WO2009157209A1 - 細胞および組織の凍結保存用組成物 - Google Patents

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WO2009157209A1
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cryopreservation
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lysine
poly
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松村和明
須賀井一
玄丞烋
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株式会社バイオベルデ
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Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation agent that can reduce freezing and thawing damage of animal cells and tissues including humans.
  • the demand for this technology is expected to increase in the field of transplantation of other biological tissues such as skin, cornea, pancreatic islet, heart valve, and regenerative medicine using stem cells such as hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, ES cells, and iPS cells.
  • stem cells such as hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, ES cells, and iPS cells.
  • Cryopreservation methods are routinely used at temperatures below 0 ° C. for long-term preservation of water-containing substances such as plant and animal cells, tissues or foods.
  • water-containing substances such as plant and animal cells, tissues or foods.
  • water molecules crystallize during freezing while eliminating the medium of solutes and contaminants to form ice crystals consisting only of water molecules.
  • the medium of contaminants diffuses unevenly and freeze concentration occurs.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • glycerol glycerol
  • the cells are suspended in a physiological solution such as a culture solution containing a cryopreservative such as 5 to 20% dimethyl sulfoxide, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol, packed in a cryotube, cooled, and finally -80 ° C. Or it is generally stored frozen at an extremely low temperature of -196 ° C.
  • a physiological solution such as a culture solution containing a cryopreservative such as 5 to 20% dimethyl sulfoxide, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol, packed in a cryotube, cooled, and finally -80 ° C.
  • a cryopreservative such as 5 to 20% dimethyl sulfoxide, glycerin, ethylene glycol, propylene glycol
  • dimethyl sulfoxide is the most effective and frequently used.
  • dimethyl sulfoxide is physiologically toxic, especially at high concentrations, and is known to cause hypertension, nausea and vomiting in patients injected with cryopreserved cells. Due to the toxicity of dimethyl sulfoxide, there is also a problem that the survival rate and function of the thawed cells are lowered during culture or after being injected into a living body.
  • cryopreservatives such as glycerin are less effective, it is necessary to suspend the cells and leave them at room temperature or refrigerated for a while before freezing them, or strictly control the temperature with a program freezer or the like. In addition, there are problems such as low freezing protection effect and reduced function after thawing.
  • vitrification method a rapid freezing method containing a high concentration of frost damage protective substances such as dimethyl sulfoxide, acetamide, propylene glycol, and polyethylene glycol.
  • frost damage protective substances such as dimethyl sulfoxide, acetamide, propylene glycol, and polyethylene glycol.
  • the vitrification method is a method in which the moisture contained in the cells is made glassy by rapidly lowering the temperature, and the obstacle due to ice crystal formation is avoided.
  • the high-concentration antifreezing agent used at this time is highly toxic, there is a high possibility of damaging cells and tissues, and it is used only for tissue cryoprotection.
  • Patent Documents 3 to 4 when manufacturing ice for medicines, foods, and displays, salts such as sodium chloride and saccharides such as glucose and trehalose are also added. Furthermore, the addition of antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins produced by plants, fish and insects is known (Patent Documents 3 to 4).
  • water is generated at one electrode with an electrochemical reaction.
  • water is generated at the cathode electrode.
  • a part of the generated water moves to the anode side through the electrolyte membrane.
  • the gas flow in the fuel cell may be hindered.
  • battery performance may fall by supply of the gas to an electrode being hindered.
  • water retention is achieved by providing a hydrophilic coating film such as protein on the inside of the fuel cell, for example, the surface of the gas separator.
  • Patent Document 5 a method of adding an antifreeze protein that suppresses the growth of ice crystals from liquid water together with the polymer electrolyte to the curable resin that forms the surface layer of the solid polymer electrolyte membrane (Patent Document 5), but this also has problems such as high cost.
  • cryopreservation method including the quick freezing method
  • Dimethyl sulfoxide is known to induce differentiation such as HL-60 cells, and some cells are not suitable for preservation.
  • antifreeze protein and antifreeze glycoprotein are excellent in the effect of preventing freeze concentration, they are too expensive (1.3 million yen / g) and have limited application to foods.
  • an object of the present invention is to provide a cryopreservation agent that is low in toxicity and excellent in the effect of protecting cell tissues, in place of dimethyl sulfoxide.
  • the present invention provides an inexpensive and safe product that has the effect of preventing freeze-concentration equivalent to that of antifreeze protein and antifreeze glycoprotein when performing frozen storage and freeze-dry storage of foods and medicines. It is something to try.
  • the cryopreservation solution of the present invention contains substantially 1-50% of a polyamine having an amino group in the side chain, and the other composition is a physiological solution such as physiological saline or a culture solution component.
  • cryopreservation agents such as dimethyl sulfoxide, which are highly toxic by immersing animal cells and plant cells including various humans in the preservation solution and cryopreserving them in liquid nitrogen or liquid nitrogen vapor. Can be preserved while maintaining the survival rate and physiological activity. Since existing cryopreservatives such as dimethyl sulfoxide, glycerin, and ethylene glycol are not used, toxicity to frozen cells is kept low, and cryopreservation can be performed for a long time while maintaining the function. In addition, since protein components such as fetal bovine serum and albumin are not used, there is no concern about infectious diseases and the difference between lots due to biologics is not affected.
  • Polyamines having an amino group in the side chain are considered to have a cell-protecting effect because of their affinity for cell membranes.
  • polymer compounds with many carboxyl groups in the molecule have a high affinity with water, and help to expel the intracellular fluid quickly during freezing, thus providing a protective effect during cryopreservation of cells.
  • a further excellent cytoprotective effect upon freezing can be expected.
  • a polyamino acid having a cationic substituent such as an amino group in the side chain or a polymer compound having an anionic substituent such as a carboxyl group and a high molecular weight having both a cationic substituent and an anionic substituent.
  • cryopreservation agent of the present invention is less toxic than DMSO, it does not require washing after thawing, and can be cultured immediately by adding it to the medium as it is.
  • the present invention it is possible not only to stably carry out cryopreservation of experimental cultured cells, but also functional cells such as islets and stem cells, and stem cells such as ES cells, mesenchymal stem cells, and iPS cells. Since it can be stored without losing its function, it is expected that the efficiency of cell transplantation will be improved.
  • non-freezing polyamino acid of the present invention it is possible to suppress the deactivation of the physiologically active substance when the hydrate containing the physiologically active substance is frozen. Furthermore, by using the non-freezing polyamino acid of the present invention, it is possible to homogenize the diffusion of the components in a frozen product or a freeze-dried product obtained by freezing or freeze-drying a hydrate containing components other than water molecules. it can. Examples of frozen products include ice cream, sherbet, ice confectionery, display ice, and frozen soup. Examples of the freeze-dried product include powdered freeze-dried foods and pharmaceuticals produced by freeze-drying.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing a state in which L929 cells are frozen in a 7.5% solution of 63% PLL succinic anhydride, transferred to a plate as they are without washing or dilution after thawing, and cultured for 24 hours.
  • the cryopreservation solution of the present invention is obtained by dissolving 1-50 w / w% of a polymer compound such as polylysine in a physiological solution. It is preferably 2 to 20 w / w%, particularly preferably 3 to 15 w / w%, more preferably 5 to 10 w / w%.
  • a physiological solution a general culture solution for various cells or tissues can be used in addition to physiological saline.
  • Dulbecco's modified Eagle MEM medium (DMEM) can be mentioned as a preferable one.
  • polyallylamine can also be used.
  • a compound selected from other polyamines such as aminated polysaccharide, polyamino acids such as polyarginine, polyglutamic acid, polyaspartic acid and aminated polysaccharide
  • polyamino acids such as polyarginine, polyglutamic acid, polyaspartic acid and aminated polysaccharide
  • polycarboxylic acids such as polyacrylic acid
  • polysaccharides selected from the group consisting of dextran, dextrin, pullulan, and chitosan can also be used.
