TW570803B - Influenza vaccine - Google Patents

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570803 經濟部中央標準局員工消費合作社印黧 A7 B7 五、發明説明（！） 本發明係關於由在培養之動物細胞中繁殖之流行性感冒 病毒所製備的流行性感冒病毒表面抗原疫苗，與其表面抗 原蛋白質的製備方法。 流行性感冒病毒的大小約125毫微米，以核糖核酸爲核 心，並與核蛋白（mucleopr〇tein)結合，外層由具有雙層脂 質結構的病毒外鞘（envelope)所包覆。該外鞘的内層的主 要組成爲基質蛋白（matrix pr〇tein)，而外層則主要含有來 的宿主的脂質成份。 所謂的"表面蛋白"是指出現在病毒表面棘（spike )的神 經胺酸甞酶（neuraminidase ; NA )與血球凝集素（1^11^881扒· inine ; HA) 〇 大部份市面上的去活化的流行性感冒疫苗爲所謂的”分 離疫苗（split vaccines )，，或次單元疫苗。 ’·分離疫苗”的製備是以適當濃度的清潔劑將整個流行性 感冒病毒溶解，接著除去清潔劑與大部份的脂質成份。 預防流行性感冒的·•次單元疫苗’’和’’分離疫苗”不同，它 不含所有的病毒蛋白，相反的，"次單元疫苗”含有較多 在接種時可謗導特定病毒的中和性（保護性）抗體產生的表 面蛋白。 目削市面上大部份的流行性感冒疫苗是由培養在難胚的 流行性感冒病毒所製備而得的。然而，爲所公認；以雞胚 培養產生的流行性感冒病疫苗，具有許多的缺點： 1·由於每個蛋的（微）生物品質不同，此種製備方法是比 較不可靠的。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 sf 570803 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 2. —旦需求增加，如：嚴重的流行病或大流行此種製備 法完全沒有變通性（flexibility )，因爲它的困難在於缺 乏大量可適用的蛋。 3. 此種製備法產生的疫苗對於那些對難或難蛋的蛋白質 會產生過敏的人，是禁忌使用的。 解決以上問題的方法也許可借助組織培養來繁衍流行性 感冒病毒，組織培養的方法具有許多優點： 1·組織培養細胞株可由無（微）生物污染的公認細胞庫系 統中取得，因此可大幅改善批次的一致性（batch_t〇_ batch consistency)，並可獲得高品質的產物。 2·如果發生嚴重流行病或大流行時，較有可能提供足夠 的疫苗。 3.最後得到的流行性感冒病毒成份將更適用於其它的給 藥方式（口服，鼻用，吸入）。 4·從世界衛生組織（WHO )的觀點看來：此項技術將可延 長每年的疫苗組成更改（從二月中至三月中），增加疫 苗與循環中的病毒株的對抗力。 然而，以組織培養的方式取得流行性感冒病也有一項嚴 重的問題，那就是疫苗中可能出現同一宿主細胞株的遺傳 物質。 此問題如果沒有設法補救，則其潛藏的危機可能導致有 關當局基於安全考量拒絕此種流行性感冒疫苗申請上市的 請求。例如，美國食品藥物管理局要求針對人類使用的生 物科技產物每劑量不可含超過100微微克的宿主細胞 •------1T------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5- 570803 經濟部中央標苹局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 ) DNA 〇 因此，本發明提供一種製備流行性感冒疫苗表面抗原的 方法，其中該表面抗原是作爲疫苗使用，此種方法所製備 的疫苗是安全的，並不含無法接受量的有害遣傳物質，且 符合有關當局的要求。然而，在過去想要製備含宿主細胞 DNA低於1〇〇微微克/每劑量的流行性感冒疫苗一直被認 爲是奢望並令人驚I牙的。 