SK43194A3 - Bioprocess for preparing 7-aminodeacetylcephalosporanic acid and 7-amino-cephalosporanic acid - Google Patents

Description

Dôležité medziprodukty na prípravu cefalosporínových antibiotík, kyselina 7-aminodeacetylcefalospo-ranová 7-ADAC a kyselina 7-aminocefalosporanová 7-ACA sa pripravujú novým biologickým spôsobom, pri ktorom sa pestuje transformovaný kmeň Penicillium chrysogenum v prítomnosti adipátu za vzniku adipoyl-6-ΑΡΑ s následnou expresiou génov, použitých na transformáciu, a to 1) génu pre expandázu za vzniku adipoyl-7-ADAC, 2) génu pre hydroxylázu za vzniku 7-ADAC a 3) génu pre acetyltransferázu za vzniku adipoyl-7-ACA. Výsledná 7-ACA sa získa odštiepením adipoylového bočného reťazca adipoylacylázou.

i

- 1 Ί>ν W Biologický ranovej a spôsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalospokyseliny 7-aminocefalosporanovej

Oblasť techniky

Vynález sa týka biologického spôsobu výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanovej pestovaním transformovaného kmeňa Penicillium chrysogenum a vektora na expresiu príslušnej rekombinačnej DNA.

Doterajší stav techniky

V súčasnej dobe je známa už štvrtá generácia cefalosporínových antibiotík, ktoré majú nesmierny liečebný význam. Veľké množstvo rôznych bočných reťazcov v bežne používaných a dodávaných cefalosporínoch a veľká hospodárska dôležitosť týchto antibiotík podnecuje snahy dosiahnuť hospodárnejšie a účinnejšie postupy na výrobu kľúčových medziproduktov, z ktorých je potom možné ľahko vyrobiť rôzne druhy cefalosporínov.

Jedným z týchto kľúčových medziproduktov je kyselina 7-aminoceíalosporanová, 7-ACA, ktorú je možné vyjadriť nasledujúcim vzorcom

V súčasnej dobe sa 7-ACA vyrába z cefalosporínu C. Cefalosporín C je fermentačný produkt, ktorý je východiskovou látkou pre takmer všetky bežne dodávané cefalosporiny. Avšak syntetické postupy na výrobu rôznych dodávaných cefalosporinov vo väčšine prípadov vychádzajú z kyseliny

7-aminocefalosporanovej, ktorú je najskôr nutné z cefalosporínu C pripraviť odštiepením 7-aminoadipoylového bočného reťazca. Typické bežne dodávané cefalosporíny, ktoré sú takto synteticky odvodené od 7-ACA a ktoré teda majú 3-acetyloxymetylénový bočný reťazec, sú napríklad cefotaxím, cefaloglycín, cefalotín a cefapirín.

Ďalším z kľúčových medziproduktov je kyselina 7-aminodeacetylcefalosporanová, 7-ADAC, ktorú je možné vyjadriť nasledujúcim vzorcom

V súčasnej dobe je táto látka taktiež vyrábaná z cefalosporínu C odstránením 7-D-alfa-aminoadipoylového bočného reťazca so súčasnou premenou 3-acetyloxymetyIónového bočného reťazca na 3-hydroxymetyl. 7-ADAC je užitočným medziproduktom na výrobu tých cefalosporínových derivátov, ktoré obsahujú modifikované substituenty na uhlíkovom atóme v polohe 3.

V súčasnej dobe je pri odštiepení 7-aminoadipoylového bočného reťazca metódou voľby chemický postup. Pri základnom iminohalogenidovom postupe je nutné chrániť aminoskupinu a karboxylovú skupinu na 7-aminoadipoylovom bočnom reťazci, bežne sa na tento účel používa niekoľko postupov. Chemické štiepenie, v súčasnej dobe používané, však má niekoľko vážnych nevýhod. Ide o velastupňový a zložitý postup, pri ktorom je nutné používať veľmi nízke teploty, nákladné reakčné činidlá, pričom vzniká podstatné množstvo vedľajších produktov, ktoré je nutné ďalej spracovať a okrem toho je nutné nečistý východiskový materiál pred chemickým spracovaním čistiť. V dôsledku týchto nevýhod sú stále vyvíjané snahy navrhnúť mikrobiologický alebo fermentačný postup, ktorým by bolo možné dosiahnuť enzymaticku deacyláciu cefalosporínu

C tak, aby bolo možné získať kyselinu 7-aminocefalosporanovú hospodárnejším spôsobom než súčasnými chemickými postupmi.

Uvedené snahy nájsť úspešný mikrobiologický postup boli však dosiaľ do značnej miery vynakladané márne. Predpokladalo sa, že bude možné takýto postup uskutočniť vzhľadom na stereochémiu aminoadipoylového bočného reťazca v molekule cefalosporínu C a tiež vzhľadom na to, že penicilín bol úspešne deacylovaný enzymatickým štiepením za použitia enzýmu penicilín acylázy, ktorá je produkovaná celým radom mikroorganizmov. Správy o úspešnosti enzymatickej deacylácie cefalosporínu C v jednom stupni sú na druhej strane v literatúre často nereprodukovateľné alebo poskytujú len malé výťažky .

Vynález sa teda týka zvlášť vyriešenia úlohy, ako pripraviť kľúčový medziprodukt 7-ACA a zvlášť, ako ho pripraviť biologickým postupom tak, aby bolo možné hospodárnejšie vyrobiť bežné cefalosporíny.

Ako už bolo uvedené, boli až dosial snahy navrhnúť biologický postup na výrobu 7-ACA z väčšej časti bezvýsledné, zvlášť pokiaľ ide o výrobu tejto látky vo veľkom meradle. Hoci je napríklad možné pripraviť kyselinu 6-aminopenicilanovú, 6-APA, priamou fermentáciou a/alebo enzymatickým spracovaním penicilínu G, takže zostáva expandovať kruh, aby bolo možné pripraviť 7-ADCA, bolo preukázané, že nanešťastie enzýmy Cephalosporium alebo Streptomyces, ktorými sa vykonáva za zvyčajných metabolických podmienok v týchto mikroorganizmoch expanzia kruhu, nespracovávajú 6-APA ako substrát. Tieto enzýmy, ktoré sa v danej oblasti techniky označujú ako DAOCS alebo aj ako expandázy, sú definované ako enzýmy, ktoré katalyzujú expanziu penamového kruhu, to znamená, štruktúry, ktorá sa nachádza v molekulách penicilínového typu až k cef-3-emovým kruhom, ktoré sa vyskytujú v cefalosporíne.

V priebehu prihlášky budú uvedené enzýmy súhrne označované ako expandázy.

Substrát, ktorý je expandázami spracovávaný, je penicilín N, z ktorého po expanzii kruhu a po hydroxylácii vzniká kyselina deacetylcefalosporanová, DAC. Je len potrebné odštiepiť (D)-alfa-aminoadipoylový bočný reťazec, aby bolo možné získať 7-ADAC, avšak práve tento bočný reťazec je nesmierne odolný na enzymatické štiepenie, takže je možné dosiahnuť len neprijateľne nízke výťažky.

Pri postupe, ktorý je podľa vynálezu navrhovaný, je možné dosiahnuť účinný biologický postup, pri ktorom je produkovaná penicilínová zlúčenina s adipoylovým bočným reťazcom vo vysokom množstve pomocou nového fermentačného postupu, pričom táto penicilínová zlúčenina je súčasne prijateľným substrátom pre enzým expandázu, ktorý je in situ produkovaný tým istým mikroorganizmom, ktorý produkuje penicilínovú zlúčeninu vzhľadom na to, že bol transformovaný tak, aby u neho dochádzalo k expanzii tejto expandázy. Produkovaná expandáza potom expanduje kruh penicilínovej zlúčeniny za vzniku cefalosporínovej zlúčeniny vo vysokých výťažkoch.

Adipoyl-7-ADCA, produkovaná pôsobením enzýmu expandázy in situ má 3-metylový bočný reťazec, zatiaľ čo 7-ACA, ktorá je výsledným produktom, má 3-acetyloxymetylový (-CH2OC(O)CHj) bočný reťazec. Aby bolo možné previesť 3-metylový bočný reťazec na 3-acetyloxymetylový bočný reťazec, dochádza podľa vynálezu aj in situ k expresii dvoch ďalších enzýmov okrem expandázy. Ide o hydroxylázu a o acetyltransferázu, oba tieto enzýmy sú vytvárané na základe expresie génov, ktorými bol mikroorganizmus, produkujúci penicilínovú zlúčeninu, tiež transformovaný. Enzým hydroxyláza mení 3-metylový bočný reťazec v adipoyl-7-ADCA na 3-hydroxymetylový reťazec a enzým acetyltransferáza mení 3-hydroxymetylový bočný reťazec na 3-acetyloxymetylový bočný

- 5 reťazec 7-ACA.

Je veľmi dôležité, že v poslednom kritickom stupni spôsobu podlá vynálezu je bočný reťazec pôvodnej penicilínovej zlúčeniny, teraz cefalosporínovej zlúčeniny odstrániteľný ďalším enzymatickým systémom v neočakávane vysokom výťažku. Prekvapujúcim výsledkom tohto biologického postupu je teda príprava 7-ACA v neočakávane vysokom výťažku a s dostatočnou hospodárnosťou tak, aby tento postup mohol byť použitý ako alternatívny postup k súčasne používanému chemickému a biologickému spracovaniu.

Nový biologický postup podľa vynálezu je teda jedinečným a prekvapivo účinným postupom na výrobu 7-ACA a je veľmi hospodárnou alternatívou súčasných chemických postupov. Úspešnosť tohto postupu je veľmi prekvapujúca vzhľadom na to, že až dosial boli všetky snahy navrhnúť takýto biologický postup opakovane neúspešne. Napríklad v európskom patentovom spise EP-A-0 422 790 sa opisuje DNA, ktorá je kódom pre izopenicilín N : acyl-CoA-acyltransferázu z Aspergillus nidulans, opisuje sa tiež použitie tohto enzýmu na prípravu cefalosporínu z pliesní, produkujúcich penicilín, tento postup až dosiaľ nebol opísaný. Tento postup je však opisovaný ako porušenie alebo presun génu pre acyltransferázu spolu s pridaním génov, ktoré sú kódom pre enzýmy epimerázu a expandázu z organizmov, produkujúcich cefalosporin. Pri praktickom uskutočnení postupu však nedošlo v dostatočnom stupni ani k transformácii, ani k expresii. Okrem toho, aj v prípade, že by bola transformácia úspešná, bola by stále ešte nedostatočná pre účely vynálezu vzhľadom na to, že by stále pretrvával problém, ako odstrániť D-alfa-aminoadipoylový bočný reťazec. Tento nedostatočný pokus na získanie dostatočných výsledkov pri výrobe medziproduktov na výrobu bežných cefalosporínov z kultúr húb, produkujúcich penicilín je v kontraste s výsledkami, ktoré je možné dosiahnuť pri použití spôsobu podlá vynálezu.

\a

- 6 Prvým enzymatickým biologickým postupom pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je expanzia kruhu adipoyl-6-ΑΡΑ, ktorá je vykonávaná enzýmom expandázou, ktorá je produktom expresie génu pre expandázu, ktorým bol transformovaný nerekombinačný hostiteľ P. Chrysogenum. Použitie enzýmu expandázy bolo už doporučené v literatúre. Napríklad v publikácii Cantwell a ďalší, Curr Genet, 1990, 17:213 až 221, sa doporučuje biologický postup na výrobu 7-ADCA expanziou kruhu penicilínu V s následnou enzymatickou hydrolýzou výsledného deacetoxycefalosporínu V za vzniku 7-ADCA. Uvedený návrh je založený na dostupnosti klonovaného génu pre expandázu penicilínu N (cefE) zo S. clavuligerus podľa publikácií Kovacevic a ďalší, J. Bacteriol., 1989, 171:754 až 760 a Ingolia a ďalší, US 5 070 020. Avšak vzhľadom na to, že expandáza pôsobí na penicilín N, to znamená na svoj prírodný substrát, avšak nie na penicilín V, je ešte potrebný genetický postup na získanie modifikovaného génu pre expandázu, schopnú spôsobiť expanziu kruhu penicilínu V. Táto požadovaná modifikácia nebola podľa publikácie Cantwell a ďalší dosiahnutá a autorom sa podarila len transformácia Penicillium chrysogenum za použitia génu cefE zo Streptomyces slavuligenus a dosiahnutie úrovne expresie enzýmu expandázy.

Expandázy boli veľmi podrobne v danej oblasti techniky študované a to tak vzhladom na svoju účinnosť, ako aj pokiaľ ide o genetický reťazec. Napríklad podľa US patentových spisov č. 4 510 246 a 4 536 476 (Volfa), boli oddelene izolované enzýmami cykláza, epimeráza a enzýmami kruhu z bezbunkového extraktu prokaryotických organizmov, produkujúcich beta-laktámové zlúčeniny včítane Streptomyces clavuligerus za získania stabilných enzymatických reakčných činidiel. V US patentovom spise č. 5 082 772, ktorému zodpovedá EP-A 366 354 (Dotzlaf) sa opisuje izolovaný a čistený enzým expandáza z S. clavuligerus, ktorého vlastnosti sú plne opísané včítane terminálneho zvyšku a zloženia aminokyselín, pričom sa uvádza molekulová hmotnosť približne 34 600.' To je však v kontraste, s molekulovou hmotnosťou 29 000, ktorá je

-· 7 pre tento enzým uvádzaná v US 4 536 476. EP-A- 233 715 opisuje izoláciu a reštrikčnú mapu endonukleáz pre gén pre expandázu, získaný z S. clavuligerus, opisuje sa taktiež expresia kódovej DNA pre rekombinačnú expandázu za dosiahnutia účinnej expandázy u kmeňa S. clavuligerus, ktorý nemá schopnosť produkovať cefalosporin. V US 5 070 020, ktorému zodpovedá EP-A 341 892 (Ingolia a ďalší) sa opisuje reťazec kódovej DNA pre enzým expandázu, získaný z S. clavuligerus a súčasne sa opisuje aj transformácia kmeňa P. chrysogenum za použitia vektora na expresiu s obsahom uvedeného reťazca DNA a dosiahnutia expresie enzýmu expandázy. Uvádza sa, že získaný enzým je použiteľný na expanziu substrátov, odlišných od penicilínu N, neuvádza sa však žiadny konkrétny výsledok pokusu o takú expanziu.

Vyššie uvedené snahy sa sústredili na enzým expandázu, odvodený od prokaryotického organizmu S. clavuligerus. K expresii enzýmu, ktorý má zrejme rovnakú účinnosť na expanziu kruhu, dochádza aj u kmeňov eukaryotického organizmu Cephalosporium acremonium, organizmus sa tiež označuje ako Acremonium chrysogenum. K expresii expandázy u týchto kmeňov však dochádza na základe prítomnosti bifunkčného génu, cefEF, ktorý súčasne zaisťuje expresiu hydroxylázy DACS, ktorej prirodzenou funkciou je premena kyseliny desacetoxycefalosporanovej, DAOC, produktu enzýmu expandázy, na deacetylcefalosporín C, DAC. Výsledkom uvedenej expresie je jediný, avšak bifunkčný enzým, ktorý pôsobí súčasne ako expandáza aj ako hydroxyláza. Boli vyvíjané snahy oddeliť od seba účinnosti týchto dvoch produktov uvedeného génu, avšak tieto snahy dosial neboli úspešné. Napríklad v EP-A 281 391 sa opisuje izolácia a identifikácia reťazca génu pre expandázu DAOCS a DACS, získaného z C. acremonium ATCC 11550 spolu so zodpovedajúcim reťazcom aminokyselín tohto enzýmu. Došlo k transformácii kmeňa Penicillium a k expresii uvedených enzýmov, avšak nikdy nebol uvedený úspešný výsledok pokusu o premenu penicilínov G a V na zodpovedajúci cefalosporin. Okrem toho cez myšlienku, že by genetickou technikou bolo možné od seba oddeliť genetickú informáciu, ktorá je kódom pre DAOCS od kódovej informácie pre DACS a potom dosiahnuť oddelenú expresiu týchto enzýmov, nikdy nebol uvedený skutočný dôkaz takéhoto rozdelenia.

Enzým DAOCS/DACS, to znamená expandáza a hydroxyláza z C. acremonium bol taktiež v danej oblasti techniky dôkladne preštudovaný a to pokial ide o jeho účinnosť, jeho vlastnosti a jeho genetický reťazec. Napríklad podľa US patentových spisov č. 4 178 210, 4 248 966 a 4 307 192 (Demain) boli rôzne východiskové látky typu penicilínu spracovávané bezbunkovým extraktom C. acremonium, čím došlo k epimerácii a k expanzii kruhu za vzniku cefalosporínového antibiotika ako výsledného produktu. V US 3 753 881 (Vu-Kuang Yeh) sa opisuje enzým z C. acremonium, pokiaľ ide o jeho izoelektrický bod, molekulovú hmotnosť, zvyšky aminokyselín, pomer účinnosti hydroxylázy k účinnosti expandázy a tiež peptidové fragmenty týchto enzýmov.

Enzým acetyltransferáza z C. acremonium bol taktiež podrobne opísaný, pokial ide o jeho účinnosť, vlastnosti, mapu s použitím reštrikčných enzýmov a reťazce nukleotidov a aminokyselín, výsledky boli uvedené napríklad v EP-A 437 378 a EP-A 450 758.

Vyššie uvedený doterajší stav techniky sa zaoberá len jedným hľadiskom vynálezu, to znamená transformáciou kmeňa P. chrysogenum za použitia génov na expresiu enzýmu expandázy alebo enzýmu expandázy/hydroxylázy, opisuje sa aj pokus na dosiahnutie expresie týchto enzýmov. V doterajšom stave techniky sa však opisuje len použitie enzýmov, ktorých expresia bola dosiahnutá na expanziu kruhu v prípade penicilínu N, avšak nie v prípade penicilínu G a V. Avšak aj v opísanom prípade má penicilín N v polohe 7 bočný reťazec, ktorý nie je možné odštiepiť enzymatickým spôsobom tak, aby v tejto polohe bola zvyšná voľná aminokyselina. Vynález je však založený na prekvapujúcom zistení, že adipoylový bočný reťazec môže byť za použitia kmeňa P. chrysogenum účinne naviazaný, že je možné použiť enzým expandázu, ktorého expresia sa dosahuje in situ na expanziu kruhu v získanej zlúčenine za vzniku adipoyl-7-ADCA, že enzýmy hydroxyláza a acetyltransferáza, ktorých expresia sa taktiež dosahuje in situ, je možné využiť na získanie 3-acetoxymetylového bočného reťazca 7-ACA za použitia adipoyl-7-ADCA ako substrátu a že je potom možné účinne odštiepiť adipoylový bočný reťazec pôsobením ďalšieho enzýmu za vzniku 7-ACA. Aj keď teda je možné v doterajšom stave techniky nájsť rôzne izolované fragmenty poznatkov, ktoré sú základom spôsobu podľa vynálezu, až dosiaľ nebolo nikdy navrhované, že by tieto poznatky bolo možné spojiť na dosiahnutie neočakávaných výsledkov, ktoré je spôsobom podľa vynálezu možné dosiahnuť.

Napríklad výroba kyseliny 6-adipoylpenicilanovej je známa napríklad z publikácie Ballio A. a ďalší, Náture, 1960, L85, 97 až 99. Enzymatická expanzia kyseliny 6-adipoylpenicilanovej , avšak len in vitro je taktiež známa napríklad z publikácie Baldwin a ďalší, Tetrahedron, 1987, 43, 3009 až 3014 a EP-A 268 343. Konečne enzymatické odštiepenie adipoylového bočného reťazca je taktiež známe napríklad z publikácie Matsuda a ďalší, J. Bact., 1987, 169, 5815 až 5820.