  • a polymer compound in which a monomer having both a cationic substituent and an anionic substituent in the same molecule is polymerized, particularly a polyamino acid can be mentioned as a preferable one.
  • the repeating unit of the polymer compound has both an amino group and a carboxyl group.
  • the polylysine may be any one of ⁇ -poly-L-lysine or ⁇ -poly-D-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, and ⁇ -poly-D-lysine.
  • the polymer compound as the cryoprotective component has a molecular weight of 100 to 100,000.
  • ⁇ -poly-L-lysine having a number average molecular weight of b1000 to 20,000, particularly 1,000 to 10,000 produced by a microorganism or an enzyme can be mentioned.
  • ⁇ -Poly-L-lysine is produced exclusively by actinomycetes belonging to the genus Streptomyces and is used exclusively as a food additive (http://www.chisso.co.jp/fine/jp/ polylisin / index.html), in addition to those having a polymerization degree of 15 to 35, production of those having a polymerization degree of 20 or less has also been attempted (for example, JP 2003-171463, JP 2005-318815).
  • the number average molecular weight or the number average degree of polymerization is measured by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), for example, by using an electrophoresis apparatus manufactured by Ato Co., Ltd. and a densitograph (AE-6920V type). And can be easily measured. At this time, a standard protein marker is used. Polylysine can also be used with a molecular weight of 30,000 or more by increasing the molecular weight by heat treatment. However, the above molecular weight range is preferable from the viewpoint of preventing an increase in viscosity.
  • Polylysine which has a free carboxyl group only at the terminal, has only a primary amino group in the side chain, but has excellent miscibility by partially amidating with carboxylic anhydride as described later. Or it is thought that solubilization performance is exhibited. In particular, excellent performance can be exhibited by reacting dicarboxylic anhydride or the like to partially carboxylate.
  • particularly preferred polymer species used in the present invention include polyallylamine having a weight average molecular weight of 1000 to 1000000, preferably 1000 to 20,000.
  • an allylamine polymer (PAA-03 from Nittobo Co., Ltd.) added with acetic anhydride or acetic acid or a partially methoxycarbonylated allylamine polymer (PAA-U5000 from Nittobo Co., Ltd.) Can do.
  • PAA-03 from Nittobo Co., Ltd.
  • PAA-U5000 from Nittobo Co., Ltd.
  • polylysine has only primary amino groups in the side chain, but the density of primary amino groups per unit molecular weight is large, and when partially carboxylated as described later, polylysine is It is thought that it performs the same action as partially carboxylated.
  • the amino group of the polyamine is preferably partially blocked or carboxylated or acetylated with carboxylic anhydride.
  • the amino group of the polyamine is preferably 50 to 99 mol%, particularly 50 to 93%, more preferably 50 to 90 mol%, further preferably 55 to 80 mol%, most preferably 58 to 76 mol%. Is blocked by carboxylation or acetylation.
  • about 50% of amino groups can be blocked by reacting 52 to 53 mol% of carboxylic anhydride with respect to amino groups of polyamine. When 100 mol% of carboxylic anhydride is reacted, 90 to 95% of amino groups can be blocked under normal reaction conditions.
  • carboxylic anhydride used here may include acetic anhydride, citric anhydride, succinic anhydride, glutaric anhydride, malic anhydride, fumaric anhydride, and maleic anhydride. Of these, succinic anhydride and acetic anhydride can be mentioned as particularly preferred.
  • a polyamine in which the amino group is free and is not blocked that is, the degree of carboxylation and acetylation is effective in the range of 0-100 mol / mol%.
  • a polycarboxylic acid in which a carboxyl group is partially aminated is also effective.
  • the diamine to be used include hydrazides such as ethylenediamine and adipodihydrazide. The reaction between these amino compounds and carboxylic acid is based on an addition reaction using carbodiimide.
  • the degree of amination at this time is effective in the range of 0-100 mol / mol%, but preferably 50 to 99 mol%, more preferably 60 to 97 mol% of carboxyl as in the case of blocking the amino group.
  • the reaction is performed such that the group remains and the remainder is aminated.
  • polyacrylic acid having a number average molecular weight of 1,000 to 3,000,000, particularly polyacrylic acid having a number average molecular weight of 1,000 to 10,000, is used, and 1 to 50 mol%, preferably 3 to 40 mol% of the carboxyl group is ethylenediamine.
  • Block with amine species such as dihydrazide and carbodiimide.
  • cryopreservation agent of the present invention existing cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide, glycerol, ethylene glycol, trehalose and sucrose may coexist in 0.1-50 w / w%, particularly 0.3 to 15 w / w%. Good. It is said that when cells are thawed from freezing, they are damaged by oxidative stress, and the addition of antioxidants is expected to improve their effectiveness. Examples of the antioxidant include catalase, peroxidase, superoxide dismutase, vitamin E, vitamin C, polyphenols such as epigallocatechin gallate, glutathione, and the like.
  • the osmotic pressure of the cryopreservation agent of the present invention is 200-1000 mOsm / kg, more preferably 300-700 mOsm / kg, and still more preferably 400-600 mOsm / kg.
  • the cryopreservation agent of the present invention can be applied not only to cells but also to tissues. Examples of cells that can be cryopreserved using the cryopreservation agent of the present invention include established cells for culture, fertilized eggs and egg cells of animals including humans.
  • stem cells such as sperm cells, ES cells, iPS cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, umbilical cord blood cells, hepatocytes, nerve cells, cardiomyocytes, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, blood cells, etc.
  • animal cells including humans or plant cells.
  • tissues / organs that can be cryopreserved using the cryopreservation agent of the present invention include skin, nerves, blood vessels, cartilage, cornea, liver, kidney, heart, islet and the like.
  • the same high molecular compound as described above may be added to a hydrated food or pharmaceutical product to suppress freeze concentration and to apply to the production of a frozen product or a lyophilized product in which the components are homogeneously diffused. it can.
  • an amino group-containing unit selected from the group consisting of ⁇ -poly-L-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, polyarginine, other polyamino acids, aminated polysaccharides, and polyallylamine
  • a polymer compound made of a polymer may be blocked by reacting succinic anhydride, acetic anhydride or other carboxylic anhydrides as described above and carboxylating or acetylating.
  • the amino group is partially blocked in the water-containing raw material composition of the ice cream described above or the water-containing raw material composition when producing freeze-dried food.
  • Polylysine and other polyamino acids or aminated polysaccharides are blended to a weight concentration of 1 to 15%. In this way, suppression of freeze concentration can be realized.
  • succinic anhydride is used, freeze-concentration prevention can be achieved by using succinic anhydride equivalent to 50 to 85 mol% of the amino group (actual block ratio of about 48 to 80 mol%) An excellent effect was obtained.
  • an amino group-containing unit selected from the group consisting of ⁇ -poly-L-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, polyarginine, other polyamino acids, aminated polysaccharides, and polyallylamine
  • Surface layer material exposed to the inside of the fuel cell which is blocked by reacting succinic anhydride, acetic anhydride or other carboxylic anhydrides as described above with a polymer compound, which is blocked by carboxylation or acetylation It can be added to and used.
  • it can be blended in the material of the coating film forming the surface of the separator or the solid electrolyte membrane, particularly in the UV curable resin liquid so as to have a weight concentration of 1 to 15%.
  • ⁇ -Poly-L-Lysine (Made by Chisso, molecular weight 4000) is a 25% aqueous solution, polyallylamine (Nittobo, molecular weight 5000 (PAA-05L), 15000 (PAA-L), 60000 (PAA-H) ) Using 20% aqueous solution, and adding 0-100% succinic anhydride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in mol% to the amino groups in the molecule, polyamines with different amino group blocking rates can be obtained. Created.
