200423948 (1) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於含貴金屬微粒子之肌萎縮性脊髓側索硬 化症等之神經變性疾病、風濕病性疾病、缺血性心臟病、 壓力性潰瘍、皮膚炎、動脈硬化症、及高脂血症之預防及 /或治療用醫藥。 【先前技術】 肌萎縮性脊髓側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis :以下本說明書中亦簡稱爲「ALS」）係由大腦 皮質至脊髓之上行運動神經元及由脊髓至肌肉之下行運動 神經元選擇性地受阻礙之進行性神經變性疾病。ALS之發 病頻率高，日本國內亦有許多患者。臨床上肌肉萎縮及肌 力降低爲特徵，病況持續進行時，因肌力降低而發生言語 障礙、吞嚥障礙及呼吸障礙等。病勢發展較爲迅速，若不 使用人工呼吸器等，大多於2至4年死亡。然而，因爲沒 有ALS的根本治療法，關於此疾病，包含患者的照顧， 成爲社會上極大的問題。 由 ALS之其發病型態分爲單發性及家族性。家族性 之 ALS已知分爲優性及劣性之遺傳性。近年來，同定出 作爲優性遺傳性之ALS 1型之原因基因之活性氧代謝酵素 之 Cu/Zn Superoxide Dismutase (銅•鋅超氧化物歧化酵 素；SOD1 ) 。ALS大多是單發性，遺傳性者未滿20%。 因爲ALS1係佔有全ALS比率之2%以下，ALS發症之分 (2) (2)200423948 子機制解明及治療法的開發，雖有待於SOD 1基因以外之 ALS原因基因的發現，採取劣性遺傳型式之ALS2型之原 因基因之嶄新的 ALS 2 CR6基因被單離·同定。另外，關 於 ALS等之神經變性疾症發生活性氧之機制，最有力的 說明係突變等所變異的蛋白質凝聚，引起活性氧的發生（ Current Topic in Medical Chemistry 1:507-517, 2001 )。 對於AL S，包含藥物療法之根本治療法尙未確立。作 爲藥物係使用延緩ALS進行的藥劑之riluzole ( 「Rilutec 」），其他雖使用肌肉弛緩藥、鎭痛劑、精神安定劑、睡 眠劑及維生素B劑等，任何一種均爲對症療法之藥物療法 〇 風濕性疾病係以結締組織之炎症、變性、或代謝障礙 之各種異常爲特徵之疾病，關節、肌肉、骨及韌帶等之運 動器官障礙，並伴隨疼痛及僵硬感之疾病。典型的風濕性 疾病係類風濕關節炎，引起全身的結締組織變化之膠原病 的全身性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus，SLE )或自我免疫疾病亦包含於風濕性疾病。 對於類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA)，並 無根本治療法，經驗性地進行對症療法。作爲治療方法， 藥物療法之外，雖進行基礎療法（安靜、患者教育、及理 學療法等）及手術療法等，治療的原則係藥物療法。作爲 藥物療法，常使用抑制因RA所引起之滑囊炎，減輕疼痛 用之阿斯匹靈、美洒辛（Indomethacin)及二克氯吩（ Diclofenac)等之非類固醇性抗炎症劑（NSAID)，重症 (3) (3)200423948 病例時，亦使用氫化潑尼松（pre do ni so ne )等類固醇劑。 另外，爲修正RA的免疫異常以延緩骨破壞進行，使用抗 風濕劑。作爲抗風濕劑，例如可使用金製劑（蘋果酸金鈉 或金諾芬（auranofin)或methotrexate等之免疫抑制劑。 因心臟的冠狀動脈的粥狀硬化等，發生血管狹窄或閉 塞，冠血流量減少所引起之心機能障礙係造成心臟肌肉成 缺血狀態，所以稱爲缺血性心臟病。缺血性心臟病之代表 性疾病係狹心症及心肌梗塞。心肌梗塞係由血栓而發生持 續性地缺血，引起心肌壞死，有時亦導致死亡。較輕症之 突發性狹心症係於發作時會發生激烈胸痛。 狹心症的藥物療法係使用鋅酸戊酯、硝化甘油及硝酸 異山梨糖醇等之亞硝酸劑、石一型阻斷劑（/3 -blocker) 、銘離子拮抗劑（Calcium antagonists)及 Dipyridamole 等之冠狀動脈擴張劑。對於心肌梗塞則於急性期使用末梢 血管擴張劑及尿激酶（urokinase)等之血栓溶解劑及肝素 鈉（Heparin Sodium)等之抗凝血劑、阿斯匹靈或 ticlopidine等之抗血小板劑等。然而，尤其對於心肌梗塞 急性期，尙未提供可有效地抑制心肌壞死的藥劑。 另外，關於壓力性潰瘍、皮膚炎、動脈硬化症及高脂 血症，亦嘗試使用各種醫藥，但幾乎完全不能提供可達成 滿足治療效果的醫藥，期待嶄新藥劑的開發。 