SK6498A3

SK6498A3 - Mutated 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase, gene coding for said protein and transformed plants containing said gene

Info

Publication number: SK6498A3
Application number: SK64-98A
Authority: SK
Inventors: Michel Lebrun; Alain Sailland; Georges Freyssinet; Eric Degryse
Original assignee: Rhone Poulenc Agrochimie
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 1998-11-04
Also published as: DK1217073T3; DE69635995T2; OA10788A; SK285144B6; HU226302B1; KR19990029084A; CA2223875A1; DK0837944T3; EP0837944B1; UA75315C2; EA199800138A1; PL189453B1; ES2255534T3; JP4691733B2; HUP9900463A2; SI0837944T1; DE69635913T2; IL122941A0; CN1196088A; BG64628B1

Description

Mutovaná 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntáza, gény, ktoré ju kódujú a ich použitie

Oblasť techniky

Vynález opisuje novú formu enzýmu 5-enolpyruvylšikimát-3fosfát syntázy (skrátene EPSPS), ktorá vykazuje zvýšenú toleranciu voči herbicídom, ktoré sú kompetitivnymi inhibítormi aktivity EPSPS vzhľadom na fosfoenolpyruvát (PEP). Táto odolnejšia forma enzýmu obsahuje najmenej jednu substitúciu aminokyselín, a to zámenu treonínu za izoleucín. Vynález sa ďalej vzťahuje na gén kódujúci tento proteín, na rastlinné bunky transformované chimérickými génovými konštrukciami, ktoré obsahujú tento gén, na regenerované rastliny z týchto buniek a tiež na rastliny, ktoré vznikli krížením s použitím týchto transformovaných rastlín.

Doterajší stav techniky

Glyfosat, sulfosat a fosametin sú širokospektrálne herbicídy, ktoré patria do rodiny fosfometylglycínových herbicídov. Pôsobia v podstate ako kompetitívne inhibítory 5enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntázy (EC 2.5.1.19) alebo EPSPS, vzhľadom na PEP (fosfoenolpyruvát). Po ich aplikácii na rastliny sa tieto herbicídy v rastline lokalizujú v rýchlo rastúcich častiach, osobitne v stonkových a koreňových vrcholoch, kde sa akumulujú a spôsobujú poškodenie, ktoré vedie až k deštrukcii citlivých rastlín.

Plastidová EPSPS, hlavný ciel týchto herbicídov, je enzým, ktorý sa v metabolizme zúčastňuje biosyntézy aromatických aminokyselín. EPSPS je kódovaná jedným alebo viacerými jadrovými génmi a syntetizovaná vo forme cytoplazmatického prekurzoru, ktorý je následne importovaný do plastidov, kde sa enzým akumuluje vo svojej maturovanej forme.

Tolerancia rastlín voči glyfosatu a podobným herbicídom z rovnakej skupiny sa získa začlenením EPSPS génu do ich genómu. Gén je rastlinného alebo bakteriálneho pôvodu' a je mutovaný alebo inak pozmenený, a to tak, aby došlo k zmene charakteru ľnhibície produktu génu glyfosatom. Z hľadiska pôsobenia glyfosatu a stupňa tolerancie produktu použitých génov voči glyfosatu, sa ukazuje výhodné, aby bolo možné exprimovať produkt translácie tohto génu tak, aby došlo k jeho akumulácii v dostatočnom množstve priamo v plastidoch.

V US patente 4,535,060, je opisovaná tolerancia rastlín voči vyššie spomínaným typom herbicídov, osobitne Nfosfonometyglycinu a glyfosatu, ktorá sa dosiahla zavedením génu kódujúceho EPSPS s najmenej jednou mutáciou do rastlinného genómu. Táto mutácia spôsobila, že zmienený enzým po jeho lokalizácii v plastidovom kompartmente je odolnejší voči jeho inhibíroru (glyfosatu).

Uvedené techniky by však mali byť vylepšené tak, aby sa získala väčšia spoľahlivosť s používaním týchto rastlín v poľnohospodárskych podmienkach.

Podstata vynálezu

V tomto vynáleze sa pod pojmom rastlina rozumie každý mnohobunkový organizmus schopný fotosyntézy, a pojmom rastlinná bunka sa rozumie každá bunka odvodená od rastliny, schopná tvoriť akékoľvek nediferencované pletivá, ako sú kalusy alebo diferencované pletivá, ako sú embryá, rastlinné časti alebo semená.

Predmetom predkladaného vynálezu je príprava transformovaných rastlín so zvýšenou toleranciou voči herbicídom fosfonometyl-glycínovej skupiny, a to regeneráciou buniek transformovaných pomocou nových chimérických génov, ktoré obsahujú gén pre toleranciu voči týmto herbicídom.

Predmetom vynálezu je tiež chimérický gén, o ktorom je známe, že v rastlinách zvyšuje toleranciu voči herbicídom s cieľovým pôsobením na EPSPS. Tento gén obsahuje v smere transkripcie po sebe: promótorovú oblasť, voliteľne aj tranzitnú peptidovú oblasť, sekvenciu génu pre toleranciu enzýmu voči glyfosatu a neprekladanú oblasť s polyadenylačným signálom na 3' konci. Gén pre rezistenciu voči glyfosatu obsahuje v porovnaní s génom, z ktorého je odvodený, substitúciu treonínu 102 za izoleucín v aroA oblasti. Vo výhodnom usporiadaní tento gén obsahuje navyše v rovnakej oblasti substitúciu prolínu 106 za serín. Tieto substitúcie môžu byť vnesené, alebo už sú prítomné v EPSPS sekvencii akéhokoľvek pôvodu, osobitne rastlinného či bakteriálneho, alebo v enzýme z rias či húb.

Tranzitné peptidy, ktoré môžu byť použité v tranzitnej peptidovej oblasti, môžu byť rastlinného pôvodu, odvodené napríklad z kukurice, slnečnice, hrachu, tabaku alebo z ďalších ľubovoľných rastlín. Prvý a druhý tranzitný peptid môžu byť identické, podobné alebo rôzne. Ďalej môžu obsahovať jednu alebo viac jednotiek tranzitných peptidov, ako je .uvedené v Európskej patentovej prihláške EP 0 508 909. Úlohou tejto charakteristickej oblasti je umožniť uvoľnenie maturovaných a natívnych proteínov s maximálnou účinnosťou, osobitne vyššie zmieneneného mutovaného EPSPS, v plazmidových kompartmentoch.

Výhodne sa podľa vynálezu promótorová oblasť chimérického génu skladá najmenej z jedného promótora génu alebo promótorového fragmentu, ktorý je v rastlinných pletivách prirodzene exprimovaný (tubulín, intróny, aktín, histón).

Neprekladaná oblasť so signálom pre termináciu transkripcie na 3' konci chimérického génu môže byť rôzneho pôvodu, napríklad bakteriálneho, ako signál z génu pre nopalín syntázy, alebo rastlinného, ako signál z génu pre histón H4A748 z Ärabidopsis thaliana, ako je uvedené v Európskej patentovej prihláške 633 317 (European Application 633 317).

Chimérický gén podlá vynálezu môže obsahovať, okrem vyššie zmienených častí, ešte najmenej jednu neprekladanú spájajúcu oblasť (linker), ktorá môže byť umiestnená medzi dvoma rôznymi transkribovanými oblasťami, ktoré boli opísané vyššie. Táto spájajúca oblasť môže byť akéhokoľvek pôvodu, napríklad bakteriálneho, vírusového alebo rastlinného.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Izolácia cDNA kódujúcej kukuričnú EPSPS:

V nasledujúcej časti sú opísané rôzne postupy vedúce ku získaniu cDNA kódujúcej EPSPS z kukurice. Táto cDNA slúži ako základ na vnesenie dvoch mutácií, ako je opísané nižšie. Všetky operácie opísané nižšie sú opísané formou príkladov a zodpovedajú jednému možnému vybranému spôsobu z mnohých, ktoré vedú k dosiahnutiu rovnakých výsledkov. Tento výber nemá žiadny vplyv na kvalitu výsledkov, a tak možno na dosiahnutie výsledkov použiť akúkoľvek vhodnú metódu, podľa výberu odborníka v danom odbore. Väčšina metód týkajúcich sa molekulového inžinierstva DNA fragmentov je opísaná v Current Protocols in Molecular Biology Diel 1 a 2, Ausubel a kolektív, vydané v Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989) (ďalej uvádzané odkazy na protokoly opísané v tejto práci budú označené skratkou ref. CPMB). Operácie vzťahujúce sa na DNA, ktoré sú uskutočňované podľa protokolov opísaných v tejto práci, sú predovšetkým tieto: ligácia DNA fragmentov, pôsobenie Klenowovho fragmentu DNA polymerázy I a T4DNA polymerázy, príprava plazmidovej DNA a DNA z bakteriofága λ, ďalej tiež minipreparácia a maxipreparácia a analýza RNA a DNA pomocou Southern a Northern hybridizácie. Ďalšie metódy opísané v tejto práci boli uskutočnené podľa uvedených protokolov a len významné modifikácie a dodatky k týmto protokolom sú opísané nižšie.

Príklad 1:

1. Získanie fragmentov EPSPS z Arabidopsis thaliana

a) dva 20-mérové oligonukleotidy s nasledovnými sekvenciami:

5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3'

5' -GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3' boli syntetizované podlá sekvencie génu pre EPSPS z Arabidopsis thaliana (Klee H. J. a kolektív (1987) Mol. Gen. Genet., 210, strana 437 až 442) . Tieto dva oligonukleotidy zodpovedajú pozíciám 1523 až 1543 a 1737 až 1717 podľa publikovanej sekvencie a v opačných orientáciách.

b) celková DNA z Arabidopsis thaliana (var. columbia) bola získaná z firmy Clontech (citácia katalógu: 6970 až 1) .

c) 50 nanogramov (ng) DNA sa zmieša s 300 ng každého oligonukleotidu a podrobí sa 35 amplifikačným cyklom v prístroji Perkin-Elmer 9600, s použitím štandardného média na amplifikáciu, ktoré je odporúčané výrobcom. Výsledný fragment s dĺžkou 204-bp tvorí fragment EPSPS z Arabidopsis thaliana.

