TW201010729A - GIP-based mixed agonists for treatment of metabolic disorders and obesity - Google Patents

Description

201010729 六、發明說明： , 【發明所屬之技術領域】 • 本發明係關於呈現⑽活性之天_高血糖素的類 似物。更特定言之，經發現對天然胰高灰糖素序列之修飾 可產生呈現強效、及強效姨高血糖素及/或強 效GUM活性的肽。本發明之狀尤其有利於誘發減重或 預防體重增加，以及治療高血糖，包括糖尿病。 _ 本中請案主張下列中請案之優先權：2008年6月17 曰提出申請之美國臨時專利申請案第61/〇73,274號； 2008年7月3日提出申請之美國臨時專利申請案第 2〇曰提出申請之美國臨時 專利申請案第61/090,448號；及2〇〇9年2月1〇曰提出 申請之美國臨時專利巾請案第61/151，349號。將各申請 案之揭示内容的全體特意地以引用方式併入本文中。 •【先前技術】 胰间血糖素前原（pre_pr〇glucag〇n)係一種在不同組 織中經處理形成許多不同胰高血糖素原（pr〇glucag〇n) 衍生肽的158個胺基酸前體多肽，其包括參與多樣生理 功能（包括葡萄糖體内平衡、胰島素分泌、胃排空 '及腸 道生長、以及食物攝取調節）的胰高血糖素、胰高血糖素 樣肽-1 (GLP-1)、胰高血糖素樣肽_2(GLp_2)及調酸素 201010729 (OXM ; oxyntomodulin)。膜高jk糖素係對應於胰高血 糖素前原之胺基酸33至61的29-胺基酸肽，而GLP-1 係經產生為對應於胰高血糖素前原之胺基酸72至108的 37-胺基酸肽。 當血糖開始下降時，胰高血糖素（一種由胰腺所產生 的激素）會對肝臟發出分解糖原及釋放葡萄糖的信號，導 致血糖值朝向正常值上升。GLP-1具有與胰高血糖素不 同的生物活性。其之作用包括刺激胰島素合成及分泌、抑 制胰高血糖素分泌、及抑制食物攝取。GLP-1經證實可 降低糖尿病患中的高血糖（升高的葡萄糖值）。促胰島素分 泌素-4 (exendin-4)(—種與GLP-1共有約50%胺基酸實 體之來自蜥蜴毒（lizard venom)的肽）使GLP-1受體活化 且同樣經證實可降低糖尿病患中的高血糖。 葡萄糖依賴型促胰島素肽（GIP)係一種在葡萄糖之存 在下刺激自胰腺β細胞分泌胰島素的42-胺基酸胃腸調節 肽。其係藉由蛋白分解處理衍生自133_胺基酸前體， preproGIP ° 【發明内容】

如本文所揭示，提供作為天然胰高血糖素（SEQ ID NO: 1)之類似物且展現GIP活性的胰高血糖素肽。本發 明亦提供使用該等肽之方法。 201010729 天然胰高血糖素不會使GIP受體活化，且通常對 . GLP·1受體具有天然GLP-1之約1%的活性。修飾文中 . 所述之天然胰高血糖素序列產生可展現與天然胰高血糖 素（SEQ ID NO: 1)之活性相當或更佳之強效胰高血糖素 活性、與天然GIP(SEQ ID NO: 4)之活性相當或更佳之 強效GIP活性、及/或與天然GLP-1之活性相當或更佳 之強效GLP-1活性的胰高血糖素肽。GLp_1(7_36)醯胺 〇 (SEQ ID NO: 3)或 GLP-l(7-37)(酸）（SEQ ID NO: 2) 係GLP-1的生物強效形式，其對GLpq受體展現基本上 相等的活性。 文中所述數據顯示同時具有Gip活性及GLP-1活性 之肽尤其有利於誘導減重或預防增重，以及治療高血糖， 包括糖尿病。文中揭示的活體内數據顯示GIp激動劑活 性與GLP-1激動劑活性之組合對減重產生較單獨之 藝 GLP-1大的作用。有鑑於在技藝中需要拮抗Gip來降低 每日食物攝取及體重、及提高姨島素敏感性及能量消耗的 教示，此活性尤其係在意料之外。（Irwin等人， Diabetologia 50: 1 532_154〇 (2〇〇7);及 Ahhage 等 人’ J Biol Chem，於2〇〇8年4月17日電子出版）。 因此，在-態樣中，本發明提供誘導減重或預防增重 之方法，其包括向有需要的病患投與有效量之對Gip受 體及GLP-i受體兩者展現活性，且視情況亦對姨高血糖 201010729 素受體展現活性的化合物（例如，胰高血糖素肽）。此等化 . 合物包括文中所述的GIP/GLP-1共同激動劑及胰高血糖 、 素/GIP/GLP-1三重激動劑。 對GIP受體的增加活性係由在位置1處之胺基酸修 飾所提供。舉例來說，位置1處之His經大的芳族胺基酸， 視情況為Tyr、Phe、Trp、胺基-Phe、硝基-Phe、氯-Phe、 磺酸基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr、或3-胺基Tyr Q 所取代。 對GIP受體的增加活性係藉由使胰高血糖素肽或其 類似物之C-端部分（胺基酸12 — 29)之oc螺旋結構穩定的修 飾所提供。舉例來說，可藉由在位置i與i + 4處，或在位 置j與j + 3之間，或在位置k與k + 7之間之兩胺基酸之側 鏈之間的共價鍵形成分子内架橋。在範例具體例中，架橋 係位在位置12及16、16及20、20及24、24及28、 Q 或1 7及2 〇之間。在其他具體例中，可在位於該等位置 處的帶正電與帶負電胺基酸之間形成諸如鹽橋的非共價 又互作用i者’舉例來說，透過在維持#望活性的位置 處％、引入或夕個α，α_:取代胺基酸而達成胰高血糖 =肽之C·端部分（大約胺基酸12_29)中之以螺旋結構的穩 疋化在些具體例中，胰高企糖素肽或其類似物之位置 16'17'18M9,20^21>24^29t^-^.=. 四或更多個經α „ _抱沙吐1, α，α_一取代胺基酸取代。舉例來說，胰高 201010729 血糖素肽或其類似物之位置16經胺基異丁酸（AIB)取代 提供在不存在鹽橋或内醯胺下的穩定化α螺旋。此等肽在 此被視為係缺少分子内架橋的肽。在特定態樣中，α螺旋 的穩定化係藉由引入一或多個α，α_二取代胺基酸，但不 引入共價分子内架橋（例如，内醯胺橋、二硫化物橋）而達 成。此專狀在此被視為係缺少共價分子内架橋的狀。在一 些具體例中，位置16、20、21或24中之一、二、三或 更多個經ΑΙΒ取代。 對GIP受體的增加活性係藉由在位置27及/或 28 ’及視情況在位置29處之胺基酸修飾所提供。舉例來 說’在位置27處之Met經大的脂族胺基酸（視情況為Leu) 取代’在位置28處之Asn經小的脂族胺基酸（視情況為 Ala)取代，及在位置29處之Thr經小的脂族胺基酸（視 情況為Gly)取代。 對GIP受體的增加活性亦藉由在位置i 2處之胺基酸 修飾所提供。舉例來說’位置12經大的脂族非極性胺基 酸（視情況為11 e)取代。 對GIP受體的增加活性亦藉由在位置17及/或18 處之胺基酸修飾所提供。舉例來說，位置17經極性殘基 (視情況為Gin)取代，及位置is經小的脂族胺基酸（視情 況為Ala)取代。 對胰高血糖素受體的增加活性係藉由在如文中所述 201010729 之天然胰高企糖素（SEQ ID NO: 1)之位置16處的胺基 . 酸修飾來提供。 對胰高灰糖素受體的減低、維持、或增加活性係（例 如）藉由在如文中所述之位置3處的胺基酸修飾來提供。 已藉由在位置1及/或2處之胺基酸修飾降低之胰高 血糖素活性的回復係藉由使胰高血糖素肽或其類似物之 C-端部分（胺基酸12-29)之ct螺旋結構穩定的修飾來提 ❹ 供。舉例來說’可藉由在位置i與i + 4處或在位置j與j + 3 之間，或在位置k與k + 7之間之兩胺基酸之侧鏈之間的 共價鍵形成分子内架橋。在其他具體例中，可在位於該等 位置處的帶正電與帶負電胺基酸之間形成諸如鹽橋的非 共^貝交互作用。在又其他的具體例中’將一或多個α，α _ 二取代胺基酸在維持期望活性的位置處插入或取代入此 C-端部分（胺基酸12-29)中。舉例來說，位置16、2〇、 ❹ 21或24中之一、二、三個或全部經α，α_二取代胺基酸（例 如，ΑΙΒ)取代。 對GLP-1受體的增加活性係藉由以電荷中性基團 (諸如醯胺或酯）取代C-端胺基酸之羧酸來提供。 對GLP-1受體的增加活性係藉由使胰高血糖素肽或 其類似物之C-端部分（大約胺基酸12_29)2α螺旋結構穩 定的修飾來提供。在一些具體例中，可藉由在位置i與i + 4 處或在位置j與j + 3之間，或在位置k與k + 7之間之兩胺 201010729 基酸之側鏈之間的共價鍵形成分子内架橋。在其他具體例 . 中，可在位於该等位置處的帶正電與帶負電胺基酸之間形 成諸如鹽橋的非共價交互作用。在又其他的具體例中，將 一或多個α，α-二取代胺基酸在維持期望活性的位置處插 入或取代入此C-端部分（胺基酸12-29)中。舉例來說， 位置16、20、21或24中之一、二、三個或全部經α，α_ 二取代胺基酸（例如，AIΒ)取代。 ❹ 對GLP -1受體的增加活性係藉由在如文中所述之位 置20處的胺基酸修飾來提供。 對GLP_1受體的增加活性係藉由將c_端延伸肽諸如

GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96)加成至c-端來提供。該等類似物中之 GLP-1活性可藉由如文中所述修飾位置18、28或29， 或位置18及29處之胺基酸而進一步提高。 ❷ GLP-1效力之進一步的適度增加係藉由將位置1〇處 之胺基酸修飾為大的芳族胺基酸殘基（視情況為Trp)來 提供。 對GLP -1受體之減低活性係（例如）如文中所述，藉 由在位置7處之胺基酸修飾、除去在位置27或28處之 胺基酸C-端的胺基酸、產生27-或28-胺基酸肽、或其組 合來提供。 於聚乙二醇化後之活性的維持係藉由將 201010729 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)加成至 C_端來提供。 如文中所展示，對各胰高血糖素受體、glp-i受體、 及GIP受體之維持或增加活性（相較於含内酿胺、GIP活 性、基於姨高血糖素之類似物）係藉由以下方式來提供： (i)以式IV之胺基酸對位置16處之Ser作胺基酸取代： Η

Η2Ν-C——COOH (CH2)n

[式 IV]， 其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或 2至6、或2或3或4或5，！^及尺2各係獨立地選自由 以下基團組成之群：H'CVCu烷基、（CVCu烷基）ΟΗ、 (C「C18 烷基）NH2、（CVCu 烷基）SH、（C〇-C4 烷基） (C3-C6)環烷基、（C〇-C4 烷基）（C2-C5 雜環基）、（C〇-C4 © 烷基）（c6-c10芳基）R7 '及（CVC4烷基）（c3-c9雜芳基）， 其中R7係Η或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺 基，及（ii)位置20處之Gin經α，α-二取代胺基酸（例如， ΑΙΒ)作胺基酸取代。在一些具體例中，位置16處之胺基 酸係Lys及位置20處之胺基酸係ΑΙΒ。 在位置16處包含式IV之胺基酸及在位置20處包含 α，α-二取代胺基酸之類似物對各胰高血糖素受體、 201010729 GLP-i受體、及GIP受體之活性可藉由延長肽之長度（例 * 如’藉由將長度（例如）約丨·21、約9至21、約6-18、約 9-12、或約1〇或n個胺基酸融合至〇_端延伸肽）而進 一步提高。在一些具體例中，C-端係藉由融合至 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)^ XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96)而延長’其中χ係Gly或小的脂族或 非極性或輕度極性胺基酸。在替代具體例中，c_端係藉 ❹ 由融合至GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)而延長，且 將1-1 1個胺基酸（例如，1_5、或1、2、3、4、5、0、7、 8、9、10、11 個胺基酸）融合至 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)之 C-端。位在 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95) 之C -端的1 -1 1個胺基酸可包含，例如，一或多個小的脂 族胺基酸’諸如Ala或Gly。在此方面，C-端延伸可為， 例如，GPSSGAPPPSXm，其中m係i至n(例如，1至 ❹ 5)及X係Ala或Gly。或者，融合至SEQIDNO:95之 C-端的1-1 1(例如’ 1至5)個胺基酸可為不同小脂族胺基 酸之組合。舉例來說，1-1 1(例如，1至5)個胺基酸可為 A1 a及G1 y殘基之組合。 GIP活性、基於騰面血糖素之類似物（包括含有位於 位置16處之式IV胺基酸及位於位置20處之α，α_二取代 胺基酸之類似物）對各胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體 之活性的提高可進一步在位於C -端延伸内或C -端胺基酸 • 11 - 201010729 (例如，加成至c-端延伸之c-端的胺基酸）處之胺基酸的 ， 醯化或烷化後達成。醯化或烷化可係位在，例如，位置 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49' 及 50 之任一者處 的胺基酸。在一些具體例中’經醯化或烷化的胺基酸係位 在位置37、38、39、40、41、42、或43處。在一些具 體例中，經醯化或烷化的胺基酸係連接至醯基或烷基（例 ❹ 如，C10-C22)的Lys。在某些具體例中’ Lys係位在由 SEQ ID NO: 95之胺基酸序列所組成之C-端延伸的C· 端，以致Lys係位在類似物的位置40處。視情況，經酿 化的C-端延伸肽亦經聚乙二醇化，例如，在位置24處。 此外，GIP活性、基於跋高血糖素之類似物對各騰高 血糖素、GLP-1、及GIP受體之活性的提高可藉由透過 間隔物（例如，胺基酸、二肽、三狀、親水性雙官能間隔 ❹ 物、疏水性雙官能間隔物）將胺基酸醯化或烷化而達成。 在一些具體例中，GIP活性、基於胰高血糖素之類似物包 含透過一間隔物的醯基或烷基’該間隔物係連接至類似物 之位置10或位置40處之胺基酸的侧鏈。在其他具體例 中’類似物包含在位置29處之胺基酸C -端之1至21個 胺基酸的C _端延伸及間隔物，該間隔物係共價連接至醯 基或烧基，在對應於相對於SEQ ID NO: 1之位置3 7-43 之一者的位置處連接至該延伸之一胺基酸。在某些具體例 -12- 201010729

中，間隔物之長度為3至10個原子。在特定態樣中，門 隔物及醯基或烷基之總長度為約14至約28個原子長B 度。用於提高對胰高血糖素、GLP-1、及GIp受體中之 一或多者之活性的適當間隔物將進一步說明於文中。 上文所述之提高或減低GIP活性、提高或減低姨高 血糖素受體活性、及提高或減低GLP」受體活性的任何 修飾可個別或組合地應用。上文所述之任何修飾亦可與職 ❹ 丨其他期望性質（諸如提高溶解度及/或穩定性及/或作 用期間）的其他修飾組合。或者，上文所述之任何修都可 與不會實質影響溶解度或穩定性或活性的其他修飾組 合。範例性的修飾包括，但不限於： (A)改良溶解度，例如，經由引入一、二、二戋更多 個帶電胺基酸至天然騰高血糖素之端部分，較佳係於 位置27之C_端的位置處。此一帶電胺基酸可經由（例如） ❹ 於位置28或29處以帶電胺基酸取代天然胺基酸，或者 !由（例如）於位置27、28或29之後加成帶電胺基酸而 引入。在範例具體例中，帶電胺基酸中之一、二、三個或 全部係帶負電。在其他具體射，帶電胺基酸中之一、二、 二値或全部係帶正電。此等修飾使溶解度提高，例如，當 在25t下於24小時後量測時，在約5.5與8間之給定 ΡΗ(>]如’PH 7)下相對於天然胰高血糖素提供至少2倍、 ^ 1〇倍、15倍、25倍、30倍或以上的溶解度。 -13- 201010729 ()藉由如文中所述，例如，於狀的位置i6、i7、 . 24或29處、於c_端延伸内、或於c-端胺基酸 冑力成親水&部分諸如聚乙二醇鏈，而提高溶解度及作用 期間或循環半衰期。 (C)藉由如文中所述將胰高血糖素肽醯化或烷化而提 间/合解度及/或作用期間或循環半衰期及/或延遲作用 之開始。 ® (D)透過經由如文中所述修飾位置1或2處之胺基酸 引入對二肽基肽酶IV(Dppiv)分裂之抗性而提高作用期 間或循環半衰期。 (E)藉由修飾位置15處之Asp，例如，經由刪除或 以麩胺酸、升麵胺酸、半胱胺磺酸或升半胱胺磺酸取代， 而提高穩定性。此等修飾可在5.5至8範圍内之pH下降 低降解或分裂’例如，於25 t下在24小時後保有至少 ❹ 75%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%、 至多1 0 0 〇/〇的原始肽。此等修飾降低在A s p 1 5 · S e r 1 6間 之狀鍵的分裂。 (F )藉由修飾位置1 6處之S e r，例如經由以τ h r或 AIB取代’而提高穩定性。此等修飾亦可降低在 Aspl5-Serl6間之肽鍵的分裂。 (G)藉由修飾在位置27處之曱硫胺酸，例如，經由 以白胺酸或正白胺酸取代，而提高穩定性。此等修飾可降 201010729 低氧化性降解。亦可經由修飾位置2〇或24處之Gin， • 例如，經由以Ala、Ser、Thr、或AIB取代，而提高穩 定性。此等修飾可降低透過Gin之脫醯胺作用所發生的 降解。可藉由修飾在位置21處之Asp，例如，經由以 Glu取代，而提高穩定性。此等修飾可降低透過Asp之 脫水形成環狀琥珀醯亞胺中間體隨後再異構化成異天冬 胺酸酯所發生的降解。 0 (H)不會實質影響活性的非保留性或保留性取代、加 成或刪除，例如，在位置2、5、9、1 0、1 1、1 2、1 3、 14、15、16、17' 18、19、20、21、24'27'28 或 29 中之一或多處的保留性取代；以Ala取代一或多個此等位 置；刪除位置27、28或29中之一或多處的胺基酸；或 刪除胺基酸2 9視情況並結合以C -端醯胺或酯替代C -端 羧酸基；以Arg取代位置12處之Lys ;以Val或Phe 取代位置10處之Tyr ; ❹ 在一些具體例中’文中所述之胰高血糖素肽呈現約 ΙΟΟηΜ 或以下’或約 75、50、25、10、8、6、5、4、3、 2或1 nM或以下之對GIP受體活化活性的EC50。在一 些具體例中’文中所述之胰高血糖素肽呈現約0.001 nM、0.01 nM、或 0.1 nM 之對 GIP 受體的 EC50。在 一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽呈現不多於約1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、5 nM、6 nM、8 nM、1 0 nM、 -15· 201010729 15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、40 ιιΜ、50 、75 nM、或100 nM之對GIP受體的EC50。在一些具體例 中，胰高血糖素肽呈現約ΙΟΟηΜ或以下，或約75、50、 25、10、8、6、5、4、3、2或InM或以下之詞"騰高血 糖素受體活化的EC50。在一些具體例中，文中所述之胰 高血糖素肽呈現約0.001 nM、0.01 nM、或〇.1 nM之 對胰高jk糖素受體的EC50。在一些具體例中’對胰高血 ❹ 糖素受體之EC50係不多於約1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、 5 nM、6 nM、8 nM、1 0 nM、1 5 nM、20 nM、25 nM、 30 nM、40 nM、50 nM、75 nM、或 100 nM ° 在一些 具體例中，胰高血糖素肽呈現約l〇〇nM或以下，或約 75、50、25、10、8、6、5、4、3、2 或 InM 或以下之 對GLP-1受體活化的EC50。在一些具體例中，文中所 述之姨高血糖素肽呈現約0,001 nM、0.01 nM、或0.1 nM .之對GLP-1受體的EC50。在一些具體例中，對GLP-1 受體之EC50係不多於約1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、 5 nM、6 nM、8 nM、1 0 nM、1 5 nM、20 nM、25 nM、 30 nM、40 nM、50 nM、75 nM、或 100 nM。受體活 化可藉由測量過度表現受體之HEK293細胞中之cAMP 誘發的活體外檢定法測量，例如，如實施例16中所述之 檢定經共轉染編碼受體之DNA及鍵聯至c AMP反應元件 之勞光素酵素基因的HEK293細胞。 -16· 201010729 在一些具體例中，胰高血糖素肽對GIP受體呈現相 . 對於天然 GIP 至少約 0.1%、0.2%、0.3 %、0.4%、0.5%、 0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、5%、10%、20%、 30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、 175%或200%或更高的活性（GIP效力）。在一些具體例 中’文中所述之胰高血糖素肽對GIP受體呈現相對於天 然 GIP 不多於 1000〇/〇、10,000〇/〇、100,000〇/〇、或 φ 1，0 0 0，〇 〇 〇 %的活性。在一些具體例中，胰高血糖素肽對 胰高血糖素受體呈現相對於天然胰高血糖素至少約1〇/〇、 5〇/〇、10%、20%、3 0%、40%、5 0%、60%、75%、100%、 125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、 400%、45 0%、或500%或更高的活性（胰高血糖素效 力）。在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽對胰高 血糖素受體呈現相對於天然胰高血糖素不多於1000%、 10,000%、100,000%、或 1,000,000% 的活性。在一 4b Ο 具體例中’胰高血糖素肽對GLP-1受體呈現相對於天然 GLP-1 至少約 0.1 〇/〇、〇.2%、0.3 %、0.4%、0.5%、0.6%、 0.7%、0.8%、0.9%、1 %、5%、1 0%、20%、3 0%、40%、 5 0%、60%、75%、100%、125%、150%、175% 或 200% 或更高的活性（GLP-1效力）。在一些具體例中，文中所述 之胰高血糖素肽對GLP-1受體呈現相對於天然GLP-1不 多於 1 0 0 0 0/〇、1 〇，〇 〇 〇 〇/〇、1 〇 〇, 〇 〇 〇 〇/0、或 1，0 0 0，〇 〇 〇 〇/〇 的 -17- 201010729 活性。胰高血糖素肽對受體相對於受體之天然配體之活性 • 係以姨高血糖素肽相對於天然配體之EC50的反比計算。 因此，本發明之一態樣提供對姨高血糖素受體及GI p 受體兩者呈現活性的胰高血糖素肽（「胰高血糖素/ Gip 共同激動劑」）。此等狹高金糖素肽失去天然姨高血糖素 對胰高血糖素受體相較於對GIP受體的選擇性。在一些 具體例中’胰高糖素肽對GIP受體之EC50與其對胰 〇 高血糖素受體之EC50的差（較高或較低）係低於約50 倍、40倍、30倍或20倍。在一些具體例中，胰高血糖 素肽之GIP效力與其之姨高血糖素效力的差（較高或較低） 係低於約 500、450、400、350、300、250、200、150、 100'75、50、25、20、15、10、或 5 倍。在一些具體 例中，胰高血糖素肽對GIP受體之EC 50除以胰高血糖 素肽對騰高血糖素受體之E C 5 0的比係低於約1 〇 〇、7 5、 60、50、40、30、20、15、10、或 5。在一些具體例中， 對GIP受體之EC50除以對胰高血糖素受體之EC50的 比係約1或低於約1(例如，約〇.〇1、0.013、0.0167、 0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些 具體例中’胰高血糖素肽之GIP效力相較於胰高血糖素 肽之胰高血糖素效力的比係低於約500、450、400、350、 300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、 20、15、10、或5。在一些具體例中，對GIP受體之效 201010729 力除以對胰高血糖素受體之效力的比係約1或低於約 - 1 (例如，約 0.01、0.013、0,0167、0.02、0.025、0.03、 〇·〇5、0.067、0.1、0.2)。在一些具體例中，GLP-1 活 性已，例如，藉由在位置7處之胺基酸修飾、刪除在位置 27或28處之胺基酸C-端的胺基酸、產生27-或28-胺基 酸肽、或其組合’而顯著地降低或經破壞。 本發明之另一態樣提供對騰高血糖素、GIP及GLP-1 φ 受體呈現活性的胰高血糖素肽（「胰高血糖素/GIP/ GLP_ 1二重激動劑」）。此等膜高血糖素狀已失去天然姨 高血糖素對胰高血糖素受體相較於對GLP-1及GIP受體 兩者的選擇性。在一些具體例中，胰高血糖素肽對Gip 受體之EC50與其對胰高血糖素及GLP-1受體之各別 E C 5 0的差（較高或較低）係低於約5 〇倍、4 0倍、3 0倍或 20倍。在一些具體例中，胰高血糖素肽之GIp效力與其 ❹ 之胰高血糖素及GLP-1效力的差（較高或較低）係低於約 500、450、400、350、300、250、200、150、1〇〇、 75、50、25、20、15、10、或5倍。在一些具體例中， 三重激動劑對GIP受體之EC50除以三重激動劑對 GLP-1受體之EC50的比係低於約100、75、60、50、 40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對gip 受體之EC50除以對GLP-1受體之EC50的比係約1或 低於約 1(例如，約 〇.〇1、0.013、0.0167、0.02、0.02 5、 -19- 201010729 0.03、0.05、0.067、〇·ΐ、0.2)。在一些具體例中，三 . 重激動劑之GIP效力相較於三重激動劑之GLP-1效力的 比係、低於約 100、75、60、50、40、30、20、15、10、 或5。在一些具體例中，對GIP受體之效力除以對GLP -1 受體之效力的比係約1或低於約1 (例如，约0. 〇 1、 0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、 〇·1、0.2)。在相關具體例中，三重激動劑對GIP受體之 ❹ EC50除以三重激動劑對胰高血糖素受體之EC50的比係 低於約 100、75、60、50、40、30、20、15、1〇、或 5。 在一些具體例中’對GIP受體之EC50除以對胰高血糖 素受體之EC50的比係約1或低於約1(例如，約〇.〇1、 0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、 0·1、0.2)。在一些具體例中，三重激動劑之GIP效力相 較於三重激動劑之胰高血糖素效力的比係低於約500、 @ 450、4〇〇、350、300、250、200、150、1〇〇、75、60、 5G、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對 GIP受體之效力除以對胰高血糖素受體之效力的比係約1 或低於約 1(例如，約 0.(H、0.〇13、〇.〇167、〇.〇2、0.025、 〇.03、0.05、0.067、0_1、0.2)。在一些具體例中’三 重激動劑對GLP-1受體之EC50除以三重激動劑對胰高 血糖素受體之EC50的比係低於約1()〇、75、60、50、 4〇、3〇、2〇、15、1〇、或5。在一些具體例中，對（31^-1 -20- 201010729 受體之EC50除以對胰高血糖素受體之EC50的比係約j . 或低於約 U例如，約 0.(H、0.013、0.0167、0.02、0.025、 0·03、0·05、0_067、0.1、〇.2)。在一些具體例中，三 重激動劑之GLP-1效力相較於三重激動劑之胰高血糖素 效力的比係低於約 100、75、60、50、40、30、20、15、 10、或5。在一些具體例中，對GLP-1受體之效力除以 對胰高企糖素受體之效力的比係約1或低於約丨（例如， d 約 0 01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、〇·〇5、 0.067 、 0.1 、 0.2) 〇 本發明之又另一態樣提供對GLP-1及GIP受體呈現 活性’但其中之胰高血糖素活性經顯著降低或破壞（例 如’藉由在位置3處之胺基酸修飾）的胰高血糖素肽 (「GIP/GLP-1共同激動劑」）。舉例來說，於此位置經 酸性、鹼性、或疏水性胺基酸（麩胺酸、鳥胺酸、正白胺 φ 酸）取代可使騰高血糖素活性降低。在一些具體例中，胰 高jk糖素肽對GIP受體之EC50與其對GLP-1受體之 EC50的差（較高或較低）係低於約5〇倍、40倍、30倍或 20倍。在一些具體例中，胰高血糖素肽之GIP效力與其 之GLP-1效力的差（較高或較低）係低於約25、20、15、 10、或5倍。在一些具體例中，此等胰高血糖素肽對胰 高血糖素受體具有天然胰高血糖素之約1〇%或以下（例 如，約1-10%，或約0.1-10%，或大於約^。/。但小於約 -21 · 201010729 10%)的活性。在一些具體例中，胰高血糖素肽對GIP受 體之EC50除以胰高血糖素肽對GLP-1受體之EC50的 比係 於約 100、75、60、50、40、30、20、15、10、 或5，且不低於卜在一些具體例中，胰高血糖素肽之GIP 效力相較於胰高血糖素肽之GLP-1效力的比係低於約 100、75、60、50、40、30、20、15、10、或 5，且不 低於1。 H 本發明之再一態樣提供對GIP受體呈現活性，其中 之胰高A糖素及GLP-1活性經顯著降低或破壞（例如，藉 由在位置3及7處之胺基酸修飾）的胰高血糖素肽（「GIP 激動劑胰高jk糖素肽」）。在一些具體例中，此等跋高血 糖素肽對胰高血糖素受體具有天然胰高血糖素之約丨〇 0/〇 或以下（例如，約1 - 1 0%，或約〇. 1 _丨〇%，或大於約〇丨％、 0.5°/。、或1%但小於約ι%、5。/。、或1〇〇/。）的活性。在一 ❹些具體例中，此等胰高血糖素肽亦對GLP-1受體具有天 然GLP-1之約10%或以下（例如，約i_1〇%，或約 〇」-1〇%，或大於約0.1%、0.5%、或1%但小於約1%、 5%、或1〇%)的活性。 根據本發明之一些具體例，具有GIP激動劑活性之 胰高血糖素（SEQIDNO: 1)的類似物包含具有（a)在位置 1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，（b)使類似物之 C-端部分（胺基酸12-29)之α螺旋結構穩定的修飾，及（c) -22- 201010729 視情況 1 至 10 個（例如，i、2、3、4、5、6、7、8、9、 • 10個）進一步的胺基酸修飾的SEQ ID NO: 1。在—些具 體例中，類似物對GIP受體呈現天然GIP之至少約1% 的活性或文中所述之對GIP受體的任何其他活性值。使以 螺旋結構穩定的修飾可係技藝中已知之任何修飾，諸如， 比方說，文中所述之任何修飾。參見「使α螺旋結構穩定 化」之章節中的教示。在一些具體例中，使α螺旋結構穩 Φ 定之修飾係選自由下列組成之群之修飾：（i)在位置i及 1 + 4處之胺基酸之侧鏈之間或在位置』及j + 3處之胺基酸 之侧鏈之間的内醯胺橋，其中丨係12、13、16、n、2〇 或24 ’及其中j係17 ’及（ii)在類似物之位置16、2〇、 2 1 '及2 4處之胺基酸中的一、二、三個、或全部係經αα _ 二取代胺基酸所取代。此等具有GIP激動劑活性之胰高 血糖素的類似物將進一步說明於文中。 _ 在一些具體例中，本發明提供具有GIP激動劑活性 之胰尚血_糖素（SEQ ID NO: 1)的類似物，其具有以下的 修飾： (a) 在位置1處之胺基酸修飾， (b) (i)在位置i及i + 4處之胺基酸之侧鏈之間或在位 置j及j + 3處之胺基酸之側鏈之間的内醯胺橋，其中i係 12、13、16、17、20 或 24，及其中 j 係 17，或（ii)在 位置16、20、21、或24中之一、二、三處、或全部經α，α_ -23- 201010729 二取代胺基酸的胺基酸取代， . (c)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸 修飾， (d)l、2、3、4、5、6、或8個進一步的胺基酸修飾， 其中該類似物對GIP受體活化之EC50係約1〇〇 nM或 以下。 在範例具體例中， ❹ （a)位置1處之胺基酸修飾係位置1處之His經大的 芳族胺基酸（視情況為Tyr、Phe、Trp、胺基-Phe、硝基 -Phe、氣-Phe、磺酸基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基_Tyr、 或3-胺基Tyr)取代， (b) (i)内醯胺橋係位在位置16及20處之胺基酸之 間’其中位置16及20處之一個胺基酸經Glu取代，及 位置16及20處之另一個胺基酸經LyS取代，或（ii)該 α，α-二取代胺基酸係AIB， ❹ (c) 位置27處之Met經大的脂族胺基酸（視情況為 Leu)取代， (d) 位置28處之Asn經小的脂族胺基酸（視情況為 Ala)取代，及 (e) 位置29處之Thr經小的脂族胺基酸（視情況為 Gly)取代。 該類似物可包括進一步的修飾，包括但不限於： •24· 201010729 (a) 位置1 2處之胺基酸修飾，視情況經11 e取代， - (b)位置17及18處之胺基酸修飾，視情況在位置17 處經Q取代及在位置18處經A取代， (c)將 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)加成至 C- 端，或其任何組合。 該類似物可替代地或另外再包括進一步的修飾，包括 但不限於： 〇 (a)位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、 N-甲基-Ser、AIB、Val、或α·胺基-Ν· 丁酸取代； (b) 位置 10 處之 Tyr 經 Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、 或Val取代； (c) 一醯基鍵聯至位置10處之Lys ; (d) 位置12處之Lys經Arg取代； (e) 位置16處之Ser經Glu、Gin、升麩胺酸、升半 鲁 胱胺磺酸、Thr、Gly、或AIB取代； (f) 位置17處之Arg經Gin、Lys或Glu取代； (g) 位置 1 8 處之 Arg 經 Ala、Ser、Thr、或 Gly 取 代； (h) 位置 20 處之 Gin 經 Ala、Ser、Thr、Lys、瓜胺 酸 ' Arg、〇rn、或 AIB 取代； (i) 位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺磺 酸取代； -25- 201010729 (j)位置23處之Val經ne取代； . (k)位置 24 處之 Gin 經 Asn、Ala、Ser、Thr、Glu、

Lys、或AIB取代；及 ⑴在位置 2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、24、27、28、及 29 中任一者處 之保留性取代， 或其任何組合。 0 在一些具體例中，當胰高血糖素肽未經聚乙二醇化 時，類似物對GIP受體活化之EC50係約4、2、1 nM 或以下’或類似物對GIP受體具有天然GIP之至少約 1%、2%、3%、4%或5%的活性。在相關具體例中，未 經聚乙二醇化之類似物對GLP-1受體活化之EC50係約 4、2、1 nM或以下，或對GLP_1受體具有天然GLP-1 之至少約1%、2%、3%、4%或5%的活性。在又其他的 相關具體例中，未經聚乙二醇化之類似物對胰高血糖素受 ❹ 體活化之EC50係約4、2、1 nM或以下，或對胰高血糖 素受體具有天然胰高血糖素之至少約5%、10%、15%或 20°/❶的活性。在一些具體例中，未經聚乙二醇化之類似物 對胰高血糖素受體具有天然胰高血糖素之低於约1%的活 性。在其他具體例中’未經聚乙二醇化之類似物對GLP-1 受體具有天然GLP-1之低於約1〇%、5%或1°/。的活性。 在一些具體例中’胰高血糖素肽係共價鍵聯至位在胺 -26 - 201010729 基酸位置 16、17、20、21、94、★ ίο 各 υ d、24、或29、在位置μ之後 在C_端延伸内之加成胺基酸處（例如，位置30)、或在C_ 端胺基酸處之任-者處之親水性部分。在範例具體例中 此親水性部分係共價鍵聯至在任何該等位置處之、

Cys'Orn、升半胱胺酸、或乙醯基_苯基丙胺酸殘基。親

水性部分的實例包括，例如，分子量約^000道耳吞 (Dalton)至約40,〇〇〇道耳吞，或約2〇 〇〇〇道耳吞至約 40，000道耳吞的聚乙二醇（pEG)。 在類似物係鍵聯至諸如p E G之親水性部分的該等具 體例中，與沒有親水性部分的類似物相比，對一或多種受 體的相對EC50可較高，例如’高約1 〇倍。舉例來說， 經聚乙二醇化之類似物對GIP受體活化之EC5〇係約1〇 nM或以下’或類似物對GIP受體具有天然GIP之至少 約 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、或 〇.5% 的活性。在相 關具體例中，經聚乙二醇化之類似物對GLP-1受體活化 之EC50係約10 nM或以下，或對GLP-1受體具有天然 GLP-1 之至少約 〇.1〇/0、0.2%、0.3%、0.4%或 0.5%的 活性。在又其他的相關具體例中，經聚乙二醇化之類似物 對姨高血糖素受體活化之EC50係約1〇 nM或以下，或 對騰南企糖素受體具有天然跌南金糖素之至少約0.5%、 1 %、1.5 %或2 %的活性。在一些具體例中，類似物對胰 高血糖素受體具有天然胰高血糖素之低於約1%的活性。 -27- 201010729 在其他具體例中，類似物對GLP4受體具有天然GLpd . 之低於約10%、5%或1%的活性。 胰高血糖素肽可為包含至少兩個、三個、或更多個透 過連接體（linker)鍵結之肽之二聚體、三聚體或更高級多 聚體的部分，其中至少一或兩個肽為姨高血糖素狀。二聚 體可為均二聚體或雜二聚體。在一些具體例中，連接體係 選自由雙官能硫醇交聯體及雙官能胺交聯體所組成之 © 群。在某些具體例中，連接體係PEG，例如，5 kDa PEG、 2〇 kDa PEG。在一些具體例中’連接體係二硫化物鍵。 舉例來說，一聚體之各單體可包含Cys殘基（例如，位在 終端或内部的Cys)，且纟Cys殘基之硫原子參與二硫化 物鍵之形成。在本發明之一些態樣中，單體係透過終端胺 基酸(d例如，Ν·端或c-端），透過内部胺基酸，或透過至 少一單體之終端胺基酸及至少另一單體之内部胺基酸連 ❹ #在特定癌樣巾’單體並非透過Ν_端胺基酸連接。在 -些態樣中，多聚體之單體係以「尾接尾」取向連接在一 起’其中各單體之c_端胺基酸連接在—起。—結合物部 分可共價鍵聯至文中所述之任何姨高血糖素肽，包括二聚 體、二聚體或更高級多聚體。 文中所述之S高騰高血糖素受體活性、維持部分胰高 血糖素受體活性、改良溶解度、提高穩定性、或降低降解 的任何修飾可個別或組合地應用至胰高血糖素肽。在-歧 -28 - 201010729 具體例中，胰高血糖素肽在6至8之間、或ό至9之間、 • 或7至9之間（例如，ρΗ 7)的ρΗ下可以至少1毫克/毫 升之濃度溶解，且視情況於在25 t：下24小時後保留原始 肽的至少95%(例如，原始肽的5%或以下經降解或分裂）。 提供包含醫藥學上可接受之載體或稀釋劑的無菌醫 藥組成物及包含裝置的套組。提供減輕體重增加或誘發減 重的方法，其包括向有需要的病患投與可有效減輕體重增 G 力口或誘發減重之量的此等醫藥組成物。提供治療糖尿病的 方法’其包括向有需要的病患投與可有效降低血糖值之量 的此等醫藥組成物。 文中所述之所有治療方法、醫藥組成物、套組及其他 類似具體例涵蓋術語肽、激動劑、共同激動劑、三重激動 劑、或類似物之使用包括其所有醫藥學上可接受之鹽或 ❹ 先别之【發明内容】並非要定義本發明之每個態樣， 且額外的具❹m明於其他章節，諸如【實施方式】中。 整份文件係要認同為統一的揭示案，且應明瞭可涵蓋文中 所述特徵之所有可能的組合，即使該等特徵之組合未一起 出現於本文件之相同句子、或段落、或章節中。 所3 圍以任何方式較由文中特定段落 ^義之變化窄之本發明的任—或所有具體例。舉例來 說，‘說明本發明之某些態樣作為-類時，應明瞭一類之 •29- 201010729 每一者係個別地為本發明之一具體例，且該類之兩者或兩 以上的組合係本發明之具體例。 【實施方式】 定義 在描述及主張本發明時，將根據以下所述的定義使用 以下術語。 0 如文中所使用之術語「約」係指較所述之值或值的範 圍大或小1 〇%，但並非要將任何值或值的範圍指示為僅 此較廣的疋義。前置術語「約」之各值或值的範圍亦欲涵 蓋所述絕對值或值範圍的具體例。 如文中所用之術語「醫藥學上可接受之載劑」包括任 何的標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液 諸如油/水或水/油乳液、及各種類型的濕潤劑。此術語 亦涵蓋任何經美國聯邦政府之管理機關所認可或列於美 國藥典（US Pharmacopeia)中使用於動物（包括人類）的 試劑。 如文中所用之術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保有 母化合物之生物活性，且無在生物或其他方面之不利作用 之化合物的鹽。本文揭示之許多化合物可藉由胺基及/或 羧基或其類似基團之存在而形成酸及/或鹼鹽。 醫藥學上可接受之鹼加成鹽可由無機及有機鹼來製 201010729 備。衍生自無機鹼的鹽包括（僅作為實例）鈉、鉀、鋰、銨 鈣及鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括(但不限於)第一、第， 及第三胺之鹽。 Ο

醫藥學上可接受之酸加成鹽可由無機及有機酸來製 備。衍生自無機酸的鹽包括氫氯酸、氫演酸、硫酸、硝酸、 磷酸等等。衍生自有機酸的鹽包括乙酸、丙酸、羥乙酸' 丙嗣酸、草酸、顏果酸、丙二酸、號賴、順丁烯二酸、 反丁烯二酸、酒石酸、轉檬酸、苯甲酸 酸、甲續酸、乙續酸、Μ苯績酸、水揚酸等等。本乙％ 如文中所用之術語「㈣」包括預防特定病症或病 況’或減輕與特定病症或病況相_症狀及/或預防或消 除該等症狀。舉例來說，如本文所用之術語「㈣糖尿病」 一般將係指朝正常值的方向改變葡萄糖血值，且可視給定 障況而包括提兩或降低jk糖值。 如本文所使用之「有效」量或「治療有效量」之騰高 血糖素肽係指無毒性但可提供期望效果之足夠量的狀。舉 例來說’-期望的效果㈣預m療低血糖，如（例如） 藉由a糖值的升高所量♦本揭示案之胰高血糖素狀之另 -期望的效果將包括治療高血糖（例如，如由較接近正常 的血糖值變化所㈣），朗發減重/㈣增重（例如，如 由體重之降低所量測）’或預防或降低體重增加，或使體 脂分佈達到標準。「有效」的量將隨對象而異，視個體的 201010729 年齡及一般狀況、給藥方式等等而定。因此，並非始終可 . 明確指出確切的「有效量」。然而，在任何個別情況中的 適當「有效」量可由熟悉技藝人士使用例行實驗而決定。 術語「非經腸道」係指不通過供給營養的管道，而係 經由一些其他途徑諸如皮下、肌肉内、脊椎内、或靜脈内。 如本文所用之術語「經純化」及類似術語係關於以實 質上不含一般與分子或化合物於原生或天然環境中相關 ❹ 之污染物的形式分離出分子或化合物。如本文所使用之術 語「經純化」不需要絕對純度；反之，其係指相對的定義。 術語「經純化的多肽」在此係用於描述經自包括（但不限 於）核酸分子、脂質及碳水化合物之其他化合物分離的多 肽。 術語「經分離」需要將所提及的物質自其之原始環境 (例如，若其係天然產生時的自然環境）移除。舉例來說， 〇 存在於活動物體内之天然產生的多核苷酸係未經分離，但 自於天然系統中之一些或所有共同存在物質中分離出的 相同多核苷酸係經分離。 如本文所使用之術s吾「狀」涵蓋3個或3個以上之胺 基酸且典型上少於50個胺基酸的序列，其中該等胺基酸 係天然產生或非天然產生的胺基酸。非天然產生的胺基酸 係指不會於活體内自然產生，但可經併入至文中所述之肽 結構内的胺基酸。 -32- 201010729 如本文所用之術語「多肽」及「蛋白質」係交替用於 指示胺基酸之聚合物的術語，而與聚合物的長度無關。典 型上’多肽及蛋白質具有大於「肽」的聚合物長度。 如本文所使用之「胰高血糖素肽」包括任何包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列、或任何seQ ID NO: 1之胺基 酸序列之類似物的肽，包括肽的胺基酸取代、加成、刪除 或後轉#修飾（post translational modification)(例 如，甲基化、醯化、烷化、泛醌化、分子内共價鍵結諸如 内醢胺橋形成、聚乙二醇化等等），其中該類似物刺激胰 尚血糖素或GLP-1或GIP受體活性，例如，如使用實施 例16中所述之檢定法由CAMP產生所量測。 術語「胰高血糖素激動劑」係指包含刺激胰高血糖素 受體活性（例如，如使用實施例16中所述之檢定法由 cAMP產生所量測）之胰高血糖素肽的複合物。 如本文所用之胺基酸「修飾」係指胺基酸的取代、加 成或刪除，且包括經20種常見於人類蛋白質中之胺基 酸，以及非典型或非天然產生之胺基酸中的任一者取代或 加成。在全篇申請案中，所有以數字（例如，位置28)提 及之特定胺基酸位置係指在天然胰高血糖素（SEQ ID NO: 1)中之該位置或在其任何類似物中之相應胺基酸位 置處的胺基酸。舉例來說，文中提及「位置28」對於其 中SEQ ID NO: 1之第一個胺基酸經刪除的騰高血糖素類 -33- 201010729 似物而言將係指相應的位置27。同樣地，文中提及「位 • 置28」對於其中在SEQ ID NO: 1之N-端之前加成一個 胺基酸的胰高血糖素類似物而言將係指相應的位置29。 非典型胺基酸的商業來源包括