另一方面，已知鉛膠體可分解一種活性氧之過氧化氫 (特開平1 0 -6 8 00 8號公報，0040段落）。然而，此公報 中，並非顯示鈾膠體對於治療及或預防ALS等之神經變 (4) (4)200423948 性疾病、風濕性疾病、缺血性心臟病、壓力性潰瘍、皮膚 炎、動脈硬化症及高脂血症之有效性者。 【發明內容】 發明之揭示 本發明之課題係提供 ALS或阿滋海默氏症（ Alzheimer’s disease)等之神經變性疾病、類風濕關節炎 等之風濕病性疾病、心肌梗塞等之缺血性心臟病、壓力性 潰瘍、皮膚炎、動脈硬化症、及高脂血症之預防及/或治 療用醫藥。本發明者等人爲解決上述課題，努力進行硏究 的結果係發現依據投予鉑膠體等之金屬膠體，可進行預防 及/或治療上述各種疾病。本發明係基於上述發現可完成 者。 亦即，依據本發明，爲選自神經變性疾病、風濕病性 疾病、缺血性心臟病、壓力性潰瘍、皮膚炎、動脈硬化症 、及筒脂血症所成群之疾病的預防及/或治療用醫藥，提 供含有貴金屬或含貴金屬合金之微粒子爲有效成份之醫藥 〇 依據上述發明之適合型態係提供神經變性疾病爲肌萎 縮性脊髓側索硬化症、阿滋海默氏症或巴金森氏病之上述 醫藥；及神經變性疾病爲肌萎縮性脊髓側索硬化症之上述 醫藥；風濕病性疾病爲類風濕關節炎之上述醫藥；缺血性 心臟病爲急性期心肌梗塞之上述醫藥；壓力性潰瘍爲壓力 -8- (5) (5)200423948 性胃潰瘍或壓力性十二指腸潰瘍之上述醫藥。 另外，依據上述發明之更好的型態係貴金屬爲1種或 2種以上選自釕、铑、鈀及鈾所成群的貴金屬之上述醫藥 ;貴金屬爲鉛之上述醫藥；貴金屬微粒子係平均粒徑爲 l〇nm以下之鉑膠體之上述醫藥。 從其他的觀點上，爲選自神經變性疾病、風濕病性疾 病、缺血性心臟病、壓力性潰瘍、皮膚炎、動脈硬化症、 及高脂血症所成群之疾病的預防及/或治療方法，提供包 含投予貴金屬微粒子於包括人之哺乳動物之步驟的方法。 另外，由本發明亦提供製造上述醫藥用之貴金屬微粒子之 使用。 用以實施發明之最佳型態 本發明之醫藥係選自神經變性疾病、風濕病性疾病、 缺血性心臟病、壓力性潰瘍、皮膚炎、動脈硬化症、及高 脂血症所成群之疾病的預防及/或治療用醫藥，以含貴金 屬微粒子爲有效成份爲特徵。貴金屬的種類並無特別地限 制，雖然可使用任一種之金、釕、铑、鈀、餓、銥或鉑， 但適合的貴金屬爲釕、铑、鈀或鉑。貴金屬微粒子亦可含 有2種以上之貴金屬。另外，亦可使用含有至少1種貴金 屬合金之微粒子、或含有1種或2種以上之貴金屬微粒子 與1種或2種以上貴金屬以外之金屬微粒子之混合物。例 如可使用金及鉑所形成之合金。其中適合的是鈾或含鉑之 合金，以鉑尤佳。 -9- (6) (6)200423948 作爲貴金屬微粒子，比表面積大，以可形成表面反應 性優異之膠體狀態之微粒子爲宜。微粒子的粒徑並無特別 的限制，可使用具有平均粒徑爲5 0 nm以下之微粒子，以 平均粒徑2 0 n m以下爲宜，以平均粒徑1 〇 n m以下尤佳， 以平均粒徑1至6nm程度更好之微粒子。亦可使用再細 小的微粒子。 貴金屬微粒子的製造方法已知數種（例如特公昭5 7 -43 1 25號公報、特公昭5 9- 1 20249號公報、及特開平9-22 5 3 1 7號公報、特開平10- 1 76207號公報、特開200 1 -7 93 82號公報、及特開200 1 - 1 22723號公報等），該業者 可由參考此等方法而容易地調製微粒子。例如，作爲貴金 屬微粒子之製造方法，可使用稱爲沈澱法或金屬鹽還原反 應法之化學性方法、或稱爲燃燒法之物理性方法等。作爲 本發明醫藥之有效成份雖可使用以任一種方法所調製之微 粒子，但就製造的容易性及品質面上，以使用金屬鹽還原 反應法所調製之微粒子爲宜。 金屬鹽還原反應法，例如調製水溶性或有機溶媒可溶 性之貴金屬鹽或貴金屬配位化合物之水溶液或有機溶媒溶 液，此溶液中加入水溶性高分子後，調節溶液之pH爲9 至1 1，於不活性環境下，以加熱回流還原而可得金屬微 粒子。貴金屬之水溶性或有機溶媒可溶性之鹽的種類並無 特別的限定，但可使用例如醋酸鹽、氯化物、硫酸鹽、硝 酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽等，亦可使用此等之配位化合物。 金屬鹽還原反應法所使用之水溶性高分子的種類，並 -10- 200423948 無特別的限定，可使用例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇 、聚丙烯酸、環狀糊精、胺基果膠或甲基纖維素等，亦可 組合此等之2種以上使用。可使用聚乙烯基吡咯烷酮爲宜 ，以使用聚（1-乙烯基-2-吡咯烷酮）尤佳。