentioned raw materials may be added batchwise, fed-batch or continuous in a manner appropriate to the culture during the culturing process.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • the temperature of the culture is usually 27 ° C to 37 ° C, preferably 30 ° C to 35 ° C.
  • Incubation is continued until the maximum amount of D-type lactic acid is obtained. This object is usually achieved in 10 to 100 hours.
  • type D lactic acid is excreted in the culture medium, but may be contained in the cells in some cases.
  • the step of recovering the D-lactic acid from the culture may be performed by a method known in the art.
  • the known D-type lactic acid recovery method is not particularly limited as long as it can recover the D-type lactic acid present in the culture, preferably, centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, Electrophoresis, fractional dissolution (e.g., ammonium sulfate precipitation, etc.), chromatography (e.g., ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, size exclusion chromatography, etc.) can be used.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of analyzing the ratio of D-type lactic acid and L-lactic acid produced in 10 wild-type lactic acid bacteria.
  • L-lactic acid-producing strains are known to have better overall lactic acid production yields than D-lactic acid-producing strains, the overall productivity of lactic acid is superior to the above 10 strains, and the proportion of L-lactic acid is overwhelming.
  • Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei
  • Lactobacillus casei Lactobacillus casei
  • Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus
  • each gene encoding the L-LDH of the three lactic acid bacteria has a very similar nucleotide sequence, in particular ldh1 of Lactobacillus casei is known as the major L-lactic acid production gene (J. Ind. Microbiotechnol., 2008, 35: 579-586).
  • ldh2 of Lactobacillus casei was co-deleted with ldh1 to produce relatively optically pure D-lactic acid bacteria as a second L-lactic acid producing gene.
  • a vector for the L-LDH gene deletion of Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus selected in Example 2 was prepared.
  • ldh and ldh1 of Lactobacillus paracasei ldh1 and ldh 2 of Lactobacillus cassei
  • the ORF peripheral sequence of LGG02523 and LGG00606 genes of Lactobacillus rhamnosus was designated as the homologous base sequence to prepare a primer of SEQ ID NO: 1 to 24 (Table 2).
  • 700 base sequences (ldh.pc_UP_700) of the ldh gene ORF and 700 of the 3 'region Dog base sequence (ldh.pc_DOWN_700) was amplified.
  • 700 base sequences (ldh1.pc_UP_700) of the 5 'region of the ldh1 gene ORF and 700 base sequences (ldh1.pc_DOWN_700) of the 3' region ) was amplified.
  • the amplified DNA fragments ldh.pc_UP_700, ldh.pc_DOWN_700, and ldhA were subjected to overlap PCR using the primers of SEQ ID NOs: 1 and 6 to have homologous sequences around the ldh ORF, with D- in the center.
  • a cassette of ⁇ ldh.pc-ldhA (Lb.db) in which lactate dehydrogenase was located was prepared.
  • the same procedure was performed for the ldh1 gene to prepare a ⁇ ldh1.pc-ldhD (Lb.pl) cassette. At this time, each cassette was designed to include XhoI at 5 'end and SpeI restriction enzyme region at 3' end.
  • primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 and primers of SEQ ID NOs: 5 and 6 were amplified (ldh1.ca_UP_700) and 700 base sequences (ldh1.ca_DOWN_700) of the 3 'region.
  • ldh1.ca_UP_700, ldh1.ca_DOWN_700, and ldhA were subjected to overlap PCR using primers of SEQ ID NOs: 1 and 6 to have homologous sequences around the ldh1 ORF, with D-lactate dehydrogenase in the center.
  • a cassette of ⁇ ldh1.ca-ldhA (Lb.db) was prepared.
  • the same process was performed for the ldh2 gene to prepare a ⁇ ldh2.ca-ldhD (Lb.pl) cassette.
  • 700 base sequences (LGG_00606_UP_700) and 5 base sequences (LGG_00606_DOWN_700) of the 5 'region of the LGG_00606 gene ORF were amplified using the primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 and primers of SEQ ID NOs: 23 and 24. .
  • the amplified DNA fragments LGG_02523_UP_700, LGG_02523 _DOWN_700 and ldhA were subjected to overlap PCR using primers of SEQ ID NOs: 13 and 18 to have homologous sequences around the LGG_02523 ORF, with D-lactate D in the middle.
  • a cassette of ⁇ LGG_02523-ldhA (Lb.db) in which the hydrogenase was located was prepared.
  • the same procedure was followed for the LGG_00606 gene to prepare a ⁇ LGG_00606-ldhD (Lb.pl) cassette.
  • each cassette was designed to include XhoI at 5 'end and SpeI restriction enzyme region at 3' end.
  • the culture was centrifuged to remove the medium to obtain the cells, which were washed twice with washing buffer (5 mM sodium phosphate, 1 mM MgCl 2 , pH.7.4). Then, 25 ⁇ l of 0.5 M sucrose solution was added to the strain, suspended, and 50 ⁇ l were dispensed. 200ng of each vector prepared in Example 3 was added to the divided strains, and electroporation was performed under conditions of 1800v, 25F, and 200 ⁇ . Then, the strain was incubated in 500 ⁇ l MRS medium at 37 ° C. for 2 hours, plated in solid MRS medium containing 10 ⁇ g / ml of erythromycin (MRSE) and incubated at 30 ° C. for 3 days to obtain colonies. It was.
  • washing buffer 5 mM sodium phosphate, 1 mM MgCl 2 , pH.7.4
  • 25 ⁇ l of 0.5 M sucrose solution was added to the strain, suspended, and 50 ⁇ l were dispense
  • colonies obtained from a transformant derived from Lactobacillus paracasei (Lactobacillus strain introduced with plasmid pG + host6- ⁇ ldh1-ldhA including ldhA derived from Lactobacillus delbruecki) A part of was inoculated in 1 ml of liquid MRS medium containing 10 ⁇ g / ml of erythromycin, and cultured for 1 day at 42 ° C. to induce primary crossover. 100 ⁇ l of the culture was plated on a solid MRSE medium and cultured for 7 days, colonies were taken, passaged on a solid MRSE medium, and then cultured at 42 ° C. for 2 days to secure cells.