Adipoylový bočný reťazec má nasledujúcu štruktúru: COOH-(CH₂)4-CO-, existujú ešte dva ďalšie štruktúrne príbuzné bočné reťazce a to glutarylový reťazec so štruktúrou COOH-(CH₂)3-CO- a (D)-alfa-aminoadipoylový reťazec so štruktúrou COOH-CH(NH₂)-(CH₂)3-CO-. Enzymatické odštiepenie glutarylového bočného reťazca je známe a bolo opísané napríklad v publikácii Shibuya a ďalší, Agric. Biol. Chem., 1981, 45, 1561 až 1567 a US 3 960 662, ďalej Matsuda a Komatsu, J. Bact., 1985, 163, 1222 až 1228, Matsuda a ďalší, J.,Bact., 1987, 169, 5815 až 5820, japonský patentový spis 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.) a japonský patentový spis 52-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.). Tiež

ΕΡ-Α 453 048 opisuje spôsob na zlepšenie účinnosti odštiepenia adipoylového reťazca za použitia enzýmu gluotarylacylázy, produkovanej Pseudomonas SY-77-1. Pri náhrade rôznych aminokyselín v určitých polohách v alfa-podjednotke, bolo možné dosiahnuť 3x až 5x vyššiu rýchlosť odštiepenia adipoylovej skupiny z adipoylserínu. Je nutné uviesť, že v EP-A 453 048 sa zjavne opisuje acyláza so zlepšenou účinnosťou k adipoylovým bočným reťazcom, v žiadnom prípade sa neopisuje chemický ani biologický postup, obdobný spôsobu podľa vynálezu, predovšetkým taký, ktorým by bolo možné vytvoriť adipoylcefalosporín.

V prípade, že je prítomný (D)-alfa-aminoadipoylový bočný reťazec, je známe najprv enzymaticky odštiepiť aminoskupinu a skrátiť tento bočný reťazec oxidázou (D)-aminokyselín, takže zostáva glutarylový bočný reťazec GL-7 a tento reťazec sa potom odstráni ďalším enzýmom glutarylacylázou. Takýto postup s dvoma stupňami je opísaný v Maťsuda, US 3 960 662, EP-A 275 901, japonský patentový spis 61-218057 (1988

- Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.), VO 90/12110 (1990

- Vong, Biopure Corp.) a EP-A 436 355, Isogai a ďalší,

Bio/Technology, 1991, 9, 188 až 191.

Je tiež známe uskutočniť v jednom stupni odštiepenie (D)-alfa-aminoadipoylového bočného reťazca, zvlášť za použitia rekombinačnej techniky. Tento postup je opísaný napríklad v nasledujúcich publikáciách:

Odštiepenie (D)-alfa-aminoadipoylového reťazca v jednom stupni:

- Jap. 53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188),

- Jap. 52-143289 (= US 4 141 790, Meiji, Aspergillus sp.),

- US 4 774 179 (Asj i 1988, Pseudomonas sp. SE-83 a SE-495), = Jap. 61-21097 a Jap. 61-152286,

- Fr. pat. 2 241 557 (Aries 1975, Bacillus cereus var.

fluorescens), !

- Jap. 52-082891 (Toyo Jožo 1977, Bacillus megaterium NRRL B 5385) ,

- EP-A 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, gamma-glutamyltranspeptidáza),

- EP-A 322 032, EP-A 405 846 a US 5 104 800 (Merck, Bacillus mega-terium) ,

- EP-A 283 218 a US 4 981 789 (Merck, Arthrobacter viscosus).

Rekombinačný postup v jednom stupni: Ceph C - 7-ACA:

- Jap. 60-110292 (Asahi 1985, Comamonas, rekombinačný kmeň E. coli s génom z Comamonas sp. SY-77-1, premena v jednom stupni),

- Jap. 61-152-286 (Asahi 1986, Pseudomonas, rekombinačný kmeň E. coli s génom z Pseudomonas sp. SE83, sú opísané genetické reťazce, postup v jednom stupni už bol uvedený v US 4 774 179),

- Jap. 63-74488 (Asahi 1988, Trigonopsis variabilis, Comamonas, rekombinačný E. coli, expresia oxidázy D-aminokyseliny a acylázy GL-7-ACA ako genetickej konštrukcie),

- EP-A-475 652 (Fujisawa, acyláza cefalosporínu C a jej výroba rekombinačnou technológiou).

V danej oblasti techniky sú taktiež opísané rôzne spôsoby na výrobu 7-ADAC, napríklad v publikáciách US 3 304 236 a 3 972 774 (Eli Lilly a Co.), EP-A 454 478 (Shionogi a Co., Ltd.) a vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 04 53 499 (Shionogi a Co., Ltd.).

Odkaz na súčasne prejednávanú patentovú prihlášku

V tejto súvislosti je potrebné upozorniť na súčasne prejednávanú US patentovú prihlášku č. 07/933469, podanú 28. augusta 1992, v ktorej sa opisuje biologický postup na výrobu 17-ADCA, spočívajúci v expresii enzýmu expandázy v transformovanom P. chrysogenum a celý biologický postup na výrobu 7-ADAC a 7-ACA, tak ako je opísaný v predmetnej prihláške. Avšak biologický postup v predmetnej prihláške spočíva ešte v ďalších transformáciách na expresiu ďalších enzýmov tak, že je nakoniec dosiahnutý celkom odlišný rekombinačný metabolický postup, vedúci k odlišným výsledným produktom, z ktorých žiadny nie je v uvedenej prihláške opísaný.

Aby bolo možné zaistiť lepšie porozumenie spôsobu podľa vynálezu v súvislosti s vyššie opísanými postupmi, ktoré boli uvedené v známom stave techniky, sú ďalej uvedené rôzne stupne metabolických postupov, ktoré môžu viesť k získaniu adipoyl-6-ΑΡΑ, adipoyl-7-ADCA, adipoyl-7-ACA, opísané sú taktiež medziprodukty a enzýmy, ktorými je možné transformáciu uskutočniť.

Kyselina L-alfa-aminoadipová + L-cysteín + L-valín

ACV syntetáza

II

KDOC

LLD-ACV syntetáza izopenicilínu N (IPNS)

izopenicilín N (IPN) amidolyáza IPN. acyl CoA: 6-APA acyltransferáza fenylacetyl CoA

penicilín G

izopenicilín N (IPN) empimeráza IPN fenylacetyl CoA

CD)

penicilín N expandáza penicilínu N

kyselina desacetoxycefalosporanová

desacetyl cefalosporanová (DAC) acetyltransferáza DAC

CD)

CEFALOSPORÍN C

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanovej, 7-ADAC, ktorý spočíva v tom, že sa

1) v živnom prostredí, vhodnom pre jeho rast udržuje kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N a k živnému prostrediu sa pridáva adipát, obsahujúci jednu alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová, jej soli a jej estery, ktoré sú kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané na výrobu kyseliny adipoyl-6-aminopenicilanovej , adipoyl-6-ΑΡΑ, za vzniku tejto kyseliny, potom sa

2) vykonávajú in situ expresiou zodpovedajúceho génu nasledujúce enzymatické premeny:

a) je expandovaný in situ kruh adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodesacetoxycefalosporanovej, adipoyl-7-ADCA pôsobením enzýmu expandázy, pričom kmeň P. chrysogenum je predbežne transformovaný kódovou DNA pre enzým expandázu, schopný pôsobiť na adipoyl-6-ΑΡΑ ako na substrát, výsledkom tejto expresie je expanzia kruhu adipoyl-6-APA in situ za vzniku adipoyl-7-ADCA,

b) 3-metylový bočný reťazec adipoyl-7-ADCA je in situ hydroxylovaný za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporanovej, adipoyl-7-ADAC pôsobením hydroxylázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predbežne transformovaný kódovou DNA pre tento enzým hydroxylázu, schopný pôsobiť na adipoyl-7-ADCA ako na substrát, výsledkom tejto expresie je hydroxylácia adipoyl-7-ADCA za vzniku adipoyl-7-ADAC a

3) adipoyl-7-ADAC sa uvedie do styku s adipoylamidázou, čím dôjde k odstráneniu bočného reťazca za vzniku 7-ADAC; ktorá sa izoluje.

Podstatu vynálezu tvorí aj biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminocefalosporanovej, 7-ACA, ktorý spočíva v tom, že sa

1) v živnom prostredí, vhodnom pre jeho rast pestuje kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N a k živnému prostrediu sa pridáva adipát, obsahujúci jednu alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová, jej soli alebo jej estery, ktoré sú kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané na výrobu kyseliny adipoyl-6-aminopenicilanovej, adipoyl-6-ΑΡΑ, za vzniku tejto kyseliny, potom sa

2) vykonávajú in situ expresiou zodpovedajúceho génu nasledujúce enzymatické premeny:

a) je expandovaný in situ kruh adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodesacetóxycefalosporanovej, adipoyl-7-ADCA pôsobením enzýmu expandázy, pričom kmeň P. chrysogenum je predbežne transformovaný kódovou DNA pre enzým expandázu, schopný pôsobiť na adipoyl-6-APA ako na substrát, výsledkom tejto expresie je expanzia kruhu adipoyl-6-APA za vzniku adipoyl-7-ADCA,

b) 3-metylový bočný reťazec adipoyl-7-ADCA je in situ hydroxylovaný za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporanovej, adipoyl-7-ADAC pôsobením hydroxylázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predbežne transformovaný kódovou DNA pre tento enzým, schopný pôsobiť na adipoyl-7-ADCA ako na substrát, výsledkom tejto expresie je hydroxylácia adipoyl-7-ADCA za vzniku adipoyl-7-ADAC a

c) adipoyl-7-ADAC sa in situ acetyluje za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminocefalosporanovej, adipoyl-7-ACA pôsobením enzýmu acetyltransferázy, pričom uvedený kmeň P. chrysogenum bol predbežne transformovaný kódovou DNA pre enzým acetyltransferázu, schopný pôsobiť na adipoyl-7-ADAC ako substrát, v dôsledku tejto expresie dochádza k acetylácii adipoyl-7-ADAC, produkovanej týmto kmeňom, in situ za vzniku adipoyl-7-ÄCA a

3) adipoyl-7-ACA sa uvedie do styku s adipoylamidázou, čím dôjde k odstráneniu adipoylového bočného reťazca za vzniku 7-ACA, ktorá sa izoluje.

Jednotlivé pojmy, tak ako boli vyššie použité, majú nasleduj úci význam:

7-ACA je kyselina 3-[(acetoyloxy)metyl]-7-amino-8-oxo-5tia-l-azabicyklo[4.2.0]okt-2-en-2-karboxylová, adipoyl-6-APA je kyselina [2S-(2alfa,5alfa,6beta)]-3,3-dimetyl-7-oxo-6- [ (hexán-1,6-dioyl) amino] -4-tia-l-azabicyklo[3.2.0]heptán-2-karboxylová, adipoyl-7-ADCA je kyselina 3-metyl-7-[(hexán-1,6-dioyl)amino] -3-metyl-8-oxo-5-tia-l-azabicyklo[4.2.0] okt-2-en-2karboxylová a adipoyl-7-ADAC je kyselina 3-hydroxymetyl-7-[(hexán-1,6dioyl) amino] -3-metyl-8-oxo -5-tia-l-azabicyklo[4.2.0] okt-2en-2-karboxylová.

Vynález sa zvlášť týka nových biologických postupov na prípravu kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanovej, 7-ADAC a kyseliny 7-am.inocefalosporínovej , 7-ACA, tak ako boli vyššie uvedené, v týchto postupoch sa ako adipát s výhodou použije disodná soľ kyseliny adipovej a DNA, ktorá obsahuje kódový reťazec pre enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu sa vo všetkých troch prípadoch odvodí od Cephalosporium acremonium, reťazec pre adipoylacylázu je odvodený od čeľade Pseudomonas.

Podstatu vynálezu tvoria aj vektory na expresiu, ktoré obsahujú kódovú DNA pre enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu, odvodené od Cephalosporium acremonium a promótory, ktoré riadia expresiu génov pre tieto enzýmy, vektor obsahuje plazmidy pPEN/CEPH-1, pPENCACT a pTS-8, ako bude ďalej vysvetlené.

Podstatu vynálezu tvoria aj hostiteľské bunky Penicillium chrysogenum, transformované vektory na expresiu rekombinačnej DNA pre enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu, odvodené od Cephalosporium acremonium a promótor, riadiaci expresiu tejto DNA s obsahom promótora génu IPNS Penicillium chrysogenum. Vynález sa zvlášť týka hostiteľských buniek Penicillium chrysogenum, transformovaných vektorom na expresiu rekombinačnej DNA s obsahom plazmidov pPEN/CEPH-1, pPenCACT a pTS-8, ako bude ďalej opísané.

Podstatu vynálezu tvorí aj spôsob pestovania rekombinačných hostiteľských buniek Penicillium chrysogenum za podmienok, vhodných ne expresiu génu, pričom uvedené rekombinačné hostiteľské bunky obsahujú vektory na expresiu rekombinačnej DNA, ktoré obsahujú kódovú DNA pre enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu, odvodené od Cephalosporium acremonium a promótor, riadiaci expresiu tejto kódovej DNA pre uvedené enzýmy s obsahom promótora génu IPNS Penicillium chrysogenum. Vynález sa zvlášť týka spôsobu pestovania rekombinačných hostiteľských buniek Penicillium chrysogenum za podmienok, vhodných na expresiu génu, pričom rekombinačné hostiteľské bunky obsahujú vektory na expresiu rekombinačnej DNA s obsahom plazmidov pPEN/CEPH-1, pPenCACT a pTS-8, ako bude ďalej opísané.

Podrobnejší opis výhodných uskutočnení

V jednom z výhodných uskutočnení sa vynález týka nového biologického postupu na výrobu kyseliny 7-aminocefalosporanovej 7-ACA a kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanovej, ide o kľúčové produkty na výrobu bežných syntetických cefalosporínov a je možné ich vyjadriť pomocou nasledujúcich štruktúrnych vzorcov:

COOH COOH

Okrem cefalosporínového jadra je význačnou vlastnosťou 7-ACA jej 7-aminoskupina a jej 3-acetyloxymetylová skupina, často uvádzaná ako 3-acetoxymetylová skupina. 7-aminoskupina je skupina, ktorú je možné previesť na veľký počet rôznych ďalších cefalosporínov. 3-acetyloxymetylová skupina sa taktiež často prevádza na iný bočný reťazec za vzniku bežných cefalosporínov.

7-ACA ako výsledný produkt a adipoyl-7-ACA ako medziprodukt spôsobu podlá vynálezu je možné uviesť do kontrastu s cefalosporínom C, iným klúčovým medziproduktom pri výrobe cefalosporínu, ktorý je možné vyjadriť nasledujúcim štruktúrnym vzorcom

V prípade tohto medziproduktu nie je 7-(D)-alfa-aminoadipoylový bočný reťazec vhodný pre ďalšie syntetické manipulácie a musí byť odštiepený za vzniku požadovanej a prijateľnej 7-aminoskupiny. Nanešťastie je odstránenie uvedeného reťazca veľmi ťažké, a to tak chemickým, ako aj biochemickým spôsobom.

Vysvetlenie skratiek

V priebehu opisu, zvlášť pri opise výhodných uskutočnení sú použité niektoré skratky, ktoré majú nasledujúci význam :

7-ACA

7-ADCA

6-APA

DAOC

DAOCS

DAC

DACS

IPNS

Tris

EDTA

DEPC

TE

SSC

SDS

PEG kyselina 7-aminocefalosporanová kyselina 7-aminodesacetoxycefalosporanová kyselina 6-aminopenicilanovej kyselina desacetoxycefalosporanová DAOC-syntetáza deacetylcefalosporín C

DAC syntetáza izopenicilín N syntetáza tris/hydroxymetyl/aminometán kyselina etyléndiamíntetraoctová dietylpyrokarbonát pufer tris/EDTA chlorid sodný a citrát sodný v zmesi ako pufer dodecylsíran sodný polyetylénglykol.

Kultúra

Penicillium chrysogenum

V prvom stupni spôsobu podľa vynálezu sa udržuje v živnom prostredí, schopnom udržať jeho rast kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N, pričom sa k živnému prostrediu pridáva adipát, tvorený kyselinou adipovou, jej soľami a jej estermi v akejkoľvek zmesi, tieto látky sú kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané za vzniku adipoyl-6-ΑΡΑ. Adipát je možné k živnému prostrediu pridávať po jeho naočkovaní P. chrysogenom, avšak s výhodou je tento materiál v živnom prostredí už prítomný v okamžiku očkovania.

Aj iné rody než Penicillium, napríklad Aspergillus nidulans a tiež iné organizmy z rodu Penicillium okrem čela22 de chrysogenum produkujú izopenicilín N. Avšak historicky boli známym spôsobom na šľachtenie kmeňov vyvinuté kmene s najväčšou produkciou izopenicilinu N práve z čeľade chrysogenum. Z tohto praktického dôvodu je vynález spájaný s kmeňom Penicillium chrysogenum, hoci jeho použiteľnosť v prípade iných čeľadí je zrejmá. Akýkoľvek už uložený kmeň Penicillium chrysogenum alebo akýkoľvek iný verejne dostupný zdroj takéhoto kmeňa je vhodným východiskovým materiálom na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu.

Živné prostredie, schopné udržovať rast kmeňa Penicillium chrysogenum, produkujúceho izopenicilín N je bežného typu, tak ako sú tieto prostredia v danej oblasti techniky známe. Je napríklad možné použiť aeróbnu submerznú fermentáciu a živné prostredie vybrať z radu dostupných vhodných prostredí. Typické prostredia obsahujú zdroje uhlíka, ako sú sacharóza, glukóza a škrob, zdroje dusíka, napríklad sójovú múku alebo drvinu, olej z bavlníkových semien, arašidovú múku, rôzne aminokyseliny, ich zmesi a peptóny. Požiadavky na produkciu sú najmä vysoký výťažok a ľahkosť izolácie a výhodným prostredím pre toto použitie môže preto byť napríklad melasa ako zdroj uhlíka a sójová múka a aminokyseliny, ako zdroje dusíka.

K živnému prostrediu sa bežne pridávajú anorganické živné soli, ktoré dodávajú vo forme iónov nasledujúce zložky: sodík, draslík, amónny ión, vápnik, fosfát, sulfát, chlorid, bromid, dusičnan, uhličitan, železité a železnaté ióny, horčík, mangán a podobne. Pre rast, vývoj a metabolizmus Penicillium chrysogenum sú zvyčajne podstatné aj stopové prvky, ktoré je taktiež možné priamo pridávať do živného prostredia, pokiaľ už nie sú prítomné ako znečisteniny iných zložiek živného prostredia.

Kmene Penicillium chrysogenum môžu byť pestované v zariadení s malým objemom, napríklad v trepacích fľašiach s objemom 1 liter tam, kde je potrebné získať len malé množ23 stvá adipoyl-7-ACA a prípadne 7-ACA. V prípade, že je žiaduce získať väčšie množstvo adipoyl-7-ACA, je však nutné použiť fermentačné tanky na fermentáciu vo väčšom meradle, zvyčajne pri submerznej aeróbnej fermentácii.

