1252737 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、內容、實施方式及圖式簡單說明) (一） 發明所屬之技術領域： 本發明係關於一種改良的醬油釀造方法，其包括將醬油 麴菌混入一種鹽水中以製成醬油醪，將預培養之醬油乳酸 菌及醬油酵母菌添加至醬油醪中，在以一般技術添加之後 進行醬油醪的醱酵及熟化，以及關於一種可確實獲得具有 所需乙醇濃度及乳酸濃度和具有甘醇風味醬油的方法。 (二） 先前技術 傳統的醬油釀造法係包括將蒸過的黃豆與烤過及碾製過 的小麥摻混在一起，並以用於醬油的種子麴菌接種於此混 合物，並且培養這種混合物以製得醬油麹菌，在醬油麴菌 中添加適量的鹽水以獲得一種醬油醪，使醬油醪經過一段 固定時間的醱酵及熟化之後，獲得一種熟化的醬油醪，最 後再將這種熟化的醬油醪予以壓濾。然而，醬油醪的醱酵 和熟化通常是在開放的系統中進行，並且幾乎沒有人工添 加任何微生物，如醬油酵母菌或醬油乳酸菌。因此，所有 在醬油_中作用的微生物（酵母菌和乳酸菌）皆是來自棲息 於釀造地點、設施、裝置等之天然植物所衍生的天然雜質 〇 在本發明中’所謂的，，野生酵母菌，，係指棲息於釀造醬油 之地點、設施、裝置等處’並且自然會在醬油醪中污染和 ~ 6 - 1252737 增殖之酵母菌。 相反地’本發明中所使用的醬油酵母菌很容易藉由已知 的一般方式自醬油醪中收集（分離），並且以能夠產生酒精 且能耐鹽者爲較佳。這種醬油酵母菌純粹是用人工培養， 並且被添加至醬油醪中。因此，這種經過預培養的醬油酵 母菌顯然與野生酵母菌有很大的不同。 天然植物是相當多樣化的，因此，天然污染的醬油酵母 菌及醬油乳酸菌中可能會含有具有不是完全有利用醬油品 質之特性的細菌。此外，由於天然植物因地區或時間的不 同而會有不同組成差異的此項缺點，因於產品的品質會隨 著釀造地點的不同而有所改變，而無法在一整年內獲得具 有一定品質的醬油。 基於這些觀點’爲了能連續製造出具有一定品質之釀造 醬油而無須考慮地區或時間等限制，本發明提出了 一種釀 造醬油的方法。這種釀造醬油的方法包括將醬油麴菌混入 一種鹽水中以製成醬油醪；將預培養之醬油乳酸菌及醬油 酵母菌添加至醬油醪中；然後在一般技術添加之後進行醬 油醪的醱酵及熟化。 說的更明確一點，一種已知的方法，包括將醬油麴菌混 入一種鹽水中以製成醬油醪，將預培養之醬油乳酸菌添加 至醬油醪中，培養這些細菌，在進行乳酸醱酵的時候（通常 爲混合後的20到40天），當醬油醪中之乳酸菌細胞數超過 1 〇7個/每克醬油醪且醬油醪的pH値降低至5 . 1到5 . 2之間 時’加入醬油酵母菌（主要爲 Zygosaccharomyces rouxii 1252737 ’它是主要的醬油醱酵酵母菌），進行乙醇醱酵，因而製得 了具有良好風味的釀造醬油（醬油的科學與技術，由 Shinrokuro TOCHIKURA所編輯及撰寫，日本釀造學會， 1 9 8 8 )(食品微生物學手冊，和井久雄，金子安之及山口和 夫編撰，技報堂出版，1 9 9 5 )。 然而在此方法中，由於使用的不是無菌的麴，並且是在 微生物的開放容器中進行醱酵及熟化，基於複雜的麻煩因 素無法被界定，因此醬油醪的乳酸醱酵及酵母醱酵都很容 易受到野生微生物的污染。