2. Konštrukcia knižnice cDNA z BMS bunkovej línie kukurice

a) 5g filtrovaných buniek je zhomogenizovaných v kvapalnom dusíku, celkové nukleové kyseliny sú odstránené spôsobom podľa Shura a kolektív, s nasledovnými modifikáciami:

- pH lyžujúceho pufru je upravené na pH 9,0

- po precipitácii s izopropanolom sa sediment rozpustí vo vode a pridá sa chlorid lítny do koncentrácie 2,5 M. Po

dvanásťhodinovej	inkubácii	pri	0 °C sa sediment získaný
centrifugáciou	počas 15	minút	pri 30.000	g	pri 4 °C
resolubilizuj e.	Rozpustený	sediment obsahuje	RNA	frakciu z
celkových nukleových kyselín	•
b) Poly (A)⁺rna	frakcia sa	získa	chromatografiou	na	oligo (dT)-

celulózovej kolóne, ako je opísané v Current Protocols in Molecular Biology.

c) Syntéza dvojvláknovej cDNA obsahujúcej syntetický EcoRI koniec: táto syntéza sa uskutočňuje podľa protokolu výrobcu dodávajúcim rôzne chemikálie potrebné na túto syntézu vo forme kitov, napríklad - copy kit od firmy InVitrogen.

Dva jednovláknové a čiastočne komplementárne oligonukleotidy nasledujúcich sekvencií:

5' -AATTCCCGGG-3·'

5'-CCCGGG-3' (tento oligonukleotid je fosforylovaný) sa ligujú k tupým koncom dvojvláknovej cDNA.

Výsledkom ligácie adaptorov je vytvorenie Smal miest pripojených k dvojvláknovej cDNA a kohéznych EcoRI miest na každom konci dvojvláknových cDNA.

d) Konštrukcia knižnice:

cDNA s umelo vytvorenými kohéznymi EcoRI miestami na koncoch sa liguje s XgtlÓ cDNA po štiepení pomocou EcoRI a defosforyláciou podľa protokolu dodávateľa kitu New England Biolabs.

Časť produktov ligačnej reakcie je enkapsidovaná in vitro s enkapsidačnými extraktmi, menovite s Gigapack Gold, podľa inštrukcií dodávateľa. Knižnica je ďalej titrovaná s použitím baktérií E. coli C600 hfl. Takto získaná knižnica sa namnoží a skladuje podľa inštrukcii toho istého dodávateľa a obsahuje cDNA knižnicu pre BMS bunkovú suspenziu kukurice.

3. Skrining cDNA knižnice BMS bunkovej suspenzie kukurice pomocou EPSPS sondy z Arabidopsis thaliana

Protokol používaný na tento skrining sleduje návody uvedené v Current Protocols in Molecular Biology diel 1 a 2, Ausubel a kolektív, publikovaný v Greene Publishing Associates and WileyInterscience (1989) (CPMB).

V skratke, približne 10⁶ rekombinantných fágov sa vyseje pri priemernej hustote 100 fágov na cm² na LB misky. Lytické plaky sa replikujú na membrány Amersham Hybond N ako duplikáty.

DNA sa fixuje na filtre pomocou pôsobenia 1600 kJ UV (Stratagene Stratalinker). Filtre sa prehybridizujú v 6xSSC/ 0,1% SDS/ 0,25% odtučnené mlieko počas dvoch hodín pri 65 °C. Hybridizačná sonda pre EPSPS z Arabidopsis thaliana bola označená s [³²P]dCTP metódou náhodných primerov podľa návodu dodávateľa kitu (Pharmacia Ready to Go kit). Získaná špecifická aktivita je rádovo 10⁸ cpm na μg fragmentu. Po denaturácii trvajúcej 5 minút pri 100 °C sa sonda pridá do prehybridizačného média a hybridizácia pokračuje ďalších 14 hodín pri 55 °C. Filtre boli autorádiografované po 48 hodín trvajúcej expozícii pri -80 °C na film Kodak XAR5 a s použitím kazety so zosilňovačom s'ignálu Amersham Hyperscreen RPN. Porovnanie pozitívnych škvŕn na filtri s miskami, z ktorých boli replikované, umožní zistiť fágy zodpovedajúce pozitívnym hybridizačným signálom s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana. Tieto kroky odobratia z kultivačných platní, vysiatia, prenosu, hybridizácie a opätovného získavania sú opakované dovtedy, pokým všetky škvrny na miske z úspešne purifikovaných fágov nie sú pri hybridizácii 100% pozitívne. Jednotlivé plaky z fágového lyzátu sú prenesené do riediaceho média λ (Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgSO₄, 0,1 M NaCl, 0,1% želatína). Tieto fágy tvoria v roztoku EPSPS-pozitívne klony BMS bunkovej suspenzie kukurice.

4. Príprava a analýza DNA z EPSPS klonov BMS bunkovej suspenzie kukurice

Približne 5xl0⁸ fágov sa pridá ku 20 ml baktérií C600 hfl s optickou hustotou OD₆oonm=2/rnl a inkubuje sa 15 minút pri 37 °C. Táto suspenzia sa nariedi do 200 ml bakteriálneho rastového média vil Erlenmayerových bankách a mieša sa na rotačnej trepačke pri 250 rpm. Lýza je zjavná keď sa médium začne číriť, čo zodpovedá lýze turbídnych baktérií a prejavuje sa približne po 4 hodinách miešania. S týmto supernatantom sa zaobchádza pódia inštrukcií opísaných v Current Protocols in Molecular Biology. Získaná DNA zodpovedá EPSPS klonom bunkovej suspenzie kukurice BMS.

Jeden až dva mikrogramy tejto DNA sa štiepia s EcoRI a delia sa v 0,8% LGTA/TBE agarózovom géle (ref. CPMB).

Konečné overenie je založené na kontrole toho, že purifikovaná DNA vykazuje hybridizačný signál s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana. Po elektroforéze sú fragmenty DNA prenesené na membrány Amersham Hybond N podlá protokolu opisujúceho Southern blotting a opísaného Current Protocols in Molecular Biology. Tento filter sa hybridizuje so sondou EPSPS z Arabidopsis thaliana podľa vyššie opísaných podmienok v sekcii

3. Kloň, ktorý vykazuje hybridizačný signál s touto sondou pre EPSPS z Arabidopsis thaliana a obsahujúci najdlhší EcoRI fragment by mal mať odhadovanú veľkosť na géle približne 1,7 kbp.

5. Získanie klonu pRPA-ML-711

Desať mikrogramov klonu fága obsahujúceho 1,7 kbp dlhý inzert sa podrobí pôsobeniu reštrikčného enzýmu EcoRI a rozdelí sa v 0,8% LGTA/TBE agarózovom géle (ref. CPMB) . Časť gélu s 1,7 kbp dlhým inzertom sa vyreže z gélu po vyfarbení pomocou BET a fragment sa opracuje agarázou podlá inštrukcií dodávateľa, New England Biolabs., Purifikovaná DNA získaná z fragmentu 1,7 kbp sa liguje pri 12 °C počas 14 hodín s DNA plazmidom pUC19 (New England Biolabs) naštiepeným pomocou reštrikčného enzýmu EcoRI podľa protokolu na ligáciu opísaného v Current Protocols in Molecular Biology. Dva mikrolitre vyššie zmienenej ligačnej zmesi boli použité na transformáciu časti elektrokompetentných buniek E. coli DH10B, transformácia sa uskutočňuje elektroporáciou pri nasledovných podmienkach: zmes kompetentných baktérií a ligačné médium sa prenesie do elektroporačnej kyvety s hrúbkou 0,2 cm (Biorad), ktorá sa predtým vychladí na 0 °C. Fyzikálne podmienky elektroporácie pri použití elektroporátoru vyrobeného firmou Biorad sú nasledovné: 2500 V, 25 μΓ a 200 Ω. Za týchto podmienok je stredná doba vybitia kondenzátora rádovo 4,2 milisekundy. Baktérie sa následne prenesú do 1 ml SOC média (ref. CPMB) a miešajú sa jednu hodinu pri 200 rpm na rotačnej trepačke v pätnásťmililitrových skúmavkách Corning. Po vysiatí na LB/agarové médium, do ktoré je pridaný karbenicillin do 100 μς/πιΐ, sa uskutoční minipreparácia bakteriálnych klonov, ktoré narástli cez noc pri 37 °C. Minipreparácia sa uskutočňuje podľa návodu opísaného v Current Protocols in Molecular Biology. Po naštiepení DNA s enzýmom EcoRI a separácii elektroforézou v 0,8% LGTA/TBE agarózovom géle (ref. CPMB) sa vyberú klony s 1,7-kbp dlhým inzertom. Konečné overenie sa skladá z kontroly toho, že purifikovaná DNA skutočne vykazuje hybridizačný signál s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana. Po elektroforéze sa DNA fragmenty prenesú na membrány Amersham Hybond N, tak ako je to opísané v návode na Southern blotting v Current Protocols in Molecular Biology.

Filtre sa hybridizujú s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana podľa podmienok opísaných vyššie v sekcii 3. dlhým klonovaným inzertom a hybridizujúci Arabidopsis thaliana bol pripravený vo výsledná DNA bola je opísané

Purifikovaná

DNA

Plazmid s 1,7-kbp s EPSPS sondou z väčšom množstve a purifikovaná z baktérií na

Current Protocols in Molecular ' gradiente

CsCl, ako bola čiastočne

Biology.

