WO1999057301A1 - Composes dont la structure comporte des derives d'acide glucuronique et des derives de glucosamine, leur procede de preparation et d'utilisation - Google Patents

Description

グルクロン酸誘導体およびダルコサミン誘導体を構造中に有する化合物、

その製造法およびその用途

技術分野

本発明は、 新規なグルクロン酸誘導体およびダルコサミン誘導体を構造中に有 する化合物、 その製造法、 それを含有する医薬組成物およびそれを側鎖構造にも つ高分子、 それらを用いて製造した成型物およびその成型物を部品として用いて 製造した人工臓器、 医療用具、 細胞培養器材に関する。 背景技術

血栓症は欧米および近年の日本における主要な死因のひとつであり、 心筋梗塞、 脳梗塞などの動脈性疾患を合計すると、 癌を越える最大の死因である。 血栓症に は様々な要因があるが、 動脈硬化などの血管の病変がその基盤となっていること が多い。 正常血管は血管内皮細胞によって高度に抗血栓化されているが、 動脈硬 化巣などの血管病変部位では活性化している血管内皮細胞、 あるいは、 傷害によ つて露出した血管内皮下組織に血小板が粘着して病的血栓が形成されやすくなつ ている。 病的血栓の形成を抑制する薬剤として、 血小板の粘着や凝集を抑制する 薬剤、 いわゆる、 「抗血小板剤」 が注目され臨床的に広く用いられつつあるが、 抗血小板剤の歴史は比較的新しく、 より優れた薬剤の開発が期待されている。 上述したように、 正常血管は血管内皮細胞によって高度に抗血栓化されている が、 ここで血管内皮細胞の役割をさらに詳しくみてみると、 血管内皮細胞は、 全 身の血管内腔を連続して被覆する一層の細胞群である。 正常な血管内皮細胞は、 ①血管透過性の抑制、 ②血管内腔の抗血栓化、 ③血管平滑筋の弛緩、 収縮の調節、 ④血管壁細胞の遊走や増殖の制御のような多彩な機能を果たしており、 血管内皮 細胞は血管を血管たらしめる中心的存在であると言われている。

ヒトは血管とともに老いるといわれており、 血管壁は年齢とともに障害を受け る。 血管壁が障害を受けて破綻すると、 血管の破綻は心筋梗塞、 大動脈瘤、 脳卒 中、 あるいは壊死といった循環器疾患の形で現れる。 血管壁の破綻の最大の原因 は動脈硬化である。 現在の動脈硬化の治療又は予防は、 そのほとんどが脂質代謝の改善という面か らのアプローチであり、 薬剤としては抗高脂血症剤が汎用されている。 その他、 動脈硬化部位の血管の閉塞を防ぐ目的で抗血小板剤ゃ抗血液凝固剤が投与される。 しかし、 これらの薬剤は、 血管壁の破綻を積極的に治療するものではなく、 破綻 の原因の一つである高脂血症あるいは破綻の進展原因の一つである血栓形成を押 さえ込むことによって破綻の進展を防ぐという間接的な作用を期待するものであ る。

動脈硬化の発症、 進展には、 血管内皮細胞の損傷や機能喪失が重要かつ不可欠 であるとされている。 前述のように、 従来の療法では、 治療を行ううえで最も重 要な血管の破綻の根本的原因の解消、 即ち血管内皮細胞の再生および機能回復に ついては単純に生体がもつ修復機能に依存するのみであった。 従って、 損傷を受 けて本来の機能を喪失した血管内皮細胞の再生や機能回復を促進する、 いわゆる

「血管内皮再生療法」 は従来の治療法の欠点を克服し得る極めて有用な治療法で あるといえる。 しかし、 血管内皮再生療法に利用しうる薬剤は実用化されておら ず、 優れた薬剤の開発が望まれている。 血管内皮再生療法の例としては、 実験的 に傷害したゥサギの血管内皮障害部位に血管内皮細胞成長因子 （VEGF) の遺伝 子を導入して VEGFを発現させ、 その有効性を検討した報告 （Asahara, T. et al. , Circulation, 94, 3291, 1996) などがある。

経皮経管的冠動脈形成術 （PTCA) は、 血管内に入れたバルーンカテーテルを 膨らませ （バル一二ング） 、 動脈硬化の進展によってできた狭窄部位を拡張する 手法であり、 冠動脈硬化症の確立された治療法の一つである。 しかし、 術後 6ケ 月以内に 3 0〜5 0 %の患者に再狭窄が認められ、 大きな問題となっている。 再 狭窄は、 バルーニングによって引き起こされ、 急激に進行する一種の動脈硬化症 であるといえる。 これまで、 バル一ニングの手技の工夫やカテーテルの改良など とともに様々な薬剤を用いた治療が試みられてきたが、 未だに充分であるとは言 い難く、 より優れた治療法や薬剤の開発が期待されている。 血管内皮再生療法な らば、 PTCA後の再狭窄を効果的に予防できると考えられ （前記の Asaharaら の報告を参照されたい） 、 これに用いる優れた薬剤の開発が期待されている。 心筋梗塞などの虚血性疾患の予後は、 多くの因子によって影響を受けるが、 側 副血行路の発達の程度は、 最も重要な予後決定因子の一つであると考えられてい る。 側副血行路の充分な発達があれば、 狭窄や閉塞 （梗塞） が生じても、.虚血ゃ 組織の壊死が押さえられ、 梗塞サイズの縮小や予後の改善が得られる。 従来、 側 副血行路形成の機序として、 血管内圧や血流の変化が重要視されてきたが、 側副 血行路形成時に血管内皮細胞や血管平滑筋細胞に D N A合成を伴う細胞分裂像が 認められることが報告され、 側副血行路の形成過程は、 単に既存の吻合血管の物 理的要因による拡張だけでなく、 少なくともその一部は血管壁構成細胞の増殖が 関与する血管新生過程であると理解されるようになっている。 近年、 「血管新生 療法」 という新しい治療法によって虚血性心疾患を治療しょうとする試みがなさ れている （例えば、 Yanagisawa-Miwa, A. et al. , Science, 257, 1401, 199

2) 。 血管新生療法とは、 虚血組織周辺の血管新生を促進することによって積極的 に側副血行路を確保し、 虚血組織を保護しょうとする試みであり、 "pharmacolo gical bypass therapy (薬物投与によるバイパス形成療法） "ともいえる新しい治 療法である。 しかし、 未だに実用化には至っておらず、 これに用いることのでき る優れた薬剤や治療法の開発が期待されている。 また、 血管新生促進活性をもつ 物質 （例えば、 線維芽細胞成長因子） を創傷の治療に利用する試みがなされてい る （Hockel, M. et al. , Arch. Surg. , 128, 423, 1993などを参照されたい） 。

人工臓器とは、 心臓、 血管、 心臓弁、 肺、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 皮膚、 粘膜な どの各種の生体組織および臓器の機能を人工的な材料を用いた成型物やそれを部 品として用いた装置によって補助あるいは代行しょうとするものである。 人工臓 器は、 生体内に埋入したり、 血管への力二ユレ一シヨンによって引き出した血液 を接触させることによってその機能を発揮するため、 それらに用いる材料は生体 に害を与えることなく使用できる性質、 つまり、 生体適合性をもたなければなら ない。 人工臓器の生体適合性を規定する最も重要な生体の反応は血栓形成反応で ある。

血小板の粘着と凝集は、 血液凝固系たん白質の活性化とならぶ血栓形成反応に 関与する重要な生体反応のひとつであり、 正常な生体防御システムに不可欠な止 血機能のために存在する。 しかし、 血液が人工臓器に接触したときにも血小板の 粘着と凝集を経た血栓形成が引き起こされる可能性がある。 血栓が形成されると、 人工臓器は本来の機能を果たすことができなくなる。 血栓が形成されるような不 都合を避けるために、 血小板の粘着凝集を引き起こさない材料、 すなわち、 抗血 栓性材料の開発が試みられてきた。 さまざまな検討が盛んに行われてきたが、 い まだに充分といえるものではない。 優れた人工臓器の開発に不可欠であるより優 れた抗血栓性材料の開発が期待されている。

血栓形成を避けるために、 血液と接触しても血栓を形成しない材料、 すなわち、 抗血栓性材料の開発が試みられてきた。 体内で血液と直接触れるのは血管内皮を 構成する血管内皮細胞であり、 正常な血管内皮細胞の上では血栓は形成されない。 当然のことではあるが、 最も優れた抗血栓性材料は天然の抗血栓性材料である血 管内皮細胞といえる。 本来の臓器と同様に人工臓器の血液接触面が血管内皮細胞 で被覆されていれば、 血栓形成反応は起こらない。 血管内皮細胞の抗血栓性を積 極的に利用した人工臓器を開発する試みとして新生内膜治癒促進型人工血管など の臨床応用が試みられており、 ある程度の成果が得られている （例えば、 Noishi ki, Y. et al. , Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. , 27, 309, 1986) 。 これまで、 細胞親和性の高い材料を用いたり、 成型物の有孔性を高くすることに よって細胞侵入を促進するなどといった方法でアプローチがなされているが、 血 管内皮細胞の成長を促進する物質を利用して血管内皮細胞の被覆を促進するとい つた試みはほとんどなされていない。

また、 人工臓器以外にも、 血液と接触する機会のある医療用具も接触によって 血小板の粘着凝集が起こることが不都合であるため、 抗血栓性をもつ材料を用い ることが望ましい。 これらの理由からも、 より優れた抗血栓性材料の開発が期待 されている。

さらに、 血管内皮細胞の成長促進作用をもつ物質は細胞培養用組成物や細胞培 養用器材の材料としても利用可能である。 発明の開示

上記の記述から明らかなように、 優れた抗血小板剤および抗血栓性材料の提供 は医療上の重要な課題である。

さらに、 優れた血管内皮細胞増殖促進物質および血管内皮細胞増殖促進作用を もつ高分子物質の提供は医療上ならびに細胞生物学的実験を行ううえでの重要な 課題である。 .