  • Each polyamine solution was added to Dulbecco's modified medium (DMEM, manufactured by Sigma-Aldrich) at 0-10 w / w%. At this time, the solution was neutralized with 1N hydrochloric acid or aqueous sodium hydroxide so that the pH was within the range of 7.0-8.0.
  • the osmotic pressure of the solution was measured with a 5520 type vapor pressure osmometer manufactured by Wescor, and a 10% aqueous sodium chloride solution was used to adjust the osmotic pressure.
  • Example 2 Cryopreservation of cultured cells> 1 ⁇ 10 6 L929, MG63, Caco-2 cells (Dainippon Sumitomo Pharma), colon26, HT1080, B16F1, KB cells (ATCC) are suspended in 1 mL of each cryopreservation solution in cryovials (Simport Plastics) Cryopreservation was performed in a freezer at -80 ° C. One week later, it was quickly thawed in a 37 ° C. warm bath, washed with DMEM, and then judged to be alive by trypan blue staining.
  • the thawed cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells in a 6-well culture dish, and the survival rate after 6 and 24 hours was evaluated by trypan blue staining.
  • 10% DMSO / fetal bovine serum (FBS) which is a commonly used preservation solution, was used.
  • the region showing the best results in FIGS. 1 and 2 is 400 to 600 mOsm / kg when the osmotic pressure of the cryopreservation solution is obtained. That is, the highest preservation effect was obtained when the osmotic pressure was 400 to 600 mOsm / kg.
  • Table 1 shows the preservation effect of other cells when preserved with 7.5% PLL and 63% succinic anhydride. As can be seen from the results in Table 1, all cell types showed viability almost equal to or higher than that of DMSO system (10% DMSO / fetal calf serum). Although specific data is not shown, the same was true when polyallylamine having a partially blocked amino group was used.
  • Example 3 Toxicity Test Toxicity tests using L929 cells were performed. L929 cells suspended in Dulbecco's modified Eagle's MEM medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum were seeded at 1.0 ⁇ 10 3 cells / well in a 96-well microplate, cultured at 37 ° C. for 72 hours, and then ⁇ -poly -L-lysine and polylysine added with various concentrations of succinic anhydride were added to a final concentration of 0-10%. After 48 hours, cell growth was inhibited by 50% using the non-added system as a control. The concentration to be obtained was defined as IC 50 and obtained by MTT method. The results are shown in Table 2.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's MEM medium
  • the comparative example was DMSO (10% DMSO / fetal calf serum).
  • DMSO 10% DMSO / fetal calf serum
  • the IC 50 of PLL succinic anhydride 58%, 63%, 79% was 2-3 times that of DMSO system. That is, the toxicity of the partially blocked polylysine used in the above examples was determined to be 1/2 to 1/3 of a conventional general cryopreservation solution.
  • the IC 50 values were particularly large in 63% PLL succinic anhydride and 58% PLL succinic anhydride, which had high cell viability in the data of FIG.
  • a cryopreservation solution containing L929 cells was thawed, seeded in a 12-well plate as it was, and observed after incubation at 37 ° C. for 24 hours. That is, it was cryopreserved and thawed in the same manner as in Example 2 in a 7.5% solution of PLL succinic anhydride 63% and 10% DMSO / fetal calf serum. Without washing, the cells were directly transferred onto a plate and cultured. As a result, in the DMSO system (10% DMSO / fetal calf serum), the cells are clearly rounded and dead as shown in FIG. 3-1, whereas the preservation solution of the present invention is used as shown in FIG. 3-2.
  • Example 4 Storage of Mesenchymal Stem Cells> Rat mesenchymal stem cells (RMSC) were cryopreserved.
  • the preservation solution of the comparative example is 10% DMSO / fetal calf serum, and the preservation solution of the example is a 7.5% solution of PLL succinic anhydride 63% (indicated as 7.5% PLL (0.63) in FIG. 4).
  • Table 3 shows the survival rate after thawing of rat mesenchymal stem cells (RMSC).
  • the cryopreservation solution of the present invention showed almost the same survival rate as that of the DMSO system.
  • Cryopreservation solution using partially blocked polyallylamine for 5,000 molecular weight allylamine polymer, succinic anhydride equivalent to 63-85 mol% of amino groups is reacted and added to DMEM medium to a concentration of 7.5%) The same high survival rate.
  • FIG. 4 shows only the red (R) color element after color separation into three primary colors (RGB) of light for image data of a color micrograph. Therefore, the red part is expressed in white and the blue part is expressed in black.
  • R red
  • RGB primary colors
  • the differentiation induction system is all expressed in a light monochrome pattern compared to the non-differentiation induction system. Shows redness.
  • alkaline phosphatase activity was higher than that in the non-freezing system when frozen in any of the storage solutions, compared to the non-differentiation induction system.
  • the fat differentiation ability was determined by staining lipid droplets in cells with Oil Red O, and the lipid droplets stained in red as in the unfrozen system (diameter in the middle of FIG. 4) when frozen in any storage solution. A portion expressed as a light circular or elliptical pattern of several tens of ⁇ m) was confirmed.
  • Umbilical cord blood was collected from human umbilical cord using a 7 mL plastic vacuum blood collection tube (Terumo Corporation, Benogect 2 vacuum blood collection tube) filled with 10.5 mg of blood anticoagulant (EDTA2Na). Next, 63% PLL succinic anhydride (7.5% PLL (0.63)) was added to 7.5% in human umbilical cord blood to which the anticoagulant was added in this manner, and then in a freezer at -80 ° C for 3 months. It was stored frozen for a while. A portion of human umbilical cord blood that was rapidly thawed in a 37 ° C.
  • CD34 a surface marker of hematopoietic stem cells
  • the number of CD34 hematopoietic stem cells was measured by a conventional method described in the literature (A. Higuchi et al., J. Biomed. Mater. Res., 68A, 34-42 (2004)) using flow cytometry. That is, the number of CD34 hematopoietic stem cells was determined using Stem-Kit (manufactured by Beckman Coulter) according to the manual (International Blood Therapy and Transplant Society ISHAGE Guidelines). Even after 3 months, the number of CD34 hematopoietic stem cells was observed to be around 70% as measured on the first day.
  • CD34 hematopoietic stem cells in human umbilical cord blood cryopreserved with 10% DMSO solution was approximately 20% of the number of cells counted on the first day.
  • CD34 hematopoietic stem cells can be stored in an undifferentiated state for a long period of time when human umbilical cord blood is stored in a storage solution to which ⁇ -poly-L-lysine is added.
  • cryopreservation solution of the example of the present invention was remarkably excellent in the effect of preservation of cord blood.
  • Antifreeze protein activity of PLL ( ⁇ -poly-L-lysine) and succinic anhydride-treated PLL was examined. That is, the effect of inhibiting ice recrystallization was investigated.
  • Antifreeze proteins are known to have a variety of special activities, such as thermal hysteresis, ice recrystallization growth inhibition, and ice crystal hexagonal or bipyramidal shape change due to adsorption to the ice surface. It is known to cause (Patent Documents 3 to 4).
  • Freeze-concentration prevention (freeze-thawed agar gel): Add a 63% PLL succinic anhydride to agar powder (first grade reagent, Nacalai Tesque) to prepare a 5% solution, and add red ink to this solution. After freezing at ⁇ 20 ° C. in a plastic container, it was thawed at room temperature. The results are shown in the photograph of FIG. The left is the one with no addition, and the right is the one with 5% PLL oxalic acid derivative added.
  • the additive-free one has a red part (opaque upper half) and a transparent part (a shadow is formed on the upper right of the place where the gel is placed, but the paper towel mesh pattern below the gel is seen through. It is clear that they are clearly separated. On the other hand, it was known that the 5% PLL oxalic acid derivative additive showed a uniform red color throughout the thawed gel and prevented freeze concentration.