Pharmacia kitu podľa návodu výrobcu a s sekvenovaná pomocou použitím primerov, ako sú M13 priamy a dodávané rovnakým výrobcom.

univerzálny primer,

Čiastočná sekvencia ktoré sú pokrýva

0,5 kbp. Odvodená aminokyselinová sekvencia maturovaného proteínu (približne 50 aminokyselinových zvyškov) približne v oblasti vykazuje 100% totožnosť so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou maturovanej kukuričnej EPSPS opísanej v Americkom patente USP 4,971,908. Tento kloň zodpovedajúci 1,7-kbp EcoRI fragmentu EPSPS DNA z BMS bunkovej suspenzie kukurice, bol označený ako pRPA-ML-711. určená sekvenovaním

Pharmacia kitu oligonukleotidov k

Kompletná sekvencia tohto klonu bola obidvoch vláken s použitím postupu podľa komplementárnych opačne orientovaným, týmto syntetizovaním vláknam, ale i približne pre každých 250

1713-bp dlhého klonu je uvedená bp. Kompletná v Sekvencii

6. Získanie klonu pRPA-ML-715

Analýza sekvencie klonu aminokyselinovej sekvencia získaného id.

najmä porovnanie odvodenej sekvenciou z kukurice, vykazuje predĺženie so zodpovedaj úcou sekvencie o 92 bp proti smeru transkripcie od GCG kodónu kódujúceho NH₂-koncový alanín maturovanej časti kukuričnej EPSPS (Americký patent USP 4,971,908). Podobne je v smere transkripcie pozorované predĺženie sekvencie o 288 bp od AAT kodónu kódujúceho COOH-koncový (Americký patent USP kukuričnej EPSPS časti by mohli časti sekvencie zodpovedať v prípade tranzitného génu pre lokalizáciu v plastide a v prípade COOH-konca, neprekladanej 3' oblasti DNA.

V prípade získania cDNA kódujúcej maturovanú časť kukuričnej EPSPS, ako je opísané v USP 4,971,908, sú uskutočnené nasledovné operácie:

a) Odstránenie 3' neprekladanej oblasti: konštrukcia pRPA-ML712:

Kloň pRPA-ML-711 bol štiepený s reštrikčným enzýmom Asel. Na výsledné získané štepy sa pôsobilo Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I podlá protokolu opísanom v CPMB. Tak boli získané tupé konce. Produkt bol následne štiepený s reštrikčným enzýmom SacII. Výsledná DNA bola delená elektroforézou v 1% LGTA/TBE agarózovom géle (ref. CPMB).

Časť gélu obsahujúca inzert s veľkosťou 0,4-kbp, so zarovnaným koncom po pôsobení reštrikčného enzýmu Asel a siahajúca až po miesto štiepenia enzýmu SacII, bola vyrezaná z gélu a purifikovaná podlá protokolu uvedeného vyššie v odseku 5.

DNA získaná z klonu pRPA-ML-711 štiepeniu s enzýmom HindlII v bola podrobená mieste HindlII reštrikčnému ležiacom v polylinkeri klonovaného vektora pUC19. Presahujúce konce vzniknuté týmto štiepením boli polymerázy

Klenowovým fragmentom DNA Ďalej nasledovalo štiepenie reštrikčným enzýmom SacII. DNA vzniknutá touto manipuláciou bola delená pomocou elektroforézy v 0,7% LGTA/TBE agarózovom géle (ref. CPMB).

Časť gélu obsahujúca fragment s približnou veľkosťou 3,7kbp s tupými koncami po štiepení reštrikčným enzýmom HindlII a siahajúca až po štiepne miesto pre reštrikčný enzým SacII bola vyrezaná z gélu a purifikovaná podľa protokolu opísanom vyššie v odseku 5.

Tieto dva inzerty boli ligáciou spojené a 2 μΐ ligačnej zmesi boli použité na transformáciu E. coli DH10B, ako už bolo opisané vyššie v odseku 5.

Obsah plazmidovej DNA z rôznych kmeňov bol analyzovaný podľa postupu opísaného pre pRPA-ML-711. Jeden z vybraných plazmidových klonov obsahuje približne 1,45-kbp dlhý EcoRIHindlII inzert. Sekvenovaním terminálnych koncov tohto klonu sa potvrdilo, že 5' koniec inzertu presne zodpovedá korešpondujúcemu koncu pRP-ML-711 a 3'koniec má nasledujúcu sekvenciu:

5'-. . .AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT - 3'

Podčiarknutá sekvencia zodpovedá kodónu pre COOH-koncovú aminokyselinu asparagín, nasledujúci kodón zodpovedá translačnému stop kodónu.

Nukleotidová sekvencia v smere transkripcie zodpovedá sekvencii časti polylinkera pUC19. Tento kloň obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu sekvencii pRPA-ML-711 až po miesto pre termináciu translácie maturovanej kukuričnej EPSP syntázy. Za týmto miestom nasleduje sekvencia polylinkera pUC19 až po miesto HindlII. Celá táto konštrukcia sa nazýva pRPA-ML-712.

b) Modifikácia 5'konca pRPA-ML-712: konštrukcia pRPA-ML-715:

Kloň pRPA-ML-712 bol štiepený reštrikčnými enzýmami PstI a HindlII. Z týchto manipulácií vzniknutá DNA bola separovaná pomocou elektroforézy na 0,8% LGTA/TBE agarózovom géle (ref. CPMB). Časť gélu obsahujúca Pstl-EcoRI inzert s veľkosťou 1,3kbp bola vyrezaná z gélu a purifikovaná podľa návodu uvedeného vyššie v odseku 5.

í *

I

Inzert bol ligovaný za prítomnosti ekvimolárnych množstiev každého z dvoch čiastočne komplementárnych oligonukleotidov s nasledujúcimi sekvenciami:

Oligol: 5'- GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATGGTGCTGCA - 3

01igo2: 5'- GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC - 3 a tiež v prítomnosti DNA plazmidu pUC19 štiepenej s reštrikčnými enzýmami BamHI a HindlII.

Dva mikrolitre ligačnej zmesi boli použité na transformáciu E. coli DH10B, ako je opísané vyššie v odseku 5. Po analýze obsahu plazmidovej DNA v rôznych klonoch, ktorá bola uskutočnená podľa návodu v časti 5, bolo zistené, že jeden kloň obsahuje inzert s približne 1,3-kbp dlhou sekvenciou. Tento bol podrobený ďalšej analýze. Sekvencia 5' konca vybraného klonu sa skladá z nasledujúcich časti: sekvencia polylinkera, a to od štiepneho miesta pre EcoRI až po miesto štiepenia BamHI, potom nasleduje sekvencia oligonukleotidov použitých na klonovanie, ďalej nasleduje zvyšok sekvencie nachádzajúci sa v pRPA-ML-712. Tento kloň bol označený pRPA-ML-713. V tomto klone je kodón ATG pre metionin zahrnutý do väzbového miesta pre reštrikčný enzým Ncol, a to proti smeru transkripcie N-koncovej časti kodónu pre alanin matúrovanéj EPSP syntázy. Ďalšie kodóny pre alanin a glycin· nachádzajúce sa na N-konci, sú zachované, ale sú modifikované na tretej variabilnej báze: počiatočný GCGGGT dáva po modifikácii GCCGGC.

Kloň pRPA-ML-713 bol štiepený reštrikčným enzýmom HindlII. Na získané výsledné štepy sa pôsobilo Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I. DNA bola potom podrobená reštrikčnému štiepeniu s enzýmom Sací. Výsledná DNA bola delená elektroforézou v 0,8% LGTA/TBE agarózovom géle (ref. CPMB).

Časť gélu obsahujúca inzert s veľkosťou 1,3-kbp HindlIItupý koniec/SacI bola vyrezaná z gélu a purifikovaná podlá protokolu uvedeného vyššie v odseku 5. Tento inzert bol ligovaný za prítomnosti DNA z plazmidu pUC19, ktorá bola štiepená s reštrikčným enzýmom Xbal a prečnievajúce konce vzniknuté týmto štiepením boli ' zarovnané pomocou Klenowovho fragmentu DNA polymerázy I. Výsledný produkt bol štiepený s reštrikčným enzýmom Sací.

μΐ ligačnej zmesi boli použité na transformáciu E. coli DH10B, ako je opísané vyššie v odseku 5. Po analýze plazmidovej DNA z rôznych klonov, ktorá bola uskutočnená podlá návodu v časti 5, bolo zistené, že jeden kloň má inzert s približne 1,3kbp sekvenciou. Tento bol podrobený ďalšej analýze. Sekvencia DNA koncových častí tohto vybraného klonu sa skladá z nasledovných častí: sekvencia pUC19 polylinkera, a to od štiepiaceho miesta pre EcoRI až po miesto Sací štiepenia, potom nasleduje sekvencia oligonukleotidov použitých na klonovanie, z ktorých bola vynechaná sekvencia s dĺžkou 4 bp GATC z oligonukleotidu 1 opísaného vyššie. Ďalej nasleduje zostávajúca sekvencia prítomná v pRPA-ML-712 až po miesto štiepenia pre HindlII a sekvencia polylinkera pUC19 od miesta pre Xbal po miesto pre HindlII. Tento kloň bol označený pRPA-ML-715.