本発明者らは、 かかる課題を解決するために鋭意研究を重ねてきた結果、 一般 式 （1 ) に示される化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物または 塩の溶媒和物が優れた血小板粘着凝集抑制作用を有することを見いだし、 さらに、 その化合物を側鎖構造として有する高分子が優れた血小板粘着抑制作用を有する ことを見いだして本発明を完成するに至った。

本発明者らは、 さらに、 一般式 （1 ) に示される化合物、 その薬理学的に許容 される塩および溶媒和物または塩の溶媒和物が優れた血管内皮細胞増殖促進作用 および血管新生促進作用を有することを見いだし、 さらに、 その化合物を側鎖構 造として有する高分子物質が優れた血管内皮細胞増殖促進作用を有することを見 いだして本発明を完成するに至った。

すなわち、 本発明は、 下記一般式 （1 ) で表される グルクロン酸誘導体および ダルコサミン誘導体を構造中に有する化合物、 その薬理学的に許容される塩およ び溶媒和物または塩の溶媒和物を提供する。

本発明はさらに、 ヒアルロン酸またはその塩を解重合する工程を含むことを特 徵とする一般式 （1 ) の化合物の製造方法を提供する。

本発明はさらに、 一般式 （1 ) の化合物の少なくともひとつを有効成分とする 医薬組成物を提供する。 前記医薬組成物は血栓症治療薬および予防薬、 循環器疾 患治療薬および予防薬、 脳血管障害治療薬および予防薬、 末梢血管障害治療薬お よび予防薬として有用である。

本発明はさらに、 一般式 （1 ) の化合物の少なくともひとつを有効成分とする 抗血小板剤を提供する。

本発明はさらに、 一般式 （1 ) の化合物を有効成分とする血管内皮細胞増殖促 進剤を提供する。 前記血管内皮細胞増殖促進剤は血管内皮再生療法のための治療 薬または予防薬、 血管新生療法のための治療薬または予防薬として有用である。 本発明はさらに、 一般式 （1 ) の化合物の少なくともひとつを側鎖構造として 有する高分子を提供する。

本発明はさらに、 一般式 （1 ) の化合物、 あるいは前記高分子の少なくともひ とつを有効成分とするコーティング剤を提供する。

本発明はさらに、 前記高分子の少なくともひとつを材料として用いた成型物を 提供する。

本発明はさらに、 前記コーティング剤の少なくともひとつを使用して製造した 成型物を提供する。

本発明はさらに、 前記成型物の少なくともひとつを部品として用いた人工臓器 を提供する。

本発明はさらに、 前記成型物の少なくともひとつを部品として用いた医療用具 を提供する。

本発明はさらに、 前記高分子を有効成分として含む細胞培養用組成物を提供す る。

本発明はさらに、 前記成型物およびノまたはコ一ティング剤を使用して製造し た細胞培養用器材を提供する。 発明を実施するための最良の形態

[本発明の化合物]

本発明の化合物は、 下記一般式 （1) で表されるグルクロン酸誘導体およびグ ルコサミン誘導体を構造中に有する化合物、 その薬理学的に許容される塩および 溶媒和物または塩の溶媒和物である。

式 （1)

[式 （1) 中、 R ¹は保護基または下記式 （2) 〜 （5) を表す。 式 （2) 〜

(5) 中、 R ^1Qは水素原子、 保護基または下記式 （6) 〜 （8) を表し、 R ¹¹は 水素原子または保護基を表す。 ただし、 R ^lQおよび R ¹¹が水素原子または保護 基である場合、 R ¹は COOR⁴に対してトランス結合あるいはシス結合のどちら であってもよい。 - 式 （2)

- OR ¹⁰ 式 （3)

NHR ¹¹ 式 (4)

CH 2 R ¹ 式 (5)

一 SR ¹ 式 (6)

〇 R

式 (7)

式 (8) 〇 R'

また、 R '^Qが式 （6) 〜 （8) である場合、 式 （6) 〜 （8) 中、 R ¹³、 R ¹⁷お よび R ²⁶を除く R ¹²〜R ²⁸は同一または異なって水素原子または保護基を表し、 R ¹³、 R ¹⁷および R²⁶はアジド基または下記式 （9) を表す。

式 （9)

- NR²⁹R³⁰

式 （9) 中、 R²⁹および R^3Qは、 同一または異なり水素原子または保護基を表 す。

式 （1) 中、 R²〜R ⁸は同一または異なって水素原子または保護基を表す。

式 （1) 中、 R⁹は、 水素原子、 保護基または下記式 （10) または下記式 （11) を表す。

式 (10)

式 （11)

式 （10) および （11) 中、 R ³¹〜！ ³⁷は同一または異なって水素原子または保 護基を表す。

式 （1) 中、 nは 0〜2 5の整数を表す。

(ただし、 nが 0のときは、 R ¹は式 （2) 、 は式 （8) で表される基であ り、 R⁹は式 （10) または式 （11) で表される基である。 ）

式 （1) 、 式 （6) 〜 （8) および式 （10) 〜 （11) 中、 保護基は互いに同一ま たは異なり、 置換されていてもよい炭素原子数 1〜8の直鎖または分枝鎖のアル キル、 置換されていてもよい炭素原子数 2〜 8の直鎖または分枝鎖のアルケニル、 置換されていてもよい炭素原子数 1〜 8のァシル、 置換されていてもよい芳香族 ァシル、 または置換されていてもよい芳香族アルキルであり、 また R ¹³、 R ¹⁷ および: R²⁶を除く R²〜R³⁷の任意の保護基 2つが一緒になつて、 置換されて いてもよい炭素原子数 3〜 8のアルキリデン、 置換されていてもよい炭素原子数 3〜 8の環状アルキリデン、 置換されていてもよいべンジリデン、 または、 置換 されていてもよいフタロイルを形成してもよい。

また、 nが 2以上の場合、 R²〜！ ⁸は、 繰り返し単位ごとに同一であっても異 なっていてもよい。 ]

すなわち、 式 （1) で表される本発明の化合物は、 下記式 （12) で表される D -ダルコサミン誘導体と式 （13) で表される D-グルクロン酸誘導体が結合した 構造を有する。

式 （12)

[式 （12) 中、 R ³⁸〜！ ⁴³は水素原子または保護基を表す。 ]

式 (13)

[式 （13) 中、 R ⁴⁴は水酸基または保護基を表し、 R⁴⁵〜R⁴⁸は水素原子また は保護基を表す。 ]

式 （1) において、 nは 0〜25の整数を表す力 IIが 0のとき R¹は式

(2) 、 Ϊ ¹⁽⁾は式 （8) で表される基であり、 R⁹は式 （10) または （11) で表 される基である。 すなわち、 式 （1) の化合物は下記式 （14) または （15) で表 される。 式 ( 14)

式 ( 15)

本発明でいう保護基とは、 Theodra W. Green著の "Productive Groups in 0 rganic synthesis" ；第 2半 lj ; 1991年刊に表されている各種の保護基を含むもの である。

上記式 （1 ) 〜 （1 1 ) 中で示される保護基は、 置換されていてもよい炭素原子 数 1〜8の直鎖または分枝鎖のアルキルとしては例えば、 メチル、 ェチル、 プロ ピル、 イソプロピル、 プチル、 第三級プチル、 ペンチル、 ォクチル、 メトキシメ チル、 第三級プチルチオメチル、 1-エトキシェチル、 シロキシメチルまたは 2- メトキシェトキシメチルなどを表し、 置換されていてもよい炭素原子数 2〜8の 直鎖または分枝鎖のアルケニルとしては、 例えば、 ェテニル、 1-プロべニル、

2 -プロべニル、 ブテニルまたはォクテニルなどを表し、 置換されていてもよい

1〜 8の直鎖または分枝鎖のァシルとしては、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオ二 ル、 プチリル、 バレリルまたはビバロイル、 またはハロゲン化ァシルなどを表し、 八ロゲン化ァシルとしては例えば、 クロロアセチル、 ジクロロアセチル、 トリク ロロァセチル、 トリフルォロアセチルなどを表し、 置換されていてもよい芳香族 ァシルとしては例えば、 ベンゾィル、 パラクロロベンゾィルなどを表し、 置換さ れていてもよい芳香族アルキルとしては、 例えば置換されていてもよいベンジル、 置換されていてもよいジフエニルメチルまたは置換されていてもよいトリフエ二 W 5

ルメチルなどを表し、 置換されていてもよいべンジルとしては、 例えば 4-メト キシベンジルなどを表す。 さらに、 式 （1 ) 〜 （1 1 ) 中で示される保護基は、 R ^{1 3}、 R ^{1 7}および R ^{2 6}を除く R ²〜R ^{3 7}の任意の保護基 2つが一緒になつて、 1 つの保護基を表してもよく、 即ち置換されていてもよい炭素原子数 3〜 8のアル キリデン、 置換されていてもよい炭素原子数 3〜8の環状アルキリデン、 置換さ れていてもよいべンジリデン、 または、 置換されていてもよいフタロイルを形成 してもよい。 置換されていてもよい炭素原子数 3〜8のアルキリデンとしては例 えば、 プロピリデン、 ブチリデンまたはォクチリデンなどを表し、 置換されてい てもよい炭素原子数 3〜 8の環状アルキリデンとしては例えば、 シクロペンチリ デン、 シクロへキシリデンまたはシクロへプチリデンなどを表し、 さらに、 置換 されていてもよいべンジリデンまたは置換されていてもよいフタロイルなどを表 す。 水酸基の保護基としては置換されていてもよい炭素原子数 1〜 8の直鎖また は分枝鎖ァシル、 置換されていてもよい芳香族アルキル、 置換されていてもよい 炭素原子数 2以上の直鎖または分枝鎖のアルケニルまたは置換されていてもよい ベンジリデンなどが好ましく、 さらに好ましくはァセチル、 ベンジル、 1 -プロ ぺニルまたはべンジリデンなどを表し、 ァミノ基の保護基としては、 置換されて いてもよい炭素原子数 1以上の直鎖または分枝鎖のァシルまたは置換されていて もよいフタロイルなどが好ましく、 さらに好ましくはァセチルまたはフタロイル などを表し、 カルボキシル基の保護基としては、 置換されていてもよい炭素原子 数 1〜 8の直鎖または分枝鎖のアルキルまたは置換されていてもよい芳香族アル キルなどが好ましく、 さらに好ましくは、 メトキシル、 メチル、 ェチル、 プロピ ル、 イソプロピル、 ブチル、 イソプチル、 ペンチル、 イソペンチルまたはジフエ ニルメチルなどを表す。 上記の保護基は、 同一の化合物中で互いに同一でも異な つていてもよく、 任意に選ばれる。

式 （1 ) 中の nは 0〜2 5の整数であり、 好ましくは、 0〜 1 0、 特に好 ましくは 0〜5である。

R ⁹は上記の記載に合致するものであればよいが、 特に、 前記式 （1 1 ) である こと、 すなわち、 式 （1 ) の化合物が下記式 （16) であることが好ましい。 式 ( 16)

さらにこのとき、 式 （11) において、 R ¹が前記式 （6) 〜 （8) であること、 すなわち、 式 （1) の化合物が下記式 （Π) 〜 （19) であることがより好ましレ: 式 (17)

式 (18)

式 (19)

C H₂OR^2;

また、 さらに前記式 （1 7) 〜 （1 9) において、 R ^{1 3}、 R ^{1 7}、 R ^{2 6}が前記式

( 9 ) であることが特に好ましい。

本発明の化合物は、 （A) 血小板粘着凝集抑制作用と、 （B ) 血管内皮細胞増 殖促進作用および血管新生促進作用という 2つの異なる作用を有する。 （B ) の 目的で使用するためには、 式 （16) の化合物が特に好ましい。

本発明における薬理学的に許容される塩とは、 本発明の化合物を治療に必要な 量を投与する場合に、 生体に対して悪影響を及ぼさない、 あるいは、 本発明の化 合物の有効な薬理学的な性質を塩としたことで損なわない塩であることを意味す る。 具体例としては、 ナトリウム塩、 カリウム塩またはカルシウム塩などのアル カリ金属またはアルカリ土類金属の塩； フッ化水素酸塩、 塩酸塩、 臭化水素酸塩、 ヨウ化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；メタンスルホン酸塩、 トリフルォロ メタンスルホン酸塩、 エタンスルホン酸塩などの低級アルキルスルホン酸塩；ベ ンゼンスルホン酸塩、 p. トルエンスルホン酸塩などのァリールスルホン酸塩； フマル酸塩、 コハク酸、 クェン酸塩、 酒石酸塩、 シユウ酸塩、 マレイン酸塩など の有機酸塩；およびグルタミン酸塩、 ァスパラギン酸塩などのアミノ酸塩をあげ ることができる。 またさらに、 本発明の化合物およびその塩は、 薬理学的に許容 される各種の溶媒、 例えば水、 有機溶媒、 緩衝液などとの溶媒和物や結晶多形の ものなども含まれる。

本発明の化合物は置換基の種類によって不斉炭素原子を有し、 不斉中心の存在 に基づく光学異性体が存在する場合がある。 本発明の化合物には、 各々の異性体、 および、 それらの混合物のすべてが含まれる。 例えば、 ある光学異性体とその鏡 像異性体 （ェナンチォマ一） との混合物、 特に、 等量混合物であるラセミ体、 ま た、 あるいは、 ある光学異性体とそのジァステレオマーとの混合物も含まれる。 [本発明の化合物の製造法]