另外，亦可 使用取代水溶性高分子，或與水溶性高分子一起之各種界 面活性劑’例如陰離子性、非離子性或脂溶性等之界面活 性劑。使用醇進行還原時，可使用乙醇、正丙醇、正丁醇 、正戊醇或乙二醇等。當然，貴金屬微粒子的調製方法係 不局限於上述所說明的方法。 本發明之醫藥係可使用於預防及/或治療選自神經變 性疾病、風濕病性疾病、缺血性心臟病、壓力性潰瘍、皮 膚炎、動脈硬化症、及高脂血症所成群之疾病。 作爲神經變’性疾病，可舉例如肌萎縮性脊髓側索硬化 症、阿滋海默氏症及巴金森氏病等，但不以此爲限。本發 明醫藥的適用對象爲肌萎縮性脊髓側索硬化症。 作爲風濕病性疾病，可舉例如類風濕關節炎、幼年型 類風溼性關節炎、紅斑性狼瘡（盤狀狼瘡、全身性紅斑狼 瘡、及藥源性狼瘡等）、硬皮症、廣泛性滑膜炎、多發性 肌肉炎及壞死性血管炎及其他血管症、修格連氏症候群（ Sjogren s Syndrome)、合併症 fl矢群（overlap syndrome) 等之廣泛性結締組織異常、伴隨脊髓炎之關節炎、變性關 節疾病（骨關節症、變形性關節症）、伴隨感染病原體之 關節炎、伴隨風濕症狀之代謝性及內分泌性疾病、新生物 (腫瘍）、神經•血管異常、骨及軟骨疾病、關節外疾病 -11 - (8) (8)200423948 及關節症狀之各種疾病等（Decker J.L. et al.5 Arth. Rheum·，26(8)，1 9 8 3 )，但並不局限於此等。本發明醫藥 之適用對象以類風濕關節炎爲宜。。 本說明書所使用之缺血性心臟病之用語至少包含狹心 症及心肌梗塞，分別包含各種病型。例如狹心症有勞動性 狹心症及自發性狹心症等（海老原等編，「狹心症與/3型 阻斷劑-臨床藥理與臨床應用-」，臨床醫學硏究教會， 1 9 8 9 )，亦可分類爲勞動性狹心症及不安定狹心症（ American Health Association)。心肌梗塞一般係冠狀動 脈的大分枝發生阻塞，該灌流區域發生大範圍的壞死。缺 血性心臟病亦可分類爲勞動性狹心症、心肌梗塞症（包含 急性及陳舊性）、中間型、及無痛性缺血性心臟病（包含 無症狀性及慢性心肌障礙）（安部等編，「狹心症」，金 原出版，1 9 8 5 )。另外，已知心肌梗塞治療所實施之 PTCA ( Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty ，氣球擴張術）中，汽球或導管的處置後，血管再狹窄或 再阻塞的發生比率高，但伴隨此等處置所引起之血管再狹 窄或再阻塞之心臟病亦包含於缺血性心臟病。本說明書中 所使用之缺血性心臟病之用語係必須最廣義地解釋以包含 全部此等疾病，不局限於任何的意義的解釋。 壓力性潰瘍包含消化性潰瘍，更具體地包含胃潰瘍及 十二指腸潰瘍。消化性潰瘍的第一次病因已知爲壓力之外 因性病因，對於壓力爲主要病因之潰瘍，可適用本發明之 醫藥。本發明之醫藥係壓力爲確實原因之外，懷疑其存在 •12- (9) (9)200423948 時亦可適用。 對於皮膚炎，例如由接觸毒性化學物質或光所引起之 接觸性皮膚炎（一時刺激性接觸皮膚炎、過敏性接觸性皮 膚炎、光毒性接觸性皮膚炎及光過敏性接觸性皮膚炎等， 大城戶編，皮膚科治療手冊，南山堂，1 9 8 9 )之外，包括 濕疹群（急性濕疹及慢性濕疹等）、異位性皮膚炎（新生 兒至乳兒期、幼兒期至學童期及成人期中之異位性皮膚炎 等）、脂漏性皮膚炎、自體敏感性皮膚炎（ autosensitization dermatitis)及藥瘆等。本發明之醫藥係 除了全身投予外，亦可局部投予於皮膚炎的部位。 動脈硬化症係表示動脈壁的改建、硬化及機能降低之 局部性動脈病變之總稱，包含中膜硬化、細動脈硬化、及 粥狀（aterom )硬化等之病態。成爲本發明醫藥之提供對 象之動脈硬化症係此等中任一種皆可，動脈的部位亦無特 別的限制，例如任何一種冠狀動脈、腦動脈、腎動脈及四 肢動脈等皆可。另外，本發明醫藥之適用對象亦可爲動脈 硬化病變初期之血管內皮細胞之泡沬細胞化、泡沬細胞的 細胞壞死、及粥狀硬化病巢之脂質堆積等之任一種病變期 之動脈硬化。本發明醫藥之提供對象係對於完成的動脈硬 化以外，亦包含達成動脈硬化形成過程之病變，必須最廣 義地解釋。另外，本發明之醫藥具有降低血中脂質作用， 可使用於預防及/或治療高脂血症。 本說明書中，「預防及/或治療」之用語係預防上述 疾病之發病，及上述疾病發病後之治療以外，必須包含抑 -13- (10) (10)200423948 制上述疾病的進行、改善或減輕上述疾病、以及預防上述 疾病再發等之最廣義地解釋，不局限於任何的意義的解釋 〇 本發明醫藥之投予途徑並無特別的限制，可選擇任一 種的經口投予或非經口投予之投予途徑。