Sigma-Aldrich(Milwaukee, WI) ' ChemPep Inc. (Miami, FL)、及 Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA)。非典型胺基酸可購自商業供應商、 〇 重新合成得、或自其他胺基酸化學修飾或衍生而得。 如本文所使用之術語「天然胰高血糖素」係指由SEQ ID NO: 1之序列所組成的肽，術語「天然GIP」係指由 SEQ IDNO: 4之序列所組成的肽，及術語「天然GLP-1」 係指示GLP-l(7-3 6)醯胺（由SEQ ID NO: 3之序列所組 成）、GLP-1(7_37)酸（由SEQ IDNO: 2之序列所組成）、 或該兩化合物之混合物的一般術語。如本文所使用之一般 ❹ 在不存在任何進一步指示下的提及「騰高血糖素」或 「GIP」或「GLP-1」分別係意指天然胰高血糖素或天然 GIP或天然GLP-1。 如本文所使用之胺基酸「取代」係指以不同的胺基酸 殘基取代一個胺基酸殘基。 如本文所使用之術語「保留性胺基酸取代」在本文係 經定義為在以下五群之一者内的交換： 工.小的脂族、非極性或輕度極性殘基： -34- 201010729

Ala、Ser、Thr、Pro、Gly ; II. 極性、帶負電殘基及其之醯胺及輯： . ASP、Asn、G1U、Gln、半胱胺續酸及升半胱胺績 酸； III. 極性、帶正電殘基：

His、Arg、Lys ;鳥胺酸（〇rn) IV. 大的脂族非極性殘基： © Met、LeU、Ile、Va卜⑼、正白胺酸（NU)、升 半胱胺酸 V. 大的芳族殘基：

Phe、Tyr、Trp、乙醯基苯丙胺酸 如本文所使用之一般術語「聚乙二醇鏈」或「pEG鏈」 係指由通式H(〇CH2CH2)n〇H所表示之環氧乙烷與水之 ❹呈分支鏈或直鏈之縮合聚合物的混合物，其中n為至少 9。若不存在任何進一步的表徵，則此術語係意指包括平 均總分子量選自500至40, 〇〇〇道耳吞之範圍之乙二醇的 聚合物。「聚乙二醇鏈」或「peg鏈」係與數字字尾結 合使用以指示其之大約平均分子量。舉例來說， PEG-5,〇〇〇係指具有約5,〇〇〇之總分子量平均值的聚乙 二醇鏈。 如本文所使用之術語「聚乙二醇化」及類似術語係指 •35- 201010729 經由使聚乙二醇鏈鍵聯至化合物而自其之天然狀態經修 飾的化合物。「經聚乙二醇化之胰高血糖素肽」係具有共 價鍵結至胰高血糖素肽之PEG鏈的胰高血糖素肽。 如本文所使用之一般提及肽係意指涵蓋具有經修飾 胺基及羧基終端的肽。舉例來說，包含醯胺基替代終端敌 酸之胺基酸鏈係意指涵蓋在指示標準胺基酸的胺基酸序 列内。 φ 如本文所使用之「連接體」係使兩個個別實體彼此結 合的鍵、分子或分子基團。連接體可提供兩實體的最佳間 隔，或可進一步提供使兩實體可彼此隔開的不穩鍵聯。不 穩鍵聯包括光可分裂基團、酸不穩定部分、鹼不穩定部分 及酵素可分裂基團。 如本文所使用之「二聚體」係包含兩個透過連接體彼 此共價鍵結之子單元的複合物。術語二聚體當在沒有任何 ❹ 修飾語下使用時係涵蓋均二聚體及雜二聚體兩者。均二聚 體包含兩個相同的子單元，而雜二聚體包含兩個不同的子 單元，儘管兩個子單元彼此實質上相似。 如本文所使用之術語「帶電胺基酸」係指包含在生理 pH下之水溶液中帶負電（即去質子化）或帶正電（即質子 化）之側鏈的胺基酸。舉例來說，帶負電的胺基酸包括天 冬胺酸、麩胺酸、半胱胺磺酸、升半胱胺磺酸、及升麩胺 馱而帶正電的胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶 -36 - 201010729 電胺基酸包括在20種常見於人類蛋白質中之胺基酸 及非典型或非自然產生之胺基酸中的帶電胺基酸。 以 如本文所使用之術語「酸性胺基酸」係指包含第二個 酸性部分，包括例如，㈣或姐基團的胺基酸。 如本文所使用之一分子對第一受體相對於第二受體 之術語「選擇性」係指以下的比：該分子對該第二受體之 EC50除以該分子對該第一受體之EC5〇 ^舉例來說對 第-受體具有1 nM之EC50及對第二受體具有1〇〇 _

之EC50的分子對第一受體相對於第二受體具有ι〇〇倍 的選擇性。 如本文所使用之一分子的「騰高血糖素效力」係指該 分子對膜高血糖素受體之EC50除以天然胰高血糖素對 胰高血糖素受體之EC50的比。 如本文所使用之一分子的「GIP效力」係指該分子對 GIP受體之EC50除以天然GIP對GIP受體之EC50的 比。 如本文所使用之一分子的「GLP-1效力」係指該分子 對GLP-1受體之EC50除以天然GLP-1對GLP-1受體 之EC50的比。 如本文所使用之術語「烷基」係指含有指定碳原子數 的直鏈或分支鏈烴。烷基之實例包括曱基、乙基、及直鏈 丙基。 -37- 201010729 如本文所使用之術語「雜烷基」係指含有指定碳原子 - 數及位於結構主鏈中之至少一個雜原子的直鏈或分支鏈 烴。適用於此的雜原子包括，但不限於，N、s、及〇。 如本文所使用之術語「環烷基」係指含有指定碳原子 數的環狀烴基，例如，環丙基、環丁基、環己基、及環戊 基。 如本文所使用之術語「雜環基」係指含有指定碳原子 φ 數及一至二個獨立地選自由氧、氮、及硫組成之群之雜原 子的環狀烴基。雜環烷基的非限制性實例包括哌啶、四氫 〇夫喃、四風旅喃、二風η夫喃、JJ末琳、嗟吩等。 如本文所使用之術語「芳基」係指含有指定碳原子數 之單環或多環芳基，較佳為單環或雙環芳基，例如，苯基 或萘基。除非另作指示，否則芳基可未經取代或經取代。 如本文所使用之術語「雜芳基」係指含有指定碳原子 纟及至少—個選自由氧、氮、及硫組成之群之雜原子的單 if或多¥芳基。除非另作指示’否則芳基可未經取代或經 取代。 具體例 文中揭示之修飾允許處理胰高血糖素（SEQ ID N⑴ 1) ’以產生呈現提⑤之GIP活性、胰高血糖素活性、及 /或GLM活性的胰高血糖素肽。文中揭示之其他修飾 -38- 201010729 (長生成肽的半衰期、提高溶解度、或提高穩定性。文中 揭示之又其他的修飾對活性沒有影響，或可不破壞一或多 期望活f生而⑦成。提供相同目的（例如，提高活性） ’任何組s可個別或組合地應用。賦予增進性質的任何單 —組合或其集合可個職組合地應用，紗，提高的⑽ 及/或GLP-1活性可與提高的半衰期組合。

夕在範例具體例中，姨高血糖素肽可包含總計1個、至 ^ 2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個至 多7個、至多8個、至多9個、或至多1〇個相對於天然 胰高A糖素序制胺基酸修飾。在—些具體射，此等姨 高血糖素肽保留至少22、23、24、25、26、27或28個 天然胰高血糖素巾減位置處之天然I生之胺基酸（例 如，相對於天然產生之胰高血糖素具有丨_7、丨巧或^3 個修飾）。在相關具體例中，j、2、3 ^ 6或更多個 胺基^修飾可為非保留性取代、加成或刪除。纟_些具體 :中，卜^…卜“戈更多個胺基酸修飾可：保留 :取代。在-些具體例中，在任意的位置2、5、7、1〇、 或29處進行！、2、3、4或5個非保留性取代，及在任 何此等位置處進行至多5個進-步的保留性取代。在一扭 具體例中，在位置丨_16之胺基酸内進行丨、2、 二 基酸修飾，及在位置17-26之胺基酸内進 或3個胺 订1、2、或3 •39- 201010729 個胺基酸修飾。 影響G1P活性的修飾 對GIP受體的提高活性係藉由在位置1處之胺基酸 修飾來提供。舉例來說’位置1處之H is經大的芳族胺基 酸，視情況為Tyr、Phe、Trp、胺基-Phe、硝基-Phe、 氣-Phe、磺酸基-Phe、4_吡啶基-Ala、曱基-Tyr、或3-胺基Tyr所取代。意料之外地，位置1處之Tyr與對應 於胺基酸12-29之區域内之α螺旋之穩定化的組合提供活 化GIP受體以及GLP-1受體及胰高血糖素受體的胰高血 糖素肽。α螺旋結構可經由，例如，形成共價或非共價分 子内架橋、或以使〇c螺旋穩定的胺基酸（例如，α，α -二取 代胺基酸）取代及/或插入在大約位置12-29處之胺基酸 而穩定化。 對GIP受體的提高活性亦係藉由在位置27及/或28 處，及視情況在位置29處之胺基酸修飾來提供。舉例來 說’位置27處之Met係經大的脂族胺基酸（視情況為Leu) 取代’位置2 8處之A s η係經小的脂族胺基酸（視情況為 Ala)取代，及位置29處之Thr係經小的脂族胺基酸（視 情況為Gly)取代。在位置27-29處以LAG取代相對於 在該等位置處的天然MNT序列提供提高的GIP活性。 對GIP受體的提高活性亦係藉由在位置12處之胺基 201010729 酸修飾來提供。舉例來說，位置12經大的脂族非極性胺 . 基酸（視情況為lie)取代。 . 對GIP叉體的提尚活性亦係藉由在位置1 7及/或i 8 處之胺基酸修飾來提供。舉例來說，位置丨7經極性殘基 (視情況為Gin)取代，及位置18經小的脂族胺基酸（視情 況為Ala)取代。在位置17及18處以QA取代相對於在 該等位置處的天然RR序列提供提高的GIp活性。 ® 以上所述之提高GIP受體活性的任何修飾可個別或 組合地應用。提高GIP受體活性之修飾的組合一般提供 較任何單獨的該等修飾高的GIP活性。 景夕響胰高J&L糖素活性的修飾

在一些具體例中，提供具有提高效力及視情況改良之 心解度及穩定性的胰高血糖素之類似物。在一具體例中， ⑩ 提同的胰咼血糖素效力係藉由在天然胰高血糖素（SEQ ID NO: 1)之位置16處的胺基酸修飾來提供。舉非限制 I·生的實例來說，此等提高的效力可藉由以麵胺酸或以另一 具有4個原子長度之側鏈的帶負電胺基酸，或者以麩醯胺 酉文升麵胺酸、或升半胱胺磺酸中之任一者、或具有含至 )一個雜原子（例如，N、0、S、P)之側鏈且具約4(或 3_5)個原子之侧鏈長度的帶電胺基酸取代位置16處之天 然產生的絲胺酸來提供。在一些具體例中，胰高血糖素肽 201010729 保留其對胰高灰糖素受體相對於對GLP_1受體的原始選 . 擇性。 - 姨高也糖素受體活性可藉由在位置3處之胺基酸修飾 來降低，例如，以酸性、鹼性、或疏水性胺基酸取代位置 3處之天然產生的麩醯胺酸。舉例來說，以麩胺酸、鳥胺 酸'或正白胺酸在位置3作取代實質上地降低或破壞胰高 血糖素受體活性。 Ο 對騰南血糖素受體的維持或提高活性可藉由以麩醯 胺酸類似物修飾位置3處之Gin而達成。舉例來說，包 含位置3處之麩醯胺酸類似物的胰高血糖素肽可對胰高 企糖素受體呈現天然胰高血糖素（SEq id NO: 1)之約 5%、約10%、約20%、約5〇%、或約85%或以上的活 性。在一些具體例中’包含位置3處之麵醢胺酸類似物的 騰高血糖素肽可對胰高血糖素受體呈現除了位置3處之 @ 經修飾胺基酸外具有與包含麵醯胺酸類似物之肽相同之 胺基酸序列（例如，SEQ ID NO: 250 或 SEQ ID NO: 251) 之相應胰高jk糖素肽之約2 0 %、約5 0 %、約7 5 %、約 100%、約200%或約500%或以上的活性。在一些具體 例中，包含位置3處之麩醯胺酸類似物的胰高血糖素肽對 胰高血糖素受體呈現提高的活性’但該提高的活性不多於 天然胰高血糖素或除了位置3處之經修飾胺基酸外具有 與包含麵醯胺酸類似物之肽相同之胺基酸序列之相應胰 -42- 201010729 高血糖素肽之活性的1000%、10,000%、100,000%、或 1，000,000〇/〇 〇 在一些具體例中，麩醯胺酸類似物係包含結構I、η 或III之側鍵之天然產生或非天然產生的胺基酸：

卜 r1-ch2-x _1r2 結構I

結構II ❹ Ο

^-r1-ch2-s-ch2-r4 結構III 其中R1係C〇-3烷基或c0-3雜烷基；R2係NHR4或 Cu烧基；R3係Cw烷基；R4係η或Cw烷基；X係 NH、Ο、或 S ;及 γ 係 NHR4、SR3、或 〇R3。在一些具 體例中，X係NH或Y係NHR4。在一些具體例中，Ri 係C〇- 2烧基或C i雜烧基。在一些具體例中，r2係nhr4 或C!烧基。在一些具體例中，R4係η或C1烷基。在範 例具體例中’提供包含結構I之侧鏈的胺基酸，其中R 1 係CHz-S，X係NH，及R2係CH3(乙醯胺甲基·半胱胺 酸，C(Acm)) ; R1 係 CH2 ’ X 係 NH，及 R2 係 CH3(乙醯 二胺基丁酸’ Dab(Ac)) ; R1係c〇烧基，X係NH，R2係 -43- 201010729 NHR ’及R係Η(胺曱酿基二胺基丙酸，Dap(脲））；或 Rl係CH2_CH2 ’ X係NH，及R2係CH3(乙醯基鳥胺酸， Orn(AC))。在範例具體例中，提供包含結構π之側鏈的 胺基酸，其中R1係CH2，Υ係NHR4，及R4係CH3(甲 基麩醯胺酸，Q(Me));在範例具體例中，提供包含結構 III之側鏈的胺基酸，其中R1係CH2及R4係H(甲硫胺 酸-亞砜，M(O));在特定具體例中，位置3處之胺基酸經 ❿ Dab(Ac)取代。舉例來說，騰高血糖素激動劑可包含SEq ID NO: 243-248、250、251、及 253-256 中任一者之 胺基酸序列。 影響G L P -1活性之修飾 對GLP-1受體的提高活性係藉由以電荷中性基團（諸 如醯胺或酯）取代C-端胺基酸之羧酸來提供。 ❹ _GLP-1受體的提高活性亦係藉由使姨高血糖素之 C-端部分（大约胺基酸12_29)中之α螺旋結構穩定來提 供，例如，透過在兩個胺基酸之側鏈之間形成分子内架 橋，或在大約位置12_29處之胺基酸中以使α螺旋穩定之 胺基酸（例如，α，α-二取代胺基酸）取代及/或插入。此等 胺基酸之侧鏈可透過氫鍵結或離子交互作用（諸如形成鹽 橋），或經由共價鍵而彼此鍵聯。在一些具體例中，架= 係形成於間隔三個的胺基酸之間22、23、24或25)。在 201010729 範例具體例中，胺基酸對12及16、13及17、16及2〇、 - 17 及 21、20 及 24 或 24 及 28(其中 i = 12、16、20、 或24之胺基酸對）之側鏈彼此鍵聯，因此使胰高血糖素之 α螺旋穩定化。 在其他具體例中，架橋係形成於間隔兩個插入胺基酸 的胺基酸之間，即位置「〗」處之胺基酸與位置處 之胺基酸，其中j係12至26之任何整數（例如，12、13、 〇 14、15、16、、18、19、20、21 ' 22、23、24、25 或26)。在範例具體例中，』係17。在其他具體例中，架 橋係形成於間隔六個插入胺基酸的胺基酸之間，即位置 「k」處之胺基酸與位置rk + 7」處之胺基酸，其中让係 12至22之任何整數（例如，12、13、14、15、ι6、17、 18、19、20、21或22)。在一具體例中，k係17。 在一些具體例中，架橋或連接體之長度係約8(或約 ❹ 7-9)個原子，尤其係當架橋係在位置i與i + 4之間時。在 一些具體例中，架橋或連接體之長度係約6(或約5_7)個 原子’尤其係當架橋係在位置j與j + 3之間時。 在一些具體例中，分子内架橋係藉由下列方式形成. U)以麩胺酸或以另一具有4個原子長度之側鏈的帶負電 胺基酸，或者以麩醯胺酸、升麩胺酸、或升半胱胺磺酸中 -45· 201010729 之任一者、或具有含至少一個雜原子（例如，N、〇、s、 p)之側鏈且具約4(或3·5)個原子之側鏈長度的帶電胺基 酸取代位置1 6處之天然產生的絲胺酸，及（b)以另一具有 帶電或具有氫鍵結能力，且長度至少約5 (或約4 _ 6 )個原 子之側鏈的親水性胺基酸（例如，離胺酸、瓜胺酸、精胺 酸、或鳥胺酸）取代位置20處之天然產生的麩醯胺酸。位 置16及20處之此等胺基酸的侧鏈可形成鹽橋或可共價 ❹ 鍵聯。 在一具體例中，兩個胺基酸彼此鍵結形成内醯胺環。 内醯胺環的大小可視胺基酸侧鏈的長度而異，且在一具體 例中，内醯胺係經由使離胺酸胺基酸之側鏈鍵聯至麩胺酸 侧鏈而形成。内醯胺環中之醢胺鍵的次序可顛倒（例如， 内酿胺環可在Lysl2與Glul6或者在Glu 12與Lysl6 之側鏈之間形成）。 〇 在一些具體例中，胰高血糖素肽之c_端部分中之α螺 旋結構的穩定化係透過形成除内醯胺橋外的分子内架橋 而達成。舉例來說，合適的共價鍵結方法包括烯烴複分 解、基於羊毛硫胺酸之環化、二硫化物橋或經修飾含硫橋 形成、使用α，ω_二胺基烷繫鏈、形成金屬-原子橋中之任 何—或多者，及使用其他的肽環化方式於使α螺旋 化。 對GLP-1受體之效力可進一步藉由對位置18處之天 -46· 201010729 然精胺酸的丙胺酸取代而提高。 - 上文所述之提高GLP-1受體活性的任何修饰可個別 或組合地應用。提高GLP-1受體活性之修飾的組合一般 提供較任何單獨的該等修飾高的GLP-1活性。舉例來 說’本發明提供包含在位置16、位置20、及C-端叛酸 基處之修飾，視情況並具有在位置16及20處之胺基酸 之間之共價鍵的胰高血糖素肽；包含在位置16及C -端羧 〇 酸基處之修飾的跌高血糖素肽；包含在位置16及20處 之修飾，視情況並具有在位置1 6及2 0處之胺基酸之間 之共價鍵的胰高血糖素肽；及包含在位置20及C-端叛酸 基處之修飾的胰高血糖素肽。 GLP-1活性可藉由包含以下各項而降低：（i)c_端α 羧酸酯基，（ii)以不含羥基的胺基酸（例如，Abu或lie) 取代位置7處之Thr，（iii)刪除位置27或28處之胺基酸 0 C —端的胺基酸（例如，刪除位置2 8處之胺基酸，刪除位 置28及29處之胺基酸），而產生27或28個胺基酸長度 的肽，或（iv)其之組合。 影響騰高血糖素、GLP -1、及GIP受體各者活性之修飾 對胰高血糖素受體、GLP-1受體、及GIP受體各者 之提高活性係藉由以下各項而提供：（i)以式IV之胺基酸 對位置16處之Ser作胺基酸取代： 201010729 Η

Η2Ν-C-COOH CH2)n

[式 IV] ’ 其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或 2至6、或2或3或4或5，！^及尺2各係獨立地選自由 以下基團組成之群：Η、Ci-Cu烷基、（CVCb烷基）〇η、 ® (CVC"烷基）ΝΗ2、（CVCh 烷基）SH、（CQ-C4 烷 基）（c3-c6)環烷基、（cG-c4 烷基）（c2_c5 雜環基）、（C()_C4 烷基）（c6-c1()芳基）R7、及（CVC4烷基）（c3_c9雜芳基）， 其中R7係Η或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺 基’及（ii)位置20處之Gin經α，α-二取代胺基酸（例如， ΑΙΒ)作胺基酸取代。在一些具體例中，位置16處之胺基 酸係Orn、Dab、Lys、或升Lys，及位置20處之胺基酸 Ο 係AIB。在特定具體例中，位置16處之胺基酸係LyS， 及位置20處之胺基酸係AIB。 在位置16處包含式IV之胺基酸及在位置2〇處包含 α，α -二取代胺基酸之類似物對各胰高血糖素受體、 GLP-1受體、及GIP受體之活性可藉由延長肽之長度（例 如，藉由將長度（例如）約1-21、約9至21、約6·ι8、約 9-12、或約1〇或11個胺基酸融合至c_端延伸肽）而進 -48 - 201010729 一步提高。在一些具體例中，匕端係藉由融合至

GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96)而延長，其中X係Gly或小的脂族或 非極性或輕度極性胺基酸。在替代具體例中，c_端係藉 由融合至GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)而延長，且 將 1-1 1 個胺基酸融合至 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95) 之C -端。舉例來說，類似物之c -端延伸可包含 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)接著 1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、或 11 個位在 SEQ IDNO: 95 之 C- 端的額外胺基酸。該1 - 1 1個額外胺基酸可為，例如，小 的脂族胺基酸’諸如A1 a。在此方面，C -端延伸可，例如， 包含GPSSGAPPPS Am之胺基酸序列，其中m係1至1 1。 GIP活性、基於胰高血糖素之類似物（包括含有位於 位置16處之式IV胺基酸及位於位置20處之α，α_二取代 胺基酸之類似物）對各胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體 之活性的提高可進一步在位於C -端延伸内或C -端胺基酸 (例如’加成至C-端延伸之C·端的胺基酸）處之胺基酸的 醯化或烷化後達成。醯化或烷化可係位在，例如，c —端 延伸類似物之位置30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39 ' 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 ' 及50之任一者處的胺基酸。在一些具體例中，經醯化或 烷化的胺基酸係位在C-端延伸類似物之位置37、38、 -49- 201010729 39、40、41、42、或43處。在一些具體例中，經醯化 或烷化的胺基酸係連接至醯基或烷基（例如，C10-C22) 之式I、II、或III的胺基酸，例如，Lys。在某些具體例 中’ Lys係位在由SEQ ID NO: 95組成之C-端延伸的 C-端，以致Lys、Dab、Orn、或升[yS係位在類似物的 位置4 0處。視情況，C -端延伸肽亦經聚乙二醇化，例如， 在文中所述的任何位置處（例如，位置2 4)。 0 此外，GIP活性、基於胰高血糖素之類似物對各胰高 血糖素、GLP-1、及GIP受體之活性的提高可藉由透過 間隔物（例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔 物、疏水性雙官能間隔物）將胺基酸醯化或烷化而達成。 在一些具體例中，G〗p活性、基於胰高血糖素之類似物包 含透過一間隔物的醯基或烧基，該間隔物係連接至類似物 之位置10處之胺基酸的側鏈。在其他具體例中，類似物 藝包含在位置29處之胺基酸C-端之1至21個胺基酸的c_ 端延伸（例如，包含SEQIDNO:95或96之胺基酸序列 的延伸）及間隔物，該間隔物係共價連接至醯基或烷基， 在對應於相對於SEQ ID NO: 1之位置37_43之一者的 位置處連接至該延伸之一胺基酸。在特定具體例中，間隔 物係連接至相對於SEQ ID NO: 1之位置4〇處的胺基 酸。在某些具體例中，間隔物之長度為3至1〇個原子。 在特定態樣中，間隔物及醯基或院基之總長度為約14至 201010729 約28個原子長度。舉例來說，間隔物可為胺基酸，包括， 但不限於’文巾所述之任何胺基酸。此外，例如，間隔物 可為包含文中所述之胺基酸的二肽或三肽。在特定態樣中 之間隔物為以下二肽中之一者：Ala_Ala、pAla_pAia、 或用於提高對胰高血糖素、GLpq、及Gip 艾體中之一或多者之活性的額外適當間隔物將進一步說 明於文中。 0 改善DPP-ΐγ抗性的修飾 位置1及/或2處之修飾可提高肽對二肽基肽酶IV (DPP IV)分裂的抗性。舉例來說，位置2處之胺基酸可 經絲胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺 酸、N-甲基丙胺酸、或胺基異丁酸取代。在一些具體例 中，位置1處之胺基酸可經D_組胺酸、脫胺基組胺酸、 羥基組胺酸、乙醯基組胺酸、升組胺酸、N_甲基組胺酸、 ❿ α甲基組胺I、咪唑乙酸、或α，α-二甲基咪唑乙酸（DMIA) 取代。 經觀察到位置2處之修飾（例如，位置2處之AIB) 及在一些情況中在位置丨處之修飾（例如，位置丨處之 DMIA)可降低胰高血糖素活性，有時係顯著地；令人驚 奇地，此胰高血糖素活性的降低可藉由使胰高血糖素之 C-端部分（大約胺基酸12·29)中之α螺旋結構穩定而回 復，例如，如文中所述透過在兩胺基酸之側鏈之間形成共 -51 - 201010729 價鍵。在一些具體例中，共價鍵係位在位置「丨」及「丨+4」 - 或位置Ί」及「j+3」處之胺基酸之間，例如，在位置 12 及 16、16 及 20、20 及 24、24 及 28、或 17 及 2〇 之間。在範例具體例中，此共價鍵係在位置16處之麩胺 酸與位置20處之離胺酸之間的内醯胺橋。在一些具體例 中，此共價鍵係除内醯胺橋外的分子内架橋。舉例來說， 合適的共價鍵結方法（即形成共價分子内架橋之方式）包 〇 括烯烴複分解、基於羊毛硫胺酸之環化、二硫化物橋或經 修飾含硫橋形成、使用α，ω_二胺基烷繫鏈、形成金屬_ 原子橋、及其他肽環化方式中之任何一或多者。 降低降解的修飾 在又進一步的範例具體例中，任何的胰高血糖素肽可 進一步經修飾，以經由修飾SEQ ID NO: 1之位置15及 /或16處之胺基酸來改良穩定性，而降低肽隨時間的降 解，尤其係於酸性或鹼性緩衝液中。此等修飾降低 Aspl5-Serl6肽鍵的分裂。在範例具體例中，位置15處 之胺基酸修飾係將Asp刪除或以麵胺酸、升麩胺酸、半 胱胺磺酸或升半胱胺磺酸取代。在其他範例具體例中，位 置16處之胺基酸修飾係將ser刪除或以Thr或AIB取 代。在其他範例具體例中，位置16處之Ser係經麩胺酸 或經另一具有4個原子長度之側鏈的帶負電胺基酸，或者 -52· 201010729 經麩醯胺酸、升麩胺酸、或升半胱胺磺酸中之任一者取代。 在一些具體例中，存在於天然肽之位置27處之甲硫 胺酸殘基係（例如）經由刪除或取代而作修飾。此等修飾可 防止肽的氧化性降解。在一些具體例中，位置2 7處之 Met係經白胺酸、異白胺酸或正白胺酸取代。在一些特定 具體例中，位置2 7處之M e t係經白胺酸或正白胺酸取代。 在一些具體例中，位置20及/或24處之Gin係（例 如）經由刪除或取代而作修飾。此等修飾可降低透過Gln 之脫醯胺而發生的降解。在一些具體例中，位置20及/ 或24處之Gin係經Ala或AIB取代。在一些具體例中， 位置20及/或24處之Gin係經Lys、Arg、Orn、或瓜 胺酸取代。 在一些具體例中，位置2 1處之A s p係（例如）經由刪 除或取代而作修飾。此等修飾可降低透過Asp之脫水形 成環狀琥珀醯亞胺中間體隨後再異構化成異天冬胺酸酯 而發生的降解。在一些具體例中，位置2 1係經Glu、升 麩胺酸或升半胱胺磺酸取代。在一些特定具體例中，位置 2 1係經Glu取代。 其他修飾 天然騰高血糖素肽之一些位置可經修飾，同時仍維持 母肽的至少一些活性。因此，申請人預期位在位置2、5、 10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、 -53- 201010729 2 8或2 9之位置處的一或多個胺基酸可經不同於天然胰高 血糖素狀中所存在者的胺基酸取代，且仍維持對胰高金糖 素受體的活性。 在一些具體例中，位置1 8係經選自由a 1 a、S e r、或 Thr組成之群之胺基酸取代。在一些具體例中，位置2〇 處之胺基酸係經Ser、Thr、Lys、Arg、〇rn、瓜胺酸或 AIB取代。在一些具體例中，位置2 1係經Glu、升麵胺 酸或升半胱胺績酸取代。在一些具體例中，胰高血糖素肽 包含1至10個選自位置16、17、18、20、2卜23、24、 2 7、2 8及2 9的胺基酸修飾。在範例具體例中，該等修飾 係一或多個選自由 Glnl7、Alai 8、Glu21、Ile23、 Ala24、Val27及Gly29組成之群的胺基酸取代。在一些 具體例中’ 1至2個選自位置17-26之胺基酸不同於母 肽。在其他具體例中’ 1至2個選自位置17-22之胺基酸 不同於母肽。在又其他的具體例中，該等修飾係Glnl7、

Alal8、Glu21、Ile23 及 Ala24。 在一些具體例中，將一或多個胺基酸加成至胰高血糖 素肽之羧基端。胺基酸典型上係選自2〇種常見胺基酸中 之一者，且在一些具體例中，胺基酸具有替代天然胺基酸 之羧酸的醯胺基。在範例具體例中，加成的胺基酸係選自 由麩胺酸及天冬胺酸及甘胺酸組成之群。 其他不會破壞活性的修飾包括W10或R20。 •54- 201010729 在一些具體例中，文中揭示之胰高血糖素肽係經由將 c-端截去一或兩個胺基酸殘基作修飾，但仍維持對胰高 血糖素、GLP-1及/或GIP受體的相似活性及效力。在 此方面，可將位置29及/或28處之胺基酸刪除。 使α螺旋結構穩定化 使胰高血糖素肽之C-端部分（大約胺基酸12-29)中 之α螺旋結構穩定化提供提高的GLP-1及/或GIP活 性，及回復經由位置1及/或2處之胺基酸修飾而降低的 胰高血糖素活性。α螺旋結構可藉由，例如，形成共價或 非共價分子内架橋，或將大約位置12-29處之胺基酸以 使α螺旋穩定的胺基酸（例如，α，α-二取代胺基酸）取代及 /或插入而穩定。 在一些具體例中，在兩個胺基酸側鏈之間形成分子内 架橋，以使胰高血糖素肽之羧基端部分（例如，胺基酸 12-29)的三維結構穩定。兩個胺基酸侧鏈可透過非共價 鍵（例如，氫鍵結）、離子交互作用（諸如形成鹽橋）、或藉 由共價鍵彼此鍵聯。當兩個胺基酸側鏈透過一或多個共價 鍵彼此鍵聯時，該肽在此可被視為包含共價分子内架橋。 當兩個胺基酸側鏈透過非共價鍵（例如，氫鍵、離子交互 作用）彼此鍵聯時，該肽在此可被視為包含非共價分子内 架橋。 -55- 201010729 在一些具體例中，分子内架橋係在隔開3個胺基酸的 兩胺基酸（例如，位置1及丨+ 4處之胺基酸）之間形成，其 中i係在1 2及2 5間的任何整數（例如，J 2、j 3j 4、工5、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、及 25)。更特 疋而3 ’胺基酸對12及16、16及20、20及24或24 及28(其中i = 12、16、20、或24之胺基酸對）之側鏈 彼此鍵聯，因此使胰高血糖素螺旋穩定化。或者，i φ 可為17。 在一些特定具體例中，其中位置i及i + 4處之胺基酸 係藉由分子内架橋結合，連接體之大小係約8個原子，或 約7_9個原子。 在其他具體例中’分子内架橋係在隔開兩個胺基酸的 兩胺基酸（例如，位置j及j + 3處之胺基酸）之間形成，其 中j係在1 2及2 6間的任何整數（例如，j 2、1 3、1 4、1 5、 ❿ 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、及 26)。 在一些特定具體例中，j係17。 在一些特定具體例中’其中位置j及j + 3處之胺基酸 係藉由分子内架橋結合，連接體之大小係約6個原子，或 約5至7個原子。 在又其他的具體例中，分子内架橋係在隔開6個胺基 酸的兩胺基酸（例如，位置k&k + 7處之胺基酸）之間形 成，其中k係在12及22間的任何整數（例如，12、13、 -56 - 201010729 14、15、16、17、18、19、20、21 及 22)。在一些特 定具體例中，k係12、13、或17。在一範例具體例中， k 係 1 7。 可共價鍵結形成六原子鍵聯橋之胺基酸配對的實例 包括Orn與Asp、Glu與式I之胺基酸（其中n為2)、及 升麩胺酸與式I之胺基酸（其中η為丨），其中式I為： Η

Η2Ν-C-COOH 〇 (CH2)n nh2 其中n = 1至4 [式I] 可共價鍵結形成七原子鍵聯橋之胺基酸配對的實例 包括Orn-Glu(内醯胺環）；Lys-Asp(内酿胺）；或 Homoser-Homoglu(内酯）。可形成八原子連接體之胺基 酸配對的實例包括Lys-Glu(内醮胺）；Homolys-Asp(内 酿胺）；Orn-Homoglu(内酿胺）；4-胺基Phe-Asp(内酿 胺）；或Tyr-Asp(内酯）。可形成九原子連接體之胺基酸 配對的實例包括Homolys-Glu(内醯胺）； Lys_Homoglu(内醯胺）；4-胺基Phe-Glu(内醯胺）；或 Tyr-Glu(内酯）。此等胺基酸上之任何侧鏈可額外地經額 外的化學基團取代，只要α-螺旋的三維結構不會遭破壞即 •57- 201010729 可。熟悉技藝人士可設想將可產生類似大小及期望效果之 - 穩定化結構之另類的配對或另類的胺基酸類似物，包括經 化學修飾的衍生物。舉例來說，升半胱胺酸-升半胱胺酸 二硫化物橋係6個原子長度，且可進一步經修飾以提供期 望效果。即使沒有共價鍵聯，上述的胺基酸配對或熟悉技 藝人士可設想的類似配對亦可透過非共價鍵，例如，透過 形成鹽橋或氫鍵結交互作用’而對α_螺旋提供增加的穩定 ❹ 性。 内醯胺環的大小可視胺基酸侧鍵的長度而異，且在一 具體例中，内醯胺係經由使離胺酸胺基酸之側鏈鍵聯至麩 胺酸側鏈而形成。其他的範例具體例包括視情況具有内醯 胺橋的以下配對：位置12處之Glu與位置16處之Lys; 位置I2處之天然Lys與位置16處之Glu ;位置16處之 Glu與位置20處之Lys ;位置16處之Lys與位置20處 〇 之Glu ;位置20處之Glu與位置24處之LyS ;位置20 處之Lys與位置24處之Glu ’位置24處之Glu與位置 28處之Lys ;位置24處之Lys與位置28處之Glu。或 者，内醯胺環中之醯胺鍵的次序可顛倒（例如，内醢胺環 可在Lysl2與GU16或者在Glu 12與Lysl6之側鏈之 間形成）。 可使用除内酿胺橋外之分子内架橋於使胰高血糖素 類似物肽的α螺旋穩定化。在一具體例中，分子内架橋係 -58- 201010729 疏水性橋。在此情況，分子内架橋視情況係位在作為騰高 . 血糖素類似物肽之α螺旋之疏水面之部分的兩胺基酸之 側鏈之間。舉例來說，經由疏水性橋結合的其中一個胺基 酸可係在位置10、14、及18處之胺基酸。 在一特定態樣中，使用晞烴複分解於利用全烴交聯系 統交聯胰高血糖素肽之α螺旋的一或兩匝。此情況中的胰 高血糖素肽可包含帶有不同長度之烯烴側鏈且經組態成 ❹ 具有位於1及i + 4或i + 7位置處之R或s立體化學性的α_ 甲基化胺基酸。舉例來說，烯烴側鏈可包含（CH2)n，其 中η係1至6間之任何整數。在一具體例中，對於8個原 子之交聯長度，η係3。形成此等分子内架橋的適當方法 說明於技藝中。參見’例如’ Schafmeister等人，《/.

Soc. 122: 5891 -5892 (2000)及 Walensky 等 人，心305: 1466-1470 (2004)。或者，胰高血糖 ❿ 素肽可包含位在透過釕催化之閉環複分解作用橋連在一 起之相鄰螺旋匝上的〇_烯丙基Ser殘基❶此等交聯程序 說明於，例如 ’ Blackwell 等人，五ί/. 37: 328 1 -3284 (1 998)中。 在另一特定態樣中’使用非天然的硫·二丙胺酸胺基 酸、經廣泛採用作為胱胺酸之擬肽類的羊毛硫胺酸來交聯 α螺旋之一匝。基於羊毛硫胺酸之環化反應的適當方法係 技藝中所知曉。參見’例如，Matteucci等人，Te/riz/iei/ri)” •59- 201010729 45: 1399-1401 (2 004); Mayer 等人， 5 1: 432-436 (1 998);Polinsky 等人，j. Mei/. C/zew. 35: 41 85-4194 (1992) ; Osapay 等人，j. Mei/. C/?ew. 40:2241-2251 (1997); Fukase 等人，^//^/^^.^^· «/p w · 65: 2227-2240 (1992)，Harpp 等人，j". (9 rg·. C/z e/w. 36. 73-80 (1971)’Goodman 及 Shao，PwreJpp/· c/zew. 68: 1 303-1 308 (1 996);及 Osapay 及 Goodman，*/. Chem. Soc. Chem. Commun. 1 599- 1 600 (1 993)。 在一些具體例中’使用位在位置i及i + 7處之兩Glu 殘基之間的α，ω-二胺基烷繫鏈（例如，1,4-二胺基丙烷及 1，5 -二胺基戊烧）來使騰高血糖素肽之α螺旋穩定化。此等 繫鏈視二胺基烷繫鏈之長度而導致形成長度9個原子或 以上的橋。產生經此等繫鏈交聯之肽的適當方法說明於技 藝中。參見，例如，Phelan等人，《/·火亂1 1 9: 455-460 (1997) 〇 在本發明之又另一具體例中，使用二硫化物橋於交聯 騰尚血糖素狀之(X螺旋的一或兩阻。或者，使用其中一或 兩個硫原子經導致同電子排列巨環化（isosteric macrocyclization)之亞甲基置換的經修飾二硫化物橋於 使胰高血糖素肽之α螺旋穩定化。以二硫化物橋或硫基環 化作用修飾肽的適當方法說明在，例如，Jacks〇η等人， ·/ Jw. C/z㈣心c. 1 13: 93 91-93 92 (1991)及 Rudinger 201010729 A Jost > Experientia 20: 570-571 (1964)中。 在又另一具體例中’胰高血糖素肽之α螺旋係透過藉 由位在i及i + 4之兩個His殘基或His及Cys對結合金 屬原子而穩定化。金屬原子可為，例如，Ru(ni)、Cu(n)、 Zn(II)、或Cd(II)。此等基於金屬結合之a螺旋穩定化的 方法係技藝中所知曉。參見，例如，A n d r e w s及T a b 〇 r， 55: 1 171 1_1 1743 (199 9) ; Ghadiri 等人， ·/· 乂w. C/^所. Soc. 1 12: 163 0-163 2 (1990);及 Ghadiri 專 k ’ J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997) 〇 或者，胰高血糖素肽之oc螺旋可透過其他的肽環化方 式穩定化’該等方式於Davies，J.尸印"心.5cz·· 9: 471-501 (2 003)中作回顧。以螺旋可透過形成醯胺橋、硫 醚橋、硫酯橋、脲橋、胺基曱酸酯橋、績醯胺橋等而穩定 化。舉例來說，可在C-端與Cys殘基之側鏈之間形成硫 酯橋。或者，可透過具有硫醇之胺基酸（Cys)及具有羧酸 之胺基酸（例如，Asp、Glu)之側鏈形成硫酯。在另一方 法中，父聯體，諸如二羧酸，例如检酸（辛二酸）等，可在 胺基酸側鏈之兩官能基（諸如自由胺基、經基、硫醇基、 及其組合）之間引入鍵聯。 根據一具體例，胰高血糖素肽之α螺旋係透過在位置 i及i + 4處加入疏水性胺基酸而穩定化。比方說，丨可為

Tyr及1 + 4可為Val或Leu ; i可為Phe及i + 4可為Cys 201010729 或Met;I可為Cys及i + 4可為Met;或i可為phe及i + 4 可為lie。應明瞭對於此處之目的，以上的胺基酸配對可 顛倒，以致在位置i處之指示胺基酸可替代地位在丨+ 4 處，而i + 4胺基酸可位在丨位置處。 根據本發明之其他具體例，（^^螺旋係透過在胰高血糖 素肽之c-端部分（大約胺基酸12_29)加入（藉由胺基酸取 代或插入）一或多個使α螺旋穩定之胺基酸而穩定化。在一 特疋具體例中，使OC螺旋穩定之胺基酸係α，α •二取代胺基 酸，包括，但不限於，胺基異丁酸（ΑΙΒ)、經選自甲基、 乙基、丙基、及正丁基之相同或不同基團、或經環辛烷或 環庚烧二取代的胺基酸（例如，1_胺基環辛烧_丨_羧酸）中 之任一者。在一些具體例中，胰高血糖素肽之位置16、 17、18、19、20、21、24 或 29 中之一、二、三、四或 更多個經α，α_二取代胺基酸取代。在一特定具體例中， 位置16、20、21、及24中之一、二、三個或全部經α α_ 二取代胺基酸（例如，ΑΙΒ)取代。舉例來說，胰高血糖素 狀可包含在不存在分子内架橋’例如，非共價分子内架橋 (例如’鹽橋）或共價分子内架橋（例如，内醯胺）下之位置 16經ΑΙΒ的取代。此等不含分子内架橋之肽有容易製備 的優點。 根據一些具體例’不含分子内架橋之胰高血糖素肽包 含於胺基酸位置12-29内之一或多個經〜心二取代胺基 •62- 201010729 酸的取代及共價連接至胰高血糖素肽之胺基酸（例如，姨 • 高血糖素肽之位置1G或40處之胺基酸）之側鏈的醯基或 烷基。在特定具體例中，醯基或烷基對於天然產生之胺基 酸係非天然的。在某些態樣中，醯基或烷基對於位置i 〇 處之胺基酸係非天然的。此等不含分子内架橋之經醯化或 烷化的胰高血糖素肽相較於未經醯化的相對肽對GLP_ 1 及胰高血糖素受體呈現提高的活性。對GLPd及胰高血 〇 糖素受體之活性的進一步提高可藉由不含分子内架橋之 經醯化的胰高血糖素肽經由在醯基或烷基與肽之位置 或40處之胺基酸之侧鏈之間加入間隔物而達成。加入或 不加入間隔物之醯化及烷化將進一步說明於文中。 在特定具體例中，經醯化或烷化的胰高血糖素肽或其 類似物進一步包含選擇性地降低對GLP-1受體之活性的 修飾。舉例來說，經醯化或烷化的胰高血糖素肽或其類似 ^ 物包含下列之一者或一組合：C-端a羧酸酯、刪除位置27 ❹ 或28處之胺基酸C-端的胺基酸（例如，刪除位置29處之 胺基酸、刪除位置28及29處之胺基酸）、以大的脂族非 極性胺基酸（例如，lie)取代位置7處之Thr。在一些具體 例中，位置16或位置20係經α，α-二取代胺基酸（例如， ΑΙΒ)取代。在一些具體例中，位置20係經cx，a-二取代胺 基酸（例如，ΑΙΒ)取代。在某些具體例中’位置20係經 α，α-二取代胺基酸（例如，ΑΙΒ)取代’及位置16係經式 • 63- 201010729 ιν之胺基酸取代 H2N——C——COOH CH2)n

I N.