当然のことではあるが、 本発明の化合物を得る方法には種々の方法がある。 例 えば、 グルクロン酸誘導体やダルコサミン誘導体などを原料にして有機化学的手 法によって中間体あるいは目的化合物を合成 ·修飾する方法や多糖を酸やアル力 リなどを用いて分解して中間体あるいは目的化合物を得る方法などの有機化学的 手法、 ダルク口ン酸ゃ N-ァセチルダルコサミンなどを原料にして転移酵素や分 解酵素の逆反応などを利用して中間体あるいは目的化合物を合成 ·修飾する方法 や多糖を酵素を用いて分解して中間体あるいは目的化合物を得る方法などの生化 学的手法、 あるいは、 微生物や細胞に酵素の遺伝子を導入して原料、 中間体ある いは目的化合物、 または合成 ·修飾に用いる酵素を得るなどの遺伝子工学的手法 などを、 単独あるいは組み合わせて用いる方法をあげることができる。 もちろん、 本発明の化合物はその製造法によって限定されるものではなく、 目的化合物が得 られるのならばどのような方法を用いても差し支えない。

しかし、 種々の製造法の中でも天然物、 特に多糖やオリゴ糖など、 を原料や中 間体として用いて製造する方法が最も効率的な方法であり、 好ましい。 さらに、 動物組織、 あるいは、 微生物の培養液から抽出および必要に応じて精製したヒア ルロン酸およびその塩を原料として用い、 ヒアルロン酸を解重合することによつ て得られた分解物を中間体あるいは目的化合物として用いる方法がより好ましレ^ 解重合の方法としては、 例えば、 熱や超音波などを用いる ¼1理的な方法、 酸ゃァ ルカリなどを用いる化学的な方法、 または、 酵素などを用いる生化学的な方法な どを単独、 あるいは、 組み合わせて用いる方法をあげることができる。 それらの 中でも、 反応の特異性、 効率、 あるいは、 安全性などの面から考えて、 酵素を用 いる方法が好ましい。 用いる酵素はヒアルロン酸の解重合反応を触媒する活性を もつものであればよく、 特に限定されず、 それらを目的に応じて単独で、 あるい は、 複数を組み合わせて用いることができる。 用いる酵素を具体的に例示すれば、 動物組織由来の酵素、 例えば、 精巣型のヒアルロニダ一ゼ (EC 3. 2. 1. 35)、 ヒル のヒアルロニダーゼ（EC 3. 2. 1. 36)、 ォコゼ毒液中のヒアルロニダ一ゼ（EC 3. 2. 1 ）3—ダルクロニダーゼ (EC 3. 2. 1, 31)、 ]3 -N-ァセチルへキソサミニダ一ゼ (EC 3. 2. 1. 52)など、 や微生物由来の酵素、 例えば、 Streptomyces hyal lytic us由来のヒアルロニダーゼ (EC 4. 2. 2. 1)、 ヒアルロニダ一ゼ SD (EC 4. 2. 2)、 コンドロイチナ一ゼ ABC (EC 4. 2. 2. 4)、 コンドロイチナ一ゼ AC I (EC 4. 2. 2.

5)、 コンドロイチナーゼ AC Π (EC 4. 2. 2. 5)など、 をあげることができる。 そ の中でも、 安定した品質のものを安定的に供給できるなどの利点から、 微生物由 来の酵素が好ましく、 その中でも Streptomyces hyalurolyticus由来のものが特 に好ましい。

酵素反応はそれぞれの酵素の特性に応じて温度、 pHなどの諸条件を設定して 行えばよいが、 以後の分画 ·精製や修飾を行うにあたって必要になる可能性が高 い脱塩操作を省くために、 実質的に塩を含まない状態、 あるいは、 不揮発性の塩 および有機溶媒不溶の塩を実質的に含まない状態で反応が行われることが好まし レ^ ここでいう実質的に塩を含まない状態とは、 酵素反応後に脱塩操作などをせ ずに以後の分画 ·精製、 あるいは、 修飾操作を容易に実施可能な量を超える量の 塩を含まない状態であることを意味する。 好ましくは反応液中の塩含量は目的化 合物の 10 % (w/w)以下、 より好ましくは l % (w/w)以下である。 本発明でいう反 応液中の塩とは、 イオン強度や pHの調整などのために用いられる緩衝液の成分、 例えば、 酢酸ナトリウム、 リン酸ナトリウム、 クェン酸カリウム、 塩化ナトリウ ム、 塩化カリウム、 塩化カルシウムなどを意味する。 本発明でいう不揮発性の塩 とは、 酢酸アンモニゥムゃ重炭酸アンモニゥムなど、 減圧操作などによって比較 的容易に揮発する揮発性の塩以外の塩を意味する。 揮発性の塩を用いれば、 中間 体や目的化合物の溶液から液成分を減圧などによって除去する操作を行うときに、 同時に塩を除去することが可能となる。 本発明でいう有機溶媒不溶の塩とは、 酢 酸アンモニゥムゃ酢酸ナトリウム、 酢酸カリウム、 酢酸カルシウムなどのように 水にも有機溶媒、 例えば、 エタノール、 メタノール、 プロパノールなどにも溶け る塩以外の塩を意味する。 有機溶媒可溶の塩を用いれば、 有機溶媒可溶の塩が混 在している水には可溶であるが有機溶媒には不溶である中間体や目的化合物を含 む混合物を適切な有機溶媒で洗浄することによって、 混在する塩を容易に分離す ることが可能となる。

得られた分解物は必要に応じて、 常法、 例えば、 抽出、 濃縮、 ろ過、 再結晶、 再沈殿またはクロマトグラフ法などによって分離精製することができる。 その中 でも、 その効率の良さからクロマトグラフ法、 より好ましくはイオン交換クロマ トグラフ法によって分離精製する工程を含むことが好ましく、 担体として陰ィォ ン交換体を用いることがさらに好ましい。 クロマトグラフには回分式、 循環式、 移動床式、 擬似移動床式などの方式があるが、 場合に応じて最適なものを選択す ればよい。 クロマトグラフ法に用いる溶離液は、 用いる方法に応じて最適な組成 のものを用いればよいが、 以後の精製や修飾を行うにあたって必要になる可能性 が高い脱塩操作を省くために、 不揮発性の塩および有機溶媒不溶の塩を実質的に 含まない溶離液を用いることが好ましい。 ここでいう 「不揮発性の塩および有機 溶媒不溶の塩を実質的に含まない溶離液」 とは、 クロマトグラフ後に脱塩操作な どをせずに以後の分画 ·精製、 あるいは、 修飾操作を容易に実施可能な量を超え る量の不揮発性の塩および有機溶媒不溶性の塩を含まない溶離液であることを意 味する。 好ましくは溶離液中の各々の塩含量は 0. 5M以下、 より好ましくは 0. 1 M以下である。 通常、 イオン交換クロマトグラフ法に用いる溶離液はイオン強 度や p Hの調整などのために塩を含む。 塩を含む溶離液を使用する場合、 塩とし て実質上揮発性の塩のみを含む溶離液を用いることが好ましく、 揮発性の塩とし ては、 扱いの容易さ、 安全性、 入手の容易さ、 価格などの点から考えてアンモニ ゥム塩が好ましく、 酢酸アンモニゥムであることがさらに好ましい。 または、 塩 として実質上有機溶媒可溶性の塩のみを含む溶離液を用いることが好ましく、 有 機溶媒可溶性の塩としては、 扱いの容易さ、 安全性、 入手の容易さ、 価格などの 点から考えて酢酸塩が好ましく、 酢酸アンモニゥム、 あるいは、 酢酸ナトリウム であることがさらに好ましい。

得られた中間体は種々の方法、 例えば、 有機化学的手法や生化学的な手法など、 あるいは、 それらの組み合わせによつて精製や修飾などを行って目的化合物とす ることができる。

[本発明の化合物の投与方法、 投与量および剤形]

本発明の化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物または塩の溶媒 和物は、 通常、 全身的または局所的に、 経口的または非経口的に投与される。 投 与量は、 疾患の種類、 症状の程度、 投与対象の年齢や体重などの諸条件をもとに 総合的に判断し、 最適な量を適宜決定するべきであり、 特に限定されない。 しか し、 通常、 成人では 1日当たり経口投与の場合 0. 01〜100mg/kg、 非経口投与の 場合 0. 001〜10mg/kgである。 投与は必要に応じて 1日 1回ないし複数回に分け て行われる。

本発明の化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物または塩の溶媒 和物の投与は、 固体組成物、 液体組成物およびその他の組成物の経口投与、 注射 剤、 外用剤、 坐剤などの非経口投与のいずれの形態であってもよく、 必要に応じ て最適な方法が選択される。 本発明の化合物、 その薬理学的に許容される塩およ び溶媒和物または塩の溶媒和物の少なくともひとつを有効成分として含有する医 薬組成物は、 通常の製剤化に用いられる担体、 賦形剤、 その他の添加剤を用いて 調製することができる。 製剤用の担体ゃ賦形剤としては、 例えば、 乳糖、 ステア リン酸マグネシウム、 デンプン、 タルク、 ゼラチン、 寒天、 ぺクチン、 アラビア ゴム、 ォリーブ油、 ゴマ油、 カカオバタ一、 エチレングリコールなどやその他常 用されるものをあげることができる。

経口投与のための固体組成物としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒 剤などが用いられる。 このような固体組成物においては、 少なくともひとつの活 性物質 （有効成分） が少なくともひとつの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マン 二トール、 ブドウ糖、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶性セルロース、 デ ンプン、 ポリビニルピロリドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合 される。 組成物は、 常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、 例えば、 ス テアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 繊維素ダリコール酸カルシウムのよう な崩壊剤、 グルタミン酸またはァスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいて もよい。 錠剤または丸剤は、 必要によりショ糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピル メチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性または腸溶性物質のフィルムで 被覆してもよいし、 2つ以上の層で被覆してもよい。 さらに、 ゼラチンのような 吸収されうる物質のカプセルも含まれる。

経口投与のための液体組成物は、 薬剤的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤などを含み、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例 えば精製水、 エタノールなどを含んでいてもよい。 この組成物は、 不活性な希釈 剤以外に湿潤剤、 懸濁剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤など を含んでいてもよい。

非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水性の溶液剤、 懸濁 剤、 乳濁剤が含まれる。 水性の溶液剤、 懸濁剤としては、 例えば、 注射用水およ び注射用生理食塩液が含まれる。 非水性の溶液剤、 懸濁剤としては、 例えば、 プ ロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 オリ一ブ油のような植物油、 ェ タノ一ルのようなアルコール類、 ポリソルベート 80 (登録商標） などが含まれる。 このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 （例え ば、 乳糖） 、 溶解補助剤 （例えば、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸） のような補 助剤を含んでいてもよい。 これらは、 例えば、 精密ろ過膜によるろ過滅菌、 高圧 蒸気滅菌のような加熱滅菌、 あるいは、 殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によ つて無菌化することが可能である。 また、 無菌の固体組成物を製造し、 使用前に 無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。

非経口投与のためのその他の医薬組成物としては本発明の化合物の少なくとも ひとつを有効成分として含み、 常法によって処方される外用液剤、 軟膏剤、 塗布 剤、 坐剤、 経皮剤、 点眼剤などが含まれる。

[本発明の高分子およびその製造法]