  • Lactobacillus paracasei Lactobacillus strain introduced with plasmid pG + host6- ⁇ ldh1-ldhA including ldhA derived from Lactobacillus delbruecki
  • Colonies secured in 1 ml MRS-dispensed 1.5 ml tubes were inoculated, respectively, and cultured at 37 ° C. for 1 day to induce secondary crossover.
  • a part of the cells cultured at 37 ° C was taken and colony PCR was performed to confirm that the ldhA (Lb.db) gene was inserted in the region of ldh1, and single colonies were selected from the solid MRS medium.
  • the ldh gene deletion and insertion confirmation PCR of D-lactate dehydrogenase were performed on individual single colonies again to finally produce ldh1 :: ldhA (Lb.db) strain.
  • ldh was deleted in the same manner and ldhD (Lb.pl) was inserted to prepare a final D-lactic acid-producing strain lacking two L-lactate dehydrogenases.
  • L-lactate dehydrogenase was deleted from each strain in the same process for Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus, so as to produce a D-type lactic acid-producing strain.
  • D-lactic acid-producing strains having Lb.plantarum as a parent strain are strains which are missing one or both of two L-type lactate dehydrogenases of their own (Appl. Environ. Microbiol. 2009) 462 ⁇ 467) is a strain produced by a similar approach. This strain has a genotype of ldhL1 or ldhL2 deficient in L-lactic acid dehydrogenase, and both strains produce D-lactic acid with an optical purity of 99% or more.
  • two D-type lactic acid producing strains based on Lactobacillus plantarum and three newly produced recombinant Lactobacillus strains were cultured in solid MRS medium for 1 day, and the obtained cells were taken in a single loop and liquid MRS. Inoculation was further incubated at 37 ° C for 1 day.
  • a total of five recombinant Lactobacillus strains were inoculated in a 250 ml baffle flask in a 25 ml GY liquid medium with an initial cell concentration of 600 nm at an optical density of 0.1.
  • the incubation temperature was carried out in an incubator at 37 °C, agitation conditions 100 rpm and the total incubation time is 42 hours.
  • ldh SEQ ID NO: 25
  • ldh1 SEQ ID NO: 26
  • ldhA derived from Lactobacillus delbruecki
  • a transformant Lb.paracasei ldh :: ldhA ldh1 :: ldhD
  • SEQ ID NO: 31 a gene encoding
  • SEQ ID NO: 32 a gene encoding ldhD

Abstract

본 발명은 L형 젖산 생산균주에서 L형 젖산 탈수소효소(L-LDH)의 활성을 억제하고, D형 젖산 탈수소효소(D-LDH)의 활성을 도입하는 단계를 포함하는 변이된 D형 젖산 생산균주의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 변이된 D형 젖산 생산균주 및 및 상기 균주를 배양하고 배양물로부터 D형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 D형 젖산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 D형 젖산 생산균주는 L형 젖산 생산능이 우수한 생산균주를 변이시켜 제작된 것으로서, D형 젖산의 생산성이 우수하므로, D형 젖산을 원료로 사용하는 각종 제품의 생산성을 향상시키는데 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 Ｄ형 젖산 생산균주 및 그의 용도
본 발명은 신규한 D형 젖산 생산균주 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 L형 젖산 생산균주에서 L형 젖산 탈수소효소(L-LDH)의 활성을 억제하고, D형 젖산 탈수소효소(D-LDH)의 활성을 도입하는 단계를 포함하는 변이된 D형 젖산 생산균주의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 변이된 D형 젖산 생산균주 및 및 상기 균주를 배양하고 배양물로부터 D형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 D형 젖산의 제조방법에 관한 것이다.
젖산은 식품 분야, 의약분야, 화장품 분야 등 산업 분야에서 다양하게 이용되고 최근에는 폴리유산의 단량체로 활용되어 그 요구량이 크게 증가하고 있다.
젖산을 생산하는 방법으로는 전통적인 화학합성법과 탄수화물을 기질로 하는 생물학적 발효법이 있다. 상업적으로는 후자의 방법이 선호되는데, 그 이유는 화학합성법을 이용해 젖산을 제조하는 경우 유가상승에 의한 원가상승 측면이나 환경오염 측면의 문제점 외에도 D형 젖산과 L형 젖산이 50%씩 섞여있는 라세믹(racemic) 혼합물 형태의 비활성인 D형 또는 L형 젖산이 생성된다는 단점 때문이다. 이때에 D형과 L형 젖산의 혼합물 조성비는 조절이 불가능하며, 라세믹 혼합물 형태의 젖산을 원료로 폴리유산을 제조할 경우 용융점이 낮은 무정형의 고분자가 되어 용도 개발 시에도 제한이 많다. 반면에 미생물을 이용한 생물학적 발효법의 경우 사용하는 균주에 따라서 D형 또는 L형의 젖산만을 선택적으로 생산하는 것이 가능하다. 예를 들면, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 리조푸스 속(Rhizopus sp.), 스트렙토코코스 속(Streptococcus sp.), 엔테로코코스 속(Enterococcus sp.) 등의 미생물은 L형 젖산을 주로 생산하며, 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 미생물과 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus vulgaricus)는 D형 젖산을 주로 생산하는 것으로 알려져 있다. 특히, D형 젖산은 체내에서 대사되지 않는다는 특징이 있어서, 이를 이용하여 의료분야에서 생체적 합성 재료용으로 사용될 뿐 아니라 에스테르화 및 염소화함으로써 광학활성 제초제로서도 사용될 수 있는데, 제초제가 광학활성을 갖는다면 약효가 훨씬 향상되고 적은 살포량으로도 동일한 효과를 나타낸다는 것이 확인되어 D형 젖산의 수요가 증가하고 있다. 뿐만 아니라, sc-폴리유산(stereocomplex-PLA)은 기존의 폴리유산과 비교하여 융점 및 열분해온도가 크게 상승되어 고내열성 플라스틱 원료로 이용 가능하며, 이는 순수한 L형 폴리유산에 순수한 D형 폴리유산이 혼합되어 생산된다. 결과적으로 D형 폴리유산의 단량체로 D형 젖산이 필요하게 되어 이의 수요는 점점 증가하게 된다.