  • Freeze-dried agar gel Agar powder (1st grade reagent, manufactured by Nakarai Tech Co., Ltd.) is added with 0%, 1%, 3% of PLL succinic anhydride 63% (actual block ratio 0.60) and put in a plastic container- After freezing at 20 ° C., lyophilization was performed for 2 to 3 days at a vacuum of 1 torr to obtain lyophilized agar. The resulting lyophilized product is shown in the photograph of FIG. When the amount of PLL succinic acid derivative added is 0% (left), the volume shrinks to about 1/3 due to lyophilization.
  • the lyophilizates with 1% (middle) and 3% (right) addition of PLL succinic acid derivatives have little volume shrinkage. From this, by containing the antifreeze polyamino acid of the present invention and freeze-drying, the material to be dried could be dried efficiently and with stable quality.

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Abstract

【課題】ヒトを含む動物や植物の細胞や組織を、ジメチルスルホキシドなどの有害な凍結保存剤を用いずに安全に凍結保存可能な凍結保存用組成物を提供する。また、食品や医薬品の凍結保存や凍結乾燥製品への応用を提供する。 【解決手段】ε-ポリ-L-リジンに無水コハク酸を反応させて、ε-ポリ-L-リジンのアミノ基の60%以上をブロックする。このようにして得た高分子化合物を、市販の培養液の一つであるダルベッコ改変培地（DMEM）に7.5w/w%溶解させて、凍結保存液とする。また、食品や医薬品へはε-ポリ-L-リジン琥珀酸誘導体を0.5～10％添加して凍結濃縮を防止する。

Description

細胞および組織の凍結保存用組成物
　本発明は、ヒトを含む動物細胞および組織の凍結解凍障害を軽減可能な凍結保存剤に関する。また、皮膚、角膜、膵島、心臓弁など他の生体組織移植分野及び造血幹細胞、間葉系幹細胞、ES細胞、iPS細胞などの幹細胞を用いる再生医療分野においてもこの技術の需要は高まると予測される。
　植物や動物の細胞、組織、あるいは食品などの水を含む物質を長期に保存するために０℃以下の温度で凍結保存法が日常的に用いられている。しかし、これら水を含有する物質を凍結すると、凍結中に水分子同士が、溶質や混入物の媒質を排除しながら結晶化して水分子のみからなる氷結晶を形成するため、含水物中で溶質や混入物の媒質が不均一に拡散し、凍結濃縮が発生することが知られている。
　このような凍結濃縮を防止するため、様々な低分子化合物を添加する方法が行われている。例えば、細胞の凍結保存を行う場合に、凍結保存中に起こる細胞内の結晶化による細胞へのダメージを最小限に抑えるために、凍結保護剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やグリセロール等を添加する方法が行われている。
　すなわち、5～20%のジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの凍結保存剤を含む培養液などの生理的溶液に細胞を懸濁しクライオチューブに詰めて冷却し、最終的に-80℃もしくは-196℃の極低温で凍結保存するのが一般的である。
　そのなかで最も効果が高く、よく用いられているのがジメチルスルホキシドである。しかしジメチルスルホキシドが特に高い濃度では生理学的に有毒であり、凍結保存された細胞を注入された患者に高血圧、悪心、嘔吐を引き起こすことも知られている。ジメチルスルホキシドの毒性により解凍した細胞の培養時もしくは生体に注入した後の生存率や機能が低下する問題もある。
　また、グリセリンなどのその他の凍結保存剤は効果が低いため、細胞を懸濁してしばらく室温もしくは冷蔵で放置してから凍結する必要や、プログラムフリーザーなどによる厳密な温度管理が必要とされる。また、凍結保護効果が低く、解凍後の機能が低下するなどの問題がある。
　一方、ES細胞やiPS細胞などの幹細胞や精子、卵子、受精卵などでは例えばジメチルスルホキシド、アセトアミド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの高濃度の凍害保護物質を含有する急速凍結法（ガラス化法）が知られている。ガラス化法とは急激に低温にすることで細胞に含まれる水分をガラス状にし、氷晶形成による障害を避ける方法である。しかしながら、この際に用いられる高濃度の凍害防止剤の毒性が高いため、細胞や組織を損傷する可能性が高く、組織の凍結保護には限定的にしか用いられていない。
　他方、医薬品や食品、ディスプレイ用の氷を製造する場合に、塩化ナトリウム等の塩類や、グルコース、トレハロース等の糖類を添加することも行われている。さらに、植物や魚類、昆虫などが産生する不凍蛋白質や不凍糖蛋白質の添加が知られている（特許文献3～4）。
　また、燃料電池においては、電気化学反応に伴って一方の電極で水が生じる。例えば、固体高分子型燃料電池では、カソード電極において水が生じる。また、生じた水の一部は、電解質膜を介してアノード側へと移動する。このように燃料電池内で生じた水、あるいは、燃料電池に供給されるガス中の水蒸気が燃料電池内で凝縮すると、燃料電池内におけるガス流れが妨げられる可能性がある。そして、電極へのガスの供給が妨げられることによって、電池性能が低下する可能性がある。このような、凝縮水がガス流れを妨げることに起因する不都合を防止するための構成として、燃料電池の内部、例えばガスセパレータの表面にタンパク質などの親水性塗膜を設けることによって、水の滞留を抑える構成が知られているが、低温条件下においては、液水が凍結することに起因する不都合が生じる場合があった。上記目的を達成するために、例えば、固体高分子電解質膜の表面層をなす硬化性樹脂に、高分子電解質ととともに、液水からの氷の結晶の成長を抑制する不凍タンパク質を添加する方法がある（特許文献5）が、これもコストが高いなどの問題がある。
特表平10-511402 特許第3694730号 特開2005-126533 特開2003-250506 特開2008-041596
Lovelock JE and Bishop MWH, Nature 183:1394-1395, 1959 Polge C, Smith AU, Parkes AS, Nature 164:666-666, 1949 Miszta-Lane H, Gill P, Mirbolooki M, Lakey JRT. Cell Preserv Technol 5,16-24, 2007 Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Human Reproduction 20,1779-1786, 2005 Yu HN, Lee YR, Noh EM, et al. INT J HEMATOL ≡87: 189-194 ;2008 Adler S, Pellozzer C, Paparella M, Hartung T, Bremer S. Toxicol in Vitro 20:265-271; 2006
　急速冷凍法を含む現状の凍結保存法では、凍結解凍後の細胞・組織の完全な形での保存が困難であり、毒性の低い新たな凍結保存物質が待ち望まれている。また、ジメチルスルホキシドはHL-60細胞などの分化を誘導することがわかっており、保存に適しない細胞もある。一方、不凍蛋白質や不凍糖蛋白質は凍結濃縮を防止する効果には優れているものの、あまりにも高価（130万円/ｇ）で食品などへの応用には限界がある。