本発明の高分子とは、 本発明の化合物を側鎖構造として有する高分子化合物の ことであり、 抗血栓性を有する高分子材料として使用できる。 本発明の高分子の 製造に用いる主鎖となるポリマ一は生体適合性ポリマ一であることが好ましく、 例えば、 ポリエチレン、 ポリスチレン、 ポリウレタン、 ポリ塩化ビニル、 ェチレ ン酢酸ビニル、 ポリプロピレン、 ポリカーボネイト、 シリコン、 ポリメチルメタ クリレート、 ポリ四フッ化工チレン、 ポリエチレンテレフタレ一卜、 ポリアミド、 ポリスルホン、 A B S樹脂、 ポリアセタールおよびこれらの誘導体を挙げること ができる。 主鎖と側鎖の間には適当なスぺ一サを入れることもでき、 これによつ て抗血栓性を有する側鎖に柔軟性を付与することができる。 また、 本発明の化合 物を側鎖構造に有する複数の高分子化合物のブロックコポリマーであってもよい。 さらには、 本発明の化合物に加えて、 へパリンなどの血栓形成抑制物質やゥロキ ナ一ゼなどの血栓溶解酵素などの抗血栓作用を有する物質を併せて結合してもよ い。

当然のことながら、 本発明の高分子は製造法によって限定されるものではなく、 目的とするものが得られるのであれば、 どのような方法を用いても差し支えない。 本発明の高分子を得るには種々の方法があり、 それらの方法を単独あるいは組み 合わせて用いることができる。 これらの製造法は当業者に公知である。 例えば、 主鎖となるポリマーのモノマーに本発明の化合物を結合した後、 重合反応を行い 主鎖ポリマーを形成してもよく、 あるいは主鎖ポリマーに本発明の化合物を結合 してもよい。

本発明の化合物はグルクロン酸誘導体やダルコサミン誘導体といった生体成分 の誘導体をその構造中にもつことからもわかるように生体適合性が高く、 生体に 悪影響を及ぼすことが少なく、 仮に高分子より本発明の化合物が脱落したとして も生体に悪影響を及ぼすことが少ない。 [本発明のコーティング剤、 成型物およびその製造法]

本発明はさらに、 本発明の化合物の少なくともひとつを有効成分とするコ一テ ィング剤および本発明の高分子の少なくともひとつを有効成分とするコ一ティン グ剤を提供する。 このようなコ一ティング剤は本発明の化合物または高分子を適 当な溶媒に溶解、 分散し、 人工臓器や医療用具などに塗布、 含浸、 スプレーコ一 ティングなどの方法によりコ一ティングすることができる。

本発明の成型物は、 本発明の化合物あるいは本発明の高分子の少なくともひと つを材料として用いて製造されるものであり、 その使用目的に応じてつくられる。 したがって、 材料のもつ本来の性質を損ねない範囲であれば、 どのような方法に よってつくられても差し支えない。 本発明の成型物を得るには、 化合物や高分子 を別に製造した成型物にコーティングする方法、 化合物を別に製造した成型物と 結合させる方法、 化合物や高分子を含む材料から直接成型する方法など、 種々の 方法があり、 それらの方法を単独あるいは組み合わせて用いることができる。 本発明の成型物は、 優れた抗血栓性を有するため、 人工臓器、 医療用具の部品 あるいはそれ自体として用いることができる。 成型物の形状は用いる材料の性質 にもよるが、 その使用目的に応じて、 フィルム状物、 膜状物、 管状物、 板状物、 網状物、 繊維状物、 布状物などのいずれかの形状にすることができる。

[本発明の人工臓器およびその製造法]

本発明の人工臓器は、 本発明の化合物あるいは本発明の高分子の少なくともひ とつを材料として、 または、 本発明の成型物の少なくともひとつを部品として用 いて製造されるものであり、 その使用目的に応じてつくられる。 また、 このよう にして製造された人工臓器あるいはその他の方法で製造された従来型の人工臓器 に、 さらに本発明のコーティング剤を塗布して製造することもできる。 したがつ て、 材料あるいは部品のもつ本来の性質を損ねない範囲であれば、 どのような方 法によってつくられても差し支えない。

本発明の人工臓器の例としては、 人工血管、 人工心臓、 心臓ペースメ一カー、 人工心臓弁、 人工腎臓、 人工肺、 人工心肺、 人工脬臓、 人工骨、 人工関節、 人工 靭帯などをあげることができる。

[本発明の医療用具およびその製造法]

本発明の医療用具は、 本発明の化合物あるいは本発明の高分子の少なくともひ とつを材料として、 または、 本発明の成型物の少なくともひとつを部品として用 いて製造されるものであり、 その使用目的に応じてつくられる。 したがって、 材 料あるいは部品のもつ本来の性質を損ねない範囲であれば、 どのような方法によ つてつくられても差し支えない。

本発明の医療用具の例としては、 注射筒、 注射針、 透析用留置針、 留置針、 輸 液セット、 輸液 ·血液用フィル夕一、 血液バッグ、 チューブ，カテーテル （栄養 用、 胃 ·食道用、 胆管用、 呼吸器用、 泌尿器用、 血管用、 心臓用、 吸引 ·注入， 排液用など） 、 血液透析器ハウジング、 血液透析器中空糸、 血液透析膜、 体外循 環血液回路、 外シャント、 人工肺膜、 創傷被覆材、 ステントなどをあげることが できる。

[本発明の細胞培養用組成物]

本発明の細胞培養用組成物は従来の細胞培養用組成物に本発明の化合物または 前記化合物の少なくともひとつを側鎖構造として有する高分子を添加して製造す ることができる。 本発明または前記化合物の少なくともひとつを側鎖構造として 有する高分子を添加する細胞培養用培地には、 例えば 199培地、 MEM (ィーグ ルの最小必須培地） 、 BME (イーグルの基本培地） 、 DMEM (ダルベッコ変法 イーグル培地） 、 RPMI1640, Ham's F12培地、 MCDB104, MCDB153を含むが これに限定されない。 本発明の細胞培養用組成物を用いて培養することのできる 細胞には、 魚類細胞、 両生類細胞、 鳥類細胞、 哺乳動物細胞などの脊椎動物の細 胞を含むが、 これに限定されない。 本発明の化合物は顕著な血管内皮細胞増殖促 進作用および血管新生促進作用を有することから、 本発明の細胞培養用組成物は 哺乳動物細胞、 特に血管内皮細胞の培養時に用いて、 試験研究用の培養に利用で きることはもちろんのこと、 細胞成長因子 （例えば、 VEGF) のような有用物質 の生産に用いたり、 火傷の治療用の人工培養皮膚のような治療用組織の製造にも 利用することができる。

[本発明の細胞培養用器材]

本発明の細胞培養用器材は、 本発明の化合物あるいは本発明の高分子の少なく ともひとつを材料として、 または、 本発明の成型物の少なくともひとつを部品と して用いて製造されるものであり、 その使用目的に応じてつくられる。 また、 こ のようにして製造された細胞培養用器材あるいはその他の方法で製造された従来 型の細胞培養用器材に、 さらに本発明のコ一ティング剤を塗布して製造すること もできる。 したがって、 材料あるいは部品のもつ本来の性質を損ねない範囲であ れば、 どのような方法によってつくられても差し支えない。

本発明の細胞培養用器材の例としては、 シャーレ、 フラスコ、 マイクロプレー ト、 ボトルなどをあげることができる。

[本発明の化合物の化合物および高分子の血小板凝集抑制作用、 血小板粘着抑制 作用]

本発明の化合物 （化合物例 1， 2 , 3 , 4 , 6， 8， 1 0 ) の血小板凝集抑制 作用を、 ゥサギ多血小板血漿を用いて、 Born, O'Brienの方法 （Born, G. , V. , R. ： Nature (London) , 194, 924 (1962) . , O'Brien, J. , R.： J. Clin. Pathol. , 15, 556 (196 2) . ) に準じて測定した。 比較対照として抗血小板剤である塩酸チクロビジンにつ いても同様の試験を行った。 その結果、 本発明の化合物はいずれも低濃度で顕著 な血小板凝集抑制作用を示した。 また、 本発明の化合物を側鎖構造として有する高分子化合物 （高分子例 2〜 4 ) の血小板粘着抑制作用を、 ゥサギ多血小板血漿を用いて、 ミクロスフィァカ ラム法 (Kataoka, K. , Maeda, M. , Nishimura, Τ. , Nitadori, Υ. , Tsuruta, Τ. , Ak aike, Τ. , Sakurai, Υ.： J. Biomed. Mater. Res. , 14, 81 7 (1980) . ) により評価した。 その結果、 本発明の高分子は顕著な血小板粘着抑制作用を示した。

さらに、 本発明の化合物をポリエチレンイミン活性化ポリエチレン管と反応さ せて得られる本発明の化合物を固定した成型物の血小板粘着率を測定したところ、 本発明の化合物を固定しない未処理管に比べて血小板粘着が全く検出されず、 優 れた抗血栓性を示すことが明らかとなった。

[本発明の化合物および高分子の血管内皮細胞増殖促進作用]

本発明の化合物の血管内皮細胞増殖促進作用をゥシ大動脈内皮細胞を用いて測 定した。 その結果、 試験に用いた本発明の化合物はいずれも低濃度で優れた増殖 促進作用を示した。 また、 本発明の化合物は、 血管内皮細胞に特異的に作用し、 血管内皮細胞の増殖を促進するサイトカインとして知られる血管内皮細胞成長因 子 （VEGF) と相乗的に作用し、 より優れた血管内皮細胞増殖促進作用を示した。 これは、 本発明の化合物が生体由来の内因性および治療目的で投与あるいは誘導 された外因性の VEGFと相乗的に作用することによって、 より優れた血管内皮 細胞増殖促進作用を発現することを示すものである。

本発明で使用する前記高分子をコ一ティングしたマイクロプレ一トでゥシ大動 脈内皮細胞を培養し、 血管内皮細胞増殖促進作用を測定した。 その結果、 本発明 の高分子 （本発明の成型物） はいずれも優れた増殖促進作用を示した。

[本発明の化合物の血管新生促進作用 ]

本発明の化合物の血管新生促進作用をゥシ大動脈内皮細胞を用いて測定した。 その結果、 本発明の化合物はいずれも優れた血管新生促進作用を示した。 発明の効果

本発明の一般式 （1 ) の化合物およびその薬理学的に許容される塩および溶媒 和物または塩の溶媒和物は、 優れた血小板粘着凝集抑制作用を有し、 この作用に 基づく治療薬、 すなわち、 抗血小板剤として有用である。 具体的には、 血栓症の 進展阻止、 再発防止、 血栓症の危険因子を有する患者の血栓症の二次防止、 健康 人の血栓症の一次防止を目的とした治療に用いることができる。 さらに、 具体的 には、 循環器疾患 （急性心筋梗塞、 不安定狭心症、 慢性安定型狭心症、 陳旧性心 筋梗塞、 心房細動による血栓塞栓症、 汎発性血管内血液凝固症候群 （DIC) 、 冠 動脈バイパス術後のグラフト閉塞、 経皮的冠動脈形成術 （PTCA) 後の冠動脈の 狭窄および閉塞、 人工心臓弁置換術後の血栓性合併症 （血栓栓塞症、 血栓弁） 、 肺血栓，栓塞症、 体外循環血液中の血小板活性化） 、 脳血管障害 （一過性脳虚血 発作 （TIA) 、 脳梗塞） 、 末梢動脈閉塞症 （閉塞性動脈硬化症、 閉塞性血栓血管 炎、 血行再建術後の閉塞） 、 糸球体腎炎， ネフローゼ症候群、 その他の血栓症な ど （本態性血小板症、 血栓性血小板減少性紫斑病 （TPP) 、 溶血性尿毒症症候群、 抗リン脂質抗体症候群、 川崎病、 子癇、 ベーチェット病） の治療および予防に対 して有効である。 また、 本発明はこのような優れた化合物を製造するうえで有用 な製造法を提供するものである。