이러한 광학적으로 순수한 D형의 젖산은 미생물 효소의 광학특이적 기질선택성을 이용한 생물학적 발효법이 바람직하나, 자연계에 존재하는 일반적인 야생형 D형 젖산 생산 미생물은 산업 용도로 사용하기에는 젖산의 광학순도면에서나 생산성 측면에서 아직 불리한 점이 있다. 대표적인 D형 젖산 생산 미생물로 Lb. plantarum, Lb. pentosus, Lb. fermentum, Lb delbrueckii 등이 있으나 일반적으로 고생산성과 고수율로 젖산을 생산하지 못하고 있으며 광학불순물로 L형의 젖산을 20~40% 포함하고 있다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여, EMS(ethyl methanesulfonate) 처리를 한 변이 젖산균을 유도, 선별하여 고농도 포도당 함유 배지에서 고농도 젖산을 생산하는 변이주를 확보하고자 하였다(J. Industrial Microbiol, 11:23-28, 1992). 그 결과 대조구에 비해 약 4.8배 생산성이 향상된 균주를 선별하였으나 균주의 장기간 보관에 따른 활성 감소가 수반되었다. 한편, 변이주를 이용한 균주 개발은 일반적으로 수율 향상주는 생산성이 감소되고 반대로 생산성이 향상되면 수율이 감소되는 경향을 보인다.
본 발명자들은 현재까지 산업적으로 안정적인 젖산 발효의 모균주는 L형 젖산 생산을 기반으로 하는 미생물이며 대체로 이들 미생물이 D형 젖산을 생산하는 미생물 보다 젖산 생산성과 수율이 우수하다는 점에 착안하여 고생산성 L형 젖산 생산 미생물로부터 L형 젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)를 코딩하는 유전자를 불활성화시키고, 외래의 D형 젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase, D-LDH)를 코딩하는 유전자를 도입한 결과, D형 젖산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 L형 젖산 생산균주에서 L형 젖산 탈수소효소의 활성을 약화 또는 불활성화시키고, D형 젖산 탈수소효소의 활성을 도입 또는 강화시키는 단계를 포함하는 변이된 D형 젖산 생산균주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어 변이된 D형 젖산 생산균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이된 D형 젖산 생산균주를 이용하여 D형 젖산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 D형 젖산 생산균주는 젖산의 생산성이 우수한 L형 젖산 생산균주를 변이시켜 제작된 것으로서, D형 젖산의 생산성이 우수하므로, D형 젖산을 원료로 사용하는 각종 제품의 생산성을 향상시키는데 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 10종의 야생형 젖산균에서 생산된 D형 젖산과 L형 젖산의 비율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 L형 젖산 생산균주에서 L형 젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)의 활성을 약화 또는 불활성화시키고, D형 젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase, D-LDH)의 활성을 도입 또는 강화시켜서 변이된 D형 젖산 생산균주를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 변이된 D형 젖산 생산균주의 제조방법은 (a) L형 젖산 생산균주에서 L형 젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)의 활성을 약화 또는 불활성화시켜서, 변이된 젖산 생산균주를 수득하는 단계; (b) 상기 변이된 젖산 생산균주에 D형 젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase, D-LDH)의 활성을 도입 또는 강화시키는 단계를 포함한다.
이때, 상기 L형 젖산 생산균주는 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 만을 단독으로 발현시켜서 L형 젖산을 생산하는 균주 또는 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 동시에 발현시켜서 L형 젖산과 D형 젖산을 함께 생산하는 균주가 될 수 있고; L-LDH의 활성을 약화 또는 불활성화시키는 방법은 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 위치에서 1개 또는 수 개의 뉴클레오티드를 치환, 결실, 삽입 또는 부가시켜 수행할 수 있으며; D-LDH의 활성을 도입 또는 강화시키는 방법은 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 개량된 활성을 나타내도록 변이된 D-LDH 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 존재하는 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 개량된 활성을 나타내는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 개량된 활성을 나타내는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 개량된 활성을 나타내도록 변이된 D-LDH 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주에 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주에 개량된 활성을 나타내도록 변이된 D-LDH 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주에 개량된 활성을 나타내는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법 또는 변이된 젖산 생산균주에 개량된 활성을 나타내는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 개량된 활성을 나타내도록 변이된 D-LDH 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법 등을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 용어 "젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)"란, NADH를 이용하여 젖산으로부터 수소를 제거하여 피루브산을 생성하거나 또는 피루브산을 환원시켜서 젖산을 생성하는 반응을 촉매하는 세포질성 효소를 의미한다, 상기 LDH는 약 140kDa의 분자량을 나타내고, L형 젖산을 생성하는 L-LDH(EC 1.1.1.27.), D형 젖산을 생성하는 D-LDH(EC 1.1.1.28.), FMN 및 헴을 함유하는 L-LDH(시토크롬 b2, EC 1.1.2.3) 등으로 분류될 수 있다.
본 발명의 용어 "L형 젖산 생산균주"란, L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 자체적으로 발현시키고, 생성된 L-LDH를 이용하여 L형 젖산을 생산하는 균주를 의미하는데, L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 만을 단독으로 발현시켜서 L형 젖산을 생산하는 균주 뿐만 아니라, L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 동시에 발현시켜서 L형 젖산과 D형 젖산을 함께 생산하는 균주를 포함한다. 상기 L형 젖산 생산균주는 L형 젖산을 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus case) 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 카세이 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이가 될 수 있다.
상기 L형 젖산 생산균주로부터 L-LDH의 활성을 약화 또는 불활성화시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 L형 젖산 생산균주에 내재된 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 위치에서 1개 또는 수 개, 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개, 가장 바람직하게는 2 내지 5개의 뉴클레오티드를 치환, 결실, 삽입 또는 첨가시켜서 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하거나 또는 불활성화된 L-LDH를 생산하는 방법을 사용할 수도 있고, 그 외에도 L형 젖산 생산균주로부터 L-LDH의 활성을 약화 또는 불활성화시키는 결과를 도출할 수 있는 방법이라면 특별히 이에 제한되지 않고 사용될 수 있다.