　そこで本発明は、ジメチルスルホキシドに代わる、低毒性でさらに細胞組織の保護効果に優れた凍結保存剤を提供することを目的とする。また、本発明は、食品や医薬などの冷凍保存や凍結乾燥保存を行うにあたり、不凍蛋白質や不凍糖蛋白質と同等な凍結濃縮を防止する効果を有し、安価でしかも安全なものを提供しようとするものである。
　本発明の凍結保存液は、アミノ基を側鎖にもつポリアミンを実質上1-50%を含み、その他組成は生理食塩水や培養液成分などの生理的溶液である。
　様々なヒトを含む動物細胞、植物細胞を該保存液に浸漬して-80℃または液体窒素中もしくは液体窒素蒸気中で凍結保存することで毒性の高いジメチルスルホキシドなどの既存の凍結保存剤を使用せずに生存率、生理活性を維持したまま保存することが可能である。既存のジメチルスルホキシドやグリセリン、エチレングリコールなどの凍結保存剤を使用しないため、凍結する細胞に対する毒性が低く抑えられ、機能を維持したまま長期間凍結保存することが可能である。また、ウシ胎児血清、アルブミンなどのタンパク質成分を使用しないため感染症などの心配がなく、生物製剤によるロット間格差も影響しない。
　ε-ポリ-L-リジンやポリアリルアミンなどのアミノ基を側鎖にもつポリアミンは、そのアミノ基により細胞膜親和性を持つため、細胞の保護効果があると考えられる。また、カルボキシル基を分子中に多数持つ高分子化合物は水との親和性が高く、細胞内の液体を凍結中に速やかに外に排出することを助けることから細胞の凍結保存時の保護効果があると期待される。これら両官能基を分子中に適度な割合で持つことでさらに優れた凍結時細胞保護効果が期待できる。そこで本発明においては側鎖にアミノ基などのカチオン性置換基をもつポリアミノ酸もしくはカルボキシル基などのアニオン性置換基を持つ高分子化合物、およびカチオン性置換基とアニオン性置換基の両方をもつ高分子化合物の条件を鋭意検討することにより、有効性と安全性の高い凍結保存液を提供する。
　また、本発明の凍結保存剤はDMSOに比べて毒性が低いため、解凍後の洗浄が不要で、そのまま培地に添加することですぐに培養を行うことができる。
　本発明により、実験用培養細胞の凍結保存を安定的に行うことが可能となるだけでなく、膵島や幹細胞の様な機能性細胞やES細胞や間葉系幹細胞、iPS細胞などの幹細胞もその機能を失わずに保存することができるため、細胞移植の効率が向上すると期待される。
　また、本発明の不凍結ポリアミノ酸を用いることにより、生理活性物質を含む含水物を凍結する際の、該生理活性物質の失活を抑制することもできる。さらに、本発明の不凍結ポリアミノ酸を用いることにより、水分子以外の成分を含む含水物を凍結又は凍結乾燥して得られる凍結物又は凍結乾燥物中における該成分の拡散を均質にすることもできる。凍結物としては、アイスクリーム、シャーベット、氷菓、ディスプレイ用の氷、冷凍スープ等が挙げられる。凍結乾燥物としては、凍結乾燥により製造される粉末状のフリーズドライ食品や医薬品等が挙げられる。
　また、工業用の燃料電池を起動する際の液体の凍結に起因する起動性の低下を抑制する用途などにも適用可能である。
無水コハク酸により部分的にアミノ基をブロックしたε-ポリ-L-リジンを用いてL929細胞を凍結保存した場合の、アミノ基のブロック率と細胞生存率との関係を示すグラフである。 アミノ基あたり63モル%の無水コハク酸を添加したε-ポリ-L-リジン（PLL無水コハク酸63%）を用いてL929細胞を凍結保存した場合の、この部分ブロック化ポリリジンの濃度と細胞生存率との関係を示すグラフである。 L929細胞を10%DMSO/ウシ胎児血清中にて凍結し、解凍後洗浄や希釈をせずにそのままプレート上に移して24時間培養した場合の様子を示す顕微鏡写真である。 L929細胞をPLL無水コハク酸63%の7.5%溶液中にて凍結し、解凍後洗浄や希釈をせずにそのままプレート上に移して24時間培養した場合の様子を示す顕微鏡写真である。 PLL無水コハク酸63%の7.5%溶液、及び、10%DMSO/ウシ胎児血清を凍結保存液として用いラット間葉系幹細胞（RMSC）を凍結保存後に、多分化能（骨、脂肪、軟骨への分化誘導）を評価した結果を示すグラフである。未凍結の場合、及び、非分化誘導系を併せて示す。 スクロース30%の水溶液に無処理のPLL（ε-ポリ-L-リジン）および無水コハク酸処理PLL（PLL無水コハク酸63%）を0.1-15%で添加し、氷再結晶抑制効果を観察した一連の顕微鏡写真である。 無処理のPLL（ε-ポリ-L-リジン）の5%溶液、および無水コハク酸処理PLL（PLL無水コハク酸63%）の5%溶液を凍結させた場合の、氷の結晶の形態を示す顕微鏡写真である。 凍結解凍寒天ゲルの写真(1)である。左が無添加のもの、右がPLL無水コハク酸63%を5%添加したものを示す。 凍結解凍寒天ゲルの写真(2)である。PLL無水コハク酸63%の添加量が、0%のもの（左）、1%のもの（中）、及び3%のもの（右）を示す。
　本発明の凍結保存液は、生理的溶液に、ポリリジンなどの高分子化合物が1-50w/w%溶解されてなる。好ましくは2～20w/w%、特に好ましくは3～15w/w%、さらに好ましくは5～10w/w%溶解されてなる。生理的溶液としては、生理食塩水の他、各種の細胞または組織用の一般的な培養液を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（DMEM）を好ましいものとして挙げることができる。ポリリジンに代えて、またはポリリジンとともに、ポリアリルアミンを用いることもできる。また、これらに代えて、または、これらの少なくとも一方ととともに、アミノ化多糖類などの他のポリアミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などのポリアミノ酸およびアミノ化多糖類から選択される化合物を用いることができ、また、ポリアクリル酸などのポリカルボン酸の他、デキストラン、デキストリン、プルラン、キトサンからなる群から選択される多糖類を用いることもできる。これら高分子のうちでも、同一分子内にカチオン性置換基とアニオン性置換基の両方をもつ単量体が重合した形の高分子化合物、特には、ポリアミノ酸を好ましいものとして挙げることができる。すなわち、高分子化合物の繰り返し単位が、アミノ基及びカルボキシル基を共に有するのが特に好ましい。ポリリジンは、ε-ポリ-L-リジンもしくはε-ポリ-D-リジン、α-ポリ-L-リジン、α-ポリ-D-リジンのいずれであっても良い。凍結保護成分である高分子化合物は分子量が100～100,000である。最も好ましい高分子種として、微生物または酵素により生産される数平均分子量がｂ1000～2万、特には1000～1万のε-ポリ-L-リジンを挙げることができる。ε-ポリ-L-リジンは、ストレプトマイセス属（Streptomyces）に属する放線菌により生産されてもっぱら食品添加物として用いられており（http://www.chisso.co.jp/fine/jp/polylisin/index.html）、重合度15～35のものの他、重合度が２０以下のものの生産も試みられている（例えば、特開2003-171463、特開2005-318815）。数平均分子量または数平均重合度の測定は、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、例えば、アトー(株)製の電気泳動装置及びデンシトグラフ（AE-6920V型）を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパクマーカーを用いる。なお、ポリリジンは、加熱処理による高分子量化により分子量3万以上として用いることもできる。しかし、粘度の上昇を防ぐ等の観点から上記の分子量範囲が好ましい。末端のみにフリーのカルボキシル基を有するポリリジンは、側鎖に1級アミノ基のみを有しているが、後述するように無水カルボン酸を用いて部分的にアミド化することで、優れた混和性能ないし可溶化性能を発揮するものと考えられる。特には、無水ジカルボン酸などを反応させて部分的にカルボキシル化することで、優れた性能を発揮することができる。本発明でも用いる特に好ましい高分子種の他の例として、重量平均分子量が1000～1000000、好ましくは1000～2万のポリアリルアミンを挙げることができる。例えば、アリルアミン重合体（日東紡績(株)のPAA-03）の水溶液に無水酢酸または酢酸を添加したものや、部分メトキシカルボニル化アリルアミン重合体（日東紡績(株)のPAA-U5000）を挙げることができる。アリルアミン重合体は、ポリリジンの場合と同様、側鎖に1級アミノ基のみを有するが、単位分子量あたりの1級アミノ基の密度は大きく、後述のように部分的にカルボキシル化した場合、ポリリジンを部分的にカルボキシル化したと同様の作用を行うものと考えられる。