また、 本発明の一般式 （1 ) の化合物、 特に式 （16) の化合物およびその薬理 学的に許容される塩および溶媒和物または塩の溶媒和物は、 優れた血管内皮細胞 増殖促進作用と優れた血管新生促進作用を有し、 これらの作用に基づく治療薬と して有用である。 具体的には、 血管内皮再生療法あるいは血管新生療法に用いる 治療薬および予防薬 （血管内皮細胞増殖促進剤、 血管新生促進剤） として有用で ある。 さらに具体的には、 循環器疾患 （急性心筋梗塞、 不安定狭心症、 慢性安定 型狭心症、 陳旧性心筋梗塞、 心房細動による血栓塞栓症、 汎発性血管内血液凝固 症候群 （DIC) 、 冠動脈バイパス術後のグラフト閉塞、 経皮的冠動脈形成術 （P TCA) 後の冠動脈の狭窄および閉塞、 人工心臓弁置換術後の血栓性合併症 （血 栓栓塞症、 血栓弁） 、 肺血栓 ·栓塞症、 脳血管障害 （一過性脳虚血発作 （TIA) 、 脳梗塞） 、 末梢動脈閉塞症 （閉塞性動脈硬化症、 閉塞性血栓血管炎、 血行再建術 後の閉塞） 、 糸球体腎炎， ネフローゼ症候群、 その他の血栓症など （本態性血小 板症、 血栓性血小板減少性紫斑病 （TPP) 、 溶血性尿毒症症候群、 抗リン脂質抗 体症候群、 川崎病、 子癇、 ベーチェット病） の治療および予防、 創傷 （褥瘡など を含む慢性皮膚潰瘍、 糖尿病性潰瘍、 火傷、 角膜創傷、 化学療法 ·放射線療法を 受けた癌患者の口腔粘膜炎、 皮膚移植などの各種手術後の創傷、 胃腸組織の損傷 など） の治療に対して有効である。

本発明の化合物および高分子は優れた抗血栓性を有するため、 抗血栓性を必要 とする成型物をつくるための材料あるいはコ一ティング剤として有用である。 本発明の化合物、 高分子および成型物は優れた抗血栓性を有するため、 抗血栓 性を必要とする人工臓器、 医療用具の部品あるいはそれ自体として有用である。 具体的には、 人工血管、 人工心臓、 心臓ペースメーカ一、 人工心臓弁、 人工腎臓、 人工肺、 人工心肺、 人工滕臓、 人工骨、 人工関節、 人工靭帯などの人工臓器、 注 射筒、 注射針、 透析用留置針、 留置針、 輸液セット、 輸液 ·血液用フィルタ一、 血液バッグ、 チューブ ·カテーテル （栄養用、 胃，食道用、 胆管用、 呼吸器用、 泌尿器用、 血管用、 心臓用、 吸引 ·注入，排液用など） 、 血液透析器ハウジング、 血液透析器中空糸、 血液透析膜、 体外循環血液回路、 外シャント、 人工肺膜、 創 傷被覆材、 ステントなどの医療用具の材料や部品として有用である。

さらに、 本発明の化合物およびこれを側鎖構造として有する高分子は優れた血 管内皮細胞増殖促進作用を有し、 血管内皮細胞の被覆を促進するため、 抗血栓性 を必要とする成型物をつくるための材料あるいはコ一ティング剤として有用であ る。 また、 これらの化合物、 高分子および成型物は優れた血管内皮細胞増殖促進 作用を有し、 血管内皮細胞の被覆を促進するため、 抗血栓性を必要とする人工臓 器、 医療用具の部品あるいはそれ自体として有用である。

さらに、 本発明の化合物または前記化合物の少なくともひとつを側鎖構造とし て有する高分子は細胞培養用組成物の成分として有用であり、 本発明の化合物お よびこれを側鎖構造として有する高分子は細胞培養用器材としての利用が期待で きる。 実施例

以下の実施例において、 化合物製造例、 高分子製造例、 成型物製造例、 抗血栓 作用試験および製剤製造例、 をあげて本発明をさら詳しく説明する。 なお、 当然 のことではあるが、 本発明は以下の実施例に記載された物質、 処方および方法に 06 限定されるものではなく、 特許の請求の範囲に含まれるすべての物質、 処方およ び方法を含むものである。

実施例 1 ：化合物製造例 1

4-デォキシ - a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル - (1—3) -Ο-2-ァセ トアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピ ランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- 3 -D-ダルコピラノ —ス [△ HexA β l→3GlcNAc β l→4GlcA β l→3GlcNAc (化合物例 1 ) ] 、 4- デォキシ - a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル - (1→3) -0-2-ァセト アミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコビラ ンゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノシ ル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル - (1—3) -0-2-ァセトアミド - 2 - デォキシ - ;3 -D-ダルコビラノース [△ HexA 3 l→3GlcNAc β l→4GlcA β l→3 GlcNAc β l→4GlcA β l→3GlcNAc (化合物例 2 ) ] 、 4-デォキシ - ひ -L-スレ ォ-へキサ ェンピランゥロノシル -(1→3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0- 2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- 13 -D-ダルコビラノシル - (1—4) -3-0- β -D-グ ルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコ ピラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトァ ミド - 2 -デォキシ - β -D-ダルコピラノ一ス [△ HexA β 1→ 3 GlcNAc β 1→4G IcA β l→3GlcNAc β l→4GlcA β l→3GlcNAc l→4GlcA β l→3GlcNAc (化合 物例 3) ] および 4-デォキシ - a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル- (1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル- (1—3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D -ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァ セトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコ ピランゥロノシル - (1— 3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラ ノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド -

2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノース [△ HexA β 1- 3G1CNAC β l→4GlcA β l→3GlcNAc β l→4GlcA β l→3GlcNAc β l→4GlcA β l→3GlcNAc β l-→4GlcA β l→3GlcNAc (化合物例 4 ) ] の製造

ヒアルロン酸ナトリウム （紀文フードケミファ製；商品名 「ヒアルロン酸 FC H」 ） 30 gを蒸留水 3 Lに溶解し、 40°Cとなるように加温した。 0. 1M水酸化ナ トリゥム水溶液で溶液の pHを 6. 0に調整した後、 Streptomyces hyalurolyticus 由来のヒアルロニダーゼ （天野製薬製；商品名 「ヒアル口ニダーゼ "ァマノ

" 」 ） をヒアルロン酸ナトリウム 1 mgあたり 0. 5濁度減少単位となるように添 加し、 40°Cで 100時間反応を行った。 反応後、 公称分画分子量 10 kの親水性ポリェ 一テルスルフォン製の限外ろ過 （ミリポア製） によって溶液中から酵素を除去し た。 凍結乾燥することによって溶媒を除去し、 分解物 （27. 4 g ) を得た。

分解物を陰イオン交換クロマトグラフ法 （カラム： YMC-Pack IEC-AX， 溶離 液： A;水， B;0. 4M NaCl;リニアグラジェント （30分） ， 検出: UV(232nm) ) によ つて分画し （化合物例 1、 2、 3、 4の順に溶出） 、 化合物例 1〜4を含む画分 を得た。 各画分をゲルろ過法 （担体：セフアデックス G-10, 溶離液：水） によ つて脱塩後、 凍結乾燥して化合物 1〜4 (白色粉末） を得た。 収量は、 それぞれ、 化合物例 1 :1. 7g,化合物例 2 :5. 9g,化合物例 3 :3. 4g,化合物例 4 :2. 2_gであった。 各化合物はナトリゥム塩として得られた。

化合物例 1〜4は下記式 （20) で表される化合物である。 式 （20) において、 nは 1〜4の整数を示し、 nが 1のとき化合物例 1、 2のとき化合物例 2、 3の とき化合物例 3、 4のとき化合物例 4を示す。

下記式 （20)

高速液体クロマトグラフ法 （カラム: TSKgel DEAE-5PW, 溶離液： A;水， B;0. 3M NaCl;リニアグラジェント （20分） ， 検出: UV(232nm)；面積百分率法） によ つて測定した各化合物の純度は 97%以上であった。 化合物例 1〜4の各々のゥロ ン酸含量をダルクロノラクトンを標準品として Bitterと Muirの方法 （Bitter, T. , Muir, H.： Anal. Biochem. , 4, 330 (1962). ) によって、 へキソサミン含量を 3 Ν塩酸中 lOO :で 16時間加水分解後、 ダルコサミン塩酸塩を標準品として Boas の方法 （ただし、 樹脂処理なし； Boas, N. , F,： J. Biol. Chem. , 204, 553 (1953). ) によって分析したところ、 各化合物例の分析値はほぼ理論値通りであった。 実施例 2 ：化合物製造例 2

4-デォキシ- a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル - (1—3) -0-2-ァセ トアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピ ランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノ —ス [△ HexA β l→3GlcNAc β l→4GlcA β 1- 3G1CNAC (化合物例 1 ) ] 、 4- デォキシ - a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル - (1→3)-0-2-ァセト アミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピラ ンゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシ ル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 - デォキシ - )3 -D-ダルコビラノース [△ HexA β l→3GlcNAc β l→4GlcA β 1→3 GlcNAc β l→4GlcA β l→3GlcNAc (化合物例 2 ) ] の製造

ヒアルロン酸ナトリウム （紀文フードケミファ製；商品名 「ヒアルロン酸 FC H」 ） 60gを蒸留水 3 Lに溶解し、 40°Cとなるように加温した。 0. 1M水酸化ナ トリゥム水溶液で溶液の pHを 6.0に調整した後、 Streptomyces hyalurolyticus 由来のヒアルロニダ一ゼ （天野製薬製；商品名 「ヒアル口ニダ一ゼ "ァマノ " 」 ） をヒアルロン酸ナトリウム 1 mgあたり 1濁度減少単位となるように添加 し、 40 で 100時間反応を行った。 反応後、 公称分画分子量 10kの親水性ポリエー テルスルフォン製の限外ろ過 （ミリポア製） によって溶液中から酵素を除去した。 凍結乾燥することによって溶媒を除去し、 分解物 （53.7g) を得た。

分解物を陰イオン交換クロマトグラフ法 （カラム： TSKgel DEAE-5PW, 溶 離液： A;水， B;0.5M酢酸ナトリゥム水溶液;リニアグラジェント （A/B(90/10)→

A/B (60/40) ； 40分） ， 検出: UV(232nm)) によって分画し （化合物例 1、 2の順 に溶出） 、 化合物例 1および 2を含む画分を得た。 各画分から凍結乾燥すること

2フ によつて水を除去した。 凍結乾燥した各画分をェ夕ノ一ルで洗浄して塩を除去し、 再度水に溶解した後に凍結乾燥して化合物例 1 、 2 (白色粉末） を得た。 -収量は、 それぞれ、 化合物例 1 :18. l _g,化合物例 2 :29. であった。 各化合物はナトリウ ム塩として得られた。

高速液体クロマトグラフ法 （カラム: TSKgel Amide-80, 溶離液：ァセトニト リル /水/酢酸/トリェチルァミン (65/35/2/1, v/v)， 流速： 1. OmL/分， 力ラム温度： 80°C , 検出： UV (232nm) ;面積百分率法） によって測定した各化合物の純度は 97 %以上であった。 ゥロン酸含量とへキソサミン含量を実施例 1に示した方法によ つて分析したところ、 値はほぼ理論値通りであった。 実施例 3 ：化合物製造例 3

