WO2006093194A1

WO2006093194A1 - 抗アレルギー組成物

Info

Publication number: WO2006093194A1
Application number: PCT/JP2006/303889
Authority: WO
Inventors: Syuichi Segawa; Kazuhisa Yasui; Toshio Kurihara
Original assignee: Sapporo Breweries Limited
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-03-01
Publication date: 2006-09-08
Also published as: CA2599867A1; EP1854446A4; JPWO2006093194A1; CN101132807A; AU2006219286B2; NZ561165A; JP4709205B2; US7910141B2; EP1854446A1; EP1854446B1; AU2006219286A1; US20110165272A1; US20090028970A1

Abstract

　副作用が低減され人体や皮膚に緩和な抗アレルギー組成物を提供することを目的とする。この目的を達成するために、ホップの組織の冷水抽出物又はホップの組織の冷水抽出物から分離されたフラボノイド配糖体からなるからなる抗アレルギー組成物を提供する。

Description

明細書

抗アレルギー組成物

技術分野

[0001] 本発明は、抗アレルギー組成物に関する。

背景技術

[0002] 近年、茶葉の成分が生体の様々な生理活性を調節することが見出され、特に、カテキン等のポリフエノール類の抗酸ィ匕作用が注目されている（非特許文献 1)。また、抗酸化剤として有効な成分が、ホップ苞の水溶性画分をゲル型合成吸着剤に吸着させることで得られることが報告されて、る (特許文献 1)。

特許文献 1：特許第 3477628号公報

非特許文献 l :New Diet Therapy. Vo. 19, 9 (2003)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] ヒトは体内に侵入した異物 (細菌、花粉、ダニなど;抗原ともいう）を排除するために、それに対抗する生体成分 (抗体やリンパ球など)を産生して体を守るように働く免疫機能を備えている。ところが、時としてその免疫反応が過敏になるため、身体に有害となり種々の病気の原因となってしまうことがある。このような免疫機能障害による反応をアレルギーと言われ、即時型アレルギー（または Ι〜ΠΙ型アレルギー）と遅延型ァレルギ一（または IV型アレルギー）とに分類されて、る。

[0004] アレルギー反応の中、発症頻度が高いのは即時型であり、主として免疫グロブリン E (IgE抗体）が関与している。 IgEは、体内に侵入した抗原に対して免疫細胞である B細胞が産生するものであり、肥満細胞や好塩基球に作用して、これらの細胞力ヒスタミンゃセロトニンなど多数の活性物質を放出させ、種々のアレルギー症状を引き起こす。例えば、皮膚にかゆみを伴う発赤やふくれあがった発疹 (蓴麻疹）が生じたり、鼻や目に炎症を起こしてかゆくなり鼻汁や涙の分泌が盛んになる。また、呼吸気道が詰まったり呼吸困難の発作を起こしたりする症状 (気管支喘息)などが現れる。

[0005] 従来、使用される抗アレルギー組成物の多くは、即時型アレルギー反応によって引き起こされる症状を治療する目的で作用点が比較的明らかな薬剤である。このような薬剤として、例えば、平滑筋を弛緩させる鎮痙薬、毛細血管の透過性の亢進を抑制する交感神経興奮薬、ヒスタミン遊離抑制剤が挙げられるが、これらはいずれも対症的な治療薬であり、し力も、そのほとんどが化学合成医薬品であるため、副作用を生じな、かに注意が必要であった。

[0006] 本発明はこのような従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、副作用を充分に低減することができ、人体や皮膚に緩和な抗アレルギー組成物を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは、ヒト好塩基球細胞でヒスタミンの遊離を測定するスクリーニング系を用いて、種々の食品成分を添加してその効果を判定したところ、ホップから所定の方法により抽出した抽出物がヒスタミン遊離抑制作用、すなわち、抗アレルギー作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

[0008] すなわち、本発明は、ホップの組織の冷水抽出物からなる抗アレルギー組成物に関するものである。

[0009] この抗アレルギー組成物はヒスタミン遊離抑制作用を有し、例えば、この抗アレルギ一組成物をマウスに強制経口投与した後に、マウス耳介にマウス抗 DNP— IgE抗体を皮内投与し、その後、抗原として DNP— HASを尾静脈に注射して、耳介厚増加量及び耳介浮腫率を求めると、顕著なアレルギー反応抑制効果が生じることが確認される。また、本発明の抗アレルギー組成物は天然物であるホップ力抽出したものであり、抽出方法も特殊な有機溶媒を用いる必要はなく冷水で行うために、副作用を生じるおそれが少なぐ人体や皮膚に緩和な抗アレルギー組成物として適用でき、抗ァレルギ一剤として使用できる。