因此，很難在相當長的時段內 維持适些被添加微生物得以穩定且平衡的生長，同時又要 能兼顧較佳的醱酵效果。 此外，在純培養的情況下，雖然主要的醬油醱酵酵母菌 種具有高的乙醇生產力或者是能夠形成良好的醬油氣味， 但是當這些菌種被用於真正的釀造製程中時，在許多情況 下並無法達到純培養條件下的相同結果。 因此，近幾年來，有一些硏究企圖能使得添加之醬油酵 母菌和乳酸菌達成平衡且穩定的長期生長。說的更明確一 點，即使在最新的、密封及獨立型混合及醱酵槽中，以及 鄰近的混合及醱酵槽之間控制進醬油醪的醱酵和熟化，並 且在每一次使用之後，就將混合及醱酵槽或是混合及醱酵 的路徑予以淸潔。 然而，因爲不同批次之間的醬油麴菌或醬油醪的品質亦 有所不同，使得pH値會隨著乳酸醱酵作用而呈現不穩定下 降，使得這種方法也有缺點，因此，只能依照專家的經驗 -8- 1252737 和感覺來判斷添加酵母菌的適當時機。 此外’要自淸潔的混合及醱酵槽或混合及醱酵路徑中完 全淸除微生物是有其極限的。因此，當耐鹽性的野生酵母 菌無法被消滅時，會有少數的野生酵母菌殘留並且污染了 醬油醪’並且可能會在添加醬油酵母菌之前就成長成優勢 的一部分，不但會抑制乳酸醱酵，同時也會受到野生酵母 菌的影響而產生不良的氣味。 此外，被添加的酵母菌須先被培養成所需的量並且予以 貯存。有一項缺點是：當酵母菌的添加時間明顯地與預定 時間要早或晚時，可能會導致添加酵母菌不足或是酵母菌 活性降低等結果’因此酵母菌的醱酵作用並不是在添加至 醬油醪之後立即開始的。 (三）發明內容 本發明的目的之一係可靠的獲得具有所需乙醇濃度（例如 3 % ( V / V )或更高）、所需乳酸濃度（例如〇 . 8到1 . 〇 % )、ρ Η値 爲4 . 6到4 . 9之間且具有甘醇風味的醬油，其係藉由一種 醬油的釀造方法來解決上述的缺點，其方法包括將醬油麴 菌混入一種鹽水中以製成醬油醪，將預培養之醬油乳酸菌 及醬油酵母菌添加至醬油醪中，在以一般技術添加之後， 進行醬油醪的醱酵及熟化。 將硏究的重點放在解決上述問題之結果，本發明人發現 :藉由注意醬油醪中耐鹽性野生酵母菌在醱酵初期的細胞 數，並且在醬油醪中添加比野生酵母菌多上1 〇到丨〇〇倍的 醬油酵母活菌，可達到抑制野生酵母菌成長的效果，同時 -9- 1252737 也不會影響乳酸醱酵，只會活化添加之醬油酵母菌的成長 ，並且可達到成功的乙醇醱酵作用。此外，本發明人亦發 現：當醬油酵母菌係在混合之後的1 0天內添加至醬油醪中 ，而使得醬油酵母活菌的細胞數比既存於醬油麴中的野生 酵母菌多1 0倍到1 0 0倍時，僅添加極少量的醬油酵母菌即 足以達成上述的效果。此外，本發明者發現：在此期間， 如果醬油酵母菌的添加量超過2 X 1 0 5個細胞/每克醬油酸 時’共存於醬油醪中的乳酸菌所進行的醱酵作用就會受到 影響’而使得乳酸不會被生成和累積，而導致醬油的風味 不佳。此外，本發明者亦發現；如果醬油酵母菌以2 X 1 〇5 或更少個細胞/每克醬油醪的比率添加，並使得醬油酵母菌 的細胞數比既存於醬油醪中的野生酵母菌多1 〇倍到1 〇〇倍 曰寸’醬油酵母菌所進行的乙醇醱酵可充份進行，而不會抑 制A酸醱酵’並且可以可靠的獲得具有所需乙醇濃度（例如 3%( V/V)或更高）、所需乳酸濃度（例如〇 . 