4-デォキシ - a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル - (1→3) -0-2-ァセ トアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノシル - (1—4) -3-0- β -D-ダルコピ ランゥロノシル - (1→3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラ二 トール [△ HexA β l→3GlcNAc β 1— 4GlcA β 1→3G1CNAC OH (化合物例 5 ) ] 、 4-デォキシ - ひ - L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル - (1→3) -0-2-ァセ トアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノシル - (1— 4) -3-O- j3 -D-ダルコピ ランゥロノシル - (1→3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノ シル - (1→4) -3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル - (1→3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ - β -D-ダルコビラ二トール [△ HexA β l→3GlcNAc β l→4GlcA β 1 →3GlcNAc β l→4GlcA β 1— 3GlcNAc OH (化合物例 6 ) 3 の製造

50mgの化合物例 1を 50mLの 3 mg/mL水素化ホウ素ナトリゥム水溶液に溶 解し、 室温で 1時間処理した。 5 mLの 6 M酢酸を加えて反応を停止し、 50mL のメタノールを加えた後、 エバポレー夕一を用いて乾固した。 さらに、 50mLの メタノールの添加および乾固を 2回繰り返した。 乾固によって残った固形物を 5 mLの水に溶解し、 実施例 1と同様にゲルろ過法によって脱塩後、 凍結乾燥して 化合物例 5 (白色粉末； 44. 7mg) を得た。

同様の方法で化合物例 2を原料として用いて化合物例 6を得た。

化合物例 5および化合物例 6は式 （21 ) で表される化合物である。 式 （21 ) に おいて、 nは 1〜 2の整数を示し、 nが 1のとき化合物 5を、 2のとき化合物 6 を示す。

式 （21 )

化合物 5および 6の純度を実施例 2に示した方法によって測定したところ、 98 %以上であった。 ゥロン酸含量とへキソサミン含量を実施例 1に示した方法によ つて分析したところ、 分析値はほぼ理論値通りであった。 実施例 4 ：化合物製造例 4

4-デォキシ- a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル - (1— 3) -0-2-ァセ トアミド - 2 -デォキシ- /3 -D-ダルコピラノシル - (1→4) -3-0- β -D-ダルコピ ランゥロン酸 [ Δ HexA j3 l→3GlcNAc |3 1— 4GlcA (化合物例 7 ) 3 、 4-デォ キシ- ひ -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル - (1→3) -0-2-ァセトアミ ド - 2 -デォキシ - β -D-ダルコビラノシル - (1→4) -3-0- β -D-ダルコピランゥ ロノシル - (1→3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- 3 -D-ダルコビラノシル- (1→4) -3-0- β -D-ダルコピランゥロン酸 [厶 HexA β l→3GlcNAc β l→4GlcA jS l→3GlcNAc l→4GlcA (化合物例 8 ) の製造

化合物例 1を Reissi らの方法 (Reissig, J. , L. , Strominger, J. L. , Leloir, L. , F.： J. Biol. Chem. , 217, 959 (1953) . ) に準じて pH 9のホウ酸緩衝液中で加熱し た。 反応液中のホウ酸を実施例 3と同様にホウ酸メチルとして除去し、 実施例 1 と同様にゲルろ過法によって脱塩後、 凍結乾燥して化合物例 7 (白色粉末） を得 た。 50mgの化合物例 1を原料としたとき、 43. lmgの化合物例 7を得た。

同様に、 50mgの化合物例 2を原料としたとき、 44. 8mgの化合物例 8 (白色 粉末） を得た。 化合物例 7および化合物 8は式 （22) で表される化合物である。 式 （22) にお いて、 nは 0〜1の整数を示し、 nが 0のとき化合物 7を、 1のとき化合物 8を 示す。

式 (22)

化合物例 7および 8の純度を実施例 2に示した方法によつて測定したところ、 98%以上であった。 ゥロン酸含量とへキソサミン含量を実施例 1に示した方法に よって分析したところ、 分析値はほぼ理論値通りであった。 実施例 5 ：化合物製造例 5

4-デォキシ -ひ - L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセ トアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピ ランゥロニトール [△ HexA i3 l→3GlcNAc /3 l→4GlcA。_H (化合物例 9 ) ] 、 4

-デォキシ- Q; -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセト アミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコビラ ンゥロノシル -(1—3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノシ ル -(1→4)-3-0- i3 -D-ダルコピランゥロニトール [△ HexA 3 l→3GlcNAc j31

→4GlcA /3 l→3GlcNAc 1→4G1CAOH (化合物例 10) ] の製造

化合物例 7を実施例 3と同様の方法で処理して化合物例 9 (白色粉末） を得た

20mgの化合物例 7を原料としたとき、 15.9mgの化合物例 9を得た。

同様に、 20mgの化合物例 8を原料としたとき、 17.8mgの化合物例 10 (白 色粉末） を得た。

化合物例 9および化合物 10は式 （23) で表される化合物である。 式 （23) に おいて、 nは 0〜1の整数を示し、 nが 0のとき化合物 9を、 1のとき化合物 1 0を示す。

式 (23)

化合物 9および 1 0の純度を実施例 2に示した方法によって測定したところ、 98%以上であった。 ゥロン酸含量とへキソサミン含量を実施例 1に示した方法 よって分析したところ、 分析値はほぼ理論値通りであった。 実施例 6 ：高分子化合物製造例

ポリ （N-P-ビニルベンジル- [0-4-デォキシ - ひ -L-スレオ-へキサ -4-ェンピ ランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノ シル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル - (1—3) -0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ - |3 -D-ダルコンアミド] ) (高分子例 1) 、 ポリ （Ν-Ρ-ビニルベン ジル- [0-4-デォキシ - a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル -(1→3)- 0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D- ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダル コピラノシル -(1—4) -3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセト アミ ド - 2 -デォキシ - /3 -D-ダルコンアミド] ) (高分子例 2) 、 ポリ （Ν-Ρ- ビニルベンジル- [0-4-デォキシ - ひ -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシ ル -(1— 3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1— 4)-3 -0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1— 3)-0-2-ァセ卜アミド - 2 -デォキシ - β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0- 2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1—4) -3-0- β -D-グ ルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミ ド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコ ンアミド] ) (高分子例 3 ) およびポリ （N-P-ビニルベンジル- [0-4-デォキ シ- a -L-スレオ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノ シル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ - β -D-ダルコビラノシル -(1— 4)-3-Ο- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキ シ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→ 3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコビラノシル -(1→4)-3-0- β - D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-グ ルコンアミド] ) (高分子例 4) の製造

10 gの化合物例 1を蒸留水 5 mLに溶解し、 メタノール 45mLを加えて混和し た。 その液を 40°Cに加温したヨウ素のメタノール溶液 （17. 1 g/200mL) に加え て 40°Cで 30分間放置した。 4 %水酸化力リゥム /メ夕ノール溶液をヨウ素の色が 消失するまで徐々に添加した。 反応液を氷冷し、 析出した沈殿をろ取した。 沈殿 を冷エタノール、 冷ェ一テルの順で洗浄し、 エタノール/水 （90/10, w/w) から再 結晶することによってカリウム塩を得た。 カリウム塩を蒸留水 50mLに溶解し、 イオン交換樹脂 （アンバーライト IR-12B (H +型） ） を充填したカラムに通液し て凍結乾燥した。 凍結乾燥物にメタノールを加えて減圧濃縮して結晶を得た。 結 晶に少量のメタノ一ルを加えて溶かし、 さらにェタノールを加えて脱水濃縮する という操作を 5回繰り返した後、 減圧乾固してラクトン化した化合物例 1 (7.4 g) を得た。

7gのラクトン化した化合物例 1をメタノール 50mLに溶解し、 P-アミノメチ ルスチレンのメタノール溶液 （2.5g/0.5mL) を加熱還流下で加えた。 120分間 加熱還流した後、 アセトン 200mLを加えて結晶化した。 結晶をメタノールより

2回再結晶させて精製結晶 （N-P-ビニルベンジル- [0-4-デォキシ - a -L-スレ ォ-へキサ -4-ェンピランゥロノシル -(1→3)-0-2-ァセトアミド - 2 -デォキシ- β -D-ダルコピラノシル -(1→4)-3-0- β -D-ダルコピランゥロノシル -(1→3)-0-

2-ァセトアミド - 2 -デォキシ - 0 -D-ダルコンアミド] ; 3.3g) を得た。

2 gの精製結晶を水 2 mLに溶解し、 重合開始剤としてペルォキソ二硫酸力 リウム （0. 2mol %) を添加した。 窒素下で 60°Cにて 24時間加熱して重合反応を 行った。 重合後、 液をメタノール中に注入して、 重合体を析出させた。 メタノ一 ルをデカンテーシヨンで除き、 重合体を分離した。 重合体を水に溶解し、 メタノ ールから析出させる再沈殿法によって重合体を精製して高分子例 1 (1.4g) を得 た。

同様の方法で化合物例 2を原料として用いて高分子例 2を、 化合物例 3を原料 として用いて高分子例 3を、 化合物例 4を原料として用いて高分子例 4を得た。 高分子例 1〜4は下記式 （24) で表される化合物である。 式 （24) において、 nは 1〜4の整数を示し、 nが 1のとき高分子例 1、 2のとき高分子例 2、 3の とき高分子例 3、 4のとき高分子例 4を示す。

光散乱法によつて高分子例 1〜 4の重量平均分子量を測定したところ、 約 4万 であった。

式 (24)

実施例 7 ：成型物製造例

化合物例 1〜4固定ポリエチレン管 （成型物例 1〜4) の製造

Larm b (Larm, 0. , Lasson, R. , Olsson, P.： Biomat. e a. Dev. Art. Org. , 11, 161 (1983).) の方法に準じて製造を行った。 化合物例 1とポリエチレンイミン活 性化ポリエチレン管 （1.8mmID XlOOcmL) を 0.15MNaCl中、 NaB(CN)H ₃ と pH3.5, 50でで 2時間反応させて化合物例 1固定ポリエチレン管 （成型物例 1) を得た。

同様の方法で、 化合物例 2を原料として成型物例 2、 化合物例 3を原料として 成型物例 3、 化合物例 4を原料として成型物例 4を得た。 実施例 8 ：本発明の化合物の血小板凝集抑制作用

ゥサギ大動脈から、 3. 8 %クェン酸ナトリゥム水溶液 1容に対して血液- 9容とな るように採血し、 直ちに遠心分離 （50 X g , 1 0分，室温） して上清として多血小板 血漿 （platelet-rich plasma;PRP) を得た。 PRP1 00 i Lに各濃度の本発明化合 物 1〜7の溶液 10 Lを加えて 37°Cで 1分間保持後、 凝集惹起剤として 10 L の 1 0 g/mLコラーゲン （ゥシ腱コラーゲン；明治薬品製） を加え、 添加後 7 分間凝集曲線を記録した。 血小板凝集能の測定は、 血小板凝集計 （製造：ェム - シー · メディカル） を使用して Born, O'Brienの方法 （Born, G. , V. , R.： Nature (London) , 194, 924 (1962) . , O'Brien, J.， R.： J. Clin. Pathol. , 15, 556 (1962) . ) に 準じて行った。 比較対照として、 代表的な抗血小板剤である塩酸チクロビジンに ついても試験を行った。 結果を表 1に示す。

【 ¹】 表 1

試験化合物 50¾阻害濃度

M)

化合物例 1 2.7

化合物例 2 0.0032

化合物例 3 0.0052

化合物例 4 0.0044

化合物例 6 0.0027

化合物例 8 0.0038

化合物例 10 0.0035

塩酸チクロビジン 427

表 1に示したように、 本発明の化合物は優れた血小板凝集抑制作用を示した。

実施例 9 ：本発明の化合物の急性毒性

本発明化合物の代表例 （化合物例 1一 1 0 ) について、 ラット （体重 300〜400 g， Wistar系， ォス） を用いて急性毒性試験を行ってところ、 LD ₅。は 500mg/k g以上であった。