[式 iv] ’ 其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或 2至6、或2或3或4或5, Ri及R2各係獨立地選自由 以下基團組成之群：Η、Ci-C18烷基、（Ci-Cu烷基）〇H、 (C1-C18 烧基）NH2、（Ci-Cig 烧基）SH、（CG-C4 院基） (c3-c6)環烷基、（Cg_c4 烷基）（C2-C5 雜環基）、（Cg_C4 烧基）（c6-c10芳基）r7、及（Cl_c4烷基）（c3-c9雜芳基）， 其中R7係Η或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺 基。在特定具體例中，式IV之胺基酸係2,3-二胺基丙酸 (DAP)、2,4_二胺基丁酸（DAB)、〇rn、Lys 或升 Lys。 位置16處之式胺基酸與α，α-二取代胺基酸之組合有 利地對各胰高血糖素、GLPd、及GIp受體提供改良的 活性。 親水性部分之鍵聯 在另具體例中，文中揭示之胰高血糖素肽的溶解度 係藉由親水性部分對肽的共價鍵聯而提高。親水性部分可 在用於使蛋白質與活化聚合物分子反應的任何適當條件 64· 201010729 下連接至胰高血糖素肽。可對目標化合物上之反應性基團 .(例如’搭、胺基、酉旨、硫醇、心幽乙酿基、順丁蝉二酿 • 亞胺基或肼基）使用技藝中知曉的任何方式，包括透過醯 化、還原烧化、麥可加成_化61祕出〇11)、硫醇烧化 或其他透過在PEG部分上之反應性基團（例如，酸、胺 土酉曰硫醇、α_鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基或肼基） 的化予選擇性共輛/連接方法。可用來將水溶性聚合物鍵 ❹ 聯至一或多個蛋白質的活化基團包括，但不限於，砜、順 丁烯二酿亞胺、鲸基、硫醇、三氟甲績酸醋、三氣乙續酸 醋"丫環丙烧、環氧乙燒、5_0比咬基、及心齒化醯基（例 如’ cx-填乙酸、α-溪乙酸、α_氣乙酸）。若藉由還原炫化 連接至肽，則所選擇之聚合物應具有單一的反應性搭，以 致可控制聚合度。參見，例如，Kinstler等人，3 54: 477_485 (2〇〇2);R〇berts 等人以心 ❹ 〜叹乃心卿少細.54:459-476 (2002) ; AZalipsky 等人，#ν· DrMg 7?ev. 16: 157_182 (1 995)。 在本發明之一特定態樣中，在具有硫醇之胰高血糖素 肽上之胺基酸殘基係經諸如PEG的親水性部分修飾。在 一些具體例中，硫醇係於麥可加成反應中經順丁烯二醯亞 胺·活化PEG修飾，而產生以下所示之包含硫醚鍵聯的經 聚乙二醇化肽： -65- 201010729

在—體例中，贿係於親核s代反應中經_乙醯基_ 活化P E G修傲，&士， 而產生以下所示之包含硫醚鍵聯的經聚 乙二醇化肽：

一適S的親水性部分包括聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇、 聚氧乙基化多το醇（例如’ p〇G)、聚氧乙基化山梨糖醇、 聚氧乙基化㈣糖、聚氧乙基化甘油（pGG)、聚氧伸烧 基、聚乙二醇秘 '乙二醇/丙二醇之共聚物、單甲氧_ 聚乙二醇、單_(Cl_cl〇)烷氧基·或芳氧基-聚乙二醇、羧 曱基纖維素、聚縮醛、聚乙烯醇(pVA)、聚乙烯基吡咯啶 酮、聚_1，3_二卩号卩東、聚-H6-三D号！1山、乙烯/順丁烯二 酸酐共聚物、聚（β-胺基酸均聚物或無規共聚物）、聚（N_ 乙烯基》比咯啶酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物（PPG)及其他 聚氧化烯、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、結腸酸 (colomc acid)或其他多醣聚合物、聚蔗糖（Fic〇u)或聚 葡萄糖及其混合物。 根據一些具體例，親水性部分（例如，聚乙二醇鏈）具 有選自約500至約40,〇〇〇道耳吞之範圍的分子量。在一 • 66 - 201010729 具體例中’親水性部分（例如，PEG)具有選自約5〇〇至約 * 5,000道耳吞’或約I。00至約5，_道耳吞之範圍的分 子量。在另一具體例中，親水性部分（例如，PEG)且有約 HMOOBmGGG道耳吞之分子量。在又其他的範例且 體例中，親水性部分（例如，PEG)具有約2〇，_至約 40,000道耳吞之分子量。 在一具體例中，使用聚葡萄糖作為親水性部分。聚葡 ❿ 萄糖係主要經由α1·6鍵聯連接之葡萄糖子單元的多醣聚 合物。聚㈣糖可以許多分子量範圍取得，例如，約i kD 至約 l〇〇kD，或約 5、1〇、15或2〇1^至約2〇3〇、 40、50、60、70、80 或 90 kD。 涵蓋線性或分支鏈聚合物。所得的結合物之製劑基本 上可為單分散或多分散，且可具有每個肽約、 12、1.5或2個聚合物部分。 ❿ 在一具體例中，親水性部分係聚乙二醇（pEG)鏈，其 視情況鍵聯至位置16、17、21、24、29 之 位置（例如…、3卜32、33、34、35、36=伸3内8之 3 9)、或C-端胺基酸（例如，40)中之一或多處的肽。在一 些具體例中’該位置處之天然胺基酸係經具有適合於與親 水性部分交聯之側鏈的胺基酸取代，以利於親水性部分鍵 聯至肽。在範例具體例中，該位置處之天然胺基酸係經 Lys、cys、〇rn、升半胱胺酸、或乙醯基_苯丙胺酸殘基 -67- 201010729 取代。在其他具體例中，將經修飾成包含親水性基團的胺 基酸加成至肽的c-端。 ' 其他提高溶解度的修飾 在另一具體例中，任何胰高血糖素肽之溶解度可藉由 將帶電胺基酸引入至肽之C-端部分（較佳係在SEQ ID NO: 1之位置27 C-端之位置處）的胺基酸取代及/或加 ▲ 成而改良。視情況，可將一、二或三個帶電胺基酸引入 C-端部分内，較佳係位置27之C-端。在一些具體例中， 位置28及/或29處之天然胺基酸係經一或兩個帶電胺 基酸取代，及/或在再一具體例中，亦將一至三個帶電胺 基酸加成至肽之C -端。在範例具體例中，帶電胺基酸中 的一個、兩個或全部係帶負電。在一些具體例中，帶負電 (酸性胺基酸）係天冬胺酸或糙胺酸。 可對胰高血糖素肽進行仍使其可保留GIP活性（及視 ® 情況GLP-1活性及/或胰高血糖素活性）之額外的修飾 (例如，保留性取代）。 結合物及融合物 本揭示案亦涵蓋其中本發明之胰高血糖素肽視情況 透過共價鍵結及視情況透過連接體鍵聯至結合物部分的 其他結合物。鍵聯可藉由共價化學鍵、物理力諸如靜電、 -68- 201010729 氫離子、凡得瓦（van der Waals)、或疏水性或親水性 . &互作用完成°可使用各種非共價偶合系統，包括生物素 • 抗生物素蛋白質（avidin)、配體/受體、酵素/基質、 核酸/核酸結合蛋白、脂質/脂質結合蛋白、細胞黏附分 子伴體；或對於彼此具有親和力的其之任何結合伴體或片 段。 肽可經由使肽之目標胺基酸殘基與可與此等目標胺 ® 基酸之N-或C-端殘基之選定側鏈反應之有機衍生化試劑 而透過直接共價鍵聯連接至結合物部分。肽或結合物上之 反應性基團包括，例如，醛、胺基 '酯、硫醇、α_鹵乙醯 基、順丁稀二醯亞胺基或肼基。衍生化試劑包括，例如， 順丁烯二醯亞胺苯甲醯基磺酸琥珀醯亞胺酯（透過半胱胺 酸殘基結合）、Ν-羥基琥珀醯亞胺（透過離胺酸殘基）、戊 一路、號珀酸酐或其他技藝中知曉之試劑。或者，結合物 ❹ 部分可間接地透過中間載體（諸如多醣或多肽載體）鍵聯 至肽。多酶載體的實例包括胺基聚葡萄糖。合適多肽載體 的實例包括聚離胺酸、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、其之共聚 物、及此等胺基酸與其他胺基酸（例如，絲胺酸）之混合聚 合物’以在所得負載載體上賦予期望的溶解度性質。 半胱胺酸基殘基最常與α_鹵乙酸酯（及相應的胺），諸 如氯乙酸、氣乙醯胺反應，而產生羧曱基或羧醯胺曱基衍 生物。半胱胺酸基殘基亦經由與以下物質反應而衍生化： -69· 201010729 溴三氟丙酮、α-溴-β-(5·亞胺醯基）丙酸、氣乙醯基磷酸 酯、Ν-燒基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-°比啶二硫、甲基 2-吡啶二硫、對氯汞苯甲酸鹽、2_氯汞-4-硝基酚、或氯 -7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑。 組胺酸基殘基係經由在pH 5.5 -7.0下與焦碳酸二乙 酯反應而衍生化’因此試劑對組胺酸基侧鏈相當具特異 性。亦可使用對溴苯曱醯基溴甲烷；此反應較佳係在〇. i Μ二甲胂酸納中在pH 6.0下進行。 離胺酸基及胺基封端殘基係與玻珀酸酐或其他叛酸 酐反應。用此等試劑衍生化有逆轉離胺酸基殘基的效果。 用於衍生化含α-胺基之殘基的其他適當試劑包括亞胺酯 諸如0比唆甲酿亞胺酸甲酯、吼哆藤磷酸、e比哆搭、氯蝴氫 化物、三硝基苯磺酸、〇 -甲基異脲、2,4 -戊二酮、及利用 乙醛酸酯的轉胺酶催化反應。 精胺酸基殘基係經由與一或數種習知試劑反應而修 飾’其中包括本基乙二路、2,3_ 丁二酮、ι，2 -環己烧二_、 及茚三酮。由於胍官能基之高pKa，因而精胺酸殘基之衍 生化需要反應在驗性條件下進行。再者，此等試劑可與離 胺酸以及精胺酸ε -胺基之基團反應。 酪胺酸基殘基之特定修飾可特別重要地在於經由與 芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入至酪 胺酸基殘基中而進行。最常分別使用N-乙醯基咪唑及四 201010729 硝基曱烷於形成0-乙醯基酪胺酸基物種及3_硝基衍生 物。 . 羧基側基（天冬胺酸基或麩胺酸基）係經由與碳二醯亞 胺（11-：^.仙(1.(：.心(1.^，）反應而選擇性地經修飾，其中 R及R’係不同烷基，諸如丨_環己基_3_(2_昧啉基_4乙基) 碳二醯亞胺或1-乙基·3_ (4-氮陽離子_4,4_二曱基戊基） 碳二醯亞胺。此外，天冬胺酸基及麩胺酸基殘基係經由與 ❿ 銨離子反應而轉變為天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基。 其他的修飾包括脯胺酸及離胺酸之經基化，絲胺酸基 或經丁胺醯基殘基之羥基的磷酸化，離胺酸、精胺酸、及 組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化（τ. Ε. Creighton，蛋白 質.結構及分子性質（Proteins: Structure and

Molecular Properties)，w.H. Freeman & Co.，San

Francisco ’ 79-86頁（1983)) ’天冬醯胺酸或麵醯胺酸之 ©脫醯胺，N-端胺之乙醯化，及/或C_端羧酸基之醯胺化 或醋化。 另一類型的共價修飾涉及將醣苷化學或酵素偶合至 肽。糖可連接至（a)精胺酸及組胺酸，（b)自由羧基， 自由疏基諸如半胱胺酸之彼等，（d)自由羥基諸如絲胺 酸、蘇胺酸、或羥基脯胺酸之彼等，（e)芳族殘基諸如酪 胺酸、或色胺酸之彼等，或（f)麩醯胺酸之醯胺基。此等 方法說明於1987年9月11日公告之W087/05330中， •71 - 201010729 及於 Aplin 及 Wriston，crc Crit. Rev. Biochem.， 259-306 頁（1981)中。 可鍵聯至文中說明之任何胰高血糖素肽的範例結合 物部分包括’但不限於，異源（heterolog〇us)肽或多肽（包 括’例如’血漿蛋白）、標靶試劑、免疫球蛋白或其之部 分（例如’可變區域、CDR、或Fc區域）、診斷標記諸如 放射性同位素、螢光團或酵素標記、包括水溶性聚合物的 聚合物、或其他治療或診斷試劑。在一具體例中，提供一 種包含本發明之胰高血糖素肽及血漿蛋白的結合物，其中 該血漿蛋白係選自由白蛋白、轉鐵素（transferin)、纖維 蛋白原及球蛋白所組成之群。 在一些具體例中，連接體包含自1至約60、或1至 30個原子或更長、2至5個原子、2至1〇個原子、5至 10個原子、或1〇至20個原子長的原子鏈。在一些具體 例中’鏈原子皆為破原子。在一些具體例中，連接體之主 鏈中的鏈原子係選自由C、Ο、N、及s所組成之群。鏈 原子及連接體可根據其之期望溶解度（親水性）作選擇，以 k供更可溶的結合物。在一些具體例中，連接體提供會因 存在於標的組織或器官或細胞中之酵素或其他催化劑或 水解條件而分裂的官能基。在一些具體例中，連接體的長 度夠長而可降低位阻（steric hindrance)的可能性。如連 接體為共價鍵或肽基鍵且結合物為多肽，則整個結合物可 -72· 201010729 為融合蛋白。此等肽基連接體可為任何長度。範例連接體 • 的長度係自約1至50個胺基酸，5至50、3至5、5至 1〇、5至15、或1〇至30個胺基酸長度。另一種方式為 此專融0蛋白可藉由熟悉技藝人士已知的重組基因工程 方法製得。 如則所指，在一些具體例中，胰高血糖素肽係結合（例 如’融合）至免疫球蛋白或其之部分（例如，可變區域、 〇 CDR、或Fc區域）。已知的免疫球蛋白（Ig)類型包括

JgG、IgA、IgE、IgD 或 IgM。Fc 區域係 ig 重鏈之 c_ 端區域，其負責結合至執行諸如再循環（其導致延長的半 衰期）、抗體依賴型細胞介導的細胞毒性（ADCC)、及補 體依賴型細胞毒性（CDC)之活動的Fc受體。 舉例來說，根據一些定義，人類IgG重鏈Fc區域自 Cys226拉伸至重鏈之C-端。「絞鏈區（hinge region)」 一般自人類1gGl之Glu216延伸至Pr〇230(其他IgG同 〇 型（isotype)之絞鏈區可經由使參與半胱胺酸鍵結之半胱 胺酸對準而與IgGl序列對準）。lgG之Fc區域包括兩個 恒定域，CH2及CH3。人類IgG Fc區域之CH2域通常 自胺基酸231延伸至胺基酸341。人類lgG Fc區域之 CH3域通常自胺基酸3 42延伸至447。關於免疫球蛋白 或免疫球蛋白片段、或區域之胺基酸編號的指示皆係根據 Kabat等人1991 ’重要免疫學蛋白質之序列（Sequences -73- 201010729 of Proteins of Immunological Interest)，美國公共衛 生咅P(U.S. Department of Public Health) ， Bethesda，

Md。在一相關具體例中，Fc區域可包含來自免疫球蛋白 重鏈之除CH1外之一或多個天然或經修飾恒定區域，例 如，IgG及IgA之CH2及CH3區域、或igE之CH3及 CH4區域。 適當的結合物部分包括免疫球蛋白序列之包含FcRn 結合位點的部分。FcRn(—種救援受體（salvage receptor))係負責再循環免疫球蛋白及將其送回至血液 循環。結合至FcRn受體之IgG之Fc部分的區域已基於 X-射線晶體學作描述（Burmeister等人1994，Nature 372:379)。Fc與FcRn之主要接觸區域係接近CH2與 CH3域之接點。Fc-FcRn接觸皆係在單一 ig重鏈内。主 要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、 272、285、288、290-291、308-311、及 314 及 CH3 域之胺基酸殘基385-387、428、及433-436。 一些結合物部分可包括或不包括FqR結合位點。 FcyR係負責ADCC及CDC。Fc區域内與FcyR直接接 觸之位置的實例為胺基酸234-239(下方絞鏈區）、胺基酸 265-269(B/C環路）、胺基酸297-299(C’/E環路）、及胺 基酸 327-332(卩/〇)環路（8〇11461>111&1111等人卞&11^6 406: 26 7-2 73，2000)。IgE之下方絞鏈區亦牽連FcRI結合 -74- 201010729 (Henry 等人，Biochemistry 36, 15568.15578, 1997)。

/步及IgA受體結合的殘基說明於Lewis等人，（J

Immunol. 175:6694-701 ’ 2005)。涉及 IgE 受體結合 的胺基酸殘基說明於Sayers等人（j Biol Chem. 279(34):35320-5，2004)。 可對免疫球蛋白之Fc區域進行胺基酸修飾。此等變 異Fc區域包含在Fc區域之CH3域（殘基3 42-447)中之 至少一個胺基酸修飾及/或在Fc區域之CH2域（殘基 231 ―341)中之至少一個胺基酸修飾。咸信可賦予對FcRn 之增加親和力的突變包括T256A、T307A、E380A、及 N434A (Shields 等人 2001，J. Biol. Chem. 276:6591)。其他突變可降低Fc區域對FcyRI、 FcyRIIA、FcyRIIB、及/或 FcyRIIIA 之結合，而不會 顯著地降低對F cRn之親和力。舉例來說，fc區域之位 置297處之Asn經Ala或另一胺基酸取代移除高度保留 性N-糖化作用位點，且可導致降低的免疫性與伴隨的 區域之延長半衰期，以及對FcyRs的降低結合 (Routledge 等人 1995，Transplantation 60:847 ; Friend 等人 1999，Transplantation 68:1632 ; Shields 等人 1995 ’ J. Biol. Chem. 276:6591)。已對 igGl 之 位置233-236處進行降低對FcyRs之結合的胺基酸修飾 (Ward 及 Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2:77 -75- 201010729 及 Armour 等人 1999，Eur. J· Immunol. 29:2613)。 一些範例的胺基酸取代說明於美國專利7,355,〇〇8及 7，381，408中，將其各者之全體内容以引用的方式併入本 文中。

本揭示案亦涵蓋胰高血糖素融合肽或蛋白質，其中第 一個肽或多狀經融合至騰南血糖素肽之終端（例如，敌基 端）。在一些具體例中，加成至胰高血糖素肽之羧基端的 第二個肽係鍵聯至胰高血糖素肽之胺基酸29的SEQ ID NO: 95 (GPSSGAPPPS)^SEQIDNO: 97 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 98 (KRNR)。在其他具體例中，第二個 狀係 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96)，其中 X 係選 自20種常見胺基酸中之一者’例如，楚胺酸、天冬胺酸 或甘胺酸。在一具體例中，X代表例如Cys之胺基酸， 其進一步包含共價鍵聯至該胺基酸之侧鏈的親水性部 分。此等C-端延伸改良溶解度且亦可改良Gip或glP-1 活性。在一些具體例中’其中該胰高血糖素肽進一步包含 叛基端延伸，該延伸之羧基端胺基酸終止於醯胺基或酯基 而非羧酸。 在一些具體例中，例如’在包含C-端延伸之胰高血糖 素肽中’在天然胰高血糖素肽之位置29處的蘇胺酸經甘 胺酸取代。舉例來說’具有在位置29處對蘇胺酸之甘胺 酸取代且包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)之C-端 •76- 201010729 延伸的胰高血糖素肽對glp-1受體之效力為經修飾成包 • 含相同C-端延伸之天然胰高血糖素的四倍。此T29G取 . 代可與文中揭示之其他修飾結合使用，而增進胰高血糖素 肽對GLP-1受體之親和力。舉例來說，丁29(^取代可與 S16E及N20K胺基酸取代組合，視情況與胺基酸16及 20間之内醯胺橋，及視情況與加成如文中所述之peg鏈 組合。 φ 在一些具體例中，將一胺基酸加成至C -端，且該額外 的胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及甘胺酸組成之群。 本揭示案亦涵蓋文中揭示之經修飾胰高血糖素肽的 多聚體。兩個或兩個以上的經修飾胰高血糖素肽可使用熟 悉技藝人士已知之標準的鍵聯劑及程序鍵聯在一起。舉例 來說，可透過使用雙官能硫醇交聯體及雙官能胺交聯體在 兩個經修飾胰高血糖素肽之間形成二聚體，尤其係對於經 胱賴、離胺酸、鳥親、升半胱胺酸或乙醯基苯丙胺 酸殘基取代的姨高血糖素狀而言。 醢化及烷化 根據-些具體例’文中揭示之胰高血糖素肽係經修飾 成包含醯基或烷基，例如，對天然產生之胺基酸為非天然 的醯基或縣。㈣纽化可提高胰高血糖素肽於循環中、 之半衰期。醯化或烧化可有利地延遲對胰高域素及义、 GLP]受體之作用的開始及/歧長作用期間及 ^ •77· 201010729 良對諸如DPP-IV之蛋白酶的抗性及/或改良溶解度。於 酿化後可維持胰高血糖素肽對胰高血糖素及/或GLP-1 . 及/或GIP受體的活性。在一些具體例中，經醯化之胰 南血糖素肽的效力與未經醯化形式的胰高血糖素肽相 當。在另類的具體例中’經醯化之胰高血糖素肽的效力較 未經醯化形式的胰高血糖素肽提高。 在一些具體例中，本發明提供一種經修飾成包含共價 Ο 鍵聯至胰高血糖素肽之位置ίο處之胺基酸之醯基或烷基 的胰兩血糖素肽。此胰高血糖素肽可進一步包含位於胰高 灰糖素肽之位置10處之胺基酸與醯基或烷基之間的間隔 物。在一些具體例中，醯基係脂肪酸或膽汁酸、或其鹽， 例如，C4至C3 0脂肪酸、C8至C24脂肪酸、膽酸、C4 至C30燒基、C8至C24烧基、或包含膽汁酸之類固醇部 分的燒基。間隔物係任何具有用於連接醯基或烷基之適當 ❹反應性基團的部分。在範例具體例中，間隔物包含胺基 酸、二肽、三肽、親水性雙官能、或疏水性雙官能間隔物。 在一些具體例中，間隔物係選自由以下組成之群：Trp、

Glu、Asp、cys 及包含 NH2(CH2CH20)n(CH2)mc〇〇H 之間隔物，其中m係1至6之任何整數及n係2至i2之 任何整數。此等經醯化或烷化之胰高血糖素肽亦可進一步 包含親水性部分’視情況為聚乙二醇。任何前述的胰高丘 糖素肽可包含兩個醯基或兩個烷基、或其之組合。 -78 - 201010729 酿化可在胰高血糖素肽内之任何位置，包括位置 i_29:C-端延伸内之位置、或N-或C·端胺基酸之任一者 處進^ ’其限制條件為GiP活性（及視情況GLP-1及/ 或胰间血糖素活性）若未經提高的話，係經維持。醯化可， 4如表生在任何加成至姨高血糖素序列（seq ID Ν〇· !) 的胺基酸4例如’在N_4 c•端。非限制性實例包括胰 高血糖素肽的位置

17、18、19、20、21、24、27、28、29 3〇、3132、 33 34、35'36、37、38、39、40、41、42、43、44、 47 48、49、或50°醯基可直接共價鍵聯至騰 高A糖素肽的胺基酸，或透過間隔物間接共價鍵聯至姨高 企糖素肽的胺基酸，其中該間隔物係位於騰高金糖素狀之 胺基酸與醯基之間。胰高血糖素肽可在鍵聯親水性部分的 相同胺基酸位置處’或在不同胺基酸位置處醯化。非限制 性實例包括在騰高血糖素肽之位置1〇或位置4〇處之醯 化及在C-端部分中之一或多個位置（例如，位置24、 或29、在C_端延伸内或在匕端（例如，透過加成〇端 Cys))處的聚乙二醇化。 在一些具體例中，胰高血糖素肽係經修飾成包含在 SEQ ID NO: 1之胰高血糖素肽或其類似物c端之約工 至約2!個胺基酸的延伸，且該延伸之至少一個胺基酸經 醯化或烷化。舉例來說，經修飾的胰高血糖素肽可包含在 -79- 201010729 SEQ ID NO. 1之胰高血糖素肽或其類似物之位置μ處 . 之胺基酸C·端之約1至約21個胺基酸的延伸。或者，如 • 冑高血糖素肽或其類似物經截去-或兩個胺基酸，則約! 至約21個胺基酸之延伸可係在胰高企糖素狀或其類似物 之位置27或28處之胺基酸的C-端。因此，在c_端延伸 内之經醯化魏化之胺基酸可係，例如，在C·端延伸騰 高血糖素肽之位置28、29、3〇、31、32、33、34、35、 〇 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48 49、或50處的任何胺基酸。在一些具體例中，c_ 端延伸包含SEQ ID NO: 95或96之胺基酸序列。在一 些具體例中，騰高血糖素肽包括含有SEq ID N〇: 95之 胺基酸序列及位在SEQ ID NO: 95之C·端處之1至u 個額外胺基酸的C-端延伸，該額外胺基酸係如文中所述 經醯化或烷化。在特定具體例中，經醯化或烷化之胺基酸 ⑩ 係Dab、〇rn、Lys、或升Lys殘基，且係位在C_端延伸 胰高jk糖素肽或其類似物的位置4〇處。 根據一具體例’肤局血糖素狀係經修飾成包含透過 醋 '硫酯、或醯胺鍵聯連接至胰高血糖素肽之醯基，以延 長於循環中之半衰期及/或延遲作用的開始及/或延長 作用期間及/或改良對諸如DPP-IV之蛋白酶的抗性。 在本發明之一特定態樣中，胰高血糖素肽係經由直接 醯化胰高血糖素肽之胺基酸之側鏈的胺、羥基、或硫醇， 201010729 而經修飾成包含酿基。在一些具體例中，胰高血糖素肽係 透過胺基酸之側鏈胺、羥基、或硫醇直接醯化。在一些具 體例中，醯化係在位置10、20、24、29、或40處。在 此方面，經醯化的胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO : 1 之胺基酸序列，或其之包含文中所述之一或多個胺基酸修 飾的經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24、29、及 40處之至少一胺基酸經修飾成包含侧鏈胺、羥基、或硫 醇之任何胺基酸。在本發明之一些特定具體例中，胰高血 糖素肽的直接醢化係透過位置1 0或4 0處之胺基酸的侧 鏈胺、羥基、或硫醇發生。 在一些具體例中’包含側鏈胺之胺基酸係式I之胺基 酸： Η

Η2Ν-C-COOH I CH2)n

I ❹ nh2 其中n = l至4 [式I] 在一些範例具體例中，式I之胺基酸係其中n為4(Lys) 或η為3(〇rn)之胺基酸。 在其他具體例中’包含側鏈羥基之胺基酸係式π之胺 基酸： 201010729 Η Η2Ν-C-COO Η CH2)n

I

OH 其中n=l至4 [式Π] 在一些範例具體例中，式II之胺基酸係其中η為^Ser) 之胺基酸。 © 在又其他的具體例中，包含側鏈硫醇之胺基酸係式 III之胺基酸： Η

Η2Ν-C-COOH

I (CH2)n

I

SH 其中n=l至4 [式 III] 在一些範例具體例中，式Π之胺基酸係其中n為1(cys) 之胺基酸。 在又其他的具體例中，包含侧鏈胺、羥基、或硫醇之 胺基酸係包含式I、式II、或式III之相同結構的二取代 胺基酸，僅除了鍵結至式I、式Π、或式ΠΙ之胺基酸之 0C石反的虱係經第二侦侧鍵取代。 在本發明之一具體例中，經酿化之胰高企糖素肽包含 位於肽與醯基之間的間隔物。在一些具體例中，胰高血糖 -82- 201010729 素狀係共價鍵結至間隔物，該間隔物再共價鍵結至醯基。 . 間隔物所連接之胺基酸可係任何包含允許鍵聯至間 • 隔物之部分的胺基酸（例如，經單一或雙重α -取代之胺基 酸）。舉例來說，包含側鏈ΝΗ2、-ΟΗ、.或-COOH之胺 基酸（例如，Lys、Orn、Ser、Asp、或Glu)為適當。在 此方面，經醯化之胰高血糖素肽可包含Seq id NO : 1 之胺基酸序列，或其之包含文中所述之一或多個胺基酸修 ❹ 飾的經修飾胺基酸序列.，其中位置10、20、24、29、及 4 0處之至少一胺基酸經修飾成包含側鏈胺、經基、或叛 酸酯之任何胺基酸。 在一些具體例中’間隔物係包含側鏈胺、羥基、或硫 醇之胺基酸，或包括含有側鏈胺、羥基、或硫醇之胺基酸 的二肽或三肽。 當透過間隔物之胺基發生酿化時，酿化可透過胺基酸 之α胺或側鏈胺發生。在其中α胺經醯化的情況中，間隔 11 物胺基酸可為任何胺基酸。舉例來說，間隔物胺基酸可為 疏水性胺基酸，例如，G1 y、A1 a、V a 1、L e u、11 e、T r ρ、 Met、Phe、Tyr、6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚 酸、及8 -胺基辛酸。或者，間隔物胺基酸可為酸性殘基， 例如，A s p及G1 u。 在其中間隔物胺基酸之侧鏈胺經醯化的情況中，間隔 物胺基酸係包含側鍵胺之胺基酸，例如，式I之胺基酸（例 -83- 201010729 如’ Lys或〇rn)。在此情況，α胺及間隔物胺基酸之侧鏈 - 胺兩者可皆經酿化，以致胰高血糖素肽經二醯化。本發明 之具體例包括此等經二醯化之分子。 當酿化係透過間隔物之經基發生時，胺基酸或二肽或 二肽之其中一個胺基酸可為式II之胺基酸。在一特定範 例具體例中，胺基酸係Ser。 當醯化係透過間隔物之硫醇基發生時，胺基酸或二肽 〇 或三肽之其中一個胺基酸可為式III之胺基酸。在一特定 範例具體例中，胺基酸係Cy S。 在一些具體例中，間隔物係親水性雙官能間隔物。在 某些具體例中，親水性雙官能間隔物包含兩個或兩個以上 的反應性基團，例如，胺、羥基、硫醇 '及羧基或其之任 何組合。在某些具體例中，親水性雙官能間隔物包含經基 及羧酸酯。在其他具體例中，親水性雙官能間隔物包含胺 ❹ &及叛酸S旨。在其他具體例中，親水性雙官能間隔物包含 硫醇基及㈣醋。在特定具體例中，間隔物包含胺基聚（烧 氧基）羧酸酯。在此方面，間隔物可包含，例如， NH2(CH2CH2〇)n(CH2)mC〇〇H，其中 m 係！至 6 之任 何整數及η係2至12之任何整數，諸如，比方說，8_胺 基·3,6·二氧雜钱，其可購自心·^』，

Inc. (Louisville，KY)。 在些具體例中，間隔物係疏水性雙官能間隔物。疏 -84 - 201010729

水性雙官能間隔物係技藝中所知曉。參見，例如，立粉，结 合物技術（Bioconjugate Techniques)，Q,飞 Hermanson (Academic Press, San Diego, 〇A 1996)，將其全體内容以引用的方式併入本文中。在某些 具體例中，疏水性雙官能間隔物包含兩個或兩個以上的反 應性基團，例如，胺、羥基、硫醇、及羧基或其之任何組 合。在某些具體例中，疏水性雙官能間隔物包含羥基及羧 酸酯。在其他具體例中，疏水性雙官能間隔物包含胺基及 缓酸酯。纟其他具體例中，疏水性雙官能間隔物包含硫醇 基及羧酸酯。技藝中知曉包含羧酸酯、及羥基或硫醇基之 適當的疏水性雙官能間隔物，且其包括，例如，8_經基辛 酸及8 -疏基辛酸。 •在一些具體例中，雙官能間隔物不為在㈣醋基之間 匕3 1 7個<原子之未分支鏈亞甲基的二賴。在一些具 :例中，雙官能間隔物係在羧酸酯基之間包含Μ個碳原 子之未分支鏈亞甲基的二羧酸。 在特定具體例中之間隔物（例如，胺基酸、二肽、三 二水性雙官能、或疏水性雙官能間隔物)係3至1〇 ^子（例如，6至1G個原子)(例如，6、7、8、9、或 10個在更特定的具體例中’間隔物係約3至

Cl8月1肽1 ’6至10個原子）長度，及酿基係、C12至 曰酿基，例如，C14脂肪酿基、⑴脂㈣基， •85· 201010729 以致間隔物及醯基之總長度係14至28個原子 約 “、15、16、U、18、19、20、21、22、;3: I5二27、或28個原子。在-些具體例中，間隔物及 酿基之長度係17至28(例如，19至26、19至2D個原 子0

根據某些前述具體例，雙官能間隔物可為包含3至W 個原子長度之胺基酸主鏈的合成或天然產生之胺基酸（包 括，但不限於，任何文中所述者）（例如，L胺基己酸、^ 胺基戊酸、7-胺基庚酸、及8_胺基辛酸）。或者，間隔物 可為具有3至1〇個原子（例如，6至1〇個原子）長度之肽 主鏈的二肽或三肽間隔物。二肽或三肽間隔物的各胺基酸 可與一肽或二肽的其他胺基酸相同或不同，且可獨立地選 自由下列組成之群：天然產生及/或非天然產生之胺基 酸’包括’例如’天然產生胺基酸（Ala、Cys、Asp、Giu、 P h e G1 y、H i s、11 e、L y s、L e u、M e t、A s η、P r ο、 Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)之任何的 D 或 L· 異構 物’或選自由下列組成之群之非天然產生胺基酸之任何的 D或L異構物：β-丙胺酸（β — Ala)、Ν-α-甲基-丙胺酸 (Me-Ala)、胺基丁酸（Abu)、γ-胺基丁酸（γ-Abu)、胺基 己酸（ε - Ahx)、胺基異丁酸（Aib)、胺甲基吡咯羧酸、胺 基哌啶羧酸、胺基絲胺酸（Ams)、胺基四氫哌喃-4-羧酸、 精胺酸N-曱氧-N-曱基醯胺、β-天冬胺酸（β-Asp)、三亞 -86- 201010729 甲亞胺羧酸、3-(2 -苯并噻唑基）丙胺酸、α_第三丁基甘胺 酸、2·胺基脲基-正戊酸（瓜胺酸，Cit)、β·環己基丙 胺酸（Cha)、乙醯胺甲基半胱胺酸、二胺基丁酸（Dab)、 二胺基丙酸（Dpr)、二羥苯基丙胺酸（DOPA)、二甲基噻 唑啶(DMTA)、γ-麩胺酸(γ-Glu)、升絲胺酸(Hse)、羥基 脯胺酸（Hyp)、異白胺酸N-甲氧·Ν-曱基醯胺、曱基-異 白胺酸（Melle)、異六氫菸鹼酸（isn)、甲基·白胺酸 ❹ （MeLeu)、甲基-離胺酸、二曱基-離胺酸、三曱基·離胺 酸、曱橋脯胺酸、曱硫胺酸-亞颯（Met(O))、甲硫胺酸-砜（Met(〇2))、正白胺酸（Nle)、甲基-正白胺酸 (Me-Nle)、正纈胺酸（Nva)、鳥胺酸（Orn)、對胺基苯甲 酸（PABA)、青黴胺（peil)、曱基苯丙胺酸（MePhe)、4-氯苯丙胺酸（Phe(4-Cl))、4-氟苯丙胺酸（Phe(4-F))、4· 硝基苯丙胺酸（Phe(4-N02))、4-氰基苯丙胺酸 (Phe(4-CN))、苯基甘胺酸（phg)、哌啶基丙胺酸、哌啶 ❹ 基甘胺酸、3,4-去氫脯胺酸、吡咯啶基丙胺酸、肌胺酸 (Sar)、硒半胱胺酸（sec)、〇-苄基-磷絲胺酸、4-胺基-3-羥基-6-甲基庚酸（Sta)、4-胺基-5-環己基-3-羥基戊酸 (ACHPA)、4_胺基-3-羥基-5-苯基戊酸（AHPPA)、 1，2,3,4 -四氫異喹琳-3-叛酸（Tic)、四氫旅喃甘胺酸、售 吩基丙胺酸（Thi)、0-苄基-磷酪胺酸、〇-磷酪胺酸、曱 氧酪胺酸、乙氧酪胺酸、〇_(雙-二曱胺基_膦酸基）_酪胺 • 87 - 201010729 酸、酪胺酸硫酸酯四丁胺、甲基·纈胺酸（MeVa丨）、及烷 化3-毓基丙酸。 在一些具體例中，間隔物包含總體負電荷，例如，包 含一或兩個帶負電胺基酸。在一些具體例中，二肽不為任 何一般結構A-B之二肽，其中A係選自由Gly、Gln、

Ala、Arg、Asp、Asn、lie、Leu、Va卜 Phe、及 Pro 組成之群，其中B係選自由Lys、His、Trp組成之群。 在一些具體例中，二肽間隔物係選自由以下組成之群：

Ala-Ala、β-Ala- β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-胺基 丁酸-γ-胺基丁酸、及 γ-Glu- γ-Glu。 在一些範例具體例中，姨高血糖素肽係經由將間隔物 之胺、羥基、或硫醇醯化而經修飾成包含醯基，該間隔物 係連接至騰高血糖素肽之位置1〇、2〇、24、29、或40 處之胺基酸、或C-端胺基酸之側鏈。 在又更特定的具體例中，醯基係連接至胰高血糖素肽 之位置10或40處之胺基酸，且視情況，間隔物及醯基 之長度係1 4至2 8個原子。在一些態樣中，位置1 〇或4 〇 處之胺基酸係式I之胺基酸’例如，L y s，或與式I相關 的二取代胺基酸。在更特定的具體例中，胰高血糖素肽不 含分子内架橋，例如，共價分子内架橋。胰高血糖素肽， 例如’可為包含一或多個α,α_二取代胺基酸（例如，AIB) 之肽’以使肽之α螺旋穩定。如文中所示，此等包含共價 •88- 201010729 連接至位置40處之胺基酸之側鏈之醯化間隔物的肽對 GIP、GLP-1、及胰高血糖素受體呈現提高的效力。 透過胺、羥基、及硫醇之肽醯化的適當方法係技藝中 所知曉。參見，例如，Miller，及ei Cowwww 2 1 8: 377-3 82 (1 996)，實施例 19(關於透過胺 醯化之方法）；Shimohigashi 及 Stammer，/«/«/ Pepi /Voiezw Λα 19: 54-62 (1982);及 Previero 等人， ❹ jcia 263 : 7-1 3 ( 1 972)(關於透過經 基酿化之方法）；及San及Silvius，《/尸epi 66: 169- 1 80 (2005)(關於透過硫醇醯化之方法）； CAew.「蛋白質之化學修飾：歷史及應用 (Chemical Modifications of Proteins: History and Applications)」，1、2-12 頁（1990); Hash imoto 等人， Pharmacuetical Res. 「胰島素之棕櫊醯基衍生物之合 成及其生物活性（Synthesis of Palmitoyl Derivatives w of Insulin and their Biological Activity)」第 6 冊， No: 2，171-176 頁（1 989)。 經酿化胰高血糖素肽之醯基可為任何大小，例如，任 何長度碳鏈，且可為直鍵或分支鏈。在本發明之一些特定 具體例中，醯基為C4至C30脂肪酸。舉例來說，醯基可 為C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12 脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20 -89- 201010729 脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28 . 脂肪酸、或C3〇脂肪酸中之任一者。在一些具體例中， 酿基係C 8至C 2 0脂肪酸，例如，c 1 4脂肪酸或C 1 6脂 肪酸。 在另一具體例中，醯基係膽汁酸。膽汁酸可為任何適 合的膽汁酸，包括’但不限於，膽酸、鵝去氧膽酸、去氧 膽酸、石膽酸、牛膽酸、甘膽酸、及膽固酵酸。 瘳 在本發明之一些具體例中，胰高血糖素肽係經由利用 胰高血糖素肽醯化長鏈烷而經修飾成包含醯基。在特定態 樣中，長鏈烷包含與胰高血糖素肽之羧基或其活化形式反 應之胺、經基、或硫醇基（例如，十八胺、十四烧醇、及 十六烷硫醇）。胰高血糖素肽之羧基或其活化形式可為胰 鬲血糖素肽之胺基酸（例如，麩胺酸、天冬胺酸）之側鏈的 部分或可為肽主鏈之部分。 φ 在某些具體例中，跋高血糖素肽係經由利用連接至胰 咼血糖素肽之間隔物醯化長鏈烷而經修飾成包含醯基。在 特定態樣中，長鏈烷包含與間隔物之羧基或其活化形式反 應之胺、羥基、或硫醇基。包含羧基、或其活化形式之適 當的間隔物說明於文中，且包括，例如，雙官能間隔物， 例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔物及疏水 性雙官能間隔物。 如文中所使用之術語「羧基之活化形式」係指具有通 201010729 式R(C = 0)X之羧基’其中χ係脫離基及r係胰高血糖 素肽或間隔物。舉例來說，羧基之活化形式可包括，但不 限於，醯基氯、酐、及酯。在一些具體例中，活化緩基係 具有N-羥基琥珀醢亞胺酯（NHS)脫離基的酯。 關於其中長鏈烷係經胰高血糖素肽或間隔物醯化之 本發明的此等態樣，長鏈烷可為任何大小，且可包含任何 長度的碳鏈。長鏈烧可為直鏈或分支鏈。在某些態樣中， 長鍵烧為C4至C30院。舉例來說，長鍵烧可為C4炫、 C6 烷、C8 娱：、C10 烧、C12 院、C14 烧、C16 院、C18 烧、C20 烧、C22 烧、C24 烷、C26 烧、C28 院、或 C30 烧中之任一者。在一些具體例中，長鏈烷包含C8至C20 烧’例如，C14烷、C16烷、或C18烷。 此外，在一些具體例中，胰高血糖素肽之胺、羥基、 或硫醇基係利用膽固醇酸酿化。在特定具體例中，騰高血 糖素肽係透過經修飾的Cys間隔物鍵聯至膽固醇酸。 文中所述之經醋化的胰南血糖素肽可進一步經修飾 成包含親水性部分。在一些特定具體例中，親水性部分可 包含聚乙二醇（PEG)鏈。親水性部分之併入可透過任何適 當的方式，諸如文中所述之任何方法完成。在此方面，經 醯化之胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO: 1，包括文中所 述之任何修飾’其中位置1〇、2〇、24、29、及40處之 至少一胺基酸包含醯基，且位置16、17、21、24、29、 -91· 201010729 或4〇、c-端延伸内之位置、或C_端胺基酸之至少一胺基 酸經修飾成Cys、Lys、Orn、升-Cys、或Ac-Phe，且 胺基酸之側鏈係共價鍵結至親水性部分（例如，pEg)。在 一些具體例中，醯基係視情況透過包含Cys、Lys、Orn、 升-Cys、或Ac-Phe之間隔物連接至位置10或4〇，且親 水性部分係併入至位置24處之Cys殘基。 或者，經醯化之胰高血糖素肽可包含一間隔物，其中 0 該間隔物係既經醯化且亦經修飾成包含親水性部分。適當 間隔物的非限制性實例包括含有選自由Cys、Ac_Cys、

Lys、〇rn、#_CyS、及Ae_phe組成之群之一或多個胺 基酸的間隔物。 在本發明之一特定態樣中，經醯化之姨高血糖素肽包 含 SEQ ID NO : 101-106、113-115、117-119、 123-125 、 128-130 、 132-134 、 136-138 、 141-145 、 〇 148、151、152、154、156、158、160、162、163、 165、166、23 1、234-239、257、及 258 中任一者之胺 基酸序列。 根據一些具體例，胰高血糖素肽係經修飾成包含烷 基例如，非天然存在於胺基酸上之烧基（例如，對天然 產生之胺基酸為非天然的烷基）。不以任何特殊理論為基 礎’咸信胰高血糖素肽之烷化將達成與胰高血糖素肽之醯 化相似（若非相同的話）的效果，例如，延長的循環半衰 -92- 201010729 期、延遲作用之開始、延長作用期間、改良對蛋白酶（諸 * DPP-IV)之抗性、及提高對GLjm、Gip、及姨高血 糖素受體之效力。 烷化可在胰高血糖素肽内的任何位置處進行，包括任 何的位置1-29、C-端延伸内之位置、或义或c_端胺基 酉夂，其限制條件為GIP活性（及視情況GIp及/或膜高血 糖素活性）若未經提升的話，係經維持。烷化可發生在， ❿ 例如，任何加成至胰高血糖素序列（SEQ ID NO: 1)的胺 基酸處，例如，在N-或C-端。非限制性的實例包括位置 1 5 10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、 21、24、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、或50。烷基可直接共價鍵聯至胰高血糖素肽的胺基 酸’或透過間隔物間接共價鍵聯至胰高血糖素肽的胺基 ❹酸’其中该間隔物係位於胰高血糖素肽之胺基酸與烷基之 間。姨而企糖素肽可在鍵聯親水性部分的相同胺基酸位置 處’或在不同胺基酸位置處烷化。非限制性實例包括在胰 高血糖素肽之位置10或40處之烷化及在c_端部分中之 一或多個位置（例如，位置24、28、29、或40、在C- 端延伸内、或在0_端（例如，透過加成C-端CyS))處的聚 乙二醇化。 在本發明之一特定態樣中，胰高血糖素肽係經由直接 -93· 201010729 烧化姨尚血糖素狀之胺基酸之侧鍵的胺、經基、或硫醇， 而經修飾成包含烷基。在一些具體例中，胰高血糖素肽係 透過胺基酸之側鏈胺、羥基、或硫醇直接烷化。在一些具 體例中，炫化係在位置10、20、24、29、或40處。在 此方面，經烧化的胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO . 1 之胺基酸序列’或其之包含文中所述之一或多個胺基酸修 飾的經修飾胺基酸序列，其中位置1〇、2〇、24、29、及 4 0處之至少一胺基酸經修飾成包含侧鏈胺、經基、或硫 醇之任何胺基酸。在本發明之一些特定具體例中，胰高血 糖素肽的直接烧化係透過位置1 〇處之胺基酸的侧鏈胺、 經基、或硫醇發生。 在一些具體例中’包含侧鏈胺之胺基酸係式I之胺基 酸。在一些範例具體例中，式I之胺基酸係其中η為4(Lys) 或η為3(Orn)之胺基酸。 在其他具體例中’包含側鏈羥基之胺基酸係式Η之胺 基酸。在一些範例具體例中，式π之胺基酸係其中η為 l(Ser)之胺基酸。 在又其他的具體例中，包含側鏈硫醇之胺基酸係式 ΠΙ之胺基酸。在一些範例具體例中’式m之胺基酸係 其中η為1 (Cys)之胺基酸。 在又其他的具體例中，包含側鏈胺、羥基、或硫醇之 胺基酸係包含式I、式II、或式III之相同結構的二取代 94· 201010729 胺基酸，僅除了鍵結至式j、式π、或式ΙΠ之胺基酸之 • α碳的氫係經第二個側鏈取代。 在本發明之一具體例中，經烷化之胰高血糖素肽包含 位於肽與烷基之間的間隔物。在一些具體例中，胰高血糖 素狀係共價鍵結至間隔物，該間隔物係共價鍵結至烷基。 在一些範例具體例中，騰高血糖素肽係經由烧化間隔物之 胺、羥基、或硫醇而經修飾成包含烷基，該間隔物係連接 φ 至騰高金糖素肽之位置10、20、24、29、或40處之胺 基酸的側鏈。間隔物所連接之胺基酸可係任何包含允許鍵 聯至間隔物之部分的胺基酸（例如，經單—α_取代之胺基 酸或oc，a- 一取代胺基酸）。舉例來說，包含侧鍵 NH2、—OH、或-COOH 之胺基酸（例如，Lys'C^rn'Sei·、 Asp、或Glu)為適當。在此方面，經烧化之胰高企糖素 肽可包含SEQ ID NO : 1之胺基酸序列，或其之包含文 ©中所述之一或多個胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中 位置10、20、24、29、及40處之至少一胺基酸經修飾 成包含側鏈胺、羥基、或羧酸酯之任何胺基酸。 在一些具體例中，間隔物係包含側鏈胺、羥基、或硫 醇之胺基酸’或包括含有側鏈胺、羥基、或硫醇之胺基酸 的二肽或三肽。 當透過間隔物之胺基發生烷化時，烷化可透過胺基酸 之(X胺或側鏈胺發生。在其中《胺經烷化的情況中，間隔 -95- 201010729 物胺基酸可為任何胺基酸。舉例來說，間隔物胺基酸可為 疏水性胺基酸’例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、 Met、Phe、Tyr、6-胺基己酸、5_胺基戊酸、7_胺基庚 酸、及8 -胺基辛酸❶或者，間隔物胺基酸可為酸性殘基， 例如’ Asp及Glu ’其限制條件為烷化係在酸性殘基的α 胺上發生。在其中間隔物胺基酸之侧鏈胺經烷化的情況 中，間隔物胺基酸係包含側鏈胺之胺基酸，例如，式j之 ❹ 胺基酸（例如，Lys或〇rn) ^在此情況，α胺及間隔物胺 基酸之側鏈胺兩者可皆經烷化，以致胰高血糖素肽經二烷 化。本發明之具體例包括此等經二烷化之分子。 當烷化係透過間隔物之羥基發生時，胺基酸或二肽或 三肽之其中一個胺基酸可為式[〗之胺基酸。在一特定範 例具體例中，胺基酸係Ser。 當醯化係透過間隔物之硫醇基發生時，胺基酸或二肽 或二肽之其中一個胺基酸可為式III之胺基酸。在一特定 範例具體例中，胺基酸係Cys。 在些具體例中，間隔物係親水性雙官能間隔物。在 某些具體例中，親水性雙官能間隔物包含兩個或兩個以上 的反應性基團’例如，胺、經基、硫醇、及缓基或其之任 何組合。在某些具體例中，親水性雙官能間隔物包含經基 及缓酸醋。在其他具體例中，親水性雙官能間隔物包含胺 基及缓酸醋。在其他具體例中，親水性雙官能間隔物包含 -96· 201010729 硫醇基及竣酸醋。在-特定具體例中，間隔物包含胺基聚 (烷氧基）羧酸酯。在此方面，間隔物可包含，例如， NH2(CH2CH2〇)n(CH2)mC〇〇H，其中爪係丨至 6 之任 何整數及η係2至12之任何整數，諸如，比方說，8_胺 基料酸，其可購自 PePtides Intefnati〇nal，