Na prípravu adipoyl-7-ACA vo veľkom meradle sa spory Penicillium chrysogenum udržujú na šikmom agare. Tieto spory zo šikmého agaru sa potom použijú na naočkovanie vegetatívneho živného prostredia s malým objemom. Vegetatívne prostredie sa inkubuje za vzniku intenzívne rastúcej čerstvej kultúry mikroorganizmu. Táto kultúra vo vegetatívnej rastovej fáze sa potom použije na naočkovanie veľkého množstva živného prostredia vo fermentačnej produkčnej fáze. V niektorých prípadoch môže byť žiaduce založiť ešte ďalšiu vegetatívnu kultúru ako očkovací materiál pre fermentačné prostredie. Takýto druhý stupeň vegetatívneho živného prostredia sa bežne používa v prípade, že objem fermentačného prostredia je podstatne väčší než objem prvého vegetatívneho prostredia. Postupuje sa teda tak, že sa spory mikroorganizmu najskôr pestujú v malom vegetatívnom prostredí za získania očkovacieho materiálu pre väčší objem vegetatívneho prostredia. V tomto vegetatívnom prostredí s väčším objemom je potom možné dosiahnuť dostatočnú koncentráciu mikroorganizmu na rýchle zahájenie fermentácie vo veľkom meradle vo fermentačnom tanku. Vegetatívne prostredie môže mať rovnaké zloženie ako fermentačné prostredie alebo môže obsahovať ešte ďalšie zložky na podporu rastu a vývoja mikroorganizmu v malom meradle.

Kmene Penicillium chrysogenum, používané na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu sa najúčinnejšie pestujú pri teplotách v rozmedzí 20 až 30 °C, optimálne výťažky je možné dosiahnuť pri teplote 22 až 28 °C a zvlášť 25 °C.

K maximálnej produkcii adipoyl-7-ACA dochádza pri pestovaní kmeňa Penicillium chrysogenum v tanku s veľkým objemom po dobu 10 až 30, s výhodou 15 až 25 dní. Avšak pri pes24 tovaní v zariadení s menším objemom, napríklad v trepacích fľašiach s objemom 250 ml je rast mikroorganizmu rýchlejší a organizmus produkuje adipoyl-7-ACA v kratšej dobe, napríklad v rozmedzí 4 až 15 dní, často 5 až 7 dní.

V prípade, že konečná hodnota pH pri fermentácii v tanku vo veľkom meradle dosiahne 8,0 alebo ešte vyššiu hodnotu, môže byť nepriaznivo ovplyvnený výťažok adipoyl-7-ACA. V takomto prípade je žiaduce v priebehu fermentácie sledovať pH živného prostredia. V prípade, že sa ukáže, že pH dosiahne uvedené hodnoty pred dosiahnutím maximálnej produkcie adipoyl-7-ACA, je nutné hodnotu pH upraviť pridaním vhodnej kyseliny alebo pufra do fermentačného prostredia.

Produkciu adipoyl-7-ACA je možné sledovať tak, že sa vzorky fermentačného prostredia chromatografujú.

Tak ako tomu je vo väčšine prípadov aeróbnej fermentácie, necháva sa živným prostredím prechádzať sterilný vzduch na dosiahnutie účinnejšieho rastu kmeňa Penicillium chrysogenum a zvýšenej produkcie adipoyl-7-ACA. Objem vzduchu, ktorý prechádza živným prostredím je zvyčajne aspoň 0,2 objemu vzduchu za minútu na jeden objem živného prostredia. Zvýšenie rýchlosti prechodu vzduchu však môže mať často priaznivý vplyv na rýchlosť produkcie adipoyl-7-ACA.

Kmeň Penicillium chrysogenum bude typicky produkovať okrem adipoyl-7-ACA rad vedľajších produktov a metabolitov. Vzhľadom na to, že niektoré z týchto zlúčenín sú labilné v kyslom prostredí, je žiaduce pri izolácii adipoyl-7-ACA z fermentačného prostredia postupovať tak, že sa na celé fermentačné prostredie pôsobí krátku dobu kyslým pH tak, aby došlo k rozkladu aspoň niektorých súčasne produkovaných nečistôt. Fermentačný produkt, adipoyl-7-ACA sa potom z filtrovaného takto spracovaného fermentačného prostredia oddelí a prípadne je túto látku možné oddeliť od ďalších zložiek fermentačného prostredia chromatografiou na ionomeničovej živici a v prípade potreby je možné produkt ďalej čistiť pred následným enzymatickým odštiepením adipoylového bočného reťazca. Delenie chromatografiou na ionomeniči je možné uskutočniť tiež až po odštiepení bočného reťazca. Jedným z hlavných vedľajších produktov, ktoré spôsobujú ťažkosti pri izolácii, je adipoyl-6-ΑΡΑ, tento vedľajší produkt je možné chemicky alebo enzymaticky rozložiť tak, aby oddeľovanie bolo ľahšie. Na začiatku je možné filtrát fermentačného prostredia predbežne čistiť, čo môže zahrňovať počiatočnú extrakciu, organickým rozpúšťadlom, nemiešateľným s vodou, ako je n-butanol alebo amylacetát na odstránenie nečistôt. Extrahované živné prostredie je potom možné ďalej čistiť predbežnou chromatografiou na aktivovanom uhlí.

Pridávanie adipátu

V dobe, kedy je fermentačná kultúra Penicillium chrysogenum pripravená, to znamená pred naočkovaním sa s výhodou k ostatným zložkám fermentačného živného prostredia pridá ako substrát adipát. Adipát je prípadne možné pridávať aj určitú dobu po naočkovaní fermentačného prostredia, napríklad 1, 2 a/alebo 3 dni po naočkovaní. Adipát je definovaný ako jedna alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová alebo soli alebo estery kyseliny adipovej, ktoré môžu byť asimilované a využívané pestovaným kmeňom Penicillium chrysogenum za vzniku adipoyl-6-ΑΡΑ. Kyselinu adipovú, jej soli a jej estery je možné použiť jednotlivo alebo v ake j kolvek kombinácii. Výhodná je disodná soľ, avšak použiť je možné aj draselnú soľ a zmesné soli so sodíkom. Použiteľný je metylester uvedenej kyseliny, avšak etylester je vo vode nerozpustný. Soľ kyseliny adipovej alebo jej ester musí byť taký, aby mohol byť kmeňom Penicillium chrysogenum asimilovaný a využívaný na produkciu adipoyl-6-ΑΡΑ. Je možné použiť kyselinu adipovú ako takú, hoci je vo vode nerozpustná, v prípade, že sa za vhodných podmienok pH vytvára asimilovatelná soľ.

Vhodné enzýmy expandáza a/alebo hydroxyláza.

Kmeň Penicillium chrysogenum, ktorý bol pestovaný a ktorý je schopný spracovávať vyššie uvedený adipát tak, aby bol získaný produkt adipoyl-6-APA, môže byť tiež taký kmeň, ktorý bol transformovaný pomocou kódovej DNA pre enzýmy expandázu a hydroxylázu tak, že v dôsledku tejto expresie dochádza k expanzii kruhu v získanom produkte adipoyl-6-ΑΡΑ in situ za vzniku adipoyl-7-ADCA a súčasne tiež dochádza k premene 3-metylového bočného reťazca na 3-hydroxymetylový reťazec.

Adipoyl-6-APA sa tvorí vnútrobunkovo pri fermentácii Penicillium chrysogenum, pestovaného v prítomnosti adipátu. Pri tejto fermentácii dochádza u transformovaného kmeňa Penicillium chrysogenum in situ tiež k expresii kódovej DNA pre enzýmy expandázu a hydroxylázu a tieto enzýmy spracovávajú adipoyl-6-APA ako substrát, takže dochádza k expanzii kruhu za vzniku adipoyl-7-ADCA a tento produkt je potom hydroxylovaný na adipoyl-7-ADCA, to znamená na kyselinu adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporanovú.

Nový biologický spôsob podlá vynálezu v sebe zahrňuje aj premenu kmeňa Penicillium chrysogenum vyššie uvedeného typu transformáciou za použitia akejkoľvek kódovej DNA pre enzýmy expandázu a hydroxylázu, v dôsledku tejto expresie dochádza in situ k expanzii kruhu v adipoyl-6-APA za vzniku adipoyl-7-ADCA a potom v dôsledku hydroxylácie dochádza k vzniku adipoyl-7-ADAC. To znamená, že pri expresii DNA, ktorá sa použije na transformáciu použitého kmeňa Penicillium chrysogenum musí dochádzať k tvorbe enzýmov, ktoré nielen majú účinnosť enzýmu expandázy, tak ako už bolo opísané v známom stave techniky, to znamená schopnosť expanzie kruhu izopenicilínu N na DAOC, ale tiež schopnosť expandovať kruh adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku adipoyl-7-ADCA. Okrem toho musí byť enzým hydroxyláza, ktorý sa tvorí v dôsledku expresie DNA, použitej na transformáciu, schopný spôsobiť hydroxylá27 ciu adipoyl-7-ADCA na požadovanú adipoyl-7-ADAC.

Pokial ide o zaistenie účinnosti enzýmu expandázy a hydroxylázy, je možné v rámci spôsobu podlá vynálezu použiť dve rôzne uskutočnenia. V jednom z týchto uskutočnení, ktoré je výhodným uskutočnením, je možné zaistiť funkcie enzýmov expamdázy a hydroxylázy pomocou jediného, v podstate bifunkčného génu kmeňa Cephalosporium acremonium, ktorým sa transformuje P. chrysogenum. Tento gén, v dôsledku ktorého expresie dochádza spoločne k tvorbe expandázy a hydroxylázy bude ďalej označovaný ako gén pre expandázu/hydroxylázu podlá svojho produktu, ktorým sú enzýmy expandáza a hydroxyláza. V prípade transformácie P. chrysogenum pri použití kódovej DNA z C. acremonium pre enzýmy expandázu a hydroxylázu bude v typických prípadoch expresia uvedenej DNA riadená jediným promótorom, čo je ukazovatelom toho, že prítomný je len jeden gén.

V ďalšom možnom uskutočnení, ktoré je taktiež vhodným uskutočnením, dochádza k transformácii P. chrysogenum ako hostiteľského kmeňa za použitia kódovej DNA pre enzýmy expandázu a hydroxylázu vo forme dvoch odlišných génov na rozdiel od uskutočnenia, kedy je pre oba enzýmy použitý jediný gén. Je nutné uviesť, že oddelené gény pre enzýmy expandázu a hydroxylázu je možné nájsť v prokaryotických mikroorganizmoch, napríklad u S. clavuligerus a nie v eukaryotických mikroorganizmoch, ako je C. acremonium, kde je prítomný jediný gén pre oba enzýmy, ako už bolo uvedené vyššie .

Reťazec enzýmu hydroxylázy a prokaryotických organizmov a príslušnej kódovej nukleotidy boli opísané v publikácii Kovacevic a ďalší, J. Bacteriol., 173(1), 398 až 400, 1991 a EP-A 465 189, opísané sú tiež spôsoby izoláciu týchto enzýmov. Ako je v danej dostatočne známe, je na základe reťazca pre hydroxylázu možno syntetizovať laboratórnym spôsobom alebo na automatických a prostriedky na oblasti techniky syntetizátoroch DNA celú kódovú DNA pre enzým hydroxylázu. Túto DNA alebo obdobné reťazce, ktoré sú kódovými reťazcami pre rovnaký reťazec aminokyselín hydroxylázy alebo pre fragmenty alebo deriváty tohto reťazca so zodpovedajúcou hydroxylázovou účinnosťou je možné použiť ako základ na prípravu rôznych vektorov na klonovanie a na expresiu po kombinácii s promótorom a s ďalšími riadiacimi reťazcami, celú konštrukciu je potom možné použiť na transformáciu P. chrysogenum ako hostiteľského organizmu, v ktorom potom dochádza k expresii génu pre hydroxylázu, pomocou ktorého je teda možné uskutočniť spôsob podľa vynálezu. Je tiež možné postupovať tak, že sa DNA použije ako sonda na sériové vyšetrenie knižnice genómu určitého kmeňa, ktorý potenciálne obsahuje použiteľný enzým hydroxylázu a týmto spôsobom sa identifikuje na základe hybridizácie príslušný homológny reťazec. Účinnosť akéhokolvek takto identifikovaného enzýmu hydroxylázy je potom možné potvrdiť za použitia adipoyl-7-ADCA ako substrátu pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu s následnou izoláciou získaných produktov tejto hydroxylácie pomocou HPLC.

V prípade, že sa použije toto uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu, to znamená expresia génu, ktorý produkuje len enzým hydroxylázu, bude potom potrebné taktiež oddelene použiť ďalšiu DNA s kódovým reťazcom pre enzým expandázu, takže bude možné transformovať P. chrysogenum vhodným vektorom na expresiu, ktorý zaistí in situ expresiu génu pre enzým expandázu, takže dochádza k expanzii kruhu pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu.

Ďalšie výhodné uskutočnenia spôsobu podlá vynálezu sú založené na skutočnosti, že na transformáciu nerekombinačného kmeňa P. chrysogenum je možné použiť DNA, ktorá obsahuje kódový reťazec pre viac než jednu expandázu a/alebo pre viac než jednu hydroxylázu. V priebehu týchto uskutočnení¹ j e potom možné získať zvýšenú účinnosť typu expandázy ä/alebo hydroxylázy vzhľadom na zvýšené množstvo bielkoviny enzýmu, k expresii ktorého dochádza.

V odstavcoch, týkajúcich sa známeho stavu techniky už bolo uvedené, že bol plne analyzovaný reťazec enzýmu expandázy, odvodeného od kmeňa Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a že tento reťazec bol charakterizovaný na základe mapy pôsobenia reštrikčných endonukleáz. Avšak boli taktiež podané správy o enzýme, ktorý sa zdal byť totožným enzýmom a bol odvodený od S. clavuligerus NRRL 3585. U tohoto enzýmu bola zistená odlišná molekulová hmotnosť, avšak reťazec enzýmu dosial nebol analyzovaný. Vo vyššie uvedených odstavcoch pre známy stav techniky je taktiež opísané, že bol analyzovaný reťazec enzýmu DAOCS/DACS z Cephalosporium acremonium ATCC 11550, ako je uvedené v Samson a ďalší, Bio/Technology (1987) 5 : 1207 až 1214 a v EP-A 281 391.

Tieto expandázy, ktoré už boli identifikované a tvoria súčasť známeho stavu techniky, je taktiež možné použiť pri uskutočňovaní nového biologického postupu podlá vynálezu. Môže sa ukázať, že aj iné expandázy, ktoré dosiaľ neboli identifikované a môžu byť odvodené od odlišných kmeňov S. clavuligerus alebo C. acremonium alebo dokonca od mikroorganizmov celkom odlišných rodov, môžu byť taktiež vhodné na uskutočnenie nového spôsobu podľa vynálezu. Spôsoby identifikácie takýchto nových kmeňov a rodov vhodných mikroorganizmov a spôsobmi izolácie zodpovedajúcich enzýmov typu expandázy, ako ak zistenie, či tieto enzýmy sú vhodné na použitie pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu patria do bežnej praxe v danej oblasti techniky. Sériové vyšetrenie bezbunkových extraktov prípadných nových kmeňov a rodov použiteľných mikroorganizmov je možné uskutočniť pomerne pohodlným a reprodukovateľným spôsobom tak, že sa tieto extrakty pridajú k adipoyl-6-APA ako substrátu v prítomnosti známych kofaktorov DAOCS, ako sú železnaté ióny, askorbát, alfa-ketoglutarát a adenozíntrifosfát, ATP. Adipoyl-6-ATA je možné v dostatočnom množstve pripraviť pridávaním adipátu ako substrátu k netransformovanému Penicillium chrysogenum spôsobom, ktorý bude ďalej podrobnejšie opísaný. Požadovaná expandáza alebo expandáza aj hydroxyláza sú prítomné v tom prípade, že sa začne vytvárať adipoyl-7-ADCA a/alebo adipoyl-7-ADAC, prítomnosť týchto látok je možné ľahko dokázať chromatograficky.

Pri použití známej rekombinačnej techniky je tiež možné vytvoriť sondy DNA na báze nukleotidových reťazcov génov pre expandázy napríklad z S. clavuligerus a C. acremonium, napríklad na zistenie obsahu DNA vo vyšetrovaných mikroorganizmoch, ktoré by mohli produkovať expandázu, vhodnú na použitie pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu.

Potenciálne zdroje expandázy, hydroxylázy alebo expandázy/hydroxylázy

Expandázy, ako už bolo uvedené, sú enzýmy, ktoré katalyzujú expanziu penamového kruhu, ktorý sa nachádza v molekulách typu penicilínu na cef-3-emový kruh, ktorý sa nachádza v cefalosporínoch. Akýkoľvek organizmus, produkujúci metabolity s obsahom cefemového kruhu je teda potenciálnym zdrojom kódovej DNA pre expandázu. Taktiež akýkoľvek organizmus, ktorý produkuje cefalosporín s obsahom 3-hydroxymetylovej skupiny je potenciálnym zdrojom kódovej DNA pre hydroxylázu alebo expandázu/hydroxylázu. Príklady takýchto organizmov budú ďalej uvedené, ide však len o príklady, ktoré v žiadnom zmysle nie sú vyčerpávajúce.

Huby

Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp.

Emericellopsis

Paecilomyces

Scopulariopsis

Diheterospora '

Spiroidium

Anoxiopsis ,

Aktinomycety

Streptomyces clavuligerus

S. lipmanii

S. wadayamensis

S. todorominensis

S. filipinensis cephamycini

S. heteromorphus

S. panayensis

S. griseus

S. cattleya

Nocardia lactamdurans

Iné baktérie

Flavobacterium sp.

Alcaligenes denitrificans

Mycoplana bullata

Providenc-ia rettgeri

Lysobacter lactamgenus

Expandázy a hydroxylázy, produkované vyššie uvedenými organizmami sú zatiaľ len materiálom pre ďalšie výskumy a je možné, že len niektoré z nich budú skutočne vhodné na použitie pri vykonávaní nového spôsobu podľa vynálezu.

Izolácia kódových fragmentov DNA pre expandázu

Hneď ako bol požadovaný enzým expandáza zistený vyššie uvedeným spôsobom, je možné použiť známe postupy na izoláciu kódovej DNA pre takýto enzým. Je potrebné skonštruovať sondy DNA na báze známych reťazcov a častí reťazcov kódových génov pre expandázy, tieto sondy potom budú hybridizovať s kódovou DNA pre požadovaný enzým, ktorú je nutné izolovať. Konštrukcia takýchto sond je založená na znalosti reťazcov aminokyselín a reťazcov nukleotidových báz, ktoré sú kódovými re32 ťazcami pre enzým expandázu a tiež na preferenciách kodónov u určitých mikroorganizmov. Podrobný opis typického postupu tohto typu, použitého v prípade DNA genónu mikroorganizmu

Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 bude ďalej podrobnejšie opísaný.

Izoláciu kódovej DNA pre enzým expandázu je možné uskutočniť za použitia reštrikcie reštrikčnými enzýmami s následnou spätnou väzbou, tak ako je to dobre známe v technológii na získavanie rekombinačnej DNA. Je potrebné poznať mapu miest pôsobenia reštrikčných endonukleáz genómu použitého mikroorganizmu tak, aby bolo možné oddeliť a izolovať príslušný reštrikčný fragment. Reštrikčné mapy pre S. clavuligerus a C. acremonium sú už dostupné. V prípade prvého mikroorganizmu sa používajú reštrikčné enzýmy Bam Hl a Sal I a elektroforézou sa potom izolujú požadované fragmenty s veľkosťou 1,8 až 2,5 kb.

Zdroje enzýmu acetyltransferázy a izolácia kódových fragmentov DNA pre tento enzým

Klonovanie génov pre DAC acetyltransferázu z C. acremonium je možné uskutočniť podľa dobre známych rekombinačných postupov, ktoré budú teraz všeobecnejšie opísané.