[0010] なお、上記特許文献 1ではホップの苞から 95°C又は 80°Cで熱水抽出物を得ている力後述の実施例及び比較例に示されるように、このような熱水抽出物は抗アレルギ一性をほとんど示さない。また、冷水抽出物を加熱しても抗アレルギー性が低下しな V、ことから、熱水抽出物と冷水抽出物では有効成分が全く異なって!/、ると考えられる [0011] 本発明の抗アレルギー組成物において、好適な抽出物を得るために、ホップはビール醸造用ホップを用いるとよぐホップの組織としては、茎、毬花又は葉を使用できる。さらに、上記組織は、乾燥された毬花の粉砕物であって、ルブリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものであることが好ましぐ乾燥された苞の粉砕物であればより好ましい。

[0012] ビール等発泡性アルコール飲料の醸造で使用するホップは、茎や葉を除いた毬花を乾燥させ、粉砕後に篩分して篩を通過したものを固めてホップペレットとして使用する力篩を通過しなカゝつた粉砕物は廃棄されることになる。この廃棄される粉砕物は、ルブリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものであり、その大部分は苞であるため、これを原料として抗アレルギー組成物の抽出に用いれば産業廃棄物の減少に貢献し、ホップの苞を有効利用できる。

[0013] さらに、上記の乾燥された毬花の粉砕物は、乾燥された毬花の凍結物の粉砕物であることが好ましい。乾燥された毬花を凍結後に粉砕すると、粉砕効率が増し、粉砕時に生じる熱の影響を受けにくくなるため、粉砕物に含まれる抗アレルギー組成物の抗アレルギー活性を安定的に維持できる。また、ルブリンの大きさ以下の粉砕物が容易に篩を通過するようになるため、ルブリンの大きさを越える粉砕物の純度が高まり、抗アレルギー組成物の純度も高めることができる。

[0014] また、上記組織は、乾燥された毬花から、有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出される物質の少なくとも一部が除かれたホップ残渣とすることができる。ビール等発泡性ァルコール飲料の醸造で使用するホップ毬花は、ホップペレットとして使用する他に、ホップエキスの抽出のために使用されるが、ホップエキスを抽出した後に残るホップ残渣は廃棄されることになる。この廃棄されるホップ残渣は、有機溶媒抽出又は超臨界流体で抽出される物質の少なくとも一部が除かれたものであるため、これを原料として抗アレルギー組成物の抽出に用いれば産業廃棄物の減少に貢献できる。

[0015] 上記冷水抽出物は典型的にはフラボノイド配糖体を含有しており、冷水抽出物から分離されたフラボノイド配糖体は抗アレルギー組成物として機能し、抗アレルギー剤として使用できる。このフラボノイド配糖体はフラボノール配糖体であることが好ましく、フラボノール配糖体としてはケンフエロール配糖体を含有することが好ましい。ケンフエロール配糖体としては、ケンフェロールルチノシド、ァストラガリン及びケンフエ口ールマロ-ルダルコシドからなる群より選ばれる少なくとも 1つが挙げられ、抗アレルギー組成物は、フラボノール配糖体として、ケルセチンマロ-ルダルコシドを更に含有していてもよい。なお、フラボノールは以下の式（1)の構造を主核として有する化合物である。

[0016] [化 1]

[0017] ケンフエロール配糖体は、以下の一般式（2)に示す骨格を有する。一般式（2)において、 Rが水素原子であり Rがルチノース残基である場合がケンフェロールルチノシ

1 2

ド、 Rが水素原子であり Rがグルコース残基である場合がァストラガリン、 Rが水素

1 2 1 原子であり Rがマロニルグルコース残基である場合がケンフエロールマロニルダルコ

2

シド (ァストラガリンマロン酸エステル)である。なお、一般式（2)において、 R及び R

1 2 力 Sともに水素原子である場合がケンフエロールであり、 Rが OH基であり Rがマロ-

1 2 ルグルコース残基である場合がケルセチンマロ-ルダルコシド（イソケルシトリンマロン酸エステル)である。

[0018] [化 2]

フラボノール配糖体は経口摂取されると、消化管内で配糖体のまま吸収される力、又は消化管内で加水分解され遊離型 (ァグリコン)となって吸収されると考えられる（臨床栄養 Vol.102, No3, 285 (2003))。また、ケンフエロール（又はケルセチン）の母核を持つフラボノイド配糖体は加水分解され、ァグリコンの状態で吸収されると考えられる。