Inc. (Louisville，KY)。 ❹ 在二具體例中，間隔物係疏水性雙官能間隔物。在 某些具體例中，疏水性雙官能間隔物包含兩個或兩個以上 的反應性基團，例如，胺、經基、硫醇、及㈣或1之任 何組合。在某些具體例中，疏水性雙官能間隔物包含經基 =酸醋。在其他具體例中，疏水性雙官能間隔物包含胺 ==酸I在其他具體财，疏錢雙宫㈣隔物包含 ::二竣酸醋。技藝中知曉包含幾酸醋、及經基或硫醇 土之適备的疏水性雙官能間隔物4其包括，例如， 羥基辛酸及8_毓基辛酸。 在特定具體例中之間隔物（例如，胺基酸、二狀、三 :::性雙官能、或疏水性雙官能間隔物)係3至 1〇 (例如，6至10個原子）（例如，6、7、8、9、或 10個原子）長度。在更 〆 10個々子m m、體例中，間隔物係約3至 C18广其(例如’6至10個原子）長度，及燒基係⑴至 狀：:長：如，。4炫基、C16燒基，以致間隔物及 坑基之總長度係14至28個原子，例如，約i4、i5、i6、 -97- 201010729 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或 28個原子。在一些具體例中，間隔物及烷基之長度係17 至28(例如，19至26、19至21)個原子。 根據某些前述具體例，雙官能間隔物可為包含3至1〇 個原子長度之胺基酸主鍵的合成或非天然產生之胺基酸 (例如，6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸、及8_胺 基辛酸）。或者，間隔物可為具有3至10個原子（例如，6 瘳 至10個原子）長度之肽主鏈的二肽或三肽間隔物。二肽或 二肽間隔物可由天然產生及/或非天然產生之胺基酸（包 括，例如’文中教示之任何胺基酸）所構成。在一些具體 例中’間隔物包含總體負電荷，例如，包含一或兩個帶負 電胺基酸。在一些具體例中，二肽間隔物係選自由以下所 組成之群.Ala-Ala、β-Ala- β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、 γ -胺基丁酸-γ -胺基丁酸、及γ-Glu· γ-Glu。 ❹ 技藝中知曉透過胺、羥基、及硫醇進行肽烷化之適當 方法。舉例來說’可使用威廉生（Williamson)醚合成法 於在胰高血糖素肽之羥基與烷基之間形成醚鍵聯。此外， 肽與鹵烧基的親核性取代反應可產生醚、硫趟、或胺基鍵 聯中之任一者。 經烷化胰高血糖素肽之烷基可為任何大小，例如，任 何長度碳鏈，且可為直鏈或分支鏈。在本發明之一些具體 例中’烧基為C4至C30院基。舉例來說，烧基可為匸4 -98- 201010729 烷基、C6烷基、C8烷基、CIO烷基、C12烷基、ci4 烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22垸基、C24 烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基中之任一者。 在一些具體例中，烷基係C8至C20烷基，例如，C14 烷基或C16烷基。 ❹ 在一些特定具體例中，烷基包含膽汁酸（例如，膽酸、 鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸、牛膽酸、甘膽酸、及膽 固醇酸）之膽固醇部分。 在本發明之一些具體例中，胰高血糖素肽係經由使親 核性、長鍵烧與騰南jk糖素狀反應而經修飾成包含烧基， 其中該胰高血糖素肽包含適合於親核性取代的脫離基。在 特定態樣中，長鏈烷的親核性基團包含胺、羥基、或硫醇 基（例如，十八胺、十四烷醇、及十六烷硫醇）。胰高血糖 素肽之脫離基可為胺基酸之側鏈的部分或可為肽主鏈之 ❹ 在某些具體例中，胰高血糖素肽係經由使親核性、長 鏈烷與連接至胰兩血糖素肽之間隔物反應而經修飾成包 含烷基，其中該間隔物包含脫離基。在特定態樣中，長鍵 院包含胺、經基、或硫醇基。在某些具體例中，包含脫離 基之間隔物可為進-步包含合適脫離基之文中論述的任 何間隔物，例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間 部分。適當的脫離基包括，例如，N_羥基琥珀醯亞胺、 鹵素、及續酸醋。 -99- 201010729 隔物及疏水性雙官能間隔物。 關於其中長鏈烷係經胰高血糖素肽或間隔物烷化之 本發明的此等態樣，長鏈燒可為任何大小4可包含 長度的碳鏈。㈣奸為直鏈或分支鏈。在某㈣樣中， 長鏈烧為C4至C3〇燒。舉例來說，長舰可為C4燒、 C6炫、C8烧、⑽燒、⑴燒、C14炫、Cl6燒、叫 烷、C20烷、C22烷、C24烷、⑶烷、⑶院、或⑶

院中之任—者。在—些具體例中，長鏈烧包含C8至C2〇 院，例如，C14烷、C16烷、或ci8烷。 此外，在一些具體例中，烷化可在胰高血糖素肽與膽 固醇部分之間發生。舉例來說，膽固醇的羥基可置換長鏈 烧上之脫離基而形成膽固醇_騰高血糖素肽產物。 文中所述之經院化的騰高血糖素肽可進一步經修飾 成包含親水性部分。在一些特定具體例中，親水性部分可 包含聚乙二醇（PEG)鏈。親水性部分之併入可透過任何適 當的方式’諸如文中所述之任何方法完成。在此方面，經 烷化之胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO: 1，或其之包括 文中所述之一或多個胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其 中位置10、20、24、29、及40處之至少一胺基酸包含 烧基’且位置16、17、21、24、29、及40、C -端延伸 内之位置或C-端胺基酸之至少一胺基酸經修飾成Cys、

Lys、Orn、升-Cys、或Ac-Phe ’且胺基酸之側鏈係共 -100- 201010729 價鍵結至親水性部分（例如，PEG)。在一些具體例中，烷 基係視情況透過包含Cys、Lys、Orn、升-Cys、或Ac-Phe 之間隔物連接至位置1〇或4〇，且親水性部分係併入至位 置24處之Cys殘基。 或者，經烧化之姨兩血糖素肽可包含一間隔物，其中 該間隔物係既經烷化且亦經修飾成包含親水性部分。適當 間隔物的非限制性實例包括含有選自由Cys、Lys、〇rn、 ❿ 升·Cys、及Ac-Phe組成之群之一或多個胺基酸的間隔 物。 範例具體例 根據本發明之一些具體例，具有GIp激動劑活性之胰 高也糖素（SEQ ID NO: υ的類似物包含具有以下各項的 SEQ ID NO: 1 :⑷在位置！處賦予GIp激動劑活性之 胺基酸修飾，（b)使類似物之c_端部分（胺基酸12_29)之 ® 旋結構穩定的修飾，及⑷視情況，1至1()(例如，卜 2'3'4'5'6>7'8'9、1〇)個進一步的胺基酸修飾。 在-些具體例中’類似物對GIp受體呈現天然Gip之至 少約1〇/。的活性，或文中所述之任何其他對Gip受體的活 性值。 在某些具體例中，使α螺旋結構穩定的修飾係提供或 引入分子内架橋’包括，例如，共價分子内架橋，諸如文 -101 - 201010729 中所述之任何架橋的修飾。在一些具體例中，共價分子内 架橋係内醯胺橋。此等具體例之類似物的内醯胺橋可為如 文中所述的内醯胺橋。參見’例如，在「使OC螺旋結構穩 定」之章節中之内醯胺橋的教示。舉例來說，内醯胺橋可 係位在位置i與i + 4處之胺基酸之側鏈之間或位在位置j 與j + 3處之胺基酸之側鏈之間，其中i係1 2、1 3、1 6、 17、20或24,及其中j係17。在某些具體例中，内醯胺 橋可係位在位置1 6及2 0處之胺基酸之間，其中在位置 16及20處之一個胺基酸係經Glu取代及在位置16及20 處之另一個胺基酸係經Lys取代。 在另類的具體例中，使α螺旋結構穩定的修飾係在類 似物的位置16、20、21、及24處引入一、二、三、或 四個α，α-二取代胺基酸。在一些具體例中，α,α_二取代 胺基酸係ΑΙΒ。在某些態樣中’ α，α_二取代胺基酸（例如， ΑΙΒ)係在位置20處，及位置16處之胺基酸係經帶正電 的胺基酸（諸如，比方說，說明於文中之式IV胺基酸）取 代。式IV之胺基酸可為升Lys、Lys、Orn、或2,4-二 胺基丁酸（Dab)。 在本發明之特定態樣中，位置1處之胺基酸修飾係

His經不含咪唑侧鏈之胺基酸（例如，大的芳族胺基酸（例 如，Tyr))取代。 在某些態樣中’胰高血糖素之類似物包含在位置27、 •102- 201010729 28及29之一處、兩處或全部的胺基酸修斜。舉例來說， 位置27處之Met可經大的脂族胺基酸（視情況為Leu)取 代，位置28處之Asn可經小的脂族胺基酸（視情況為Ala) 取代，位置29處之Thr可經小的脂族胺基酸（視情況為 Gly)取代，或前述之二或三者的組合。在特定具體例中， 胰高血糖素之類似物包含在位置27處之Leu、在位置28 處之Ala、及在位置29處之Gly或Thr。 〇 在本發明之某些具體例中，胰高血糖素之類似物包含 在位置29處之胺基酸C -端之1至21個胺基酸的延伸。 該延伸可包含，例如，SEq IDNO:95或96之胺基酸序 列。另外或替代地，胰高血糖素之類似物可包含該延伸之 K個胺基酸係帶正電胺基酸的延伸。帶正電胺基酸可為 式IV之胺基酸，包括，但不限於，LyS、升Lys、0rn、 及 Dab 〇 Q 在一些具體例中，騰高也糖素之類似物係如文中所述 經醯化或烷化。比方說，醯基或烷基可如進一步說明於文 中，在類似物之位置1〇或4〇處，藉由或不藉由間隔物 連接至胰高血糖素之類似物。另外或替代地，類似物可經 修飾成包含如進一步說明於文中的親水性部分。此外，在 一些具體例中，類似物包含以下修飾的任一者或組合： (a)位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D_Aia、Gly、 曱基-Ser、AIB、Val、或α-胺基丁酸取代； •103· 201010729 (b) 位置 10 處之 Tyr 經 TrP、Lys、〇rn、Glu、phe、 或Val取代； (c) 一醯基鍵聯至位置i〇處之Lys; (d) 位置1 2處之Lys經Arg或lie取代； (e) 位置16處之Ser經Glu、Gln、升麩胺酸、升半 胱胺續酸、Thr、Gly、或AIB取代； (f) 位置1 7處之Arg經Gin取代； (g) 位置 18 處之 Arg 經 Ala、Ser、Thr、或 Gly 取 ❹ 代； (h) 位置 20 處之 Gin 經 Ser、Thr、Ala、Lys、瓜胺 酸、Arg、Orn、或 AIB 取代； (i) 位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺磺 酸取代； (j) 位置23處之Val經lie取代； (k) 位置 24 處之 Gin 經 Asn、Ser、Thr、Ala、或 ® AIB取代；及 (l) 在位置 2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、 18、19、20、21、24、27、28、及 29 中任一者處之保 留性取代。 在範例具體例中，具有GIP激動劑活性之騰高血糖素 (SEQ ID NO: 1)的類似物包含以下修飾： ⑷在位置1處賦予GIp激動劑活性之絲酸修飾， -104- 201010729 (b) 在位置i與i + 4處之胺基酸之侧鏈之間或在位置j - 與j + 3處之胺基酸之側鍵之間的内酿胺橋，其中丨係1 2、 13、16、17、20 或 24’ 及其中 j 係 17， (c) 在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸 修飾’例如’在位置2 7及/或2 8處之胺基酸修飾，及 (d) l -9或1-6個進一步的胺基酸修飾，例如，1、2、 3、4、5、0、7、8或9個進一步的胺基酸修飾， φ 且該類似物對GIP受體活化之EC50係約10iim或以下。 此等具體例之類似物的内醯胺橋可係如文中所述之 内醯胺橋。參見，例如，「使α螺旋結構穩定化」之章節 中之内醯胺橋的教示。舉例來說，内醯胺橋可係位在位置 及20處之胺基酸之間’其中在位置16及20處之一個 胺基酸係經Glu取代及在位置16及2〇處之另一個胺基 酸係經Lys取代。 ❹ 根據此等具體例，類似物可包含，例如，SEQ ID NO: 5-94中任一者之胺基酸序列。 在其他範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰高血 糖素（SEQ ID NO: 1)的類似物包含以下修飾： (a) 在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾， (b) 該類似物之位置16、20、21、及24處之一個、 兩個、二個、或全部的胺基酸係經α，α -二取代胺基酸取 代， -105- 201010729 (c)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸 - 修飾’例如，在位置27及/或28處之胺基酸修飾，及 • (d)1-9或1_6個進一步的胺基酸修飾，例如，1、2、 3、4、5、6、7、8或9個進一步的胺基酸修飾， 且該類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下。 此等具體例之類似物的α，α _二取代胺基酸可係任何 的α，α-二取代胺基酸，包括，但不限於，胺基異丁酸 φ (ΑΙΒ)、經選自甲基、乙基、丙基、及正丁基之相同或不 同基團、或經環辛烷或環庚烷二取代的胺基酸（例如，】_ 胺基環辛燒-1-叛酸）。在某些具體例中，α，α_二取代胺基 酸係ΑΙΒ。在某些具體例中，位置2〇處之胺基酸係經〜心 二取代胺基酸（例如，AIΒ)取代。 根據此等具體例，類似物可包含，例如，SEQ ID NO: 99-141、144-164、166-169、及 1 73-1 78 中任一者之 胺基酸序列。 在又其他的範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰 高血糖素（SEQ ID NO: 1)的類似物包含以下修飾： (a) 在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾， (b) 位置16處之Ser經式IV之胺基酸的胺基酸取代： -106 - 201010729 Η

Η2Ν-C-COOH • 丨。从 * 入

Ri R2 [式 IV]， 其中n係1至16、或1至10、或i至7、4li6、 -V __ 3 至6，R1及R2各係獨立地選自由以下基團組成之

君篆 * TT 睿 . C”CU 烷基、（CVC"烷基）〇H、（(^-。"烷 )2 (Ci-Ci8 烧基）SH、（C〇-C4 院基）（C3_C6)環 烧基、（CQ-C4烷基）（C2-C5雜環基）、（C〇-C4烷基） (C6-C1。芳基)r7、及（Cl_C4统基）（C3_C9雜芳基），其 中反7係Η或OH ’及式IV之胺基酸的侧鏈包含自由 胺基， (C)位置20處之Gin經α，α-二取代胺基酸的胺基酸取 代，

Q (d) 在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸 修飾’例如，在位置27及/或28處之胺基酸修飾，及 (e) l - 9或1 _6個進一步的胺基酸修飾，例如，1、2、 3、 4、5、6、7、8或9個進一步的胺基酸修飾， 且該類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下。 此等具體例之類似物的式IV胺基酸可係任何的胺基 駿，諸如’比方說’式IV之胺基酸，其中η係1、2、3、 4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16。 -107- 201010729 在某些具體例中，η係2、3、4、或5，在此情況中，胺 , 基酸分別係Dab、Orn、Lys、或升Lys。 此等具體例之類似物的α，α -二取代胺基酸可係任何 的α，α_二取代胺基酸，包括，但不限於，胺基異丁酸 (ΑΙΒ)、經選自曱基、乙基、丙基、及正丁基之相同或不 同基團、或經環辛烷或環庚烷二取代的胺基酸（例如，^ 胺基環辛烷-1-羧酸）。在某些具體例中，α，α_二取代胺基 φ 酸係ΑΙΒ。 根據此等具體例，類似物可包含，例如，Seq id NO: 99-165中任一者之胺基酸序列。 在又其他的範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰 高血糖素（SEQ ID NO: 1)的類似物包含： (a)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾， 及 ⑩ （b)在位置29處之胺基酸C -端之約1至約21個胺基 酸的延伸，其中該延伸之至少一個胺基酸經醯化或烷化， 其中該類似物對GIP受體活化之EC50係約1〇 nM或以 下。

在一些具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係式I、II、 或III之胺基酸。在更特定的具體例中，式丨之胺基酸係 Dab、Orn、Lys、或升Lys。此外，在一些具體例中， 約1至約2 1個胺基酸之延伸包含GPSSGAPPPS (SEQ -108· 201010729 ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96)(其中 ， x 係任何胺基酸）、或 GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 170) 或 XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 171)或 XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 172)(其中 X 係 Gly 或 小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸）之胺基酸序列。在 一些具體例中’該約1至約21個胺基酸可包括含有一或 多個相對於 SEQ ID NO: 95、96、170、171 或 172 之 0 保留性取代的序列。在一些具體例中，經醯化或烷化之胺 基酸係位在C-端延伸類似物的位置37、38、39、40、 41 4 2、或4 3處。在某些具體例中，經醢化或烧化之胺 基酸係位在C-端延伸類似物的位置4〇處。 在一些具體例中，具有GIP激動劑活性之類似物進一 步包含在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸 修飾，例如，在位置27及//或28處之胺基酸修飾。

❹ 在以上範例具體例之任一者中，在位置1處賦予GIP 激動劑活性之胺基酸修飾可係His經不含味嗤側鏈之胺 基酸的取代。位置！處之胺基酸修飾可係，例如，His經 大的芳族胺基酸之取代。在一些具體例中，大的芳族胺基 酸係文中所述之任一者，包括，例如，丁”。 此外關於以上的範例具體例，在位置2 78及2 9 之-、二或全部處的胺基酸修飾可係文中所述之在此等位 置的任何修飾。舉例來却 J木說位置27處之Met可經大的脂 -109- 201010729 族胺基酸（視情況為Leu)取代，位置28處之Asn可經小 的脂族胺基酸（視情況為Ala)取代，及/或位置29處之 Thr可經小的脂族胺基酸（視情況為Gly)取代。或者，類 似物可包含在位置27及/或28處之此等胺基酸修飾。 以上範例具體例之類似物可進一步包含或丨_6個 進一步的額外胺基酸修飾’例如，1、2、3、4、5、6、7、 8或9個進一步的胺基酸修飾，諸如，比方說’文中所述 之任何提尚或減低對任何GIP、GLP-1、及胰高血糖素受 體之活性、改良溶解度、改良循環中之作用期間或半衰 期、延遲作用之開始、或提高穩定性的修飾。類似物可進 一步包含’例如，在位置12處視情況經Ile取代的胺基 酸修飾、及/或在位置17及18處視情況經位置17處之 Q及位置18處之A取代的胺基酸修飾、及/或加成 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQIDNO:9 6)、或含有一或多個相對於seQIDNO: 9 5或9 6對C -端之保留性取代的序列，該類似物可包含 一或多個以下的修飾： ⑴位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、 N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N_ 丁酸取代； (ii) 位置 10 處之 Tyr 經 Trp、Lys、〇rn、Glu、Phe、 或Val取代； (iii) 一醯基鍵聯至位置10處之Lys ; -110- 201010729 (iv) 位置12處之Lys經Arg取代； (v) 位置16處之Ser經Glu、Gin、升麩胺酸、升半 胱胺磺酸、Thr、Gly、或AIB取代； (vi) 位置17處之Arg經Gin取代， (vii) 位置 18 處之 Arg 經 Ala、Ser、Thr、或 Gly 取代； (viii) 位置 20 處之 Gin 經 Ala、Ser、Thr、Lys、瓜 胺酸、Arg、〇rn、或AIB取代； (ix) 位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺 績酸取代； (X)位置23處之Val經lie取代； (xi) 位置 24 處之 Gin 經 Asn、Ala、Ser、Thr、或 AIB取代；及 (xii) 在位置 2、5、9、10、1 1、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、24、27、28、及 29 中任一 者處之保留性取代。 在一些具體例中之類似物包含修飾（i)至（xii)之組 合。或者或另外地，類似物可包含位置3處之胺基酸修飾 (例如’ Gin經Glu之胺基酸取代），其中該類似物對胰高 血糖素受體具有胰高血糖素之低於1 %的活性。或者或另 外地’類似物可包含位置7處之胺基酸修飾（例如，Thr 經不含羥基之胺基酸（例如，Abu或lie)之胺基酸取代）， -111- 201010729 受體具有GLP-1之低於約10〇/〇 其中該類似物對GLp_ 1 的活性。 關於範例具體例，類似物可共價鍵聯至親水性部分。 在些具體{列中，11似物係共價鍵聯至胺基酸位置16、 17、20、21、24、29、4G、或C·端之任-者處的親水 性部分。在某些具體例中，類似物包括C-端延伸（例如， Q ID NO. 95之胺基酸序列）及包含親水性部分之胺基

酸的加成，以致親水性部分於位置4〇處共價鍵聯至類似 物0 在一些具體例中，親水性部分係共價鍵聯至類似物之 1^8、〇7 3、〇1：11、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸。1^8、 Cys、〇rn、升半胱胺酸、或乙醯基_苯丙胺酸可係胰高血 糖素序列（SEQ ID NO: 1)之天然的胺基酸，或其可係取 代SEQ ID NO: 1之天然胺基酸的胺基酸。在一些具體 例中，其中該親水性部分係連接至Cys，對親水性部分之 鍵聯可包含以下結構

或

S

112- 201010729 關於包含親水性部分之類似物，該親水性部分可係 文中所述之任何親水性部分。參見，例如，在「親水 . ㈣分之鍵聯」章節下的教示。在-些具體例中，親 ‘ 水性部分係聚乙二醇（PEG)。某些具體例中之pEG具 有約1，000道耳吞至約40,000道耳吞，例如，約 20，000道耳吞至約4〇 〇〇〇道耳吞之分子量。 關於範例具體例，類似物可包含其中之側鏈係共價 φ 鍵聯至酿基或统基（例如，對於天然產生之胺基酸係非 天然的醯基或烷基）的經修飾胺基酸。經醯化或烷化之 類似物可係根據「醯化及烷化」之章節中所述的經醯 化或烷化肽。在一些具體例中，醯基係C4至C3 0脂 肪醯基，諸如，比方說’ C10脂肪醯基或烷基、C12 脂肪醯基或烷基、C14脂肪醯基或烷基、C16脂肪醯 基或烷基、C18脂肪醯基或烷基、C20醯基或烷基、 或C22醯基或烷基。醯基或烷基可共價連接至類似物 ❹ 之任何胺基酸，包括，但不限於，位置10或40處之 胺基酸、或C-端胺基酸。在某些具體例中，類似物包 括C-端延伸（例如，SEQ ID NO: 95之胺基酸序列） 及包含醯基或烷基之胺基酸的加成，以致醯基或烷基 係於位置40處共價鍵聯至類似物。在一些具體例中’ 醯基或烷基係共價鍵聯至式I、II、或III之胺基酸（例 如，Lys殘基）的側鏈。醯基或烷基可共價鍵聯至對胰 •113- 201010729 高血糖素序列（SEQ ID NO: 1)為天然的胺基酸，或可 鍵聯至加成至SEQ ID NO: 1之序列或至SEQ ID NO: 1接著SEQ ID NO: 95之序列的胺基酸（在N-或C- 端），或可鍵聯至取代天然胺基酸的胺基酸（例如，在 SEQ ID NO: 1 之位置 1〇 處的 Tyr)。 在以上的範例具體例中，其中該類似物包含酿基或 烷基’該類似物可透過如文中所述之間隔物連接至醯 基或院基。該間隔物’例如，可係3至1 〇個原子長度， 且可係，例如，胺基酸（例如，6-胺基己酸、文中所述 之任何胺基酸）、二肽（例如’ Ala-Ala、pAla-PAla、 Leu-Leu、Pro-Pro、YGlu-yGlu)、三肽、或親水性 或疏水性雙官能間隔物。在某些態樣中，間隔物及醯 基或烧基之總長度係約1 4至约2 8個原子。 在又進一步的範例具體例中，具有GIP激動劑活 性之胰咼jk糖素的類似物包含根據Seq id NO: 227、228、229或230中任一者之胺基酸序列，其進 一步包含以下修飾： (a) 視情況在位置1處職予GIp激動劑活性之胺基酸 修飾， (b) 在位置29處之胺基酸c_端之約i至約21個胺基 酸的延伸，其中該延伸之至少一個胺基酸經醯化或烷化， 及 • 114 - 201010729 (C)至多6個進一步的胺基酸修飾’ 其中該類似物對Gip受體活化之EC5 0係約1 0 nM或 以下。 在一些態樣中，經醯化或烷化之胺基酸係式I、II、 或ΙΠ之胺基酸。在更特定的具體例中，式I之胺基酸 係Dab、〇rn、Lys、或升Lys。此外’在一些具體例 中’該約1至約21個胺基酸包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96)(其 中X係任何胺基酸）、或GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 170)或 XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 171)或 XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 172)(其中 X 係 Gly 或小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸）之胺基酸序 列。在一些具體例中，該約1至約21個胺基酸可包括 含有一或多個相對於SEQ ID NO: 95、96、170、171 或1 7 2之保留性取代的序列。在一些具體例中，經醯 化或烧化之胺基酸係位在C -端延伸類似物的位置 37、38、39、40、41、42、或43處。在某些具體例 中，經醯化或烷化之胺基酸係位在C-端延伸類似物的 位置40處。 在以上範例具體例之任一者中，在位置1處賦予 GIP激動劑活性之胺基酸可係不含咪唑侧鏈之胺基 酸。位置1處之胺基酸可係，例如，大的芳族胺基酸。 -115- 201010729 在些具體例中，大的芳族胺基酸係文中所述之任一 者’包括’例如，T y r。 . 以上範例具體例之類似物可進一步包含丨_6個進 、 一步的胺基酸修飾，諸如，比方說，文中所述之任何 提高或減低對任何GIP、GLP — ；!、及胰高血糖素受體 之活性、改良溶解度、改良循環中之作用期間或半衰 期、延遲作用之開始、或提高穩定性的修飾。 G 在某些態樣中，以上範例具體例中所述之胰高企糖素 類似物包含在位置27、28及29之一、二或全部處的進 一步胺基酸修飾。在此等位置之修飾可係文中所述之相對 於此等位置的任何修飾。舉例來說，相對於SEQID N〇: 227、228、229或230之位置27可經大的脂族胺基酸（例 如，Leu、lie或正白胺酸）或Met取代，位置28可經另 一小的脂族胺基酸（例如，Gly或Ala)或Asn取代，及/ ❹ 或位置29可經另一小的脂族胺基酸（例如，Ala或Gly) 或Thr取代。或者’類似物可包含在位置27及/或28 處之此等胺基酸修飾。 類似物可進一步包含一或多個以下的額外修飾： (i) 位置2處之胺基酸係D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、 1^-曱基-861*、入18、\^1、或〇1-胺基-1^-丁酸中之任一者； (ii) 位置10處之胺基酸係Tyr、Trp、Lys、Orn、 Glu、Phe、或 Val ; -116- 201010729 (山）一醯基鍵聯至位置l〇處之LyS ; (iv)位置12處之胺基酸係ne、Lys或Arg ; * (v)位置16處之胺基酸係Ser、Glu、Gin、升麵胺 • 酸、升半胱胺績酸、Thr、Gly、或AIB中之任一者； (vi) 位置17處之胺基酸係（jin或Arg ; (vii) 位置18處之胺基酸係Ala、Arg、Ser、Thr、 或Gly中之任一者； ❹ （viii)位置20處之胺基酸係Ala、Ser、Thr、Lys、 瓜胺酸、Arg、Orn、或AIB或另一α，α-二取代胺基酸中 之任一者； (ix)位置21處之胺基酸係Glu、Asp、升麩胺酸、 升半胱胺績酸中之任一者； (X)位置23處之胺基酸係val或lie ; (xi)位置24處之胺基酸係Gin、Asn、Ala、Ser、 Thr、或AIB中之任一者；及

G (xii)— 或多個在位置 2、5、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、 及29中任一者處之保留性取代。 一些具體例中之類似物包含修飾（i)至（xii)之組合。 或者或另外地，類似物可包含位置3處之胺基酸修飾（例 如’ Gin經Glu之胺基酸取代），其中該類似物對胰高血 糖素受體具有姨尚血糖素之低於1%的活性。或者或另外 -117- 201010729 地，類似物可包含位置7處之胺基酸修飾（例如，Thr經 不含經基之胺基酸（例如，Abu或lie)的胺基酸取代），其 中該類似物對GLP-1受體具有GLP-1之低於約10%的 活性。 關於範例具體例，類似物可共價鍵聯至親水性部分。 在一些具體例中’類似物係共價鍵聯至胺基酸位置16、 17 ' 20 ' 21、24、29、40、或C-端之任一者處的親水 〇 性部分。在某些具體例中’類似物包括在位置24處共價 鍵聯至類似物的親水性部分。 在一些具體例中’親水性部分係共價鍵聯至類似物之 LyS、CyS、〇rn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸。Lys、 Cys、〇rn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸可係SEQ ι〇 NO: 1、227、228、229或230之天然的胺基酸，或其 可係經取代的胺基酸》在一些具體例中，其中該親水性部 分係鍵聯至Cys，該鍵聯可包含以下結構

關於包含親水性部分之類似物，該親水性部分可係 -118 - 201010729 文中所述之任何親水性部分。參見，例如，在「親水 性α卩分之鍵聯」章節下的教示。在一些具體例中，親 水性部分係聚乙二醇（PEG)。某些具體例中之peg具 有約1，000道耳吞至約40,000道耳吞，例如，約 20,000道耳吞至約40,000道耳吞之分子量。 關於範例具體例，類似物可包含其中之側鏈係共價鍵 聯至醯基或烷基之位於C-端延伸内的經修飾胺基酸。經 醯化或烷化之類似物可係根據「醯化及烷化」之章節中所 述的經醯化或院化肽。在一些具體例中’醯基係C 4至 C30脂肪醯基，諸如’比方說，ci〇脂肪醯基或烷基、 C12脂肪醯基或烷基、C14脂肪醯基或烷基、C16脂肪 醯基或烷基、C18脂肪醯基或烷基、C20醯基或烷基、或 C22醯基或烷基。醯基或烷基可共價連接至類似物之任何 胺基酸，包括’但不限於，位置1〇或40處之胺基酸、 或C-端胺基酸。在一些具體例中，醯基或烷基係共價鍵 聯至式I、II、或III之胺基酸（例如，Lys殘基）的侧鏈。 醯基或烷基係共價鍵聯至對SEQ ID NO: 1、227、228、 229或230為天然的胺基酸，或其可鍵聯至經取代胺基 酸。醯基或烷基係共價鍵聯至對SEQ ID NO: 95、96、 171或172為天然的胺基酸，或其可鍵聯至經取代胺基 酸。 在以上的範例具體例中，其中該類似物包含醯基或烷 -119- 201010729 基，該類似物可透過如文中所述之間隔物連接至醯基或烧 基該間隔物’例如，可係3至1 〇個原子長度，且可係， • 例如’胺基酸（·，胺基己酸、文巾所述之任何胺基 ' 酸）、二肽（例如，A1a-Ala、βΑΙα-βΑΙα、Leu-Leu、

Pro Pro yGlu-yGiu)、三肽、或親水性或疏水性雙官能 間隔物。在某些態樣中，間隔物及醯基或燒基之總長度係 約1 4至約2 8個原子。 φ 在一些非常特定的具體例中，本發明之類似物包含選 自由 SEQ ID NO: 99-141、144-164、166、192-207、 2 09-2 21 及 223 或選自由 SEq id NO: 167-169、 173-178及225所組成之群之胺基酸序列。 此外’本發明之類似物的特定實例包括，但不限於， 表1-3中所提及之任一者。 在又進一步的範例具體例中，具有GIP激動劑活性之 胰高血糖素的類似物包含醯基或烷基（例如，對天然 '、、、I i 之胺基酸為非天然的醯基或烧基），其中該醯基或烧基係 連接至一間隔物，其中（i)該間隔物係連接至類似物之位 置10處之胺基酸的側鍵，或（ii)類似物包含在位置29處 之胺基酸C-端之1至21個胺基酸的延伸，且該間隔物係 連接至對應於相對於SEQ ID NO: 1之位置37_43之一 者之胺基酸的侧鏈，其中該類似物對GIP受體活化之 EC50係約10 nM或以下。 -120- 201010729 在此等具體例中，類似物可包含SEQ ID NO: 1之胺 基酸序列與（i)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸 修飾、（ii)在位置27、28、及29之一、二或全部處的胺 基酸修飾、（i i i)下列至少一者： (A) 該類似物包含在位置i及i + 4處之胺基酸之側鏈 之間或在位置j及j + 3處之胺基酸之侧鏈之間的内醯胺 ❹ ❹ 橋’其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j係 17， (B) 在類似物之位置16、20、21、及24處之胺基酸 中的一、二、三個、或全部係經α, α _二取代胺基酸取代； 或 (c)該類似物包含⑴位置16處之Ser經式IV之胺基 酸的胺基酸取代： Η

η2ν-C-COOH (CH2)n R1/、 [式 IV]， 其中n係1至7，其中Ri及R2各係獨立地選自由以下基 團組成之群：H'CVC”烷基、（Cl_Ci8烷基）〇h、（Ci_Ci8 燒基）NH2、（CVC"烷基）sh、（C〇-C4 烷基）（C3-C6)環烷 基、（c〇-c4烧基）（c2-c5 雜環基）、（Cq_C4院基kc6_Cio 芳基）尺7、及（CVC4烷基）（C3_C9雜芳基），其中尺7係Η -121- 201010729 或OH’及式IV之胺基酸的侧鏈包含自由胺基；及（u) 位置20處之Gin經α，α-二取代胺基酸的胺基酸取代，及 * (iv)至多6個進一步的胺基酸修飾。 - 此等具體例之類似物的α，α -二取代胺基酸可為任何 的α，α-二取代胺基酸，包括，但不限於，胺基異丁酸 (ΑΙΒ)、經選自甲基、乙基、丙基、及正丁基之相同或不 同基團、或經環辛烷或環庚烷二取代的胺基酸（例如，卜 ❺ 胺基環辛烧_1_叛酸）。在某些具體例中，α，α-二取代胺基 酸係ΑΙΒ。 此等具體例之類似物的式IV胺基酸可係任何的胺基 酸，諸如，比方說，式IV之胺基酸，其中η係i、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或 16。 在某些具體例中’ η係2、3、4、或5，在此情況中，胺 基酸分別係Dab、Orn、Lys、或升Lys。 ❿ 在任何以上的範例具體例中，位置1處賦予GIP激動 劑活性之胺基酸修飾可係His經不含咪唑侧鏈之胺基酸 取代。位置1處之胺基酸修飾可係，例如，His經大的芳 族胺基酸取代。在一些具體例中，大的芳族胺基酸係文中 所述之任一者，包括，例如，Tyr。 此外，關於以上的範例具體例，在位置27、28、及 29之一、二或全部處的胺基酸修飾可係文中所述之任何 在此等位置處的修飾。舉例來說，位置27處之Μ"可經 •122· 201010729 大的脂族胺基酸（視情況為Leu)取代，位置28處之Asn 可經小的脂族胺基酸（視情況為Ala)取代，及/或位置29 - 處之Thr可經小的脂族胺基酸（視情況為Gly)取代。或 、 者，類似物可包含在位置27及/或28處的此等胺基酸 修飾。 以上範例具體例之類似物可進一步包含卜9或1-6個 進一步的額外胺基酸修飾，例如，i、2、3、4、5、6、7、 φ 8或9個進一步的胺基酸修飾，諸如，比方說，文中所述

之任何提高或減低對任何GIP、GLP-1、及胰高血糖素受 體之/舌性、改良溶解度、改良循環中之作用期間或半衰 期、延遲作用之開始、或提高穩定性的修飾。類似物可進 一步包含，例如，在位置12處視情況經Ile取代的胺基 酸修飾、及/或在位置17及18處視情況經位置17處之 Q及位置18處之A取代的胺基酸修飾、及/或加成 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)^ XGPSSGAPPPS ❹ (SEQ ID NO: 96)、或含有一或多個相對於seQ ID NO: 9 5或9 6對C -端之保留性取代的序列。該類似物可包含 一或多個以下的修飾： (i) 位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D_Ala、Gly、 N-曱基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N-丁酸取代； (ii) 位置 1 0 處之 Tyr 經 Trp、Lys、〇rn、Glu、Phe、 或Val取代； •123· 201010729 (iii) 一醯基鍵聯至位置10處之Lys ; (iv) 位置1 2處之Lys經Arg取代； (v) 位置16處之Ser經Glu、Gin、升麵胺酸、升半 胱胺磺酸、Thr、Gly、Lys、或AIB取代； (vi) 位置17處之Arg經Gin取代； (vii) 位置 18 處之 Arg 經 Ala、Ser、Thr、或 Gly 取代； (viii) 位置 20 處之 Gin 經 Ala、Ser、Thr、Lys、瓜 胺酸、Arg、Orn、或AIB取代； (ix) 位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺 磺酸取代； (X)位置23處之Val經lie取代； (xi) 位置 24 處之 Gin 經 Asn、Ala、Ser、Thr、或 AIB取代；及 (xii) 在位置 2、5、9、10、1 1、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、24、27、28、及 29 中任一 者處之保留性取代。 在一些具體例中之類似物包含修飾（i)至（xii)之組 合。或者或另外地，類似物可包含位置3處之胺基酸修飾 (例如，Gin經Glu之胺基酸取代），其中該類似物對胰高 血糖素受體具有胰高血糖素之低於1%的活性。或者或另 外地，類似物可包含位置7處之胺基酸修飾（例如，Thr -124- 201010729 經不含羥基之胺基酸（例如，Abu或11 e)之胺基酸取代）、 刪除位置27或28處之胺基酸C-端的胺基酸、產生27_ • 或28_胺基酸肽、或其之組合，其中該類似物對GLP-1 - 受體具有GLP-1之低於約1 〇%的活性。 關於範例具體例，類似物可共價鍵聯至親水性部分。 在一些具體例中，類似物係共價鍵聯至胺基酸位置16、 17、20、21、24、29、40、或C_端之任—者處的親水 〇 性部分。在某些具體例中，類似物包括c-端延伸（例如， SEQ ID NO: 95之胺基酸序列）及包含親水性部分之胺基 酸的加成，以致親水性部分於位置4〇處共價鍵聯至類似 物。 在一些具體例中，親水性部分係共價鍵聯至類似物之 Lys、CyS、〇rn、升半胱胺酸、或乙醯基_苯丙胺酸。、 Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基_笨丙胺酸可係胰高血 ⑩ 糖素序列（SEQ ID NO:丨）之天然的胺基酸，或其可係取 代SEQ ID NO: 1之天然胺基酸的胺基酸。在一些具體 例中，其中該親水性部分係連接至Cys，對親水性部分之 鍵聯可包含以下結構

•125· 201010729 s^TNx^x-〇i^ yen 〇 0 n o ' g於包含親隸部分<_物，減水㈣分可係文 中所述之任何親水性部分。參見，例如，在「親水性部分 之鍵聯」章節下的教示。在—些具體例中，親水性部分係 聚乙二醇（PEG)。某些具體例中之PEG具有約1〇〇〇道 ❺ 耳吞至約4〇,〇〇〇道耳吞，例如，約2〇,〇〇〇道耳吞至約 40,000道耳吞之分子量。 在範例具體例中’其中該類似物包含透過間隔物連接 至類似物之醯基或烷基，該間隔物可係如文中所述之任何 間隔物。該間隔物，例如，可係3至丨〇個原子長度，且 可係，例如，胺基酸（例如，6_胺基己酸、文中所述之任 何胺基酸）、一肽（例如，Ala-Ala、pAla-pAla、Leu_Leu、 ❹ Pr〇-Pro、YG1u-yG1u)、三肽、或親水性或疏水性雙官能 間隔物。在某些態樣中，間隔物及醯基或烷基之總長度係 約1 4至約2 8個原子。 醢基或烷基係如文中所述之任何醯基或烷基，諸如對 天然產生之胺基酸係非天然的醢基或烧基。一些具體例中 之醯基或烷基係C4至C30脂肪醯基，諸如，比方說， C10脂肪醯基或烷基、C12脂肪醯基或烷基、C14脂肪 醯基或烷基、C16脂肪醯基或烷基、C18脂肪醯基或烷 -126- 201010729 基、C20醯基或烷基、或C22醯基或烷基、或C4至C30 烷基。在特定具體例中，醯基係C12至C1 8脂肪醯基（例 如，C14或C16脂肪醯基）。 在一些具體例中，在類似物之位置29處之胺基酸C-端之約1至約21個胺基酸之延伸包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96) (其中X係任何胺基酸）、或GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 170)或 XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 171)或 XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 172)(其中 X 係 Gly 或 小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸）之胺基酸序列。在 一些具體例中’該約1至約21個胺基酸可包括含有一或 多個相對於 SEQ ID NO: 95 ' 96、170、171 或 172 之 保留性取代的序列。在一些具體例中，經醯化或烷化之胺 基酸係位在C-端延伸類似物的位置37、38、39、40、 41、42、或43處。在某些具體例中’經醯化或烷化之胺 基酸係位在C -端延伸類似物的位置4 〇處。 醫藥址成物反治療方法 在一些態樣中，本發明提供一種包含任何本文所揭示 之新穎騰南血糖素肽（其較佳為無菌且較佳具有至少 904、91%、92%、93%、94%、95¾、96%、97%、98% 或9 9 %之純度值）、及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或 -127- 201010729 賦形劑的醫藥組成物。此等組成物可包含濃度至少A的 胰高血糖素肽’其中A係〇,001毫克/毫升、〇.〇1毫克 /毫升、0.1毫克/毫升、〇5毫克/毫升、1毫克/毫 升、2毫克/毫升、3毫克/毫升、4毫克/毫升、5毫克 /毫升、6毫克/毫升、7毫克/毫升、8毫克/毫升、9 毫克/毫升、10毫克/毫升、11毫克/毫升、12毫克/ 毫升、13毫克/毫升、14毫克/毫升、15毫克/毫升、 16毫克/毫升、17毫克/毫升、is毫克/毫升、19毫 克/毫升、20毫克/毫升、21毫克/毫升、22毫克/毫 升、23毫克/毫升、24毫克/毫升、25毫克/毫升或以 上。在其他具體例中，此等組成物可包含濃度至多B的 胰高血糖素肽，其中B係30毫克/毫升、25毫克/毫升、 24毫克/毫升、23毫克/毫升、22毫克/毫升、21毫 克/毫升、20毫克/毫升、19毫克/毫升、18毫克/毫 升、17毫克/毫升、16毫克/毫升、15毫克/毫升、14 毫克/毫升、13毫克/毫升、12毫克/毫升、11毫克/ 毫升、10毫克/毫升、9毫克/毫升、8毫克/毫升、7 毫克/毫升、6毫克/毫升、5毫克/毫升、4毫克/毫 升、3毫克/毫升、2毫克/毫升、1毫克/毫升、或〇.1 毫克/毫升。在一些具體例中’組成物可包含在A至B 毫克/毫升之濃度範圍的騰南血糖素狀’例如，0.001至 30.0毫克/毫升。在一具體例中’醫藥組成物包含經滅 -128- 201010729 菌且視情況储杨各種容器内的水溶液。在—些具體例 ^可使用本發明之化合物於製備立即可注射的預調配溶 液。在其他具體例中，醫藥組成物包含决乾粉末。醫藥植 成物可經進-步包裝為包括用於將組成物投與病患之可 棄式裝置之套組的部分。容器或套組可經標示為在環境室 溫或在冷凍溫度下儲存。