Aby bolo možné klonovať gén pre acetyltransferázu, je najprv nutné vytvoriť mutanty C. acremonium, ktoré nemajú schopnosť premieňať kyselinu deacetylcefalosporanovú, DAC, na cefalosporín C. Tento postup spočíva v tom, že sa bunky kmeňa C acremonium podrobia pôsobeniu mutagénov, napríklad N-nitrozoguanidínu, NTG, kyseliny dusitej alebo ultrafialového svetla, potom sa kmeň pestuje na vhodnom rastovom prostredí a potom sa napríklad chromatografickým alebo biologickým spôsobom sleduje nahromadenie DAC.

Po identifikácii vhodnej mutanty sa v nasledujúcom stupni na identifikáciu kódového génu pre acetyltransferázu izoluje DNA kmeňa C. acremonium, ktorý produkuje cefalosporín C. Po odštiepení pôsobením reštrikčnej endonukleázy alebo mechanickým spôsobom sa získajú fragmenty s vhodnou dĺžkou reťazca a gén sa uloží do vektora pre transformáciu, napríklad plazmidu alebo kozmidu, ktorý tiež obsahuje vhodný dominantný značiaci gén, napríklad gén na odolnosť proti hygromycínu alebo proti fleomycínu. Vektor by mal tiež obsahovať reťazce DNA, ktoré môžu ulahčiť nasledujúcu spätnú izoláciu uloženej DNA, napríklad miesta z fágu lambda, ako oblasť cos, ktorá dovoľuje spätnú izoláciu klonovanej DNA in vitro po infekcii E. coli, postup je možné vykonať známym spôsobom.

Protoplasty mutovaného kmeňa, ktorý pôvodne neprodukoval acetyltransferázu sa potom transformujú za použitia vektora s obsahom statických fragmentov DNA genómu a transformované bunky sa podrobia selekcii podľa odolností proti antibiotikám. Transformované bunky potom je možné sledovať na opätovné získanie schopnosti produkcie cefalosporínu C, čo je ukazovateľom úspešnej komplementácie génom pre acetyltransf erázu, obsiahnutým vo vektore. Mutanty, ktoré pravdepodobne obsahujú klonované kópie génov je potom možné pestovať, ich DNA izolovať a izolovať aj DNA z vektora vyššie uvedeným spôsobom. Skutočnosť, že vektor obsahuje gén pre acetyltransferázu, je možné potvrdiť subklonovaním v E. coli pri použití štandardných postupov a lahko dostupných vektorov s následnou retransformáciou mutanty, ktorá neprodukuje acetyltransferázu. Gén je potom možné izolovať, analyzovať jeho reťazec a prípadne ďalej spracovať tak, ako bude ďalej uvedené v príkladoch uskutočnenia za použitia bežne používaných postupov v molekulárnej genetike.

Podľa ďalších postupov, ktoré sú v danej oblasti techniky tiež známe, je možné napríklad podľa publikácie Matsuda a ďalší, izolovať a analyzovať reťazec kódového génu pre acetyltransferázu z C. acremonium a tiež odvodiť príslušný reťazec aminokyselín enzýmu, ako už bolo opísané v EP-A 450

758. Tieto alternatívne postupy spočívajú v izolácii enzýmu acetyltransferázy, analýze N-terminálneho reťazca aminokyselín a z tejto informácie sa potom odvodí kódový reťazec nukleotidov pre túto časť reťazca celého enzýmu. Na základe tejto informácie je potom možné skonštruovať sondy, ktoré budú hybridizovať na celý kódový reťazec, čo umožní jeho izoláciu.

Transformácia kmeňa Penicillium chrysogenum

Hneď ako sú získané kódové fragmenty DNA pre enzýmy expandázu/hydroxylázu, expandázu a hydroxylázu a tiež pre acetyltransferázu, je možné tieto fragmenty uložiť do plazmidu alebo do iného vektora na expresiu spolu s ďalšími fragmentárni DNA, ktoré obsahujú reťazce promótora, reťazce na aktiváciu translácie, reťazce na odolnosť ako značiace reťazce, riadiace reťazce, reťazce na tvorbu kozmidov a akékoľvek ďalšie reťazce DNA, ktoré dovoľujú alebo môžu uľahčiť transformáciu a napomáhajú expresii produktov génov alebo môžu uľahčiť izoláciu transformovaných buniek. Vektor na expresiu, ktorý bol takto skonštruovaný, je potom možné použiť na transformáciu kmeňa Penicillium chrysogenum a na vnútrobunkovú expresiu enzýmov expandázy/hydroxylázy, expandázy, hýdroxylázy a acetyltransferázy. Postupy, použité na dosiahnutie transformácie a expresie sú v danej oblasti techniky dobre známe a podrobný opis typického postupu na toto použitie bude ďalej uvedený.

Ako už bolo uvedené vyššie, dochádza u transformovaného kmeňa Penicillium chrysogenum k expresii enzýmov expandázy/hydroxylázy, expandázy, hydroxylázy a acetyltransferázy vo vnútri buniek a potom môže in situ dochádzať v substráte, ktorým je adipoyl-6-ΑΡΑ, k expanzii kruhu za vzniku adipoyl-7-ADCA, táto látka je potom hydrolyzovaná na adipoyl-7-ADAC a tento produkt je potom acetylovaný za vzniku výslednej adipoyl-7-ACA.

Nový transformovaný mikroorganizmus

Špecifické transformáty Penicillium chrysogenum, u ktorých dochádza k expresii kódových génov pre enzýmy expandázu/hydroxylázu a expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu, ktoré tvoria výhodné uskutočnenia vynálezu, sú nové, pokiaľ ide o porovnanie s podobnými konštrukciami, ktoré boli už skôr opísané napríklad v publikácii Cantwell a ďalší, 1990, Current Genetics, 17, 213 až 221 a v EP-A 281 391 a EP-A 437 378. Pri konštrukcii podľa Cantwella je gén pre expandázu zo Streptomyces clavuligerus uložený pod riadením promótora P. chrysogenum pre izopenicilín-N-syntetázu, IPNS a tak sa líši od konštrukcie podľa vynálezu tým, že chýba akákoľvek kódová DNA pre enzýmy hydroxylázu alebo acetyltransferázu.

V EP-A 281 391 (Ingolia a ďalší) sa opisujú vektory na transformáciu P. chrysogenum, ktoré obsahujú kódovú DNA pre bifunkčný enzým expandázu/hydroxylázu C. acremonium, expresia sa dosahuje za použitia promótora IPNS z Penicillium.

V jednej z týchto konštrukcií, pPS62, je gén pre expandázu/hydroxylázu napojený v smere expresie génu a v rámci s génom pre hygromycínfosfotransferázu. Produkt génu, ktorým je zložená bielkovina, hygromycínfosfotransferáza spolu s expandázou/hydroxylázou je teda celkom odlišný od produktu spôsobu podľa vynálezu, v ktorom je enzým expandáza/hydroxyláza v podstate totožný s enzýmom, produkovaným v C. acremonium. Ďalší vektor, ktorý bol opísaný v EP-A 281 391 bol skonštruovaný dlhou sériou molekulových manipulácií včítane použitia syntetických spojovníkov DNA.

V konečnej konštrukcii, pPSól sa využíva fragment Ncol s veľkosťou 1,2 kb z promótora IPNS Penicillium na expresiu génu pre expandázu/hydroxylázu a gén pre acetamidázu z Aspergillus nidulans sa používa ako značiaci gén na selekciu transformovaných buniek Penicillium. Reťazce kodónov 9 a 10 v géne pre expandázu/hydroxylázu, ktoré sú kódom pre arginín a leucín, sú pozmenené na CGTCTC k CGCCTA, čo nemení výsledný reťazec aminokyselín.

V konštrukcii podľa vynálezu je fragment promótora IPNS po štiepení Ncol s veľkosťou 1,2 kb spojený s génom pre expandázu/hydroxylázu, bez toho aby pri tom došlo k zmenám v prírodnom reťazci génu pre expandázu/hydroxylázu. Promótor IPNS, použitý na konštrukciu podľa vynálezu má dva opakujúce sa reťazce štyroch báz v porovnaní s natívnym promótorom, jeden z týchto reťazcov sa nachádza v mieste štiepenia Sali 620 párov báz proti smeru expresie kodónu ATG pre začiatok, druhý z týchto reťazcov sa nachádza v mieste štiepenia enzýmom Xbal 5 párov báz proti smeru expresie kodónu pre začiatok v oblasti 5’-neprenášaného vedúceho reťazca. Tieto zmeny nespôsobujú žiadne ovplyvnenie vysokej úrovne expresie génu pre expandázu/hydroxylázu.

Ďalší rozdiel vo vektoroch spočíva v génoch, použitých na uľahčenie nasledujúcej selekcie. Konštrukcie, opísané v EP-A 281 391 používajú na označenie acetamidázu a hygromycín. To znamená veľký rozdiel v porovnaní s vektorom pre transformáciu Penicillium s obsahom génu pre expandázu a hydroxylázu, používaným pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu, pPEN/CEPH-1, ktorý obsahuje ako označenie gén na odolnosť proti fleomycínu. Jeden z kmeňov Penicillium chrysogenum, ktorý bol transformovaný pomocou vektora pPEN/CEPH-1 a bol schopný expresie génu pre expandázu/hydroxylázu bol označený PC200. Taxonomické vlastnosti tohto kmeňa typicky zahrňujú tvorbu rozširujúcich sa kolónii modrozelenej až zelenej farby so zamatovým povrchom so žltými kvapkami, zadná strana kolónie je žltá a kolónia difunduje do agaru, hlavy konídií sú rozvetvené a všetky ich časti sú hladké, konídie sú vajcovité až guľovité s dĺžkou 3 až 4 mikrometre. Pri pestovaní P. chrysogenum je možné použiť tuhé prostredie, ktoré obsahuje 1,5 % monohydratovanej laktózy, 0,5 % objemových kukuričného výluhu, 0,5 % peptónu, 0,4 % chloridu sodného, 0,05 % síranu horečnatého x 7H₂0, 0,6 % dihydrogénfosforečnanu draselného, 0,0005 % chloridu železitého x 6H₂0,

0,0002 % síranu meďnatého x 5H2O a 3,0 % agaru v 1 litri destilovanej vody s pH 4,8. Ak nie je výslovene uvedené inak, ide vždy o percentá hmotnostné. Opísaný kmeň P. chrysogenum, ktorý bol označený ako PC200, bol uložený do verejnej zbierky kultúr American Type Culture Collection, ATCC, 12301 Parklawb Drive, Rockville, Maryland 20852, pod číslom ATCC 74186, kmeň bol uložený dňa 23. septembra 1992.

Druhý nový transformovaný kmeň Penicillium chrysogenum podľa vynálezu, ktorý je schopný produkcie adipoyl-7-ACA je kmeň, u ktorého dochádza k expresii génu pre expandázu/hydroxylázu a.j pre acetyltransferázu po transformácii pomocou jediného vektora pTS-8, ktorý obsahuje kódovú DNA pre oba tieto enzýmy. Uvedený vektor sa však líši od vektorov pre transformáciu Penicillium, tak ako sú uvedené v EP-A 437 378, ktoré obsahujú kódovú DNA len pre acetyltransferázu C. acremonium alebo v spojení s kódovým reťazcom DNA pre mutantu polypeptidu expandázy/hydroxylázy. V konštrukcii pTS-8 sú gény pre expresiu expandázy/hydroxylázy a acetyltransferázy vždy pod pôsobením oddelených kópií promótora IPNS P. chrysogenum a tretia kópia promótora IPNS je použitá na uskutočnenie transkripcie génu na odolnosť proti fleomycínu, ktorý je určený ako značenie na uľahčenie selekcie.

V ďalšom možnom uskutočnení vynálezu je možné gény pre expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu uložiť do oddelených vektorov a použiť v hostiteľskom kmeni Penicillium postupne. Poradie, v ktorom sa ukladajú kódové fragmenty DNA pre enzýmy expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu je dôležité len z praktického hľadiska. S výhodou sa postupuje tak, že sa najskôr uloží gén pre enzýmy expandázu/hydroxylázu a potom sa kmeň Penicillium transformuje génom pre acetyltransferázu vzhľadom na to, že ide o poradie, v ktorom jednotlivé enzýmy spracovávajú substrát in vivo. To znamená, že takto transformovaný organizmus je potom možné sledovať na expresiu génu pre expandázu/hydroxylázu sledovaním produkcie adipoyl-7-ADAC. Táto zlúčenina je potom substrátom pre enzým acetyltransferázu a expresiu kódového génu pre acetyltransferázu, je teda možné preukázať na základe produkcie adipoyl-7-ACA. Použitím vhodnej skúšky in vitro na acetyltransferázu je možné transformovať kmeň Penicillium najskôr génom pre acetyltransferázu, expresiu tohto génu preukázať skúškou in vitro a potom až uložiť gén pre expandázu/hydroxylázu. Každý z oboch uvedených postupov teda predstavuje vhodné uskutočnenie spôsobu podlá vynálezu na prípravu 7-ACA.

Vo výhodnom uskutočnení je však možné uložiť kódové reťazce pre všetky tri enzýmy súčasne za použitia konštrukcie jediného vektora vo forme plazmidu, ktorý obsahuje kódové reťazce tak pre expandázu/hydroxylázu, ako aj pre acetyltransf erázu C acremonium. Kmeň Penicillium chrysogenum, transformovaný takýmto vektorom vo forme plazmidu, označeným ako vektor pTS-8 bol identifikovaný ako PC300. U tohto kmeňa dochádza tak k expresii génu pre expandázu/hydroxylázu, ako aj k expresii génu pre acetyltransferázu. Taxonomické vlastnosti tohto kmeňa sú obdobné ako vlastnosti vyššie uvedeného kmeňa PC200. Prijateľné podmienky pestovania pre PC300 sú rovnaké ako podmienky, ktoré boli vyššie uvedené na pestovanie PC200. Kmeň P. chrysogenum, označený ako PC300, bol uložený do verejnej zbierky kultúr American Type Culture Collection ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod číslom ATCC 74187, kmeň bol uložený 23. septembra 1992.

Špecifický kmeň Penicillium chrysogenum transformovaný vektorom pPenFTSO na expresiu génu pre expandázu S clavuligerus, ktorý predstavuje výhodné uskutočnenie vynálezu, je nový v porovnaní s vyššie opísanými konštrukciami, tak ako boli opísané napríklad v publikácii Cantwell a ďalší, 1990, Current Genetic. , 17, 213 až 221. V oboch konštrukciách sei používa vyvolanie mutácie in vitro na spojenie promótora s génom pre expandázu. V Cantwellovej konštrukcii dochádza pri manipulácii k zavedeniu miesta pôsobenia pre Ndel v ko39 done ATG génu pre expandázu, ktorý je naviazaný na miesto pôsobenia Xbal na 3’-zakončenie promótora IPNS za použitia spojovníka Xbal/Ndel. V konštrukcii podľa vynálezu je vytvorené miesto pôsobenia Ncol v kodóne ATG génu pre expandázu s väzbou na miesto pôsobenia Ncol na 3’-zakončenie spojovníka IPNS. Týmto spôsobom dochádza k vytvoreniu nasledujúcich reťazcov, susediacich v týchto konštrukciách s miestom spojenia príslušného promótora a génu:

Xbal Ncol

IPNS promótor	5’	TCTAGACACATGG	3’	reťazec	č.l
Strep. expandáza	5’	GTGAGAGTTGATGGAC	3’	reťazec	č.2
Cantwell	5’	TCTAGACACTATGGAC	3’	reťazec	č. 3
podľa vynálezu	5’	TCTAGACACCATGGAC	3’	reťazec	č.4

V Cantwellovej konštrukcii je jeden zvyšok C nahradený zvyškom T, zatiaľ čo pri konštrukcii podlá vynálezu je uvedený zvyšok C zachovaný. To znamená, že reťazec promótora IPNS, ktorý bezprostredne susedí s kodónom ATC pre začiatok presne zodpovedá reťazcu z prírodnom géne IPNS. Je možné, že promótor, ktorý bol skôr používaný, hoci sa líšil len jedinou nukleotidovou bázou, mohol viesť k nižšej účinnosti translácie a v dôsledku toho aj k nižšej úrovni expresie génu pre expandázu.

Ďalšie rozdiely je možné nájsť v oblasti promótora alebo génu, ktorý je do konštrukcie uložený. Cantwellova konštrukcia obsahuje oblasť 5’ BamHI až Xbal 3’ promótora IPNS, zatial čo vektor podľa vynálezu obsahuje oblasť 5’ Ncol až Ncol 3’ podľa Diez a ďalší, 1990, J. Biol. Chem., 265, 16358 až 16365. To znamená, že sa v Cantwellovej konštrukcii nachádza na 5’-zakončení promótora IPNS približne 250 prídatných báz. Táto oblasť sa však nachádza v otvorenom čítacom rámci génov pre syntetázu ACV proti smeru translácie génu IPNS.

Cantwellova konštrukcia obsahuje aj gén zo Streptomyces od ATG do miesta BamHI 3’ génu, zatiaľ čo vektor podľa vynálezu obsahuje ATG v bezprostrednom susedstve miesta Sali 3’ génu podľa Kovacevic a ďalší, 1989, J. Bacteriol., 171, 754 až 760. To znamená, že Cantwellova konštrukcia obsahuje na 3’-zakončení reťazca približne 1000 párov báz naviac. Konštrukcia podľa vynálezu stále ešte obsahuje oblasť génu pre expandázu proti smeru jeho translácie v susedstve miesta BamHI 5’ ATG, táto oblasť je však oddelená od čítacieho rámca génu pre expandázu promótorom IPNS.

Ďalší rozdiel v konštrukcii pPenFTSO podľa vynálezu v porovnaní so známymi konštrukciami sa týka použitého označenia pre selekciu. Použitie promótora IPNS z Penicillium a spojenie s génom na odolnosť proti fleomycínu v konštrukcii podľa vynálezu dovoľuje selekciu na integráciu mnohopočetných kópií alebo integráciu v miestach, ktoré dovoľujú vysokú úroveň expresie, takže môže vzniknúť väčší počet transformovaných buniek, u ktorých dochádza k vysokej úrovni expresie génu pre expandázu.

Odštiepenie adipoylového bočného reťazca

Posledným stupňom nového biologického postupu podľa vynálezu je odštiepenie adipoylového bočného reťazca z adipoyl-7-ADAC alebo z adipoyl-7-ACA, tento postup znamená nutnosť spracovania produktu z predchádzajúcich stupňov enzýmom adipoylamidázou. Ako už bolo vyššie uvedené, je jednou z podstatných výhod spôsobu podľa vynálezu možnosť uskutočniť všetky stupne, vedúce k tvorbe adipoyl-7-ADAC a adipoyl-7-ACA v jedinej fermentačnej kultúre. Týmto spôsobom je možné dosiahnuť výnimočne vysokú účinnosť vzhľadom na to, že nie je nutné izolovať a čiastočne čistiť medziprodukty stupeň od stupňa. V poslednom stupni však nie je prítomný enzým adipoylamidáza vzhľadom na to, že nebol vytvorený in situ v pôvodnej fermentačnej kultúre prírodnou ani rekombinačnou expresiou génov P. chrysogenum.

V prípade, že nový biologický postup podľa vynálezu je vykonávaný po vsádzkach, bude nevyhnutné izolovať a čiastočne čistiť produkt z prvého stupňa, vyššie už boli opísané predbežné postupy na tento účel.