所以’本發明係關於一流行性病毒表面抗原疫苗，該疫 苗是由經動物細胞繁殖而得的流行性感冒病毒製備而得 的，而且其中所含的宿主細胞DNA量等於或低於每劑量 25微微克。 在一特定具代表性實例中，本發明提供一種製備表面抗 原蛋白的方法，其中該表面抗原蛋白是用於製備含低量 DNA的流行性感冒疫苗，而這種流行性感冒病毒是由動 物細胞繁殖而得的。本方法含有下列步驟： a·以DNA分解酵素處理得自細胞培養物之含完整病毒之 液體，並且 b.添加陽離子清潔劑。 隨後，分離表面抗原蛋白質。 本發明的方法可應用於不同的流行性感冒病毒疫苗的生 產’典型的病毒包括人類流行性感冒，豬流行性感冒，馬 流行性感冒與禽流感。 本發明的動物細胞培養包括初級細胞，如：雞胚纖維織 母細胞（CEF)或永久細胞株，如馬汀黛比貓腎細胞 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-口 ώψ. 570803 五、發明説明（ (MDCK)中國倉鼠卵細胞（CH〇)與維羅（Ver〇)細胞。 DNA分解酵素分解具完整病毒體之培養液的過程可直接 在發酵槽中進行，最好是在細胞培養與病毒增殖的過程中 進行。 ,適合的DNA分解酵素爲DNA分解酶（DNase)(酵素編號 爲 121與五。3.1.22)與核酸酵素（1111(：16犯6)(酵素編號 爲 ’· EC 3.1.30 與EC 3.1.31)。 根據本發明，適合的陽離子性清潔劑最好爲含有下列化 學式的化合物 RN VR3 Λ x 一 其中 Ri，R2與 R 或及1與112 爲相同或不同，並且爲烷基或芳基， 與其所附接之氮原子結合形成5或6員飽 和雜環， 爲烷基或芳基， 經濟部中央標率局員工消費合作社印繁 或與&與其所附接之氮原子結合形成5或6員雜 環’其中不飽和位置在氮原子上， R4 爲烷基或芳基，且 X 爲陰離子。 陽離子清潔劑的實例包括鯨蠟基三甲基銨鹽，如：鯨蠟 基三甲基銨化溴（C.T.A.B.)，與肉菫蔻基三甲基銨鹽。合 適的β潔劑還包括力玻菲叮（Hp〇fectine)，力玻菲他命 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570803 A7 B7 五、發明説明（5 ) (lipofectamine )，DOTMA 0 這些陽離子清潔劑最好與非離子性清潔劑一起使用， 如：吐溫（Tween)。 凊潔劑處理後的表面抗原蛋白分離步驟可包括： 1 ·利用離心，或超高速離心將RNP顆粒（體）從表面抗原 蛋白中分離，且 2.利用清潔劑與特定樹脂（如：安伯萊特（Amberlite) XAD-4)間的厭水性相互作用，且/或超（透）過濾 (ultra(dia)filtration)將清潔劑從表面抗原蛋白中分離。 很令人驚訝地，本發明方法所得的產物，其中所含的動 物細胞DNA量是非常低的。DNA濃度可低至2 5毫微克/劑 量，並且很容量的可獲得低至10毫微克/劑量。 表面抗原蛋白可再經處理，以供製備流行性感冒疫苗使 用，這些處理包括：添加緩衝液（如：PBS )，且/或與其 它血清型的流行性感冒病毒一起混合。 表面抗原蛋白的濃度最好符合疫苗製備的要求。 實例1 A.病毒的增殖 1·在發酵槽中，將具有抗原型B/亞瑪加塔（Yamagata)之 流行性感冒病毒加入馬汀黛比貓腎（MDCK)細胞 (ATCC CCL34)中，於35。(：下培養2天，令病毒增殖。 2.然後，加入稀釋的氫氧化鈉以調高ρη値至8.0，並加 入班容（Benzon)核分解酶至終濃度爲每公升1〇〇〇單位 (1微克）。 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ιτ 570803 A7 Β7 五、發明説明（6 ) 3. 在35°C下，作用4小時。 B · 病毒的分離 1·以濾孔大小爲0.5微公分的厚濾紙將培養液過濾，去除 細胞破片。 