8到〇%)、pH値 爲4 . 6到4 . 9之間且具有甘醇風味的醬油。 本發明已藉由這些發現而得以完成。說的更明確一點， 本發明係關於一種醬油的釀造方法，其包括步驟爲：將醬 油麴菌混入一種鹽水中以製成醬油醪；將預培養之醬油乳 酸菌及醬油酵母菌添加至醬油醪中；在以一般技術添加之 後，進行醬油醪的醱酵及熟化，其中，被添加至醬油醪中 的k油酵母菌爲醬油酵母菌的細胞數比已存在於醬油醪中 之野生酵母菌大上至1〇〇倍。 本發明係一種醬油的釀造方法，包括步驟爲：將醬油麴 -10- 1252737 菌混入一種鹽水中以製成醬油醪；將預培養之醬油乳酸菌 及醬油酵母菌添加至醬油醪中；並且在以一般技術添加之 後，進行醬油醪的醱酵及熟化，其中被添加至醬油醪中的 醬油酵母菌係在混合1 〇天內添加，以醬油酵母菌細胞數比 已存在於醬油醪中之野生酵母菌多上1 0至1 0 0倍之量添加 〇 此外，本發明係一種醬油的釀造方法，包括步驟爲：將 醬油麹菌混入一種鹽水中以製成醬油醪；將預培養之醬油 乳酸菌及醬油酵母菌添加至醬油醪中；並且在以一般技術 添加之後，進行醬油醪的醱酵及熟化，其中被添加至醬油 醪中的醬油酵母菌係在混合1 0天內添加，以醬油酵母菌細 胞數比已存在於醬油醪中之野生酵母菌多上10至100倍之 量添加，並且爲2 X 1 0 5或更少個細胞/每克醬油醪。 本專利申請書包含日本專利申請書第200 1 - 3 8 8 748號中 所揭示之部分或全部內容和/或圖示，該申請書爲本申請案 的優先權文件。 以下將針對本發明做更詳細的描敘。 爲了實現本發明，首先，先將依一般生產醬油麴菌方法 所製備的醬油麴菌依照一般的醬油釀造方法混入鹽水中。 本文中所使用鹽水的用量比醬油麴菌原料的重量多1到 3倍。這裡所使用的食鹽濃度係經調整成適合釀造醬油所 用，使食鹽的濃度爲1 5到2 0 % ( W / V )，又以1 6到1 8 % ( W / V ) 爲更佳。在混合時，將食鹽的濃度調整在上述範圍內是相 S重女的，因爲食鹽、丨辰度低於1 5 %時，可能會使得醬油酸 1252737 在夏季25到35T：的溫度下腐敗。醬油醪的食鹽濃度較低 較利於酵素反應成功的進行，亦有利於醬油乳酸菌和醬油 酵母菌的增生及醱酵作用更爲順利，而使得醬油醪的細胞 溶fe及成熟更爲快速。然而’在食鹽濃度低於1 5 %的情況 下’所謂的腐敗細菌會大量成長’因而產生明顯酸的氣味 和酸敗味，終而使得醬油產品完全失去價値。因爲食鹽濃 度不當所造成的醬油醪腐敗可以藉由設定條件的方式來解 決’ s者如將醬油醪的溫度維持在4 0 °C或更高，或者是藉由 添加酸，例如鹽酸或乳酸的方式將pH値調整成3 . 〇或更低 。然而，這些條件同時也會破壞醬油的原有風味，因而使 得產品失去醬油的價値。當醬油醪的溫度或ρί]値或者是醬 油醪液的氮濃度不適合腐敗細菌的增殖或生存時，即使食 鹽的濃度低，醬油醪也不會腐敗。然而，這些只是特殊情 形，這些不能被視爲釀造醬油的一般方法。除非在夏季食 鹽的濃度爲17%或更高’或者是在春或秋季食鹽的濃度爲 1 5 %或更高，否則無法達到成功的醱酵和熟化作用。