Spôsob podľa vynálezu je však možné vykonávať akýmkoľvek spôsobom, pri ktorom sa účinne dostáva do styku adipoylamidáza s adipoyl-7-ADAC alebo adipoyl-7-ACA tak, že môže dôjsť k enzymatickej premene tejto zlúčeniny na 7-ADAC alebo 7-ACA. Ide teda o uvedenie do styku v najširšom zmysle. Je možné použiť bezbunkové živné prostredie s obsahom surových produktov adipoyl-7-ADAC alebo adipoyl-7-ACA a toto prostredie spracováva po jednotlivých vsádzkach pomocou surového prostredia s obsahom adipoylamidázy. Tento postup je pomerne účinný vzhladom na to, že nemusí byť vykonané počiatočné čistenie reakčných zložiek. Sú však možné určité modifikácie. Je napríklad možné reakčné zložky predbežne čistiť do akéhokoľvek požadovaného stupňa pred vzájomným uvedením do styku. Je tiež možné vykonávať spôsob kontinuálne a nie po vsádzkach. Vlastný styk reakčných zložiek môže byť modifikovaný rôznym spôsobom na dosiahnutie lepšieho priebehu postupu. Je napríklad možné použiť imobilizovaný enzým, napríklad vo forme stĺpca, ktorý obsahuje adipoylacylázu a potom je možné nechať prechádzať stĺpcom adipoyl-7-ADAC alebo adipoyl-7-ACA. Imobilizovaný enzým je tiež možné pridať k roztoku adipoyl-7-ADAC alebo adipoyl-7-ACA vo forme suspenzie. Imobilizovaný enzým poskytuje výhodu ľahkej spätnej izolácie enzýmu a jeho opakovaného použitia. Ďalším príkladom technológie môže byť reaktor, opatrený membránou. Najvýhodnejším postupom pre styk s reakčnými zložkami je však stĺpec s iinobilizovaným enzýmom.

Adipoylamidázy, vhodné na štiepenie

Existuje rad enzýmov so známou špecifičnosťou pre adipoylové bočné reťazce. V nasledujúcich príkladoch budú uvedené výsledky, ktoré boli získané s bežne dodávanými adi- 42 poylamidázami (RAEV Corp.). V literatúre sa uvádza ešte sedem ďalších enzýmov, schopných odstrániť adipoylové bočné reťazce z molekúl cefalosporínového typu. Šesť z týchto siedmich enzýmov je z čeľade Pseudomonas a siedmy z čeľade Bacillus. Medzi enzýmami z Pseudomonas sú niektoré podobnosti, všetky sa však fyzikálne/biologicky trochu líšia. Ďalej budú uvedené niektoré ich vlastnosti.

Enzým Literárny údaj Približná (kmene Pseudomonas mol. hmotnosť a Bacillus) (podjednotka)

P. SY-77-1 (Toyo Jožo)	Shibuya a ďalší, (1981)	javí sa rovnaká ako pre GK 16
P. GK 16	Matsuda, Komatsu	16 000
(Asahi)	(1985)	54 000
P. SE83 (acyl)	Matsuda a ďalší	38 200
(Asahi)	(1987)	19 900
P-SE83 (acyll)	Matsuda a ďalší,	25 400
(Asahi)	(1987)	58 200
P. diminuta N176	Aramori a ďalší,	58 000
(Fuj isawa)	(1991a)*	26 000
P. diminuta V22	Aramori a ďalší,	?
(Fuj isawa)	(1991a)*	?
Bacillus laterospo-	Aramori a ďalší,	70 000
rus J1 (Fujisawa)	(1991b)**	(monomérne)
Pseudomonas sp.	-	16 000
(RAEV Corp.)		54 000

* Aramori a ďalší, J. Ferment. Bioeng., 1991, 72:232 až 243 ** Aramori a ďalší, J. Bacteriol., 1991, 173:7848 až 7855.

Všetky uvedené adipoylamidázy je možné použiť pri novom biologickom postupe podľa vynálezu.

Ďalšie adipoylamidázy, použiteľné pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je možné lahko zistiť tak, že sa prípadné enzýmy skúšajú na adipoyl-7-ACA a dipoyl-7-ADAC ako na substráte. Pozitívny výsledok je teda dôkazom, že uvedený enzým je skutočne možné pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu použiť. Substrát je možné pripraviť reakciou anhydridu kyseliny adipovej so 7-ACA za použitia modifikácie podlá publikácie Szewczuk a Vellman-Bednawska, Clin. Chim. Acta, 1978, 74, 19 až 26. Je tiež možné upraviť postup, opísaný v Agric. Biol. Chem., 1981, 45(7), 1561 až 1567 na prípravu glutaryl-7-ACA. Anhydrid kyseliny adipovej je možné pripraviť podľa publikácie Albertson a Lundmark, J. Macromol, Sci. Chem., 1990, A27, 397 až 412. Substrát 7-ACA je dostupný z radu bežných zdrojov včítane Sigma Chemical Co.

V prípade, že je potrebné rýchle sériovo vyšetriť rad enzýmov za použitia kolorimetrických postupov, je možné namiesto adipoyl-7-ACA použiť kolorimetrický substrát, napríklad adipoyl-PABA, kyselinu paraaminobenzoovou alebo adipoyl-pNA, paranitroanilín. Postup je potom možné upraviť podľa postupu, opísaného pre gamma-glutamyl PABA v publikácii Szewczuk a ďalší, Clinica Chimica Acta, 84, 1987, 19 až 26. Odštiepením bočného reťazca vzniká sfarbenie, ktorého prítomnosť a koncentráciu je možné stanoviť za použitia kolorimetra. Podrobnejšie informácie o tejto metóde aj o ďalších vhodných postupoch je možné nájsť v publikácii Marelli L. P., 1968, J. Pharm. Sci., 57:2172 až 2173, Szasz G., 1969, Clin. Chem., 15, 124 až 136, Szewczuk A. a ďalší, 1980, Anál. Biochem. 103, 166 až 169 a Reyes F. a ďalší, 1989, J. Pharma. Pharmacol., 41, 136 až 137.

- 44 Bolo uskutočnené porovnanie N-terminálneho reťazca aminokyselín v enzýme RAEV s veľkými podjednotkami enzýmov acyll a GK16 z vyššie uvedenej tabuľky. Výsledky tohto porovnania sú ďalej uvedené, pričom zvyšky v zátvorkách označuj ú zvyšky, ktoré pravdepodobne nie sú rozhodujúce.

RAEV - reťazec č. 5:

(S) N (S) (G) A V A P G K T A N G N A L (L) L Q N (P)

GK16 - reťazec č. 6:

S N S V AVAPGKTANGNAL L LQN P acyll - reťazec č. 7:

S N N V AVAPGRTATGRPI L AGD P

Vo vyššie uvedených reťazcoch je zrejmé, že všetky tri peptidy sú. príbuzné. Avšak bielkovina s N-terminálnym reťazcom, podobným uvedeným reťazcom nemusí mať nevyhnutne účinnosť adipoylamidázy, tak ako tomu je v prípade acylázy penicilín G, ktorá je produkovaná kmeňom Arthrobacter. Na druhej strane existujú adipoylamidázy, použiteľné pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu, u ktorých nie je možné dokázať významnú homológiu s vyššie uvedenými N-terminálnymi reťazcami. Napríklad acylázy acyl (Asahi) a B. laterosporus J1 (Fujisawa) z vyššie uvedenej tabuľky, ktoré majú určitú účinnosť pri odštiepení adipoylového reťazca z adipoyl-7-ACA, nemajú žiadnu homológiu reťazca s ostatnými uvedenými enzýmami. Je teda zrejmé, že pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je použiteľnosť adipoylamidázy v poslednom stupni nového postupu určovaná len tým, či enzým je schopný odštiepiť adipoylový bočný reťazec z adipoyl-7-ACA, čo je možné ľahko uskutočniť, ako už bolo vyššie uvedené.

Praktické uskutočnenie vynálezu bude vysvetlené nasle- 45 dujúcimi príkladmi, ktoré však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Podmienky pestovania Penicillium chrysogenum

Kmene Penicillium chrysogenum, použité pri týchto postupoch boli udržované na platniach, obsahujúcich prostredie LCSB, ktoré obsahovalo 1,5 % monohydratovanej laktózy, 0,5 % objemových kukuričného výluhu, 0,5 % peptónu, 0,4 % chloridu sodného, 0,05 % síranu horečnatého x 7H₂0, 0,06 % dihydrogénfosforečnanu draselného, 0,0005 % chloridu železitého x 6Η₂0, 0,0002 % síranu meďnatého x 5H₂0 a 3,0 % agaru v 1 litri destilovanej vody s pH 4,8. Všetky percentuálne údaje sú hmotnostné, ak nie je uvedené inak. Po 12 dňoch pestovania pri teplote 25 “C pri relatívnej vlhkosti 65 % boli jednotlivé kolónie oddelené a pridané do 2 ml sterilizovanej vody v skúmavke so skrutkovacím vekom, obsahujúcej sklenené gulôčky. Po rozrušení kultúry homogenizáciou bola suspenzia použitá na naočkovanie takzvaných ryžových fľaši. Tieto fľaše obsahovali pri objeme 250 ml celkom 25 g prírodnej dlhozrnej ryže Uncle Ben’s, ktorá bola vopred 7 minút premývaná tromi až štyrmi objemami destilovanej vody za premiešavania každých 30 sekúnd a potom bola uložená na sito na tak dlho, až voda, zadržaná v ryži predstavovala približne 25 %. Po 12 dňoch pri teplote 25 ’C a relatívnej vlhkosti 65 % boli spóry z ryže vymyté za použitia 50 ml sterilnej vody. Suspenzia spór bola potom použitá na naočkovanie kvapalných kultúr a časť kultúry bola taktiež lyofilizovaná a potom skladovaná pri teplote 4 ’C. Postup bol uskutočnený tak, že spóry boli zmiešané s rovnakým objemom 5% odstredeného mlieka a zmes bola lyofilizovaná v sterilných ampulkách .

Na produkciu penicilínov alebo na produkciu mycélia ako zdroja RNA alebo DNA, bola použitá fermentácia kmeňa v dvoch stupňoch v trepacích fľašiach. Očkovací stupeň bol zahájený pridaním 1 x 10θ spór do fľaše s objemom 500 ml, obsahujúcej 50 ml živného prostredia, obsahujúceho 3,0 % glukózy, 1,0 % pharmamédia, 3,0 % objemových kukuričného výluhu, 0,2 % síranu amónneho, 0,5 % uhličitanu vápenatého, 0,05 % bezvodého dihydrogénfosfátu draselného, 1,0 % laktózy a 1,0 % primárnych sušených kvasníc v 1 litri destilovanej vody. Všetky percentuálne údaje sú hmotnostné, ak nie je uvedené inak. Zmes bola inkubovaná pri teplote 25 °C a relatívnej vlhkosti 65 % na rotačnej trepačke s výkyvom 70 mm pri 220 ot/minútu. Po 48 hodinách inkubácie bolo zahájené produkčné pestovanie prenesením 2 ml vegetatívneho očkovacieho materiálu do fľaše s objemom 500 ml a s obsahom 35 ml živného prostredia s nasledujúcim zložením: 0,05 % dihydrogénfosforečnanu draselného, 0,5 % síranu draselného, 1,0 % síranu amónneho, 12,0 % laktózy, 2,75 % pharmamédia, 1,0 % zrazeného uhličitanu vápenatého, 1,0 % objemových oleja v 1 litri destilovanej vody s pH 6,6. Všetky percentuálne údaje sú hmotnostné, ak nie je uvedené kláve, avšak pred naočkovaním inak. Po sterilizácii v autobol pridaný ešte sterilný 25% adipát sodný pri pH 6,6 tak, aby konečná koncentrácia adipátu sodného bola 2,5 % hmotnostných. Potom bola kultúra inkubovaná za rovnakých podmienok ako očkovacia kultúra 5 až 7 dní .

V prípade, že má byť získané mycélium a protoplasty na transformáciu alebo ako zdroje DNA, je vhodné kmeň pestovať vo fľašiach s objemom 250 ml s obsahom 50 ml úplného prostredia CM so zložením: 50 ml 20 x Clutterbuckových solí (120 g Na₂N0₃, 10,4 g KC1, 10,4 g MgSO₄ x 7H₂0, 30,4 g KH₂PO₄), 2,0 ml Vogelových stopových prvkov (9,3 M kyselina citrónová, 0,2 M ZnS0₄, 25 mM Fe(NH₄)₂(S0₄)₂ x 6H₂O, 10 mM CuSO₄ . 3 mM MnS0₄, 8 mM kyseliny boritej a 2 mM Na₂Mo0₄ x 2H₂O), 5 g tryptónu, 5 g extraktu z kvasníc a 10 g glukózy v 1 litri destilovanej vody. Kultúra bola inkubovaná pri

- 47 teplote 25 °C na rotačnej trepačke pri 220 ot/minútu.

Príklad 2

Pestovanie Cephalosporium acremonium

Kmene C. acremonium boli udržované na šikmom agare, ktorý obsahoval úplné živné prostredie so zložením: 20 g sacharózy, 20 g agaru, 4 g peptónu, 4 g extraktu z kvasníc, 3 g dusičnanu sodného, 0,5 g dihydrogénfosforečnanu draselného, 0,5 g hydrogénfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu draselného, 0,5 g síranu horečnatého x 7H₂0, 0,01 g síranu železnatého x 7H₂0 v 1 litri destilovanej vody s pH 6,6. Po 10 dňoch rastu pri teplote 28 °C a relatívnej vlhkosti 66 % bolo k šikmému agaru pridaných 6 ml sterilizovanej vody a kultúra bola z povrchu agaru zoškrabaná. Výsledná suspenzia bola prenesená do sterilnej skúmavky so skrutkovacím uzáverom, obsahujúcej sklenené guľôčky. Po homogenizácii niekoľko minút bolo 3,5 ml výslednej suspenzie použitých na naočkovanie kvapalných kultúr. Suspenzia bola tiež použitá na získanie lyofilizovanej kultúry na skladovanie pri teplote 4 °C. Suspenzia kultúry pritom bola odstredená, usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 5% odstredenom mlieku a podiely získanej suspenzie boli lyofilizované v sterilných ampulkách.

Na produkciu cefalosporínu a tiež na produkciu mycélia ako zdroja DNA a RNA bola použitá fermentácia kmeňov v dvoch stupňoch v trepacích fľašiach. Očkovacia kultúra bola založená pridaním očkovacieho materiálu do fliaš s objemom 250 ml, obsahujúcich 15 ml živného prostredia s nasledujúcim zložením: 5 g glukózy, 40 g sacharózy, 30 g kukuričného škrobu, 50 g repnej melasy, 65 g sójovej múky, 15,8 g síranu vápenatého x 2H₂0, 8 g octanu amónneho, 5 g zrazeného uhličitanu vápenatého, 7,5 g síranu amónneho, 3,5 g síranu horečňatého x 7H₂0, 1 g dihydrogénfosforečnanu draselného a 0,15 ml sójového oleja v 1 litri destilovanej vody pri pH

6,2. Kultúra bola inkubovaná pri teplote 25 ⁰C a relatívnej vlhkosti 65% na rotačnej trepačke s výkyvom 70 mm pri 220 ot/minútu. Po 96 hodinách inkubácie bola zahájená produkcia kultúry prenesením 2 ml vegetatívneho očkovacieho materiálu do fľaše s objemom 250 ml a s obsahom 15 ml čerstvého vyššie uvedeného živného prostredia. Inkubácia potom bola vykonávaná ďalších 96 hodín za rovnakých podmienok.

V prípade, že je potrebné získať mycélium ako zdroj DNA pre transformáciu, je možné kmene pestovať vo fľaši s objemom 500 ml a s obsahom 100 ml úplného živného prostredia, ktoré obsahuje 20 g glycerolu, 4 g peptónu, 4 g extraktu z kvasníc, 0,5 g dihydrogénfosforečnanu draselného, 0,5 g hydrogénfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu draselného, 1 g síranu horečnatého x 7Η₂0, 3 g dusičnanu sodného a 0,01 g síranu železnatého x 7H₂0 v 1 litri destilovanej vody. Kultúra sa pestuje pri teplote 30 “C na rotačnej trepačke pri 200 ot/minútu.

Príklad 3

Izolácia DNA genómu a celkovej RNA Penicillium a Cephalosporium

Vegetatívne mycélium z kultúry, pripravené vyššie uvedeným spôsobom a pestované 48 hodín bolo oddelené filtráciou cez mul, zmrazené v kvapalnom dusíku a lyofilizované cez noc. Sušené mycélium sa drví spolu s pieskom za použitia mažiara a tíčika a potom sa znovu uvedie do suspenzie v 25 ml 100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 10 mM tris s pH 8,0 so 4 % SDS. Po zohriatí suspenzie na teplotu 50 až 55 C na vodnom kúpeli s teplotou 60 °C sa zmes najskôr extrahuje za použitia 1 M tris s pH 8, nasýteného fenolom a potom za použitia tris, nasýteného zmesou fenolu a chloroformu v objemovom pomere 1: 1 a nakoniec sa zmes extrahuje chloroformom. RNA sa zráža z vodnej fázy pridaním rovnakého objemu chladného 6 M LiCl a potom sa nechá zmes 2 až 3 hodiny pri teplote -20 °C. Po i 49 h odstredení pri 12 000.g celkom 20 minút pri teplote 4 °C sa k supernatantu pridá do 66 % objemových etanol a zmes sa 15 minút chladí na -20 “C na vyzrážanie DNA. Po odstredení rovnakým spôsobom ako je uvedené vyššie, sa usadenina DNA premyje 70% etanolom, vysuší sa a znova sa uvedie do suspenzie v pufri TE (10 mM tris-HCl s pH 7,5, 1 mM EDTA). Koncentrácia DNA sa stanoví porovnaním so známym štandardom DNA pri farbení etidiumbromidom elektroforézou na agarozovom géli.

Na extrakciu RNA sa kultúry Penicillium chrysogenum a Cephalosporium acremonium, opísané v príkladoch la 2, pestujú 96 hodín v 35 ml fermentačného prostredia za vyššie uvedených podmienok pri teplote 25 °C na rotačnej trepačke pri 220 ot/minútu. Mycélium sa oddelí filtráciou cez filter Vhatman 1 za zníženého tlaku a premyje sa približne 50 ml vody. Potom sa mycélium okamžite zoberie z filtra, znova sa uvedie do suspenzie v 5 ml pufra na rozrušenie buniek (50 mM tris-HCl s pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA s pH 8,0 a 5 % SDS), zmrazí sa v kvapalnom dusíku a lyofilizuje sa. Po lyofilizácii cez noc sa pridá 5 ml vody, obsahujúcej 0,1 % DEPC a 5 ml zmesi fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu 50: 50:1 s 1 M tris s pH 8 a zmes sa nechá 20 minút za pretrepávania stáť pri teplote 37 “C. Potom sa zmes odstredí pri 12 000.g 10 minút pri teplote 4 ’C, vodná vrstva sa oddelí a znova sa extrahuje najskôr za použitia zmesi fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu 50:50:1 s 1 M tris s pH 8 a potom fenolom, nasýteným 1 M tris s pH 8 a nakoniec chloroformom. Ku konečnej vodnej vrstve sa pridá rovnaký objem 6 M LiCl a roztok sa nechá stáť najmenej 4 hodiny pri teplote 20 °C. Celková RNA sa odstredí pri 12 000.g celkom 20 minút pri teplote 4 °C a usadenina sa rozpustí v 0,3 ml pufra TE s 0,03 ml 3 M octanu sodného a potom sa pridá 2,5 objemov etanolu k opätovnému vyzrážaniu RNA. Konečná usadenina sa rozpustí v 0,1 ml pufra TE a koncentrácia RNA sa stanoví spektrofotometricky za využitia absorpcie pri 260 nm.