본 발명에서 활성을 약화시키거나 또는 불활성화시키는 대상이 되는 L-LDH는 상기 L형 젖산 생산균주에서 내재적으로 생성되는 L-LDH가 될 수 있으므로 L-LDH의 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열(서열번호 25) 및 LDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열(서열번호 26), 락토바실러스 카세이의 LDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열(서열번호 27) 및 LDH2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열(서열번호 28), 락토바실러스 람노서스의 LGG_02523을 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열(서열번호 29) 및 LGG_00606 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열(서열번호 30) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "변이된 젖산 생산균주"란, L-LDH의 활성을 약화 또는 불활성화시킨 L형 젖산 생산균주를 의미한다. 상기 변이된 젖산 생산균주는 정상적인 L형 젖산 생산균주에 인위적으로 돌연변이를 유발시켜서 L-LDH의 활성을 약화 또는 불활성화시킨 변이균주가 될 수도 있고, 인위적인 변이를 유발시키지 않고, 천연적으로 발생되는 돌연변이에 의하여 L-LDH의 활성이 약화 또는 불활성화된 변이균주가 될 수도 있다.
상기 변이된 젖산 생산균주에 D-LDH의 활성을 도입 또는 강화시키는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 개량된 활성을 나타내도록 변이된 D-LDH 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 존재하는 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 개량된 활성을 나타내는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 개량된 활성을 나타내는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 개량된 활성을 나타내도록 변이된 D-LDH 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주에 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주에 개량된 활성을 나타내도록 변이된 D-LDH 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주에 개량된 활성을 나타내는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법, 변이된 젖산 생산균주에 개량된 활성을 나타내는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 개량된 활성을 나타내도록 변이된 D-LDH 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "발현벡터"란, 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 생산물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 발현벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상적으로 사용되는 발현벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에서 사용되는 벡터는 그람양성균에서 넓은 범위의 숙주에 사용되는 벡터인 pG+host6이다. 이 벡터의 특징으로는 대장균에서 사용이 가능하기 위한 암피실린 내성 유전자와 대장균용 복제원점, 그람양성균에서 사용이 가능하기 위한 에리트로마이신 내성 유전자와 그람양성균용 복제원점을 가지고 있다는 점이다. 특히 그람양성균용 복제원점은 열민감성 변이가 포함되어 있어 37℃ 이상의 온도에서는 복제가 되지 않으며 이러한 특징은 그람 양성균에서 상동염기서열을 통한 유전자 삽입을 가능하게 한다 (미국 공개특허 20060025190).
본 발명의 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 발현산물인 mRNA 또는 단백질을 생산하는 일련의 작업을 의미한다. 상기 숙주세포에 도입되는 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 한, 어떠한 형태라도 무방하다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소(상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위, 번역 종결신호 등)를 포함하는 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있는데, 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 D-LDH는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 D형 젖산을 대량으로 생산되는 균주로부터 유래된 것이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼 또는 락토바실러스 델브루에키 등으로부터 유래된 것이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 델브루에키 유래의 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 락토바실러스 플란타럼 유래의 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 될 수 있다. 또한, 상기 서열번호 31 또는 32의 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 다수개(단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위된 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 상기 D-LDH의 활성을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 서열번호 31 또는 32의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 폴리펩티드가 갖는 활성을 나타내는 효소의 아미노산 서열에 차이가 있을 수 있기 때문에 특별히 이에 제한되지는 않으며, 상기 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 D-LDH의 활성을 함유하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 생기는 돌연변이 서열 또는 인위적인 변이 서열까지도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "상동성"이란, 서로 다른 두 아미노산 서열 또는 염기서열 사이의 동일성을 의미하는데, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
통상적으로 L형 젖산을 생산하는 균주가 D형 젖산을 생산하는 균주보다도 전체적인 젖산의 생산수율이 우수하다고 알려져 있으므로, 본 발명자들은 L형 젖산을 생산하는 균주를 D형 젖산을 생산하는 균주로 변이시킴으로써, D형 젖산의 생산성이 우수한 균주를 제작하고자 하였다. 이를 위하여, 야생형 락토바실러스속 균주의 D형 및 L형 젖산 발효 비율을 비교한 결과, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 카세이 및 락토바실러스 람노서스 균주가 젖산의 전체적인 생산성이 우수하고, L형 젖산의 비율이 압도적으로 우수함을 확인하고, 이들의 변이균주를 작제하고자 하였다(도 1). 예를 들어, 락토바실러스 파라카세이에서 유래된 L-LDH 유전자인 ldh 및 ldh1를 결손시키고, 동시에 D-LDH를 삽입 하기 위한 카세트인 δldh1-ldhA(Lb.db)와 δldh-ldhD(Lb.pl)를 각각 제작하고, 이를 열 민감성 벡터인 pG+host6에 도입하여, pG+host6-δldh1-ldhA(Lb.db) 와 pG+host6-δldh-ldhD(Lb.pl)의 2종 벡터를 제작하였다(실시예 3). 이어, 상기 각 벡터를 L-LDH 유전자가 결실된 락토바실러스 파라카세이에 도입하여, L-LDH의 활성이 약화 또는 불활성화되고, D-LDH의 활성이 증강된 형질전환체를 제조하였다(실시예 4). 상기 제조된 형질전환체를 배양하고, 이로부터 생산되는 젖산을 분석한 결과, D형 젖산이 41.6g/L의 농도로 생산되고 L형 젖산은 생산되지 않으며, 상기 생산된 D형 젖산의 생산수율은 공지된 D형 젖산 생산균주에서 생산되는 D형 젖산의 생산수율보다 우수함을 확인하였다(실시예 5).
따라서, 전체적인 젖산의 생산수율이 우수한 L형 젖산 생산균주에서, L-LDH의 활성을 약화 또는 불활성화시키고, D-LDH의 활성을 도입하거나 또는 증강시킬 경우, 종래의 D형 젖산 생산균주 보다도 우수한 생산수율로 D형 젖산을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조되어, L-LDH의 활성을 나타내는 L형 젖산 생산균주에서, 상기 L-LDH의 활성이 약화 또는 불활성화되고, D-LDH의 활성을 나타내거나 또는 증강되도록 변이된 D형 젖산 생산균주를 제공한다.
상기 변이된 D형 젖산 생산균주는 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 L형 젖산 생산균주의 염색체 내의 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 위치에 치환되고 과발현된 균주가 될 수 있다. 상기 변이된 D형 젖산 생산균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 락토바실러스 카세이의 LDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 27) 및 LDH2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 28)가 각각 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환된 균주; 락토바실러스 람노서스의 LDH(LGG_02523)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 29) 및 LDH(LGG_00606)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 30)가 각각 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환된 균주; 락토바실러스 파라카세이의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 25) 및 LDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 26)가 각각 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환된 균주 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 25) 및 LDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 26)가 각각 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환된 균주가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Lactobacillus paracasei CC02-0095(KCCM11273P)가 될 수 있다.