除此之 外’在4 0 °C或更高的溫度下水解醬油醪也會導致有不佳氣 味伴隨著醬油的缺點，這就是所謂的“ warm_brew，，（暖釀） 氣味。 接下來’將預先選好或特殊培育之具有良好性質的醬油 乳酸菌及醬油酵母菌（在下文中，有時被簡稱爲，，主要醬油 醱酵酵母菌”）添加至所製成的醬油醪中，除此之外，可依 照傳統釀造醬油的方法來添加醬油乳酸菌，其比率爲1 X丨〇4 個細胞/每克醬油醪到1 X 1 07個細胞/每克醬油醪之間。 - 1 2 - 1252737 在本發明中相當重要的一點是，所添加的醬油酵母菌可 使得醬油酵母菌的細胞數比已存在於醬油醪中之野生酵母 菌多上1 0至1 0 0倍。當此比率低於]0倍時會產生一種危 險’使得共存於醬油醪中的野生酵母菌變爲相對多數，而 具有良好性質且已被添加至醬油醪中的醬油酵母菌種就很 難大重成長’迨是由於其與共存於醬油酸中之野生酵母菌 的競爭之故，因此在競爭性的生長抑制作用之下，這些醬 油酵母菌可能就被消滅或是驅逐了。 相反地’如果添加的比率大於1 0 0倍時，共存的乳酸菌 不能活潑的成長’因此不能獲得具有所需乳酸濃度、適當 Ρ Η値（例如ρ Η値爲4 . 6到4 · 9之間）和甘醇風味的釀造醬 油。 此外’預培養的醬油乳酸菌和醬油酵母菌較好是在混合 後1 〇天以內添加’又以在混合後七天之內添加爲宜。最佳 的添加時間是在混合當時（剛混合之後）到混合後的隔天之 間。這個範圍會較爲適當的原因是因爲它可以大幅節省所 添加醬油酵母菌的用量。 相反地’當醬油酵母菌的添加時間是在混合後的丨丨天或 更晚時’共存在醬油醪中的野生酵母菌數變得更多。在這 @情況下，必需添加較大量的醬油酵母菌。結果造成，當 _母菌的濃度變的愈高時，就抑制了乳酸菌的生長，因此 ’這樣的結果將會造成所獲得的醬油具有低的乳酸含量且 風^未不佳。此外，還有一種危險是：被添加至醬油醪中的 胃 '油酵母菌（具有良好性質的主要醬油醱酵酵母菌）很難活 -13- 1252737 潑的成長’這是由於其與共存於醬油醪中之野生酵母菌的 競爭之故’因此在野生酵母菌的競爭性生長抑制作用之下 ’這些醬油酵母菌可能就被消滅或是驅逐了。也就是說， 因爲醬油酵母菌可能無法有效的增殖，而造成本發明的問 題無法順利被解決的危險。 相當重要的是，所添加醬油酵母菌的用量比率爲2 X 1 05 或更少個細胞/每克醬油醪。當用量的比率爲2 X 1 0 5個細 胞/每克醬油醪或更高時，乳酸菌將無法有效的增値。因此 ’可能無法獲得具有所需乳酸濃度、適當p pj値（例如ρ η値 爲4 . 6到4 . 9之間）和甘醇風味的醬油。 Μ本發明之醬油酵母菌的實例包括釀造醬油用的耐鹽 丨生醬油酵母囷’如：屬於Z y g 〇 s a c c h a r 〇 m y c e s r 〇 u X i i菌種 ’且主要適用於醬油醪之乙醇醱酵作用的主要醬油醱酵酵 母菌’其在6到28%(W/V)的氯化鈉和葡萄糖存在的情況下 ’具：有相當明顯的乙醇醱酵能力；屬於假絲酵母（Candicia) 屬’包括 Candida versatil is 和 Candida etch ellsii 的 耐鹽丨生酵母囷群；或者是T o r u 1 o p s i s屬的耐鹽性酵母菌群 ’其係當醬油主要醱酵酵母菌的乙醇醱酵完全之後才開始 作用’主要係關於醬油一般香氣的產生，有時亦被稱爲後 熟酵母菌群。 