Príklad4

Konštrukcia génovej banky Cephalosporium acremonium a izolácia génov pre expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu z C. acremonium

Izolácia génu pre expandázu/hydroxylázu C. acremonium

DNA genómu C. acremonium bola čiastočne rozštiepená pomocou enzýmu Sau3AI za vzniku priemernej veľkosti fragmentu 10 až 20 kb, rozštiepený materiál bol odstredený za použitia hustotného gradientu s obsahom 5 až 20 % chloridu sodného. DNA, frakcionovaná podľa veľkosti bola použitá na vytvorenie genómovej banky DNA C. acremonium cez väzbu do miesta pôsobenia BamHI vektora lambda 2001, uloženie do častíc fágu za použitia Gigapak (Stratagene) s následnou infekciou E. coli. Výsledné plaky boli prenesené na nitrocelulózu a sériovo vyšetrené hybridizáciou s komplementárnou oligonukleotidovou sondou na 3’-zakončení známeho reťazca génu pre expandázu/hydroxylázu (Samson a ďalší, 1987). Sonda bola koncovo označená pomocou / - P/ATP za použitia T4-polynukleotidkinázy. Pozitívne klony boli izolované, bola skonštruovaná mapa pôsobenia reštrikčných endonukleáz a orientácia génu bola určená hybridizáciou Southern blot za použitia vyššie uvedeného oligonukleotidu a ďalšieho oligonukleotidu s reťazcom, komplementárnym k 5’-zakončeniu génu.

Izolácia génu pre acetyltransferázu z C. acremonium

Hoci nejde o postup, použitý na izoláciu génu pre acetyltransferázu na konštrukciu vektora, opísaného v príkladoch 11 a 12, je možné použiť nasledujúci postup s použitím známej DNA. Postupuje sa tak, že sa z genómovej banky C. acremonium, pripravenej vyššie uvedeným spôsobom vyberie kloň, obsahujúci kód pre acetyltransferázu na základe hybridizácie za použitia syntetických oligonukleotidových sond, komplementárnych k reťazcu pre acetyltransferázu spôsobom podía publikácie Matsuda a ďalší, 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun., 182, 995 až 1001.

Príklad 5

Podmienky pestovania Streptomyces clavuligerus

Na pestovanie bol použitý Streptomyces clavuligerus kmeň ATCC 27064. Tento kmeň bol udržovaný na platniach, ktoré obsahovali 4 g extraktu z kvasníc, 10 g sladového extraktu, 4 g glukózy, 20 g agaru v 1 litri destilovanej vody s pH 7,2. Po piatich dňoch rastu pri teplote 30 °C boli k platniam pridané 2 ml sterilnej vody a kultúry boli zoškrabané z povrchu agaru. Výsledná suspenzia bola prenesená do sterilných skúmaviek so skrutkovacími uzávermi, obsahujúcich sklenené guľôčky. Po homogenizácii kultúry miešaním bola suspenzia použitá na naočkovanie kvapalného živného prostredia. Suspenzia bola použitá aj na uskladnenie pri teplote -70 °C po pridaní glycerolu do 15 % konečného objemu.

V prípade, že bolo potrebné získať mycélia na prípravu protoplastóv na transformáciu alebo ako zdroj DNA, boli kmene pestované vo fľašiach s objemom 1 litra s obsahom 200 ml živného prostredia YEME, ktoré obsahuje 3 g extraktu z kvasníc, 5 g peptónu, 3 g sladového extraktu, 10 g glukózy, 340 g sacharózy, 1,02 g chloridu horečnatého x 6H₂O, 5 g glycínu, 18 g agaru v 1 litri destilovanej vody. Kultúra sa inkubuje pri teplote 28 °C na rotačnej trepačke pri 220 ot/minútu.

Príklad 6

Izolácia DNA genómu Streptomyces

Vegetatívna kultúra na pestovanie vyššie uvedenej kultúry sa odstredí 48 hodín pri 22 100.g celkom 10 minút. Bunkový materiál sa znova uvedie do suspenzie v 10 ml pufra TE, pridá sa 10 mg lyzozýmu a zmes sa inkubuje 15 minút pri teplote 30 °C. Potom sa pridá 1 ml 20% SDS a potom ihneď ešte 10 ml fenolu, nasýteného TE s pH 8 a 1,5 M roztoku chloridu sodného a zmes sa 20 minút opatrne mieša prevracaním. Fázy sa oddelia odstredením pri 12 000. g po dobu 10 minút, potom sa vodná vrstva oddelí a prenesie do čerstvej skúmavky. Pridá sa rovnaký objem chloroformu a zmes sa 10 minút opatrne mieša prevracaním skúmavky. Potom sa fázy opäť oddelia odstredením 10 minút pri 12 000.g, vodná vrstva sa oddelí a prenesie sa do čistej skúmavky. Opatrne sa pridajú dva objemy izopropanolu a vyzrážaná DNA sa znova rozpustí v čo najmenšom objeme pufra TE. Potom sa pridá RNA-áza A do konečnej koncentrácie 20 mikrogramov/ml a roztok sa 1 hodinu inkubuj e pri teplote 50 °C. Potom sa pridá proteáza K do konečnej koncentrácie 100 mikrogramov/ml spolu so 100 mM NaCl a 0,4% SDS a zmes sa inkubuj e ďalšiu hodinu pri teplote 37 °C. Roztok sa potom znova extrahuje rovnakým objemom fenolu, nasýteného TE s pH 8 a znovu sa extrahuje chloroformom. DNA sa oddelí po pridaní dvoch objemov izopropanolu a koncentrácia sa stanoví spektrofotometricky pri odčítaní absorpcie pri 260 nm.

Príklad 7

Konštrukcia génovej banky a izolácia fragmentov DNA, obsahujúcich gény pre expandázu a hydroxylázu Streptomyces clavuligerus

Izolácia génu pre expandázu S. clavuligerus

DNA genómu Streptomyces clavuligerus, získaná vyššie uvedeným spôsobom sa rozštiepi reštrikčnými enzýmami BamHI Sali. Rozštiepená DNA sa podrobí elektroforéze na 0,8% agarozovom gé-li a fragmenty s veľkosťou 1,8 až 2,2 kb sa vymyjú a naviažu na DNA pUC18, vopred rozštiepenú tými istými enzýmami. Zriedené podiely získanej zmesi po väzbe sa použijú na transformáciu buniek JM109 za použitia otvorenia pórov elek53 trickým prúdom za použitia zariadenia Gene Pulser (Bio-Rad, Richmond, CA). Príprava buniek a otvorení pórov elektrickým prúdom sa vykonáva podlá doporučenia výrobcu. Transformovaný materiál sa nanesie na platne LB, obsahujúce 100 mikrogramov/ml ampicilínu a 75 mikrolitrov 20 X-Gal. Po inkubácii cez noc pri teplote 37 °C sa rekombinačné kolónie inkubujú podľa svojho bezfarebného vzhľadu vzhľadom na inaktiváciu génu pre beta-galaktozidázu vo vektore. Bezfarebné kolónie sa prenesú na čerstvú platňu s prostredím LB s obsahom 100 mikrogramov/ml ampicilínu. Po pestovaní cez noc pri teplote 37 “C sa kolónie prenesú na nitrocelulózu a hybridizujú sa za použitia sondy, získanej pomocou PCR-reakcie, zodpovedajúcej reťazcu známeho génu pre expandázu Streptomyces clavuligerus, bázy 52 až 918 podľa publikácie Kovacevic a ďalší, 1989, J. Bacteriol., 171, 754 až 760 a podľa US 5 070 020 (Ingolia a ďalší). Značenie reakčného produktu PCR-reakcie je možné uskutočniť extenziou štatistickým priemerom za použitia P dCTP a skúšobného balíčka Oligolabelling Kit, podlá návodu výrobcu (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Hybridizačné reakcie sa vykonávajú v prítomnosti rádioaktívne značenej sondy (10^ impulzov za minútu), 30% formamidu, 5x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M citronanu sodného s pH 7), 0,1 % SDS, 5x Denhardt (5 g ficoll, 5 g polyvinylpyrolidónu a 5 g BSA na 500 ml 50x zásobného roztoku) a 100 mikrogramov/ml DNA z teľacieho brzlíka cez noc pri teplote 37 °C. Niekoľko transformovaných kolónií silne hybridizovalo so sondou. Bolo potvrdené, že jedna z kolónií obsahuje vektor, nesúci gén pre expandázu, analýza bola vykonávaná pomocou reštrikčných enzýmov. Zistený plazmid bol označený pFTSO-1.

Izolácia génu pre hydroxylázu S. clavuligerus

DNA genómu Streptomyces clavuligerus bola čiastočne rozštiepená enzýmom BamHI a naviazaná na vektor lambda Dash II (Stratagene). Výsledná genómová banka bola sériovo sledovaná hybridizáciou na oligonukleotid, obsahujúci 30 báz, s totožným reťazcom, ako prvých 30 báz známeho reťazca génu pre hydroxylázu z publikácie Kovacevic a Miller, 1991, J. Bact., 173:398. Po vykonaní hybridizácie Southern blot za použitia DNA z dvoch pozitívnych klonov fágov po rozštiepení enzýmom BamHI bol získaný očakávaný fragment s veľkosťou 6 kb, ktorý bol subklonovaný. Z tohto subklonu bol získaný po rozštiepení enzýmom KpnI rad fragmentov v súlade so zverejnenou mapou pôsobenia reštrikčných enzýmov pre gén pre hydroxylázu podľa Kovacevica a Millera, 1991.

Príklad 8

Izolácia DNA plazmidu

Kultúry Escherichia coli, obsahujúce požadovaný plazmid, boli pestované v 500 ml prostredí LB s obsahom 20 g/liter základu pre kvapalné prostredie LB (Gibco, Paisley, Škótsko) s obsahom 15 mikrogramov/ml tetracyklínu na rotačnej trepačke pri 220 ot/minútu 12 až 16 hodín pri teplote 37 “C. Bunky boli oddelené odstredenim pri 4000.g celkom 10 minút pri 4 °C. Usadenina buniek bola znova uvedená do suspenzie v 18 ml pufra s glukózou (50 mM glukózy, 25 mM tris s pH 8,0 a 10 mM EDTA) a 2 ml 40 mg/ml lyzozýmu (Sigma, St. Luis, MO) v glukózovom pufri, po zmiešaní bola zmes 15 minút inkubovaná pri teplote miestnosti. Potom bolo pridaných 40 ml čerstvo pripraveného roztoku 0,2 N NaOH, 1 % SDS, zmes bola opatrne premiešaná a uložená na 10 minút do ľadu. Potom bolo pridaných 30 ml 5 M octanu draselného s pH 4,8 a po premiešaní bola zmes uložená ešte na 10 minút do ľadu. Bunková drvina potom bola usadená odstredenim pri 4000 g na 10 minút pri 4 °C a výsledný supernatant bol prefiltrovaný cez vrstvu mulu. K vyčerenému supernatantu bolo pridaných 0,6 objemov izopropanolu na vyzrážanie DNA plazmidu, zrazenina sa tvorila 20 minút v priebehu inkubácie pri teplote miestnosti . DNA plazmidu bola usadená odstredenim 20 minút pri 4000 g pri teplote 4 °C, potom bola premytá 70% etanolom a krátko sušená. Usadenina potom bola znovu uvedená do sus- 55 penzie v 9 ml pufra TE a potom bolo pridaných 10 g CsCl a 0,387 ml roztoku etidiumbromidu s obsahom 10 mg/ml. Tento roztok bol odstredený 24 hodín pri 313 100.g. Výsledný pás plazmidu v gradiente chloridu cézneho bol vizualizovaný pomocou ultrafialového svetla, oddelený a etidiumbromid bol odstránený extrakciou butanolom, nasýteným vodou. Potom bol chlorid cézny odstránený dialýzou proti puf.ru TE a nakoniec bola DNA koncentrovaná za použitia PEG s molekulovou hmotnosťou 8000. Koncentrácia DNA bola stanovená spektrofotometricky odčítaním absorpcie pri 260 nm.

Príklad9

Konštrukcia vektora pPenFTSO na transformáciu Penicillium

Uloženie génu na odolnosť proti fleomycínu

Vektor na transformáciu Penicillium bol skonštruovaný za použitia génu na odolnosť proti fleomycínu ako dominantného označenia pre nasledujúcu selekciu. Najskôr bol izolovaný fragment s veľkosťou 660 bp s obsahom génu na odolnosť proti fleomycínu (išlo o gén pre bielkovinu, ktorá viaže fleomycín zo Streptoalloteichus hindustanus) a bola vykonaná jeho väzba na terminátor cytochrómu Cl z kvasiniek za použitia plazmidu pUT713, rozštiepeného enzýmami BamHI/BglII (CAYLA, Toulouse Cedex, Francúzsko), postup bol vykonávaný za použitia elektroforézy s následnou elúciou z agarozového gélu. Izolovaný fragment bol uložený do miesta štiepenia BamHI vektora pSELECT^ 1 (Promega Corporation) a orientácia génu bola overená analýzou reštrikčnými enzýmami. Jediné miesto pôsobenia HindlII výsledného plazmidu bola odstránená rozštiepením enzýmom HindlII, vyplnením vzniknutých zakončení Klenowovou polymerázou a opätovným naviazaním. Potom bol uložený fragment Pst I s veľkosťou 550 bp a s obsahom lambda cos, ktorý umožňuje použitie vektora na tvorbu kozmidu v prípade, že sa použijú na uloženie fragmenty s príslušnou velkosťou. Tento vektor bol označený pSCP4.

DNA genómu P. chrysogenum bola čiastočne rozštiepená enzýmom Sau3A a použitá na prípravu banky fágu lambda EMBL3 ako vektora. Kloň, obsahujúci gén pre syntetázu izopenicilínu N, IPNS bol z banky izolovaný a použitý na prípravu radu subklonov, z ktorých jeden obsahoval fragment s veľkosťou 3,6 kb z prvého miesta pôsobenia BamHI proti smeru translácie génu IPNS a ž k prvému miestu pôsobenia HindlII v smere translácie tohto génu. Jediné miesto pôsobenia Sali v tomto subklone bolo odstránené rozštiepením Sali, vyplnením vzniknutých zakončení Klenowovou polymerizáciou a opätovným naholo obdobným spôsobom odstránené jediné Xbal rozštiepením pomocou Xbal, vyplnením miest a opätovnou väzbou. Výsledný plazmid bol označený pSXF-1. Skonštruovaný promótor IPNS bol na géli izolovaný z plazmidu pSXF-1 ako fragment po štiepení enzýmom Ncol s 1, 2 kb a bol uložený do miesta Ncol vo vyššie opísanom plazmide pSCP4. Orientácia, stanovená rozštiepením reštrikčnými enzýmami bola zvolená tak, že promótor bol spojený s génom na odolnosť proti fleomycínu v mieste kodónu ATG pre štart. Tento plazmid bol označený pUTZ-2.

viazaním. Potom miesto pôsobenia

Uloženie génu pre expandázu S. clavuligerus

Fragment s veľkosťou 1 645 kb, obsahujúci gén pre expandázu Streptomyces clavuligerus bol čistený z materiálu, získaného z pFTSO-1, tak ako bol vyššie opísaný, enzýmami BamHI a Sali, čistenie bolo vykonávané elektroforézou a elúciou z 0,8% agarozového gélu. Izolovaný fragment bol uložený do vektora pSELECT (Promega Corporation), taktiež rozštiepeného enzýmami BamHI a Sali. Vzniknutý vektor bol označený pFTSO-8. Nové miesto pôsobenia Ncol bolo vytvorené u kodónu ATG pre začiatok génu pre expandázu cielenou mutagenézou in vitro Altered Sites^R (Promega Corporation). Mutácia bola vyvolaná podľa návodu výrobcu. Bol skonštruovaný oligonukleotid, komplementárny ku kódovému reťazcu oblasti DNA u kodónu ATG pre začiatok zo zverejneného reťazca génu pre expandázu Streptomyces tak, ako bol opísaný v publikácii Ko- 57 vacevic a ďalší, 1990, Journal of Bacteriology, 171, str. 3952 až 3958. Tento oligonukleotid bol syntetizovaný kyanoetylfosforemiditóvým postupom za použitia zariadenia Gene Assembler (Pharmacia), oligonukleotid mäl nasledujúci reťazec .

reťazec č. 8:

’ CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5 ’

Vznik mutácie bol potvrdený analýzou reštrikčným enzýmom. Potom bol izolovaný fragment Ncol s 1,2 kb z plazmidu pUTZ-2, obsahujúci konštrukciu promótora IPNS z P. chrysogenum pomocou reštrikčného enzýmu Ncol s následnou elektroforézou na agarozovom géli. Oblasť promótora IPNS bola naviazaná do vektora pFTSO-8 v novom mieste pôsobenia Ncol, ktoré bolo vytvorené mutáciou na kodóne ATG pre začiatok génu pre expandázu. Orientácia promótora vzhľadom ku génu pre expandázu bola overená analýzou reštrikčnými enzýmami. Kazeta, obsahujúca promótor IPNS a gén pre expandázu potom bola vybratá ako fragment BamHI/Sali a uložená do vektora pUTZ-2 po jeho rozštiepení BamHI/Sali na jeho transformáciu, išlo o vyššie uvedený vektor Penicillium. Konečná konštrukcia bola označená pPenFTSO.

Príklad 10

Konštrukcia vektora pPEN/CEPH-1 pre transformáciu Penicillium

Uloženie promótorovej oblasti IPNS

Oblasť promótora IPNS bola izolovaná z plazmidu pUTZ-2, opísaného v príklade 9 rozštiepením enzýmami Xhol/Smal. Vektor pUTZ-2 bol rozštiepený enzýmom BamHI a vzniknuté zakončenia boli vyplnené za použitia dNTP a Klenowovho fragmentu za vzniku vyplnených zakončení a potom bol materiál rozštie- 58 pený pomocou enzýmu Xhol a izolované fragmenty promótora IPNS po štiepení enzýmami Xhol/Smal boli uložené do tohoto rozštiepeného vektora, čím vznikla konštrukcia, obsahujúca dve oblasti promótora IPNS. Tento vektor bol označený pUTZ-7.

Uloženie génu pre expandázu/hydroxylázu C. acremonium

Jedna z oblastí promótora IPNS potom bola izolovaná elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu z plazmidu pUTZ-7 ako fragment po štiepení Xhol/Xbal a uložená do vektora pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA) po jeho rozštiepení enzýmami Xhol/Xbal. Tento vektor bol označený pIPNSp/blue.