作爲本發明之醫 藥，可直接使用由上述說明方法所調製之膠體狀態之貴金 屬分散物或乾燥狀態之貴金屬微粒子。水中或有機溶媒中 ，或水與有機溶媒之混合物中所調製之金屬微粒子雖以膠 體狀態存在，但此膠體狀態之貴金屬分散物可作爲本發明 之醫藥直接使用。另外，貴金屬微粒子組合而形成群之水 性懸濁劑亦可作爲本發明之醫藥使用。另外，若須除去溶 媒時，可由加熱等之操作，除去溶媒而得到乾燥狀態之微 粒子，由此操作所得之乾燥微粒子亦可作爲本發明之醫藥 使用。作爲淸涼飮料水之含鉛微粒子水（例如「白金玄水 」，Inobex股份有限公司）或急性腸胃炎或慢性腸胃黏膜 炎之治療劑之鈷·鈀膠體製劑（「內服用paplal」，東洋 厚生製藥所股份有限公司）等亦可作爲本發明之醫藥使用 〇 另外’本發明之醫藥係可由該業者已知的方法所製造 之經口用或非經口用之醫藥組成物而投予。作爲適合經口 投予之醫藥用組成物，可舉例如錠劑、膠囊劑、散劑、細 粒劑、顆粒劑、液劑及糖漿劑等，作爲適合非經口投予之 醫藥用組成物，可舉例如注射劑、點滴劑、栓劑、吸入劑 、點眼劑、點鼻劑、點耳劑、軟膏劑、乳霜劑、經皮吸收 -14- (11) 200423948 劑、經黏膜吸收劑及貼附劑等。上述之醫藥組 用有效成份之貴金屬微粒子與1種或2種以上 加物而製造。作爲製劑用添加物，可舉例如賦 劑或助崩解劑、結合劑、滑澤劑、包覆劑、色 、基劑、溶解劑至助溶劑、等張化劑、酸驗調 化劑、噴射劑及粘合劑等，此等可因應醫藥用 態，該業者可適當地選擇。 本發明醫藥之投予量並無特別的限制，可 類、預防或治療的目的、患者的年齡、體重及 當地選擇，例如經口投予時，成人每日之貴金 量，可使用於0.001至l，000mg程度之範圍。 【實施方式】 實施例 以下係依據實施例更具體地說明本發明， 範圍並不局限於下述之實施例。 例1 於連接芳基冷卻管與三路活塞之100ml 瓶，放入聚（1 一乙儲基一 2 —吼咯院酮）（和 有限公司製，〇· M67g )，以23ml的蒸餾水转 溶液10分鐘後，加入溶解氯化鉑酸（H2PtCl 光純藥股份有限公司製）於蒸餾水之1.66x1 2ml)，再攪拌30分鐘。氮氣取代反應糸 成物係可使 之製劑用添 形劑、崩解 素、稀釋劑 節劑、安定 組成物之型 因應疾病種 症狀等而適 屬微粒子重 但本發明之 二口圓底燒 光純藥股份 解。攪拌此 • 6H20 ，和 )_ 2 Μ溶液（ 統內，加入 -15- (12) 200423948
2 5ml之特級乙醇，保持氮氣環境下，於10(TC下回流2小 時。測定反應液之UV，確認鉑離子波峰的消失及依據金 屬固體特有的散亂之波峰飽和，結束還原反應。減壓餾去 有機溶媒，調製含鉑微粒子（平均粒徑數2.4 ±0.7 nm )之 鉑膠體水。於下述實施例中，此鉑膠體水係以PVP-Pt表 示。同樣地操作，使用聚丙嫌酸鈉（Aldrich社製，對於 Pt之單位爲125倍）取代聚（卜乙烯基-2·吡咯烷酮）， 調製平均粒徑爲2.0 ± 0.4nm之鉑膠體水。於下述實施例 中，此鈾膠體水以PAA-Pt表示。 例2 6 至 8 週齡大之 B6S JL-TgN ( SODIG93 A ) GUr 小鼠 (肌萎縮性脊髓側索硬化症模式小鼠），自由地給予0.66 //Μ、0.066//M、或6.6nM之上述鉑膠體水（PVP-Pt)而
飼育。從第1 6週起，以通常的水飼育之對照組小鼠，發 現肌萎縮性脊髓側索硬化症之典型症狀，後腳無法動作， 只能靠前腳爬。另一方面，投予鉑膠體水之小鼠，認爲依 投予量而改善上述之症狀。6.6nM投予組之小鼠，雖步行 時後腳有搖搖擺擺等之異常，但可以步行。0.0 6 6 // Μ投 予組之小鼠，雖認爲後腳顫抖，但爲可以很快地站立的狀 態，0.66 // Μ投予組之小鼠，認爲未發現症狀，具有與正 常小鼠同樣的步行能力。 例 -16- (13) (13)200423948 對於3週齡大及7週齡大之B6SJL-TgN ( SODIG93A )GUi*小鼠，投予0.5 // Μ之上述鉑膠體水（PVP-Pt，用 量爲鉑投予量），使用紅外線掃描器，測定小鼠受信之移 動次數。移動次數少意味著因肌萎縮性脊髓側索硬化症發 病而運動量降低。投予水以取代鉑膠體水之B6SJL-TgN ( SODIG93A ) GUr小鼠爲比較組（病態小鼠），進行與正 常小鼠的比較。使用7週齡大的小鼠之實驗結果如第1圖 所示。投予本發明醫藥組，有意義地抑制因肌萎縮性脊髓 側索硬化症發病之運動量降低。 例4 將大鼠（日本 Charles River，LEW/CrJ 系，100 至 1 3 0g，7週齡大）於5天的檢疫期間及之後8天的馴化期 間後，使用於實驗。