在追些酵母菌群中’具有活性乙醇醱酵能力的主要醬油 釀酵酵母囷以可獲得（特別是）具有3 % ( V / V )或更高乙醇濃 度和甘醇風味的爲較佳。 依照本發明人的硏究’主要的醬油醱酵酵母菌不能被視 -14- 1252737 爲共同的，因爲它們會隨著菌種的不同而有所差異。也就 是說，不同菌種的主要醬油醱酵酵母菌在醬油醪中的增殖 能力和乙醇醱酵能力也會有很大的差異。 在開放系統進行醱酵及熟化製程所得的普通醬油醪中， 有無數種野生酵母菌共存於其中，並且會形成主要醬油醱 酵酵母菌株。然而，並非所有的主要醬油醱酵酵母菌種在 醬油醪的乙醇醱酵作用中皆擔任同等重要的角色。也就是 說，只有一小部分的醱酵酵母菌種會對乙醇醱酵發揮重要 的作用。 野生酵母菌種可以含有一些具有不全然對醬油品質有利 之性質的微生物。此外，由於其組成會隨著地區或時間而 異，使得產品的品質會因釀造地點的不同而改變，或者是 無法在整年內皆獲得具有一致品質的醬油。 因此，抑制野生酵母菌的成長以維持添加醬油酵母菌的 活潑成長是非常重要的。 依照上述本發明之酵母菌的添加條件，當醬油酵母菌（特 定主要的醬油醱酵酵母菌種）被添加至醬油醪中時，醬油酵 母菌種會與其它菌種競爭以存活，並且它在競爭後不會被 消滅’因此，醬油酵母菌種可以在培養條件下活躍的成長 ’而這些醬油酵母菌種可與野生酵母菌種共存。 接著’依照一般醬油釀造方法，以適當攪伴的方式來控 制醬油乳酸菌和醬油酵母菌所添加進去的醬油醪。接著， 以一般的技術使醬油醪在維持室溫在1 5到35 t (更佳爲20 到 3 0 °C )的條件下進行醱酵和熟成達到3到8個月，以4 -15- 1252737 到6個月爲佳。 將所獲得之成熟醬油醪予以壓榨、過濾，然後予以精製 ，結果就可獲得具有所需乙醇濃度（例如3 % ( V / V )或更高） 、所需乳酸濃度（例如〇 . 9到1 . 〇% )、適當pH値（pH値爲4 . 6 到4 . 9之間）且具有甘醇風味的醬油。 (四）實施方式 實例 以下將以實施例對本發明做更詳細的解釋。 在以下實施例中所使用的醬油酵母菌是藉由已知的一般 方式就可以由醬油醪中輕易地萃取（分離）出來的酵母菌。 這種酵母菌藉由在鹽濃度爲1 6 . 5 ( W / V ) %之醬油麹中進行酒 精醱酵的方式可以生產和累積3 . 0 ( V / V ) %或更高的酒精。 實施例1 將25%(W/V)的鹽水（30升）與依照一般醬油麹菌製法所製 得之醬油麴菌（2 0公斤）摻混在一起，因而製得醬油醪。將 所製得的醬油醪送入一個混合醱酵的容器中。 上述的程序係在使用加熱的蒸氣來消毒製麴菌的裝置以 及混合和醱酵容器的情況下進行，以儘量避免被野生的微 生物（野生酵母菌、乳酸菌等）所污染。 在醬油醪製備好之後’依照一般釀造醬油的方法，使醬 油醪維持在2 0到2 5 °C的溫度下達5個月，並偶爾予以攪 拌，以進行醱酵和熟化。 另一方面’硏究在上述程序中所獲得之醬油醪中的野生 酵母菌隨時間增加和減少的關係，以瞭解混合後下一天的 -16- 1252737 野生酵母菌的數目。 混合後的隔天，將醬油醪予以攪拌，並且加入醬油酵母 菌（純培養溶液）和醬油乳酸菌（純培養溶液）’以達到表1 中所述的條件。