Gén pre expandázu/hydroxylázu Cephalosporium bol izolovaný elektroforézou a elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,6 kb po štiepení HindlII/XabI z jedného vyššie identifikovaného klonu genómu a bol uložený do miesta HindlII/Xbal rozštiepeného vektora pSELECT. Nové miesto BspHI bolo vytvorené v mieste kodónu ATG génu pre expandázu/hydroxylázu cielenú mutáciou za použitia systému na tvorbu mutácie in vitro, Altered Sites¹ (Promega Corporation) . Mutácia bola vytvorená podľa inštrukcií výrobcu. Bol skonštruovaný oligonukleotid, komplementárny ku kódovému reťazcu oblasti DNA v mieste kodónu ATG pre začiatok z uverejneného reťazca génu pre expandázu/hydroxylázu Cephalosporium acremonium podľa publikácie Samson a ďalší, Bio/Technology, zv. 5, november 1987. Oligonukleotid bol syntetizovaný za použitia kyanoetylfosfoamiditového postupu za použitia zariadenia Gene Assembler (Pharmacia), oligonukleotid mal tento reťazec:

reťazec č. 9:

GTTTTGGTGTCGTAGTAGTACTGAAGGTTCCAG

5’

Vznik mutácie bol potvrdený analýzou pomocou reštrikčných enzýmov. Potom bol elektroforézou a elúciou z agarozového gélu. izolovaný gén pre expandázu/hydroxylázu Cephalosporium acremonium ako fragment BspHI/Xbal a bol uložený do vektora pIPNSp/blue, rozštiepeného Ncol/Xbal tak, ako bol opísaný v predchádzajúcich odstavcoch. Tento vektor teda teraz obsahoval promótor IPNS Penicillium v mieste kodónu ATG génu pre expandázu/hydroxylázu Cephalosporium acremonium. Vektor bol označený pIPNSp/EXP/blue.

Táto kazeta s obsahom promótora IPNS a génu pre expandázu/hydroxylázu bola čiastočne rozštiepená enzýmom Xhol a úplne rozštiepená enzýmom Xbal a fragment bol izolovaný elektroforézou a elúciou z agarozového gélu a uložený do miesta Xhol/Xbal rozštiepeného vektora pUTZ-2 tak, ako bol opísaný vyššie, čím vznikol výsledný vektor pre transformáciu, pPEN/CEPH-1.

Príkladll

Konštrukcia vektora pre transformáciu Penicillium tak, aby došlo k expresii oboch génov pre expandázu a pre hydroxyláxu S. clavuligerus

Gén pre beta-tubulín P. chrysogenum bol klonovaný z banky genómu fágu lambda za použitia génu pre beta-tubulín Aspergillus niger ako hybridizačné sondy. Fragment s veľkosťou 2,0 kg po štiepení Xbal/HindlII, obsahujúci promótor beta-tubulín Penicillium bol uložený do miesta Xbal/HindlII plazmidu pSELECT (Promega). Miesto pôsobenia Ncol bolo vytvorené v mieste kodónu ATG pre začiatok cielenou mutagenézou reťazca AAATGCGT na reťazec ACCATGGGT. Z výsledného vektora bol na géli izolovaný po štiepení BamHI/NcoI fragment s 1,4 kb, ktorý bol uložený medzi miesta BamHI a Ncol vyššie opísaného plazmidu pUTZ-2 za vzniku vektora pCI-6. Z klonu genómu P. chrysogenum bol na géli izolovaný fragment Sali s veľkosťou 5,1 kb, obsahujúci tak IPNS,

- 60 ako aj gén pre acyltransferázu a tento fragment bol uložený do miesta Sali plazmidu pUTZ-2 za vzniku plazmidu pUTZ-5. Z plazmidu pUTZ-5 bol izolovaný 3’ terminátorový reťazec génu IPNS reštrikciou enzýmami BamHI a HindlII s následnou izoláciou fragmentu s veľkosťou 1,3 kb na géli, fragment bol potom uložený medzi miesta BamHI a HindlII vyššie opísaného plazmidu pCI-6 za vzniku plazmidu pCI-13. Jediné miesto pôsobenia Sali v blízkosti miesta BamHI v plazmide pCI-13 bolo odstránené reštrikciou, vyplnením pomocou Klenowovej polymerázy a opätovnou väzbou. Nové miesto pôsobenia Sali bolo vytvorené na druhej strane miesta BamHI cielenou mutagenézou reťazca GGAAGACG za vzniku reťazca GGTCGACG. Potom bol z plazmidu odstránený gén na odolnosť proti ampicilínu reštrikciou enzýmom Pvul, izoláciou väčšieho fragmentu a opätovnou väzbou za vzniku plazmidu pCI-15. Nakoniec bola kazeta, obsahujúca promótor IPNS a gén pre expandázu, izolovaná z plazmidu pPENFTSO na géli ako fragment s veľkosťou 2,4 kb po štiepení BamHI/SalI a kazeta bóla uložená do plazmidu pCI-15 za vzniku plazmidu pEXP-1.

Konštrukcia vektora pre expresiu oboch génov, génu pre hydroxylázu aj génu pre expandázu S. clavuligerus, zahrňuje nasledujúce stupne. Fragment s veľkosťou 2,9 kb po štiepení KpnI, obsahujúci gén pre hydroxylázu sa subklonuje v plazmide pSELECT tak, že miesto EcoRI v polyspojovníku sa nachádza smerom 5’ v bezprostrednej blízkosti génu. Jediné miesto Ncol v plazmide sa odstráni cielenou mutagenézou reťazca TCCATGGGC za vzniku reťazca TCGATGGGC a súčasne sa vytvorí v mieste kodónu pre začiatok nové miesto pôsobenia Ncol zmenou reťazca AACATGGC na reťazec ACCATGGC. Obe zmeny uchovávajú výsledný reťazec aminokyselín. Fragment s veľkosťou 1,0 kb po štiepení AcoRI/Ncol, obsahujúci skonštruovaný promótor IPNS sa izoluje na géli z plazmidu pUTZ-2 a uloží medzi miesta pôsobenia EcoRI a Ncol vyššie uvedeného vektora, obsahujúceho pozmenený gén pre hydroxylázu. Potom sa jediné miesto pôsobenia EcoRI vo výslednom vektore zmení na miesto pôsobenia HindlII cielenou mutagenézou. Konštrukcia, obsahu- 61 júca spojený gén pre hydroxylázu a 5’-IPNS sa z výsledného vektora izoluje ako fragment po pôsobení enzýmu HindlII a tento fragment sa uloží do jediného miesta pôsobenia enzýmu HindlII vo vyššie opísanom vektore pEXP-1. Výsledný vektor obsahuje gén pre expandázu a gén pre hydroxylázu, pričom každý z týchto génov je pod riadením promótora IPNS, okrem toho obsahuje tento vektor značiaci gén na odolnosť proti fleomycínu pod riadením promótora pre beta-tubulín.

Príklad 12

Konštrukcia vektora pPenCACT na transformáciu Penicillium

Uloženie génu na odolnosť proti hygromycínu

Bol skonštruovaný vektor na transformáciu Penicillium s obsahom génu na odolnosť proti hygromycínu ako dominantného značenia na selekciu. Gén pre fosfotransferázu hygromycínu B z E. coli, bol izolovaný elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,15 kb po štiepení vektora pHph-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) enzýmom BamHI a gén bol potom uložený do vektora mpl9 po jeho rozštiepení BamHI. Orientácia génu na odolnosť proti hygromycínu v mpl9 bola stanovená analýzou RF DNA pomocou reštrikčných enzýmov. 5’-miesto pôsobenia BamHI sa nachádza blízko kodónu ATG pre začiatok v géne na odolnosť proti hygromycínu. Aby bolo možné uľahčiť uloženie iného promótora do tohto 5’ BamHI miesta, bolo 3’ BamHI miesto odstránené cielenou mutagenézou za použitia balíčka na cie'TM lenú mutagenézu, Mutator (Stratagenom La Jolla, CA). Mutácia bola vytvorená podľa pokynov výrobcu. Bol skonštruovaný nukleotid, komplementárny k oblasti DNA v mieste 3’-BamHI zo zverejneného reťazca génu pre fosfotransferázu hygromycínu B E. coli (Gritz., a Davies J., 1983, Gene 25, 179). Tento oligonukleotid bol syntetizovaný za použitia kyanoetylfosforamidového postupu za použitia zariadenia Gene Assembler (Pharmacia) a mal nasledujúci reťazec:

reťazec č. 10:

5’ TACCCGGGGTTCCCGCGAACT 3 ’

Vznik mutácie bol potvrdený analýzou pomocou reštrikčných enzýmov. Mutovaný gén na odolnosť proti hygromycínu bol potom izolovaný elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu ako fragment po pôsobení enzýmov Smal/Xbal a bol uložený do vektora pUC18 po jeho rozštiepení pôsobením enzýmu Smal/Xbal.

Promótor IPNS z Penicillium bol izolovaný elektroforézou a následnou elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,2 kb z vyššie opísaného vektora pUTZ-2 po jeho rozštiepení enzýmom Ncol. Syntetické oligonukleotidové spojovníky boli syntetizované na vytvorenie miesta pôsobenia BamHI z miest pôsobenia Ncol na koncoch fragmentu promótora IPNS tak, aby promótor IPNS bol uložený v mieste 5’ BamHI blízko kodónu ATG génu na odolnosť proti hygromycínu. Oligonukleotidy boli syntetizované kyanoetylfosforamiditovou metódou za použitia zariadenia Gene Assembler (Pharmacia) a mali nasledujúce reťazce:

reťazec č. 11:

5’ CATGAAGAAG 3’ reťazec č. 12:

3’ TTCTTCCTAG 5’

Tento reťazec zachováva prírodný reťazec promótora IPNS, avšak pridáva dve aminokyseliny v géne na odolnosť proti hygromycínu. Oligonukleotidy boli spojené, fosforylované a uložené do fragmentu promótora IPNS do miesta po rozštiepení Ncol, čím došlo k vzniku miest pôsobenia BamHI na 5’ aj 3’-zakončenie fragmentu promótora IPNS. Takto modifi- 63 kovaný promótor bol uložený do génu na odolnosť proti hygromycínu, rozštiepeného enzýmom BamHI v plazmide pUS18 a orientácia bola potvrdená analýzou pomocou reštrikčných enzýmov. Táto kazeta s obsahom promótora IPNS a génu na odolnosť proti hygromycínu potom bola izolovaná elektroforézou a elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 2,1 kb po rozštiepení enzýmami Xhol/Sall (miesto Xhol je uložené na 5’-zakončení promótora IPNS a miesto pôsobenia Sali pochádza z polyspojovníka pUC) a fragment sa uloží do vektora pSELECT, rozštiepeného Sali. Orientácia kazety sa overí analýzou reštrikčným enzýmom. Takto získaný vektor bol označený pIPNS/HYG.

Uloženie génu pre acetyltransferázu Cephalosporium acremonium

Gén pre acetyltransferázu Cephalosporium bol izolovaný z vyššie opísaného klonu genómu ako fragment s veľkosťou 1,8 kb po štiepení BglII/Sall, izolácia bola uskutočnená elektrof orézou a elúciou z agarozového gélu. Gén pre acetyltransferázu bol uložený do rozštiepeného vektora pSELECT do miesta po štiepení BamHI/SalI. Aby bolo uľahčené uloženie promótora IPNS Penicillium do miesta kodónu ATG génu pre acetyltransferázu Cephalosporium, bolo vytvorené nové miesto pôsobenia enzýmu Ncol v kodóne ATG génu pre acetyltransferázu a miesto pôsobenia enzýmu Ncol vo vnútri štruktúrneho génu bolo odstránené za použitia systému pre mutagenézu in vitro. Altered Sites^ (Promega Corporation). Mutácia bola vyvolaná podľa návodu výrobcu. Boli skonštruované oligonukleotidy, komplementárne ku kódovému reťazcu príslušných oblastí DNA z reťazca génu pre acetyltransferázu Cephalosporium tak, ako boli vyššie uvedené ako reťazec č. 1 a 2. NA odstránenie vnútorného miesta pôsobenia enzýmu Ncol v štruktúrnom géne boli použité nasledujúce oligonukleotidové reťazce:

- 64 reťazec č. 13:

’ GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5 ’

Oligonukleotidový reťazec, použitý na vytvorenie nového miesta Ncol v kodóne ATG pre začiatok translácie mal nasledujúce zloženie:

reťazec č. 14:

3’ CGCCCACCATGGCGCCTCAGAT 5 ’

Tieto oligonukleotidy boli syntetizované kyanoetylfosforamiditovou metódou za použitia zariadenia Gene Assembler (Pharmacie). Vznik mutácie bol potvrdený analýzou pomocou reštrikčných enzýmov. Získaný vektor bol označený pMUTACT.

Promótor IPNS Penicillium bol izolovaný elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,2 kb po štiepení enzýmom Ncol z vektora pUTZ-2, ktorý bol podrobnejšie opísaný vyššie. Uvedený fragment promótora bol potom uložený do vektora pMUTACT do miesta pôsobenia enzýmu Ncol po rozštiepení vektora týmto enzýmom. Týmto spôsobom sa dostáva promótor IPNS do polohy kodónu ATG génu pre acetyltransferázu Cephalosporium acremonium. Orientácia promótora bola overená analýzou pomocou reštrikčných enzýmov. Uvedená kazeta s obsahom promótora IPNS a génu pre acetyltransferázu bola rozštiepená enzýmami Xhol/Sall (miesto Xhol sa nachádza na 5’-zakončení promótora IPNS a miesto Sali sa nachádza na 3’-zakončení génu pre acetyltransferázu) a potom bola uložená do vektora pSELECT po jeho rozštiepení enzýmom Sali. Orientácia fragmentu bola overená analýzou reštrikčnými enzýmami. Takto pripravený vektor bol potom označený pMUTACT/IPNS.

Mutáciou, ktorá bola použitá na vytvorenie nového miesta pôsobenia Ncol v kodóne ATG génu pre acetyltransferázu došlo k zmene druhej aminokyseliny zo serínu na alanín. Aby bolo možné udržať kódový reťazec, totožný s prírodným génom, bola uskutočnená ešte jedna cielená mutácia za použitia systému na vytvorenie mutácie in vitro Altered Sites^. Oligonukleotid bol skonštruovaný ako komplementárny ku kódovému reťazcu príslušnej oblasti DNA reťazca génu pre acetyltransferázu, tieto reťazce boli uvedené vyššie ako reťazce č. 1 a 2. K zmene druhej aminokyseliny z alanínu na serín bol použitý oligonukleotid s nasledujúcim reťazcom:

reťazec č. 15:

’ TCTAGCTAGACACCATGTCGCCTCAGAT 5 ’

Oligonukleotid bol syntetizovaný za použitia kyanoetylfosforamiditovej metódy a zariadenie Gene Assembler (Pharmacia) . Vznik mutácie bol potvrdený analýzou reťazca DNA za použitia balíčku na stanovenie reťazca DNA, USB Sequenase Version 2.0 (USB, Cleveland, Ohio). Priméry na analýzu reťazca boli syntetizované kyanoetylfosforamiditovou metódou a zariadením Gene Assembler (Pharmacia). Získaný vektor bol označený pMUTACT/IPNS-2.

Kazeta, obsahujúca promótor IPNS a gén na odolnosť proti hygromycínu sa vyberie z vektora pIPNS/HYG ako fragment po štiepení Xbal a uloží sa do vektora pMUTACT/IPNS-2, rozštiepeného pPenCACT. Orientácia kazety na odolnosť proti hygromycínu sa stanoví analýzou reštrikčnými enzýmami.

Príklad 13

Konštrukcia vektora p-TS-8 na transformáciu Penicillium tak, aby dochádzalo k expresii génu pre expandázu/hydroxylázu aj génu pre acetyltransferázu z Cephalosporium acremonium

Gén pre acetyltransferázu Cephalosporium bol izolovaný elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,8 kb kolonu genómu po rozštiepení enzýmu BglII/Sall a bol uložený do vektora pSELECT (Promega Corporation), rozštiepeného BamHI/SalI. Na uľahčenie vhodného uloženia promótora IPNS Penicillium do kodónu ATG génu pre acetyltransferázu Cephalosporium sa vytvorí nové miesto pôsobenia Ncol v kodóne ATG, uloženého u bázy - 42 (Mathison a ďalší, Current Genetics, v tlači) a odstráni sa vnútorné miesto Ncol v štruktúrnom géne vyvolaním cielenej mutácie za použitia systému na vyvolanie mutácie in vitro, Altered Sites (Promega Corporation). Mutácia bola vyvolaná podlá návodu výrobcu. Oligonukleotidy boli skonštruované tak, aby boli komplementárne ku kódovým oblastiam v príslušnej časti reťazca DNA, avšak boli zaradené niektoré zmeny tak, aby došlo k vytvoreniu alebo odstráneniu miesta pôsobenia enzýmu Ncol. Oligonukleotid, použitý na odstránenie vnútorného miesta pôsobenia Ncol v štruktúrnom géne mal nasledujúci reťazec:

reťazec č. 16:

3’ GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5’

Oligonukleotid, použitý na vytvorenie nového miesta pôsobenia enzýmu Ncol v kodóne ATG u bázy - 42 mal nasledujúci reťazec:

reťazec č. 17:

5’ CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT 3’

Oligonukleotidy boli syntetizované kyanoetylfosforamiditovou metódou za použitia zariadenia Gene Assembler (Pharmacia) . Vznik oboch mutácií bol potvrdený analýzou reštrikčnými enzýmami. Získaný vektor bol označený pMUTACT. Promótor IPNS Penicillium bol izolovaný elektroforézou a následnou elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,2 kb z vektora pUTZ-2, ktorý bol podrobnejšie opísaný vyššie, po jeho rozštiepení enzýmom Ncol. Tento fragment promótora potom bol uložený do vektora pMUTACT po jeho rozštiepení enzýmom Ncol, promótor IPNS bol teraz uložený priamo v -42 ATG géne pre acetyltransferázu Cephalosporium. Orientácia promótora bola potvrdená analýzou reštrikčnými enzýmami. Takto získaný vektor bol označený pMUTAC/IPNS. Z vektora pMUTACT/IPNS bol elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu izolovaný fragment s veľkosťou 2,5 kb štiepením Xhol/Sall, tento fragment obsahoval kazetu s promótorom IPNS a génom pre acetyltransferázu, táto kazeta potom bola uložená do vyššie opísaného vektora pUTZ-2, rozštiepeného Sali. Tento vektor, vytvorený ako medziprodukt bol potom rozštiepený enzýmom Xbal a naviazaný na fragment Xbal s veľkosťou 2,1 kb z vyššie opísaného vektora pPEN/CEPH-1, obsahujúceho kazetu s promótorom IPNS a génom pre expandázu/hydroxylázu, čím bol získaný výsledný vektor pre transformáciu, ktorý bol označený pTS-8.

Príklad 14

Transformácia Penicillium chrysogenum

Protoplasty z vyššie uvedeného kmeňa Penicillium chrysogenum boli vytvorené naočkovaním 50 ml kvapalného živného prostredia CM za použitia 1 x 10 spór na 67 hodín, po túto dobu bolo prostredie udržované na teplote 25 °C na rotačnej trepačke pri 220 ot/minútu. Mycélium bolo oddelené filtráciou cez vrstvu mulu, preneseného do fliaš s objemom 500 ml a znova uvedené do suspenzie v 25 ml prostredia KMP s obsahom 0,7 M KC1, 0,8 M mannitolu, 0,02 M KPO₄ s pH 6,3, okrem toho obsahovalo prostredie 100 mg prostriedku Novozyme 234 (Novo BioLabs, Bagsvaerd, Dánsko), potom bolo prostredie inkubované pri 30 °C a 100 ot/minútu. Sferoplasty boli oddelené filtráciou cez vrstvu mulu a sklenenej vaty a usadené odstredením 10 minút pri 350.g. Potom boli sferoplasty trikrát premyté 10 ml pufra KMP a znovu uvedené do suspenzie v KMPC (KMP s 50 mM CaC^) do koncentrácie 5 ‘x 10⁷

- 68 buniek/ml a zmes bola ponechaná pri teplote miestnosti 20 minút. Na transformáciu Penicillium bolo 200 mikrolitrov suspenzie sferoplastu pridaných k DNA (5 mikrogramov DNA vektora v 6,2 mikrolitroch KMPC s 5 mg/ml heparínu) s 50 mikrolitrami PPC (40% PEG s molekulovou hmotnosťou 3500, 20 mM KPO^ s pH 6,3 5% CaCl₂ bol pridaný tesne pred použitím) a výsledná zmes bola inkubovaná v ľade celkom 30 minút. Potom bol pridaný 1 ml čerstvo pripraveného PPC a zmes bola prenesená do 50 ml agaru na regeneráciu s teplotou 50 °C (CM plus 1,3 M mannitolu a 3 % agaru). Transformačná zmes bola potom rozdelená do piatich Petriho misiek. Po regenerácii 24 hodín pri 25 °C boli platne prevrstvené OL (1% peptón v 10 agare) s obsahom 100 mikrogramov/50 ml fleomycínu. Množstvo materiálu na prevrstvenie bolo rovnaké ako množstvo agaru na regeneráciu. Platne potom boli inkubované 7 až 14 dní pri 25 °C a bola pozorovaná tvorba kolónií transformovaného organizmu.