動物係飼育於室溫爲20至2 6°C，濕 度爲4 0至7 0 %，明暗各12小時之條件下，以固體飼料（ CRF-1，Oriental酵母工業股份有限公司）自由攝餌。將引 起發炎用試藥（Mycobacterium butyricum, Difco)懸濁於 流動鏈烯烴，使濃度成爲1 .Omg/ 0· lmL，於乙醚麻醉下 ，使用裝有27G注射針（裝片針）之聚丙烯製可拋棄式 注射筒，投予左側後肢腳掌皮內。引起發炎用試藥係投予 藥劑開始日之投予藥劑前，投予0 . 1 mL /隻。 將作爲本發明醫藥之上述鉑膠體水（PAA-Pt )，使用 裝有2 5 G注射針之聚丙烯製可拋棄式注射筒，投予尾靜 脈內。投予次數爲1日1次，投予開始日爲投予1日，投 -17- (14) (14)200423948 予期間爲20日。投予量爲0.05/zmol/kg、0.5//mol/kg及 5 // mol/kg。對照之生理食鹽水同樣地投予尾靜脈內。 動物係各組1 0隻，投予1、2、4、7、9、1 1、14、
1 6及1 8日之投予藥劑前以及解剖日，使用小鼠及大鼠後 肢腳掌容積測定裝置（TK - 1 0 1 CMP, Unicom股份有限公司 )’進丫了測疋兩側後肢腳掌容積。由投予1日及各測定曰 之腳掌容積，使用下式算出浮腫率。浮腫率（△ % )二（ 各測定日之腳掌容積（mL) -投予i日之腳掌容積（mL ))+投予1日之腳掌容積（mL) xlOO 於剖檢日，以乙醚麻醉或腹部大動脈放血致死後，於 大腿骨中央部份切斷兩後肢，以20%之中性緩衝福馬林固 定。固定後，以軟X射線攝影裝置拍攝軟X射線照片。 骨破壞係觀察透視機上所照射之X射線底片，對於破壞 程度評分化。評分化係對於腳跟骨（Calcaneus )、躕骨 (Tarsal bones )、中足骨（Metatarsals)及脛骨（Tibia )，依據下述判定基準判定，求出4部位之評分合計。 骨破壞評分 〇 :正常 1 :輕度骨破壞，密度降低 2 :中度骨破壞，密度降低 3 :強度骨破壞及變形 第2圖係表示對於浮腫率之本發明醫藥之效果。另外 ，第3圖係對於骨破壞之本發明醫藥之效果。顯示本發明 醫藥對於浮腫及骨破壞具有優異的治療效果。就病理所見 -18- (15) (15)200423948 ，炎症細胞浸潤於患部係藥劑投予組與對照組間認爲並無 差異，但對於浮腫、膿瘍及骨破壞等之組織破壞狀況，認 爲藥劑投予組比對照組有明顯的改善。 例5 將兔子（北山labes股份有限公司，Kbl : JW ( SPF )系，2.00至2.80kg，12週齡大），設有5天的檢疫及 2天的馴化期間後，進行測定體重及觀察一般狀態，使用 認爲一般狀態及體重變化無異常的動物於實驗。動物係飼 育於室溫爲20至26 °C，濕度爲40至70%，明暗各12小 時之條件下，以每日l〇〇g比率之固體飼料（RC4， Oriental酵母工業股份有限公司）給餌。 由 13 至 16 週齡之兔子之耳廓靜脈，投予 3 Omg/mL/kg 之戊巴比妥鈉（pentobarbital sodium)麻醉 後，固定成背位。插入氣管套管（Cannula )於氣管後， 連接人工呼吸器（NEW ENGLAND INC·，141A )(設定條 件：40至60次/分，20至30ml/次，依麻醉狀況的範 圍內調整），維持呼吸。血壓係介由插入於大腿動脈之動 脈套管所連接之壓力轉換器（TP-3 0 0T，日本光電工業股 份有限公司），誘導至偏壓用放大器（AP-601G，日本光 電工業股份有限公司）及血壓測定單位（AP-61 1G，日本 光電工業股份有限公司），記錄於記錄器（WT-64 5 G，曰 本光電工業股份有限公司）上。心電圖（第2誘導）係以 電極針誘導生體電學用放大器（AB-621G，日本光電工業 -19- (16) 200423948 股份有限公司），記錄於記錄器（WT- 645 G，日本光 棄股份有限公司）上。 將施以處置之兔子之左第四肋骨與第五肋骨間切 開胸。切開心包膜後，使心臟露出胸腔外，將左冠狀 (L C A ) ’使用帶縫合線針結紮（3 / 8圓型圓針，日 事股份有限公司），封閉3 0分鐘（缺血）。封閉3 〇 後解開所結紮的縫合針（縫合線爲能即時結紮LCA， 留在胸腔內），開放血管（再灌流）。於60分鐘後 ，動物放回飼育室內。 開放約4 8小時後，以戊巴比妥鈉同上述麻醉後 動物由總頸動脈放血致死。開胸摘出心臟，以生理食 洗淨心臟。結紮洗淨心臟的LCA，由大動脈的切開口 流染色1至 K5ml程度的0.5 %之伊凡士藍。染色後 心臟的左心室，將心肌以平行心底部而由心尖部每 5mm切片後（各個體爲6片），放入放有1%TTC ( 三苯四氮 D坐，Triphenyltetrazolium Chloride)磷酸緩 液之燒杯，於設定爲3 7 t之恒溫槽中加溫1 〇分鐘。 