[0020] なお、上述した抗アレルギー組成物は、医薬品、化粧品又は飲食品の成分として利用できる。

発明の効果

[0021] 本発明によれば、肥満細胞や好塩基球力のヒスタミンゃセロトニンなどの薬理的活性ァミンの放出抑制作用に優れ、花粉症などのアレルギー疾患の予防又は症状の緩和に使用できる抗アレルギー組成物が提供される。本発明の抗アレルギー組成物は、天然植物由来であるため、副作用を十分なレベルに低減でき、人体や皮膚に緩和な抗アレルギー組成物となり得る。

図面の簡単な説明

[0022] [図 1]ホップの葉（国産フラノ 18号）から水抽出したフラボノール画分の HPLCチヤ一トである。

[図 2]ホップペレット（チェコ産ザーッ種）力水抽出したフラボノール画分の HPLCチヤートである。

[図 3]実施例 2及び比較例 1〜2で得られたホップ抽出物のヒスタミン遊離抑制率（％) を示す図である。

[図 4]実施例 2及び比較例 3〜5で得られたホップ抽出物のヒスタミン遊離抑制率（％) を示す図である。

[図 5]実施例 2の冷水抽出物と実施例 2の冷水抽出物の熱処理物のヒスタミン遊離抑制率 (％)を示す図である。

[図 6]実施例 2〜5の冷水抽出物のヒスタミン遊離抑制率（％)を示す図である。

[図 7]蒸留水又はホップ冷水抽出液を強制経口投与したマウスについて、片側の耳介にマウス IgEを、反対側に生理食塩水（PS)を皮内注射した後、抗原を注射してァレルギ一反応を起こさせた場合の、それぞれの耳介の浮腫率を示す図である。

[図 8]蒸留水、ホップペレット冷水抽出液、ホップ葉冷水抽出液又はフマル酸ケトチフェン水溶液を強制経口投与したマウスについて、片側の耳介にマウス IgEを、反対側に生理食塩水（PS)を皮内注射した後、抗原を注射してアレルギー反応を起こさせた場合の、それぞれの耳介の浮腫率を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0023] 本発明に使用するホップは、ビール醸造のチェコ産ザーッ種、ドイツ産ハラタウ ·トラディション種、国産フラノ 18号等のビール醸造用ホップ種が好適である。

[0024] ホップの品種によってはフラボノールの含有比率が異なっており、抗アレルギー活性の高いホップ抽出物を得るため、チェコ産ザ一ッ種を使用することが好ましい。また、抽出に用いるホップ糸且織はホップの葉、毬花、もしくは茎のいずれでも良い。毬花あるいは濃縮ホップペレット加工時に得られるスベントホップもしくは炭酸ガス抽出 (超臨界抽出）した残渣も使用可能である。

[0025] このようなホップの組織力も冷水で抽出したもの力本発明の抗アレルギー組成物であるが、ここで「冷水」とは室温以下の水を意味する。冷水の温度は 0°C超 50°C以下が好ましぐ通常は 0超 30°C以下である。冷水の温度は 0超 10°C以下がより好ましぐ 5± 3°C (更には 5± 2°C)が更に好ましい。なお、抽出効率を上げ抽出時間を短縮するために、冷水には、少量のアルコール、好ましくはエタノールを 10重量％以下添カロすることができる。

[0026] 抽出する水が 0°C以下の場合は凍結のため抽出が実質的に困難となり、冷水でない場合 (例えば、 50°Cを越す場合）は、抗アレルギー活性が顕著に減少するので使用に適さない。

[0027] ホップの組織の冷水抽出は常法による。例えば、ホップペレットと水とを容器に入れ、適宜撹拌しながら所定時間静置する。こうして静置後に得られた液は、そのまま冷水抽出物として利用することも可能であるし、例えば、その液を遠心した後に生じる上清 (以下「遠心上清」という。）を採取したものを冷水抽出物して利用することも可能である。更には静置後に得られた液又は遠心上清力水分を除去したものを冷水抽出物として禾 IJ用することちできる。