본 발명자들은 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 카세이 및 락토바실러스 람노서스 균주에 존재하는 각각의 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 결손시키고, 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 각각의 형질전환체를 이용하여 D형 젖산을 생산하고, D형 젖산의 수율, 생산성, 생성량 등을 비교한 결과, 락토바실러스 파라카세이 유래의 형질전환체(Lb.paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD)가 수율, 생산성 및 D형 젖산의 생성량의 측면에서 가장 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
이에, 본 발명자는 수율, 생산성 및 D형 젖산의 생성량의 측면에서 가장 높은 수준을 나타내는 락토바실러스 파라카세이의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 25) 및 LDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 26)를 각각 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환시킨 형질전환체(Lb.paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD)를 Lactobacillus paracasei CC02-0095로 명명하고, 2012년 4월 2일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11273P로 기탁하였다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 상기 변이된 D형 젖산 생산균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 D형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는, D형 젖산의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 변이된 D형 젖산 생산균주는 젖산의 생산성이 우수한 L형 젖산 생산균주를 변이시켜 D형 젖산을 생산하도록 제작되었다. 따라서, 상기 변이된 D형 젖산 생산균주를 배양하면, 상기 배양된 균주에서 생산된 D형 젖산이 균주의 내부 또는 배양액에 축적될 수 있으므로, 상기 배양된 균주의 내부 또는 배양액에 축적된 D형 젖산을 회수함으로써 D형 젖산을 생산할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 배양은 변이된 D형 젖산 생산균주로부터 D형 젖산을 생산하려는 목적으로 수행되며, 상기 배양을 수행하는 구체적인 방법은 상기 변이된 D형 젖산 생산균주로부터 D형 젖산을 생산할 수 있게 하는 한 특별히 제한되지 않으나, 당업계에 널리 알려져 있는 모든 방법을 이용하여 수행할 수 있고, 바람직하게는 회분식 배양방법, 유가식 배양방법 또는 연속식 배양방법을 이용하여 수행될 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킴이 바람직하다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 D형 젖산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적은 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다. 대체로 D형 젖산은 배양 배지 중으로 배출되지만, 경우에 따라서는 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
아울러, 배양물로부터 D형 젖산을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 D형 젖산 회수 방법은 배양물에 존재하는 D형 젖산을 회수할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전 등), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피 등) 등의 방법을 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 야생형 락토바실러스속 균주의 D형 및 L형 젖산 발효 비율 확인
50㎖의 GY배지(5% dextrose, 1% yeast extract, 0.05% sodium citrate, 3% CaCO3, 0.02% MgSO4, 0.001% MnSO4, 0.001% FeSO4 및 0.001% NaCl)에 10종의 야생형 젖산균을 접종하여 37℃에서 40시간 동안 혐기 배양 한 뒤 발효액에 존재하는 D형 젖산과 L형 젖산의 비율을 HPLC 분석하였다(도 1). 도 1은 10종의 야생형 젖산균에서 생산된 D형 젖산과 L형 젖산의 비율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
통상적으로 L형 젖산을 생산하는 균주가 D형 젖산을 생산하는 균주보다도 전체적인 젖산의 생산수율이 우수하다고 알려져 있으므로, 상기 10종의 균주 중에서 젖산의 전체적인 생산성이 우수하고, L형 젖산의 비율이 압도적으로 많은 균주인 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 선발하고, 상기 선발된 균주를 D형 젖산 생산용 균주로 변이시키고자 하였다.
실시예 2: L형 젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase, L-LDH) 염기서열 비교
상기 실시예 1에서 선발된 각 균주에 대해 L형 젖산의 과생산을 유발하는 유전자를 결손시키기 위하여, 미국 국립생물정보센터(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov//www.ncbi.nlm.nih.gov) 에서의 검색을 통해 L-LDH를 코딩하는 각 유전자 간의 유사성을 비교 분석 하였다(표 1).
표 1 락토바실러스 파라카세이의 L-LDH 유전자와 유사 유전자의 상동성 비교
락토바실러스 파라카세이의 ldh와의 상동성 락토바실러스 파라카세이의 ldh1과의 상동성
락토바실러스 카세이 ldh1 100% 락토바실러스 카세이 ldh2 99%
락토바실러스 람노서스 ldh(LGG_02523) 91% 락토바실러스 람노서스 ldh(LGG_00606) 79%
상기 표 1에서 보듯이, 3종 젖산균의 L-LDH를 코딩하는 각 유전자는 서로 매우 유사한 염기서열을 가지고 있으며, 특히 락토바실러스 카세이의 ldh1은 주요한 L형 젖산 생산 유전자로 알려져 있다(J. Ind. Microbiotechnol., 2008, 35:579-586). 한편, 락토바실러스 카세이의 ldh2는 제2의 L형 젖산 생산 유전자로서 상대적으로 광학적으로 순수한 D형 젖산균을 제작하기 위하여 ldh1과 함께 동시결손하였다. 종합하면 총 3종의 모균주에서 각각 락토바실러스 파라카세이의 ldh, ldh1과 락토바실러스 카세이의 ldh1, ldh2, 및 락토바실러스 람노서스의 2종의 ldh들을 결손 대상 유전자로 선정하였다.
실시예 3: L-LDH 결손/D-LDH 삽입 벡터 제작
상기 실시예 2에서 선정한 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 카세이 및 락토바실러스 람노서스의 L-LDH 유전자 결손을 위한 벡터를 제작하였다. L-LDH의 결손과 동시에 D-LDH를 삽입 하기 위한 카세트를 제작하고자 락토바실러스 파라카세이의 ldh과 ldh1, 락토바실러스 카세이의 ldh1과 ldh2, 그리고 락토바실러스 람노서스의 LGG02523과 LGG00606 유전자의 ORF 주변 서열을 상동염기서열로 지정하고 서열번호 1부터 24의 프라이머를 제작하였다(표 2).