此外’在所有的實驗中加入相同數量的乳 酸菌，使得每克醬油醪中所添加的乳酸菌數爲1 X 1 06。在 測試編號6和9的實驗中’加入了給定數量之由上述醬油 醪中分離出的野生酵母菌培養溶液。在其它測試編號的實 驗中，並未添加野生酵母的培養溶液。收集所獲得成熟的 醬油醪液，然後分析每一種液體的組成。此外，也對每一 組液體進行感官測試。結果列於表1。 如表1所示之活菌數測量係依照“食品微生物學手冊”（ 和井久雄，金子安之及山口和夫編撰，技報堂出版，6 0 3 頁）中所述的方法來進行。 如表1所示的醬油成份分析係依照“醬油的實驗方法”（ 日本醬油檢驗所編輯’ 1 9 8 5年3月1日發彳了）一*書中所述 的方法來進行。 1252737
A 1 c代表乙醇，L a c代表乳酸 “氣味”和“味覺”欄中的符號： 良好，△代表有點差，X代表不良 -- _PH 氣味 味覺 品評 4.77 Δ 〇 酸味 4.85 ◎ ◎ 風味 良好 4.86 ◎ ◎ 風味 良好 4.86 ◎ ◎ 風味 良好 4.88 ◎ ◎ 風味 良好 4,89 ◎ 〇 風味 良好 5.10 〇 Δ 混濁 不淸 5.28 〇 X 殘餘 風味 5,08 〇 Δ 混濁 不淸 ◎代表非常好，〇代表 由表1中的結果可淸楚的得到以下幾點事實： ⑴在添加醬油酵母囷倍率爲5倍的比較實例i之測試結 果中可淸楚的知道’所得之成熟醬油醪具有酸味，而無法 獲得具有芳醇香味的醬油。說的更明確一點，當醬油酵母 菌的添加倍率小於1 〇倍時’在醬油酸中所共同存在的野生 酵母菌就變成相對多數’因此，具有良好性質的醬油酵母 菌就很難存活’在與共存於醬油醪中之野生酵母菌的競爭 ~18~ 1252737 性抑制生長的結果之下’這些醬油酵母菌截就被消滅了。 (2 )在添加醬油酵母菌倍率分別爲2〇〇倍和4〇〇倍的比較 實例2和3之测試結果中可淸楚的知道，乳酸濃度明顯偏 低。因此’無法獲得具有獨特甘醇風味的请油。 (3 )即使在添加醬油酵母菌倍率爲1 Q 〇倍的比較實例4之 測§式結果中仍可淸楚的知道，當每克醬油醪中含有酵母菌 數超過2 X 1 05時，乳酸濃度明顯偏低。結果將無法獲得具 有所需乳酸濃度、適當pH値（例如PH値爲4 . 6到4 . 9之間） 以及甘醇風味的醬油。 (4 )與上述這些結果相反的是’在本發明實例的五項測試 中’其中醬油酵母菌細胞數爲其它的1 〇到丨〇 〇倍，且添加 之醬油酵母菌的比率爲每克醬油醪中含有2 X丨〇5或更少個 細胞數’藉由添加醬油酵母菌可以劇烈的進行乙醇醱酵， 而可獲得具有3.0%(V/V)或更高，或者特別是高達3.5(v/V) 或更高之目標乙醇濃度的醬油。此外，很清楚的是，較好 是以醬油乳酸菌來進行乳酸醱酵，而可獲得具有適當乳酸 含量的醬油，其P Η値爲4 . 8到4 · 9之間。因此，整體而言 ’本發明可以得具有特殊香味及良好風味的醬油。 實施例2 製備8項測試所需的2 0公斤醬油麴菌，每一個皆是依照 一般醬油麴菌製法所製得。將醬油麴菌和2 5 % ( w / ν )的鹽水 (3 0升）分別添加至8個醱酵容器中，然後混合製得醬油醪 。