[0028] 本発明の抗アレルギー組成物は、乾燥されたホップの苞の粉砕物の冷水抽出物を有効成分とすることが好ましぐまた、乾燥されたホップの毬花の粉砕物力ルブリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものの冷水抽出物を有効成分とすることが好ましい。冷水抽出に用いるこの乾燥毬花の粉砕物は、例えば、ホップの毬花を乾燥して乾燥毬花を得る乾燥工程と、乾燥毬花を粉砕して粉砕物を得る粉砕工程と、この粉砕物力ゝらルプリンの大きさ以下の粉砕物を取り除く選別工程と、を備える製造方法により得られる。

[0029] 乾燥工程では、ホップの毬花を 100°C以下の温度で乾燥させ、毬花を保存可能な程度にまで水分を除去できればよいが、 55°C以下の温度で水分含量を 7〜9%まで乾燥することが好ましい。粉砕工程では、こうして得られる乾燥毬花を効率的に微粉状に粉砕できればよぐ例えば、ピンミル、ハンマーミル、ボールミル等の粉砕機を用いればよい。選別工程では、乾燥毬花の粉砕物をふるいにかけ、例えば、長径が 0. lmm以上の粉砕物を「ルブリンを超える大きさ」のものとして選別することができる。この場合において、篩を通過させない大きさを長径 0. 3mm以上とすることが好ましぐ長径 0. 5mm以上とすることがより好ましい。乾燥毬花の粉砕物カもルプリンの大きさ以下の粉砕物を取り除くには、例えば、目開き 0. 1、0. 3又は 0. 5mmのふるいで乾燥毬花の粉砕物をふる、分け、ふる、を通過しな力つた粉砕物を回収すればょ、。なお、乾燥毬花の粉砕物力ルブリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものの冷水抽出は、上述した方法で抽出すればよい。

[0030] さらに、本発明の抗アレルギー組成物を調製するために使用する乾燥されたホップの毬花の粉砕物は、乾燥された毬花の凍結物の粉砕物であることが好ましい。乾燥された毬花を凍結する方法は、特に制限されないが、—10°C以下が好ましぐ - 35 °C以下であることがより好まし!/、。

[0031] また、本発明の抗アレルギー組成物は、乾燥されたホップの毬花から、有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出される物質の少なくとも一部が除かれたホップ残渣の冷水抽出物を有効成分とすることができる。有機溶媒抽出に用いる有機溶媒としては、例えば、アルコール又はへキサンが挙げられ、炭素数 1〜4の低級アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。超臨界流体抽出に用いる超臨界流体としては、例えば、二酸化炭素、水、メタン、ェタン、エチレン、プロパン、ペンタン、メタノール、エタノールが挙げられ、二酸ィ匕炭素が好ましい。

[0032] ホップの組織の冷水抽出物に対して更に分離作業を施してフラボノイド配糖体を得ると、その配糖体も抗アレルギー組成物として適用できる。分離の方法の好適例は以下の通りである。まず、冷水抽出物とへキサンに接触させて水側に第 1の抽出物を得るステップ (以下「第 1ステップ」という。）を行い、次に、第 1の抽出物を酢酸ェチルに接触させて水側に第 2の抽出物を得るステップ (以下「第 2ステップ」という。 )を実施する。更に、第 2の抽出物を難水溶性アルコール (水と任意の割合で混合しないアルコールをいい、炭素数 4〜5のアル力ノールが好ましぐブタノールが特に好ましい）に接触させて、その中に第 3の抽出物を得るステップ (以下「第 3ステップ」）を行ってフラボノイド配糖体を得る。

[0033] 第 1ステップでは、目的とする有効成分 (フラボノイド配糖体等）以外のホップ抽出物をへキサン中に溶出させてそれを選択的に冷水抽出物から除去できる。冷水抽出物のへキサンへの接触方法としては、例えば、上述の遠心上清及びへキサンを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうして冷水抽出物をへキサンと接触させる方法が挙げられる。冷水抽出物をへキサンと接触させた後に分液ロートを静置して、水層とへキサン層とに分離させ、水層を第 2ステップで用いる。

[0034] 第 2ステップでは、第 1ステップにおいて得られる第 1の抽出物を酢酸ェチルに接触させる。これにより、目的とする有効成分以外のホップ抽出物を更に酢酸ェチル中に抽出できる。第 1の抽出物の酢酸ェチルへの接触方法としては、例えば、第 1の抽出物及び酢酸ェチルを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうして第 1の抽出物を酢酸ェチルと接触させる方法が挙げられる。第 1の抽出物を酢酸ェチルと接触させた後に分液ロートを静置して、水層と酢酸ェチル層とに分離させ、水層を第 3ステップで用いる。