표 2 프라이머의 염기서열
서열번호 염기서열(5'-3') 주형
1 atatgcctcgagcgggatttcctaggccaacaatcat Lb.paracasei, Lb.casei
2 ttgcgtaagcaaaaattttagtcatggtgatatcatcctttcttatgtgc Lb.paracasei, Lb.casei
3 gcacataagaaaggatgatatcaccatgactaaaatttttgcttacgcaa Lb.delbrueckii
4 tggttgcttacttatcagtgatcgtgatgattagccaaccttaactggagtttca Lb.delbrueckii
5 tgaaactccagttaaggttggctaatcatcacgatcactgataagtaagcaacca Lb.paracasei, Lb.casei
6 atatgcactagtgcttgttaaggatttgtgtcaagcctt Lb.paracasei, Lb.casei
7 atctctcgagtctgacttacctttcggatcaaaat Lb.paracasei, Lb.casei
8 ctcaaattcctcctcatgaagatct Lb.paracasei, Lb.casei
9 cgtcaagatcttcatgaggaggaatttgagatgaaaattattgcatatgc Lb.plantarum
10 ccgttaagctgagcgcttaacctgacgagcttagtcaaacttaacttgcg Lb.plantarum
11 gctcgtcaggttaagcgctcagctt Lb.paracasei, Lb.casei
12 atatactagtccgttggctgggcattgcgtcattc Lb.paracasei, Lb.casei
13 ccccctcgagctggtaatacatcattaactgccgc Lb.rhamnosus
14 ttgcgtaagcaaaaattttagtcatggtgatatcatcctttcttatgtgc Lb.rhamnosus
15 gcacataagaaaggatgatatcaccatgactaaaatttttgcttacgcaa Lb.delbrueckii
16 ggtttaaaatcagttatggtgaagattagccaaccttaactggagtttca Lb.delbrueckii
17 tgaaactccagttaaggttggctaatcttcaccataactgattttaaacc Lb.rhamnosus
18 tagaactagtttattcagcacttgagtaagtcctt Lb.rhamnosus
19 ccccctcgagaaccaagcgtccaagaatgtttgct Lb.rhamnosus
20 gtacagcatatgcaataattttcatcctaaacccctccttgacaggtagc Lb.rhamnosus
21 gctacctgtcaaggaggggtttaggatgaaaattattgcatatgctgtac Lb.plantarum
22 aaaaatactgacgatgggttgtgttttagtcaaacttaacttgcgtatca Lb.plantarum
23 tgatacgcaagttaagtttgactaaaacacaacccatcgtcagtattttt Lb.rhamnosus
24 tagaactagtcaaccgttgtcgaaagcattgcggt Lb.rhamnosus
락토바실러스 파라카세이의 유전체를 주형으로 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 ldh 유전자 ORF의 5'영역의 700개 염기서열(ldh.pc_UP_700)과 3'영역의 700개 염기서열(ldh.pc_DOWN_700)을 증폭하였다. 또한, 서열번호 7 및 8의 프라이머와 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 ldh1 유전자 ORF의 5'영역의 700개 염기서열(ldh1.pc_UP_700)과 3'영역의 700개 염기서열(ldh1.pc_DOWN_700)을 증폭하였다.
한편, D-LDH 유전자를 증폭하기 위하여 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)와 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)의 유전체를 주형으로 서열번호 3 및 4와 9 및 10을 이용하여 ldhA(Lb.db)와 ldhD(Lb.pl)의 DNA 절편을 제작하였다.
그런 다음, 상기 증폭된 DNA 절편인 ldh.pc_UP_700, ldh.pc_DOWN_700 및 ldhA(Lb.db)를 서열번호 1 및 6의 프라이머를 이용한 오버랩 PCR 수행하여 ldh ORF 주변과 상동 염기서열을 가지며 가운데에는 D-락테이트 디히드로게나제가 위치하는 δldh.pc-ldhA(Lb.db)의 카세트를 제작하였다. 또한, ldh1 유전자에 대하여도 동일한 과정을 진행하여 δldh1.pc-ldhD(Lb.pl) 카세트를 제작하였다. 이때, 각각의 카세트는 5' 말단에 XhoI, 3' 말단에 SpeI 제한효소 영역을 포함하도록 디자인하였다.
락토바실러스 카세이의 ldh1 및 ldh2 유전자는 락토바실러스 파라카세이의 ldh 및 ldh1 유전자와 각각 높은 유사성을 지니고 있어 동일한 프라이머를 사용하였다. 락토바실러스 카세이의 유전체를 주형으로 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 (ldh1.ca_UP_700)과 3'영역의 700개 염기서열(ldh1.ca_DOWN_700)을 증폭하였다. 또한, 서열번호 7 및 8의 프라이머와 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 ldh2 유전자 ORF의 5'영역의 700개 염기서열(ldh2.ca_UP_700)과 3'영역의 700개 염기서열(ldh2.ca_DOWN_700)을 증폭하였다.
그런 다음, ldh1.ca_UP_700, ldh1.ca_DOWN_700 및 ldhA(Lb.db)를 서열번호 1 및 6의 프라이머를 이용한 오버랩 PCR 수행하여 ldh1 ORF 주변과 상동 염기서열을 가지며 가운데에는 D-락테이트 디히드로게나제가 위치하는 δldh1.ca-ldhA(Lb.db)의 카세트를 제작하였다. 또한, ldh2 유전자에 대하여도 동일한 과정을 진행하여 δldh2.ca-ldhD(Lb.pl) 카세트를 제작하였다.
락토바실러스 람노서스의 유전체를 주형으로 서열번호 13 및 14의 프라이머와 서열번호 17 및 18의 프라이머를 이용하여 LGG_02523 유전자 ORF의 5'영역의 700개 염기서열(LGG_02523_UP_700)과 3'영역의 700개 염기서열(LGG_02523 _DOWN_700)을 증폭하였다. 또한, 서열번호 19 및 20의 프라이머와 서열번호 23 및 24의 프라이머를 이용하여 LGG_00606 유전자 ORF의 5'영역의 700개 염기서열(LGG_00606_UP_700)과 3'영역의 700개 염기서열(LGG_00606_DOWN_700)을 증폭하였다.
한편, D-LDH 유전자를 증폭하기 위하여 락토바실러스 델브루에키와 락토바실러스 플란타럼의 유전체를 주형으로 서열번호 15 및 16와 21 및 22를 이용하여 ldhA(Lb.db)와 ldhD(Lb.pl)의 DNA 절편을 제작하였다.