後，將切片心肌拍照，分別切開爲非缺血區域（伊凡 染色區域：A )、缺血部位非梗塞區域（伊凡士藍非 區域中TTC染色區域：B )及梗塞區域（伊凡士藍非 區域中T T C非染色區域：C )，分別測定其重量。由 定的重量，算出缺血區域重量（B+C之6片份之合 對於總左心室重量（A + B + C之6片份之合5十）之 ，以及梗塞區域重量（C之6片份之合計）對於缺血 電工 開而 動脈 本商 分鐘 直接 閉胸 ，將 鹽液 ，灌 ，僅 間隔 氯化 衝溶 加溫 士藍 染色 染色 所測 計） 比率 區域 -20 - (17) 200423948 重量之比率。調製1 %TTC磷酸緩衝溶液係於溶解磷酸緩 衝錠於注射用水之磷酸緩衝液中，溶解TTC成爲Iw/v% 。調製〇·5%伊凡士藍係溶解伊凡士藍於注射用水成爲 0 · 5 w / v %。
P A A-Pt係以生理食鹽水稀釋後投予靜脈內。再灌流$ 分鐘前’由大腿靜脈單次投予藥劑（〇 · 5 # g / k g )接著持 續投予至再灌流結束（0 · 5 // g / k g / h r )。投予液量係單次 投予爲〇.lmL/kg，持續投予爲imL/kg/hr。另外，再灌流 結束後2 4小時後，再次單次投予藥劑。作爲對照組係將 生理食鹽水與上述藥劑投予組同樣地單次投予及持續投予 (投予液量係單次投予爲 O.lmL/kg，持續投予爲 lmL/kg/hr)。結果如表1所示。由表1的結果顯示，本 發明之醫藥係於心肌缺血再灌流障礙模式中，有意義地減 少梗塞區域及缺血區域，認爲尤其5 // mo Ι/kg投予組有極 顯著的作用。 -21 - (18)200423948 表1 組 動物號碼 梗塞 梗塞量+ 全左 梗塞 缺血 量 缺血量 心室 區域 區域 (g) (g) (g) (%) (%) Vehicle 10 1 0.94 2.17 5.43 43.3 40.0 (生理食鹽液） 102 0.60 2.16 5.19 47.8 4 1.6 104 1.20 2.09 5.46 57.4 38.3 106 1.05 2.13 6.28 49.3 33.9 107 1.09 2.09 5.4 1 52.2 38.6 108 1.00 2.88 6.15 34.7 46.8 109 0.49 1.66 5.65 29.5 29.4 111 0.77 1.47 5.19 52.4 28.3 113 0.63 1.89 5.47 33.3 34.6 平均 42.2 36.8 標準誤差 3.7 2.0 P AA-Pt 201 0.73 1.57 5.15 46.5 30.5 0.5 μηιο 1/kg 202 0.99 2.46 5.3 1 40.2 46.3 205 0.28 1 .92 5.08 14.6 37.8 206 0.61 1.37 5.35 44.5 25.6 207 0.46 2.19 5.30 2 1.0 41.3 平均 33.4 36.3 標準誤差 6.5 3.7 P AA-Pt 301 0.11 2.05 5.94 5.4 34.5 5 μηιο 1/kg 302 0.82 2.22 5.38 36.9 4 1.3 303 0.28 2.23 6.28 12.6 35.5 304 0.68 2.77 6.17 24.5 44.9 305 0.78 2.14 5.12 36.4 41.8 306 0.34 1.77 4.84 19.2 36.6 307 1.65 2.42 5.17 68.2 46.8 308 0.40 2.57 5.92 15.6 43.4 309 0.78 2.39 5.59 32.6 42.8 3 10 0.13 1 .22 5.84 10.7 20.9 平均 26.2* 38.9 標準誤差 5.8 2.4 *p< 0.05 對 Vehicle 具有有意差（Student’s t-test) •22- (19) (19)200423948 例6 將大鼠（日本 Charles River, CrJ : CD(SD)IGS 系， 140至21 0g，雄6週齡大）於5天的檢疫期間及之後2天 的馴化期間後，使用於實驗。動物係飼育於室溫爲2 0至 26 °C，濕度爲40至70%，明暗各12小時之條件下，以固 體飼料（CRF-1，Oriental酵母工業股份有限公司）自由 攝餌。將本發明醫藥之上述鉑膠體水（PAA-Pt )，使用裝 有2 5 G注射針之聚丙烯製可拋棄式注射筒，丨日1次投予 尾靜脈內（2mL/kg )或經口投予（5mL/kg )。