[0035] 第 3ステップでは、第 2ステップにおいて得られる第 2の抽出物を難水溶性アルコールに接触させフラボノイド配糖体を得る。第 2の抽出物の難水溶性アルコールへの接触方法としては、例えば、第 2の抽出物及び難水溶性アルコールを分液ロートに入れた後、その分液ロートを振とうする方法が挙げられる。この後、分液ロートを静置すると、水層と難水溶性アルコール層とに分離するが、フラボノイド配糖体は難水溶性ァルコール層中に含まれることになる。より多くのフラボノイド配糖体を得るために、第 3 ステップは複数回繰り返されてもよぐ 2〜4回繰り返すのが好ましい。

[0036] なお、ホップの組織の冷水抽出物を、合成吸着剤（例えば合成吸着剤として、 Amb erlite XAD— 4、 7及び 16 (オルガノネ土製、商品名）、活性炭、ポリビュルポリピロリドン（PVPP ;ポリフエノール吸着剤）が挙げられ、この中でも XAD— 4が好ましく用いられる。）を充填したカラムに通すことによつても、フラボノイド配糖体を分離することができる。すなわち、ホップの組織の冷水抽出物を、合成吸着剤を充填したカラムに通し、その吸着成分を、例えば、水及びメタノールの混合溶媒に溶出させることでフラボノイド配糖体を得ることもできる。

[0037] 本発明の抗アレルギー組成物は、種々のアレルギー性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、血管性浮腫、アトピー性疾患、アレルギー性接触皮膚炎、花粉症、蓴麻疹等の予防又は症状の緩和に使用することができる。すなわち、抗アレルギー組成物としての機能を発揮する。

[0038] 本発明の抗アレルギー組成物は、ヒスタミン遊離抑制作用および耳介浮腫形成抑制作用を示すことから、特にアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎や花粉症の予防または症状の緩和に好ましく使用できる。また、これらの疾患の予防や症状の緩和の目的で、医薬品として特にアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎や花粉症の予防剤又は治療剤に製造することができる。

[0039] 更には、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎や花粉症の予防や症状の緩和の目的で、食品添加物として、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品や病者用食品等の飲食物に配合することができ、化粧品添加物として、スキンケア製品、ファンデーションやメイクアップ製品等の化粧品に添加することができる。

実施例

[0040] 以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明する力本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に明記しない限り、「％」は「重量％」を表す

[0041] (実施例 1)

ホップ葉力の冷水抽出：

ホップの葉（国産フラノ 18号）を刻み 10倍量 (wZv)の水に浸して 5°Cにてー晚静置した後、 7000rpmで 15分遠心分離し、上清を回収して冷水抽出物を得た。 [0042] 冷水抽出物の同定：

上清を分液ロートに移し、へキサンを加えへキサン移行成分を廃棄した。さらに、水層に酢酸ェチルを加え、酢酸ェチル移行成分を廃棄した。最後に水層に n—ブタノ一ルを加ぇブタノール抽出操作を 3回繰り返して得たブタノール層を合併し減圧濃縮してフラボノール画分 (ホップの組織の冷水抽出物力も分離されたフラボノイド配糖体 )を得た。

[0043] 得たフラボノール画分を、まず、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)で分析した。

HPLCによる分析は、 C18カラム（Waters Symmetry)を 40°Cにて使用し、流速を 0. 2mLZ分とした。移動相は、 0. 05%TFA/H Oを 1液とし、ァセトニトリルを 2液

2

とし、 2液の割合を 10%〜50%まで 16分間で変化させるリニアグラジェントとした。検出は 350nmの UV検出器で行つた。

[0044] さらに、上記フラボノール画分の各ピークを分取用 HPLCで分離し、各ピークの成分を同定した。 HPLCによる分取用分離は、 C18カラム（Waters SunFire)を 40°C にて使用し、流速を 6mLZ分とした。移動相は、 10%MeCNを 10分間保持し、さらに 150分間かけて 60%MeCNまで変化させるリニアグラジェントとした。検出は 350 nmの UV検出器で行った。 HPLCの分析結果を図 1に示す。

[0045] 図 1に示すように、ホップの葉抽出物のフラボノール画分には主ピークが 3つ存在し、これらは全てケンフエロール配糖体であることが同定された。詳しくは、図 1の 1で示すピークはケンフェロールルチノシド、 2で示すピークはァストラガリン、 3で示すピークはケンフエロールマロニルダルコシドであった。なお、ケルセチンマロニルダルコシド等のケルセチン配糖体は殆ど検出されな力つた。

[0046] (実施例 2)