7. Príprava cDNA kódujúcej mutovanú formu kukuričnej EPSPS.

Všetky kroky vedúce k mutagenéze boli uskutočnené pomocou súpravy Pharmacia U.S.E. podlá inštrukcií dodávateľa. Princíp tohto systému na generovanie mutácií je nasledovný: plazmidová DNA sa teplotné denaturuje a reasociuje sa v molárnom nadbytku oligonukleotidov, ktorý má eliminovať unikátne cieľové miesto pre ten reštrikčný enzým, ktorý sa vyskytuje v polylinkeri. Po reasociácii sa nasyntetizuje komplementárne vlákno pomocou T4 DNA polymerázy v prítomnosti T4 DNA ligázy a proteínu génu 32 vo vhodnom pufri, ktorý je dodávaný výrobcom. Produkt syntézy je inkubovaný v prítomnosti reštrikčného enzýmu, ktorého cieľové sa malo mutagenézou odstrániť. Ako hostiteľské bunky na transformáciu touto DNA sa použijú baktérie E. coli, predovšetkým však také kmene, ktoré obsahujú mutáciu mutS.

Bunky sa nechajú rásť v kvapalnom médiu, celková plazmidová DNA sa z nich purifikuje a tá sa potom inkubuje s uvedeným reštrikčným enzýmom. Potom sa ako hostiteľ na transformáciu touto DNA použijú baktérie kmeňa E. coli DH10B. Vyizoluje sa plazmidová DNA jednotlivých klonov a sekvenovaním sa otestuje prítomnosť mutácie.

A)- modifikácia cieľových miest alebo sekvencie, bez významného zásahu do charakteru rezistencie kukuričnej EPSPS voči produktom metabolizmu, ktoré sú zároveň kompetitívnymi inhibitormi EPSP syntázy: vynechanie cieľového miesta pre Ncol z plazmidu pRPAML-715.

Sekvencia plazmidu pRPA-ML-715 bola očíslovaná tak, že ako začiatok bol určená prvá báza N-koncového alaninového kodónu GCC. Táto sekvencia obsahuje cieľové miesto Ncol v pozícii 1217. Oligonukleotid určený na modifikáciu cieľového miesta má sekvenciu:

5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3' .

Vlastné sekvenovanie sa uskutočnilo postupom uvedeným v referenciách a pritom sa zistilo, že po mutagenéze sekvencia zodpovedá použitému oligonukleotidu. Cielové miesto Ncol bolo skutočne odstránené a translácia aminokyselín v tejto oblasti zachováva začiatočnú sekvenciu podlá plazmidu pRPA-ML-715.

Tento kloň bol označený ako pRPA-ML-716. 1340 bp dlhá sekvencia tohto klonu je znázornená v Sekvencii id. č.: 2 a v Sekvencii id. č.: 3.

B)- modifikácia sekvencie génu zvyšujúceho rezistenciu kukuričnej EPSPS voči metabolickým produktom, ktoré sú zároveň kompetitivnymi inhibitormi EPSP syntázy.

Na vnesenie mutácii sa použili nasledovné nukleotidy:

a) na vnesenie mutácie Thr 102 -> íle

5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'

b) na vnesenie mutácie Pro 106 -> Ser

5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

c) na vnesenie mutácii Gly 101 -> Ala a Thr 102 -> íle

5' -CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG- 3 ’

d) na vnesenie mutácie Thr 102 —> íle a Pro 106 -> Ser

5' -GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC- 3'

Po sekvenovani sa zistilo, že sekvencia troch mutovaných fragmentov zodpovedala DNA sekvencii pôvodného klonu pRPA-ML716, s výnimkou oblasti s cielenou mutáciou, ktoré zodpovedali použitým oligonukleotidom. Jednotlivé klony boli označené takto: kloň s mutáciou Thr 102 -> íle ako pRPA-ML-717, kloň s mutáciou Pro 106 -> Ser ako pRPA-ML-718, kloň s mutáciami Gly 101 -> Ala a Thr 102 -> íle ako pRPA-ML-719 a konečne kloň s mutáciami Thrl02 —> íle a Pro 106 —> Ser ako pRPA-ML-720.

1340-bp dlhá sekvencia plazmidu pRPA-ML-720 je znázornená na Sekvencii id. č.: 4 a Sekvencii id. č.: 5.

1395-bp dlhý inzert Ncol-HindlII je základom pre všetky konštrukcie použité na transformáciu rastlín a zamerané na vloženie génov pre rezistenciu voči herbicídom, ktoré fungujú ako inhibítory EPSPS. Vo výhodnom usporiadaní vynálezu sú tieto konštrukcie použité na vnesenie génu rezistencie voči glyfosatu.

Tento inzert bude ďalej označovaný ako dvojitý mutant kukuričnej EPSPS.

Príklad 2: In vitro tolerancia rôznych mutantov voči glyfosatu

2.a: Extrakcia EPSP syntézy

Rôzne gény pre EPSP syntézu sa pomocou Ncol-HindlII kazety vložia do plazmidového vektora pTrc99a (Pharmacia, ref. č.: 275007-01), ktorý bol predtým naštiepený s enzýmami Ncol a HindlII. Rekombinantné baktérie kmeňa E. coli DH10B exprimujúce tieto rôzne EPSP syntézy sa homogenizujú ultrazvukom v 40 ml pufru na 10 g usadených buniek a potom sa rovnakým pufrom premyjú (200mM Tris-HCl pH 7,8, 50mM merkaptoetanol, 5 mM EDTA a 1 mM PMSF), do ktorého sa pridá 1 g polyvinylpyrolidonu (PVP). Suspenzia sa 15 minút mieša pri teplote 4 °C a potom sa 20 minút centrifuguje pri 27,000xg pri 4 °C.

K supernatantu sa pridá síran amónny za vzniku roztoku so 40% nasýtením síranu amónneho. Zmes sa 20 minút centrifuguje pri 27,000xg pri 4 °C. Potom sa pridá k novému supernatantu ďalší síran amónny do 70% nasýtenia. Zmes sa potom 30 minút centrifuguje pri 27,000xg pri 4 °C. EPSP syntéza nachádzajúca sa v proteínovom sedimente sa prenesie do 1 ml pufru (20 mM TrisHCl, pH 7,8 a 50mM merkaptoetanol). Tento roztok sa cez noc dialyzuje proti 2 litrom tohto pufru pri teplote 4 °C.

2.b: Enzýmová aktivita

Aktivita jednotlivých enzýmov ako aj ich rezistencie voči glyfosatu sa meria in vitro v priebehu 10 minút pri teplote 37 °C v reakčnej zmesi obsahujúcej lOOmM kyselinu maleínovú pH 5,6, lmM fosfoenolpyruvát, 3mM šikimát-3-fosfát (pripravený podlá práce Knowles P.F. a Sprinson D.B. 1970, Methods in Enzymology 17A, strany 351 až 352, pomocou kmeňa baktérií Aerobacter aerogenes ATCC 25597) a lOmM fluorid draselný. Ako posledný, po prídavku glyfosatu v rozsahu 0 až 20mM, sa k reakčnej zmesi pridá enzýmový extrakt.

i

Enzýmová aktivita sa zmeria na základe uvoľneného fosfátu s použitím techniky opísanej v práci Tausky H.A. a Shorr E. 1953, J. Biol. Chem. 202, strany 675 až 685.

Za uvedených podmienok je enzým divého typu (WT) pri 0,12mM koncentrácii glyfosatu inhibovaný do 85%. Pri rovnakej koncentrácii glyfosatu je mutantný enzým, označený ako Serl06 inhibovaný iba do 50% a ďalšie tri mutantné enzýmy Ilel02, Ilel02/Serl06 a Alal01/Ilel02 vykazujú nepatrnú, alebo dokonca žiadnu inhibíciu.

Koncentrácia glyfosatu sa musí zvýšiť desaťnásobne, t. j. na l,2mM, aby bola dosiahnutá 50% inhibícia mutantného enzýmu Ilel02, pričom mutantné enzýmy Ilel02/Serl06, Ala/Ile a Ala ešte stále nevykazujú známky inhibície.

Je treba poznamenať, že aktivita mutantných enzýmov Ala/Ile a Ala nie je ovplyvnená ani pri lOmM koncentrácii glyfosatu, a že mutantný enzým Ilel02/Serl06 nie je nijako dotknutý ani po zdvojnásobení koncentrácie glyfosatu (to jest pri 20mM).

Príklad 3: Rezistencia transformovaného tabaku

1.1. Transformácia

Vektor pRPA-ML-173 bol vložený do kmeňa baktérií Agrobacter tumefaciens EHA101 (Hood a kolektív, 1987) obsahujúceho kozmid pTVK291 (Komari a kolektív, 1986). Transformačná technika je založená na postupu Horshe a kolektív (1985).

1.2. Regenerácia

Regenerácia tabaku PBD6 (dodaného firmou SEITA, Francúzsko) z listových explantátov sa uskutočňuje na bazálnom médiu Murashige-Skoog (MS) obsahujúcom 30 g/1 sacharózy a 200 μg/ml kanamycinu. Explantáty sa odoberú z . rastlín pestovaných v skleníku alebo in vitro a odrezky listov sa transformujú štandardným spôsobom (Science, 1985, zväzok 227, strany 1229 až 1231) v troch po sebe idúcich stupňoch: prvý je indukcia výhonkov na kompletnom médiu 30 g/1 sacharóza ’ s prídavkom 0,05 mg/1 naftyloctovej kyseliny (NAA) a 2 mg/1 benzylaminopurínu (BAP) . V tomto médiu sa' listové disky inkubujú 15 dní. Výhonky, ktoré vzniknú počas tejto doby, sa následne 10 dní vyvíjajú na MS médiu doplnenom s 30 g/1 sacharózy, ale bez prídavkov hormónov. Vyvinuté sa potom vyberú a kultivujú sa na MS médiu na tvorbu koreňov, ktoré má polovičný obsah solí, vitamínov a cukrov a neobsahuje žiadne hormóny. Po približne 15 dňoch sa zakorenené výhonky presadia do pôdy.

1.3. Rezistencia voči 1-3-glyfosatu

Dvadsať transformovaných rastlín, ktoré boli použité na konštrukciu pRPA-ML-173, bolo regenerovaných a presadených do skleníka. Tieto rastliny boli v skleníku ošetrené v štádiu piateho listu vodnou suspenziou herbicídu Round-up, čo zodpovedá použitiu 0,8 kg aktívnej substancie (glyfosatu) na 1 hektár pôdy.