作爲對照 組之生理食鹽水同樣地投予尾靜脈內。 投予檢體3 0分鐘後，放入拘束用不绣鋼製飼育箱（ 4.5 X 4 ·5 X 1 8cm，10個相連），浸入2 3 ± 1 °C的水槽中至 胸部劍狀突起。水浸拘束7小時後，使大鼠頸椎脫臼安樂 死，摘出胃。所摘出的胃，充塡10ml的生理食鹽液於內 部，再將其浸入1 %福馬林至次日固定。固定後，沿著胃 大彎切開，於生理食鹽液中輕輕洗淨後，測定潰瘍的長度 。測量短徑/長徑中之長徑，以總合爲該個體的値。 潰瘍的長徑係算出各組的平均値±標準誤差（mm ) 。有意差檢定係每投予途徑，比較媒體組與PAA-Pt組間 ，F-test 後，等分散（homoscedasticity )時係進丫了 Student’s t-test，不等分散（heteroscedasticity)時則進 行Aspin-Welch test。另外，有意水準爲5%未滿時爲有意 ，分爲5%未滿（？<0.05)及1%未滿（P < 〇.〇1 )表示。 拘束3小時之生理食鹽水投予組之潰瘍直徑（平均値）爲 -23- (20) (20)200423948 19.86mm (標準偏差 8.41mm) ，PAA-Pt投予組之潰瘍直 徑（平均値）爲 7.27mm (標準偏差 2.57mm ， p = 0.0 0 5 6 6 3 5 3 )。另外，拘束7小時之生理食鹽水投予組 之潰瘍直徑（平均値）爲4 3.8 8mm (標準偏差11.96mm) ，PAA-Pt投予組之潰瘍直徑（平均値）爲19.84mm (標 準偏差 7.50mm，p = 0.00191338)。 例7 各組使用4隻BALB/c系小鼠，使用new quinolones 系合成抗菌藥之lomefloxacin ( LFLX (鹽酸）洛梅沙星， 已知可引起光敏化），檢討本發明之醫藥對於因光敏化所 引起皮膚炎的作用（Tokira，Y. et al. J. Immunol.，160, pp.3719-3728, 1 9 9 8; Watanabe，H.，e t al. ? J. Biol. Chem. ? 279，pp. 1 676- 1 6 8 3, 2004 )。對於投予 2 m g / 0 · 2 m 1 ( i. p ·) LFLX之小鼠，照射UVA ( 12J/cm2 )於腹部剃毛部位，進 行光敏化。力日入ImM的PAA-Pt於含有2%之羧乙烯基聚 合物之水溶液中，調製成凝膠軟膏，由敏化之次日至第5 天（第5天係光照射後塗佈），於耳廓兩側塗佈0.3g/ear 。陽性對照係僅塗佈2% ( w/w )之羧乙烯基聚合物。於 第5天腹腔內（i.p.)投予2mg/0.2mL之LFLX，照射 UVA ( 20J/cm2 )於兩耳廓。對於非敏化組，於第5天僅 進行投予 2mg/0.2mL 之 LFLX 及照射 UVA(20J/cm2)。 其結果係照射24小時後（第6天）之鉑膠塗佈組與陽性 對照組相比較，耳廓腫脹爲有意義地弱。另外，觀察照射 -24- (21) 200423948 UVA ( 20J/cm2 )第1 〇天之發紅時，於鈾膠塗佈組，明顯 地耳廓的紅斑、腫脹輕微（圖4 )。 表2 ___小鼠組 陽性對照組 耳廓腫脹（平均値±SEM、// m) 52.5 ±4.5 PAA-Pt塗佈組 26.9 ±4.1* 陰性對照組 1 1 .3 ±3.5 :P < 0.001 ( n = 8 ) 例8 各組使用4至6隻BALB/c系小鼠，於試驗開始日及 其隔天’將100 // 1之1%TCSA ( 3,3，，4，，5-四氯水楊基醯 替苯胺，橄欖油-丙酮（1 : 4 )混合物中）塗佈於小鼠背 部刹毛部位，於塗佈部位照射UVA ( 1 6 J/cm2 )，進行光 敏化（Suzuki，K. et al.，J. Dermatol. Sci·，23，pp.138- 14 4 ， 2 0 0 0 ) 。 從 敏化隔 天至第 5 天 （第 5 天係光 照射後 塗佈），於耳廓兩側塗佈0.3 g/ear，於耳廓塗佈半抗原。 陽性對照組係僅塗佈2 °/〇 ( w / w )之殘乙烯基聚合物。於 第5天，塗佈40 // 1之0.1% TCSA於小鼠的兩耳垂，距離 40公分照射UVA ( 16J/cm2)。對於非敏化組，於第5天 僅進行塗佈40 // 1之0.1% TCSA及照射UVA ( 16J/cm2 ) 。照射2 4小時後，測定耳厚。其結果係鈾膠塗佈組之光 接觸皮膚炎反應比陽性對照組弱。 -25- (22) 200423948 表3 小鼠組 腫脹 (平均値±SEM、 β m ) 陽性對照組（】 a = 4 ) 36.2 ±5.5 P A A - P t塗佈組< 〔η = 6 ) 14.2 ±4.0* 陰性對照組（I ι = 4 ) 9.2 ±3.2 *: p<0.05 v.s· 陽性對照