ホップペレットからの冷水抽出：

ホップペレット（チェコ産ザーッ種：タイプ 90) 1kgを蒸留水 10Lに入れ、 5°Cにて時々攪拌しペレット状態を消失させながらー晚静置した。 7000rpmで 15分遠心分離した後、上清を回収し、それをさらに濃縮して 150gの冷水抽出物を得た。

[0047] 冷水抽出物の同定：

上清を実施例 1と同様の方法で、ブタノール抽出成分を取得し、 HPLCで分析し、成分の同定を行った。 HPLC分析の結果を図 2に示す。図 2に示すように、ホップべレット抽出物のフラボノール画分には主要ピークが 3つ存在し、これらはケンフェロール配糖体（ァストラガリン及びケンフエロールマロ-ルダルコシド）とケルセチンマロ- ルダルコシドであることが同定された。詳しくは、図 2の 1で示すピークはケンフェロールマロ-ルダルコシド、 2で示すピークはァストラガリン、 3で示すピークはケルセチンマロ-ルダルコシドであった。なお、図 2の 4で示すピークはルチン、 5で示すピークはイソケルシトリン、 6で示すピークはケンフェロールルチノシドであった。

[0048] (比較例 1)

ホップペレット（チェコ産ザーッ：タイプ 90)を 1% (w/w)となるようにクロ口ホルム一メタノール溶液 (クロ口ホルム:メタノール = 3 : 1)で抽出した。抽出はクロ口ホルム一メタノール溶液の沸点にて 2時間行った。収率は約 15%であった。

[0049] (比較例 2)

ホップペレット（チェコ産ザーッ：タイプ 90)を 1% (w/w)となるようにして煮沸水で 2時間抽出を行った。収率は約 23%であった。

[0050] ホップ抽出物のヒスタミン遊離抑制作用の確認：

実施例 2及び比較例 1〜2で得られたホップ抽出物を用いて、以下のようにしてヒスタミン遊離抑制作用の確認を行った。

[0051] ヒト好塩基球株化細胞 (KU812)を、 10%の 56°Cにて 30分間不活性ィ匕した牛胎児血清を含む RPMI1640培地（ギブコ）で、 37°Cにて 5%CO雰囲気下で培養した

2

。細胞を Tyrode溶液で 2回の洗浄を繰り返した後、 Tyrode溶液に懸濁し、 1. 5mL 容のチューブに 2 X 10⁶cellsZmLとなるように分注した。細胞懸濁液にそれぞれ表 1に示した量の緩衝液、 10mMの CaCl、 50 Mの A23187及び/又は被検サン

2

プル (ホップ抽出物）を加え、 37°Cにて 20分間ヒスタミン遊離反応をさせた後、氷中に 5分間入れて反応を停止させた。

[0052] [表 1] 細胞内自然遊離 A23187 被検

総ヒスタミン (ネ力"ティフ (ホ。シ -亍ィフ- サンプルコントロール）コントロール）

1 OmM CaCI₂ - ^^o^\ 110/ I 110 I

50 μ Μ A23187 - - 110ju I 110ju I 被検化合物 - - - 1 I 緩衝液 600 I 490 i I 380 jW I 270/^ I 細胞懸濁液 500〃 I 500 i I 500 jU I 500〃 I

[0053] その後 4°Cにて lOOOrpmで 3分間遠心分離し、上清を回収した。回収された上清力有機溶媒で遊離ヒスタミンを抽出し、 o フタルアルデヒドと反応させ発生した蛍光を、波長 350nmの光で励起こした後波長 450nmにお、て蛍光強度を測定することによって、遊離ヒスタミンを定量した。また、細胞内総ヒスタミンは、同量の細胞懸濁液を氷中で 1分間超音波破砕した後、 4°Cにて lOOOOrpmで 3分間遠心分離して得た上清中のヒスタミン含量を測定することによって得た。ヒスタミン遊離抑制率 (％)は、 100 { (各サンプルの上清中のヒスタミン含量自然遊離量） X 100/(A23187 刺激によるヒスタミン遊離量自然遊離量） }の式で求めた。

[0054] 実施例 2と同様の条件で得られたホップ冷水抽出物及び比較例 1〜2で得られたホップ抽出物についてのヒスタミン遊離抑制率（％)を図 3に示す。図 3に示されるように、実施例 2と同様の条件で得られたホップ冷水抽出物では非常に高、％のヒスタミン遊離抑制率が得られたが、クロ口ホルムメタノール抽出物（比較例 1)や熱水抽出物（比較例 2)ではヒスタミン遊離抑制能が認められな、ことがわ力つた。