胰高血糖素肽可使用任何標準的給藥途徑（包括_ 腸道，諸如靜脈内、腹膜内、皮下或肌肉内、勒内、經皮、 經直腸、經口'經鼻或經吸入)投與病患。在-具體例中， 组成物係經皮下或肌肉内投與。 在-具體例中，套組具有用於將姨高血糖素組成物投 與病患的裝置，例如，注射器針、筆裝置、噴射注入器或 其他不含針的注人器。另—種方式或除此之外，套組可包 括-或多個容器’例如，小藥瓶、管、瓶'單室或多室預 填充注射器、卡g、輸注栗（外部或可植人式）、喷射注入 器、預填充筆裝置及其類似物，其視情況含有呈來乾形式 或呈水溶液的胰高血糖素肽。套組較佳亦包括使用說明。 在一些具體例中，套組之裝置係氣溶膠配送裝置，其中該 組成物係預包裝於氣溶膠裝置内。在另一具體例中，套組 包括注射器及針，且在-具體例中’將無菌胰高金糖素組 成物預包裝於注射器内。 根據-具體例，提供-種醫藥組成物，其中該組成物 -129- 201010729 包含本揭示案之GIP活性胰高血糖素類似物、或其醫藥 學上可接受之鹽、及醫藥學上可接受之載劑。醫藥組成物 可包含任何醫藥學上可接受之成分，包括，例如，酸化劑、 - 添加劑、吸附劑、氣溶膠推進劑、空氣置換劑、驗化劑、 防結塊劑、抗凝聚劑、抗微生物防腐劑、抗氧化劑、抗菌 劑、驗、黏合劑、緩衝劑、鉗合劑、塗布劑、著色劑、乾 燥劑、清潔劑、稀釋劑、消毒劑、崩解劑、分散劑、溶解 ❿ 增進劑、染料、潤滑藥、乳化劑、乳液穩定劑、填料、成 膜劑、香味增進劑、芳香劑、流動增進劑、膠凝劑、製粒 劑、濕潤劑、潤滑劑、黏膜黏著劑、軟膏基質、軟膏、油 質媒劑、有機鹼、錠劑基質、顏料、增塑劑、磨光劑、防 腐劑、螯隔劑、皮膚滲透劑、增溶劑、溶劑、穩定劑、拴 劑基質、表面活性劑、界面活性劑、懸浮劑、甜味劑、治 療劑、增稠劑、張力劑、毒性劑、黏度提高劑、吸水劑、 Q 可與水相混溶之共溶劑、水軟化劑、或潤濕劑。 在一些具體例中，醫藥組成物包含以下成分之任一者 或組合：阿拉伯膠、醋磺内酯鉀、擰檬酸乙醯基三丁酯、 摔檬酸乙醢基三乙醋、境月旨、白蛋白、醇、脫水醇、變性 醇、稀醇、蟲膠酸、海藻酸、脂族聚酯、氧化鋁、氫氧化 鋁、硬脂酸！呂、支鏈搬粉、心直鏈殿粉、抗壞血酸、抗壞 血酸基棕橺酸醋、阿斯巴甜、注射用之抑菌水、息土、膨 潤土乳、氯化苯f烴錄、氯化苯齊松如㈣心以⑽ -130- 201010729 chloride)、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苄酯、溴硝丙二醇 (bronopol)、丁基化羥基甲氧苯、丁基化羥基曱苯、對羥 基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丁酯鈉、海藻酸鈣、抗壞血 酸#5、奴酸飼、環己胺續酸約、無水磷酸氫辑、脫水碌酸 氫鈣、磷酸三鈣、丙酸鈣、矽酸鈣、山梨酸鈣、硬脂酸鈣、 硫酸鈣、半水合硫酸鈣、菜籽油、卡波姆（carb〇mer)、 二氧化碳、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、β _胡蘿蔔 素、角叉菜膠、蓖麻油、氫化蓖麻油、陽離子乳化蠛、醋 酸纖維素、醋酸酞酸纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、 粉狀纖維素、矽化微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、鯨蠟硬 脂醇（cetostearyl alcohol)、溴化十六烧基三曱録 (cetrimide)、鯨蠟醇、洗必太（chl〇rhexidine)、氯丁醇、 氯甲酚、膽固醇、洗必太乙酸鹽、洗必太葡萄糖酸鹽、洗 必太鹽酸鹽、氯二氟乙烷（HCFC)、氯二氟曱烷、氣氟碳 化物（CFC)氯苯氧乙醇、氯二甲苯酚、玉米糖漿固體、無 水檸檬酸、單水合檸檬酸、可可脂、著色劑、玉米油 '棉 籽油、甲酚、間曱酚、鄰曱酚、對曱酚、交聯羧甲基纖維 素納、交聯聚乙稀η比洛咬酮（Cr〇Sp〇vid〇ne)、環己胺績 酸、環糊精、葡萄糖結合劑（dextrate)、糊精、葡萄糖、 無水葡萄糖、重氮烧基味啥腺（(11杜2〇1丨(1丨11)^111代3)、醜酸 二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、酞酸二乙酯、二氟乙 烧（HFC)、二甲基-0-¾糊精、環糊精型化合物諸如 -131 - 201010729

Captisol®、二甲醚、酞酸二甲酯、乙二胺四乙酸二鉀、 乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉、多庫酯（d〇cusate)鈣、 多庫酯鉀、多庫酯鈉、五倍子酸十二烷酯、溴化十二烷基 三甲銨、乙二胺四乙酸鈣二鈉、乙二胺四乙酸、N_乙基 D-葡糖胺、乙醇、乙基纖維素、五倍子酸乙酯、月桂酸 乙酉曰、乙基麥芽酚 '油酸乙酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥 基苯甲酸乙酯鉀、對羥基苯▼酸乙酯鈉、乙基香草醛、果 〇 糖、果糖液體、研磨果糖、無熱原果糖、粉狀果糖、反丁 烯二酸、明膠、葡萄糖、液態葡萄糖、飽和植物脂肪酸之 甘油酯混合物、甘油、蘿酸甘油酯、單油酸甘油酯、單硬 月曰酸甘油酯、自乳化單硬脂酸甘油酯、棕櫚硬脂酸甘油 酉曰、甘胺酸、一醇、四氫0夫喃聚乙二醇醚（glyc〇fur〇l)、 古亞膠（guar gUm)、七氟丙烷（hfC)、溴化十六烷基三 曱銨、咼果糖糖漿、人類血清白蛋白、碳氫化合物（HC)、 ⑩ 稀鹽酸、氫化植物油、第π型、羥乙基纖維素、2_羥乙 基-β -環糊精、羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、2 _ 羥丙基-β-環糊精、羥丙基曱基纖維素、酞酸羥丙基曱基 纖維素、咪唾烷基脲（imidurea)、靛卡紅（indig〇 carmine)、離子交換劑、氧化鐵、異丙醇、肉豆蔻酸異 丙酯、棕櫚酸異丙酯、等張食鹽水、高嶺土、乳酸、乳糖 醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、無水羊毛脂、卵磷脂、矽 酸鎂鋁、碳酸鎂、正碳酸鎂、無水碳酸鎂、氫氧化碳酸鎂、 -132- 201010729 氫氧化鎂、月桂基硫酸鎂、氧化鎂、矽酸鎂、硬脂酸鎂、 三矽酸鎂、無水三矽酸鎂、蘋果酸、麥芽、氫化麥芽糖、 氫化麥芽糖溶液、麥芽糊精、麥芽醇、麥芽糖、甘露糖醇、 中鏈二甘油酯、葡甲胺、薄荷腦、曱基纖維素、甲基丙烯 酸甲酯、油酸甲酯、對羥基苯曱酸甲酯、對羥基苯甲酸曱 酯鉀、對羥基苯甲酸曱酯鈉、微晶纖維素及羧甲基纖維素 鈉、礦物油、輕質礦物油、礦物油及羊毛脂醇、油、撖欖 〇 油、單乙醇胺、微晶高嶺石、五倍子酸辛酯、油酸、棕櫚 酸、石蠟、花生油、石蠟脂、石蠟脂及羊毛脂醇、醫藥釉 料、酚、液化酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇'乙酸苯 基汞、硼酸苯基汞、硝酸苯基汞、波拉克林（p〇lacriUn)、 波拉克林鉀、聚羥亞烴（poloxamer)、聚葡萄糖、聚乙二 醇、聚氧化乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯_聚氧伸丙基嵌段 聚合物、聚曱基丙烯酸酯、聚氧伸乙基烷基醚、聚氧伸乙 ❹ 基蓖麻油衍生物、聚氧伸乙基山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧伸 乙基硬月曰酸酯、聚乙稀醇、聚乙缔基。比„各啶酮、海藻酸卸、 苯甲酸卸、奴酸鼠卸、亞硫酸氫卸、氯化卸、擰檬酸卸、 無水檸檬酸鉀、磷酸氫鉀、偏二亞硫酸鉀、單鹼磷酸鉀、 丙酸鉀、山梨酸卸、普維酮（povid〇ne)、丙醇、丙酸、 碳酸丙二醋、丙二醇、丙二醇海蕩酸醋'五倍子酸丙醋、 對經基表甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯鉀、對經基苯甲酸 丙酯鈉、硫酸魚精蛋白、菜籽油、生理食鹽水（Ringer，s -133- 201010729 solution)、糖精、糖精録、糖精#5、糖精納、紅花子油、 皂石、血清蛋白質、芝麻油、膠態石夕石、膠態二氧化石夕、 海藻酸納、抗壞血酸納、苯甲酸納、碳酸氫鈉、亞硫酸氫 鈉、氯化鈉、無水#檬酸鈉、脫水檸檬酸鈉、氣化納、環 己胺確酸鈉、乙二胺四乙酸納、十二烧基硫酸鈉、月桂基 硫酸納、偏二亞硫酸納、麟酸納、二驗鱗酸納、單驗磷酸 納、三驗無水丙酸納、丙酸納、山梨酸納、殺粉經基乙酸 納、硬脂基反丁烯二酸納、亞硫酸鈉、山梨酸、脫水山梨 糖醇酯（脫水山梨糖醇脂肪酯）、山梨糖醇、山梨糖醇溶液 7 0%、大豆油、鯨蠟、澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、預 凝膠化殿粉、可滅菌玉米澱粉、硬脂酸、純化硬脂酸、硬 脂醇、蔗糖、糖、可壓縮糖、粉糖、糖球、轉化糖、糖片 、食用黃色 5 號（Sunset Yellow FCF)、合 成石躐、滑石、酒石酸、酒石黃、四氟乙烧（HFC)、可可 油（theobroma oil)、乙汞硫柳酸鈉、二氧化鈦、α生育 酚、醋酸生育酚、α生育酚琥珀酸酯、β_生育酚、δ_生育 酚、γ-生育酚、黃蓍膠、甘油三乙酸酯、檸檬酸三丁酯、 三乙醇胺、檸檬酸三乙酯、三甲基環糊精、溴化三甲 基十四烷基銨、托立斯緩衝液（trisbuffer)、乙二胺四乙 酸二鈉、香草醛、1型氫化植物油、水、軟水、硬水、無 二氧化碳水、無熱原水、注射用水、吸入用無菌水、注射 用無菌水、沖洗用無菌水、€、陰離子乳化躐、巴西掠搁 -134- 201010729 堪、陽離子乳化蠛、錄蠛酯蟻、微晶蠛、非離子乳化蟻、 栓劑蠟、白蠟、黃蠟、白石蠟脂、羊毛脂、三仙膠、木糖 - 醇、玉米蛋白、丙酸鋅、鋅鹽、硬脂酸辞、或任何在以下 艾獻今的滅形鳅，.醫藥賦形劑手冊（Handb〇〇k

Pharmaceutics Excipienis)，第三版，A H Kib}^ (Pharmaceutical Press，London，UK, 2000)，將其全 體以引用的方式併入本文中。雲代夢痹存學 Φ (Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第十六版， E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)(將其全體以引用的方式併入本文中）揭示各種用於 調配醫藥學上可接受之組成物的成分及用於其製備的已 知技術。除非任何習知試劑與醫藥組成物不相容，否則涵 蓋將其使用於醫樂組成物中。亦可將補充的活性成分併入 至組成物中。 本文所揭示之醫藥調配物可如下所述經設計為短 鲁 效、快速釋放、長效、或緩釋。醫藥調配物亦可經調配為 立即釋放、控制釋放或緩慢釋放。本組成物可進一步包 含’例如，微膠粒或脂質體、或一些其他囊封形式，或可 以延長釋放形式投與以提供長期儲存及/或傳遞作用。所 揭示之醫藥調配物可根據任何方案投與，包括，例如，每 天（母天1次、母天2次、母天3次、每天4次、每天5 次、母天6次）、每兩天、每二天、每四天、每五天、每 -135- 201010729 六天、每週、每雙週、每三週、每月、或每雙月。 在一些具體例中’前述成分可以任何濃度（諸如，比 方說，至少A)存在於醫藥組成物中，其中a係o.oooi 〇/0 w/v ' 0.001% w/v ' 0.01% w/v > 0.1% w/v > 1% w/v ' 2% w/v、5% w/v、10% w/v、20% w/v、3 0% w/v、 40% w/v、50% w/v、60% w/v、70% w/v、80% w/v、 或90% w/v。在一些具體例中，前述成分可以任何濃度（諸 如，比方說，至多B)存在於醫藥組成物中，其中b係9 0 % w/v、80% w/v、70% w/v、60% w/v、5 0% w/v、40% w/v ' 3 0% w/v ' 20% w/v ' 10% w/v ' 5% w/v ' 2% w/v ' 1% w/v、0.1% w/v、0.001% w/v、或 〇.〇〇〇”/〇。在其 他具體例中，前述成分可以任何濃度範圍（諸如，比方說， 約A至約B)存在於醫樂組成物中。在一些具體例中，A 係 0.0001 %及 B 係 90%。 醫藥組成物可經調配以達到與生理相容的pH。在一 些具體例中’醫藥組成物之pH可視調配物及給藥途徑而 為至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少 7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10、或 至少10.5直至且包括pH 11。在某些具體例中，醫藥組 成物可包含緩衝劑以達到與生理相容的pH。緩衝劑可包 括任何可在期望pH下緩衝的化合物，諸如，比方說，麟 酸鹽緩衝液（例如，PBS)、三乙醇胺、Tris、二羥乙甘胺 -136- 201010729 酸（bicine)、TAPS、麥黃酮（tricine)、HEPES、TES、 MOPS、PIPES、二甲基胂酸鹽（cacodylate)、MES 等等。 在某些具體例中，緩衝劑的濃度係至少0.5 mM、至少1 mM、至少5 mM、至少10 mM、至少2 0 mM、至少3 0 mM、至少40 mM、至少50 mM、至少60 mM、至少 70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少1 00 mM、至 少120 mM、至少150 mM、或至少2 00 mM。在一些具 φ 體例中，緩衝劑的濃度係不多於300 mM(例如，至多200 mM、至多1 〇〇 mM、至多90 mM、至多80 mM、至多 7 0 mM、至多60 mM、至多50 mM、至多40 mM、至 多30 mM、至多20mM、至多1〇 mM、至多5 mM、 至多1 mM)。 作為GIP/GLP-1共同激動劑、胰高血糖素/GIP共 同激動劑及騰南灰糖素/ GIP/GLP-1三重激動劑之姨 Q 高血糖素肽可以其各者之活性先前經描述為有用的任何 指示使用。舉例來說，胰高血糖素活性可提高葡萄糖值、 供騰島素緩衝用、或減低放射線檢查期間的腸螺動性。 GLP-1活性可降低葡萄糖值，係一種有用於治療高血糖 (例如，糖尿病）的活性。GLP-1活性亦可誘發減重或預防 增重，例如，透過減低食慾。GIP活性亦可降低葡萄糖值， 係一種有用於治療高血糖（例如，糖尿病）的活性。 GIP/GLP-1共同激動劑及姨高血糖素/Gip / -137- 201010729 GLP -1二重激動劑尤其有利於誘發減重或預防增重，以 及用於治療高血糖’包括糖尿病。文中揭示的活體内數據 顯示GIP激動劑活性與glp-i激動劑活性之組合較單獨 - 的GLP-1對減重產生更大的效果。有鑑於在技藝中需要 拮抗GIP來降低每日食物攝取及體重、及提高胰島素敏 感性及能量消耗的教示，此活性係尤其在意料之外。 (Irwin 等人，Diabetologia 50: 153 2-1540 (2 00 7);及 ❹ Althage等人，JBiolChem，2008年4月17日之電子 刊物）。 文中揭示的活體内數據亦顯示GIP激動劑活性與 GLP-1激動劑活性之組合可降低葡萄糖值。 因此，預期文中所述之胰高血糖素肽可用來降低或維 持體重，或治療高血糖，或降低血糖值，或標準化及/或 穩定化血糖值。 ◎在一些具體例中，提供一種治療高血糖之方法，或一 種降低增重或誘發減重之方法，其包括投與有效量之包含 本發明之胰高血糖素肽的水溶液。在其他具體例中，提供 一種治療糖尿病之方法，其包括共同投與習知劑量或降低 劑量之胰島素及本發明之胰高血糖素肽。亦提供利用本發 明之騰高血糖素肽，不共同投與騰島素而治療糖尿病之方 法。 預期此等用於治療高血糖的方法有用於各種類型的 -138- 201010729 咼血糖，包括糖尿病、第j型糖尿病、第π型糖尿病、 或妊娠糖尿病（包括胰島素依賴型及非胰島素依賴型），及 降低糖尿病的併發症包括腎病變、視網膜病變及血管疾 . 病。 預期用於降低食慾或促進體重減輕之方法有用於減 輕體重，預防增重，或治療各種原因的肥胖症（包括藥物 引發的肥胖症），及減少與肥胖症相關的併發症包括血管 〇 疾病（冠狀動脈疾病、中風、周邊血管疾病、局部缺血再 灌流等）、高血壓、第π型糖尿病的肇始、高脂血症及肌 肉骨骼疾病。 代謝症候群（亦稱為代謝症候群X、胰島素抗性症候 群或瑞文氏（Reaven，s)症候群）係一種影響超過五千萬個 美國人的病症。代謝症候群典型上的特徵在於以下危險因 子之至少二種或以上的群集：（丨）腹部肥胖（在腹部及周圍 ❹之過多的脂肪組織），（2)致動脈粥樣化的血脂異常（增進 斑塊在動脈壁之累積之包括高三酸甘油醋、低Hdl膽固 醇及咼LDL膽固醇的血脂病症），（3)高血壓，（4)胰島素 抗性或葡萄糖耐受不良，（5)易血栓狀態（例如，血液中之 南纖維蛋白原或纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑-〗）、及（6) 促發炎狀態（例如，血液中升高的c_反應性蛋白質）。其 他危險因子可包括老化、荷爾蒙不平衡及遺傳傾向。 代謝症候群與冠狀心臟病及其他與血管斑塊累積相 -139- 201010729 關之病症（諸如中風及稱為粥樣動脈硬化性心血管疾病 (ASCVD)的周邊血管疾病）的增加風險有關聯。患有代謝 ' 症候群的病患會從早期階段的胰島素抗性狀態進展至具 • 有ASCVD之進一步提高風險的晚期第π型糖尿病。不 欲受限於任何特定理論，胰島素抗性、代謝症候群與血管 疾病之間的關係可牵涉包括下列之一或多個同時發生的 致病機構：受損的胰島素刺激血管擴張、由於提高氧化應 Φ 激所引起之NO有效性之與胰島素抗性相關的降低、及脂 肪細胞衍生激素諸如脂聯素之異常（1^6“及Mather，Can. J. Cardiol. 20 (suppl. B):66B-76B (2004))。 根據2001年國家膽固醇教育計劃成人治療小組 (2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel)(ATP III)，同一個體中任何三 項下列特徵即符合代謝症候群的標準：（a)腹部肥胖（男性 腰圍超過102公分及女性超過88公分）；（b)血清三酸甘 油醋（150mg/dl或以上）；（c)hdL膽固醇（男性40mg/dl 或以下及女性50 mg/dl或以下）；（d)血壓（1 30/85或以 上），及（e)空腹血糖（1 1 〇 mg/d丨或以上）。根據世界衛生 組織（WHO) ’具有高胰島素值（高空腹血糖或單獨的高飯 後血糖）與至少兩項以下標準之個體即符合代謝症候群的 標準：（a)腹部肥胖（腰臀比大於0.9、身體質量指數至少 30 kg/m2、或腰圍超過37英吋）；⑻膽固醇小組顯示三 -140- 201010729 酸甘油酯遭度至少150 mg/dl或HDL膽固醇低於35 mg/dl ; (c)血壓140/90或以上，或正在治療高血壓。 (Mathur，Ruchi，「代謝症候群（Metabolic • syndrome)」’ Shiel，Jr.、William C.編輯，

MedicineNet.com，2009 年 5 月 11 曰）。 對於此處之目的，若個體符合2001年國家膽固醇教 育計劃成人治療小組或WHO所記述標準之任一或兩項 ❹ 之標準，則將該個體視為受代謝症候群所苦。 不受限於任何特定理論，文中所述之胰高血糖素肽適 用於治療代謝症候群。因此，本發明提供一種預防或治療 受檢者之代δ射症候群、或降低其之一、二、三或更多項風 險因子的方法，其包括向該受檢者投與可有效預防或治療 代謝症候群、或其風險因子之量之文中所述的胰高血糖素 肽。 ❿ 非酒精性脂肪肝病（NAFLD)係指稱自單純性脂肪肝 (脂肪肝）、至非酒精性脂肪性肝炎（NASH)、至肝硬化（肝 臟之不可逆的進行性結疤）之寬譜的肝病。NAFLD之所 有階段皆共同具有脂肪之累積（脂肪浸潤）於肝臟細胞（肝 細胞）中。單純性脂肪肝係某些類型之脂肪、三酸甘油酯 的異常累積於肝臟細胞中，而無發炎或結疤。在NASH 中，脂肪累積伴隨肝臟之不同程度的發炎（肝炎）及結疤 (纖維化）。發炎的細胞會破壞肝臟細胞（肝細胞壞死）。在 -141 - 201010729 術語「脂肪性肝炎」及「脂肪壞死」中，廯屄係指脂肪浸 潤，肝炎係指肝臟發炎，及壞死係指遭破壞的肝臟細胞。 NASH最終會導致肝臟結疤（纖維化）’然後導致不可逆的 進行性結疤（肝硬化）。由NASH所引起的肝硬化係 NAFLD譜中之最後且最嚴重的階段。（Mendler,

Michel，「脂肪肝：非酒精性脂肪肝病（NAFLD)及非酒 精性脂肪性肝炎（NASH)(Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic

Steatohepatitis (NASH))」，Schoenfield，Leslie 編 輯 ’ J.，MedicineNet.com，2005 年 8 月 29 日）。 酒精性肝病、或酒精引發的肝病涵蓋三種與過量飲用 酒精相關或由其所引起之病理上不同的肝病：脂肪肝、慢 性或急性肝炎、及肝硬化。酒精性肝炎可包括從疾病的唯 才曰才示係異常的實驗室測試之溫和性肝炎至具有諸如黃 疫（由膽紅素滯留所引起的黃皮膚）、肝性腦病變（由肝臟 衰竭所引起的神經性機能障礙）、腹水（流體累積於腹 部）、食道靜脈曲張出血（食道的靜脈曲張）、異常凝血及 昏迷之併發症的嚴重肝臟功能不良。在組織學上，酒精性 肝炎具有包括肝細胞之氣球化退化、嗜中性細胞及有時馬 洛氏小體（Mallory bodies)之發炎（細胞中間絲蛋白之異 常聚集）的特性外觀。肝硬化在解剖學上的特徵在於肝臟 中之廣泛的節結結合纖維化。（worman，Howard j，「酒 •142- 201010729 精性肝病（Alcoholic Liver Disease)」，哥倫比亞大學 醫學中心（Columbia University Medical Center)網 站）。 - 不受限於任何特定理論’文中所述之胰高血糖素肽適 用於治療酒精性肝病、NAFLD、或其任何階段，包括， 例如’脂肪肝、脂肪性肝炎、肝炎、肝臟發炎、NASH、 肝硬化、或其併發症。因此，本發明提供一種預防或治療 ❹ 受檢者之酒精性肝病、NAFLD、或其任何階段的方法， 其包括向受檢者投與可有效預防或治療酒精性肝病、 NAFLD、或其階段之量之文中所述的胰高血糖素肽。此 等治療方法包括降低下列的一、二、三或更多項：肝臟脂 肪含量、肝硬化的發生或進展、肝細胞癌的發生、發炎跡 象（例如，異常的肝酵素值（例如，天冬胺酸轉胺酶AST 及/或丙胺酸轉胺酶ALT、或LDH)、升高的血清鐵蛋 〇 白、升高的企清膽紅素）、及/或纖維化跡象（例如，升高 的TGF-β值）。在較佳具體例中，使用姨高血糖素狀來治 療已發展至超越單純性脂肪肝（脂肪肝）且呈現發炎或肝 炎跡象的病患。此等方法可導致，例如，AST及/或alt 值的降低。 本發月之冑冋糖素肽可單獨或與其他抗糖尿病或 抗肥胖藥劑組合投與。技藝中已知或在研究中的抗糖尿病 劑包括騰島素，確醯基脲，諸如甲苯續丁腺⑽butamide) -143. 201010729 (Orinase)、乙醯苯續環己脲（acetohexamide) (Dymelor)、甲確0丫庚腺（tolazamide)(Tolinase)、氯續 • 丙脲（chlorpropamide)(Diabinese)、0比績環己脲 (glipizide )(Glucotrol)、優降糖 (glyburide)(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美 脲（glimepiride) (Amaryl)、或曱績雙環腺 (gliclazide)(Diamicron);美格替耐（meglitinides)， 0 諸如諾和隆（repaglinide) (Prandin)或糖立釋 (nateglinide)(Starlix);雙縮脈（biguanides)諸如二甲 雙胍（metformin)(Glucophage)或苯乙雙脈 (phenformin) ; »塞唑啶二酮諸如梵帝雅 (rosiglitazone)(Avandia)、愛妥糖（pioglitazone) (Actos)、或曲格列剩（troglitazone)(Rezulin)、或其他 PPARy抑制劑；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑 ❹ 制劑，諸如米格列醇（miglitol)(Glyset)、阿卡波糖 (acarbose)(Precose/Glucobay);艾塞那肽（exenatide) (Byetta)或普蘭林肽（pramlintide);二肽基肽酶·4 (DPP_4)抑制劑諸如維格列汀（vildagliptin)或西他列汀 (sitagliptin) ; SGLT(納依賴性葡萄糖轉運體〇抑制劑； 葡萄糖激酶活化劑（GKA);胰高血糖素受體拮抗劑 (GRA)，或FBPase(果糖1,6-雙磷酸酶）抑制劑。 技藝中已知或在研究中的抗肥胖劑包括瘦體素 -144- 201010729 (Leptin)及纖維母細胞生長因子2 1 (FGF-2 1)，食您抑制 劑，諸如苯乙胺型刺激劑、苯丁胺（phentermine)(視情況 • 含有芬氟拉明（fenfluramine)或右芬氟拉明 . (dexfenfluramine))、二乙胺苯酮（diethylpropion) (Tenuate®)、苯雙曱嗎琳（phendimetrazine) (Prelu-2®、Bontril®)、节非他明（benzphetamine) (Didrex®)、講美婷（sibutramine)(Meridia®、

Reductil®);利莫那班（rimonabant)(Acomplia®)、其 他大麻驗（cannabinoid)受體拮抗劑；調酸素；鹽酸氟西 汀（fluoxetine hydrochloride)(Prozac);奎内薩（Qnexa) (托吡酯（topiramate)及苯丁胺）、艾斯卡利亞（ExCalia) (鹽酸安非他酮（bupropion)及吐尼沙胺（zon is amide)) 或孔特拉夫（Contrave)(鹽酸安非他酮及納曲酮 (naltrexone));或脂酶抑制劑，類似於羅氏纖（xenical) (Orlistat)或西替利司他（Cetilistat)(亦稱為 ATL-962)、或 GT 389-255。 可使用保有騰高血糖素於低血糖病患中之葡萄糖提 升作用之本發明的胰高血糖素肽來治療低血糖，例如，預 防或治療急性、週期性或夜間低血糖。此等胰高血糖素肽 亦可與胰島素共同投與，以緩衝胰島素的作用並幫助維持 糖尿病患的穩定血糖值。在此等具體例中，提供一種於胰 島素依賴型病患中調節血糖值的改良方法。本揭示案之騰 145- 201010729 高企糖素肽可與胰島素作為單一組成物共同投與，作為個 别冷液同時投與，或者，胰島素及騰高血糖素肽可在彼此 • 丨同的時間投與。在—些具體例中，此方法包括投與可在 . 治療上有效控制糖尿狀量的胰島素及投與可在治療上 有效預防低i糖之量的本揭示案之新穎經修飾胰高血糖 素肽的步驟，其中該等投與步驟係彼此相隔不到η小時 進行。經修飾胰高血糖素肽相對於經投與騰島素的確切比 © 部分將係取決於病患之葡萄糖值及其他臨床參數的測 疋使血值「標準化」意謂使血糖值回歸正常（例如，若 血糖值高於正常值則使其降低，或若血糖值低於正常值則 使其升高）。使血糖值「穩定化」意謂降低一段時間（例如， M、時、16小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6 天或1星期）内之血糖值的最大變化。舉例來說，投與胰 高血糖素肽導致血糖值隨時間的維持較未投與胰高血糖 _ 素肽之情況更接近於正常葡萄糖值範圍。 可使用維持期望活性之本發明的胰高血糖素肽來引 起腸道的暫時麻痺供放射線用途用’或治療其他由胰高血 糖素之低血值所引起的代謝疾病。在此等具體例中，提供 -種引起腸道之暫時麻痺的方法。此方法包括向病患投與 或多種本文所揭示之騰高血糖素肽的步驟。 在一不同態樣中，本發明提供一種降低増重或誘發減 重、或治療高血糖之方法，其包括向有需要的病患共同投 •146- 201010729 與可有效降低增重或誘發減重或減低食慾之量的Gip受 體激動劑分子及GLP-1受體激動劑分子》兩種分子可係 一起在相同的組成物中。或者，在此等方法中可投與同時 ' ’舌化GIP及GLP-1受體的分子。各種受體激動劑（即活 化）性質之組合提供意料之外的加成或增效作用、或其他 意料之外的臨床效益。根據此等方法涵蓋投與習知劑量之 胰島素、降低劑量之胰島素、或不投與胰島素。範例的 ❹ GIP受體激動劑分子包括於對準至使配對最大化後在視 覺檢查時（例如）保有至少50%、60%、70%、或80%序 列實體的GIP或GIP類似物。範例的GLP-1受體激動劑 分子包括於對準至使配對最大化後在視覺檢查時（例如） 保有至少50%、60%、70%、或80°/。序列實體的GLP-1、 GLP-1類似物，於對準至使配對最大化後在視覺檢查時 (例如）保有至少50%、60%、70%、或80%序列實體的 〇 促胰島素分泌素_4類似物，或其衍生物。呈現兩種活性 的範例分子包括本發明之胰高血糖素肽、同時活化 GLP-1及GIP受體的GLP-1類似物、Gip及GLP-1之 融合物、或GIP類似物及GLP-1類似物之融合物、或其 之經化學修飾的衍生物。 包括（但不限於）治療低血糖之根據本發明的治療方法 可包括使用任何標準的給藥途徑（包括非經腸道，諸如靜 脈内、腹膜内、皮下或肌肉内、鞘内、經皮、經直腸、經 •147- 201010729 口、經鼻或經吸人）向病患投與目前揭示之騰高*糖素肽 的步驟。 . ㈣一些具體例’此等方法不包括在先前技藝中依據 • 錢經揭示有用於治療該特定疾病的任何胰高血糖素類 似物或GLP-W似物。在另一具體例中，亦可排除美國 專利第6,864,069號中所；田认、AdE & 口 跳r所述之用於治療糖尿病之同時作 為GLP-1激動劑及騰高灰糖素括抗劑的狀。在另一具體 〇 例_，本發明可排除使用胰高血糖素拮抗劑來治療糖尿 病，諸如Unson等人，又仏〇/ c心w ，264:789 794 (1 989)，Ahn 等人，c/^所.，44:3 109-3116 (2001);及 Sapse 等人，Mo/. Md.，8(5):25 1-262 (2002) 中所述之拮抗劑。在一些具體例中，可排除調酸素或包含 調酸素（SEQ ID NO: 97)之8個C-端胺基酸的胰高血糖 素肽。 調酸素係一種存在於小腸中之天然產生的消化激 素，其可誘發減重（參見Diabetes 2005; 54:2390-2395)。調酸素係包含姨高血糖素（即SEq ID NO: 1)之29個胺基酸序列接著SEQ ID NO: 97 (KRNRNNIA)之8個胺基酸羧基端延伸的37胺基酸 肽。雖然本發明涵蓋文中所述之胰高血糖素肽可視情況結 合至此8個胺基酸羧基端延伸（SEQ ID NO: 9 7)，但本 發明之一些具體例亦明確地涵蓋不含SEQ ID NO: 97之 • 148- 201010729 8個相連竣基胺基酸的膜高血糖素肽。 本發明之化合物不包括以下肽中之任一者，雖然本發 . 明中可包括呈現期望之共同激動劑或三重激動劑活性之 對其的進一步修飾、使用此等化合物的醫藥組成物、套 組、及治療方法：SEQ ID NO: 1之肽，具有[Argl2]取 代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO: 1之肽，具有 [Argl2，Lys20]取代且具有 c-端醯胺；SEQ ID NO: 1 ❹ 之肽，具有[八1*812，1^824]取代且具有（：-端醯胺；8£(510 NO: 1之肽’具有[Argl2，Lys29]取代且具有c-端醯胺； SEQ ID NO: 1 之肽’具有[Glu9]取代；SEQ ID NO: 1 之肽，缺少Hisl，具有[Glu9，Glul6，Lys29]取代及C- 端醯胺；8五(）1〇1^0:1之肽，具有[〇1119,011116，1^29] 取代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO: 1之肽，具有透過 内醯胺橋鍵聯的[Lysl3, Glul7]取代且具有（：_端醯胺； 0 SEQ ID NO: 1之肽，具有透過内醯胺橋鍵聯的[Lysl7,

Glu21]取代且具有C-端醯胺；SEq id NO: 1之肽，缺 少Hisl，具有透過内醯胺橋鍵聯的[Glu2〇, Lys24]取 代；於以下申請案中揭示的肽：2008年2月13曰提出申 請之PCT/US2008/05 3 85 7、2006年5月5曰提出申古青 之PCT/US20 06/0174 94、2007年8月17曰提出申古青 之 PCT/US2007/01 841 5、2005 年 2 月 25 曰提出申請 之 PCT/GB200 5/000710、2000 年 3 月 29 曰提出申咬 -149- 201010729 3 & W請之 Mi用的方式併 之 PCT/GB00/01089、2006 年 2 月 l〇 PCT/US2006/005020，將其各者之全體 入本文中。 實施例 本發明之化合物可藉由標準合成方法、 里組DNA技 術、或任何其他製備肽及融合蛋白的方法製備得。雖然無 ❹ 域由標準的重組DNA技術表現某些非天然胺基酸，、: 技藝中知曉其之製備技術。除了適用的標準肽化學反應之 外，包含非肽部分的本發明化合物亦可藉由標準的有機化 學反應合成得。關於胰高企糖素肽之胰高血糖素及 GLP-1活性的額外資料亦揭示於2〇〇8年2月13曰提出 申請之PCT/US2008/053857中，將其全體以引用的方 式併入本文中。

實施例1 一般合成方案： 於經修改的Applied Biosystem 430 A肽合成器上 使用HBTU-活化之「FastBoc」單一偶合劑自0.2毫莫 耳之Boc Thr(OBzl)Pam樹脂開始合成得胰高血糖素類 似物。自 Midwest Biotech (Fishers，IN)取得 Boc 胺基 酸及HBTU。所使用之側鏈保護基為：Arg(Tos)、 •150- 201010729

Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、 Lys(2Cl-Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)、 及Trp(CHO)。N-端His上之側鏈保護基為Boc。 用哌啶於二甲基甲醯胺中之20%溶液處理各完成的 肽基樹脂’以自色胺酸移除曱醯基。在對甲盼及二甲硫之 存在下進行液態氟化氫分裂。分裂係使用HF裝置 (Penninsula Labs)於冰浴中進行1小時。於蒸發掉Ηρ φ 後，將殘留物懸浮於乙醚中並過濾出固體物質。將各肽萃

取至3 0-70毫升之乙酸水溶液中，並利用ηρLC

[Beckman System Gold，0.46x5cm Zorbax C8， lml/min，45C，214nm，A 緩衝液= 〇.i%TFA， B = 0.1 %TFA/90%乙猜，於i 〇分鐘内j 〇0/〇至8〇0/〇B之梯 度]分析經稀釋的等分試樣。 於FPLC上在2.2x25公分KromasilC18管柱上進 ❹ 行純化，同時並監測214奈米處2UV且收集5分鐘的 溶離份。將均勻的溶離份組合並凍乾得>9 5%之產物純 度。使用MALDI質譜分析確認準確的分子質量及純度。 實施例2 一般的聚乙二醇化方案：（Cys_順丁烯二醯亞胺基） 典型上，將胰兩血糖素Cys類似物溶解於磷酸鹽緩衝 鹽水（5-10毫克/毫升）中，及加入〇 〇1M乙二胺四乙酸 •151- 201010729 (總體積之1 0-1 5 %)。加入過量（2倍）的順丁烯二醯亞胺 基甲氧基PEG試劑（Nektar)，且將反應於室溫下攪拌同 時並利用Η P L C監測反應之進行。於8 - 2 4小時後，將反 應混合物酸化，且裝填於製備型逆相管柱上，以使用 0.1%TFA /乙腈梯度進行純化。將適當的溶離份組合並 凍乾得期望的聚乙二醇化類似物。 實施例3 胰高血糖素Cys17(l-29)及類似單cys類似物之合成 使用FastBoc HBTU -活化之單一偶合劑將存於毫 升反應容器中之0.2毫莫耳Boc Thr(OBzl)Pam樹脂 (SynChem Inc)及以下序列輸入及於經修改的Applied Biosystem 430 A肽合成器上執行。

HSQGTFTSD YSKYLDSCRAQDFVQWLMNT 使用以下之側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp^OeHex)、 Asn(Xan) > Cys(pMeBzl) ^ Glu(OcHex) ^ His(Boc) ^

Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CH0)、及

Tyr(Br-Z)。利用20%哌啶/二甲基▼醯胺處理完成的肽 基樹知，以移除Trp甲醯基保護，然後轉移至HF反應容 器中並於真空中乾燥。加人1〇毫升對甲紛及〇.$毫升二 甲硫連同一磁石攪拌棒。將容器連接至Ηρ裝置 (PenniSUlaLabs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及 •152- 201010729

凝結入大約l〇毫升之液態氟化氫。將反應於冰浴中攪拌 1小時’然後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中； 將固體過濾，以乙醚洗滌，且將肽萃取至5〇毫升乙酸水 • 溶液中。利用分裂萃取物之小樣品進行分析HPLC[0.46 X 5 cm Zorbax C8 ’ 1 ml/min，45C，214nm，A 緩衝液 為 0.1%TFA，B 緩衝液為 0.1%TFA/90%ACN，梯度= 於10分鐘内10%B至80%B]。將剩餘的萃取物裝填於 ❿ 2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上，且使用

Pharmacia FPLC系統執行乙腈梯度。收集5分鐘的溶離 份’同時並監測2 1 4奈米處之UV(2.0A)。A = 0.1 %TFA， 8 = 0.1%丁卩八/50%乙腈。梯度=於450分鐘内30%3至 100%B。 將含有最純產物的溶離份（48-52)組合冰凍，且凍乾 得3 0.1毫克。產物的HPLC分析顯示純度>90%，且 Ο M ALDI質譜分析顯示3429.7之期望質量。類似地製備 得胰高血糖素Cys21、姨高血糖素Cys24、及胰高血糖素 Cys29。 實施例4 胰高血糖素-Cex及其他C-踹延伸類似物之合点. 將285毫克（0.2毫莫耳）甲氧二苯曱基胺樹脂 (Midwest Biotech)置於60毫升反應容器中，且使用 •153- 201010729

FastBoc HBTU-活化之單一偶合劑於經修改的Applied

Biosystems 430A肽合成器上輸入並執行以下序列。

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGP

SSGAPPPS 使用以下之側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、

Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、 Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、及 ❹ Tyr(Br-z)。利用20%哌啶/二曱基甲醯胺處理完成的肽

基樹脂，以移除Trp曱醯基保護，然後轉移至HF反應容 器中並於真空中乾燥。加入1.0毫升對甲盼及〇5毫升二 甲硫連同一磁石攪拌棒。將容器連接至HF裝置 (PennisulaLabs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及 凝結入大約10毫升之液態氟化氫。將反應於冰浴中攪拌 1小時，然後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中； 將固體過濾，以乙醚洗滌’且將肽萃取至5 〇毫升乙酸水 ® 溶液中。對分裂萃取物之等分試樣進行分析ΗΡΕ(：[0.4ό X 5 cm Zorbax C8 ’ 1 ml/min，45C，214nm，Α 緩衝液 為 0.1%TFA，B 緩衝液為 〇.i%TFA/90%ACN，梯度= 於10分鐘内10 %B至80 %B]。將萃取物裝填於2.2x25 公分Kromasil C18製備型逆相管柱上，且使用 Pharmacia FPLC系統執行乙腈梯度以進行溶離。收集5 分鐘的溶離份，同時並監測214奈米處之UV(2.0A)。 -154- 201010729 A=0.1%TFA，B = 0.1〇/〇TFA/50% 乙腈。梯度=於 450 分鐘内3 0%B至1〇〇〇/〇B。將溶離份5 8-65組合，冰東且 凉·乾得1 9 8.1毫克。 產物的HPLC分析顯示純度大於95%。MALDI質譜 分析顯示存在作為C-端醯胺產物之4316.7之期望理論 質量。以經適當裝填之PAM樹脂開始，類似地製傷得作 為C-端羧酸的調酸素及調酸素-KRNR。 實施例5

騰高血糖素Cys17 Mal-PEG-5K 將15.1毫克之胰高血糖素Cys17(l-29)及27.3毫克 之甲氧基聚（乙二醇）順丁烯二醯亞胺平均M.W.5〇〇〇 (mPEG-Mal-5000，Nektar Therapeutics)溶解於 3.5 毫升之磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)中，並加入〇.5毫升之 0.01M乙二胺四乙酸（EDTA)。將反應於室溫下攪拌，並 利用 HPLC 分析[0.46 X 5 cm Zorbax C8，lml/min， 45C，214nm (0.5A)，A = 0.1o/〇TFA， B-(K1%TFA/90%ACN ’ 梯度=於 i〇 分鐘内 i〇%b 至 80%B]監測反應之進行。於5小時後，將反應混合物裝 填於2.2 X 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上。 於Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度，同時並監測2M 奈米處之UV波長且收集5分鐘之溶離份。 -155- 201010729 A = 0.1%TFA，B = 0.1%TFA/50% 乙腈，梯度=於 45〇 分鐘内自30%B至100%B。將對應於產物的溶離份組 合，冰凍且凍乾得2 5.9毫克。 於 HPLC[0.46 X 5 cmZorbaxC8，1 ml/min，45C， 214nm (0.5A)，A = 0.1%TFA，B = 0.10/〇TFA/900/〇ACN， 梯度=於10分鐘内自1〇〇/〇B至80%B]上分析此產物，其 顯示純度大約為90%。MALDI(基質輔助雷射脫附游離） 質譜分析顯示8700至9500之寬廣質量範圍（PEG衍生 物之典型值）。此顯示將大約5,000 a.m.u加成至起始騰 高血糖素肽（3429)之質量。 實施例6

胰高血糖素Cvs21 MaNPEG-5K 將21.6毫克之胰高血糖素Cys21(i_29)及24毫克之 mPEG-MAL-5000(Nektar Therapeutics)溶解於 3.5 毫 升之磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)中，並加入0.5毫升之0.01M 乙二胺四乙酸（EDTA)。將反應於室溫下攪拌。於2小時 後’加入另一 12.7毫克之mPEG-MAL-5 000。於8小時 後’將反應混合物裝填於2.2 X 25公分Vydac C1 8製備 型逆相管柱上，且於Pharinacia FPLC上於4毫升/分 鐘下執行乙腈梯度，同時收集5分鐘之溶離份。 A = 0.1%TFA ’ B = 〇.i%Tfa/5〇%acn。梯度=於 45〇 -156- 201010729 分鐘内自20°/〇至80%B。 將對應於出現產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得3 4 毫克。利用分析 HPLC[0.46 X 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，214nm (0.5A)，A = 0.1%TFA， B = 0.1%TFA/90%ACN，梯度=於 10 分鐘内自 1〇〇/〇b 至 80%B]分析產物顯示不同於起始胰高血糖素肽的均勻產 物。MALDI(基質輔助雷射脫附游離）質譜分析顯示87〇〇 至9700之寬廣質量範圍（PEG類似物之典型值）。此顯示 將大約5,000 a.m.u加成至起始胰高血糖素肽（3470)之 質量。 實施例7

胰高血糖素Cvs24 Mal_PEG-5K 在攪拌下將20.1毫克之胰高血糖素C24( 1 -29)及39.5 宅克之 mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解於 3.5毫升之PBS中，並加入〇·5毫升之0.01M EDTA。 將反應於室溫下攪拌7小時，然後加入另一 40毫克之 mPEG-Mal-500(^於大約15小時後，將反應混合物襄 填於2.2 X 25公分Vydac C18製備型逆相管柱上，且使 用Pharmacia FPLC執行乙腈梯度。收集5分鐘之溶離 份，同時並監測214奈米（2.0A)處之UV。A緩衝液 = 0.1%TFA，B 緩衝液= 〇.l%TFA/50%ACN，梯度=於 •157- 201010729 450分鐘内自30%B至1〇〇%Β。將對應於產物的溶離份 組合’冰凍且凍乾得45.8毫克。MALDI質譜分析顯示 最大值位於9175.2(其大約比胰高血糖素（：24(3 457.8)多 5,000 a.m.u.)之典型的peg寬信號。 實施例8