実施例 1 0 ：本発明の高分子の血小板粘着抑制作用

高分子例 2〜 4の血小板粘着抑制作用をミクロスフィァカラム法 （Kataoka,

K. , Maeda, M. , Nishimura, Τ· , Nitadori, Υ. , Tsuruta, Τ. , Akaike, Τ. , Sakurai, Y.： J. Biomed. Mater. Res. , 14, 817 (1980). ) により評価した。 実施例 8と同様に して得た PRPを 1200G, 7分間， 2回遠心分離によって Dulbecco PBSで洗浄 し、 終濃度 1 X10⁵ platelets/ Lの血小板懸濁液を調製した。 ミクロスフィァ カラム （テフロンカラム （3 IDmm X50mmL) にボリスチレンビーズ （直径 15 Oil m, 20%ジビニルベンゼン架橋， 非多孔質） を封入） に各濃度の高分子水溶 液を注入し、 吸着後蒸留水で充分にリンスした。 このカラムに血小板懸濁液を通 液した （流速 0.5mL/分， 室温） 。 通液後の液中の血小板濃度を測定し、 血小板 粘着率を算出した。 結果を表 2〜4に示す。

【表 2】

表 2 高分子例 2

血小板粘着率

(%) ( )

0 99.7

0.001 90.2

0.00125 63.9

0.0025 28.4

0.005 0

0.01 0

0.02 0

【表 3】

表 3 高分子例 3

血小板粘着率

(%) (%)

0 99.6

0.001 91.5

0.00125 62.9

0.0025 29.0

0.005 0

0.01 0

0.02 0 【表 4】

表 4 高分子例 4

血小板粘着率

(%)

0 99.8

0.001 90.2

0.001 25 60.8

0.0025 27.3

0.005 0

0.01 0

0.02 0

表 2〜 4に示したように、 本発明の化合物は優れた血小板粘着抑制作用を示し た。

実施例 1 1 ：本発明の成型物の抗血栓性

成型物例 2〜4の抗血栓性を評価した。 実施例 1 0と同様の方法で終濃度 1 X 10⁵ platelets/ Lの血小板懸濁液を調製した。 成型物例 2〜 4および未処理の ポリエチレン管 （未処理管） に血小板懸濁液を循環通液した （流速 0. 5mL/分， 1時間， 室温） 。

通過後の液中の血小板数濃度を測定し、 未処理管および成型物例 2〜 4の血小 板粘着率を算出した。 結果を表 5に示す。

【表 5】

表 5

試騃成型物 血小板粘着率

(%)

宋処理管 98.1

成^物例 2 0

成型物例 3 0

成型物例 ⁴ 0

表 5に示したように、 成型物 2〜4は未処理管よりも明らかに血小极粘看率が 低かった。 この結果は、 本発明の成型物が優れた抗血栓性をもつことを示すもの である。

実施例 1 2 ：本発明の化合物の血管内皮細胞増殖促進作用 1 試験には、 細胞としてゥシ大動脈血管内皮細胞 （継代数 3) 、 培地として 10% FCS (ゥシ胎児血清） 、 100 units /mLペニシリン G、 ΙΟΟ i gZmL·ストレ プトマイシンを含む MEMを用いた。 9 6ゥエルのマイクロプレー卜に細胞を 4 xlO³個 ウエル （½10⁴ ！!1 ;100 L) となるように播種し、 既定の終濃度 （0, 0.1, 0.5， 1, 5, 10 n g/mL) となるように式 （1) の化合物 （化合物例 1 〜1 0) (10/2 L；培地に溶解） を添加した。 37°C、 5% CO ₂の条件下で 20時 間培養した後、 化合物の血管内皮細胞増殖に対する作用 （指標として、 5-プロ モデォキシゥリジン （BrdU) の取り込み量を採用） を 「細胞増殖 ELISA, Brd U発色キット」 （ベーリンガー 'マンハイム社製） を用いて測定した。

比較例として、 比較化合物 1および 2についても同様に試験を行った。 比較化 合物は下記の式 （25) で示される化合物である。 式 （25) において、 nは 1また は 2の整数を示し、 1のとき比較化合物 1 (表中、 比較 1) 、 2のとき比較化合 物 2 (表中、 比較 2) を示す。 比較化合物 1および 2は、 実施例 2に準じて調製 した。 ただし、 ヒアルロニダーゼにはゥシ睾丸由来のものを用い、 検出は 206nm にて行った。 化合物の純度は 97%以上であり、 ゥロン酸含量とへキソサミン含量 はほぼ理論値とおりであった。

式 (25)

次の式を用いて、 各化合物の血管内皮細胞増殖促進作用を評価した。

促進率 （％) = (各化合物添加試験の BrdU取り込みの増加量） ÷

(対照試験の BrdU取り込みの増加量） X 1 0 0 得られた結果を表 6に示した,

3フ 【表 6】

(足進率 C%)

化合物 化合物濃度 （ g/mL)

0 0.1 0.5 1 5 10

1 100.0 110.2 149.2 198.2 188.2 146.9

2 100.0 105.2 142.5 188.1 179.2 148.0

3 100.0 107.2 139.9 179.2 175.8 136.6

4 100.0 102.1 / .u Q 177.7 147.4

5 100.0 101.1 144.2 182.7 169.9 141.1

6 100.0 100.5 143.8 167.9 168.8 142.2

7 100.0 104.8 139.7 172.6 170.0 129.7

8 100.0 103.3 140.9 181.1 168.7 141.3

9 100.0 102.8 139.5 180.3 179.3 133.4

10 100.0 101.1 138.8 178.3 170.0 135.8

比較 1 100.0 100.2 98.8 111.7 00.2 101.5

比較 2 100.0 99.5 101.1 107.3 102.0 99.2 表 6に示したように、 化合物例 1〜10はいずれも優れた血管内皮細胞増殖促 進作用を示した。

実施例 13 ：本発明の化合物の血管内皮細胞増殖促進作用 2

血管内皮細胞成長因子 （VEGF) との相互作用を検討するために試験を行った, VEGFにはヒト組換え型のもの （血管内皮細胞成長因子、 ヒト、 組換体、 生化 学用 ：和光純薬製） を用いた。

試験は実施例 12と同様に行ったが、 化合物添加と同時に VEGF (終濃度 10η g/mL) を添加した。 比較試験として、 VEGF単独添加試験 （VEGFのみ添加 の試験） および陰性対照試験 （化合物も VEGFも無添加の試験） も行った。 血 管内皮細胞増殖に対する作用は実施例 1 2と同様に測定した。

次の式を用いて、 各化合物の血管内皮細胞増殖促進作用を評価した。

促進率 （％) = (各化合物添加試験の BrdU取り込みの増加量） ÷

(陰性対照試験の BrdU取り込みの増加量） x l 00 得られた結果を表 7に示した。

【表 7】 表 7

促進率 （％)

化合物 化合物濃度 C / g/mL)

0 0.1 0.5 1 5 10

1 148.5 1 69.8 21 1 .2. 258.3 250.2 206.8

2 148.5 166.2 200.6 249.5 244.0 207.8

5 148.5 160.9 205.0 243.8 231 .1 200.4

6 148.5 159.8 205.2 232.2 224.8 205.7

7 148.5 165.0 206.2 235.9 228.7 191 .3

8 148.5 1 68.7 202.9 251 .2 224.9 199.2

9 148.5 159.8 200.2 245.6 244.2 196.8

10 148.5 165.2 199.9 243.3 228.7 194.0 なお、 表 7において、 化合物濃度 0の欄に示す促進率は、 VEGFを単独添加 した場合の促進率を示す。 本発明の化合物の単独添加試験の結果を示す表 6およ び表 7の結果から、 試験した化合物はいずれも VEGFと相乗的に作用し、 優れ た血管内皮細胞増殖促進作用を示した。 実施例 1 4 ：本発明の化合物の血管新生促進作用 1

氷水浴中で冷却しながら NaHCO ₃不含の 1 0倍濃縮 MEM 1容量に対して再 構成緩衝液 （500mM NaOH, 260mM NaHCO ₃, 200mM HEPES) 1容量を混 和した後、 0. 3«½コラーゲン塩酸溶液 （pH3. 0) 8容量を加えてよく混和し、 コ ラ一ゲン溶液とした。 2 4ゥエルのマイクロプレートにコラーゲン溶液 0. 5mL を分注し、 37で、 30分間保温してゲルを固めた。 コラーゲンゲル上にゥシ大動脈 血管内皮細胞 （継代数 3〜8 ) を 5xl 0⁴個ノウエルで播種し、 37 で約 3時間培 養して細胞を接着させた。 その後、 培地を取り除き、 コラーゲン溶液 0. 5mLを 重層して 37t：、 30分間保温してゲルを固めた後、 各濃度の化合物例 1〜4を含む l m L Zゥエルの 2% FBS-MEM培地を加えて 37°Cで 3日間 CO ₂ィンキュベー 夕一内で培養した。 3日間培養後、 形成された血管様の管腔 （新生血管） を位相 差顕微鏡下、 倍率 1 0 0倍で撮影した。 写真をトレースし、 マイクロコンピュー 夕一^ rメージングデバイス （ニューロサイエンス社製） を用いて画像解析を行い, 単位面積当たりの血管様管腔の長さを測定した。 対照試験として、 化合物を含ま ない培地で培養したものについて同様に血管様管腔の長さを測定した。

次の式を用いて、 各化合物のもつ血管新生促進作用を評価した。

促進率 （％) = { (各試験の管腔長） 一 （対照試験の管腔長） } ÷

(対照試験の管腔長） X 1 0 0 得られた結果を表 8 ：示す。

【表 8】

表 8

促進率 （％)

化合物 化合物濃度 ( ^ g/mL)

0 0.1 0.3 1 3 10

1 00.0 212.1 236.4 350.1 430.3 329.7

2 00.0 181 .8 244.9 334.2 393.9 345.5

3 100.0 212.1 315.2 327.3 351 .5 278.8

4 100.0 224.2 321 .2 369.9 406.1 357.6 表 8に示すように、 化合物 1〜 4はいずれも優れた血管新生促進作用を示した, 実施例 1 5 ：本発明の化合物の血管新生促進作用 2

化合物例 1および 2の血管新生促進作用をラットを用いたディフュージョンチ ヤンバ一法によって評価した。 すなわち、 ディフュージョンチャンバ一 （膜孔径

0. 45 m;ミリポア社製） を組み立て、 各濃度 （0, 10— ⁸, 10_ ⁷, 10— ⁶, 10一⁵

M) の化合物 1および 2の生理食塩液溶液 200 Lを封入した。

Wistar系ラット （ォス ；体重 200-250g) にペントバルビタールを腹腔内投与

( l Omg Z匹） して麻酔した後、 背部を刈毛して希ヨードチンキで消毒した。 筋 肉を傷つけないように皮膚を切開し、 上記の液封入済みディフュージョンチャン バー皮下と筋膜との間に移植した。 切開部を縫合し、 1週間飼育後、 麻酔したラ ットの背部を切開しチャンバ一を露出させ、 血管新生の様子を観察後、 チャンバ 一を筋肉ごと切除してホルマリンで固定した。

結果を表 4に示した。 表中、 十、 土、 一はそれぞれ新生血管誘導が陽性、 擬陽 性、 陰性であくd iったことを示す。

【表 9】 表 9

誘導能

化合物濃度 （M)