[0055] (比較例 3〜5)

ホップペレット（チェコ産ザーッ種：タイプ 90) lOOgを蒸留水 1Lに入れ、 15分間、 3 0分間、 60分間煮沸し、それを 7000rpmで 15分遠心分離した後、上清を回収し抽出物 (熱水抽出物）とした。抽出を 15分行ったものが比較例 3、 30分行ったものが比較例 4、 60分行ったものが比較例 5である。

[0056] 実施例 2と同様の条件で得られた冷水抽出物と比較例 3〜5の熱水抽出物を用いて上記と同様にしてヒスタミン遊離抑制率 (％)を求めた。その結果を図 4に示す (個々のデータを丸で平均値をバーで表す)。図 4に示すように、熱水抽出物に比較して冷水抽出物のヒスタミン遊離抑制率は 2〜3倍程度優れていた。

[0057] 比較例 3〜5において低いヒスタミン遊離抑制率（％)が現れる理由力加熱による失活によるのかどうかを確かめるために、以下の実験を行った。すなわち、実施例 2と同様の条件で得られた冷水抽出物と、この熱処理物（100°C30分）について、上記と同様にしてヒスタミン遊離抑制率（％)を求めた。その結果を図 5に示す (個々のデータを丸で平均値をバーで表す)。図 5に示すように冷水抽出物は熱処理によっても活性を消失しない。したがって、比較例 3〜5の熱水抽出物は実施例 2の冷水抽出物と有効成分が異なってヽることが結論できる。

[0058] (実施例 3〜5)

用いるホップの種類又は組織を変化させて実施例 1又は 2と同様にして冷水抽出物を得、上記と同様にしてヒスタミン遊離抑制率 (％)を算出した。ドイツ産ハラタウ'トラディション種のペレットを用いたのが実施例 3、国産フラノ j8のペレットを用いたのが実施例 4、国産ホップの若葉の葉を用いたのが実施例 5である。ヒスタミン遊離抑制率（％)の結果を図 6に示す。なお、実施例 2と同様のホップ (チェコ産ザーッ種のぺレット）を用いたものについては、図 6において実施例 2と記載してある。図 6に示すように、ホップ種としては、チェコ産ザーッ種、ドイツ産ハラタウ'トラディション種、国産フラノ βが優れており、組織として葉も優れていることがわ力つた。

[0059] (実施例 6)

マウス DNP— HSAによる耳介浮腫におけるホップ水抽出物の抑制作用

6週齢の ICR系マウス（雄又は雌；日本チヤ一ルス'リバ一）を、 1ケージあたり 4〜5 匹とし、室温 24± 2°C、湿度 55± 15%、 12時間ごとの明暗サイクル（明期 8 : 00— 2 0 : 00)の条件下、飼育した。一週間以上の予備飼育後、試験に供した。試験群にはそれぞれホップペレット水抽出液、ホップ葉水抽出液、又はフマル酸ケトチフェン水溶液を、対照群には蒸留水をそれぞれ lOmLZkgで強制経口投与した。ここで、ホップペレット水抽出液は、ホップペレット（チェコ産ザーッ種）を 10% (w/w)となるように蒸留水中にカ卩ぇ 4°Cで一晩抽出した後、 3000rpmで 10分間遠心分離しろ過することによって調製した。ホップ葉水抽出液は、乾燥ホップ葉（国産ホップ若葉)を 10 % (w/w)となるように蒸留水中に加え 4°Cでー晚抽出した後、 3000rpmで 10分間遠心分離し、ろ過することによって調製した。また、フマル酸ケトチフェン水溶液は、 0 . 5mgZmLの濃度となるように蒸留水に溶解することによって調製した。

[0060] 経口投与 1時間後、マウスの片側の耳介に 10 gZmLのマウス抗 DNP— IgE抗体 (シグマ）を、反対側の耳介に生理食塩水（PS)をそれぞれ 20 μ Lずつ皮内注射した。皮内注射 24時間後、 lmgZmLの DNP— HSA (抗原）を 100 /z Lずつ尾静脈より注射した。抗原投与前及び抗原投与 30分後の耳介の厚みをシックネスゲージで 3 回ずつ測定し、耳介浮腫率及び耳介厚増加量を求めた。各群間の有意差検定は t 検定によって行った。なお、耳介浮腫率 (％)は、（抗原投与 30分後の耳介厚平均値抗原投与前の耳介厚平均値） X 100Z抗原投与後の耳介厚平均値、の式で求め、耳介厚増加量 (mm)は、抗原投与 30分後の耳介厚平均値抗原投与前の耳介厚平均値、の式で求めた。