그런 다음, 상기 증폭된 DNA 절편인 LGG_02523_UP_700, LGG_02523 _DOWN_700 및 ldhA(Lb.db)를 서열번호 13 및 18의 프라이머를 이용한 오버랩 PCR 수행하여 LGG_02523 ORF 주변과 상동 염기서열을 가지며 가운데에는 D-락테이트 디히드로게나제가 위치하는 δLGG_02523-ldhA(Lb.db)의 카세트를 제작하였다. 또한, LGG_00606 유전자에 대하여도 동일한 과정을 진행하여 δLGG_00606-ldhD(Lb.pl) 카세트를 제작하였다. 이때, 각각의 카세트는 5' 말단에 XhoI, 3' 말단에 SpeI 제한효소 영역을 포함하도록 디자인하였다.
이어, 암피실린과 에리트로마이신 내성유전자를 가지고 있어 대장균-유산균의 셔틀벡터로 사용되며 락토바실러스에서는 42℃에서 증폭되지 않는 특징을 가지는 열 민감성 벡터인 pG+host6에 XhoI, SpeI 제한효소 영역을 이용하여 상기 제작한 6종의 카세트를 각각 클로닝하여 pG+host6-δldh.pc-ldhA(Lb.db) 와 pG+host6-δldh1.pc-ldhD(Lb.pl), pG+host6-δldh1.ca-ldhA(Lb.db) 와 pG+host6-δldh2.ca-ldhD(Lb.pl), pG+host6-δLGG_02523-ldhA(Lb.db) 와 pG+host6-δLGG_00606-ldhD(Lb.pl)의 6종 벡터를 제작하였다.
실시예 4: 형질전환체의 제조
MRS 고체 배지에서 하루 배양한 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 카세이 또는 락토바실러스 람노서스 균주를 10㎖ MRS배지에 접종하여 1일간 37℃에서 정치 배양하였다. 50㎖ 튜브에 50㎖의 MRS를 넣은 뒤 1일 배양한 균체를 500㎕ 접종하여 3시간 30분 동안 37℃에서 정치 배양하고, OD600=0.8이 되는 시점에서 배양물을 ice bath에서 5분동안 방치하였다. 그런 다음, 상기 배양물을 원심 분리하여 배지를 제거하여 균체를 수득하고, 이를 세척용 완충액(5mM sodium phosphate, 1mM MgCl2, pH.7.4)으로 2회 세척하였다. 이어, 상기 균주에 25㎕의 0.5M 수크로스 용액을 가하고, 현탁시킨 다음, 50㎕씩 분주하였다. 분주된 균주에 상기 실시예 3에서 제작한 각각의 벡터를 200ng씩 가하고, 1800v, 25F 및 200Ω의 조건으로 전기천공법을 수행하였다. 그런 다음, 상기 균주를 500㎕의 MRS 배지에서 37℃에서 2시간 동안 배양하고, 10㎍/㎖의 에리트로마이신이 포함된 고체 MRS 배지(MRSE)에 도말하여 3일간 30℃에서 배양하여 콜로니를 수득하였다.
실시예 5: D-ldh 삽입 균주 제작
상기 실시예 4에서 수득한 콜로니 중에서, 락토바실러스 파라카세이로부터 유래된 형질전환체(락토바실러스 델브루에키 유래 ldhA를 포함한 플라스미드 pG+host6-δldh1-ldhA가 도입된 락토바실러스 균주)로 부터 수득한 콜로니의 일부를 10㎍/㎖의 에리트로마이신이 포함된 1㎖의 액체 MRS 배지에 접종하여 42℃에서 1일간 정치 배양하여 1차 crossover를 유도하였다. 상기 배양물 100㎕를 고체 MRSE 배지에 도말하여 7일 배양 후 콜로니를 취해 고체 MRSE 배지에 계대한 뒤 42℃에서 2일 배양하여 균체를 확보하였다. 1㎖의 MRS를 분주한 1.5㎖ 튜브에 확보한 콜로니를 각각 접종하여 37℃에서 1일간 정치 배양하여 2차 crossover를 유도하였다. 37℃에서 배양한 균체의 일부를 취해 콜로니 PCR을 수행하여 ldh1의 영역에 ldhA(Lb.db) 유전자가 삽입된 것을 확인하고 고체 MRS 배지에서 단독 콜로니를 선별하였다. 개별의 단독 콜로니에 대해 ldh 유전자 결손과 D-락테이트 디히드로게나제의 삽입 확인 PCR을 재차 수행하여 ldh1::ldhA(Lb.db) 균주를 최종적으로 제작하였다. 이 균주를 모균주로 하여 같은 방법으로 ldh를 결손하고 ldhD(Lb.pl)를 삽입하여 L-락테이트 디히드로게나제 2종이 결손된 최종 D형 젖산 생산 균주를 제작하였다.
한편, 락토바실러스 카세이와 락토바실러스 람노서스에 대해서도 동일한 과정으로 각 균주에서 2종의 L-락테이트 디히드로게나제를 결손하여 D형 젖산 생산 균주를 제작하였다.
비교예 1: 신규 재조합 D형 락토바실러스의 젖산 발효 시험
본 발명을 통해 신규 제작한 재조합 D형 락토바실러스를 본 발명자들이 보유하고 있는 기존의 통상적인 재조합 D형 젖산 생산 균주인 Lb. plantarum 기반의 2종 균주와 발효 성적을 비교하였다. 여기서 Lb.plantarum을 모균주로 하는 D형 젖산 생성균주라 함은 자체 L형 젖산 탈수소효소 2종 중에서 1종 또는 2종 모두를 결손한 균주로서 Okano등이 발표한 논문(Appl. Environ. Microbiol. (2009)462~467)과 유사한 접근으로 제작된 균주이다. 본 균주는 L형 젖산 탈수소효소에서 ldhL1 또는 ldhL2가 결손된 유전자형을 가지고 있으며 2종의 균주 모두 광학순도 99% 이상 D형의 젖산을 생산하는 균주이다.