Výsledky zodpovedajú pozorovaniam fytotoxicity zaznamenaným po 3 týždňoch po ošetrení. Pri týchto podmienkach bolo dokázané, že rastliny transformované konštrukciou pRPA-ML173 vykazujú veľmi dobrú mieru tolerancie, zatiaľčo netransformované kontrolné rastliny boli úplne zničené.

Tieto výsledky jasne dokazujú zlepšenie spôsobené po-užitím chimérneho génu podľa vynálezu.

Príklad 4: Transformácia kukurice a výber buniek kukurice

Bunky kukurice odrody BMS (Black Mexičan Sweet) v exponenciálnej fáze rastu boli ostreľované konštrukciou pRPA-RD130 postupom opísaným Kleinom a kolektív, 1987 (Klen T.M., Wolf E.D., Wu R. a Sanford J.C. (1987): High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Vysokorýchlostné mikroprojektily vhodné na vnesenie nukleových kyselín do živých buniek, Náture, zv. 327, strany 70 až 73).

Dva dni po transformácii sa prenesú do rovnakého média s obsahom 2mM N-(fosfonomethyl)-glycínu. Po osemtýždňovej selekcii na tomto médiu boli vybrané vyvinuté kalusy a pomocou PCR v nich bola dokázaná prítomnosť chimérneho génu OTP-EPSPS.

Bunky, ktoré neboli transformované, ale boli pestované na tých istých médiách s obsahom 2mM N-(fosfonomethyl)-glycínu, sú herbicídom blokované a nevyvinú sa z nich žiadne kalusy.

Transformované rastliny podľa vynálezu môžu byť použité ako rodičovské rastliny na získavanie línií a hybridov s fenotypom zodpovedajúcim expresii vloženého chimérického génu.

Opis konštrukcie plazmidov

Plazmid pRPA-RD-124: polyadenylačný signál nos bol vložený do plazmidu pRPA-ML-720 za vzniku klonovacej kazety obsahujúcej dvojnásobný mutant kukuričného génu EPSPS (Thrl02—>Ile a Prol06—>Ser) . Plazmid pRPA-ML-720 bol naštiepený s reštrikčným enzýmom HindlII a opracovaný s Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I za vzniku tupých koncov. Druhé štiepenie bolo uskutočnené s enzýmom Ncol a potom bol EPSPS fragment purifikovaný. Gén EPSPS bol následne ligovaný s purifikovaným plazmidom pRPA-RD-12 (klonovacia kazeta obsahujúca polyadenylačný signál nopalín syntázy) za vzniku plazmidu pRPA

RD-124. Použiteľný, prečistený vektor pRPA-RD-12 bol získaný tak, že plazmid bol najskôr naštiepený s reštrikčným enzýmom Sali, konce zarovnané s Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I a následne štiepený s Ncol.

Plazmid pRPA-RD-125: optimalizovaný tranzitný peptid (OTP) bol vložený do plazmidu pRPA-RD-124 za vzniku klonovacej kazety obsahujúcej gén EPSPS so signálnym peptidom pre lokalizáciu do plastidov. Plazmid pRPA-RD-7 (Európska patentová prihláška EP 652 286) bol naštiepený s enzýmom Sphl, opracovaný s T4 DNA polymerázou I a potom naštiepenený s enzýmom Spel. Následne bol purifikovaný OTP fragmerit. Tento OTP fragment bol naklonovaný do plazmidu pRPA-RD-124, ktorý bol predtým naštiepený s reštrikčným enzýmom Ncol, opracovaný s Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I z E. coli a následne ešte raz štiepený s enzýmom Spel. Tento kloň bol potom sekvenovaný, aby mohla byť určená správna translačná fúzia medzi OTP a EPSPS. Vzniknutý kloň bol nazvaný pRPA-RD-125.

Plazmid pRPA-RD-130: promótor histónu z kukurice H3C4 a sekvencie intrónu 1 adhl z plazmidu pRPA-RD-124 (pozri Patentová prihláška EP 507 698) bol vložený do plazmidu pRPA-RD-125 za vzniku expresnej kazety na použitie v rastlinách na expresiu dvojnásobnej mutantnej formy EPSPS génu v tkanivách jednoklíčnych rastlín. Plazmid pRPA-RD-124 (kazeta obsahujúca promótor histónu z kukurice H3C4 fúzovaný s adhl. intrónom 1) bol naštiepený s reštrikčnými enzýmami Ncol a Sací. DNA fragment obsahujúci promótor odvodený z plazmidu pRPA-TD-123 bol následne prečistený a ligovaný s plazmidom pRPA-RD-125, ktorý bol ešte predtým naštiepený s enzýmami Ncol a Sací.

Plazmid pRPA-RD^_159: k plazmidu pRPA-RD-125 bol vložený dvojitý promótor Η4Ά748 histónu z Arabidopsis (pozri Patentová prihláška EP 507 698) za vzniku kazety na expresiu fúzneho génu OTP-dvojnásobný mutant génu EPSPS v dvojklíčnych rastlinách.

Plazmid pRPA-RD-132 (kazeta obsahujúca dvojitý promótor H4A748 histónu z Arabidopsis, pozri Patentová prihláška EP 507 698) bola naštiepená s reštrikčnými enzýmami Ncol a Sací. Purifikovaný fragment bol potom naklonovaný do plazmidu pRPARD-125, ktorý bol predtým naštiepený s enzýmami EcoRI a Sací.

Plazmid pRPA-RD-173: do plazmidu pRPA-BL-150A (pozri Európska patentová prihláška 508 909) bol vložený gén pre fúzny protein H4A748 promótor-OTP-dvojitý mutant EPSPS génu z plazmidu pRPA-RD-159 a bol vytvorený transformačný vektor v Agrobacter tumefaciens. Plazmid pRPA-RD-159 bol naštiepený s enzýmom Nôti a opracovaný s Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I z E. coli. Tento fragment bol potom naklonovaný do plazmidu pRPA-BL-150A do reštrikčného miesta Smal.

ZOZNAM SEKVENCIÍ

INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1713 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Zea mays (B) KMEŇ: BMS (Black Mexicam Sweet) (vii) KONKRÉTNY ZDROJ:

(A) KNIŽNICA: lambda gtlO (pIVB 3-420) (B) KLOŇ: pRPA-ML-711 (xi) OPIS SEKVENCIE SEQ ID NO: 1

AATOArrrc acacassaaa cacclktsac cvraruES

ATCXSCSGC GSCMK5K3 CC3KKTOC ACGC3GGTSC cvcsracc ctgctcoä: CWTWÄX GATCTCS50 XXS2OMCC TCC=3SMTC CMCTCSCTT TC9*AC=3Sk :----*Cľ CS=C=7TS TC=AG3G» CUOWTOST TSA3WCW CT&MOCT;

«SATCTCÍA CľASKTCCTC GGSXCľTOk GSACľCľTCG TCTCTCTCTC GMCCSSACk AWCľCCOA AASAGC0S7A CTIGTTCCCT CTtSCTCGAAA CTTCOSAOT? CWSAIGCIA AACWGMCT CCACCrC.r» TMGSWSG CiOWGtt MSOSSCOl TTCACWOť; crsrwcxc wczwä^a aasgcaactt xsrocnoA TCGÄOiAca acmssk»:;

so

120

180

240

300

3C0

420

480 at--muc=at Tfavrjcrn·. 'Trwrnmxt WMScusct τνπτζχχτ irrtaxmrt TCZTV-Ík-PC τ·-χστττχτΛ 'j_;<;. tu.w τολτοϊαλτ cccwttcta cjtcctosca AJxrroiAirr <Γτστ·<σττζ atcw'ävtx untcrtrjc ttxu.. 1^:1: AWcrccrc -2717--.7^727 Τ'-·Λ“-\τ<ΓΤα GN1ATTCAAA TCATTGATAA ATTAATZTCS A> CTIACU TS3AAATGAC ATTCACATTG ATWGSTTT TTOJTGTGAA AGCAGAOCAT TCJGAIAGCJ waívutt ctacattaas csacstcma mzacmstc czttaaaaat ccstasctw AACCTQATGC CTCMGCCA AGCTATTľCT TWCTGSTGS TCOATTACT KMSPCS

7SACTGTGSA AGCTW7CSC AC2W2WTT TGOÄTTGA TCTGAAffJTS GCÄACCTAC TGCAGA7GA7 GGGACCMAS GTUCATGSA CSWSWTX! C3TAACTGTT >CKGSSX CXZXSMKZ Kímsaci wccra MCCSATTOA ICTWCLgS AKAMOICC CTGATGTCSC CXTCACICrr CCTGTWTK CdCTTIGC C5WGCC=55 KXXX& twvcstfsaz τχζΐΟΜΜ. staaagsua csumsas csttgcätc cssmssmx TAACOAGC! GGCMKMC; rrrGACGXXC «cosoacia ctgcotíc acocscss asaagctsaa cstcmcsss; xxsKXSt K&axxx oosxkgss. καοαζτεα

CSCCSCSA C=7G5STOC ACSSSAASA cmcsreÄA oaattäaxm. akstccoa? CTTSTOCTCA GSMXWX TTCTrrrGTľ GWTCTG2M. COTTAGTTGT TTGXAGOW GTMGCOAA. ΤΓΤΟ,ΤΤΚΛ A5WTGSTTC 7OJÍTSAAAA ΑΑΑΑΛΛΛΛΛΑ ΑΑΛΑΑΑΑΑΑΑ

ΛΛΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΛΛΑΛΑΑΛΑ X A77~~.~.~.>Λ ~

MO 500 4—0 i:o 78Q

840

J00 »40

X 020

1080 1140 1200 1240 1320 1380 1440 1500 1540 1420 1480 1713

INFORMÁCIE 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA.: 1340 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(B) KLOŇ: pRPA-ML-716 (ix) CHARAKTERISTICKÉ ČRTY:

(A) MENO, KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 6 až 1337 (xi) OPIS SEKVENCIE SEQ ID NO: 2

CSW GCC GGC GCC GM GM ATC GTG CTG M CCC ATC AM GAG XK <7

Al« Gly Al« Clu Glu Xi· Val Leu Gin Pro XI· Lya Glu XI* 15 10

TCC

GGC

KS GTC AAG

CTC

CSC

ose TCC AAG gcs

CT?