[0061] 蒸留水及びホップ (チェコ産ザーッ種)水抽出液を経口投与されたマウスにおける耳介浮腫率を図 7に示す (図 7の PSは生理食塩水を意味する。 )₀蒸留水経口投与群では、 IgE抗体を皮内注射した耳介の耳介厚増加量は 0. 081 ±0. 019mmであり、耳介浮腫率は 31. 1 ±6. 4 (%)であった。一方、ホップペレット水抽出液経口投与群では IgE抗体を皮内注射した耳介の耳介厚増加量は 0. 019±0. 010mmであり、耳介浮腫率は 9. 7± 3. 2 (%)であった。ホップペレット水抽出液投与群は、蒸留水投与群に比べて有意に耳介浮腫率を抑制した (p< 0. 01)。これに対して、生理食塩水 (PS)を皮内注射した耳介における耳介厚みの増加は、対照群及び試験群ともに認められなかった。

[0062] また、蒸留水、ホップペレット水抽出液、ホップ葉水抽出液、又はフマル酸ケトチフヱン水溶液を経口投与されたマウスにおける耳介浮腫率を図 8に示す。蒸留水経口投与群では、 IgE抗体を皮内注射した耳介厚増加量は 0. 081 ±0. 024mmであり、耳介浮腫率は 22. 9 ±6. 8%であった。一方、ケミカルメディエーター遊離抑制薬であるフマル酸ケトチフェン水溶液投与群では、 IgE抗体を皮内注射した耳介厚増加量 ίま 0. 045±0. 020mmであり、耳介浮腫率 ίま 12. 7± 5. 4⁰/₀であった。フマノレ酸ケトチフェン水溶液投与群は蒸留水投与群に比べて有意に耳介浮腫率を抑制した（ ρ< 0. 05)。一方、ホップペレット水抽出液投与群及びホップ葉水抽出液投与群は、蒸留水投与群に対して統計上の有意差 (棄却域 5%)は認められなかったものの、耳介浮腫を抑制する傾向にあることが示唆された (p値 0. 08)。

Claims

請求の範囲

[I] ホップの組織の冷水抽出物力もなる抗アレルギー組成物。

[2] 前記ホップは、ビール醸造用ホップである、請求項 1記載の抗アレルギー組成物。

[3] 前記組織は、茎、毬花又は葉である、請求項 1又は 2記載の抗アレルギー組成物。

[4] 前記組織は、乾燥された苞の粉砕物である、請求項 1又は 2記載の抗アレルギー組成物。

[5] 前記組織は、乾燥された毬花の粉砕物から、ルブリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものである、請求項 1又は 2記載の抗アレルギー組成物。

[6] 前記乾燥された毬花の粉砕物は、乾燥された毬花の凍結物の粉砕物である、請求項 5記載の抗アレルギー組成物。

[7] 前記組織は、乾燥された毬花から、有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出される物質の少なくとも一部が除かれたホップ残渣である、請求項 1又は 2記載の抗アレルギー組成物。

[8] 前記冷水抽出物は、フラボノイド配糖体を含有する、請求項 1〜7の、ずれか一項記載の抗アレルギー組成物。

[9] ホップの組織の冷水抽出物力分離されたフラボノイド配糖体力なる抗アレルギ一組成物。

[10] 前記フラボノイド配糖体は、フラボノール配糖体である、請求項 8又は 9記載の抗ァレルギ一組成物。

[II] 前記フラボノール配糖体として、ケンフエロール配糖体を含有する、請求項 10記載の抗アレルギー組成物。

[12] 前記ケンフエロール配糖体は、ケンフェロールルチノシド、ァストラガリン及びケンフエロールマロ-ルダルコシドカもなる群より選ばれる少なくとも 1つである、請求項 11 記載の抗アレルギー組成物。

[13] 前記フラボノール配糖体として、ケルセチンマロ-ルダルコシドを更に含有する、請求項 11又は 12記載の抗アレルギー組成物。

[14] 請求項 1〜 13の、ずれか一項記載の抗アレルギー組成物を有効成分とする医薬

[15] 請求項 1〜13のいずれか一項記載の抗アレルギー組成物を含有する化粧品。

[16] 請求項 1〜13の、ずれか一項記載の抗アレルギー組成物を含有する飲食品。