Kbl: JW 系兔子（SPF，雄，體重 1.80 至 2.70kg， 北山labes股份有限公司），設有5天的檢疫及之後9天 的馴化期間飼育’於此期間，每日進行測定體重3次及觀 察一般狀態。飼料係使用固體飼料〆RC 4，〇riental酵母 工業股份有限公司）。之後，爲0 · 5 %膽固醇飼料（含有 0.5%膽固醇、3%花生油及3%椰子油之飼料），使之馴化 1 4天。篩選出總膽固醇値爲良好上昇之動物，分組使每 曰體重及總膽固醇値的平均約成相等，每組1 〇隻，分爲 4組。動物係飼育於維持室溫爲2 〇至2 6它，濕度爲4 〇至 7 0 % ’明暗各i 2小時（照明：早上6點至下午6點）， 換氣次數1 2次/小時（以過濾網除菌之新鮮空氣）之飼 育室。動物係使用鋁製飼育箱（w : 3 5 〇 X D : 5 8 0 X Η : 3 5 0 mm ’附自動洗淨及自動供水裝置）個別飼育。給餌量 係全期間爲l〇〇g/隻/ i天。飲料水係使用自來水之自動 供水裝置，自由攝取。PAA-Pt係以生理食鹽水稀釋，使 用裝有注射針（23 G，Terumo股份有限公司）之聚丙烯製 -26- (23) (23)200423948 可拋棄式注射筒（T e r u m 〇股份有限公司），1日1次投予 於耳廓靜脈內。投予期間爲7 0天（1 〇週）。膽固醇負載 前、投予開始前、投予4週、7週及1 〇週後，由前天開 始絕食約1 8小時，由耳廓動脈採血約4mi於採血管（
Terumo股份有限公司，VP-AS 0 5 4 )，以冷卻離心機（CF 8DL，日立工機股份有限公司）離心分離（約4。〇， 3 00 0rpm，15分鐘）之血淸，測定總膽固醇（tc，COD ( 膽固醇氧化酵素）· POD (過氧化物酵素）法）、三酸甘 油酯（TG，GPO (甘油磷酸氧化酵素）· HDAOS ( N-( 2-Hydroxy-3-sulfopropyl) -355-dimethoxyaniline)法）、 H D L - C (血淸高密度脂蛋白）（直接法）、及過氧化脂質 (LPO，八木別法）。 投予期間結束隔天，於戊巴比妥鈉（nenbubtal注射 液，大日本製藥股份有限公司）麻醉下剖腹，由腹部大動 脈放血致死後，開胸，記錄剖檢所見。之後，摘出大動脈 (大動脈開始部份至腸骨動脈），以1 0 %中性緩衝福馬林 固定後，以oil-red 〇 (油紅〇）染色。染色後之大動脈以 數位照相機（Finepix SI Pro，富士照片底片股份有限公 司）拍攝，由影像解析，算出染紅部位對於總大動脈面積 之比率。所得數値係算出各組的平均値±標準偏差。有意 差檢定係於媒體組及各投予組間進行，危險率爲5 %未滿 爲有意之檢定法係 Bartlett test 後，等分散 （ homoscedasticity)時係進行 Dunn ett test，不等分散（ h e t e r 〇 s c e d a s t i c i t y )時則進行S t e e 1 t e s t。生理食鹽水投予 -27- (24) (24)200423948 組之動脈硬化損傷區域（％ )之平均値爲4 5 . 5 % ( p = 1 3 . 5 )。舶膠體投予組之動脈硬化損傷區域（％ )之平均値係 0.005//mol/kg 投予組爲 Ι8·7%(ρ = 6.7) 〇.〇5//mol/kg 投 予組爲19.8%(ρ = 4·0)，以及〇.5#mol/kg投予組爲 19.2% ( p = 4.1)。 產業上利用性 本發明之醫藥作爲肌萎縮性脊髓側索硬化症或阿滋海 默氏症等之神經變性疾病、類風濕關節炎等之風濕病性疾 病、心肌梗塞等之缺血性心臟病、壓力性潰瘍、皮膚炎、 動脈硬化症·、及高脂血症之預防及/或治療用醫藥係有效 的。 【圖式簡單說明】 第1圖係表示對於肌萎縮性脊髓側索硬化症模式小鼠 ’投予本發明之醫藥，以經外線掃描器測定小鼠運動量之 結果圖。◦係表示正常小鼠、係表示本發明之醫藥投予 組（0.5 // g/kg ) 、•係表示醫藥非投予組（病態小鼠） 的結果。 第2圖係表示本發明之醫藥對於例4中浮腫率之效果 圖。〇係表示對照組（生理食鹽水投予組）、鲁係表示本 發明之醫藥投予組（5 // m ο 1 / k g / d a y )的結果。 第3圖係表示本發明之醫藥對於例4中骨破壞之效果 圖。 (25) 200423948 20J/cm2 )第 10 天之 性對照的結果，右側 第4圖係表示例7中照射UVA丨 小鼠耳廓情況的照片。左側係表示陽 係表示塗佈本發明醫藥的小鼠的結果 -29-