　ポリアミンのアミノ基は、好ましくは、部分的に、無水カルボン酸によってカルボキシル化もしくはアセチル化されて、ブロックされる。この際、ポリアミンのアミノ基について、好ましくは50～99モル%、特には50～93%、より好ましくは50～90モル%、さらに好ましくは55～80モル%、最も好ましくは58～76モル%をカルボキシル化またはアセチル化することでブロックする。なお、ポリアミンのアミノ基に対して52～53モル%の無水カルボン酸を反応させることで約50%のアミノ基をブロックすることができる。また、100モル%の無水カルボン酸を反応させた場合、通常の反応条件で、90～95%のアミノ基をブロックすることができる。ブロック率が上記の範囲を超えても、また、下回っても、凍結保存効果が小さくなる。ここで用いられる無水カルボン酸としては、無水酢酸、無水クエン酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水リンゴ酸、無水フマル酸、及び無水マレイン酸を挙げることができる。これらのうち、無水コハク酸及び無水酢酸を特に好ましいものとして挙げることができる。
　しかし、ポリアミンのアミノ基がブロックされずフリーの状態にあるものを用いることもできる。すなわち、カルボキシル化およびアセチル化の度合いは0-100mol/mol%の範囲で有効である。本発明において、カルボキシル基が一部アミノ化されたポリカルボン酸も有効である。すなわちポリカルボン酸のカルボキシル基をジアミン、トリアミン、ポリアミンなどの化合物と反応させることにより一部アミノ化したものも有効である。用いるジアミンとしてはエチレンジアミン、アジポジヒドラジドなどのヒドラジドなどが挙げられる。これらアミノ化合物とカルボン酸との反応はカルボジイミドを用いた付加反応によるものである。この時のアミノ化の度合いは0-100mol/mol%の範囲で有効であるが、アミノ基をブロックする場合と同様に、好ましくは50～99モル%、より好ましくは60～97モル%のカルボキシル基が残り、その残余がアミノ化されるように反応を行う。例えば、数平均分子量1000～300万のポリアクリル酸、特には、数平均分子量1000～1万のポリアクリル酸を用い、そのカルボキシル基の1～50モル%、好ましくは３～40モル％をエチレンジアミン、ジヒドラジドなどのアミン種及びカルボジイミド等を用いてブロックする。一方、本発明の凍結保存剤には、ジメチルスルホキシドやグリセロール、エチレングリコール、トレハロースやスクロースなどの既存の凍結保護物質が0.1-50w/w%、特には0.3～15w/w%共存していてもよい。細胞が凍結から解凍される際に酸化ストレスによるダメージを受けると言われており、抗酸化剤を添加することでさらなる有効性の向上が期待される。抗酸化剤は例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンＥ、ビタミンC、エピガロカテキンガレートなどのポリフェノール類またはグルタチオンなどが挙げられる。
　本発明の凍結保存剤の浸透圧は200-1000mOsm/kgであり、より好ましくは300-700mOsm/kgであり、更に好ましいのは400-600mOsm/kgである。本発明の凍結保存剤は保存する対象が細胞に限らず組織に対しても適用することが可能である。本発明の凍結保存剤を用いて凍結保存が可能な細胞としては、培養用樹立細胞、ヒトを含む動物の受精卵および卵細胞を挙げることができる。また、精細胞、ES細胞、iPS細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、臍帯血細胞などの幹細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血球細胞などのヒトを含む動物細胞もしくは植物細胞を挙げることができる。本発明の凍結保存剤を用いて凍結保存が可能な組織・臓器としては、皮膚、神経、血管、軟骨、角膜、肝臓、腎臓、心臓、膵島などを挙げることができる。
　なお、上記に説明したと同様の高分子化合物を、食品または医薬品の含水物に添加し、凍結濃縮を抑制し、含有成分が均質に拡散した凍結物又は凍結乾燥物の製造に応用することができる。具体的には、ε-ポリ-L-リジン、α-ポリ-L-リジン、ポリアルギニン、その他のポリアミノ酸、アミノ化多糖類、及びポリアリルアミンからなる群から選択される、アミノ基含有単位の重合体からなる高分子化合物に対し、無水コハク酸、無水酢酸またはその他の上記無水カルボンさんを反応させてカルボキシル化またはアセチル化することでブロックしたものを用いることができる。この場合、生理的溶液中に溶解したものを用いる必要はなく、例えば先述のアイスクリームの含水原料組成物またはフリーズドライ食品を製造する際の含水原料組成物に、アミノ基を部分的にブロックしたポリリジンその他のポリアミノ酸またはアミノ化多糖類を、1～15%の重量濃度となるように配合する。このようにして、凍結濃縮の抑制を実現することができる。無水コハク酸を用いた場合、アミノ基の50～85モル％に相当する無水コハク酸を反応させたもの（実際のブロック率が約48～80モル％のもの）を用いるならば、凍結濃縮防止において優れた効果が得られた。
　さらに、上記に説明したと同様の高分子化合物を工業用の燃料電池に添加して、起動時の液体の凍結に起因する起動性の低下を抑制する用途などにも適用可能である。具体的には、ε-ポリ-L-リジン、α-ポリ-L-リジン、ポリアルギニン、その他のポリアミノ酸、アミノ化多糖類、及びポリアリルアミンからなる群から選択される、アミノ基含有単位の重合体からなる高分子化合物に対し、無水コハク酸、無水酢酸またはその他の上記無水カルボン酸を反応させてカルボキシル化またはアセチル化することでブロックしたものを、燃料電池内部に露出する表面層の材料に添加して用いることができる。例えば、セパレーターや固体電解質膜の表面をなす塗膜の材料、特にはUV硬化性の樹脂液に、1～15%の重量濃度となるように配合することができる。
　以下、この発明の実施例及び比較例を示す。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１　凍結保存溶液の調整＞
　ε-ポリ-L-リジン（チッソ社製、分子量4000）は25%水溶液のものを、ポリアリルアミン（日東紡、分子量5000(PAA-05L)、15000(PAA-L)、60000(PAA-H)）は20%水溶液のものを用い、分子中のアミノ基に対し、モル％で0-100%の無水コハク酸（和光純薬工業製）を添加することでアミノ基のブロック率の異なるポリアミンを作成した。それぞれのポリアミン溶液をダルベッコ改変培地（DMEM、シグマアルドリッチ製）に0-10w/w%となるように添加した。この際、pHが7.0-8.0の範囲内になるように１Nの塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液で中和した。また、溶液の浸透圧はWescor社製5520型蒸気圧法オズモメーターにて測定し、浸透圧の調整には10%塩化ナトリウム水溶液を用いた。
＜実施例2　培養細胞の凍結保存＞
　1×106個のL929, MG63, Caco-2細胞（大日本住友製薬）, colon26, HT1080, B16F1, KB細胞（ATCC）をクライオバイアル（Simport Plastics）中で各凍結保存液1mLに懸濁し、-80℃のフリーザー中で凍結保存を行った。1週間後、37℃の温浴中で速やかに融解し、DMEMで洗浄したのち、トリパンブルー染色により生死判定を行った。また、解凍した細胞は6wellカルチャーディッシュに1×105個ずつ播種し、6時間後、24時間後のそれぞれの生存率をトリパンブルー染色により評価した。比較例としては一般的によく用いられている保存液である10%DMSO/ウシ胎児血清(FBS)を用いた。