TCC AAC

CSC xse

15

Sor

«y

?hr

V*1

Ly«

IM

Pro

Gly Sar Lya Sar

Leu

í«r Aen

Aig

11·

13

20

25

30

CTC

CCA

cx

gcc

CCC

ctg

TCC

GAG GCC ACA AGA

στα

GTT GAG

AAC

CTG

143

Leu

Lru

Ala

Leu

Sar

Glu Gly Thr Thr

Val

Val Aap

Aen

Leu

33

40

45

SO

M

40

cr:

tct <ttc

ΛΛΑ

CC7

rjC

AAA

CCT

CCC

AAA

AGA

GCT

«r?A

CTT

^^4

Leu

>r val

Glu

AU

Asp

Lra

Ala

AU

Ly.>

Arq

AU

Val

·»*·

70

»·.

T'.T

r,-Tt r.-y,

AAG

TTC

CCA

CGG

GAG

GAT

GCT

AAA

:yu;

GAA

• t »¹·

CAC

•Xyr.

Gly -.1/

t-73

pn·

Pro

Val

Glu

Au-p

Ala

L?»·

Glu

•ílu

val

Gin

40

S3

VO

TTC

—'1 GmG

ΑΛΤ

GCT

GGA

ACT

GGA

AGG

CGG

CCA

GGG

ACA

GCA

GCT

Pňa

Leu úly

Aan

Ala

Gly

Thr

Ala

Mat

Arg

Pro

Leu

Thr

All

Ala

100

105

110

ACT

CCT CCT

CCT

GGA

ΑΛΤ

CCA

ACT

TAC

GGG

CTT

GAT

GGA

CTA

CO

Thr

Ala Ala

Gly

Aan

Ala

Tur

7yr

Val

Leu

Ä»p

Gly

Val

Pro

115

120

125

A7G

AGG GM

AGA

ccc

ATT

GGC

GAC

TTG

GTT

GTC

GGA

TTG

AM

OG

Met

λτς Glu

Artj

Pro

XI·

«r

ΧΓ5

Leu

Val

Gly

Leu

ty«

Gin

130

135

140

GST

GCA GAT

GTT

GAT

TGT

*

crr

GGC

ACT

GAG

GGC

CCA

CC?

GTT

Gly

Ala Ajrp

Val

Aap

Cy«

m·

Leu

Giy

Thr

Aap

cya

Pro

Pío

Val

KS

150

133

σκ

AAG GGA

ATC

GGA

GGG

CTA

CCT

GGT

GGC

AAG

GTC

AM

CTG

*··

Val

Aan Gly

íle

Gly

Leu

Pro

Gly

Ly«

Val

Lyw

Leu

ler

160

ies

170

TTC

CCT

CTT

GGG

GAT

GTG

GAG

ACT GAA

ATC

ATT

GAT

AAA

ΤΣΑ

AGC TCC

623

Leu

All

Leu

Gly

Aep

Val

Glu

Ila Glu

XI a

11*

Aap

Ly»

Leu

na Sar

195

200

205

ATT

CCG

TAC

GTC

GAA

κα

ACA

TTG AGA

.ú

XTG

GAG

CC?

TTT

GGT GTG

671

11«

Pro

?yr

Val

Glu

Mat

Thr

Leu Are

Leu

Mat

Clu

Are

Pha

Gly Val

210

ZXS

220

AAA

CCA

GM

CAT

TC?

GAT

AGC

TGC GAC

AGA

TTC

TAC

ATT

AM

CGA GGT

719

i-y»

Ala

Clu

Hla

Sar

A«P

Sar

Trp Aap Anj

Pha

Ty?

Ila

Lya Gly Cly

223

230

235

CAA

AAA

TAC

AAG

TCC

CCT

AAA

AAT GCC

TAT

GTT

GAA

GGT

GAT

CCC TO.

767

Gin

ty»

Gyr

ty·

Sar

Pro

tya

Aan Ala

’T?

Val

Glu

Cly Aap Ala Sar

240

245

250

AGC

GCA

AGC

TAT

TTC

TTG

GC?

GGT GC?

GCA

ATT

AC?

GGA GGG

ACľ GTG

815

s«r

Ala

Sar

Tyr

Pha

Leu

Ala

Gly Ala

Ala

XI a

Thr

Gly Gly

Thr Val

255

260

265

270

ACT

CTC

OKA

GGT

GGC

ACC

ACC ACT

TTG

CM

GGT

GAG

GTG

AAG TTT

863

Thr

Val

Clu

Gly Cy.

Gly Thr Thr Sar

Leu

Gin

Cly Aap

Val

Lya Pha

275

2S0

285

GCT

GAG

GTA

CTG

GAG

AM A3G GGA GCG

AAG

GTT

ACA GGG

ACC

GAG ACT

JU

Ala

Glu

Val

Leu

Clu

Mat Mat Gly Ala

Lyn

Val

Thr Trp

Thr

Glu Thr

»0

295

e

300

AGC

GTA

ACT

GTT

ACT

GGC

CCA CCG

CSG

gag

CCA

TTT

GQS JJUL •mMM r“ “.

CAX

353

Sar

v*i

Thr

Val

Thr

Gly

ŕro

Pro

Arg

Glu

Pro

Pha

Gly Arg .Lya

Kla

305

310

315

CTC

AAG

GCC

ATT

GAG

GTC

AAC AK

AAC

AAG

AK

cer

GAT

GTC

GCC

AK

1007

La>u

Lya

Ala

XI.

A«P

Val

Am HaC

Am

ty*

Met

Pro

A«p

Val

Ala

Mat

320

325

330

ÄCľ

crr

GCT

GK

gtt

GCC

CIC

* * Λ

GCC

GAT

GGC

cs

GCC

ATC ΝΆ

1055

Thr

Leu

Ala

Val

Ala

Uxj

ftl·

Ala

A*p

Gly

Pro

Thr Ala

21» Arg

335

340

345

350

GAC

GK

GCT

TCC

TSS

AGA

OTA AAG

GAG

ACC

CM

AGG

AK

GTT

GS

ATC

1103

Aap

v«l

Ala

Sar

Trp

Arg

Val

ty·

Glu

Thr

Glu

Arg

Kat

Val

Ala

n»

355

3£0

3(5

CCG

ac:

GAG

CIA

ACC

AAG

CM

GGA

TCT

GTT

GAG

GAA

GGG

CCG

GAC

1151

Arg

Thr

Glu

Lau

Thr

Lya

Lw

Gly

Ala

Sar

Val

Glu

=iy

Pro

Aap

nu

J75

J00

T*C

TGC

ATC

ag:

CC:

GAG

AAG

CTC

AAC

CTC

ACí

txr.

ATC

gac:

1194

r 7 r

^r-

ri·.·

tu·

Tn r

PfJ

PtJ

Glu

tys

Leu

Aan

Val

Thr

Ala

11·

JH·.

J'W

at;

T AC

CAC

lUC

CAC

Ktr;

GCC

ATG

GCC

TTC

TCC

—;

GCC

TTT

1317

Tr.r

ryc

Α=Ψ

Arp

Hiŕ

Arg .Ma<·.

Ala i

Hot .

Ala

Pha

S.r

Lrv

Ala

Cys

400

405

410

ccc

G*C

CTC

CCC

GTC

ACC

ATC

CSG i

GAC <

Mm · '

GGG

TGC

ACC

CSG

AAG

ACC'

1235

Ad*

Glu

Val

Pro

Val

Thr

XI·

Arg .

Aap .Pro ¹

Gly Cys

Thr

Arg

Ly»

Thr

415

420

425

430

τ~

C=

GAC

TAC

TTC

GAT

GTG

CTG ,

kx ac: ·

TTC

GTC .

AAG

AAT

1337

Pna

Pro

A«p

Tyr

pr>«

Aap

Val

Lau :

Bar Thr !

Pha '

Val

Ly» .