姨高血糖素 Cvs24 Mai-PEG-20K 在室溫於攪拌下將25.7毫克之胰高血糖素Cys24 (1-29)及 40.7 毫克之 mPEG-Mal-20K(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之PBS中，並加入0.5毫 升之0.01M EDTA。於6小時後，如利用HPLC所測得， 起始物料對產物之比大約為60:40。加入另一 25.1毫克 之mPEG-Mal-20K且使反應再多攪拌16小時。產物比 率並未顯著地改良’因此將反應混合物裝填於22 X 25 公分Kromasil C18製備型逆相管柱上，且於pharmacia FPLC上使用於450分鐘内自30%B至1〇〇〇/〇B之梯度進 行純化。A緩衝液= 0.1%TFA，B緩衝液= 〇.i%TFA/ 50%ACN，流率=4毫升/分鐘，且收集5分鐘之溶離份 同時並監測214奈米（2.0A)處之UV。將含有均勻產物的 溶離份組合，冰凉·且象乾得2 5.7毫克。利用分析η P L C 測得之純度為〜90%。MALDI質譜分析顯示自23 〇〇()至 27,000之寬峰，其大約比起始姨高血糖素c24(3457.8) -158- 201010729 多 20,000 a.m.u. 〇 實施例9

胰高血糖素Cys29 Mal-PEG-5K 在室溫於攪拌下將20.0毫克之胰高血糖素Cys29 (1-29)及 24.7 毫克之 mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之PBS中，並加入0.5毫 升之0.01MEDTA。於4小時後，加入另一 15.6毫克之 mPEG-Mal-5 000以驅使反應完全。於8小時後，將反應 混合物裝填於2.2 X 25公分Vydac C18製備型逆相管柱 上，且於Pharmacia FPLC系統上執行乙腈梯度。收集5 分鐘之溶離份同時並監測214奈米（2.0A)處之UV。 A = 0」％TFA’B = 〇.1%TFA/5 0%ACN。將溶離份 7 5-97 組合’冰凍且凍乾得40.0毫克之不同於在HPLC上之回 收起始物料（溶離份58_63)的產物。利用分析HPLC[0.46 X 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，214nm (0.5A)， A = 0.1%TFA ’ b = 〇.1%TFA/90%ACN，梯度=於 10 分 鐘内自10%B至80%B]分析產物顯示純度大於95〇/〇。 MALDI質譜分析顯示存在具8,000至1〇,〇〇〇之質量範 圍（最大值在9025.3)的PEG成分，其較起始物料（3 4 84.8) 大 5,540 a.m.u· 〇 -159- 201010729 實施例ίο 胰高血糖素Cvs24 Γ2 -丁内醋） . 於24.7毫克之胰高血糖素Cys24 (1 -29)中加入4毫 - 升之0.05]^碳酸氫銨/50%乙腈及5.5微升之2_溴_4_ 羥基丁酸-γ-内酯之溶液（100微升於9〇〇微升乙腈中）。 於在室溫下攪拌3小時後，將另一 1〇5微升之内酯溶液 加至反應混合物，將其再多攪拌15小時。以1〇%乙酸水 Φ 溶液將反應混合物稀釋至10毫升，並將其裝填於2.2 χ 25 公分Kromasil C18製備型逆相管柱上。於pharmacia FPLC上執行乙腈梯度（於45〇分鐘内自2〇〇/(^至 80%B)’同時收集5分鐘之溶離份並監測214奈米（2 〇a) 處之UV。流率=4毫升/分鐘，a = 〇.1%tfa , B = 〇，l%TFA/50%ACN。將溶離份74_77組合，冰來且 凍乾得7.5毫克。HPLC分析顯示純度為95。/。，且MALDI _ 質譜分析顯示3540.7之質量或較起始物料多84個質量 單位。此結果與加成單一的丁内酯部分一致。 實施例11 胰高血糖素Cys24(S-羧曱基） 將18.1毫克之胰高血糖素溶解於毫 升之0.1M磷酸鈉緩衝液（pH=9 2)中，並加入〇6毫升之 演乙酸溶液（1.3毫克/毫升於乙腈中）。將反應於室溫下 160· 201010729 授拌並利用分析HPLC追蹤反應的進行。於1小時後， 加入另一 0.1毫升之溴乙酸溶液。將反應再多攪拌6〇分 • 鐘，然後用乙酸水溶液酸化並裝填於2.2 X 25公分 - Kromasil C18製備型逆相管柱上進行純化。於

Pharmacia FPLC(流率=4毫升/分鐘）上執行乙腈梯 度’同時收集5分鐘之溶離份並監測214奈米（2.〇A)處 之 UV。A = 0.1°/〇TFA，B = 0.1%TFA/50%ACN。將溶 ❹ 離份26-29組合，冰凍且凍乾得數毫克之產物。分析 HPLC顯示純度為90%，且MALDI質譜分析破認3515 之期望產物的質量。 實施例12 底高血糖素Cys24順丁烯二醯砟脖篡，PEG_3.4k_:^艚 將16毫克之胰高血糖素（^^^及κ〇2毫克之 Mal-PEG-Mal-3 40 0，聚（乙二醇）_雙_順丁烯二醯亞胺平 均 M.W. 3400(Nektar Therpeutics)溶解於 3.5 毫升之 填酸鹽緩衝鹽水及0.5毫升之0 01m EDTA中，並將反 應於室溫下攪拌。於16小時後，加入另一 16毫克之胰 高血糖素Cys24並持續攪拌。於大約4〇小時後，將反應 混合物裝填於Pharmcia PepRPC 16/10管柱上，並於 Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度，同時收集2分鐘之溶 離份並監測214奈米（2.0A)處之UV。流率=2毫升/分 •161· 201010729 鐘，A = 0.1%TFA，B = 0.1%TFA/50%ACN。將溶離份 69-74組合，冰凍且凍乾得10.4毫克。分析HPLC顯示 純度為90%，且MALDI質譜分析顯示在9500-11，000 範圍内之成分，其與期望的二聚體一致。

胰高血糖素Cy(24(i_29) 3457.8 3457.8 3572.0 10487.6

η PE 胰高血糖素C(/s24(1-29)

3400 η 實施例13 胰高血糖素内醯胺之合成 將285毫克（0.2毫莫耳）之甲氧二苯甲基胺樹脂 (Midwest Biotech)加至60毫升之反應容器，且使用Boc DEPBT-活化之單一偶合劑在經修改的Applied Biosystems 430A肽合成器上組裝以下序列。 HSQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVQWLMNT-N H2 (12-16内醯胺） 使用以下的側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHx)、 Asn(Xan)、Glu(OFm)、His(BOM)、Lys(Fmoc)、 Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、Tyr(Br-Z)。若内醯 -162- 201010729 胺係由16-20、20-24、或24_28所構成，則於位置12 處使用Lys(Cl-Z)。在旋轉下用2〇%哌啶/二甲基甲醯 . 胺將完成的肽基樹脂處理1小時，以移除Trp甲酿基以及 • 自Lys12及Glul6移除Fm〇c及〇Fm保護。當由陽性 水合茚三酮（positive ninhydrin)試驗確認移除時將樹 脂先用二甲基甲醯胺’接著用二氯甲烷及隨後再次用二甲 基甲醯胺紐1存於二甲基甲㈣及二異丙基乙基胺 © (DIEA)中之520毫克（1毫莫耳）苯并三唑-1-基-氧基-參 -吡咯錠鱗六氟磷酸鹽（PyB〇p)處理樹脂。使反應進行 8-10小時，且由陰性水合節三酮反應確認環化。將樹脂 先用二甲基曱醯胺，接著再用二氯甲院洗蘇，及隨後用三 氟乙酸處理1G分鐘。由陽性水合茚三_反應確認—基 围之移除。將樹脂用二甲基曱醯胺及二氯曱烧洗滌並乾 燥，隨後再轉移至氫氟酸（HF)反應容器。加入5〇〇微升 ◎ 對f酚連同一磁石攪拌棒。將容器連接至只1?裝置 (PeninsulaLabs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及 將大約1〇毫升之液態氫氟酸凝結至容器十。將反應於冰 浴中授掉1小時，隨後於真空中移除hf。將殘留物懸浮 於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將肽用15〇毫 升之20%乙腈/1〇/0乙酸溶解。 在以下條件[4.6又30]11111；^61^(2：8，1.50 mL/min ’ 220 urn ’ A 緩衝液為 〇 丄％ tfa/10% ACN， 163· 201010729 B緩衝液為0.1% TFA/1〇〇〇/0 ACN，梯度為於15分鐘内 5_95%B]下進行粗製溶解肽的分析性HPLC分析。將萃 ’ 取液用水稀釋兩倍，且裝填於2.2 X 25公分Vydac C4 製備型逆相管柱上，並於Waters HPLC系統上使用乙腈 梯度溶離（A緩衝液為〇·ι% TFA/10% ACN，B緩衝液 為0.1% TFA/10% ACN，及在15.00毫升/分鐘之流率 下於120分鐘内〇-i〇〇〇/0 b之梯度）。經純化肽之HPLC Ο 分析顯示純度大於95% ’且電噴灑游離（eieetrospray ionization)質譜分析碟認12-16内酿胺之3506Da的質 量。類似地製備來自16-20、20-24、及24-28的内醯胺。 實施例14 悉AA糖素容解唐檢定法： 製備存於0.0 IN HC1中之胰高血糖素（或類似物）的 溶液（1毫克/毫升或3毫克/毫升）。用0.01NHC1將 100微升之儲備溶液稀釋至1毫升，並測定uv吸光度 (2 76奈米）。使用2〇〇_25〇微升之（)1]^：^21^〇4 (PH9.2)將剩餘儲備溶液之pH調整至pH7。使溶液於4 C下靜置隔夜然後離心。接著用〇.〇1N HC1將100微升 之上清液稀釋至1毫升，並測定UV吸光度（重複兩次）。 補償起始吸光度讀數之體積的增加，且使用以下計算 於確定溶解度百分比： 最終吸光度 -164· 201010729 x 1〇〇 =溶解百分比 實施例15 姨高血糖素受體結合檢定法 利用閃爍親近（scintillation proximity)檢定技術於 競爭結合檢定法中量測肽對胰高血糖素受體的親和力。將 於閃爍親近檢定緩衝液（〇.〇5 MTris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl ’ 0.1% w/v牛血清白蛋白）中製得之肽的連續3 倍稀釋液於96孔白色/透明底盤（Corninginc，Acton， ΜΑ)中與〇_〇5 nM (3-[1251]_破酪胺醯基）TyrlO胰高血 糖素（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)(每孔 l-ό微克）、由過度表現人類胰高血糖素受體之細胞製備 得之細胞質膜片段、及1毫克/孔之經聚乙烯亞胺處理之 小麥胚芽凝集素（agglutinin) A型閃爍親近檢定珠粒 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)混合。當於 旋轉搖盪器上在800 rpm下搖盪5分鐘後，將盤於室溫 下培養12小時’然後於MicroBetal450液體閃爍計數 器（Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上進行讀取。於具有 較測試樣品之最高濃度大4倍濃度之「冷」天然配體的孔 中量測非特異結合（NSB)放射性，且於沒有競爭物的孔中 4貞測總結合放射性。特異結合百分比係計算如下：特異会士 合％ =((結合-NSB)/(總結合_NSB))X10〇cIC50值係經由 -165- 201010729 使用 Origin 軟體（OriginLab，Northampton, ΜΑ)而測 得。 實施例16 功能檢定法-cAMP厶# 於基於螢火蟲螢光素酵素之報告檢定法中量測胰高 血糖素類似物誘發cAMP的能力。經由於經補充0.25% 牛生長血清（HyClone, Logan, UT)之 DMEM(Invitrogen，Carlsbad, CA)中培養 10 小時，然 後再用胰高血糖素、GLP-1、GIP或新穎胰高血糖素類似 物之連續稀釋液於3 7 °C ’於96孔經塗布聚-D-離胺酸之 「Biocoat」盤（BD Biosciences, San Jose，CA)中之 5%C〇2下培養5小時’而將經共轉染受體（騰高血糖素受 體、GLP-1受體或GIP受體）之HEK293細胞及鍵聯至 cAMP反應元件之螢光素酵素基因除去血清。於培養結束 時’將100微升之LucLite發光基質試劑（perkin-Elmer, Wellesley，ΜΑ)添加至各孔。將盤短暫地振搖，於暗處 培養10分鐘’並於MicroBeta-1450液體閃蝶計數器 (Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上測量光輸出。經由使 用 Origin 軟體（OriginLab，Northampton, MA)計算有 效的50%濃度。 •166- 201010729 實施例17 雄二醯亞胺基PEG類似物之穩宗枓 檢定法 將各胰高血糖素類似物溶解於水或PBS中，並進行起 始HPLC分析。於調整pH(4、5、6、7)後，將樣品於 37 C下在指定的期間内培養’並再次利用hPLc分析以 測定狀的完整性。測定特定相關肽之濃度，並相對於起始 分析計算保持完整的百分比。 實施例18 Μ醯化及/或聚乙二醇化肽之芻借 如下製備經醯化及/或聚乙二醇化肽。使用CS Bio 4886肽合成器或Applied Biosystems 430A肽合成器 於固態載劑樹脂上合成肽。使用如Schnolzer等人， J. iVo/eiw 及以.40: 1 80-193 (1992)所述之原 位中和化學。對於經醯化肽，以Ν ε -FMOC離胺酸殘基 取代待酿化的目標胺基酸殘基（例如，位置1 〇)。以於D MF 中之20%哌啶將完成的Ν-端受BOC保護之肽處理30分 鐘而移除FMOC/曱醯基。經由於DMF/DIEA中偶合十 倍莫耳過量的受FMOC保護之間隔物胺基酸（例如 FMOC-(N-BOC)-色胺酸-ΟΗ)或醯基鏈（例如 C17-COOH)及PyBOP或DEPBT偶合試劑，而達成對 -167- 201010729 自由ε-胺基Lys殘基的偶合。在移除間隔物胺基酸之 FMOC基之後，接著再重複用醯基鏈偶合。最後用100% TFA處理導致移除任何的側鏈保護基及N-端BOC基。 將肽樹脂用5% DIEA/DMF中和，乾燥，然後使用HF /對甲酚（95:5)在0°C下自載劑分裂歷時1小時。於乙醚 萃取後，使用5% HOAc溶液於將粗製肽溶劑合。然後利 用ESI-MS確認溶液樣品包含正確分子量的肽。利用 RP-HPLC 使用 10% CH3CN/0.1% TFA 至 0.1% TFA 於100% CH3CN中之線性梯度純化正確的肽。使用 Vydac C1 8 22毫米X 250毫米蛋白質管柱來進行純化。 經醯化的肽類似物一般係藉由20:80之緩衝比完成溶 離。將溶離份匯集在一起並利用分析性RP-HPLC檢查純 度。將純溶離份凍乾得白色固體肽。 若肽包含内醯胺橋及待醯化的目標殘基，則醯化係如 前所述在將該胺基酸添加至肽主鏈之後進行。 對於肽聚乙二醇化，使用將肽及PEG兩者溶解成透 明溶液所需之最少量的溶劑（對於使用2-3毫克肽之反應 一般低於2毫升）使40 kDa曱氧基聚（乙二醇）順丁烯二醯 亞胺基-丙醯胺（Chirotech Technology Ltd.)與莫耳當 量的肽於7M尿素、50mM Tris-HCl缓衝劑中反應。開 始在室溫下劇烈攪拌4-6小時，且利用分析性RP-HPLC 分析反應。經聚乙二醇化之產物由於減少的滯留時間而明 201010729 顯不同於起始物料。於Vydac C4管柱上利用與起始肽純 化所用者類似的條件進行純化。溶離典型上在50:50的緩 衝比附近發生。收集純的經聚乙二醇化肽之溶離份並凍 乾。 如以上於實施例16中所述檢定肽的生物活性。經醯 化之肽可能展現對GLP-1受體的增加效力。包含色胺酸 間隔物可能提供對胰高血糖素受體的較佳效力。 雖然醯化可使肽的半衰期延長至數小時或以上，但具 有在數十kDa範圍内之重複之聚乙二醇化的作用可再更 高。製備包含兩種類型修飾的肽。預期此等肽呈現在循環 中之延長的半衰期，以及對DPP-IV及其他蛋白酶之抗 性。 實施例20 於活體内對增重、食慾及血糖值的作用 基本上如前所述合成得以下的肽。 (A) 經聚乙二醇化之胰高血糖素/GLP-1共同激動劑 肽（嵌合體（Chimera) 2 AIB2 C24 40K PEG，其係進一 步經位置2處之AIB、24處連接至40K PEG基之Cys 修飾的嵌合體2肽（見實施例21));

(B) 經聚乙二醇化之GIP拮抗劑（Pro3 C24 GIP NH2 (1-42) 40K PEG，其係 GIP(天然 GIP 之序列係 SEQ ID -169- 201010729 NO: 4)之胺基酸1-42經位置3處之Pro、連接至40K PEG基之位置24處之Cys、及替代C-端羧酸酯之醯胺 修飾）； (C)GIP 激動劑（AIB2 C24 GIP (1-42) 40K PEG， 其係GIP(天然GIP之序列係SEQ ID NO·· 4)之胺基酸 1-42經位置2處之AIB及連接至40KPEG基之位置24 處之Cys修飾）；及 經由對飲食引起肥胖（DIO)的小鼠皮下注射各種肽， 或單獨的媒劑，QW(7 0或210奈莫耳/公斤/週）而於活 體内測試肽。各組包含8隻小鼠，其各具有50克之初始 平均體重。定期測定體重、體組成、食物攝取、及血糖值。 如圖1至3所示，與經聚乙二醇化之胰高血糖素/ GLP-1共同激動劑相比，GIP拮抗劑及GIP激動劑肽皆 對小鼠之降低體重、累積食物攝取、及血糖值無效。 實施例21 肽之GIP、GLP-1及胰高血糖素活性 基本上如前所述合成得SEQ ID NO: 5-94之肽（其各 包含醯胺替代C-端羧酸酯），且依據實施例16於活體外 測試對GIP受體、GLP-1受體、及胰高血糖素受體之活 性。各肽的EC50示於表1。 -170- 201010729

GIP受體 相對活性 0.83% 1.60% 耕 聰 | 0.08 ί ^ 1_ 0.08 3 Ο —Η 〇 1 w G 9.987 5.183 N/D N/D N/D GLP-1受體 相對活性 22.22% i_ 40.00% 12.90% 38.46% _] 6.10% 標準 0.04 0 0.04 0 0.04 0 0.05 0 0.05 0 r\ 0.180 0.100 0.310 0.130 0.820 胰高血糖素受體 相對活性 172.73% 42.22% 6.03% 13.00% 13.20% 標準 0.19 0 0.19 0 0.19 0 0.26 0 0.26 0 rv J 1 w c 0.110 0.450 3.150 2.000 1.970 le g IT) 00 代號 mt-61 mt-62 mt-63 mt-66 mt-68 201010729

GIP受體 1_ 相對活性 卜 〇 10.54% 84.48% 標準 0.08 3 0.04 9 0.04 Ο U 1 14.601 N/D N/D N/D N/D 0.465 0.058 GLP-1受體 相對活性 12.20% 50.00% 12.12% 54.55% 150.00% 0.08% d 標準 ί_ 0.05 0 0.08 0 0.08 0 0.06 0 0.06 0 0.04 0 0.04 Ο —Η U ^ w G 0.410 0.160 0.660 0.110 0.040 48.920 92.860 胰高血糖素受體 相對活性 162.50% 13.33% 1.32% 14.33% 0.04% 0.29% 標準 0.26 0 0.06 0 0.06 0 0.43 0 0.43 0 0.10 0 0.18 rs U ^ w G 0.160 1 0.450 4.560 N/A 3.000 280.31 61.70 SEQ ID NO: o H <N cn 寸 in 代號 mt-69 mt-84 mt-85 mt-92 mt-93 mt-95 mt-96 201010729 GIP受體 相對活性 2.81% 25.00% 100.00% 306.25% 0.06% 標準 0.04 9 0.04 9 0.04 9 0.04 9 0.04 2 0.02 5 〇 —η 1.745 0.196 0.049 0.016 71.312 N/A GLP-1受體 相對活性 1.27% 1.42% 0.00% 0.01% 0.06% 標準 〇 0.03 0 0.04 0 0.07 0 0.06 0 0.06 0 〇 — U 1 2.360 2.820 4548.9 552.43 N/D 98.38 胰高血糖素受體 相對活性 3.19% 0.01% 0.00% 0.01% s o 標準 〇 0.13 0 0.10 0 0.18 0 0.18 0 0.18 0 i ^ 4.080 957.07 23313 1 ! 1459 N/D 798.75 SEQ ID NO: 00 代號 mt-97 mt-98 mt-99 mt-10 0 o ΐ mt-10 2 ε-_ 201010729

GIP受體 相對活性 0.22% 7.61% 0.74% 0.52% 6.99% 標準 0.04 2 0.04 2 0.02 5 0.02 5 0.02 5 0.04 rv U ^ .242 19.069 0.552 N/A 3.373 4.781 0.658 GLP-1受體 相對活性 0.02% 0.16% 12.50% 00 o 標準 0.04 6 0.06 0 0.04 0 0.04 0 0.03 r\ U ^ ω G 26.867 N/D N/A 264.4 24.770 0.320 3.860 胰高血糖素受體 相對活性 0.11% 185.71% 68.42% 76.92% 標準 0.04 6 0.18 0 0.13 0 0.13 0 0.10 c\ u ^ w c >4000 N/D N/A 'sQ H 0.070 0.190 0.130 SEQ ID NO: CN 代號 mt-10 3 mt-10 4 mt-10 5 mt-10 6 mt-10 7 mt-10 8 mt-10 201010729

GIP受體 相對活性 議 0.78% 1.31% 7.62% 標準 0.04 6 0.04 9 0.04 9 0.04 9 0.04 7 0.04 7 i r\ W G 0.478 6.258 N/A N/A 3.576 _1 0.617 GLP-l受體 相對纖 1_ 1.49% 10.61% 0.04% 0.05% 20.00% _1 1.07% 1 標準 1_ Ο 0.03 0 0.07 0 0.07 0 0.07 0 0.03 0 _1 0.04 1 1 r\ U ^ w c 2.020 0.660 172.66 143.65 0.150 3.798 1 胰高血糖素受體 1 相對活性 !_ 23.26% ι_ .. 85.19% i_ 0.07% 0.28% _1 11.36% _1 18.68% 1 1 標準 ο 0.10 0 0.23 0 0.23 0 0.23 0 0.05 0 0.14 7 r\ U ^ 0.430 0.270 335.98 81.25 0.440 0.787 SEQ ID NO: (N m m m 代號 mt-11 0 mt-11 1 mt-11 3 mt-11 4 mt-11 5 mt-11 6 201010729 GIP受體 相對活性 6.39% 1.81% 0.95% 19.64% 10.51% 0.42% 2.06% 標準 0.04 7 0.04 8 0.05 5 0.05 4 _1 0.05 4 0.06 1 0.05 Ο —η Ο | 0.736 2.622 5.793 0.275 0.518 14.622 2.879 GLP-1受體 相對活性 2.34% 13.45% 100.00% 3.17% _1 87.75% 33.33% 1.12% 標準 0.03 0 0.05 4 0.04 0 0.04 0 ________1 0.04 8 0.04 0 0.04 〇 —a| U 1.280 0.399 0.040 1.260 0.055 0.120 4.073 胰高血糖素受體 相對活性 125.00% 259.46% 8.64% 9.06% ...... . _1 718.39% 11.13% 17.34% 標準 0.05 0 0.19 2 0.21 0 0.52 0 0.31 3 0.08 6 0.16 Ο —η 〇 1 0.040 0.074 2.430 5.740 0.044 0.773 0.952 SEQ ID NO: L CO m 〇〇 m On o 代號 mt-ll 8 mt-12 0 mt-12 4 mt-12 5 mt-12 7 mt-12 8 mt-12 έι 201010729 GIP受體 相對活性 12.22% 12.85% 10.04% 36.36% 1.82% 18.54% 標準 0.07 0 0.04 7 0.07 5 0.04 8 0.04 8 0.08 9 Ο —Η 〇 1 0.569 0.366 0.747 0.132 2.635 0.480 GLP-1受體 相對活性 41.46% 49.56% _____ 36.78% 163.41% 4.53% 1 141.67% 標準 0.05 9 0.03 4 0.05 9 0.06 7 0.06 7 0.05 1 0.142 0.068 0.160 0.041 1.478 0.036 胰高血糖素受體 相對活性 561.11% 131.15% 269.33% 496.51% 16.77% 標準 0.40 4 0.19 6 0.40 4 0.42 7 0.42 7 0.38 1 CN J 1 0.072 0.149 0.150 N/A 0.086 2.272 丨SEQ ID NO: 代號 On mt-13 9 mt-14 0 mt-14 1 mt-14 2 mt-14 3 mt-14 4 -LLl· 201010729 ο GIP受體 相對活性 4.79% 13.30% 43.06% 65.26% I 91.18% 26.72% 7.28% 標準 0.05 2 0.05 2 0.06 2 0.06 2 0.06 2 0.06 2 0.06 U ^ 1.086 0.391 0.144 0.095 0.068 0.232 0.852 GLP-1受體 相對活性 0.33% 0.25% 33.87% 36.22% 97.53% 1.09% 30.16% 標準 0.03 3 0.03 3 0.03 6 0.03 6 0.03 6 0.03 8 0.03 〇 u U ^ ω G 9.936 13.093 0.105 0.098 0.036 3.474 0.126 胰高血糖素受體 相對活性 47.06% 480.00% (N 2.14% 0.64% 316.67% 30.16% 標準 0.09 6 0.09 6 0.10 5 0.10 5 0.10 5 0.11 4 0.11 U ^ w c 0.204 0.020 0.116 4.910 i 16.315 0.036 0.378 SEQ ID NO: in CN cn 代號 mt-14 5 mt-14 6 mt-14 7 mt-14 8 mt-14 9 mt-15 0 mt-15 —00-, 201010729 GIP受體 相對活性 41.19% 1.07% 7.02% 4.41% 4.00% 17.82% 標準 CN 0.03 6 0.05 9 0.04 7 0.04 1 0.04 1 0.03 1 ec50, nM 0.087 5.530 0.665 0.919 1.013 0.174 GLP-1受體 相對活性 168.75% 0.70% 98.99% 12.20% 37.04% 102.94% 標準 00 0.02 7 0.01 9 0.02 5 0.03 0 0.03 0 0.03 5 0.016 2.733 0.025 0.246 0.081 0.034 胰高血糖素受體 相對活性 36.52% 7.40% 10.93% 6.10% 6.92% 14.90% 標準 寸 0.10 7 0.09 8 0.14 0 0.18 1 0.18 1 0.15 6 S —Η Ο 1 0.293 1.325 1.276 2.965 2.616 1.047 SEQ ID NO: in in 00 〇\ 代號 mt-15 2 mt-15 4 mt-15 5 mt-15 6 mt-15 7 mt-15 8 -6-- 201010729

GIP受體 相對活性 25.74% 4.73% 16.46% 27.03% 5.94% 5.01% 0.32% 標準 0.03 5 | 0.03 5 0.02 7 0.02 0 0.01 9 0.02 0 0.02 〇 —^ U 1 0.136 0.740 0.164 0.074 0.320 0.399 6.240 GLP-1受體 相對活性 109.09% 30.00% (N in 147.83% 26.87% 7.94% 1.45% 標準 0.01 2 0.01 2 0.02 6 0.03 4 0.03 6 0.02 5 0.02 CN U ^ 0.011 0.040 0.046 0.023 0.134 0.315 1.724 胰高血糖素受體 相對活性 0.97% 251.85% 109.93% 18.81% 9.83% 34.53% 4.79% 標準 0.06 8 0.06 8 0.16 6 0.09 2 0.08 6 0.12 5 0.12 〇 —Η U 1 ω σ 7.002 撕 0.151 0.489 0.875 1 0.362 2.607 SEQ ID NO: 代號 mt-16 2 mt-16 3 mt-16 4 mt-16 5 mt-16 6 mt-16 7 mt-16 201010729 ο

G GIP受體 相對活性 1.44% 0.25% 95.65% 0.93% 40.00% 標準 _ 〇 0.02 1 1_ 0.01 9 0.01 9 0.02 2 0.01 8 0.02 2 0.142 1.285 7.542 1 0.023 1.930 0.055 GLP-1受體 相對活性 Γ5^Γ 14.60% 3.43% 1 117.65% 5.91% 0.23% 標準 m Ο — Ο 0.03 0 0.03 0 0.02 0 0.01 3 0.02 0 Ο U | 0.057 0.202 0.859 0.017 0.220 8.693 胰高血糖素受體 相對活性 51.26% 1.19% 0.45% 0.06% 1.49% 26.24% 標準 in 0.10 2 0.04 1 0.04 1 0.03 7 0.03 6 0.03 7 ύ ^ 0.199 3.447 9.162 1 57.546 2.418 0.141 SEQ ID NO: ΟΟ Ό Ο Η CN cn 代號 00 mt-16 9 mt-17 0 mt-17 2 mt-17 4 mt-17 5 mt-17 6 -ί—181 - 201010729

GIP受體 相對活性 19.30% i_ 1 4.69% 3.74% 22.13% 0.14% 16.93% 標準 0.02 2 0.02 1 0.01 8 0.01 8 0.02 1 0.03 2 0.02 U ^ 0.114 0.448 0.473 0.080 15.209 0.189 N/A GLP-1受體 相對活性 0.10% 8.19% 7.50% 0.17% 2.80% 209.09% 0.06% 標準 0.02 0.01 4 1 0.02 1 0 0.01 7 0.01 4 _1 0.02 3 0.02 rv U ^ 21.050 0.171 0.260 10.008 0.500 0.011 47.022 胰高血糖素受體 相對活性 38.95% 0.42% 2.92% 17.45% 2.22% 4.32% 標準 0.03 7 0.03 5 0.03 7 0.03 7 0.03 5 0.06 3 0.07 «Ν J 1 0.095 8.251 1.269 0.212 1.576 1.460 N/A SEQ ID NO: v〇 〇〇 代號 mt-17 7 mt-17 8 mt-17 9 mt-18 2 mt-18 6 mt-19 1 mt-19 201010729

GIP受體 相對活性 0.02% 5.51% 4.60% 44.44% 標準 i m 0.02 3 0.03 2 0.03 2 0.02 9 0.02 9 0.03 2 O u 1 Ν/Α Ν/Α 148.63 0.526 1 0.631 0.072 1 GLP-1受體 相對活性 0.63% 0.07% 0.17% 1.04% 138.10% I 191.67% 標準 0.02 6 0.02 3 0.02 3 0.02 9 0.02 9 0.02 3 O u 4.157 35.297 13.219 2.796 0.021 0.012 ! 胰高血糖素受體 相對活性 1 0.13% 0.53% 31.31% 11.96% 0.24% ! 標準 Ον 0.07 L 9一 0.06 3 0.06 3 0.06 7 0.06 7 0.06 3 ο —Η υ ^ W σ Ν/Α 47.664 11.890 0.214 0.560 26.680 SEQ ID NO: 1 ΓΟ 00 oo OO 代號 CN mt-19 4 mt-19 7 mt-19 8 mt-19 9 mt-20 0 mt-20 1 201010729 ° GIP受體 1- 相對活性 1.32% 〇 19.73% 1.74% 13.04% 2.41% Os 標準 0.02 9 0.02 9 0.02 9 0.02 9 0.01 5 0.01 5 0.01 〇 —η 〇 1 W σ 2.198 12.175 0.147 1.662 0.115 0.622 0.313 GLP-1受體 相對活性 0.18% 20.71% 161.11% 14.22% 32.63% 42.47% 11.83% 標準 0.02 9 0.02 9 0.02 9 0.02 9 0.03 1 0.03 1 0.03 EC50, ηΜ 15.725 0.14 0.018 0.204 0.095 0.073 0.262 胰高血糖素受體 相對活性 2.84% 1.38% 0.06% 0.01% 0.01% 1.31% 0.01% 標準 0.06 7 0.06 7 0.06 7 0.06 7 0.04 2 0.04 2 0.04 EC50, ηΜ 2.360 4.840 108.08 9 671.76 0 331.31 4 3.204 447.79 SEQ ID NO: 〇〇 〇〇 $ 代號 mt-20 2 mt-20 3 mt-20 4 mt-20 5 mt-20 6 mt-20 7 mt-20 寸-丨 201010729

201010729 相對活性係相對於指示受體之天然激素的活性。

201010729 基於此等數據，經判定狀mt-l40、nit-l47、ni1>l5l、 mt-152、mt-158、mt-164、mt-165、mt-166、mt-169、 mt-170、mt-172、mt-175、及 mt-179 係範例的 GLP-1 /GIP/騰高血糖素三重激動劑肽，而肽mt-1 48、 mt-149、mt-162、mt-174、mt-178、mt-201、及 mt-204 係範例的GLP -1 / GIP共同激動劑肽，及肽mt-1 1 6、 mt-176、mt-177、及mt-182係範例的GIP/胰高血糖 素共同激動劑肽。 實施例22 經由對飲食引起肥胖（DIO)的小鼠皮下注射實施例 21之GLP-1/GIP/胰高血糖素三重激動劑肽 (mt-170)、GLP-1/GIP 共同激動劑肽（mt-178)、及兩 種GIP/胰高血糖素共同激動劑肽（mt-182及 mt-179);胰高血糖素/GLP-1共同激動劑肽（包含以下 修飾的嵌合體2 AIB2(天然胰高血糖素胺基酸序列（SEQ ID NO: 1):位置17處之Gin，位置18處之Ala，位置 20處之Lys，位置21處之Glu，位置23處之lie，及位 置24處之Ala，及具有在位置2處之AIB之進一步修飾 的C-端醯胺（「嵌合體2」）或嵌合體2 AIB2内醯胺（與 嵌合體2 AIB2相同’具有位置16處之Glu及位置20 處之Lys的進一步修飾），其中内醯胺橋連Glul6及 -187· 201010729

Lys20之側鏈）；或單獨的媒劑，QW (70或210奈莫耳 /公斤/週），而於活體内測試此等肽。各組包含8隻小 鼠，其各具有50克之初始平均體重。定期測定體重。 如圖4所示，三重激動劑及GLP-1/GIP共同激動劑 對於降低小鼠之體重較嵌合體2 AIB2稍微更有效，但不 若顯示最佳降低體重能力的嵌合體2 AIB2内醯胺有效。 相對地，兩種GIP/胰高血糖素共同激動劑，尤其係 mt-182，對於降低體重較無效。 實施例23 經由對飲食引起肥胖（DIO)的小鼠皮下注射GLP-1 /GIP/胰高血糖素三重激動劑肽（mt-170)及GLP-1/ GIP共同激動劑肽（mt-178)，GLP激動劑（包含SEQ ID NO:3’具有在位置16處之Glu) ’或單獨的媒劑，QW(10 奈莫耳/公斤/週歷時4星期或35奈莫耳/公斤/週歷 時2星期），而於活體内測試此等肽。各組包含8隻小鼠， 各小鼠具有4 9克之初始平均體重。定期測定體重及血糖 值。如圖5及6所示，GLP-1 /GIP共同激動劑及三重激 動劑對於降低體重及血糖值皆較GLP-1激動劑更有效。 實施例24 經由以位置1 6處之AIB取代mt-1 65 (SEQ ID NO: -188- 201010729 64)及mt-170 (SEQ ID NO: 69)之内醯胺，而研究以α，α_ 二取代胺基酸替代内醯胺使基於胰高血糖素之類似物之 ' 〇c螺旋穩定的效果。包含mt-165之序列與以位置16處之 • AIB替代内醯胺的肽稱為「mt-241」，且具有SEQ ID NO: 167之胺基酸序列；而包含mt-1 70之序列與以位置16 處之AIB替代内醢胺的肽稱為「mt-248」，且具有SEQ ID NO: 173之胺基酸序列。 〇 亦基本上如前所述製得不含内醯胺橋且包含位置16 及/或20處之AIB之額外的線型肽。將此等肽稱為 「mt-242」、「mt-249」、「mt-250」、「mt-251」、 「mt-252」、「mt-255」、「mt-258」、及「mt-259」， 且其分別具有 SEQ ID NO: 168、174-176、107、108、 1 7 7、及2 5 8之胺基酸序列。基本上如實施例1 6所述測 試各此等肽對胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體的活體 I 外生物活性。結果示於表2。 -189- 201010729 GIP受體 相對活性 4.37% 14.10% 0.53% 0.63% 30.65% 57.58% 146.15% 146.15% 標準 0.011 0.011 0.017 0.017 0.019 0.019 0.019 0.019 ec5〇, nM 0.252 0.078 3.233 2.710 0.062 0.033 0.013 0.013 GLP-1受體 相對活性 130.43% 29.41% 9.71% 2.56% 63.64% 140.00% 116.67% 116.67% 標準 0.030 0.030 0.010 0.010 0.021 0.021 0.021 0.021 0.023 0.102 0.103 0.391 0.033 0.015 0.018 0.018 胰高血糖素受體 相對活性 3.73% 9.58% 卜 rn Ο 0.59% 6.30% 1.52% 13.17% 2.45% 標準 0.106 0.106 0.061 0.061 0.042 0.042 0.042 0.134 2.844 1.106 16.712 10.336 0.667 2.758 0.319 5.463 SEQ ID NO: 00 cn 174 in τ*·Η 代號 mt-24 1 mt-24 2 mt-24 8 mt-24 9 mt-25 0 mt-25 1 mt-25 2 mt-25 5 -061 - 201010729

GIP受體 相對活性 16.84% 12.02% 標準 0.009 6 0.009 6 〇 h—η u 0.0570 0.0799 GLP-1受體 相對活性 58.91% 62.96% 標準 0.011 9 0.011 9 rv 0.0202 0.0189 胰高血糖素受體 相對活性 14.08% 23.12% 標準 0.068 6 0.068 6 〇 h—Η u ^ w c 0.4873 0.2967 SEQ ID NO: 代號 mt-25 8 mt-25 9 201010729 如由表2中之結果明顯可見，不含内醯胺的線型肽對GIP 受體、以及胰高血糖素及/或GLP-1受體提供活性。更 明確言之，mt-242、mt-248、mt-249、mt-250、mt-252、 mt-255、mt-258、及 mt-259 呈現胰高血糖素/GLP-1 /GIP三重激動劑之活性，而mt-251呈現GLP-1/GIP 共同激動劑之活性。具有在位置16處之Lys及在位置20 處之AIB的肽mt-252呈現對胰高血糖素及GLP-1受體 的效力且呈現對GIP受體的提高活性。 實施例25 基本上如前所述製得不含内醯胺環且包含在位置16 處之Lys或類似殘基及在位置20處之AIB的線型肽。該 等肽具有 SEQ ID NO: 99-141、144-164、及 166 之胺 基酸序列。基本上如實施例16所述測試該等肽對胰高血 糖素、GLP-1、及GIP受體的活體外生物活性。結果示 於表3。 201010729 e< GIP受體 相對活 性 146.15% i_ 15.65% 282.35% 1 41.38% 583.33% 700.00% 388.89% 標準 0.019 0.018 0.009 6 0.009 6 0.010 5 0.010 5 0.010 0.013 0.115 0.0034 0.0232 0.0018 0.0015 0.0027 GLP-1受體 相對活 性 116.67% 19.43% ! 95.97% 〇\ m ! 257.35% 1_ 372.34% 397.73% 標準 0.021 0.041 0.011 9 0.011 9 0.017 5 0.017 5 0.017 β\ Ο ^ w c 0.018 0.211 0.012 4 0.030 3 0.006 8 0.004 7 0.004 胰高血糖素受體 相對活 性 13.17% 2.45% 0.12% 32.53% 6.64% 13.44% 15.86% 標準 0.042 0.134 0.068 6 0.068 6 0.021 3 0.021 3 0.021 1 ω 0.319 5.463 58.947 1 0.2109 0.3207 0.1585 0.1343 SEQ ID NO: 109 〇 ▼"H 代號 mt-25 2 mt-25 5 mt-25 6 mt-25 7 mt-26 0 mt-26 1 mt-26 -寸- 201010729 GIP受體 相對活 性 1_ 338.71% 13.62% 5.19% 0.65% 180.85% 140.35% 標準 0.010 5 0.008 5 0.008 5 0.008 5 0.008 5 0.008 0 0.008 〇 u U 1 0.0031 1_ N/A i_ 0.0624 0.1639 1.3122 0.0047 0.0057 0.0049 GLP-1受體 相對活 性 119.05% 1.77% j 1.15% 0.84% 113.55% 144.85% 211.83% 標準 0.017 5 0.017 6 0.017 6 0.017 6 0.017 6 0.019 7 0.019 〇 U ^ ω σ 寸 0.014 7 N/A 0.992 9 1.533 4 2.093 6 0.015 5 0.013 6 0.009 胰高血糖素受體 相對活 性 ί _ 0.67% 0.68% 0.23% 0.07% 0.67% 1 0.11% 0.06% 標準 (D 0.021 3 0.043 6 0.043 6 0.043 6 0.043 6 0.196 4 0.196 1 rv 3.1801 N/A 6.4308 18.645 62.010 1 6.5002 183.493 6 305.77 SEQ ID NO: <N ▼-H T-H CO H 寸 i—H T—H 117 118 代號 (N mt-26 3 mt-26 4 mt-26 5 mt-26 6 mt-26 7 mt-26 8 mt-26 9 mt-27 ;61- 201010729 GIP受體 相對活 性 i_ 142.86% 33.20% 39.71% 112.10% 173.75% 455.77% 846.43% 526.67% 標準 Ο 0.008 0 0.008 0 1_ 0.013 9 0.013 9 0.013 1 9 0.023 7 0.023 7 0.023 EC50, nM 0.0056 0.0241 0.0350 0.0124 0.0080 0.0052 0.0028 0.0045 GLP-1受體 i_ 相對活 性 185.85% 1.60% 7.75% 104.41% 107.58% 224.42% 459.52% 419.57% 標準 r- 0.019 7 0.019 7 0.007 1 0.007 1 0.007 1 1 0.019 3 0.019 3 0.019 rv U ^ 0.010 6 1.229 3 0.091 6 0.006 8 0.006 6 0.008 6 0.004 2 0.004 胰高血糖素受體 相對活 性 0.17% s d 0.06% 62.15% 77.65% 235.35% 588.37% 733.33% 標準 寸 0.196 4 1____ ___ 0.196 4 0.041 7 0.041 7 0.041 7 0.050 6 0.050 6 0.050 1 r\ W 112.980 1060.8 69.087 0.0671 0.0537 0.0215 0.0086 0.0069 SEQ ID NO: ί-Η CN CN CN cn <N (N 代號 ο mt-27 1 mt-27 2 mt-27 4 mt-27 5 mt-27 6 mt-27 7 mt-27 8 mt-27 -961- 201010729 1 GIP受體 i__ 相對活 性 159.06% 6.68% i 76.69% 83.61% 54.84% 36.43% 68.55% 117.20% 標準 卜 0.023 7 0.026 7 0.010 2 0.010 2 0.010 2 0.010 2 0.010 9 0.010 〇 — U -I 0.0149 0.3999 6 0.0133 0.0122 0.0186 0.0280 0.0159 0.0093 GLP-1受體 相對活 性 153.17% 5.13% 44.03% 37.34% 38.06% 0.75% 52.00% 94.35% j 標準 0.019 3 0.011 1 0.005 9 0.005 9 0.005 9 0.005 9 0.011 7 0.011 EC50, nM 0.012 6 0.216 5 0.013 4 0.015 8 0.015 5 0.784 4 0.022 5 0.012 胰高血糖素受體 ! 1 ... 相對活 性 74.74% 16.65% 1.18% 0.36% 0.69% 0.23% 84.80% 277.54% 標準 0.050 6 0.046 9 0.028 7 0.028 7 0.028 7 0.028 7 0.051 9 0.051 1 C\ 0.0677 0.2816 2.4367 7.9431 4.1686 12.622 0.0612 0.0187 SEQ ID NO: Ό CN 5 V-H 〇〇 CN ON (N 〇 m (N T-H m m 代號 σ\ mt-28 0 mt-28 1 mt-28 2 mt-28 3 mt-28 4 mt-28 5 mt-28 6 mt-28 -Δ61 201010729 GIP受體 相對活 性 79.56% 46.58% 23.71% 90.70% 95.12% 4.76% 19.06% 211.69% 標準 〇\ 0.010 9 0.010 9 0.007 8 0.007 8 0.007 8 0.007 8 0.011 0 0.016 EC50, nM 0.0137 0.0234 0.0329 0.0086 0.0082 0.1638 0.0577 0.0077 GLP-l受體 相對活 性 84.78% 81.25% 1 156.41% 321.05% :_1 415.91% 8.23% 6.74% 130.65% 標準 卜 0.011 7 0.011 7 0.018 3 0.018 3 0.018 3 0.018 3 0.007 7 0.016 1 U ^ 寸 0.013 8 0.014 4 0.011 7 0.005 7 0.004 4 0.222 3 0.114 3 0.012 胰高血糖素受體 相對活 性 250.72% 67.75% 113.77% 379.25% 453.38% 3.67% 0.03% 11.34% 標準 Os 0.051 9 0.051 9 0.060 3 0.060 3 0.060 3 0.060 3 0.023 5 0.047 1 e\ ω 0.0207 0.0766 0.0530 0.0159 0.0133 1.6442 87.2847 0.4214 SEQ ID NO: IT) m 136 卜 cn 00 m OS cn 〇 H 寸 代號 1> mt-28 8 mt-28 9 mt-29 0 mt-29 1 mt-29 2 mt-29 3 mt-29 5 mt-29 -S61- 201010729 GIP受體 相對活 性 ί_ 97.02% <N cn 〇 46.92% 254.69% 128.35% 285.96% 226.37% 274.67% 標準 m 0.016 3 0.020 6 0.020 6 0.016 3 0.016 3 0.016 3 _1 0.020 6 0.020 Ο μ U ^ 0.0168 0.0051 0.0439 0.0064 0.0127 1 0.0057 _1 0.0091 0.0075 GLP-l受體 相對活 性 ：125.58% i_ 180.46% 180.46% 80.60% 113.29% 68.35% _1 150.96% 253.23% if m <N 0.016 2 0.015 7 0.015 7 0.016 2 0.016 2 0.016 2 0.015 7 0.015 U ^ 寸 0.012 9 0.008 7 0.008 7 0.020 1 0.014 3 0.023 7 _1 0.010 4 0.006 胰高血糖素受體 相對活 性 362.12% 3.63% 245.38% 3.20% 16.61% 0.39% 1.77% 8.24% 赃 聰 oo 0.047 8 0.063 8 0.063 8 0.047 8 0.047 8 0.047 8 0.063 8 0.063 1 r\ ω 0.0132 1.7571 0.0260 1.4950 0.2878 12.1920 3.6109 0.7747 SEQ ID NO: o 144 4 s 代號 mt-29 7 mt-29 8 mt-29 9 mt-30 6 mt-30 7 mt-30 8 mt-30 9 mt-31 -661 - 201010729 GIP受體 相對活 性 37.80% ί_ 122.62% 30.23% 111.43% 10.64% 226.47% 187.80% 163.83% 標準 0.020 6 0.010 3 0.011 7 0.011 7 0.010 3 0.007 7 0.007 7 0.007 〇 ―^ 0.0545 i_ 0.0084 0.0387 0.0105 0.0968 0.0034 0.0041 0.0047 GLP-1受體 i 相對活 性 7.22% 35.55% 9.68% 0.83% 4.53% 85.71% j 70.59% 133.33% 標準 〇 ^.015 7 0.020 3 0.022 3 0.022 3 0.020 3 0.002 4 0.002 4 0.002 O t_( U 1 w c (N 0.217 4 0.057 1 0.230 3 2.682 8 0.448 4 0.002 8 0.003 4 0.001 胰高血糖素受體 相對活 性 0.03% 39.00% 6.41% 86.45% 0.02% I 2.80% 0.27% 1.21% 標準 〇〇 0.063 8 0.084 6 0.079 1 0.079 1 0.084 6 0.019 3 0.019 3 0.019 1 CN 197.248 2 0.2169 1.2332 0.0915 408.039 3 0.6905 7.0725 1.5956 SEQ ID NO: Ο r-H On cn in ID 代號 〇 mt-31 1 mt-32 3 mt-32 4 mt-32 5 mt-33 1 mt-33 3 mt-33 4 mt-33 — 007 201010729 GIP受體 相對活 性 19.49% 115.00% m cK m 230.00% 328.57% 27.39% 63.79% 48.59% 1 卜 0.007 7 0.009 2 0.009 2 0.009 2 0.009 0.015 5 0.015 5 0.015 0.0395 1_ 0.0080 0.0234 0.0040 0.0028 0.0566 0.0243 0.0319 1 GLP-1受體 相對活 性 7.19% 1_ 74.39% 1 2.70% 66.30% 100.00% <N — ! 41.52% 10.45% 標準 寸 0.002 4 0.006 1 0.006 1 0.006 1 0.006 1 0.009 3 0.009 3 0.009 EC5〇, nM 00 0.033 4 0.008 2 0.225 6 0.009 2 0.006 1 0.063 6 0.022 4 0.089 胰高血糖素受體 相對活 性 0.02% 0.01% 0.28% 0.24% 0.01% 1 0.07% 0.02% 標準 m 0.019 3 0.024 8 0.024 8 0.024 8 0.024 8 0.027 6 0.027 6 0.027 1 rv ω 106.382 6 295.340 7 8.7218 10.4694 499.200 8 41.0674 159.277 SEQ ID NO: 1 1 00 ID i- 159 3 H m 164 代號 mt-33 6 mt-33 7 mt-33 8 mt-33 9 mt-34 0 mt-34 1 mt-34 3 mt-34 201010729