　図1に示すように、L929細胞を凍結保存するにあたり、アミノ基のモル数に対して50%以上のモル数の無水コハク酸を添加したポリリジン（PLL）の7.5%溶液を用いた場合、比較例のDMSO溶液を用いた場合に比べて播種後２４時間においてほぼ同じか、より良好な生存率を示した。なお、100モル%の無水コハク酸を添加したカルボキシル化ポリリジンについて、残留アミノ基含量をニンヒドリン法およびTNBS法で定量することにより、アミノ基のブロック率を求めたところ93%であった。また、ポリリジンのアミノ基に対して10モル%、27モル%、45モル%、52モル%、63モル%、及び、79モル%の無水コハク酸を添加した場合に、ブロック率は、それぞれ、10%、25%、43%、50%、60%、76%であった。したがって、図1から知られるように、50～93%のブロック率について凍結保存効果が確認された他、ブロック率が60%のもの（63モル%の無水コハク酸添加）、及び76%のもの（79モル%の無水コハク酸添加）で、特に優れた凍結保存効果が見られた。アミノ基を部分的にブロックしたポリアリルアミン（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の45～90モル％に相当する無水コハク酸を反応させたもの）の水溶液を用いた場合にも、ほぼ同様に、無水コハク酸によるアミノ基ブロック率が増大するにつれて、より良好な生存率が得られた。
　図2では、同じくL929細胞を凍結保存するにあたり、アミノ基のモル数に対して63%のモル数の無水コハク酸を添加したε-ポリ-L-リジン（図表中にPLL(0.63)と表示し、以下本文中にPLL無水コハク酸63%と表記）を用い、この部分ブロック化ポリリジンの濃度と細胞生存率との関係を示す。図2から知られるように、部分ブロック化ポリリジン（PLL無水コハク酸63%）の濃度が7.0%以上である場合に、DMSO溶液を用いた場合とほぼ同等か、より高い細胞生存率が得られた。アミノ基を部分的にブロックしたポリアリルアミン（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の63～85モル％に相当する無水コハク酸を反応させたもの）を用いた場合にも、同様の傾向を示した。
　図１～２にて最も良好な結果を示す領域は、凍結保存液の浸透圧を求めた場合に、400～600mOsm/kgである。すなわち、浸透圧が400～600mOsm/kgで最も高い保存効果が得られた。
　一方、表1には、7.5%PLL無水コハク酸63%で保存したときのその他の細胞の保存効果を示す。表１の結果から知られるように、すべての細胞種においてDMSO系（10%DMSO/ウシ胎児血清）とほぼ同じかそれ以上の生存率を示した。なお、具体的なデータは示さないが、アミノ基を部分的にブロックしたポリアリルアミンを用いた場合にも同様であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例3　毒性試験＞
　L929細胞を用いた毒性試験を行った。10%ウシ胎児血清を含有したダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（DMEM）に懸濁させたL929細胞を、96wellマイクロプレートに1.0×103cell/well播種し、37℃で72時間培養後、ε-ポリ-L-リジン、及び、種々の濃度の無水コハク酸を添加したポリリジンを、最終濃度0-10%となるように添加し、48時間後、未添加系をコントロールとして細胞の増殖が50%阻害される濃度をIC50とし、MTT法で求めた。その結果を表2に示す。比較例はDMSO系（10%DMSO/ウシ胎児血清）とした。表2の結果から知られるように、PLL無水コハク酸58%、63%、79%のIC50は、DMSO系の場合の２～３倍であった。すなわち、上記実施例で用いた部分ブロック化ポリリジンの毒性は、従来一般的な凍結保存液の1/2～1/3と判断された。特には、図１のデータにて細胞生存率が高かったPLL無水コハク酸63%と、PLL無水コハク酸58%とにおいて、IC50の値が特に大きかった。
　一方、L929細胞を含む凍結保存液を解凍後に、そのまま12wellプレートに播種し、37℃で24時間培養後に観察した。すなわち、PLL無水コハク酸63%の7.5%溶液、及び、10%DMSO/ウシ胎児血清の各凍結保存液にて、実施例２と同様にして凍結保存し解凍を行ったが、解凍後に希釈や洗浄をせずに、そのままプレート上に移して培養を行った。その結果、図3－１に示すようにDMSO系（10%DMSO/ウシ胎児血清）では明らかに細胞が丸くなり死んでいるのに対して、図３－２に示すように本発明の保存液ではディッシュに付着し、良好に生着していることが確認された。アミノ基を部分的にブロックしたポリアリルアミン（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の63～85モル％に相当する無水コハク酸を反応させたもの）でも同様の低毒性の結果を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例4　間葉系幹細胞の保存＞
　ラット間葉系幹細胞（RMSC）の凍結保存を行った。比較例の保存液は10%DMSO/ウシ胎児血清であり、実施例の保存液はPLL無水コハク酸63%の7.5%溶液（図４中に7.5%PLL(0.63)と表示）である。
　表3にラット間葉系幹細胞（RMSC）の解凍後の生存率を示すが、本発明の凍結保存液でDMSO系とほぼ同じ生存率を示した。部分ブロック化ポリアリルアミンを用いた凍結保存液（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の63～85モル％に相当する無水コハク酸を反応させ、DMEM倍地に7.5%濃度となるように添加したもの）でも同様の高い生存率であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次に、実施例２と同様にして凍結保存後に解凍した後、分化誘導をかけることにより骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能を評価したところ、図4に示すように未凍結系、DMSO系とほぼ同様に多分化能を維持していることが以下のように確認された。図4は、カラーの顕微鏡写真の画像データについて、光の3原色（ＲＧＢ）への色分解を行い、赤色（Ｒ）の色要素のみを示したものである。したがって、赤色部分が白色に表現され、青色部分が黒色に表現されている。骨分化能はカルシウムの沈着をアリザリンレッドS染色により評価した結果、いずれの場合も同じく赤く染色された。図4中の上段の写真を見た場合、非分化誘導系に比べて、分化誘導系がいずれも同様に淡いモノクロパターンに表現されているが、この淡いモノクロパターンいはカラー写真にて全体に赤味がかかっていることを示す。また、アルカリ性ホスファターゼ活性は非分化誘導系に比べ、いずれの保存液で凍結した場合でも未凍結系と同じく高い値を示した。脂肪分化能は、細胞中の脂肪滴をオイルレッドOを用いて染色したところ、いずれの保存液で凍結した場合でも未凍結系と同じく赤く染色された脂肪滴（図４中段にて、径が数十μmの淡色の円形ないし楕円形パターンとして表された部分）が確認された。軟骨分化能に関しては、細胞塊中のプロテオグリカンをアルシアンブルーで染色したところ、いずれの保存液で凍結した系でも未凍結と同じく青く染まるプロテオグリカン（図4の下段にて濃い黒色部分として表された部分）が確認された。ポリアリルアミンから作成した凍結保存剤（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の63～85モル％に相当する無水コハク酸を反応させ、DMEM倍地に7.5%濃度となるように添加したもの）で凍結した場合でも同様に多分化能を維持していた。
＜実施例５　臍帯血の保存＞