2·接著，使用可阻斷分子量300,000以上通過的過濾膜， 並藉由超高速離心將流行性感冒病毒濃縮及純化。 3·加入曱醛至最終濃度爲〇·〇15% (重量百分比；w/v) 後，再將庶糖加入至終濃度爲30% (w/v)，然後將此混 合物置於2-8°C下攪拌72小時。 4. 接下來以磷酸緩衝食鹽液將濃縮的病毒稀釋五倍，並 置入含有阿美空（Amicon)塞絡芬（Cellufine)硫酸鹽的 親和性管柱中。以磷酸緩衝食鹽液清洗，去除雜質 後，以含有1.5莫耳氣化鈉濃度的磷酸缓衝食鹽液沖提 病毒，以可阻斷分子量30〇5〇〇〇以上的過濾膜，藉由超 而速離心將冲提液濃縮並且脱鹽（desalted )。 C.次單元的分雌 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂· 1·加入非離子性清潔劑吐溫_8〇至終濃度爲3〇〇微克/亳升 與溴化鯨基三甲基氨至終濃度爲750微克/毫升，接著 將此混合物置於4。(：下攪拌3小時後，藉由離心方式， 將RNP顆粒從表面抗原蛋白中分離出。 2·上層液與安伯萊特χΑΙ)·4 一起置於2_8。〇下隔夜攪拌以 去除β潔劑’以過濾方式將安伯菜特去除過濾液，緊 ^接著，以0.22微米的濾膜進行無菌過濾。 經過以上的處理，可使用有效的測試法來分析樣本中的 9- 570803 A7 B7 五、發明説明（7 ) 宿主細胞DNA的含量，該方法是使用32P-標定的貓DNA探 針，進行空位轉潰雜交（slot blot hybridisation )。 經過不同步驟處理後的DNA含量分析結果列於下列表格 中（在表格中，每個IVV劑量的DNA含量以每50微克HA 中含微微克（picogram )作爲代表。 表格 樣本 DNA含量 處理後 培養液48 hpi 19,000,000 A1 核分解酶處理後的培養液 370,000 A2 前過濾後的培養液 10,000 B1 超南速離心後的濃縮液 4350 B2 去活化並經親和性層析的滤液 4200 B4 經吐溫/C.T.A.B.處理與離心後的濾液 <25 C1 去除清潔劑後的濾液 <25 C2 實例2 在實例1中，病毒的增殖，純化，去活化與分解受到影 響。 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在病毒增殖的最後幾小時内（步驟A 2與A 3 )，以班容核 分解酶處理培養液，該核分解酶在增殖培養液的p Η値範 圍下作用（步驟A 1 )，可得到預期DNA去除的類似結果。 雖然核酸分解酶1需要較高的濃度，但是它在去除宿主 細胞DNA (步驟A1_A3 )是一樣有效的。其它的核酸内切酶 (endonuclease )也可得到類似的結果。 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 570803 A7 B7_ 五、發明説明（8 ) 實例3 除了以離心方式來去除細胞破片（步驟B 1 )外，其它的 步驟依照實例1或2。 實例4 除了以持續流動區帶離心機（continuous flow zonal centrifuge)如：Electro-Nucleonics (RK型），與庶糖梯度 如：以璘酸缓衝食鹽液配製，將培養液中的病毒濃縮與純 化（步驟B 2)外，其它的步驟依照實例1，2，或3。 實例5 除了以溴化歸基p比淀，溴化肉苴蔻基氨，氣化二異丁基 苯氧基乙氧基二甲基苯基氨（benzetonium chloride )，氯化 甲基二異丁基苯氧基乙氧基二曱基苯基氨，氣化十甲鑌 (decamethonium chloride )，或硬脂疏基二甲基苯基錄化溴 溶液來取代鯨蠟基三甲基銨化溴溶液，其它的步驟依照實 例1至4。可得到.預期宿主細胞DNA去除的類似結果。 實例6 除了親和性層析後加入蔗糖，共且加入甲酸至〇 〇5% (重量百分率濃度），作用最長爲120小時，其它步驟依照 實例1。 