GIP受體 1_ 相對活 性 4.99% 102.86% 1 0.002 7 0.003 6 EC50, nM 0.0541 0.0035 GLP-1受體 i_ 相對活 性 152.78% 128.57% 標準 m 0.005 5 0.006 3 cs 〇 ^ 0 0.003 6 0.004 9 胰高血糖素受體 相對活 性 192.90% 0.17% 標準 0.035 3 0.021 0 1 r\ ω 0.0183 12.5069 SEQ ID NO: m τ-Η 代號 寸 mt-34 5 mt-35 3 201010729 如表3所示，線型肽對GIP受體具活性，且在許多情 況中，該等肽另外對胰高血糖素受體及/或GLP-1受體 具活性。更明確言之，mt-252、mt-255、mt-257、 mt-260、mt-261、mt-262、mt-265、mt-266、mt-267、 mt-275、mt-276、mt-277、mt-278、mt-279、mt-280、 mt-286、mt_287、mt-288、mt-289、mt-290、mt-29 1、 mt-292、mt-293、mt-295、mt-296、mt-297、mt-299、 mt-3 06、mt-3 07、mt-3 10、mt-3 23、mt-3 24、及 mt-3 45 皆對GIP、GLP-1、及胰高血糖素受體呈現活性，而表3 之其他的肽對GIP及GLP-1受體呈現活性（僅除了 mt-285，其僅對GIP受體呈現活性，及mt-325，其對 胰高血糖素及GIP受體呈現活性，但未對GLP-1受體呈 現活性）。

當比較包含C-端延伸之mt-252的數據與其之肽不含 C_端延伸之mt-257、mt-258、及mt-259的數據時，明 顯可見C-端延伸對所有的胰高血糖素、GLP-1、及GIP 受體提高活性。 當比較包含在位置16處之Lys之mt-252的數據與 其之肽分別包含在位置16處之Orn及Dab殘基之 mt-275及mt_276的數據時，明顯可見Lys可經類似Lys 的殘基取代。 此外，當比較包含在位置3處之Gin之mt-252的數 -203 - 201010729 據與其之肽包含在位置3處之Glu之mt-256及mt-2 74 ‘的數據時，明顯可見以Glu殘基取代位置3處之Gin獲 -致對GLP-1及GIP受體超越胰高血糖素受體的選擇性。 由mt-260對mt-263及mt_265對mt_272之數據明 顯可見利用C14、C16、及C18脂肪酸醯化的效果。由 此等數據’明顯可見利用C 1 6及C 1 8脂肪酸酿化提供對 GLP_1及GIP受體的增加活性。此等肽之醯化甚至透過 〇 包含Gln3G1u取代之肽而甚至可提高對胰高血糖素受體 的活性。對胰高血糖素受體的提高活性亦可由三重激動劑 mt-277對mt-280的數據看出。 實施例26 於D10小鼠中測試經聚乙二醇化、含内醯胺之環狀肽 mt-178 (SEQ ID NO: 7 5)、及經聚乙二醇化、不含内醯 胺之線型肽mt-178 (SEQ ID NO: 99)的活體内活性，並 與具有SEQ ID NO: 179之基於GLP-1之結構之純 GLP-1激動劑對照物的活體内活性作比較。在第〇天將 肽或媒劑對照物以i'3'或1〇奈莫耳/公斤/週經腹膜 内注射至小鼠。 經由在注射肽或媒劑對照物中之一者後1小時將 25% (w/v)葡萄糖鹽水溶液經腹膜内注射至小鼠，而對小 鼠進行1小時葡萄糖耐受試驗（GTT)。葡萄糖鹽水溶液係 -204- 201010729 以每公斤小鼠體重i.5克之劑量投與小鼠。在注射狀或媒 . 劑對照物時（_60分鐘）’在注射葡萄糖鹽水溶液時（〇分 - 鐘），或在注射葡萄糖鹽水溶液後15、30、6〇、或12〇 分鐘時，測量血糖值。；！小時GTT之結果示於圖7。 亦以與1小時GTT相同的方式對小鼠進行24小時 GTT，僅除了葡萄糖鹽水溶㈣纽射肽或雜對照物後 24小時投與。24小時GTT之結果示於圖8。 Ο 於注射肽或媒劑對照物〇及7天後測量各小鼠的總血 糖值，且示於圖9。 此外’於注射肽或媒劑對照物後第0、1、3、5、及7 天測量各小鼠的體重。小鼠的體重變化％示於圖1〇。 如圖10所示，經以3或10奈莫耳/公斤/週劑量注 射mt_178及mt-274之小鼠減去與經注射GLp_激動劑 對照肽（以10奈莫耳/公斤/週劑量）相同或更大程度的 重量。 如圖7及8所示，相較於經注射媒劑對照物之小鼠， 經注射mt-178、mt-274、或GLP-1激動劑對照物之小 鼠呈現減低的血糖值。mt-178及mt-274之效力看來較 GLP-1激動劑對照肽之效力大，由於3奈莫耳/公斤/ 週之mt-178及mt-274達到與10奈莫耳/公斤/週劑量 之GLP-1激動劑對照肽相同的效果。mt_274看來具有最 高的效力，由於此肽在1奈莫耳/公斤/週劑量下達到與 205- 201010729 10奈莫耳/公斤/週之GLP—i激動劑對照肽類似的結 果。 實施例27 再次於小鼠中測試實施例2 6中所述之相同肽，僅除 了將較高劑量（10或35奈莫耳/公斤/週）之肽皮下注射 至小鼠體内。亦以此等劑量測試兩種額外的肽：一種肽具 0 有與mt·178相同的結構，但包含於位置40處透過經由 親核性取代所形成之更穩定之硫醚鍵聯（_SCH2C〇_)(相 對於如見於mt-1 78中之透過麥可加成經由順丁烯二醯亞 PEG所形成之傳統硫謎鍵聯）連接至Cys的PEG義. 及第二種肽具有與mt-274相同的結構，但包含於位置4〇 處透過經由親核性取代所形成之硫驗鍵聯（_ S c Η 2 C Ο -) 連接至Cys的PEG基。此等肽在文中分別被稱為 mt-178(TE)及 mt-274(TE)。 於注射肽或媒劑對照物0及7天後測量小鼠的總也糖 值且示於圖1 1。於注射肽或媒劑對照物7天後測量小氡 血糖的總變化且示於圖12。 於注射肽或媒劑對照物後第〇、1、3、5、及7、及 1 〇天測量各小鼠的體重。小鼠體重變化％成時間之函數 示於圖1 3，而於注射肽或媒劑對照物7天後測得之小鼠 體重的總變化示於圖14。 •206- 201010729 如圖12所#，相較於經注射媒劑對照物之小鼠，所 • 彳經注射任何測試肽之小㈣血糖總變化皆減小。在經注 射35不'莫耳/公斤/週之mt 274或如_ΐΝ(τΕ)的小鼠 中看到最劇烈的血糖變化。 如圖14所示，相較於經注射媒劑對照物之小鼠，所 有經注射任何測試肽之小鼠的體重總變化皆減小。如同血 糖總變化，在經注射35奈莫耳/公斤/週之mt_274或 ❹ mt-178(TE)的小鼠中觀察到最劇烈的體重變化。 實施例28 將實施例26中所述肽之活體内活性與線型mt_274 肽之經醯化形式的活體内活性作比較。更明確言之，製造 且測試三種其中之C_端胺基酸（Lys殘基）共價連接至 C16脂肪醯基、C14脂肪醯基、或C18脂肪醯基之mt_274 的經醢化形式。此等肽在文中分別被稱為mt-2 9 8、 mt-3 09、及mt-3 1 0。如同母肽mt-274，經醯化肽亦包 含40 kDa PEG基。然而，經醯化肽之peg基係共價連 接至肽之位置24處之Cy s殘基的侧鏈。經醯化肽 mt_29 8、mt-309、及mt-3 10之胺基酸序列在文中分別 係經提供為 SEQ ID NO: 101-103。 製造且測試未醯化形式的mt-298、mt-209、及 mt-310(以下稱為 mt-311)。肽 mt-311 與 mt-274 之不 -207- 201010729 同處在於mt-3 11係透過位置24處之Cys殘基之側鏈（相 • 對於mt·274中所見之C-端處之Cys殘基）共價連接至 * PEG基，且mt_311之匕端殘基係Lys殘基，而非如 mt-274中所見之Cys殘基。 於第0天將肽或媒劑對照物以1星期1 〇奈莫耳/公 斤皮下注射至DIO小鼠。 於注射肽或媒劑對照物〇及7天後測量小鼠的血糖值 ❹ 且示於圖1 5。於注射肽或媒劑對照物後第〇、1、3、5、 及7天測量各小鼠的體重。小鼠體重變化％成時間之函數 示於圖1 6 ,而於注射肽或媒劑對照物7天後測得之小鼠 體重的總變化示於圖17。 如圖17所示，相較於經注射媒劑對照物之小鼠，經 注射任何肽之小鼠呈現體重的減小。經注射經聚乙二醇 化、含内醯胺之環狀肽（mt-178)之小鼠於注射7天後顯 現最大的體重減輕。

Q 如圖 15 所示，經注射 mt_178、mt-2 74、mt_3i 1、 或其之C14或Cl 6醯化形式之小鼠的血糖值減低。利用 C 18脂肪酿基醯化看來並未導致血糖值減低，顯示醯基之 大小對於肽的葡萄糖降低效果可能相當重要。 實施例29 基本上如前所述製得經醯化但未經聚乙二醇化之不 208· 201010729 含内醯胺之基於胰高血糖素的線型肽。明確言之，製得包 含位在C-端胺基酸上之C14脂肪酿基之mt-260(SEQID - N0: 104)、包含位在C-端胺基酸上之C16脂肪醯基之 mt-261(SEQ ID NO: 105)及包含位在C-端胺基酸上之 C18脂肪醯基之mt-262(SEQ ID NO: 10 6)。各此等肽 之結構類似於mt-29 8、mt-3 09、及mt-3 10之結構，但 不同處在於mt-260、mt-261、及mt-262包含Asn殘基 〇 替代位置24處之經聚乙二醇化的Cys殘基。 將肽mt-260、mt-261、或mt-262、對照肽（利拉魯 肽，一種經醯化之GLP -1類似物）、或媒劑對照物以7天 25或125奈莫耳/公斤之劑量QD注射至小鼠體内。 於注射肽或媒劑對照物0及7天後測量小鼠的血糖值 且示於圖1 8。於注射肽或媒劑對照物後第〇、1、3、5、 及7天測量各小鼠的體重。小鼠體重變化％成時間之函數 ◎ 示於圖1 9 ’而於注射肽或媒劑對照物7天後測得之小鼠 體重的總變化示於圖2 0。 如圖1 8所示，經酿化、未經聚乙二醇化之線型肽 (mt-260、mt-261、及mt-262)對血糖值的作用相當劇 烈。在25奈莫耳/公斤下，此等肽引起血糖值約50%的 減低，及在較高劑量下，此等肽引起大於50%之血糖值 的減低。 如圖1 9所示，各經醯化、未經聚乙二醇化之線型肽（在 209- 201010729 低或高劑量下）引起較由低劑量下之利拉魯肽所達成之體 • 重減輕更有效的體重減輕。體重在7天的檢定過程中持續 ^ 減輕。 此等結果顯示對GIP及GLP-1受體具有活性之經醯 化、未經聚乙二醇化之基於騰高血糖素的線型肽可大大地 減低血糖值及體重，因而指示可使用此等肽於治療代謝病 症’包括糖尿病，及用於治療肥胖症。 ❹ 實施例30 於DIO小鼠（N =每組8隻；平均初始體重克）中 測忒不同劑量的基於胰高血糖素之線型肽mt_ 2 6〗（seq ID NO: 105)。將小鼠QD皮下注射僅僅媒劑、利拉魯肽 (30奈莫耳/公斤體重）或mt_261(〇 3、丨、3、1〇或％ 奈莫耳/公斤體重）。 0 於初次注射後第G、1、3、5、及7天測量小鼠的體 重。如圖2 1所示，注射mt-26 1或利拉魯肽引起小鼠的 體重減輕。由於3奈莫耳/公斤之mt-261達成與30奈 莫耳/公斤之利拉魯肽基本上相同的效果（圖21)，因而 肽mt-261呈現較利拉魯肽高的效力。 於初次注射7天後藉由核磁共振成像測量小鼠的脂肪 質量。如圖22所示，mt_261之增加劑量一般與減低的脂 月方質量有關聯。經注射3奈莫耳/公斤之mt-261之小鼠 -210· 201010729 的脂肪質量大約與經注射3〇奈莫耳/公斤之利拉魯狀之 小鼠的脂肪質量相同，顯示mt_261相較於利拉魯肽的高 效力。 ;初人〆主射0及7天後測量小鼠的血糖值。如圖2 3 所^低至3奈莫耳/公斤劑量之mt-261即引起血糖值 的^著減低。與脂肪質量及體重檢㈣結果—致，經注射 ❹ ❹ 不f耳/ &斤mt_26】之小鼠之血糖值的減低與經注射 奈莫耳/公斤利拉魯肽之小鼠之血糖值的減低類似， 顯示脉261相較於利拉魯肽的較高效力。 在一個別的實驗中，於九組⑶議小鼠（每組8隻 小鼠）中測試未經醯化形式之勝加（即加加⑽叩 ))對體重、食物攝取、血糖值、及脂肪質量的活 乍用錢係11個月A，且在研究時經給予致糖尿 病飲食9個月。小鼠的平均體重為57克。將小鼠每日皮 下注射3、1〇、彳。Λ + 或30不莫耳/公斤之mt-263歷時1星 :對照組接受1〇或3〇奈莫耳/公斤/天的媒劑對照 物或促胰島素分泌素_4。 、為平估對體重的活體内作用，於第〇、i、3、5、及7 :量】鼠的體重’其中帛。天係注射的第一天。如圖 斤:’以三種劑量的任—者注射如皆在7天的 态内亏1起體重的穩定減低。由於當增加mt-263之 置體重的總變化（示於圖25)增加，因而看來對體 -211 . 201010729 重的作用亦與劑量相關。此外，如圖25所示，由三種 mt-263劑量之者所達成的體重總變 注射促胰島辛分、>去h 权由 r ^素·4(以任一劑量）所達成的體重總變 化咼。

亦測定對食物攝取、脂肪質量、及血糖的活體内作 用。於經注射mt_263之小鼠之帛7天測得的總食物攝取 及脂肪質量相較於媒劑對照物及促胰島素分泌素_4降 '匕卜、’呈'主射mt_263之小鼠之血糖值的總變化（於 第7天測得值相較於第G天_得值）㈣於經注射媒劑 對照物或促胰島素分泌素_4之小鼠顯著地降低⑽Μ)。 不莫耳/ a斤劑量的肽看來係最佳劑量，其達成血糖 值的最大減低（接近_80 mg/dL)。 亦將肽mt-263對體重、食物攝取、及血糖值的活體 内作用與肽 mt-349 (SEQ ID NO: 262)、mt-280、 mt-356、及mt-357、及媒劑對照物作比較。給予小鼠 30奈莫耳/公斤/天之其中一種肽歷時i星期。相較於 媒劑對照物，所有肽皆對降低小鼠的體重有效。 實施例31 測試經醯化之基於胰高血糖素之線型肽m t _ 2 7 7、 mt-278、及mt-279的活體内作用，並與利拉魯肽作比 較。對DIO小鼠（每組8隻小鼠；平均初始體重=514克） 212· 201010729 每曰皮下注射媒劑對照物或ίο奈莫耳/公斤之利拉魯 肽、mt-277、mt-278、或 mt-279。 於初次注射後第〇、1、3、5、及7天測量小鼠的體 重。如圖27所示’注射mt-277、mt-278、或mt_279 引起小鼠的顯著體重減輕。所有此等肽進一步展現較利拉 魯狀南的效力。 於初次注射0及7天後測量小鼠的血糖值。如圖28 〇 所示，mt_277、加-278、及mt-279各引起血糖值的顯 著減低，該減低甚大於在經注射利拉魯肽之小鼠中所見 者0 實施例32 將GLP-1受體活性、基於胰高血糖素之類似物修飾 成包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列的c-端延伸，且 進一步修飾成包含SEQIDNO: 95之C-端處的Lys。位 在類似物之位置40處之Ly s殘基經C 1 4脂肪醯基醯化。 基本上如實施例16中所述測試此醯化類似物對胰高血糖 素、GLP -1、及GIP受體的活體外活性。將活體外活性 與不含C-端延伸及位置40處之醯化之母GLP-1受體活 性、基於胰南血糖素之類似物作比較。C_端延伸之趨化 類似物對GIP受體顯現大約15%的活性增加及對胰高血 糖素受體顯現大約5 2 %的增加。當經c _端延伸之醯化類 ‘213· 201010729 似物刺激時，對GLP-1受體的活性實際上減低。然而， 活性仍較天然GLP-1對GLP-1受體所達成的活性大 100%。 實施例33 基本上如前所述合成得經醯化的胰高血糖素類似物 肽（其各包含醯胺替代C-端羧酸酯）。肽mt-358、 mt-367、mt_368、及 mt-369 係酿化單體，而 mt-354、 mt-3 76、及mt-3 77係醯化二聚體，其中各二聚體包含兩 個透過C_端Cys殘基鍵聯的單體。肽mt-3 67、mt-368、 及mt-369包含yGlu-yGlu二肽間隔物用於連接醯基，而 mt-358則係在不存在間隔物的情況下醯化。狀mt-225、 mt-227、及mt-294係包含在位置Ιό處之麩胺酸與位置 20處之離胺酸之間之内醯胺橋的聚乙二醇化單體。肽 mt-225及mt-227包含二肽間隔物用於連接PEG，而 mt-294係透過精油與鹵乙醯基反應製得的硫醚醯化。肽 356及mt-357充作未酿化的對照肽，其中mt-357包含 位置7處之lie，但mt_3 56包含Thr。基本上如實施例 16中所述測試其全體對GIP受體、GLP-1受體、及騰高 血糖素受體的活體外活性。各肽的EC50 (nM)及相對於 天然激素的活性示於表4。 214· 201010729 寸< GIP受體 相對活 性 25.66% 206.37% 醯化單體結構 305.62% 296.07% 202.82% 標準 0.013 6 1 0.013 6 0.013 6 0.002 9 0.002 9 <5 u u ^ ω c 0.0530 0.0066 0.0045 0.0009 7 0.0014 GLP-1受體 相對活 性 224.02% Γ 0.86% 13.04% 418.93% 405.94% 標準 0.010 8 1 0.010 0.010 8 0.015 7 0.015 7 r\ U ^ ω G 0.004 8 1.251 8 0.083 0 0.003 8 0.003 9 胰高血糖素受體 相對活性 126.06% 1 260.92% 1_ 1266.00 % 491.82% 4.11% 標準 0.109 5 0.109 5 0.109 5 0.033 7 0.033 7 O t—i u 1 w G 0.0869 0.0420 0.0087 0.0069 0.8201 I S § (Ν m <Ν ΓΟ m CN 寸 CO (N m (N <N 醯基 澗隔 物)之 位置 σ3 cd 穿1 40 (γΕγΕ) 40 (γΕγΕ) 代號 mt-356 mt-357 mt-358 mt-368 mt-367 -7 201010729 GIP受體 相對活 性 204.26% 1_ 醯化二聚體結構 91.65% 62.63% 138.11% 經聚乙二醇化、內醯胺化之單體 0.90% 1.29% 2.95% 標準 0.002 9 0.004 2 0.004 2 0.004 2 0.017 0.017 0.011 0 ec5〇, nM 0.0014 0.0046 0.0068 0.0031 1.899 1.320 0.3727 GLP-1受體 相對活 性 385.05% 136.99% 126.82% 177.88% 29.59% 36.25% 12.66% 標準 0.015 7 0.012 0 0.013 4 0.013 4 0.029 0.029 0.007 7 Ε〇50, nM 0.004 1 0.008 8 0.010 6 0.007 6 0.098 0.080 0.060 8 胰高血糖素受體 相對活性 1.54% 1.45% 0.57% 1.98% 1.99% 1.27% 0.01% 標準 0.033 7 0.037 8 0.077 2 0.077 2 0.054 0.054 0.023 5 EC50, nM 2.1893 1 2.6078 13.464 4 3.9038 2.712 4.244 229.99 6 SEQ ID NO: 237 231 238 239 259 260 r—Η Ό CN 醯基 澗隔 物)之 位置 10 (γΕγΕ) 专1 导I 摧 摧 摧 代號 mt-369 mt-354* mt-376* 氺 mt-377* 氺 mt-225 mt-227 mt-294 -9I3_ 201010729 e ο 。(磁_鍩萆-_K'#lBH^-B-^)^_w螭0寸鲥与>韜缽婵^切鹬蜱4W鹳齡u i 。璁^o3d^^^e1$^^^?r#^eBH-^4-fr-^*^^ll&4us^^owd^^i ^黎#^痗*^宕长^¥雉垅-§瓚^#||衅^4^-缽-蝶龙韜鉍^*犛黎#^^-^长羿* • L\Z- 埤 201010729

結構B 如表4所示，所有三種醯化二聚體皆對GLP-1及GIP 受體顯現有效的活性。此外，mt-36 8所展現之對GLP-1 -218- 201010729 受體的活性相較於由mt-358所展現者大大地提高，且 mt-368對GIP受體之活性與mt_358相比基本上經維 持，顯示透過間隔物醯化胰高血糖素肽可提高對GLpq 受體之活性，同時仍維持對GIP受體的強固活性。由於 mt_367及mt-369對GLP-1及GIP受體的相對活性大約 相同，因而透過胰高血糖素類似物之位置1〇處之間隔物 醯化看來係與胰高血糖素類似物之位置4〇處同樣好的位 實施例34 基本上如文中所述製得兩種具有相同胺基酸序列，但 聚乙二醇化連接體不同的醯化胰高血糖素類似物肽： mt-33 1 (SEQ ID NO: 153)包含以下結構之對PEG的鍵 聯：

而mt-311 (SEQ ID NO: 100)包含以下結構之對peg 的鍵聯：

將兩種肽或媒劑對照物經由皮下注射QW投與多組 -219- 201010729 DIO小鼠（每組6隻小鼠；平均體重= 64.6克）歷時1星 、 期。肽係以1〇或35奈莫耳/公斤之劑量投與。 於投與肽或媒劑對照物後第〇、1、3、5、及7天測 量小鼠的體重。經注射較高劑量之mt-311或mt-331之 小鼠的體重在該星期的過程中穩定地減低。體重之總變化 (%)示於圖29。如此圖所示，經注射mt-3 11之小鼠的體 重總變化最大。 ❹ 亦於投與肽或媒劑對照物後第0、1、3、5、及7天 測量各组小鼠的總食物攝取。如圖30所示，與經注射媒 劑對照物的小鼠相比，經注射任一劑量之mt- 3 1 1或 mt-331之小鼠群組的總食物攝取皆減少。 於投與肽或媒劑對照物〇及7天後測量各組小鼠的血 糖值。小鼠之血糖值在投與較高劑量之mt_311或mt_331 後減低。如圖31所示，經注射35奈莫耳/公斤mt_331 ◎ 之小鼠的血糖值減低較大。 測量各組小鼠的脂肪質量。然而，投與肽看來並未對 脂肪質量具有影響。 實施例35 於7個月大的C57BI/6小鼠中測試兩種具相同胺基 酸序列’但不同處在於不存在連接至位置4G處之Lys之 醯基（mt_33l (SEQidn〇: 153))或存在ci4脂肪酿基 •220· 201010729 (mt-3 53 (SEQ ID NO: 166))之肽對體重、食物攝取、 ' 血糖值及脂肪質量的活體内作用。小鼠經食用致糖尿病飲 食5個月，且平均初始體重為53克。經由皮下注射以 〇·1、〇·3、3、或10奈莫耳/公斤之劑量將肽或媒劑對 照物投與小鼠歷時1星期。 於投與肽或媒劑對照物〇、1、3、5、及7天後測量 體重。如圖32所示，經注射10奈莫耳/公斤之加_331 ❹ 或mt-3 53之小鼠的體重總變化最為顯著。 於才又與狀或媒劑對照物〇、1、3、5、及7天後測量 小鼠的食物攝取。如圖33所示，與經投與媒劑對照物的 小鼠相比，經注射3或10奈莫耳/公斤之mt_331或 mt-353之小鼠的總食物攝取減少。 亦監測小鼠的血糖值。如圖34所示，mt_33l導致血 糖值以劑量相關的方式減低。兩種劑量的mt-353另外導 致血糖值減低。脂肪質量值並未顯著地受投與任一肽影 響。 實施例36 於8組DIO小鼠（每組8隻小鼠）中測試三種分別具有 SEQ ID NO: 123、124、 劑肽 mt-2 77、mt-27 8、人 食物攝取的活體内作用。售 、及125之結構之醯化三重激動 、及mt-279對體重、血糖值、及 。該等肽具有相同的胺基酸序列， -221 - 201010729 但其所連接之脂肪醯基的大小不同。使用iQnM/kg濃度 的利拉魯肽作為對照物。每曰經皮下注射投與肽 照物歷時1星期。 丁 測試對胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體的活體外活 性’且各肽相對於天然激素的活性％示於下表5。

-222- 201010729

表5

於投與肽或媒劑對照物0、 、5、及7天後測量 小鼠的體重。在該星期過程期間，相較於媒劑對照物，經 注射其中-種醯化三重激動劑肽之小鼠的體重大大地減 低如® 3 5所π ’經注射其中一種酿化三重激動劑狀之 小鼠的體重總變化（％)大約為_15%，而餘魯肽達成低於 5 %的體重減低。

實施例37 於7組具有58克平均體重的DIO小鼠（每組8隻小 鼠）中測試給藥頻率對經聚乙二醇化之醯化肽（mt_3 〇9 ; SEQIDNO: 102)及未經聚乙二醇化之醯化肽（mt_26i ; SEQ ID NO: 105)之效力的影響。將肽以每天（qd)5奈 莫耳/公斤之劑量、每兩天1〇奈莫耳/公斤之劑量、或 每星期（QW) 3 0奈莫耳/公斤之劑量經皮下注射至小 223· 201010729 鼠。研究持續6天，以致至研究期間結束時，各組小鼠經 接受30奈莫耳/公斤。於初次給藥〇及6天後測量體重 及jk糖值。 如圖36所示’經QW注射mt_3〇9之小鼠的體重總 變化（％)大約與經QD注射相同肽之小鼠的體重總變化相 同。此外，如圖36所示，經QD注射mt_261之小鼠的 體重總變化大約與每兩天注射此肽之小鼠的體重總變化 ❾ 相同。 對血糖值亦可觀察到與體重相同的趨勢（圖37) : QW 注射mt-309達成與QD注射此肽相同的血糖值減低，及 QD注射mt-261達成與每兩天注射此肽相同的血糖值減 低0 實施例38 經由對8組具有56克初始體重的DI〇小鼠（每組8 隻小鼠）皮下注射每天5奈莫耳/公斤、每兩天1〇奈莫耳 /公斤、每二天15奈莫耳/公斤、或一天3()奈莫耳/ 公斤，以致各組接受每星期3〇奈莫耳/公斤之總劑量， 而測試醯化胰咼血糖素激動劑肽mt_261(SEQ id N〇: 105)之給藥頻率對效力的影響。小鼠係8個月大，且經 食用致糖尿病飲食6個月。測量各組的體重、食物攝取、 血糖值及脂肪質量。如圖38所示，經每三天注射肽的小 •224· 201010729 鼠呈現最大的體重減輕。值得注意地，經每天注射肽的小 • 鼠及經每兩天注射肽的小鼠呈現幾乎相同的體重減輕。 實施例39

基本上如文中所述經由固相肽合成製得以下僅對胰 高血糖素受體具有明顯激動劑活性而對GIP受體不具活 性，且包含肽J

HS-X-GTFTSDYSKYLDTRRAAEFVAWL(Nle)DE (SEQ ID NO: 240)

或狀K

HS-X-GTFTSDYSKYLD(Aib)RRAADFVAWLMDE (SEQ ID NO: 241) 之主鏈與在位置3處之額外修飾的胰高血糖素類似物 肽。基本上如實施例1 6中所述測試此等肽對胰高血糖素 受體的活體外活性。各肽的EC50 (nM)示於表5。

表5 肽主鏈 位置3處之胺基酸 SEQ ID NO: 對胰高血糖 素受體的 ECso(nM) %活 性* J Q 242 0.24 25% J C(Acm) 243 0.18 33% J Dab(Ac) 244 0.31 19% -225 - 201010729 J Dap(脲） 245 0.48 13% J Q(Me) 246 0.48 13% J M(O) 247 0.91 7% J Orn(Ac) 248 0.92 7% K Q 249 0.39 15% K Dab(Ac) 250 0.07 86% K Q(Me) 251 0.11 55% Q =麩醯胺酸；C(Acm)=乙醢胺甲基-半胱胺酸；Dab(Ac) = 乙醯基二胺基丁酸；Dap(脲）=胺曱醯基二胺基丙酸；Q(Me)=甲 基麩醯胺酸；M(O)=曱硫胺酸-亞砜；Orn(Ac)=乙醯基鳥胺酸。 如表5所示，多種胺基酸可取代位置3處之Gin，而 不會有對胰高血糖素受體之活性的實質損失，且在一些情 況中，修飾實際上提高活性，例如，在肽K主鏈上的 Dab(Ac)及 Q(Me)。 實施例40 基本上如文中所述製得對胰高血糖素受體具有明顯 活性而對GIP受體不具活性，且包含在各種胰高血糖素 類似物主鏈上之位置3處之Dab(Ac)的胰高血糖素類似 物肽，並測試對胰高血糖素受體的活體外活性。各肽的結 -226- 201010729 構及活性示於表6。

-227- 201010729 Ο ο 9< S 〇 Pi Π ^ 對胰 高J0L 糖素 受體 的 EC50 (nM) 0.026 0.015 0.069 0.023 SEQ ID NO: 252 253 1 254 胺基酸序列 野生型胰高血糖素 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMDT HSDab(Ac)GTFTSDYSKYLDAibRRAADFVAWLLDE HSDab(Ac)GTFTSDYSKYLDAibRRAADFVAWLLDTGPSSGAPPPS 醯胺 -8ZZ- 201010729 ο ο

0.048 0.057 255 256 HSDab(Ac)GTFTSDYSKYLDAibRRASDFVSWLLDE HSDab(Ac)GTFTSDYSKYLDAibRRATDFVTWLLDE 舲硪^-^v^^^liir^w-fr-^^^^ll^H^T^^^^^^^^^^^^^^lf^Tfw? 學 w^w%舲4^-¾¾二务辞躺憮·φ-^_ , φ<<^β -龌^^♦•^^ν^ιέψ^^ 201010729 除非文中另作指示或前後文明顯相互衝突，否則應將 在描述本發明之文中（尤其係在以下申請專利範圍之文中） 之術語「一」及「一個」及「該」及類似指示物的使用解 釋為涵蓋單數及複數。除非另作指示，否則術語「包含」、 「具有」、「包括」及「含有」應作為開放式術語解釋（即 意指「包括，但不限於」）。 除非文中另作指示，否則文中引述值的範圍僅係要充

作個別提及落於該範圍及各終點内之各個別值的簡便方 法’且將各個別值及終點併人說明書中如同其經個別引述 於文中。 除非文中另作指示或者前後文明顯地相互衝突，否則 文中所述之所有方法可以任何適當次序進行。除非另作主 張’否則文巾提供之任何及所有實例、或範例語言⑼如， 「諸如」）之使用僅係要更佳_述本發明，轉要對本 發明之範圍提出限制。不應將說明書中之語言解釋為指示 任何未主張之要素為實施本發明之基礎。 文中說明本發明之較佳具體例，包括發明者已知為實 施本發明的最佳方式。熟悉技藝人士在閱讀先前說明後當 可明白該等較佳具體例的變化。本發明人預期熟悉技藝: 士可適當地㈣該等變化，財發明人職本發明可以除 明確說明於文中者外的方式實施。因此，本發明包括如由 適用法條所許可之於隨附申請專利範圍中所引述之主題 -230- 201010729 内容的所有修改及等效物。此外，除非文中另作指示或者 前後文明顯地相互衝突，否則本發明涵蓋前述要素之所有 可能變化的任何組合。 【圖式簡單說明】 圖1呈現於投與單獨的媒劑（空心倒三角形）、嵌合體 2 AIB2 Cys24 (40K PEG)(實心方形）、gip 拮抗劑 pr〇3 ❹ Cys24 GIP-NH2 (1-42) 40K PEG(空心菱形）、GIP 激 動劑 AIB2 Cys24 GIP (1_42) 40K PEG(具有虛線的空 心正三角形）、或無關的肽激素（陰暗的倒三角形）後，小 鼠體重變化％成時間（天數）之函數的圖。 圖2呈現小鼠之食物攝取（克數）成投與單獨的媒劑 (空心倒三角形）、嵌合體2 AIB2 Cys24 40K PEG(實心 方形）、GIP 拮抗劑 Pro3 Cys24 GIP-NH2 (1_42) 40K PEG(空心菱形）、GIP 激動劑 AIB2 Cys24 GIP (1-42) ® 4〇K PEG(具有虚線的空心正三角形）、或無關的肽激素 (陰暗的倒三角形）後之時間之函數的圖。 圖3呈現在投與單獨的媒劑（黑長條）、嵌合體2 AIB2

Cys24 (40K PEG)(白長條）、GIP 拮抗劑 pro3 CyS24 GIP-NH2 (1-42) 40K PEG(陰暗長條）、GIP 激動劑 AIB2 Cys24 GIP (卜42) 40K PEG(水平條紋長條）、咬 無關的肽激素（垂直條紋長條）後第7天之小鼠血糖值 •231- 201010729 (mg/dL)之變化圖。 圖4呈現於投與單獨的媒劑（實心倒三角形）、嵌合體 2 AIB2(空心菱形）、嵌合體2 AIB2内醯胺（空心三角 形）、三重激動劑肽MT-170(空心方形）、GIP/胰高血糖 素共同激動劑肽MT-182(實心菱形）、GLP-1/GIP共同 激動劑肽MT-178(具有虛線的陰暗三角形）、或GIP/月夷 高血糖素共同激動劑肽MT-179(實心方形）後，小鼠體重 變化％成時間（天數）之函數的圖。注意經聚乙二醇化之 MT-179係作為三重激動劑。 圖5係在投與單獨的媒劑（實心正三角形）、丨〇奈莫耳 /公斤（實心倒三角形）或3 5奈莫耳/公斤（空心方形）之 GLP-1 E 16激動劑、1〇奈莫耳^/公斤（空心倒三角形） 或3 5奈莫耳/公斤（實心菱形）之三重激動劑肽 MT-1 70、或1〇奈莫耳/公斤（灰色倒三角形）或35奈莫 耳/公斤（灰色方形）之GLP-1/GIP共同激動劑肽 MT-178後，小鼠體重變化％成時間（天數）之函數的圖。 圖6係在投與單獨的媒劑（黑長條）、1〇奈莫耳/公斤 (白長條）或35奈莫耳/公斤（灰長條）之GLp l E 16敎 動劑、10奈莫耳/公斤（水平條紋長條）或35奈莫耳/公 斤（垂直條紋長條）之二重激動劑肽MT_17〇、或1〇奈莫 耳/公斤（右-左斜紋長條）或35奈莫耳/公斤（左_右斜故 長條）之GLP-1/GIP共同激動劑肽Μτ_178後第7天之 -232- 201010729 小鼠血糖值（mg/dL)之變化圖。

圖7呈現在對經以1、3、或10奈莫耳/公斤/星期 注射（於時間點_60)媒劑對照物、GLPd激動劑肽對照 物、含内醯胺（環狀）、經聚乙二醇化、GIP-活性胰高血糖 素類似物（「mt_178」）、或不含内醯胺（線性）、經聚乙二 醇化GIP-活性胰高灰糖素類似物（「2 74」）之小鼠 實施葡萄糖注射（於時間點G時投與）之前及之後，血糖值 (mg/dL)成時間之函數的圖。此圖之數據不包含四隻小鼠 之數據’因此等小鼠呈現攻擊行為及實質的體重減輕。 圖8呈現在對經以1、3、或10奈莫耳/公斤/星期 注射(於葡萄糖注射之前24小時)媒劑對照物、激 動劑肽對照物、mt，、或mt_274之小鼠實施葡萄糖注 射（於時間點G時投與）之前及之後，血糖值（mg/dL)成時 間之函數的圖。此圖之數據不包含四隻小鼠之數據，因此 等小鼠呈現攻擊行為及實質的體重減輕。 圖9呈現在以！、3、或1〇奈莫耳，公斤/星期注射 媒劑對照物、GLP]激動劑肽對照物、mt_m、或勝川 後第〇或7天之小鼠血糖值（mg/dL)的圖。此圖之數據不 3四又小鼠之數據，因此等小鼠呈現攻擊行為及實質的 圖1〇呈現在以1、3、$ 10奈莫耳/公斤/星期注 射媒劑對照物、⑽]激動劑肽對照物、mt_m、或 -233 · 201010729 mt-274後第〇、i、3、5、及7天之小鼠體重變化百分比 的圖。此圖之數據不包含四隻小鼠之數據，因此等小鼠呈 現攻擊行為及實質的體重減輕。 圖11呈現在以10或35奈莫耳/公斤/星期注射媒 劑對照物、GLp-l激動劑肽對照物、mt-178、 mt-178(TE)、mt-274、或 mt-274(TE)後第 〇 或 7 天之 小鼠血糖值（mg/dL)的圖。rTE」係指pEG基團連接至 位置40處之Cys。 圖12呈現在以10或35奈莫耳/公斤/星期注射媒 劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、 mt-178(TE)、mt-274、或 mt-274(TE)後第 7 天之小鼠 血糖變化（mg/dL)的圖。「TE」係指PEG基團連接至位 置40處之Cys。 圖13呈現在以1〇或35奈莫耳/公斤/星期注射媒 劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt_ 1 78、 mt-17 8(TE)、mt-274、或 mt-274(TE)後第 0、1、3、5、 7、及1 0天之小鼠體重變化百分比的圖。「TE」係指peg 基團連接至位置40處之Cys。 圖14呈現在以10或35奈莫耳/公斤/星期注射媒 劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、 mt-l78(TE)、mt-274、或 mt-274(TE)後第 7 天之小鼠 體重變化百分比的圖。「TE」係指PEG基團連接至位置 234· 201010729 40處之Cys。 圖15呈現在以1〇奈莫耳/公斤注射媒劑對照物、 GLP-1激動劑肽對照物、mt_178、mt-274、線性、未經 聚乙二醇化、未醯化肽（「mt-3 1 1」）、C1 4脂肪醯化線 性肽（「mt-3 09」）、C16脂肪醯化線性肽（「mt-298」）、 或C18脂肪醯化線性肽（「mt-310」）後第0或7天之小 鼠血糖值（mg/dL)的圖。 圖16呈現在以1〇奈莫耳/公斤注射媒劑對照物、 GLP-1 激動劑肽對照物、mt-178、mt-274、mt-31 1、 mt-3 09、mt-298、或 mt-3 10 後第 0、1、3、5、及 7 天 之小鼠體重變化百分比的圖。 圖17呈現在以10奈莫耳/公斤注射媒劑對照物、 GLP -1 激動劑肽對照物、mt -1 78、mt-274、mt-3 1 1、 mt-3 09、mt-298、或mt-3 10後第7天之小鼠體重變化 百分比的圖。 圖18呈現在以25或125奈莫耳/公斤QD注射媒 劑對照物、利拉魯肽（一種醯化GLP-1類似物）、C14脂 肪醯化、未經聚乙二醇化之線性肽（「mt_260」）、C16 脂肪醯化、未經聚乙二醇化之線性肽（「mt-261」）、或 C18脂肪醯化、未經聚乙二醇化之線性肽（「mt-262」） 七天後第〇及7天之小鼠血糖值（mg/dL)的變化圖。 圖19呈現在以25或125奈莫耳/公斤注射媒劑對 -235 - 201010729 照物、利拉魯肽、mt-2 60、mt-2 61、或mt-2 62後第0、 1、3、5、及7天之小鼠體重變化百分比的圖。 ' 圖20呈現在以25或125奈莫耳/公斤注射媒劑對 照物、利拉魯肽、mt-260、mt-26 1、或mt-262後第7 天之小鼠體重變化百分比的圖。 圖21呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯肽（3〇奈 莫耳/公斤/天）、或mt-261(0.3、1、3、10、或30奈 〇 莫耳/公斤/天）後第〇、1、3、5、及7天之小鼠體重變 化的圖。 圖22呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯肽（3〇奈 莫耳/公斤/天）、或mt_261(〇 3、1、3、ι〇、或奈 莫耳/公斤/天）後第7天之小鼠脂肪質重的圖。 圖23呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯肽奈 莫耳/公斤/天）、或mt_261(〇 3、i、3、1〇、或太 ❹ 莫耳/公斤/天）後第〇及7天之小鼠血糖值（mg/dL)的丁、 圖。 圖24呈現經以（）中指示之劑量（奈莫耳/公斤/天） 注射mt-26 3、促胰島素分泌素小或媒劑對照物之小鼠 之體重變化（變化％)成時間之函數的線圖。 圖25呈現經以（）中指示之劑量（奈莫耳/公斤/ 注—、促姨島素分泌素_4、或媒劑對照物 之體重總變化（％)<於| i 4 第7天相較於第G天所測得）的長條 -236- 201010729

❹

圖26呈現經以（）#指示之劑量（奈莫耳/公斤/天） 注射mt-263、促胰島素分泌素_4、或媒劍對照物之小鼠 之血糖值變化（mg/dL)(於第7天相較㈣G天所測得）的 圖27呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯狀、 mt-277、mt_278、或 mt_279 後第 〇、j、3、$、石 之小鼠體重變化％的圖。 圖28呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯狀、 mt-277、mt_278、或則79後第❹及了天之小鼠血糖 值（mg/dL)的圖。 圖29呈現於投與mt-331、mt川、或媒劑對照物 後第7天測得之小鼠總體重變化（％)的圖。劑量（奈莫耳 /公斤）指示於（）中。 ,圖30呈現於投與mt-331、mt_3U、或媒劑對照物 後第7天測得之小鼠之總食物攝取（克）的圖。劑量（奈莫 耳/公斤）指示於（）中。 圖31呈現於投與mt-331、mt-311、或媒劑對照物 後第7天測得之小鼠血糖值總變化的圖。劑量（奈莫耳/ 公斤）指示於（）中。 圖32呈現於以（）中顯示之指示劑量（奈莫耳/公斤） 才又’、mt-3 3 1、mt·3 5 3、或媒劑對照物後第7天測得之小 237- 201010729 鼠體重總變化的圖。 . 圖33呈現於以（）中顯示之指示劑量（奈莫耳/公斤） ' 投與mt_33i、mt-353、或媒劑對照物後第7天測得之小 鼠總食物攝取（克）的圖。 圖34呈現於以（）中顯示之指示劑量（奈莫耳/公斤） 投與mt-33 1、mt-353、或媒劑對照物後第7天測得之小 鼠血糖值變化（mg/dL)的圖。 〇 圖35呈現於初次投與^^277、mt-278、mt-279、 或媒劑對照物後第7天測得之小鼠體重總變化(%)的圖。 圖36呈現於初次投與mt_261、如_3〇9、或媒劑對 照物後第6天測得之小鼠體重總變化（％)的圖。 圖37呈現於初次投與mt_261、、或媒劑對 '…物後第6天測得之小鼠血糖值（mg/dL)的圖。相同圖案 之各對長條中的第一長條係於第〇天測得之血糖值，及各 ^ 對中的第二長條係第6天的值。 圖38呈現如文中進—步說明經注射媒劑對照物或 mt 261之小鼠在初次投與mt_261後第6天測得之體重 總菱化U)(相較於在投與第一天時測得的體重）的長條 圖。 -238-