　臍帯血は、血液抗凝固剤（EDTA2Na）を１０.５mg充填された７mLプラスチック製真空採血管（テルモ株式会社製、ベノジェクト２真空採血管）を使用してヒト臍帯より採取した。次いで、このように抗凝固剤を添加したヒト臍帯血中に、7.5%となるようにPLL無水コハク酸63%(7.5%PLL(0.63))を添加し、-80℃のフリーザー中で3ヶ月間凍結保存した。37℃の温浴中で速やかに融解し、希釈等を行わないままのヒト臍帯血を一部採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて測定した。ＣＤ３４造血幹細胞数をフローサイトメトリーを用いて、文献（A. Higuchi et al., J. Biomed. Mater. Res., 68A, 34-42 (2004)）記載の常法により測定した。すなわち、ＣＤ３４造血幹細胞数は、Stem-Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、そのマニュアル（国際血液療法・移植学会 ISHAGEガイドライン）に従って行った。3ヶ月後においても、ＣＤ３４造血幹細胞数は、初日に計測された70％前後の細胞数が観察された。一方、１０％DMSO溶液で凍結保存したヒト臍帯血中のＣＤ３４造血幹細胞数は、初日に計測された２０％前後の細胞数であった。このように、ε-ポリ-L-リジンを添加した保存液でヒト臍帯血を保存すると、ＣＤ３４造血幹細胞を未分化の状態で長期間保存できることが明らかとなった。
　このように、本発明の実施例の凍結保存液は、臍帯血の保存の効果においても際立って優れていることが知られた。
＜実施例６　不凍タンパク活性＞
　PLL（ε-ポリ-L-リジン）および無水コハク酸処理PLLの不凍タンパク質活性を調べた。すなわち、氷の再結晶を阻害する効果について調べた。不凍タンパクには種々の特殊な活性が知られており、氷の表面に吸着することなどにより、熱ヒステリシス、氷の再結晶成長抑制、氷晶の六方晶もしくはバイピラミッド状への形態変化を引き起こすことが知られている（特許文献3～4）。
　まず、スクロース30%の水溶液に無処理のPLL、PLL無水コハク酸20%, PLL無水コハク酸46%, PLL無水コハク酸50%, PLL無水コハク酸65%, PLL無水コハク酸76%, 及びPLL無水コハク酸84%を0.1-15%で添加した。これら無水コハク酸処理PLLにおける実際のアミノ基ブロック率を前述の方法で測定したところ、約0.20, 0.43, 0.48, 0.62, 0.73及び0.80であった。その溶液をガラスプレートに4μLのせ、さらにガラスプレートでカバーしてからリンカム社製10002L温度制御顕微鏡ステージにて-30℃まで急冷し氷結晶を作成した。その後ゆっくりと温度を上げていき-9℃で30分放置することにより氷結晶の成長を顕微鏡で観察した。その結果、図５の一連の顕微鏡写真が知られるように、PLL（ε-ポリ-L-リジン）のアミノ基に対しその50モル%以上のカルボキシル基を導入することによりPLLに氷再結晶抑制効果を付与できることが確認された。図５には、重量濃度が5%となるように添加した場合を示すが、PLL無水コハク酸50%（PLL(0.50)）～PLL無水コハク酸84%（PLL(0.84)）は、1%～15%までの濃度で氷再結晶抑制に有効であった。
　次に同じ急冷プレートにてPLLの5%溶液の氷の結晶の形態、および無水コハク酸処理PLL（PLL無水コハク酸65%）の5%溶液の氷の結晶の形態をしらべた。すなわち、一旦-30℃まで急冷し、氷結晶を多数作成した後、視野に1つの直径10μm程度の氷結晶が存在する温度まで0.02℃/minで温度を上昇させる。その状態で安定してから今度は0.02℃/minで温度を降下させることで氷の成長時の形態を観察した。形態は図６の顕微鏡写真に示すように無水コハク酸で処理することにより六方晶を示すことがわかった。なお、このような六方晶の氷結晶は、無水コハク酸処理PLL（PLL(0.50)～PLL(0.84)）の濃度が1%～15%の範囲であるならば見られた。熱ヒステリシスとは、融点と氷晶成長開始温度の差のことで、不凍タンパク質の特徴として挙げられる。無水コハク酸処理PLLで最大0.1度の熱ヒステリシス効果が得られた。これらのことから、PLLのアミノ基に対しにカルボキシル基を50モル%以上導入することで不凍タンパク質の活性が得られることが確認された。
＜実施例７　食品の保存＞
　凍結濃縮防止（凍結融解寒天ゲル）；寒天末（１級試薬 ナカライテスク（株）社製）にPLL無水コハク酸63%を添加して５%溶液を調整し、この溶液に赤色インクを添加しプラスチック容器に入れ－２０℃にて凍結した後、常温で解凍した。結果を図7の写真に示す。左が無添加のもの、右がPLL琥珀酸誘導体5%添加のものである。無添加のものは赤色の部分（不透明な上半部）と、透明な部分（ゲルを載せた箇所の右上に影を生じさせているが、ゲルの下方のペーパータオルのメッシュ模様が透けて見えている部分）とに、明らかに分離しているのが解かる。一方、PLL琥珀酸誘導体5%添加物は解凍ゲル全体が均一に赤色を呈し、凍結濃縮が防止できているのが知られた。
　凍結乾燥寒天ゲル；寒天末（１級試薬 ナカライテック（株）社製）にPLL無水コハク酸63%（実際のブロック率0.60）を0%、1%、3%添加してプラスチック容器に入れ-20℃にて凍結した後、真空度１torrで２～３日間凍結乾燥を行い、凍結乾燥寒天を得た。得られた凍結乾燥物を図8の写真に示す。PLL琥珀酸誘導体の添加量が0%のもの（左）は凍結乾燥により体積が1/3程度に収縮している。しかし、PLL琥珀酸誘導体の添加量が1%のもの（中）と3%のもの（右）の凍結乾燥物は体積の収縮があまり生じていない。このことから、本発明の不凍ポリアミノ酸を含有し凍結乾燥することにより、効率よく、かつ品質を安定に保ち、被乾燥物を乾燥できた。

Claims (9)

  1. 　生理的溶液中に、ε-ポリ-L-リジン、α-ポリ-L-リジン、ポリアルギニン、その他のポリアミノ酸、アミノ化多糖類、及びポリアリルアミンからなる群から選択される、アミノ基含有単位の重合体からなる高分子化合物を1～50w/w%溶解させたことを特徴とする細胞および組織の凍結保存用組成物。
  2. 　前記高分子化合物のアミノ基の50～99モル％について、無水カルボン酸を反応させてカルボキシル化またはアセチル化することでブロックしたことを特徴とする請求項１に記載の凍結保存用組成物。
  3. 　生理的溶液中に、ポリアクリル酸、α-ポリグルタミン酸、γ-ポリグルタミン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、その他のポリアミノ酸、カルボキシル化多糖類からなる群から選択されるカルボキシル基含有単位の重合体からなる高分子化合物を1～50w/w%溶解させたことを特徴とする細胞および組織の凍結保存用組成物。
  4. 　前記高分子化合物のカルボキシル基の１～50モル％について、ジアミン、トリアミン、ポリアミンなどのアミノ基を複数もつ化合物を反応させてアミノ化することでブロックしたことを特徴とする請求項３に記載の凍結保存用組成物。
  5. 　生理的溶液が、生理食塩水、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（DMEM）、または、その他の細胞・組織用の培養液であることを特徴とする請求項１～４いずれかに記載の凍結
    保存用組成物。
  6. 　前記高分子化合物が、数平均分子量1000～2万のε-ポリ-L-リジンであることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の凍結保存用組成物。
  7. 前記高分子化合物が、数平均分子量1000～300万のポリアクリル酸であることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の凍結保存用組成物。
  8. 　ε-ポリ-L-リジン、α-ポリ-L-リジン、ポリアルギニン、その他のポリアミノ酸、アミノ化多糖類、及びポリアリルアミンからなる群から選択される、アミノ基含有単位の重合体からなる高分子化合物に対し、無水カルボン酸を反応させてカルボキシル化またはアセチル化することでブロックしたことを特徴とする、食品または医薬品の凍結保存用または凍結乾燥用の添加剤組成物。
  9. 　請求項１の添加剤組成物を、食品または医薬品の含水原料組成物、または、燃料電池の内部構成部材その他の工業製品の部材に親水性表面層を設けるための含水原料組成物に、１～15w/w%となるように配合することを特徴とする、食品または医薬品または燃料電池などの工業製品の製造方法。
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