一旦混合之後，將分離自醬油||的醬油乳酸菌以1 X 1 〇6 個細胞/克醬油醪的比例添加進去，並且野生酵母菌的添加 - 1 9 - 1252737 比率爲2 X 1 〇3個細胞/克醬油醪，接著依照傳統釀造 的方法來控制醬油麴，以進行醱酵和熟化。 另一方面’硏究在上述程序中所獲得之醬油醪中的 酵母菌隨時間增加和減少的關係，以瞭解混合後 1 , 3 , 5，7 , 1 〇，1 2和2 0天的野生酵母菌的數目。 接著，除了第1項測試之外，將表2中所述的醬油 菌分別在第丨天添加至第二項測試、第3天添加至第 測試、第5天添加至第四項測試、第7天添加至第五 試第1 0天添加至第六項測試、第1 2天添加至第七項 ，及第20天添加至第八項測試中以進行後醱酵作用。 及醱酵的容器係置於一個溫度爲2 3 °C的溫控室中’然 照傳統釀造醬油的方法使這些醬油醪釀造五個月’以 醱酵和熟化。 收集所製得的醬油醪液，然後施以類似實施例1中 的分析方法及感官品評。結果列於表2。 醬油 野生 的第 酵母 三項 項測 測試 混合 後依 進行 所述 -20- I252737 袠2 _式 欏號 ^—__ 項目 添加之培 養酵母菌 (天） 耐鹽野生酵 母菌(A) 經培養的酵 母菌(B) B/A (倍率） 成份分析 氣味 味覺 品評 Ale Lac pH 1 本發明 〇 2X103 2X 104 10 3.63 0.92 4.85 ◎ ◎ 風味 ----_ 良好 2 本發明 1 2X103 3x 104 15 3.50 0.90 4.88 ◎ ◎ 風味 〜--- 良好 3 本發明 3 5X103 6X 104 12 3.55 0.87 4.88 ◎ ◎ 風味 ----- 良好 4 本發明 5 7X103 8X 104 11 3.60 0.91 4.85 ◎ ◎ 風味 --- 良好 5 本發明 7 8X103 1X105 13 3.67 0.90 4.90 ◎ ◎ 風味 良好 6 本發明 10 1.2X104 1.5X105 13 3.65 0.88 4.90 〇 〇 風味 良好 7 比較實例1 12 2.2X104 3X105 13 3.65 0.15 5.12 〇 Δ 混濁 不淸 8 比較實例2 20 1.3X105 2X106 15 3.63 0.09 5.22 〇 X 殘餘 風味 由表2的結果可得知，醬油酵母菌較好是在混合後1 〇天 以內添加。當醬油酵母菌在混合時添加或者是在混合後七 天內添加時，很明顯地，可獲得具有所需乙醇及乳酸濃度 且具有甘醇風味的醬油。 此外，當醬油酵母菌的添加時間在混合1 〇天之後時，共 存在醬油醪中的野生酵母菌數變得比其它菌數多得多，医! 此無可避免的要添加更大量的醬油酵母菌。由於酵母菌Μ 度的增加會抑制乳酸菌的生長，因此很明顯地的，這樣白勺 結果將會造成所獲得的醬油具有低的乳酸含量且風味；^ ^ 實例3 -21- 1252737 依照類似實施例1的方式來製備醬油醪。在混合之後的 那一天，將醬油醪予以攪拌，然後以丨X丨〇3個細胞/克醬 油酸的比例來添加野生酵母菌，以及以1 X 1〇6個細胞/克 醬油醪的比率來添加乳酸菌。在本發明方法中，當添加野 生酵母菌時，另以1 X 1 0 4個細胞/克醬油醪的比率來添加 良好的培養乳酸菌，使得醬油酵母菌的細胞數比野生酵母 菌數大1 0倍。在對照組的實驗方法中，當醬油醪的p[1値 變爲5 . 