Am

435 <40

ΤΑΑ 1340

INFORMÁCIE 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 440 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE SEQ ID NO: 3

Ala

Gly

’ Ala

Glu

Ila

Val

. Lau

i Gin

Pro

Ila

Lya

Glu

Ila

Sar Gly

1

5

10

15

Thr

Val

Lyo

Leu

Pro

Gly

Sar

Ly>

Sar

L«u

Sar

Am

Arg

Ua

Lau Lau

20

25

30

Lau

Ala

Uv

Sar

Glu

Gly

Thr

Val

Arp

Am

Lau

Lau Am

35

40

45

Sar

Glu

Aap

Val

Hla

Tyr

Mat

Lau

Gly

Ala

Lau

Arg

Thr

Lau

Gly Lau

50

55

£0

S«r

Val

Glu

Ala

A*p

Ly»

Ala

Ly»

Arg

Ala

Val

Gly Cya

£5

70

73

80

oiy

Gly

Ly»

Pha

Pro

Val

Glu

Aap

Ala

ty»

Glu

Val

Gin

Lau Pha

85

30

33

L«u

Gly

Am

Ala

Gly

Thr

Ala

Mat

Arg

Pro

Lau

Thr

Ala

Val Thr

100

103

110

Ala

Gly

Am

Ala

Thr

Tyr

Val

Lau

Aap

Gly

Val

Pro

Arg Mat

115

120

123

Arg Glu Axg Pro XI· Gly Aap Lau Val Val αίγ Lau Lya Cln Uv Gly

130 133 140

Ale

Aap

Val

Aap

cy»

n>·

lau

Cly

Thr

Aap

Cyw

Pre

Pro

Val

Arg

Val

145

1SO

155

1C0

Aan

Gly

Zla

Gly

Cly

Lru

Pro

Gly

Cly

ty·

Val

ty»

lau

Sar

Cly

Sar

1CS

170

175

11·

S.r

Sar

Gin

Tyr

Lau

Sar

Ala

Leu

Lau

Mat

Ala

Pro

Lau

Ala

1*0

lis

l»0

Lau

Cly

Aap

Val

Clu

n·

Clu

n·

Zla

Aap

ty»

Lau

Zla

Sar

Zlo

Pro

195

200

205

Tyr

Val

Clu

Mat

Thr

Lau

Arg

Lau

Mat

Clu

Arg

ETx

GIT

Val

ty»

Ala

Z10

2XS

220

Clu

Kla

Sar

Aap

Sar

’tP

Aap

Arg

ttn

Tyr

Zla

ty»

Gly

ay

íLi

ty»

225

230

235

240

Tyr

ty»

Sar

Pro

ty»

Aan

Ala

“Tyr

Val

Clu

Gly

A»P

Ala

Sar

Ala

2<3

2S0

2SS

'—< 7 yr

t-** Al.» :-o

cir Ai.i

Ala

tu

Thr Cly Cly Thr Val 270

Thr Val

a·.

'íly

Cy

«17

Thr

Svr

Luu

cm Cly

Aap

Val

Lys Phe

Ala

Clu

’ ·’ ^ft

’uo

la**·»

Gl _Λ

M»··

Cty

AU

Lys

Val

Thr

Tep

Thr

'ílu Thr

Svr

V*.

. ’···

·)<

JOU

Thr

Vs* 1

Τη t

«17

Pro

Ár;

Clu

Pro

pn·

Cly

Arg

Lys Hla

Lau

Ly>

305

310

315

320

Ala

11«

Aj p

Val

Ajn

Mat.

Aan

ty»

Mat

Pro

Aap Val

Ala Mat

Thr

Lau

325

330

335

Ala

Val

Ala

Leu

Pn·

Ala

Aap

Cly

Prv

Thr Ala

Zla' Arg

Aap

Val

340

34S

350

Ala

Sar

7.P

Arg

Val

ty»

Clu

Thr

Clu

Arg

Mat

Val

Ala

Zla

Arg

Thr

35S

360

363

Glu

Lau

Thr

ty»

Lau

Gly

Ala

Sar

Val

Glu

Gly

Pro

Aap

Tyr

cy>

370

375

3BO

Zla

Thr

Pre

Pro

Clu

ty»

Lau

Aan

Val

Thr

Ala

Zla·

Aap

Thr

Tyr

38S

390

393

400

Aap

Kla

Ár?

Mat

Ala

Mat

Ala

Pha

Sar

Lau

Ala

cy*

Ala

Clu

4 OS

410

415

Val

Pro

Val

Thr

Zla

Arg

Aap

Pro

Gly

Cy»

Thr

Arg

ty»

Thr

Pho

Pro

420

42S

430

Aap Tyr

ΡΤ>· Aap Val Lau Ser Thr P!»a Val Lya Aan <33 «40

INFORMÁCIE 0 SEKVENCII SEQ. ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1340 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Zea mays (B) KMEŇ: BMS (Black Mexičan Sweet) (vii) KONKRÉTNY ZDROJ:

B) KLOŇ: pRPA-ML-720 (xi) OPIS SEKVENCIE SEQ ID NO: 4

CCATC CCC GGC GS GAG GM XK GTG CTG CM C5C ATC AM GM ATC Ala Gly Ala Glu Glu XI» Val Leu Gin Pro XI· Lya Clu XI· X S 10

TCC GGC Sar Gly 15

fCZ CTC AAG

CTG C3 GS TCC AM 703 CTT 7CC AM CS ATC

95

Thr

Val Lya

Lau Pre 20

Gly

Sar

Lya Sar Lau Sar Aan Ary XI·

25

30

CTC

CTA

CTC

GCC

ccc

CTG

70=

GM

GS

XI MA

G7G

OTT

GAT

AM

CTG

143

Lau

Al*

Ala

Lau

Sar

Glu

Gly

Thr

Val

Aap Aan

Lau

35

40

45

CTC

AAC

AG7

GAG

GA?

GTC

CM

7M

ATG

CTC

GGG

GCC

TTG

AGG

ACT

CTT

191

Leu

Aan

Ser

Glu

Aap

Val

Hla

Tyr

x«e

Lau

Gly Ala

Lau

Ary

Thr

Lau

50

55

CO

GG?

CTC

TCT

GTC

GAA

GS

GM

AAA

GCT

GCC

AAA AGA GCT

CCA

cm

07?

239

Gly

Leu

Sar

Val

Glu

Ala

Aap

ty·

Ala

ty· Are

Ala

Val

es

70

. 75

·> :c

T'TT arrr

GGA

aaí:

; ttc

CC*

•ju:

GAT

'XT AAA

. GM

: GM

. CTT

; cm

3 S T

•a·.

C 7- <;ty

<:i y

Ly::

: Ph.

Pro

Val

Glu

. Aip

- Ala Lyu

Glu

i Val

Cln

•«1

<·.

•>0

'rrz

ttc rrr:

•ju:

ΑΛΤ

•XT

r-ΛΑ

ATC

•XA

AT'.

ex: TS

TT*-

ACA

‘VA

GCT

JJ5

Pb·.· l.u-1

U v

A ·.

Alj

Gly

tlr

A.i

Met

Are Ser

Leu

Thr

Al t

Ala

V10

IJS

110

'ΓΤΤ

ACT GCT

•XT

•XTT

GGA

AAT

GCA

ACT

TAC

CTG CTT

GAT

CCA

GTA

CTA

383

v* i

Thr Al*

Ala

Ciy

Gly

Aan

Ala

Thr

Tyr

Val Lau

A*P

Gly

Val

Pro

115

120

1X5

AGA

ATG AGG

GM

AGA

es

ATT

GGC

GM

TTC

CTT CTC

GGA

TTG

AM

CM

431

Aro

Mat Arg

Glu

Ary

Prô

Xla

Gly

Aap

Lau

Val Val Gly

Lau

Lya

Gin

130

135

.140

CTT

GCT GCA

GAT

CTT

GAT

TCT

TTC

CTT

GGC

ACT GM

TGC

CCA

CCT

CTT

479

Lau

Gly Al*

Aap

V«1

Aap

cr«

Pha

Lau

Gly

Thr Aap

=y«

Pre

Pro

Val

145

150

155

CTT

GTC AA7

GGA

ATC

GGA

GGG

CTA

CCT

CmT

GGC AM

GTC

AM

CTG

TCT

527

Ary

Val Aan

Gly

11«

Gly

Leu

Pro

Gly

Gly Lya

Val

ty»

Lau

Sar

160

165

170

GGC

ATG

AGC

ACT

CM

TM

TTG

AGT

GCC

TTG CTC

ATG

GCT

CCT

575

Gly

Sar Xla

Sar

Gin

Tyr

Lau

Sar

Ala

Lau Leu

Mar

Ala

Pro

175

180

185

190

* · ·—

GCT CTT

GGG

GAT

GTG

GAG

ATT

GAA

ATC

ATT GAT

AAA

TTA

xs

TS

623

Lau

Al* Lau

Gly

Aap

Val

Glu

Xla

Glu

Xla

Xla Aap

ty·

Lau

Xla

Ser

195

200

205

ATT

SS TAC

CTC

GAA

ATG

AGA

TTG

AGA

TTG

ATC GM

s?

T7T

GGT

GTG

671

Xla

Pro Tyr

Val

Glu

Mat

Thr

Lau

Ary

Lau

Hac Glu

Ary

Pha

siy

Val

210

215

220

AAA

GCA GAG

CAT

7CT

GAT

AGC

TGG

GM

AGA

TTC TM

ATT

AM

GGA

GST

719

Lys

Ala Glu

Hla

Sar

Aap

Sar

Trp

Aap

Ary

Pha Tyr

Xla

Lya

Gly Gly

225

230

235

CAA

AAA TM

AM

TS

CS

AAA

AAT

GS

TAT

CTT GAA

GG7

GAT

GS

TCA

767

Gin

Lya Tyr

Ly·

Sar

Pre

Ly»

Aan

Ala

Tyr

Val Glu

Gly Aap

Ala

Sar

24 0

245

250

AGC

GCA AGC

TAT

TTC

TTG

GCT

GCA

ATT ACT

GGA GGG

ACT

GTG

815

Sar

Ala Sar

Tyr

Pha

Leu

Ala

Gly

Ala

n· Thr

Gly Gly

Thr

Val

255

260

265

270

ACT

GTG GAA

GCT

TCT

GGC

AS

AGT

TTG

CM GCT

GAT

GTG

AM

TTT

863

Thr

Val Glu

Gly

cya

Gly

Thr

Sar

Lau

Gin Gly Aap

Val

Ly»

Pha

273

280

285

GCT

GM OTA

CTG

GM

ATG

GGA

GS

AM

GTT ACA 7GG .

ACC

GM .

ACT

911

Al·

Glu Val

Leu

Glu

Mat

Gly

Ala

ty»

Val Thr

Trp

Thr

Glu ‘

Thr

290

295

300

AGC

GTA ACT

077

ACT

GGC

CCA

es

CGG

GM

CCA TTT

GGG MG .