Príklad 15

Skúšky na biologickú účinnosť

Biologická skúška s difúziou v agare bola použitá na stanovenie antibiotickej účinnosti fermentačných produktov adipoyl-6-APA a adipoyl-7-ADCA, izolovaných pomocou HPLC. 20 mikrolitrov izolovaného produktu bolo nanesené na kotúče s priemerom 5 mm na platni agaru LB (20 g/liter základného bujónu LB s 3% agarom, Gibco, Paisley, Škótsko), agar bol naočkovaný kmeňom Bacillus subtilis ATCC 33677 alebo E. coli, supersenzitívnym kmeňom (Prof. Arnold L. Demain, MIT). Bacillus subtilis bol použitý ako indikátorový kmeň na zistenie adipoyl-6-ΑΡΑ a supersenzitívny kmeň E. coli bol použitý ako indikátorový kmeň na zistenie adipoyl-7-ADCA. Po 15 hodinách inkubácie pri teplote 37 “C bolo možné pozorovať halo inhibície rastu indikátorovej baktérie okolo kotúča, čo znamená, že produkty mali biologickú účinnosť. Ako kontroly v tomto pokuse boli použité deacetoxycefalosporín C, cefa* 69 losporín C, penicilín V a agar s obsahom alebo bez obsahu penicilinázy ako kontrola na potvrdenie beta-laktámovej štruktúry.

Príklad 16

Metóda HPLC na súčasnú analýzu adipoyl-6-ΑΡΑ, -7-ADCA, -7-ADAC a -7-ACA

Fermentačné produkty z transformovaných kmeňov Penicillium, adipoyl-6-ΑΡΑ, adipoyl-7-ADCA, adipoyl-7-ADAC a adipoyl-7-ACA boli súčasne analyzované vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou, HPLC. Systém HPLC bol tvorený nasledujúcimi zložkami (Vaters): systém na prívod rozpúšťadla 625, detektor vlnovej dĺžky 409E (nastavený na 220 nm a 260 nm), systém pre maximálne údaje 825. Stacionárnou fázou bola zlisovaná radiálna náplň Nova-Pak C^g s rozmermi 5 x 100 mm s vloženým systémom Nova-Pak C^g Guard-Pak. Pri rýchlosti prietoku 1 ml/minútu bola'mobilná fáza tvorená lineárnym gradientom, ktorý sa po 10 minútach menil z počiatočného zloženia 5 % metanolu a 95 % 10 mM KP0₄ s pH 5 na % metanole a 60 % KPO₄ s pH 5. Adipoyl-6-APA bola kvantitatívne stanovená porovnaním so štandardnou krivkou pre penicilín N pri 220 nm. Expandované produkty boli kvantitatívne stanovené porovnaním so štandardnými krivkami pre syntetickú adipoyl-7-ADCA a adipoyl-7-ACA pri 260 nm.

Príklad 17

Skúšky na enzým RAEV

Chemicky syntetizovaná adipoyl-7-ADCA a adipoyl-7-ACA boli použité ako substráty na stanovenie špecifickej účinnosti enzýmu RAEV (bežne dodávaný RAEV Corp.). Reakčná zmes obsahovala 10 mM substrátu, 1 mikrogram enzýmu RAEy, 5 % glycerolu v 0,16 M KH2PO4 v celkovom objeme 50 mikrolitrov, zmes bola inkubovaná pri 37 °C. Optimálnejšie reakčné pod- 70 mienky zahrňujú použitie aspoň 20 mM substrátu v 20 až 50 mM pufra s fosforečnanom draselným. Podiely po 5 mikrolitroch sa odoberajú v čase 0 a po 1, 3, 5, 10, 20 a 30 minútach, zriedia sa 35 ml 0,01 M KH₂P0₄ s pH 3,5 a zmrazia sa na -70 °C pred analýzou pomocou HPLC za vyššie uvedených podmienok.

Účinnosť enzýmu RAEV na kyselinu adipoyl-p-aminobenzoovú ako na kolorimetrický substrát bola stanovená za použitia 5 mM substrátu, 8,25 mikrogramov enzýmu RAEV, 10 % glycerolu v 0,065 M KH₂PO₄ s pH 7,0 v celkovom objeme 50 mikrolitrov celkom 30 minút pri 37 ’C. Reakcia bola vykonávaná za použitia mikrotitračnej platne s 96 vyhĺbeninami. Na ukončenie reakcie bolo pridaných 50 mikrolitrov riedenie 1 : 100 1 M NaN0₂ v 0,25 M kyseline octovej a reakčná zmes bola ponechaná 3 minúty pri laboratórnej teplote. Potom bolo pridaných 100 mikrolitrov riedenie 1 : 100 hydrátu monosodnej soli kyseliny 4-amino-5-hydroxy-2,7-naftaléndisulfónovej s obsahom 10 mg/ml vo vode v 0,5 M uhličitane sodnom a vznik sfarbenia bol okamžite sledovaný pri 515 nm za použitia odčítacieho zariadenia EL 312 Bio-kinetics (BioTek Instruments) .

Príklad 18

Stanovenie alternatívnych adipoylacyláz

Okrem skúšok za použitia enzýmu RAEV na odstránenie adipoylového bočného reťazca z adipoyl-7-ADCA alebo iných adipoylových zlúčenín boli použité aj ďalšie enzýmy, produkované celým radom mikroorganizmov. Pri počiatočných skúškach boli pestované kmene Pseudomonas sp., SE-83 a SE-495 (Asahi), uložené v zbierke Fermentation Research Inštitúte pod číslom FERM BP-817 a FERM BP-818 a kmeň Pseudomonas SY-77-1 (Toyo Jožo), uložený v zbierke Northern Regional Research Laboratory pod číslom NRRL B-8070 celkom 72 hodín v prostredí, ktoré obsahovalo 2,0 % HyCase SF, 0,5 % monosodnej soli kyseliny glutamovej, 0,5 % extraktu z kvasníc,

0,2 % tuhého podielu kukuričného výluhu, 0,5 % oleja z bavlníkových semien a 0,1 % kyseliny glutarovej, ide vždy o percentá hmotnostné. Bunky boli oddelené odstredením, premyté 50 mM fosfátovým pufrom s pH 8,0 a potom znova uvedené do suspenzie v pufri a vonkajšie membrány boli spracované pôsobením malého objemu chloroformu, čím sa stali priepustnými . Potom bol podiel bunkovej suspenzie zmiešaný s adipoyl-paranitroanilidom (ad-pNA) a inkubovaný pri teplote 30 °C celkom 2 až 18 hodín. Po inkubácii boli zmesi okyslené pridaním 10 % objemových kyseliny octovej. Uvoľnený p-nitroanilín bol potom dokázaný kolorimetricky po jeho premene na diazozlúčeninu použitím reakčných činidiel, dodávaných vo forme skúšobného balíčka na stanovenie gamma-glutamyltransferázy (Sigma Chemical Company č. 545-A). Relatívna účinnosť uvedených troch kmeňov bola 100 % pre SE-495, 85,5 % pre SE-83 a 48 % pre SY-77-1. Pri použití podobných skúšok ako s enzýmom RAEV vyššie uvedených, bola tiež preukázaná účinnosť enzýmu SE-83 a SE-495 na adipoyl-7-ADCA ako na substrát. Produkt z beta-laktamázy kmeňom SY-77-1 zabránilo stanoveniu deacylačnej účinnosti tohto kmeňa na adipoyl-7-ADCA.

Obdobným spôsobom bola tiež preukázaná produkcia adipoylacylázy pre dva kmene húb, Alternaria sp. MA-133, ATCC č. 20492 a Aspergillus sp. MA-13, ATCC č. 20491, ATCC č. 20491, kmeň je uvedený v US 4 141 790 (Meiji Seika Kaiska Ltd.) a tiež pre tri ďalšie bakteriálne kmene, Brevibacterium ATCC č. 14 649, Achromobacterium ATCC č. 14 648 a Flavobacterium ATCC č. 14 650, tieto kmene boli opísané ako kmene, produkujúce acylázu cefalosporínu C v US 3 239 394 (Merck & Co., Inc.).

Ďalej budú uvedené v zozname reťazcov všeobecné informácie o prihláške a podrobnejšie údaje týkajúce sa reťazcov, ktoré boli v priebehu prihlášky opísané.

Zoznam reťazcov

1) Všeobecná informácia

i) prihlasovateľ: Conder Michael J.

McAda, Phyllis

Rambosek John Reeves Cristopher D.

ii) názov vynálezu: Biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanovej, spôsob pestovania rekombinačných buniek Penicillium chrysogenum a vektor na expresiu rekombinačnej DNA.

iii) počet reťazcov: 17 iv) adresa na korešpondenciu:

A)	adresát:	Merck & Co. ,	Inc.
B)	ulica:	126 E. Lincoln Ave
C)	mesto:	Rahway
D)	štát:	New Jersey
E)	kraj ina:	USA
F)	ZIP:	07065

v) forma na odčítanie počítačom:

A) typ prostredia: Floppy disk

B) počítač: IBM PC kompatibilný

C) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Software: Patentln Release 1,0, verzia 1,25 vi) údaje o prihláške:

A) číslo prihlášky: PCT IUS 92/08585

B) deň podania: 8.10.1992

- 73 C) klasifikácia: C 12 N 15/52, 1/15, C 12 P 35/02 viii) Informácie o zástupcovi:

A) meno: Speer Raymond M.

B) číslo registrácie: 26 810

C) číslo spisu: 18572IA ix) Telekomunikačné informácie:

A) telefón: (908) 594-4481

B) telefax: (908) 594-4720

2) Informácie pre reťazec č. 1:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 14 párov, báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ^: dvoj itý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 1:

ACTAGACACC ATGG 14

2) Informácie pre reťazec č. 2:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 16 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: dvojitý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 2:

GTGAGAGTTG ATGGAC 16

2) Informácie pre reťazec č. 3:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 16 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ^: dvoj itý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 3:

TCTAGACACT ATGGAC 16

2) Informácie pre reťazec č. 4:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 16 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: dvoj itý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 4:

TCTAGACACC ATGGAC 16

2) Informácie pre reťazec č. 5:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 aminokyselín

B) druh: aminokyseliny

C) typ: j ednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: peptid xi) Opis reťazca č. 5:

Ser Asn Ser Gly Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala 15 10 15

Asn Gly Asn Ala Leu Leu Gin Asn Pro 20

2) Informácie pre reťazec č. 6:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 aminokyselín

B) druh: aminokyseliny

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: peptid xi) Opis reťazca č. 6:

Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn 15 10 15

Ala Leu Leu Leu Gin Asn Pro 20

2) Informácie pre reťazec č. 7:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 aminokyselín

B) druh: aminokyseliny

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: peptid xi) Opis reťazca č. 7:

Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala 15 10 15

Thr Gly Arg Pro íle Leu Ala Gly Asp Pro 20

2) Informácie pre reťazec č. 8:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 34 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 8:

CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG 34

2) Informácie pre reťazec č. 9:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 33 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 9:

GTTTTGGTGT CGTAGTAGTA CTGAAGGTTC CAG

2) Informácie pre reťazec č. 10:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 21 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: j ednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 10:

TACCCGGGGT TCCCGCGAAC T 21

2) Informácie pre reťazec č. 11:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 10 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 11:

CATGAAGAAG 10

2) Informácie pre reťazec č. 12:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 10 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 12:

TTCTTCCTAG 10

2) Informácie pre reťazec č. 13:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 23 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 13:

GTCGGCGCAT CGATGGGTGG AAT

2) Informácie pre reťazec č. 14:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: j ednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 14:

CGCCCACCAT GGCGCCTAG AT 22

2) Informácie pre reťazec č. 15:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 15:

TCTAGCTAGA CACCATGTCG CCTCAGAT

2) Informácie pre reťazec č. 16:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 23 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: j ednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 16:

GTCGGCGGCAT CGATGGGTGG AAT 23

2) Informácie pre reťazec č. 17:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 35 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA až mRNA xi) Opis reťazca č. 17:

CTCCGATAGG GCGTGGTACC CGGCCCTACT CTTAT

Claims (3)

1. Biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanovej, 7-ADAC, vyznačujúci sa tým, že sa

1) v živnom prostredí, vhodnom pre jeho rast udržuje kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N a k živnému prostrediu sa pridáva adipát, obsahujúci jednu alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová, jej soli a jej estery, ktoré sú kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané na výrobu kyseliny adipoyl-6-aminopenicilanovej , adipoyl-6-ΑΡΑ, za vzniku tejto kyseliny, potom sa

2) vykonávajú in situ expresiou zodpovedajúceho génu nasledujúce enzymatické premeny:

a) je expandovaný in situ kruh adipoyl-6-APA za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodesacetoxycefalosporanovej, adipoyl-7-ADCA pôsobením enzýmu expandázy, pričom kmeň P. chrysogenum je predbežne transformovaný kódovou DNA pre enzým expandázu, schopný pôsobiť na adipoyl-6-APA ako na substrát, výsledkom tejto expresie je expanzia kruhu adipoyl-6-APA in situ za vzniku adipoyl-7-ADCA,

b) 3-metylový bočný reťazec adipoyl-7-ADCA je in situ hydroxylovaný za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporanovej, adipoyl-7-ADAC pôsobením hydroxylázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predbežne transformovaný kódovou DNA pre tento enzým hydroxylázu, schopný pôsobiť na adipoyl-7-ADCA ako na substrát, výsledkom tejto expresie je hydroxylácia adipoyl-7-ADCA za vzniku adipoyl-7-ADAC a

3) adipoyl-7-ADAC sa uvedie do styku s adipoylamidázou, čím dôjde k odstráneniu bočného reťazca za vzniku 7-ADAC, ktorá sa izoluje.

2. Biologický spôsob podľa nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že sa ako adipát použije disodná soľ kyseliny adipovej.

3. Biologický spôsob podľa nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že sa kódová DNA pre enzýmy expandázu a hydroxylázu použije z Cephalosporium acremonium.

r

4. Biologický spôsob podľa nároku 3, vyznačuj ú» c i satým, že sa použije jediný bifunkčný enzým expandáza/hydroxyláza.

5. Biologický spôsob podľa nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že sa použije adipoylamidáza z čeľade Pseudomonas.

6. Biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminocefalosporanovej , 7-ACA, vyznačujúci sa tým, že sa

1) v živnom prostredí, vhodnom pre jeho rast pestuje kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N a k živnému prostrediu sa pridáva adipát, obsahujúci jednu alebo * väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová, jej soli

..· alebo jej estery, ktoré sú kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané na výrobu kyseliny adipoyl-6-aminopenicilanovej, adipoyl-6-ΑΡΑ, za vzniku tejto kyseliny, potom sa

2) vykonávajú in situ expresiou zodpovedajúceho génu nasledujúce enzymatické premeny:

a) je expandovaný in situ kruh adipoyl-6-APA za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodesacetoxycefalosporanovej, adipoyl-7-ADCA pôsobením enzýmu expandázy, pričom kmeň P. chrysogenum je predbežne transformovaný kódovou DNA pre enzým expandázu, schopný pôsobiť na adipoyl-6-ΑΡΑ ako na substrát, výsledkom tejto expresie je expanzia kruhu adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku adipoyl-7-ADCA,

b) 3-metylový bočný reťazec adipoyl-7-ADCA je in situ hydroxylovaný za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporanovej, adipoyl-7-ADAC pôsobením hydroxylázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predbežne transformovaný kódovou DNA pre tento enzým, schopný pôsobiť na φ adipoyl-7-ADCA ako na substrát, výsledkom tejto expresie je hydroxylácia adipoyl-7-ADCA za vzniku adipoyl-7-ADAC » a

c) adipoyl-7-ADAC sa in situ acetyluje za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminocefalosporanovej, adipoyl-7-ACA pôsobením enzýmu acetyltransferázy, pričom uvedený kmeň P. chrysogenum bol predbežne transformovaný kódovou DNA pre enzým acetyltransferázu, schopný pôsobiť na adipoyl-7-ADAC ako substrát, v dôsledku tejto expresie dochádza k acetylácii adipoyl-7-ADAC, produkovanej týmto kmeňom, in situ za vzniku adipoyl-7-ACA a

3) adipoyl-7-ACA sa uvedie do styku s adipoylamidázou, čím dôjde k odstráneniu adipoylového bočného reťazca za vzniku j 7-ACA, ktorá sa izoluje.

* 7. Biologický spôsob podlá nároku 6, vyznačuj úci sa tým, že sa ako adipát použije disodná soľ kyseliny adipovej.

8. Biologický spôsob podľa nároku 6, vyznačuj úc i sa tým, že sa kódová DNA pre enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu odvodí z Cephalosporium acremonium .

9. Biologický spôsob podľa nároku 8, vyznačuj úc i sa tým, že sa použije jediný bifunkčný enzým expandáza/hydroxyláza.

10. Biologický spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že sa použije adipoylamidáza z čeľade Pseudomonas.

11. Rekombinačné vektory na expresiu DNA, plazmidy 1) PEN/CEPH-1, 2) pPenCACT a 3) pTS-8, schopné integrácie do chromozomálnej DNA rekombinačného kmeňa Penicillium chrysogenum, tvorené v podstate kódovou DNA pre expandázu/hydroxylázu a/alebo acetyltransferázu z Cephalosporium acremonium a promótorom na zaistenie expresie kódovej DNA pre expandázu/hydroxylázu a/alebo acetyltransferázu, ktorým je v podstate promótor génu IPNS Penicillium chrysogenum.'

12. Hostiteľská bunka Penicillium Chrysogenum PC 200, ATCC 74186 alebo PC 300, ATCC 74187, transformovaná plazmidom pPEN/CEPH-1 alebo plazmidom pTS-8 ako vektorom na expresiu DNA, integrovaným do chromozomálnej DNA hostiteľskej bunky a v podstate tvoreným kódovou DNA pre expandázu/hydroxylázu spolu s acetyltransferázou z Cephalosporium acremonium spolu s acetyltransferázou z Cephalosporium acremonium a promótorom, zaisťujúcim expresiu kódovej DNA pre expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu, tvorený v podstate promótorom génu IPNS Penicillium chrysogenum.

13. Spôsob pestovania rekombinačnej hostiteľskej bunky Penicillium chrysogenum za podmienok, vhodných na expresiu génu, vyznačujúci sa tým, že rekombinačná hostiteľská bunka obsahuje ako vektor na expresiu rekombinačnej DNA plazmid pPEN/CEPH-1 alebo plazmid pTS-8, integrovaný do chromozomálnej DNA hostiteľskej bunky a v podstate tvorený kódovou DNA pre expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu z Cephalosporium acremonium a promótor na zaistenie expresie tejto kódovej DNA pre expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu, tvorený v podstate promótorom génu