2或更低時，以2 X 1 〇5個細胞/克醬油醪的比率來 添加良好的培養乳酸菌。每一組添加皆進行五次。表3所 示爲醬油醪液在混合1 3 5天之後的乳酸含量（w / V% )。此外 醬油醪的溫度與實施例1相同。 表3 乳酸（W / V ) % 實驗編號 對照組 本發明 1 1.00 0.95 2 0.91 0.93 3 0.98 0.96 4 0.72 0.95 5 1.06 0.91 平均値 0.93 0.94 標準値 _ 0.13 0.02 ® ^ 3的結果可淸楚的看出：由於在對照組實驗中的乳 酉妾t胃'變化極大，因此很難獲得具有均勻乳酸含量的醬油 〇 相反地’由於本發明方法中的乳酸含量幾乎相同，因此 可以獲得具有均勻乳酸含量的醬油。 -22- 1252737 本發明效果 依照本發明，添加至醬油醪中的醬油酵母菌的活菌細胞 數比既存於醬油醪中的野生酵母菌多1 0倍到1 〇〇倍，因此 可以成功的進行酵母菌醱酵，而不會影響乳酸醱酵，其同 時可抑制野生酵母囷的成長’並且只會使添加的醬油酵母 菌活潑的成長。 此外’依照本發明，醬油酵母菌係在混合後的1 0天之內 添加至醬油醪中，而使得醬油酵母菌的細胞數比既存於醬 油麹中的野生醱母菌多1 0倍到1 00倍。因此，上述的效果 可藉由添加極少量的醬油酵母菌而由本發明達成。 此外’在此同時’依照本發明，在混合後丨0天內添加至 醬油醪中的醬油酵母菌細胞數比既存於醬油醪中的野生酵 母菌多1 0倍到1 0 0倍’並且相對於醬油麴而言，每克醬油 _中含有2 X 1 05或更少個細胞。因此，醬油酵母菌可充分 的進行乙醇醱酵作用，而不會抑制乳醱酵，所以可以可靠 地製得具有所需乙醇濃度（例如3 % ( V / v )或更高）、所需乳 酸濃度（例如〇 · 8到1 · 〇%)、pH値爲4 . 6到4 . 9之間且具有 甘醇風味的醬油。
Ifc外'’即丨吏医1爲不同批而造成醬油麴菌或醬油醪不同時 ’本發明仍可獲得所需之可靠醬油。 Λ有*在經過混合後不久的幾天內（特別是在混合後的i 〇 X t Θ )添加醬油酵母菌，並且測量已存在醬油醪中之野生 _ m ® % ^目’才能夠決定具有最佳乙醇醱酵能力之醬油 B母：® @ ®當添加量。除此之外，也不需擔心添加醬油酵 -23- 1252737 母菌的時間被延遲，因而可以依照所需規劃來準備醬油酵 母菌的純培養產物的適當數量。 此外，倚賴專家經驗和感覺所做的判斷就變得不需要了 〇 此外，即使因爲受限於無法自淸潔的醱酵槽和醱酵路徑 中完全淸除微生物而無法消滅耐鹽性的野生酵母菌，導致 有少數的野生酵母菌殘留並且污染了醬油醪，但以高於不 要之酵母菌種數倍之固定比率來添加醬油酵母菌可以有效 的抑制野生酵母菌增殖，並且可以只促進醬油酵母菌之活 化增生。 此外，酵母菌的添加量皆維持在不會抑制乳酸醱酵作_ 的範圍內，因此可使得乳酸醱酵得以成功的進行，並且製 得具有適當乳酸含量的醬油。 因此，將本發明應用於一般已知的醬油釀造法中，可以 獲得具有所需乙醇和乳酸濃度且具甘醇風味的醬油，例如 濃口醬油、薄口醬油、白醬油、壺底醬油、再醱酵醬油或 醬油膏。 所有在本文中所述引用的刊物、專利及專利申請書皆全 部倂爲本申請書之參考內容。 圖式簡單說明：無 -24-