AAA i

CAC

959

Sar

Val Thr

Val

Thr

Gly

Pro

Ary

Glu

Pro ma Gly Ary Lya 1

Kla

305

310

31S

CTC

AAG

GCG

ATT

GAT

GTC

AAC ATG

AAC

AAG

ATG

CCT

ara

GTC

GCC ASG

1007

Leu

ly»

Ala

Zla

Aep

Val

Aan Mal

Aan

ly»

Met

ΡΓ5

Aap

Val

Ala Mat

320

323

330

ACT

ctt

GCT

στα

GTT

GCC

CTC TTT

GCC

GAT

GGC

CX

ACA.

GC

ATC AGA

1055

Thr

Leu

Ala

Val

Ala

Leu Rm

Ala

Aap

«r

Pro

Thr

Ala

Zle Arg

335

340

345

350

GAC Aep

GTG Val

GCT TCC Ala Sar

T« ?rp 355

aga gta aag

GAG ACC GAG AGG ASG GTT GCG ASC

1103

Arg

Val

Ly»

Glu

Thr 3C0

Glu

Arg

Mat

Val Ala 3C5

Zle

CGG

ACG

GAG

CTA

ACC

AAG

CTG

GGA

OCA

TCT

GTT

GAG

GAA

GGG

CCS

GAC

1151

Arg

Thr

Glu

Leu

Thr

Ly»

Leu

Gly

Ala

Sar

Val

Glu

«T

Pre

Aap

370

375

380

TAC

TGC

ATC

ACG

cca

CCS

GAG

AAG

CTG

AAC

GTG

ACG

GCG

ATC

GAC

113»

Tyr

cy»

Zla

Thr

Pre

Glu

Lya

Lau

Aan

Val

Thr

Ala

Zla

Aap

383 330 335

ACG TAC

Thr Tyr

400

GAC Α;.·ρ 'VC Α*Φ c*c lli.<

«c·: nAT, Aii ·;ιμ

I*/ vjI

Pru 'ITC vil

Phe Pro

GAC

A*p

TAC Tyr pn« 435

ATS	ATG	GCT	ATG	ncz	TTC	TCC	CTT	CCC	GCC	tct	1247
Anj	Met	Ala	Het	Ala	Phe	Sar	Leu	Ala	Ala	Cy»
405					410
ACC	ATC	cza	GAC	ccr	&X5	TGC	ACC	C5G	AAG	ACC	IZ’í
Thr	11«	Ar<J	A-p	Pro	Gly	Cya	Thr	Arj	Lys	Thr
CO					423					<30
GIT	GTG	CTG	AGC	ACT	TTC	GTC	AAG	AAT			1337
Aap	Val	Lau	Sar	Thr	Phe	Val	Lya	Aan

440

TAA

1340

INFORMÁCIE O

SEKVENCII SEQ ID NO (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 444 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE SEQ ID NO: 5

Ala

Gly

Ala

Glu

Zle

Val

Leu

Gin

Pro

n·

iy»

Glu

Zla

Sar

Gly

1

5

10

15

Thr

Val

Lya

Leu

Pro

Gly

Sar

iy»

Sar

Leu

Sar

Aan

Arg

Zla

Lau

Leu

20

25

30

Lau

Ala

Leu

Sar

Glu

Gly

Thr

Val

Aap

Aan

Leu

Aan

35

40

45

Sar

Glu

Aap

Val

Kla

Tyr.

Mat

Lau

Gly

Ala

Leu

Arg

TŤir

Leu

Gly

Leu

50

55

CO

Sar

Val

Glu

Ala

A«P

Lya

Ala

iy»

Arg

Ala

Yal

Val

Yal

Gly

Cyw

£5

70

75

•0

Gly

Lya

Phe

Pro

Val

Glu

A«P

Ala

iy«

Glu

Val

Gin

Leu

Phe

85

30

35

Lau

Gly

Aan

Ala

Gly

Zle

Ala

Mat

Arg-

Sar

Leu

Thr

Ala

Val

•Thr

100

105

110

Ala

Gly

Aan

Ala

Thr

Tyr

Val

Lau

Aap

Gly

Val

Pro

Arg

Mat

115

120

•

125

a — Clu Ara Pra II· Gly Aap L*u Val Val Gly Leu Lys Gin Leu Gly

Ala 145

Aap

Val

Aap

cy«

Pha 150

Gly

Thr

Aap

cy* 155

Pre

Pro

Val

Αχψ

Val 160

Aan

Gly

Zle

Gly

Cly 165

Leu

Pro

Cly

Ly« 170

Val

Ly«

tau

3«r

Gly 175

Sar

Zla

Sar

C In

Tyr

tau

Sar

Ala

tau

Mat

Ala

Pro

tau

Ala

180

185

180

tau

Gly

Aap

Val

Glu

III

Glu

Zla

11«

Aap

ty»

Lau

Zla

Sar

11«

Pro

125

200

2CS

Tyr v*l Glu Mat Thr L«u Anj Lau Mat Clu Arg Fba Gly Val ty· Ala 210 215 220

Clu Hla Sar A*p s.r Trp Axp Arg Pha Tyr Ha ty» Gly Gly «In ty» 22Λ 230 235 240

Tyr

ty»

Sar

Pra

ty»

Axn

Ala

Tyr

Val

Clu

cly

Aap

Ala

Sar

Ala

245

250

255

Sar

Tyr

ftie

Lau

AU

Cly

Alt

Ala

Ila

Thr

cly

ciy

Thr

Val

znr

Val

2(0

245

270

Clu

ciy

ep»

Gly

Thr

Sar

tou

Gin

ciy

Arp

Val

ty»

Ptie

Ala

Clu

Z75

290

295

V.1I

Uaí

Clu

Mu t

Met

Gly

Ala

ty*

Val

Thr

Trp

Thr

Glu

Thr

Sar

Val

z-w

295

300

Tnr

7H

7nr

«17

ť tu

Pro

Ari

Glu

Pro

Pho

Gly

Arg

Lr-

KU

Leu

,L«

JO'.

J10

315

J20

A11

: lr

A-’fc

vi.

A;in

Mat

Axn

Lys

Met

Pro

Axp

Val

AU

Mat

Thr

Leu

iZS

JJO

JJ5

AU

Val

V»l

AU

Lau

Pha

Ala

Aap

Gly

Pro

Thr

Ala

11»

Arg

A»p

Val

340

345

350

A18

Sar

Trp

Arg

Val

Ly*

Glu

Thr

Glu

Arg

Met

Val

Ala

XI u

Arg

Thr

355

360

365

Glu

Leu

“hr

ty»

Lau

Gly

Ala

Sar

Val

Glu

Gly

Pro

A»p

Tyr

cy»

37Q

375

380

11«

11»

Thr

Pro

Glu

ty»

tau

Aan

Val

Thr

Ala

Zla

*»P

Thr

Tyr

385

390

395

4 00

Asp

Aap

Hl*

Arg

x»t

Ala

Met

Ala

Pha

Sar

tau

Ala

Cyw

Ala

Glu

405

410

415

Val

Pro

Val

Thr

Zla

Arg

Aap

Pro

Gly

cy»

Thr

Arg

ty»

Thr

Pha

Pro

p

420

425

43C

A«p

rrr

Pha

A*p

Val

Leu

Sar

Thr

ľba

Val

Lya

Axn

435

440

7/

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA gén, kódujúci mutovanú 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntázu (EPSPS), vyznačuj úci sa tým, že obsahuje aspoň jednu substitúciu treoninu 102 za izoleucin.
2. DNA gén podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že obsahuje navyše ešte mutáciu v EPSPS odlišnú od prvej mutácie.

3. DNA gén podľa nároku 2, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že obsahuje ešte ďalšiu mutáciu obsahujúcu substitúciu prolinu 106 za serin. 4. DNA gén podľa nároku 2, v y z n a č u j ú c i sa t ý m,

že navyše obsahuje ďalšiu mutáciu obsahujúcu substitúciu glycinu

101 za alanin.
5. DNA gén podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že je bakteriálneho pôvodu.
6. DNA gén podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že pochádza z baktérii rodu Salmonella typhimurium.
7. DNA gén podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že je rastlinného pôvodu.
8. DNA gén podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že pochádza z kukurice.
9. Mutovaný protein EPSPS, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa aspoň jednu substitúciu treoninu 102 za izoleucin.
10. Chimérický gén, obsahujúci kódujúcu sekvenciu, ako aj heterológne regulačné elementy v polohe 3' a 5' schopné fungovať v rastlinách, vyznačujúci sa tým, že ako kódujúcu sekvenciu obsahuje aspoň jednu sekvenciu podľa nároku 1 až 8.
11. Chimérický gén podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že obsahuje promótor rastlinného vírusu.
12. Chimérický gén podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že obsahuje promótor rastlinného pôvodu, napríklad atubulínový, histónový, intróny, aktín a tak ďalej.

13. Vektory vhodné na transformáciu rastlín , v y z n a č u - j ú c i sa t ý m, že obsahuje aspoň jeden gén podľa niektorého z nárokov 10 až 12. 14. Rastlinná bunka, v yznačujú c a s a tým, že obsahuje aspoň jeden gén podľa niektorého z nárokov 10 až 12.
15. Rastlina, vyznačujúca sa tým, že je získaná regeneráciou z bunky podľa nároku 14. ₍

16. Spôsob produkcie rastlín so zvýšenou toleranciou voči herbicídom napádajúcich EPSPS, vyznačujúci sa t ý m, že rastlinné bunky alebo pro'toplasty sa transformujú

génom podľa jedného z nárokov 1 až 8 a následne sa transformované bunky podrobia regenerácii.
17. Spôsob ošetrenia rastlín herbicídom napádajúcim EPSPS, vyznačujúci sa tým, že herbicíd sa aplikuje na rastliny podľa nároku 15.
18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že sa aplikuje glyfosat alebo jeho prekurzor.