구체적인 비교 실험에 있어서, 락토바실러스 플란타럼 기반의 2종의 D형 젖산 생산 균주와 신규 제작한 3종의 재조합 락토바실러스 균주들을 고체 MRS 배지에서 1일 배양하였고 얻어진 세포들을 1루프 취해 액체 MRS에 접종하여 37℃에서 1일 더 배양하였다. 총 5종의 재조합 락토바실러스 균주들을 250㎖ baffle 플라스크에서 25㎖ GY 액체 배지에 초기 세포 농도가 600 nm에서 0.1의 광학밀도가 되도록 접종하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 조건 100 rpm의 배양기에서 실험을 수행하였으며 총 배양시간은 42시간이다. 시료 배양액은 최초 접종 시점과 최종 발효 시점에서 각각 채취하였고 적정량을 원심분리한 후 상등액을 취하여 HPLC 분석하였다. 분석 결과, 초기 포도당 농도는 53 g/l였다. 분석된 데이터는 2회 반복하여 평균값으로 나타내었고 그 결과는 하기 표 3에 요약하였다. 모든 시료에서 생성된 젖산은 광학적으로 순수한 D형의 젖산인 것으로 효소적 정량을 통해 분석되었다 (Lactic acid, R-Biopharm, 독일).
표 3 각 균주의 젖산 생산성 비교
균주 수율(%) 생산성(g/l·h) 소모당(g/l) L형 젖산(g/l) D형 젖산(g/l)
Lb.plantarum ΔldhL1 81 0.81 42 0 34
Lb.plantarum ΔldhL1 ΔldhL2 75 0.69 39 0 29
Lb.paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD 93 1.2 53 0 49
Lb.casei ldh1::ldhA ldh2::ldhD 89 1.1 53 0 47
Lb.rhamnosus LGG_02523::ldhA LGG_00606::ldhD 85 0.99 49 0 42
상기 표 3에서 보듯이, 종래에 알려진 자체 L형 젖산 탈수소효소 2종 중에서 1종 또는 2종 모두를 결손한 균주(Lb.plantarum ΔldhL1 및 Lb.plantarum ΔldhL1 ΔldhL2) 보다는 본 발명에서 신규 제작한 3종의 재조합 락토바실러스 균주가 수율, 생산성 및 D형 젖산의 생성량의 측면에서 높은 수준을 나타냄을 확인하였다. 특히, 락토바실러스 파라카세이로부터 유래된 형질전환체(Lb.paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD)의 경우에는 수율, 생산성 및 D형 젖산의 생성량의 측면에서 가장 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
이에, 본 발명자는 수율, 생산성 및 D형 젖산의 생성량의 측면에서 가장 높은 수준을 나타내는 락토바실러스 파라카세이의 ldh(서열번호 25) 및 ldh1(서열번호 26)를 각각 락토바실러스 델브루에키 유래의 ldhA(서열번호 31)를 코딩하는 유전자 및 락토바실러스 플란타럼 유래의 ldhD(서열번호 32)를 코딩하는 유전자로 치환시킨 형질전환체(Lb.paracasei ldh::ldhA ldh1::ldhD)를 Lactobacillus paracasei CC02-0095로 명명하고, 2012년 4월 2일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11273P로 기탁하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위와 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2013003501-appb-I000001

Claims (24)

  1. L형 젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)의 활성이 약화 또는 불활성화되고, D형 젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase, D-LDH)의 활성이 증강되도록 변이된 D형 젖산 생산용 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 불활성화된 것인 균주.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 유래의 ldh(서열번호 25) 및 ldh1(서열번호 26), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 유래의 ldh1(서열번호 27) 및 ldh2(서열번호 28), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 유래의 ldh(LGG_02523)(서열번호 29) 및 ldh(LGG_00606)(서열번호 30)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 것인 균주.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 또는 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)로부터 유래된 것인 균주.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 락토바실러스 플란타럼 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것인 균주.
  7. 제1항에 있어서,
    1개 이상의 외래 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체 내의 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 위치에 치환되고 과발현되는 것인 균주.
  8. 제1항에 있어서,
    변이전 균주가 L-형 젖산을 대량으로 생산하는 균주인 균주.
  9. 제8항에 있어서,
    생산용 균주가 락토바실러스 속 유래의 균주인 균주.
  10. 제8항에 있어서,
    락토바실러스 카세이의 LDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 27) 및 LDH2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 28)가 각각 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환된 것인 균주.
  11. 제8항에 있어서,
    락토바실러스 파라카세이의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 25) 및 LDH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 26)가 각각 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환된 것인 균주.
  12. 제8항에 있어서,
    락토바실러스 람노서스의 LDH(LGG_02523)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 29) 및 LDH(LGG_00606)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 30)가 각각 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 락토바실러스 플란타럼 유래의 LDHD(서열번호 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환된 것인 균주.
  13. 제12항에 있어서,
    Lactobacillus paracasei CC02-0095(수탁번호: KCCM11273P)인 것인 균주.
  14. (a) L형 젖산 생산균주에서 L형 젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)의 활성을 약화 또는 불활성화시켜서, 변이된 젖산 생산균주를 수득하는 단계;
    (b) 상기 변이된 젖산 생산균주에 D형 젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase, D-LDH)의 활성을 도입 또는 강화시키는 단계를 포함하는 변이된 D형 젖산 생산균주의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 L형 젖산 생산균주는 락토바실러스 속 유래의 균주인 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 L형 젖산 생산균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus case)로 구성된 군으로부터 선택되는 균주인 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 L-LDH 활성의 약화 또는 불활성화는 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 또는 부가에 의해 수행되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 L-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 유래의 ldh(서열번호 25) 및 ldh1(서열번호 26), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 유래의 ldh1(서열번호 27) 및 ldh2(서열번호 28), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 유래의 ldh(LGG_02523)(서열번호 29) 및 ldh(LGG_00606)(서열번호 30)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제14항에 있어서,
    D-LDH 활성의 도입 또는 강화는 변이된 젖산 생산균주의 염색체에 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
  20. 제14항에 있어서,
    D-LDH 활성의 도입 또는 강화는 변이된 젖산 생산균주에 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 D-LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 델브루에키 유래의 LDHA(서열번호 31)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 락토바실러스 플란타럼 유래의 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것인 방법.
  22. (a) 제 1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변이된 D형 젖산 생산균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
    (b) 상기 배양물로부터 D형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는, D형 젖산의 생산방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 변이된 D형 젖산 생산균주는 Lactobacillus paracasei CC02-0095(KCCM11273P)인 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 D형 젖산의 회수는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
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