實例7 根據實例1，2，3，4與6的方法已成功的應用於製備 DNA含量低的B/哈賓（Harbin)，B/巴拿馬（Panama)，A/ 德州（Texas H1N1)，A/臺灣（H1N1)，A/約翰尼斯堡 (H3N2)與A/武漢（H3N2)等型的流行性病毒感冒疫苗。 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1. 570803 第087104913號專利申請案 中文_請專利範圍替換本(92年10 ^J) A8 B8 C8 申請專利範園 1. -種流行性感冒病毒表面抗原疫苗，此疫苗是由流行性 感冒病毒㈣物細胞培養物上繁殖製得，其包括 驟： a·以DNA分解酵素處理得自么 、、、 目肩胞培養物的含完整病毒 之液體，且該DNA分解酵夸杨、联△丄從主 肝砰京係選自由酵素編號為E C 3I2UEC 3.K2uDNase與酵素編號為π 3· 1.3 0及EC 3.1.3 1之核酸酵素所組成之群； b.添加陽離子性清潔劑，並士 乎W 具王要係如下通式化合物所 組成： Ra X R4 其中 R!，R2與R3為相同或不同，且各為烷基或芳基， 或心㈣與其所附接之氮原子結合形成…員飽和雜 環，且R3為烷基或芳基， 或κ，r々r3與其所附接之氮原子結合形成5或6員雜 環’且不飽和處在氮原子上， R4為烷基或芳基，且 X為陰離子； c.分離表面抗原蛋白質，其係利用離心或超過滤法將 RNP顆粒（體）自表面抗原蛋白質中分出，接著利用 清潔劑與適當樹脂間的厭水性相互作用，及/或利用 超過濾法，將清潔劑自表面抗原蛋白質中分出； 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公复) A BCD 570803 、申請專利範圍 3. 且其宿主細胞DNA含量等於或低於每劑量2 5微微克。 2.根據申請專利範圍第1項之流行性感冒病毒表面抗原疫 苗，其中宿主細胞DNA含量低於每劑量1 〇微微克。 一種在動物細胞培養物上繁殖流行性感冒病毒來製備表 面抗原蛋白質的方法，其包括下列步驟： a.以DNA分解酵素處理得自細胞培養物的含完整病毒 之液體，且該D N A分解酵素係選自由酵素編號為E c 3.1.21及EC 3.1.22之DNase與酵素編號為ec 3.1.30及EC 3.1.31之核酸酵素所組成之群；b. 添加陽離子性清潔劑，其主要係如下通式化合物所 組成： Ri\ Λ 其中Ri，R2與R3為相同或不同，且各為烷基或芳基，或 RAR2與其所附接之氮料結合形成5或6員飽和雜環， 且R3為烷基或芳、基， ，认’ MR3與其所附接之氮原子結合形成5或6員雜 環’且不飽和處在氮原子上， R4為烷基或芳基，且 X為陰離子； C.L=抗原蛋白質，其係利用離心或超過滤法將 ㈣顆粒(體）自表面抗原蛋白質中分出，接著利用 清潔劑與適當樹脂間的厭水性相互作用，及/或利用 -2 - I紙張尺度適财_^^s) Α4_·χ297公 570803 A8 B8 C8

   超過濾法，將清潔劑自表面抗原蛋白質中分出。 屯根據申請專利範圍第3項之方法，其中dna分解酵素的 處理係於流行性感冒病毒在細胞培養物上繁殖時進行。 5·根據巾請專利範m第3項的方法，丨中陽離子性清潔劑 主要包含鯨蠟基三甲基銨化溴。 6. 根據申請專利範圍第3項的方法，丨中陽離子性清潔劑 中補充了非離子性清潔劑。 7. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中流行性感冒病毒 在動物細胞株上繁殖。 8. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中流行性感冒病毒 在MDCK細胞上繁殖。 -3 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)