1 一 土 + +

2 + + 表に示すように、 化合物例 1および 2はいずれも優れた血管新生促進作用を示 した。 実施例 1 6 ：高分子化合物から製造される成型物の血管内皮細胞増殖促進作用 高分子例 1〜4の 0. 01w/v%水溶液をそれぞれ調製し、 9 6ゥエルのポリスチ レン製マイクロプレートに 0. SmL Zゥエルで分注、 室温で一晚静置後、 液を除 去することによりプレートのコートを行った。 これらのコート済みプレートを用 いて実施例 8と同様にゥシ大動脈由来の血管内皮細胞の培養を行った。 対照試験 として未コートのプレートを用いた培養を行った。 増殖促進作用を実施例 1 2と 同様に測定し、 次の式を用いて各高分子例 （各成型物） の血管内皮細胞増殖促進 作用を評価した。

促進率 （％) = (各試験の BrdU取り込みの増加量） ÷

(対照試験の BrdU取り込みの増加量） X 1 0 0 得られた結果を表 1 0に示した。 【表 1 0】

表 10

コートした (足進率

高 ¾子例 (%)

1 198.1

2 184.9

3 179.8

4 182.4_

宋コー卜 100.0

表 1 0に示したように、 高分子例 1 4はいずれも優れた血管内皮細胞増殖促 進作用を示した。 実施例 1 6 ：製剤製造例

錠剤の製造 1

化合物例 1 10g

ポリエチレンダリコール 6000 10g

ラウリル硫酸ナトリウム 1.5g

3g

乳糖 25g

ステアリン酸マグネシウム 0.5g

上記成分を秤量する。 ポリエチレングリコール 6000を 70〜80°Cに加熱し、 そこ に化合物例 1、 ラウリル硫酸ナトリウム、 トウモロコシデンプンおよび乳糖を混 合した後、 冷却する。 固化した混合物を粉砕器にかけ造粒し、 顆粒を得る。 顆粒 をステアリン酸マグネシウムと混合後、 圧縮打錠して重量 250mgの錠剤とする。

錠剤の製造 2

化合物例 2 30g

乳糖 55g

ジャガイモデンプン 12g

ポリビニルアルコール 1.5g

ステアリン酸マグネシウム 1.5g 上記の成分を秤量する。 化合物例 2、 乳糖、 ジャガイモデンプンを均一に混合 する。 混合物にポリビニルアルコールの水溶液を加え、 湿式顆粒造粒法により顆 粒を調製する。 顆粒を乾燥し、 ステアリン酸マグネシウムを混合後、 圧縮打錠し て重量 200mgの錠剤とする。 カプセル剤の製造

化合物例 3 10 g

乳糖 25 g

5 g

微結晶セルロース 9. 5 g

ステアリン酸マグネシウム 0. 5 g

上記の成分を秤量する。 ステアリン酸マグネシウム以外の 4成分を均一に混合 する。 ステアリン酸マグネシウムを加えた後、 さらに数分間混合する。 混合物を No. 1のハードカプセルに 200mgずつ充填し、 カプセル剤とする。 散剤の製造

化合物例 4 20 g

乳糖 79 g

ステアリン酸マグネシウム l g

上記成分を抨量する。 すべての成分を均一に混合して 20 %散剤とする。 坐剤の製造

化合物例 2 10 g

ポリエチレングリコール 1500 18 g

ポリエチレングリコール 4000 72 g

化合物例 2を乳鉢でよく研磨して微細な粉末とした後、 熔融法によって 1 gの 直腸坐剤とする。 注射剤の製造 化合物例 6 0. lg

塩化ナトリウム 0.9g

水酸化ナトリウム 適量

注射用水 lOOmL

上記成分を抨量する。 3成分を注射用水に溶解、 ろ過滅菌後、 10mLアンプル に 5 mLずつ分注し、 熔封して注射剤とする。

Claims

請求の範囲

1. 下記一般式 （1) で表されるグルクロン酸誘導体およびダルコサミン誘導 体を構造中に有する化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物または 塩の溶媒和物。

式 （1)

[式 （1) 中、 R ¹は保護基または下記式 （2) 〜 （5) を表す。 式 （2) 〜 (5) 中、 R ¹⁽⁵は水素原子、 保護基または下記式 （6) 〜 （8) を表し、 R¹¹は 水素原子または保護基を表す。 ただし、 R ^ieおよび R ¹¹が水素原子または保護 基である場合、 R ¹は COOR ⁴に対してトランス結合あるいはシス結合のどちら であってもよい。

式 （2)

- OR ¹⁰ 式 （3)

NHR 式 （4)

CH 2 R ¹¹ 式 （5)

SR ¹ 式 （6)

式 （7) R^u

R 式 (8)

R

また、 R ¹⁰が式 （6) 〜 （8) である場合、 式 （6) 〜 （8) 中、 R¹³、 R ¹⁷お よび R²' 'を除く R ¹²〜R ²⁸は同一または異なって水素原子または保護基を表し、 R ¹³、 R ¹⁷および R ²⁶はアジド基または下記式 （9) を表す。

式 （9)

- NR ²⁹ R ³⁰

式 （9) 中、 R²³および R³°は、 同一または異なり水素原子または保護基を表 す。

式 （1) 中、 R ²〜！ ⁸は同一または異なって水素原子または保護基を表す。

式 （1) 中、 R⁹は、 水素原子、 保護基または下記式 （10) または下記式 （11) を表す。

式 (10)

式 （11)

式 （10) および （11) 中、 R³¹~R ³⁷は同一または異なって水素原子または保 護基を表す。

式 （1) 中、 nは 0〜25の整数を表す。

(ただし、 nが 0のときは、 R¹は式 （2) 、 R ¹⁽¹は式 （8) で表される基であ り、 R⁹は式 （10) または式 （11) で表される基である。 ）

式 （1) 、 式 （6) 〜 （8) および式 （10) 〜 （11) 中、 保護基は互いに同一ま たは異なり、 置換されていてもよい炭素原子数 1〜8の直鎖または分枝鎖のアル キル、 置換されていてもよい炭素原子数 2〜 8の直鎖または分枝鎖のアルケニル、 置換されていてもよい炭素原子数 1〜 8のァシル、 置換されていてもよい芳香族 ァシル、 または置換されていてもよい芳香族アルキルであり、 また R¹³、 R ¹⁷ および R²⁶を除く R²〜R³⁷の任意の保護基 2つが一緒になつて、 置換されて いてもよい炭素原子数 3〜8のアルキリデン、 置換されていてもよい炭素原子数 3〜8の環状アルキリデン、 置換されていてもよいべンジリデン、 または、 置換 されていてもよいフタロイルを形成してもよい。

また、 _nが 2以上の場合、 R²〜！ ⁸は、 繰り返し単位ごとに同一であっても異 なっていてもよい。 ]

2. n = 0~ 10である請求項 1記載のグルクロン酸誘導体およびグルコサミ ン誘導体を有する化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物または塩 の溶媒和物。

3. R ⁹が前記式 （11) である請求項 2記載のグルクロン酸誘導体およ-びダル コサミン誘導体を有する化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物ま たは塩の溶媒和物。

4. R ¹が前記式 （2) であり、 R ¹⁽¹が前記式 （6) である請求項 3記載のグ ルク口ン酸誘導体およびダルコサミン誘導体を有する化合物、 その薬理学的に許 容される塩および溶媒和物または塩の溶媒和物。

5. R ¹が前記式 （2) であり、 R ^{1 ()}が前記式 （7) である請求項 3記載のグ ルク口ン酸誘導体およびダルコサミン誘導体を有する化合物、 その薬理学的に許 容される塩および溶媒和物または塩の溶媒和物。

6. R ¹が前記式 （2) であり、 R ^{1 ()}が前記式 （8) である請求項 3記載のグ ルク口ン酸誘導体およびダルコサミン誘導体を有する化合物、 その薬理学的に許 容される塩および溶媒和物または塩の溶媒和物。

7. R ¹³が前記式 （9) である請求項 4記載のグルクロン酸誘導体およびダル コサミン誘導体を有する化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物ま たは塩の溶媒和物。

8. R ¹⁷が前記式 （9) である請求項 5記載のグルクロン酸誘導体およびダル コサミン誘導体を有する化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物ま たは塩の溶媒和物。

9. R ²⁶が前記式 （9) である請求項 6記載のグルクロン酸誘導体およびダル コサミン誘導体を有する化合物、 その薬理学的に許容される塩および溶媒和物ま たは塩の溶媒和物。

1 0. ヒアルロン酸またはその塩を解重合する工程を含むことを特徴とする請求 項 1の化合物を製造する方法。

1 1. 解重合のために酵素を用いることを特徴とする請求項 10記載の方法。.

1 2. 酵素が微生物由来であることを特徴とする請求項 11記載の方法。

1 3. 微生物が Streptomyces hyalurolyticusであることを特徴とする請求項 11 記載の方法。

1 4. 解重合を実質上塩を含まない溶液中、 実質上不揮発性の塩を含まない溶液 中、 あるいは、 実質上有機溶媒不溶性の塩を含まない溶液中で行うことを特徴と する請求項 10〜13のいずれかに記載の方法。

1 5. 解重合した物質を陰イオン交換クロマトグラフ法によって分画精製するェ 程を含むことを特徴とする請求項 10〜 14のいずれかに記載の方法。

1 6. 塩として実質上揮発性の塩のみを含む溶離液を用いることを特徴とする請 求項 15記載の方法。

1 7. 塩がアンモニゥム塩であることを特徴とする請求項 16記載の方法。

1 8. アンモニゥム塩が酢酸アンモニゥムであることを特徴とする請求項 17記載 の方法。

1 9. 塩として実質上有機溶媒可溶性の塩のみ含む溶離液を用いることを特徴と する請求項 15記載の方法。

20. 塩が酢酸塩であることを特徴とする請求項 19記載の方法。

2 1. 酢酸塩が酢酸アンモニゥム または酢酸ナトリウムであることを特徴とする 請求項 20記載の方法。

22. 請求項 1記載の化合物の少なくともひとつを有効成分とする医薬組成物。

23. 請求項 1記載の化合物の少なくともひとつを有効成分とする抗血小板剤。

24. 請求項 1記載の化合物の少なくともひとつを有効成分とする血栓症治療薬 および予防薬、 循環器疾患治療薬および予防薬、 脳血管障害治療薬および予防薬、 末梢血管障害治療薬および予防薬から成る群より選択される治療薬および予防薬 として使用される請求項 22記載の医薬組成物。

25. 請求項 1記載の化合物を有効成分とする血管内皮細胞増殖促進剤。

26. 以下の式 （16) の化合物：

を有効成分とする請求項 25記載の血管内皮細胞増殖促進剤。

2 7 . 血管内皮再生療法のための治療薬または予防薬として使用する請求項 25記 載の血管内皮細胞増殖促進剤。

2 8 . 血管新生療法のための治療薬または予防薬として使用する請求項 25記載の 血管内皮細胞増殖促進剤。

2 9 . 請求項 1記載の化合物の少なくともひとつを側鎖構造として有する高分子。

3 0 . 請求項 1記載の化合物、 あるいは、 請求項 29記載の高分子の少なくともひ とつを有効成分とするコ一ティング剤。

3 1 . 請求項 29記載の高分子の少なくともひとつを材料として用いた成型物。

3 2 . 請求項 30記載のコ一ティング剤の少なくともひとつを使用して製造した成 型物。

3 3 . 請求項 31または 32記載の成型物の少なくともひとつを部品として用いた人 ェ臓器。

3 4 . 体外循環型人工臓器、 または、 体内埋込み型人工臓器である請求項 32記載 の人工臓器。

3 5 . 請求項 31または 32記載の成型物の少なくともひとつを部品として用いた医 療用具。

3 6 . 体外用医療用具、 体内と連結する体外用医療用具、 または、 体内埋込み用 医療用具である請求項 35記載の医療用具。

3 7 . 請求項 29記載の高分子を有効成分として含む細胞培養用組成物。

3 8 . 請求項 31載の成型物および Zまたは請求項 30記載のコーティング剤を使用 して製造した細胞培養用器材。