Claims (1)

1. 201010729 七、申請專利範圍： 1. 一種具有GIP激動劑活性之胰高血糖素（seqid NO: 1)的類似物，其具有以下的修飾： (a) 在位置1處賦予GIp激動劑活性之胺基酸修飾， (b) 選自由以下所組成之群之修飾： (1)在位置i及i + 4處之胺基酸之侧鏈之間或在位 ©置j及j + 3處之胺基酸之侧鏈之間的内醢胺橋， 其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j 係17，及 (11)在位置16、20、21、及24處之胺基酸中之 一、二、三個、或全部經α，α-二取代胺基酸取代， 及 (c)l-l〇個進一步的胺基酸修飾， 其中該類似物對GIP受體呈現天然GIP之至少1 %的活 ❹ 性。 2 ·如申請專利範圍第1項之類似物，其中該位置1 處之胺基酸修飾係His經不含咪唑側鏈之胺基酸取代。 3 .如申請專利範圍第2項之類似物，其中該不含咪 峻側鏈之胺基酸係大的芳族胺基酸。 -239- 201010729 4. 如申請專利範圍第3項之類似物，其中該大的芳 * 族胺基酸係T y r。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之類似物， 其中該内醯胺橋係在位置16及20處之胺基酸之間，其 中位置16及20處之其中一個胺基酸經Glu取代，及位 置16及20處之另一個胺基酸經Lys取代。 6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之類似物， 其中該α，α-二取代胺基酸係AIB。 7. 如申請專利範圍第1至4、及6項中任一項之類似 物’其中該位置16或位置20處之胺基酸係經α，α -二取 代胺基酸取代。 ❿ 8 ·如申請專利範圍第7項之類似物，其中該位置20 處之胺基酸係ΑΙΒ，及該位置16處之胺基酸係經帶正電 的胺基酸取代。 9.如申請專利範圍第8項之類似物，其中該帶正電 的胺基酸係式IV之胺基酸： •240- 201010729 H2N——C——COOH CH2)n I N. R，、 [式 iv] ’ 其中n係1至7，其中Rl及R1 2各係獨立地選自由以 下基團組成之群：Η、Cl_Cl8烷基、（Cl_Cl8烷基）〇h、 (cvc18 烷基）Nh2、（Cl_Cl8 烷基）SH、（c〇_C4 烷基） (c3-c6)環烷基、（Cg_C4烷基）（C2_c5 雜環基）、（Cq_C4 烧基）（C6-C10芳基）r7、及（Cl_C4烷基）（C3-C9雜芳基）， 其中R7係H或〇H，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺 基0 10. 如申請專利範圍第9項之類似物，其中該式IV 〇 之胺基酸係升Lys、Lys、Orn、或2,4-二胺基丁酸（Dab)。 11. 如申請專利範圍第1至丨〇項中任一項之類似 物’其包含在位置27、28及29之一、二或全部處的胺 基酸修飾。 -241 · 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項之類似物，其中 2 (a)位置27處之Met係經大的脂族胺基酸（視情況 201010729 為Leu)取代， (b)位置28處之Asn係經小的脂族胺基酸（視情況 為A1 a)取代， (C)位置29處之Thr係經小的脂族胺基酸（視情況 為Gly)取代，或 (d) (a)、（b)、及（c)之兩者或全部的組合。 13.如申請專利範圍第12項之類似物，其包含位置 27處之Leu、位置28處之Ala、及位置29處之Gly或 Thr。 1 4 .如申請專利範圍第1至1 3項中任一項之類似 物，其包含在位置29處之胺基酸C_端之}至21個胺基 酸的延伸。 15. 如申請專利範圍第14項之類似物，其中該延伸 包含SEQ ID NO: 95或96之胺基酸序列。 16. 如申請專利範圍第14或15項之類似物，其中該 延伸之1-6個胺基酸係帶正電之胺基酸。 17. 如申請專利範圍第16項之類似物，其中該1-6 個帶正電之胺基酸係為式IV : -242- 201010729 -COOH H2N·—c· (CH2)n Ri 、R2 [式 IV]， 下二1Γ1至7,其中叫各係獨立地選自由以 ❹ (c c Ρ 之群.H、Cl_Cl8 燒基、（Cl-Ci道基）〇Η、 广 燒基）SH、（c〇_C4 燒基） (=二衣燒基、（(VC4烧基)(C2_C5雜環基）、（c〇_C4 、元土 Ά〇芳基）R7、及（C1_C4院基）（C3-C9雜芳基）， 、 系Η或0H ’及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺 基。 18.如申請專利範圍第17項之類似物，其中該式IV © 之胺基酸係升Lys、Lys、Orn、或Dab。 1 9.如申請專利範圍第1至1 8項中任一項之類似 物’其包括含有共價鍵聯至醯基或院基之側鏈的胺基酸， 該醯基或烷基對天然產生之胺基酸係非天然的。 20.如申請專利範圍第19項之類似物，其中該鍵聯 至醯基或烷基之胺基酸係式I、式H、或式III之胺基酸。 -243- 201010729 2 1 ·如申請專利範圍第丨9項之類似物，其中該式工 之胺基酸係Lys。 22.如申請專利範圍第19至21項中任一項之類似 物，其中該鍵聯至醯基或烷基之胺基酸係位在相對於 SEQ ID NO: 1之類似物的位置1〇處。 2 3 .如申請專利範圍第1 9至2 1項中任一項之類似 物，其中當該類似物包含在位置29處之胺基酸c_端之i 至21個胺基酸的延伸時，該鍵聯至醯基或烷基之胺基酸 係位在對應於位置3 7 - 4 3之任一者的位置處。 24.如申請專利範圍第23項之類似物，其中該鍵聯 至醯基或院基之胺基酸係位在位置40處。 25·如申請專利範圍第19至24項中任一項之類似 物’其中該醯基或烷基係透過一間隔物共價連接至胺基酸 之側鏈。 26.如申請專利範圍第25項之類似物，其中該間隔 物係3至1 〇個原子長度。 -244- 201010729 7 ·如申吻專利範圍第2 6項之類似物，其中該間隔 物係胺基酸或二肽。 2 8.如申清專利範圍第2 7項之類似物，其中該間隔 物係6 -胺基己酸。 29.如申請專利範圍第27項之類似物，其中該間隔 ◎ 物係選自由下列所組成之群之二肽：八1&_八1&、卜八1&_ β-Ala、Leu-Leu、pro-Pro、及 γ-Glu- γ-Glu。 3 0.如申請專利範圍第25至29項中任一項之類似 物，其中s亥間隔物及該醯基之總長度係約1 4至約2 8個 原子長度。 31. 如申請專利範圍第19至3〇項中任一項之類似 物’其中該醯基係C12至C18脂肪醯基。 32. 如申請專利範圍第31項之類似物，其中該醯基 係C14或C16脂肪醯基。 33·如申請專利範圍第1至32項中任一項之類似 物’其包含選自由以下所組成之群之修飾： (a)位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、 -245- 201010729 N-曱基- Ser、AIB、Val、或α -胺基-N-丁酸取代， (b) 位置 1〇 處之 Tyr 經 Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、 或Val取代； (c) 一醯基鍵聯至位置l〇處之Lys ; (d) 位置12處之Lys經Arg或He取代； (e) 位置1 6處之Ser經Glu、Gin、升麩胺酸、升半 胱胺績酸、Thr、Gly、或AIB取代； (f) 位置17處之Arg經Gin取代； (g) 位置 18 處之 Arg 經 Ala、Ser、Thr、或 Gly 取 代； (h) 位置 20 處之 Gin 經 Ser、Thr、Ala、Lys、瓜胺 酸、Arg、Orn、或 AIB 取代； (i) 位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺磺 酸取代； (j) 位置23處之Val經lie取代； (k) 位置 24 處之 Gin 經 Asn、Ser、Thr、Ala、或 AIB取代；及 (l) 在位置 2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、 17'18、19、20、21、24、27、28、及 29 中任一者處 之保留性取代。 3 4. —種包含醯基之具有GIP激動劑活性之胰高血 -246- 201010729 糖素（SEQ ID NO: 1)的類似物’其中該醯基係連接至一 '間隔物，其中： - (i)該間隔物係連接至該類似物之位置1 〇處之胺基酸 的側鏈；或 (ii)該類似物包含在位置29處之胺基酸c-端之1至 2 1個胺基酸的延伸，且該間隔物係連接至對應於相對於 SEQ ID NO: 1之位置3 7-43之一者的胺基酸之側鏈； ❹ 其中該類似物對GIP受體呈現天然GIP之至少1%的活 性0 35.如申請專利範圍第34項之類似物，其包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列與（i)在位置1處賦予GIP激動劑 活性之胺基酸修飾及（ii)以下之至少一者或兩者： (A)該類似物包含在位置丨及丨+ 4處之胺基酸之侧鏈 之間或在位置j及j + 3處之胺基酸之側鏈之間的内醯胺 橋’其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j係 17，及 (B)在該類似物之位置16、20、21、及24處之胺基 酸中之一、二、三個、或全部經α，α _二取代胺基酸取代， 及 (in)至多6個進一步的胺基酸修飾。 •247- 201010729 36,如申請專利範圍第35項之類似物，其中該類似 物包含（i)位置16處之Ser經式iv之胺基酸的胺基酸取 代： |_| H2N-c——COOH 丨_η

   〜人 [式 IV]， 其中η係1至7，其中Ri及R2各係獨立地選自由以 下基團組成之群：Η、Cl-C18烷基、（CVCu烷基）OH、 (Cj-Cu 烷基)簡2、（CVCw 烷基)SH、（C〇-C4 烷基） (c3_c6)環烷基、（Cq_C4烷基）（C2_c5 雜環基）、（Cg_C4 燒基）（C6-C1()芳基）r7、及（Ci-CU烷基）（C3-C9雜芳基）， 其中R7係H或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺 基；及（ii)位置20處之Gin經α,α-二取代胺基酸的胺基 酸取代。 3 7.如申請專利範圍第3 4至3 6項中任一項之類似 物，其包含在位置27、28及29之一、二或全部處的胺 基酸修飾。 38.如申請專利範圍第37項之類似物，其包含位置 248- 201010729 27處之Leu、位置28處之Ala、及位置29處之Gly或 Thr。 39. 如申請專利範圍第34至38項中任一項之類似 物’其中該延伸包含SEQ ID NO: 95或96之胺基酸序 列。 40. 如申請專利範圍第34至39項中任一項之類似 物，其中該間隔物係連接至式〗、式π、或式ΠΙ之胺基 酸的侧鏈。 4 1 ·如申請專利範圍第4〇項之類似物，其中該式I 之胺基酸係Lys。 42·如申請專利範圍第34至41項中任一項之類似 物’其中該間隔物係3至1 〇個原子長度。 4 3.如申請專利範圍第42項之類似物，其中該間隔 物係胺基酸 或二肽。 44.如申請專利範圍第43項之類似物，其中 物係6-胺基己酸。 ^ -249- 201010729 45. 如申請專利範圍第43項之類似物，其中該間隔 物係選自由下列所組成之群之二肽：八1&_八1&、0_八1&_ β-Ala、Leu-Leu、Pro-pro、及 γ-Glu- γ-Glu。 46. 如申請專利範圍第34至45項中任一項之類似 物’其中該間隔物及該醯基之總長度係約1 4至約2 8個 原子長度。 〇 47. 如申請專利範圍第34至46項中任一項之類似 物’其中該醯基係C12至C18脂肪酸。 48. 如申請專利範圍第47項之類似物，其中該醯基 係 C 1 4 或 c 1 6。 49. 一種具有GIP激動劑活性之胰高血糖素（SEQID ❿ N0:丨）的類似物，其具有以下的修飾： (a) 在位置1處賦予gip激動劑活性之胺基酸修飾， (b) 在位置i及i + 4處之胺基酸之侧鏈之間或在位置j 及j + 3處之胺基酸之側鏈之間的内醯胺橋，其中丨係12、 13、16、17、20 或 24,及其中 j 係 17， (c) 在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸 修飾，及 (d) l-0個進一步的胺基酸修飾， -250 - 201010729 其中該類似物對GIP受體活化的EC50係約10 nM或以 下0 5 0.如申請專利範圍第49項之類似物，其中該位置1 處之胺基酸修飾係His經不含咪唑侧鏈之胺基酸取代。 51. 如申請專利範圍第49或50項之類似物，其中 @ (a)該位置1處之胺基酸修飾係ms經大的芳族胺基 酸（視情況為Tyr)取代， (b) 該内醯胺橋係在位置16及20處之胺基酸之間， 其中位置16及20處之其中一個胺基酸係經Glu取代， 及位置16及20處之另一個胺基酸係經Lys取代，及 (c) 該位置27處之Met係經大的脂族胺基酸（視情況 為Leu)取代， (d) 該位置28處之Asn係經小的脂族胺基酸（視情況 © 為Ala)取代，及 (e) 該位置29處之Thr係經小的脂族胺基酸（視情況 為G1 y)取代。 52. 如申請專利範圍第49至51項中任一項之類似 物，其包括一或多個以下的修飾： (a)位置12處之胺基酸修飾，視情況經lle取代， -251 _ 201010729 (b)位置17及18處之胺基酸修飾，視情況在位置17 處經Q取代及在位置1 8處經A取代， ⑷將 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)加成至 C- 端。 53.如申請專利範圍第49至52項中任一項之類似 物，其包括一或多個以下的修飾： (l) 位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、 N -甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N -丁酸取代； (m) 位置 1〇 處之 Tyr 經 Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、 或Val取代； (η)—醯基鍵聯至位置10處之Lys ; (〇)位置12處之Lys經Arg取代； (P)位置16處之Ser經Glu、Gin、升麵胺酸、升半 胱胺磺酸、Thr、Gly、或AIB取代； (q) 位置1 7處之Arg經Gin取代； (r) 位置 18 處之 Arg 經 Ala、Ser、Thr、或 Gly 取 代； (s) 位置20處之Gin經Ala、Lys、瓜胺酸、Arg、 Orn、或AIB取代； (t) 位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺磺 酸取代； -252- 201010729 (u) 位置23處之vai經Ile取代； (v) 位置24處之Gin經Asn、Ala、或AIB取代； 及 (w) 在位置 2、5、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、24、27、28、及 29 中任一 者處之保留性取代， 或其任何組合。 ❹ 5 4.種具有GIP激動劑活性之膜高血糖素（SEQ ID NO: 1)的類似物，其具有以下的修飾： (a) 在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾， (b) 在該類似物之位置16、2〇、21、及24處之胺基 酸中的一、二、三個、或全部經α，α_二取代胺基酸取代， (c) 在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸 修飾，及 (d) l-6個進一步的胺基酸修飾， 其中該類似物對GIP受體活化的EC5 0係約1 0 nM或以 下。 55.如申請專利範圍第54項之類似物，其中該位置1 處之胺基酸修飾係His經不含咪唑側鏈之胺基酸取代。 •253- 201010729 5 6.如申請專利範圍第54或55項之類似物，其中 (a) 該位置1處之胺基酸修飾係His經大的芳族胺基 酸（視情況為Tyr)取代， (b) 該a，cx-二取代胺基酸係AIB， (c) 該位置27處之Met係經大的脂族胺基酸（視情況 為Leu)取代， (d) 該位置28處之Asn係經小的脂族胺基酸（視情況 為Ala)取代，及 (e) 該位置29處之Thr係經小的脂族胺基酸（視情況 為Gly)取代。 57.如申請專利範圍第54至56項中任一項之類似 物，其包括一或多個以下的修飾： (a) 位置12處之胺基酸修飾，視情況經ne取代， (b) 位置17及18處之胺基酸修飾，視情況在位置17 處經Q取代及在位置1 8處經A取代， (c) 將 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)加成至 C- 端。 5 8.如申请專利範圍第5 4至5 7項中任一項之類似 物，其包括一或多個以下的修飾： (a)位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D_Ala、Gly、 -254· 201010729 N-曱基-Ser、AIB、Va卜或α-胺基-N-丁酸取代； (b) 位置 1 〇 處之 Tyr 經 Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、 或Val取代； (c) 一醯基鍵聯至位置10處之Lys ; (d) 位置1 2處之Lys經Arg取代； (e) 位置16處之Ser經Glu、Gin、升麵胺酸、升半 胱胺績酸、Thr、Gly、或AIB取代； (f) 位置1 7處之Arg經Gin取代； (g) 位置 18 處之 Arg 經 Ala、Ser、Thr、或 Gly 取 代； (h) 位置20處之Gin經Ala、Lys、瓜胺酸、Arg、 Orn、或AIB取代； (i) 位置21處之Asp經Glu、升楚胺酸、升半胱胺石黃 酸取代； (』）位置23處之¥31經116取代； (k)位置24處之Gin經Asn、Ala、或AIB取代； 及 ⑴在位置 2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、2〇、21、24、27、28、及 29 中任一者處 之保留性取代， 或其任何組合。 -255 - 201010729 59·—種具有GIP激動劑活性之胰高血糖素（SEQ ID NO: 1)的類似物，其具有以下的修飾： (a) 在位置1處賦予gip激動劑活性之胺基酸修飾， (b) 位置16處之ser經式IV之胺基酸的胺基酸取代： COOH h2n——C— CHz) ❹

   r2 η

   [式 IV]， ❹ 其中n係1至7,其中1及R2各係獨立地選自由以下基 團組成之群：H、Ci-C"烷基、（CrCB烷基 烧基）NH2、烷基）SH、（C〇-C4 烷基）（C3-C6)環烷 基、（C〇-C4 烷基）（C2_C5 雜環基）、（Cg_C4 烷基）（C6_Ci〇 芳基）R7、及（Ci_C4烷基）（c3-C9雜芳基），其中R7係Η 或OH ’及式ιν之胺基酸的侧鏈包含自由胺基， (c)位置20處之Gin經α，α-二取代胺基酸的胺基酸 取代， (d) 在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸 修飾，及 (e) l-6個進一步的胺基酸修飾， 其中該類似物對GIP受體活化的EC5 0係約1 0 nM或以 下。 -256- 201010729 • 60.如申請專利範圍第59項之類似物，其中該位置 . 1處之胺基酸修飾係H i s經不含味峻側鏈之胺基酸取代。 61. 如申請專利範圍第6〇項之類似物，其中該不含 咪唑側鏈之胺基酸係大的芳族胺基酸。 62. 如申請專利範圍第61項之類似物，其中該大的 芳族胺基酸係T y r。 63 ·如申請專利範圍第5 9至62項中任一項之類似 物’其中（b)中之該式IV之胺基酸係升Lys、Lys、Orn、 或2,4-二胺基丁酸（Dab)。 64.如申請專利範圍第59至63項中任一項之類似 ❿ 物，其中該α,α-二取代胺基酸係AIB 〇 6 5.如申請專利範圍第59至64項中任一項之類似 物’其中（i)該位置27處之Met係經大的脂族胺基酸（視 情況為Leu)取代’（ii)該位置2 8處之Asη係經小的脂族 胺基酸（視情況為Ala)取代，或（iii)該位置29處之Thr 係經小的脂族胺基酸（視情況為Gly)取代，或其中該類似 物包含（i)、（ii)、及（iii)之組合。 -257- 201010729 66. 如申請專利範圍第59至65項中任一項之類似 物’其進一步包括在位置29處之胺基酸C_端之 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96)的胺基酸序列。 67. 如申請專利範圍第59至66項中任一項之類似 物’其包括一或多個以下的修飾： (a) 位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、 N-甲基-Ser、AIB、Val、或ct-胺基-N-丁酸取代； (b) 位置3處之Gin經Glu取代； (c) 位置1〇處之胺基酸Tyr經包含共價鍵聯至醯基或 院基之側鏈的胺基酸取代； (d) 加成一包含共價鍵聯至醯基或烷基之側鏈的胺基 酸作為該類似物之C -端胺基酸； (e) 位置12處之Lys經lie取代； (0位置17處之Arg經Gin取代； (g) 位置18處之Arg經Ala取代； (h) 位置21處之Asp經Glu取代；及 (i) 位置24處之Gin經Asn取代。 68.如申請專利範圍第66項之類似物，其包括（a)在 258- 201010729 位置2處賦讀Dpp_IV之抗性的胺基酸修飾，及⑻在 位置40處共價鍵聯至酿基或烧基之胺基酸。 69. 如申請專利範圍第68項之類似物，其包括鍵聯 至位置2 4處之胺基酸的親水性部分。 70. —種具有GIP激動劑活性之胰高血糖素（SEq ID N〇: 1)的類似物，其包括： (a) 在位置1處賦予gip激動劑活性之胺基酸修飾， 及 (b) 在位置29處之胺基酸c-端之1至21個胺基酸的 延伸’其中對應於相對於SEQ ID NO: 1之位置37-43 之任一者的該延伸之至少一個胺基酸經醯化或烷化， 其中該類似物對GIP受體活化的EC50係約10 nM或以 下。 71.如申請專利範圍第70項之類似物，其中該類似物進 一步包含其中一個以下的修飾： (A)該類似物包含在位置i及i + 4處之胺基酸之側鏈 之間或在位置j及j + 3處之胺基酸之側鏈之間的内醯胺 橋，其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j係 17 ； -259- 201010729 (B) 在該類似物之位置16、20、21、及24處之胺基 酸中之一、二、三個、或全部經α，α_二取代胺基酸取代； 或 (C) 該類似物包含（i)位置16處之ser經式IV之胺基 酸的胺基酸取代： H2N-c-COOH φ (CH2)n [式 IV]， 其中η係1至7，其中R!及R2各係獨立地選自由以下基 團組成之群：h、Ci-C18烷基、（CVCu烷基 燒基）NH2、（Ci-Cis 炫基）SH、（C〇-C4 院基）（C3-C6)環烧 基、（Co-ca基）（C2-C5 雜環基）、（c0-c4 烧基）（c6-c10 ® 芳基）R7、及（CVC4燒基）（c3-C9雜芳基），其中尺7係Η 或0Η ’及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺基；及（ii) 位置20處之Gin經α，〇ί-二取代胺基酸的胺基酸取代。 72. 如申請專利範圍第7〇或71項之類似物，其包含 在位置27及28之一或兩者處的進一步胺基酸修飾。 73. 如申請專利範圍第70至72項中任一項之類似 -260- 201010729 物’其中該位置1處之胺基酸修飾係His經不含咪唑側鏈 之胺基酸取代。 74.如申請專利範圍第73項之類似物，其中該不含 咪唑側鏈之胺基酸係大的芳族胺基酸。 7 5.如申請專利範圍第74項之類似物，其中該大的 芳族胺基酸係Tyr。 e 76.如申請專利範圍第70至75項中任一項之類似 物’其中該1至21個胺基酸包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NCh 96)之胺基酸 序列’其中X係任何胺基酸或包含一或多個相對於SEQ ID NO: 95或96之保留性取代的胺基酸序列。 ❹ 77.如申請專利範圍第76項之類似物，其中該1至 21 個胺基酸包含 GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 95)或 XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 96)之胺基酸序列，其中 X係任何胺基酸。 7 8.如申請專利範圍第7〇至77項中任一項之類似 物’其中該經醯化或烷化之胺基酸係式I、Π、或ΙΠ之 胺基酸。 -261 201010729 - 79.如申請專利範圍第78項之類似物，其中該經醯 - 化或烧化之胺基酸係Lys。 8 0.如申請專利範圍第70至79項中任一項之類似 物’其中該經醯化或烷化之胺基酸係位在該類似物之位置 37、38、39、40、41、42 或 43 之任一者處。 ❹ 81. 如申請專利範圍第8〇項之類似物，其中該經醯 化或烧化之胺基酸係位在該類似物之位置4 〇處。 82. 如申請專利範圍第70至81項中任一項之類似 物’其中該類似物包含在位置16及20處之胺基酸之間 的内醯胺橋，其中位置16及2〇處之其中一個胺基酸係 經Glu取代，及位置16及2〇處之另一個胺基酸係經LyS ❹ 取代。 83.如申請專利範圍第70至81項中任一項之類似 物，其中該類似物包含在位置16、2〇、21或24處之胺 基酸中之一、二、三個或全部經α，α•二取代胺基酸aib 取代。 84.如申請專利範圍第83項之類似物，其中該類似 •262- 201010729 物包含在位置20處之AIB。 • 85.如申請專利範圍第7〇至81項中任一項之類似 物’其中該類似物包含在位置16處之升Lys、Lys、〇rn、 或2,4·二胺基丁酸（Dab)及在位置20處之AIB。 86·如申請專利範圍第7〇至85項中任一項之類似 ❹ 物’其包括一或多個以下的修飾： (a) 位置 2 處之 Ser 經 D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、 N -甲基-Ser、AIB、Val、或α·胺基-N_ 丁酸取代； (b) 位置3處之Gin經Glu取代； (c) 位置10處之胺基酸Tyr經包含共價鍵聯至醯基或 炫基之側鏈的胺基酸取代； Ο)位置12處之Lys經Ile取代； (Ό位置17處之Arg經Gin取代； (g) 位置1 8處之Arg經Ala取代； (h) 位置21處之Asp經Glu取代；及 (i) 位置24處之Gin經Asn取代。 8 7.如申請專利範圍第7 〇至8 6項中任一項之類似 物，其包括在位置2處賦予對Dpp_iv之抗性的胺基酸修 飾0 •263 · 201010729 88. 如申請專利範圍第87項之類似物，其中該位置2 處之胺基酸係選自由D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲 基-Ser、AIB、Va卜或α_胺基_N_ 丁酸組成之群。 89. 如申請專利範圍第70至88項中任一項之類似 物’其包含至多6個進一步的胺基酸修飾。 90. 一種騰高血糖素類似物，其包含根據SEqidn〇: 227、228、229或230中任一者之胺基酸序列及在位置 29處之胺基酸c_端之1至21個胺基酸的延伸， 其中該類似物對GIp受體活化的EC50係約1〇 nM或以 下。 91. 如申請專利範圍第9〇項之類似物，其中該1至 21個胺基酸之延伸包含gpsSGAPPPS (SEQ IDNO: 95) 或XGPSSGAPPPS (SEQIDNO: 96)之胺基酸序列，其 中X係任何胺基酸或包含一或多個相對於Seq id NO: 95或96之保留性取代的胺基酸序列。 92. 如申請專利範圍第9〇項之類似物，其中該1至 21個胺基酸之延伸包含GPSSGAPpps (SEQ ID Ν〇: 95) 或XGPSSGAPPPS (SEQIDNO: 96)之胺基酸序列，其 中X係任何胺基酸。 -264- 201010729 93. 如申請專利範圍第90至92項中任一項之類似 物其中在對應於位置37-43中任一者之位置處之該延 伸的至少一個胺基酸經醯化或烷化。 94. 如申請專利範圍第93項之類似物，其中該經醯 化或烧化之胺基酸係位在該類似物之位置4 0處。 95·如申請專利範圍第9〇至94項中任一項之類似 物’其中該胰高血糖素肽係共價鍵聯至胺基酸位置24處 之親水性部分。 96. 如申請專利範圍第95項之類似物，其中該親水 性部分係共價鍵聯至Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或 乙酿基-苯基丙胺酸。 97. 如申請專利範圍第95或96項之類似物，其中該 親水性部分係聚乙二醇（PEG)。 98. 如申請專利範圍第90至97項中任一項之類似 物’其進一步包含至多6個進一步的胺基酸修飾。 "·如申請專利範圍第98項之類似物，其包括一或 •265- 201010729 多個以下的修飾： (a) 位置2處之胺基酸係D_Ser、Ala、D-Ala、Gly、 N-甲基-Ser、AIB、Va卜或α_胺基丁酸中之任一者； (b) 位置10處之胺基酸係Tyr、Trp、Lys、Orn、 Glu、Phe、或 Val ; (C) 一醯基鍵聯至位置l〇處之LyS ; (d)位置12處之胺基酸係Ile、Lys或Arg ; Ο (e)位置16處之胺基酸係ser、Glu、Gin、升麵胺 酸、升半胱胺磺酸、Thr、Gly、或AIB中之任一者； (f) 位置17處之胺基酸係Gin或Arg ; (g) 位置18處之胺基酸係Ala、Arg、Ser、Thr、或 Gly中之任一者； (h) 位置20處之胺基酸係Ala、Lys、瓜胺酸、Arg、 、或AIB或另一 α，α_二取代胺基酸中之任一者； ❹ （丨）位置21處之胺基酸係Glu、Asp、升楚胺酸、升 半胱胺績酸中之任一者； (j) 位置23處之胺基酸係Val或lie ; (k) 位置24處之胺基酸係Gin、Asn、Ala、或AIB 中之任一者；及 ⑴一或多個在位置 2、5、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、及 29 中 任一者處之保留性取代。 -266- 201010729 100. —種類似物，其包含選自由SEQ ID NO: 99-141、144-164、166、1 92-207、209-221 及 223 所 組成之群之胺基酸序列。 101. —種類似物，其包含選自由SEQ ID NO: 167-169、173-178及225所組成之群之胺基酸序列。 102. —種類似物，其包含選自由SEQ ID NO: 5-94 所組成之群之胺基酸序列。 103. 如申請專利範圍第53或58項之類似物，其中 該醯基係透過一間隔物鍵聯至L y s。 104. 如申請專利範圍第67至69、86、及99項中任 φ 一項之類似物，其中該醯基或烷基係透過一間隔物鍵聯至 胺基酸側鏈。 10 5.如申請專利範圍第70、93、及94項中任一項 之類似物，其中該在相對於SEQ ID NO: 1之位置37-43 中任一者處之經醯化或烷化之胺基酸係透過一間隔物共 價連接至醯基或烷基。 -267- 201010729 106.如申請專利範圍第ι〇5項之類似物，其中該經 酿化或烧化之胺基酸係位在相對於Seq id NO: 1之位 置40處。 107·如申請專利範圍第100至102項中任一項之類 似物，其中當該類似物包含醯基或烷基時，該醯基或烷基 係透過一間隔物連接至該類似物。 ❹ 108. 如申請專利範圍第103至107項中任一項之類 似物’其中該間隔物係3至1 〇個原子長度。 109. 如申請專利範圍第1〇8項之類似物，其中該間 隔物係胺基酸或二肽。 110. 如申請專利範圍第1〇9項之類似物，其中該間 φ 隔物係6 -胺基己酸。 111. 如申請專利範圍第1〇9項之類似物，其中該間 隔物係選自由下列所組成之群之二肽：八1&_八1&、0-八1&- β-Ala、Leu-Leu、Pr〇-Pr〇、及 γ-Glu- γ-Glu 〇 1 12·如申請專利範圍第103至1 1 1項中任一項之類 似物’其中該間隔物及該醯基之總長度係約14至約28 -268- 201010729 個原子長度。 113.如申請專利範圍第103至112項中任一項之類 似物’其中該醯基係C1 2至C1 8脂肪醯基。 1 14.如申請專利範圍第113項之類似物，其中該醯 基係C14或C16脂肪醯基。 ❹ 1 1 5 .如先刖申請專利範圍中任一項之類似物，其中 該類似物對GIP受體活化的EC50係約1 nM或以下。 116,如先前申請專利範圍中任一項之類似物，其中 該類似物對GIP受體具有野生型gip (SEQ ID NO: 4) 之至少約4%的活性。 〇 117.如先前申請專利範圍中任一項之類似物，其中 該類似物對GLP-1受體活化的EC5〇係約！ nM或以下。 1 1 8 .如先前申請專利範圍中任一項之類似物，其中 該類似物對GLP-1嗳體具有glp_i (SEQ ID NO: 2)之 至少約4%的活性。 119.如先前申請專利範圍中任一項之類似物，其中 -269- 201010729 該類似物對胰高血糖素受體活化的EC50係約1 nM或以 下。 1 2 0.如先前申請專利範圍中任一項之類似物，其中 該類似物對胰高血糖素受體具有胰高血糖素之至少約 20%的活性。 1 2 1.如先前申請專利範圍中除申請專利範圍第1 20 項外任一項之類似物，其中該類似物包含位置3處之胺基 酸修飾且對胰高血糖素受體具有胰高血糖素之低於1%的 活性。 1 22.如先前申請專利範圍中除申請專利範圍第丨】7 及1 1 8項外任一項之類似物，其中該類似物包含位置7 處之胺基酸修飾且對GLP-1受體具有GLP-1之低於約 © 10%的活性。 1 2 3 .如先前申請專利範圍中任一項之類似物，其中 該胰高jk糖素肽係共價鍵聯至胺基酸位置19、2〇、23、 24 ' 27、32、43或C-端之任一者處的親水性部分。 124.如申請專利範圍第ι23項之類似物，其中該胰 高血糖素肽係共價鍵聯至胺基酸位置27或43處之親水 270- 201010729 性部分》 125.如申請專利範圍第I23或124項之類似物，其 中該親水性部分係共價鍵聯至Lys、Cys、〇rn、升半胱 胺酸、或乙醯基-苯基丙胺酸。 .126.如申請專利範圍第123至125項中任一項之類 似物’其中該親水性部分係聚乙二醇（peg)。 127.如申請專利範圍第ι26項之類似物，其中該 PEG具有約1，〇〇〇道耳吞（Dalt〇n)至約4〇 〇〇()道耳吞之 分子量。 1 2 8.如申請專利範圍第1 2 6項之類似物，其中該 PEG具有約20,〇〇〇道耳吞至約4〇 〇〇〇道耳吞之分子量。 129.如申請專利範圍第123至128項中任一項之類 似物，其中該類似物對GIP受體活化的ec 5 0係約1 0 nM 或以下。 130.如申請專利範圍第123至128項中任一項之類 似物’其中該類似物對GIP受體具有野生型gip(seqid NO: 4)之至少約〇.4%的活性。 -271 - 201010729 131. 如申請專利範圍第123至13〇項中任一項之類 似物’其中該類似物對GLP-1受體活化的EC 5 0係約1 0 nM或以下。 132. 如申請專利範圍第I23至130項中任一項之類 似物’其中該類似物對GLP -1受體具有GLP -1 (SEQ ID _ NO: 2)之至少約〇 ·4%的活性。 133. 如申請專利範圍第123至132項中任一項之類 似物，其中該類似物對胰高血糖素受體活化的Ec50係約 1 0 nM或以下。 134. 如申请專利範圍第123至133項中任一項之類 似物，其中該類似物對胰高血糖素受體具有胰高血糖素之 至少2%的活性。 1 3 5 .如先前申請專利範圍中除申請專利範圍第1 2 2 項外任一項之類似物，其中該類似物之Gip效力係在該 類似物之GLP-1效力的約15倍之内。 1 3 6.如先前申請專利範圍中除申請專利範圍第i 2 i 項外任一項之類似物’其中該類似物之Gip效力係在該 -272- 201010729 類似物之胰高血糖素效力的約15倍之内。 , 137. —種包含透過一連接體鍵結之兩個肽之二聚 體，其中該兩個肽中之至少一個係如申請專利範圍第i至 1 3 6項中任一項之類似物。 138. 如申請專利範圍第丨37項之二聚體，其中該二 ^ 聚體係均二聚體。 ❹ 139. 如申請專利範圍第137或138項之二聚體，其 中該連接體係選自由雙官能硫醇交聯體及雙官能胺交聯 體所組成之群。 140. —種共價鍵聯至如申請專利範圍第1至136項 中任一項之類似物、如申請專利範圍第137至139項中 © 任一項之二聚體、或其之組合的結合物。 141. 一種融合肽，其包含融合至第二個肽的如申請 專利範圍第！至136項中任一項之類似物或如申請專利 範圍第137至139項中任一項之二聚體。 142. —種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1 至136項中任一項之類似物、如申請專利範圍第137至 -273· 201010729 139項中任一項之二聚體、如申請專利範圍帛_項之結 合物、如申請專利範圍第141項之融合肽、或其之組合， 及醫藥學上可接受之载劑。 + 143. 一種套組，其包含如申請專利範圍第142項之 醫樂組成物及用於將該醫藥組成物投與病患的裝置。 ❹ 144·如申請專利範圍第143項之套組，其中該裝置 包括含有該醫藥組成物的注射器。 45.種降低體重增加或誘發減重的方法，其包括 =有需要的病患投與可有效降低體重增加或誘發減重之 量的如中請專利範圍第142項之醫藥組成物。 146.-種治療糖尿病的方法，其包括向 患投與可有效降低血糖值之量的如 病 节。月專利乾圍第1 4 2 項之醫藥組成物。 固罘M2 .! 7丨％勝進督野厨L痺的方法，1 要的病患投與可有效引起腸道暫時 量^向有需 利範圍第142項之醫藥組成物。 量的如申請專 -274- 201010729 序列列表 <110> Dimarchi 等人 \ <120>用於治療代謝病症及肥胖症之基於GIP之混合激動劑 <130>31135/43978C <160> 262 <170〉Patentln版本 3.5 <210〉1 <211>29 <212> PRT <213〉人類 <220〉 <221> MISC_FEATURE <223〉野生型胰高血糖素 <400〉1 ' His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 15 10 15 Arg Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 ' 25 <210〉2 · <211>31 <212〉PRT <213〉人類 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223>GLP-l(7-37) ，

   <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15 Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210〉3 <211>30 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成多肽 201010729 <220〉 <221〉MISC一FEATURE <222> (1)..(30) <223> GLP-1 (7-36)醯胺化 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (30)..(30) <223>C-端醯胺化 <400 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15 Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 參 ⑩ <210 4 、 <211>42 <212>PRT <213〉人類 · <220> . <221>mat_K ， <222> (1)..(42) <223>胃抑制多肽 <400> 4 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 lie His Gin Gin Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin Lys Gly Lys 20 25 30 , Lys Asn Asp Trp Lys His Asn lie Thr Gin 35 40 <210〉5 <211>29 <212> PRT <213>人工序列 <220 <223>合成多肽 <220 <221> MISC 一FEATURE <223> 類似 ^61 <220> 201010729 <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400〉5 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210 6 <211>29 <212> PRT <213>人工序列

   <220> ' <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似^62， <220> ' <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 6 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Met Asn Thr , 20 25 <210>7 <211>29 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成多狀 <220〉 <221〉MISC_FEATURE <223>類似物63 <220〉 <221>MISC FEATURE 201010729 <222> (12)..(16) <223>殘基12與16間之內醯胺橋 <400> 7 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210 8 <211>29 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽

   <220> ' <221> MISC_FEATURE <223> 類似-66 <400> 8 ' His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 ' 10 ' 15 lie His Gin Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210> 9 <211〉29 <212>PRT <213>人工序列 <220> , <223>合成多肽 <220〉 <221> MISC—FEATURE <223> 類似 ^68 <400> 9 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys 15 10 15 lie His Gin Glu Glu Phe lie Ala Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210〉10 <211>29 <212>PRT 201010729 <213>人工序列 <220 <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223〉類似 6 69 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400〉10

   His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys 1 5 10 15 lie His Gin Glu Glu Phe lie Ala Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210 11 ’ <211>29 、 <212>PRT <213>人工序列 1 <220> <223>合成多狀 <220 <221> MISC_FEATURE <223>類似物84 <220> , <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400>11 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Glu Phe lie Cys Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210〉12 <211〉29 <212> PRT <213>人工序列 201010729 <220〉 <223>合成多肽 <220〉 <221> MISC_FEATURE <223>類似物85 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <220> <221 > MISC一FEATURE <222> (24)..(24)

   <223> PEG (20kDa)共價連接至半胱胺酸 、 <400> 12 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Tyr Leu Asp Glu 1 5· 10 15 lie His Gin Lys Glu'Phe lie Cys Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210〉13 x <211>29 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成多肽 <220〉 <221> MISC_FEATURE <223〉類似物92 <400〉13 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 Lys His Gin Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210> 14 <211>29 <212> PRT <213>人工序列 <220> 201010729 <223>合成多肽 <220 <221> MISC_FEATURE <223> 類似—93 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <220 <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(21) <223>殘基17與21間之內醯胺橋 <400> 14

   His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Tyr Leu Asp Gld 15 10 15 Lys His Gin Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Leu Ala Gin 20 ‘ 25 <210> 15 ‘ <211>29 Λ <212〉PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220〉 <221> MISC_FEATURE <223>類似物95 <220〉 <221 > MISC—FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 15 His Ala Glu Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210 16 <211>29 201010729 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>mm 96 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉（16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400〉16

   Tyr Ala Glu Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Glu 1 5 10 15 lie His Gin Lys Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210〉17 . <211>29 ' <212> PRT ， <213>人工序列 <220 <223>合成多肽 <220〉 <221> MISC_FEATURE <223> 類似!^97 ， 〇 <220 <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 17 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Tyr Met Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210〉18 <211〉29 <212〉PRT 201010729 <213〉人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221〉MISC—FEATURE <223>類似物98 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 18 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Tyr Met Asp Glu 1 5 10 15

   lie His Gin Lys Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 、 20 25 <210 19 <211>42 ' <212> PRT 、 <213〉人工序列· ， <220> <223>合成多肽 <220 <221> MISC—FEATURE <223>類似物99 <400> 19 ， Tyr Ala Glu Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 lie His Gin Gin Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Trp Leu Lys His Asn lie Thr Gin 35 40 <210 20 <211>42 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 201010729 <220> <221〉MISC 一FEATURE <223> 類似 ^100 <220〉 <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223>Xaa 爲 Aib <400> 20 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Lys 15 10 15 lie His Gin Gin Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Trp Leu Lys His Asn lie Thr Gin

   35 . 40 、 <210 21 <211>42 <212> PRT ' <213>人工序列‘ <220> ' <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> mPM 101 <400> 21 Tyr Ala Pro Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Lys . 〇 1 5 10 15 lie His Gin Gin Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Trp Leu Lys His Asn lie Thr Gin 35 40 <210〉22 <211>42 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> -10 201010729 <221> MISC_FEATURE <223> 類似 fil02 <220> <221>MOD_RES <222> (2)..(2) <223〉Xaa 爲 Aib <400> 22 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser He Ala Met Asp Lys 15 10 15 lie His Gin Gin Asp Phe Val Cys Trp Leu Leu Ala Gin Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Trp Leu Lys His Asn lie Thr Gin 35 40

   <210>23 > <211>42 <212> PRT <213>人工序列· <220> ’ <223>合成多肽. ， <220> <221〉MISC—FEATURE <223〉類似 6 104 <400〉23 Tyr Ala Pro Gly Thr Phe He Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Lys 15 10 15 lie His Gin Gin Asp Phe Val Cys Trp Leu Leu Ala Gin Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Trp Leu Lys His Asn lie Thr Gin 35 40 <210〉24 <211>42 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成多肽 <220〉 <221>MISC FEATURE -11 - 201010729 <223〉類似物105 <220 <221〉MISC—FEATURE <222> (24)..(24) <223> PEG (40kDa)連接至半胱胺酸 <400> 24 Tyr Ala Pro Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Lys 15 10 15 lie His Gin Gin Asp Phe Val Cys Trp Leu Leu Ala Gin Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Trp Leu Lys His Asn lie Thr Gin 35 40 <210>25

   Ο <211>29 > <212> PRT <213>人工序列 <220> ' <223>合成多肽' <220> ' <221〉MISC—FEATURE <223>類似物106 <400> 25 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 lie His Gin Gin Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 , <210〉26 <211>29 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>»^l〇7 <220> <221>MISC FEATURE -12- 201010729 <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400〉26 His Ser Gin Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210〉27 <211>29 <212〉PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成多肽

   <220〉 、 <221> MISC_FEATURE <223>類似物108 <220〉 ' <221〉MISC_FEATURE <222> (16)..(20) · <223>殘基16與20間之內酿胺橋 <400> 27 His Ser Gin Gly Thr Phe lie Ser Asp Tyr Ser Lys Ala Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210〉28 , <211>29 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成多肽 <220 <221〉MISC—FEATURE <223>類似物109 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) -13- 201010729 <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400 28 Tyr Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210> 29 <211>29 <212> PRT <213>人工序列 <220 <223>合成多肽 <220

   <221> MISC_FEATURE ^ <223> minm no <220 <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20)' <223>殘基16與20間之內醯胺橋 · <400> 29 Tyr Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210 30 <211>29 - <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>類似物111 <220> <221>MISC FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 • 14- 201010729 <400> 30 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 20 25 <210 31 <211>24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220〉 <221> MISC—FEATURE

   <223>類似物113 、 <220〉 <221>MOD_RES <222〉⑴..(1) <223>Xaa爲3-苯基乳酸 <220> ‘ <221> MISC_FEATURE A <222〉（11)..(15) <223>殘基11與15間之內醯胺橋 <400 31 Xaa lie Ser Asp Tyr Ser lie Ala Met Asp Glu lie His Gin Lys Asp 15 10 15 Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin ， Q 20 <210> 32 <211>24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>類似物114 <220> <221>MOD RES -15- 201010729 <222> (1)..(1) <223>Xaa爲3-苯基乳酸 <220> <22 卜 MISC一FEATURE <222> (11)..(15) <223>殘基11與15間之內醯胺橋 <400> 32 Xaa Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu lie His Gin Lys Asp 15 10 15 Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gin 20 <210 33

   ❹ <211>39 、 <212>PRT <213>人工序列 <220> ' <223>合成多肽’ <220> ' <221> MISC_FEATURE <223>類似物115 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223>殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 33 . His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 15 10 15 lie His Gin Lys Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210 34 <211>39 <212〉PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成多肽 -16-