RU2664226C2 - Дифференцирование человеческой эмбриональной стволовой клетки в линию панкреатических эндокринных клеток - Google Patents
Дифференцирование человеческой эмбриональной стволовой клетки в линию панкреатических эндокринных клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2664226C2 RU2664226C2 RU2014114039A RU2014114039A RU2664226C2 RU 2664226 C2 RU2664226 C2 RU 2664226C2 RU 2014114039 A RU2014114039 A RU 2014114039A RU 2014114039 A RU2014114039 A RU 2014114039A RU 2664226 C2 RU2664226 C2 RU 2664226C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- markers characteristic
- expressing markers
- line
- cells expressing
- Prior art date
Links
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 100
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 title claims abstract description 95
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 66
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 456
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 156
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 138
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 116
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 78
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 78
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H iron(3+);methyl-dioxido-oxo-$l^{5}-arsane Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims abstract description 67
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 239000002875 cyclin dependent kinase inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 18
- 229940126074 CDK kinase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 102100034770 Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 101000945639 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 claims description 114
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 65
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 claims description 31
- -1 (4- (aminosulfonyl) phenyl) amino Chemical group 0.000 claims description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 21
- 102100041030 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101150079937 NEUROD1 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 claims description 12
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 claims description 11
- 101000613495 Homo sapiens Paired box protein Pax-4 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100040909 Paired box protein Pax-4 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100028096 Homeobox protein Nkx-6.2 Human genes 0.000 claims description 10
- 101000578254 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.1 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000578258 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 claims description 10
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 10
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 claims description 7
- 102100029087 Hepatocyte nuclear factor 6 Human genes 0.000 claims description 7
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 claims description 7
- 101000988619 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 6 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 claims description 7
- ARIOBGGRZJITQX-UHFFFAOYSA-N 5-amino-3-{[4-(aminosulfonyl)phenyl]amino}-n-(2,6-difluorophenyl)-1h-1,2,4-triazole-1-carbothioamide Chemical group N=1N(C(=S)NC=2C(=CC=CC=2F)F)C(N)=NC=1NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 ARIOBGGRZJITQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims description 6
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000576323 Homo sapiens Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100025170 Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 claims description 5
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037986 Dickkopf-related protein 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035308 Fibroblast growth factor 17 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100038146 Homeobox protein goosecoid Human genes 0.000 claims description 5
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101000951340 Homo sapiens Dickkopf-related protein 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000878124 Homo sapiens Fibroblast growth factor 17 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000819088 Homo sapiens Transcription factor GATA-6 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 claims description 5
- 102100021382 Transcription factor GATA-6 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000914195 Homo sapiens Cerberus Proteins 0.000 claims description 4
- 101001069749 Homo sapiens Prospero homeobox protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100033880 Prospero homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 229940083347 Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 77
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 63
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 60
- 101000979205 Homo sapiens Transcription factor MafA Proteins 0.000 description 60
- 102100023237 Transcription factor MafA Human genes 0.000 description 60
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 33
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 33
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 33
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 33
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 30
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 26
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 22
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 22
- 101100217147 Caenorhabditis elegans arx-4 gene Proteins 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 21
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 14
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 14
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 14
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 14
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 14
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 14
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 14
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 13
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 13
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 13
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 13
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 11
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 11
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 11
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 11
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 11
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 11
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 11
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 11
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 11
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 11
- LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 1,5-naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1h-pyrazol-4-yl]- Chemical compound CC1=CC=CC(C2=C(C=NN2)C=2N=C3C=CC=NC3=CC=2)=N1 LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- WDHRPWOAMDJICD-FOAQWNCLSA-N n-[2-[(3'r,3'as,6's,6as,6bs,7'ar,9r,11as,11br)-3',6',10,11b-tetramethyl-3-oxospiro[1,2,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-decahydrobenzo[a]fluorene-9,2'-3,3a,5,6,7,7a-hexahydrofuro[3,2-b]pyridine]-4'-yl]ethyl]-6-(3-phenylpropanoylamino)hexanamide Chemical compound C([C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@H]([C@]3(C(=C4C[C@@H]5[C@@]6(C)CCC(=O)CC6=CC[C@H]5[C@@H]4CC3)C)O1)C)N2CCNC(=O)CCCCCNC(=O)CCC1=CC=CC=C1 WDHRPWOAMDJICD-FOAQWNCLSA-N 0.000 description 10
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 9
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 9
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 9
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 9
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 9
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 9
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 9
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 9
- 101100129232 Danio rerio mafaa gene Proteins 0.000 description 8
- 101150051019 Klrg1 gene Proteins 0.000 description 8
- 101150084866 MAFA gene Proteins 0.000 description 8
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 8
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 8
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 8
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 8
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 8
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 description 6
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 6
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 6
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 description 6
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 6
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 5
- 108010025454 Cyclin-Dependent Kinase 5 Proteins 0.000 description 5
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 5
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 5
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 5
- ZKZXNDJNWUTGDK-NSCUHMNNSA-N (E)-N-[2-(4-bromocinnamylamino)ethyl]isoquinoline-5-sulfonamide Chemical compound C1=CC(Br)=CC=C1\C=C\CNCCNS(=O)(=O)C1=CC=CC2=CN=CC=C12 ZKZXNDJNWUTGDK-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 4
- ZVPDNRVYHLRXLX-UHFFFAOYSA-N 1-ter-butyl-3-p-tolyl-1h-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ylamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=NN(C(C)(C)C)C2=NC=NC(N)=C12 ZVPDNRVYHLRXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 101100518002 Danio rerio nkx2.2a gene Proteins 0.000 description 4
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 4
- 101710146526 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 4
- 108700014808 Homeobox Protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 description 4
- 102100027886 Homeobox protein Nkx-2.2 Human genes 0.000 description 4
- 101100460496 Homo sapiens NKX2-2 gene Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 4
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- WXUJAQBSBZLVEV-UHFFFAOYSA-N isogranulatimide Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1N1C=NC=C1C1=C2C(=O)NC1=O WXUJAQBSBZLVEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-M nicotinate Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- PZIRTMUUDNWDHP-BGPOSVGRSA-N (e)-2-cyano-n-[2-[[(e)-2-cyano-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]amino]ethyl]-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enamide Chemical compound C1=C(O)C(O)=CC=C1\C=C(/C#N)C(=O)NCCNC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 PZIRTMUUDNWDHP-BGPOSVGRSA-N 0.000 description 3
- KFAKESMKRPNZTM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimethoxy-10H-acridine-9-thione Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C(=S)C2=C1C(OC)=CC=C2OC KFAKESMKRPNZTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BQCNSTFWSKOWMA-GORDUTHDSA-N 2,5-dihydroxycinnamic acid methyl ester Chemical compound COC(=O)\C=C\C1=CC(O)=CC=C1O BQCNSTFWSKOWMA-GORDUTHDSA-N 0.000 description 3
- DPDZHVCKYBCJHW-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(C(=O)N)=CC=C1C1=NC(C=2C=C3OCCOC3=CC=2)=C(C=2N=CC=CC=2)N1 DPDZHVCKYBCJHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XHSQDZXAVJRBMX-DDHJBXDOSA-N 5,6-dichloro-1-β-d-ribofuranosylbenzimidazole Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N=C1 XHSQDZXAVJRBMX-DDHJBXDOSA-N 0.000 description 3
- ULTTYPMRMMDONC-UHFFFAOYSA-N 5-[(2,5-dihydroxyphenyl)methyl-[(2-hydroxyphenyl)methyl]amino]-2-hydroxybenzoic acid Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N(CC=2C(=CC=CC=2)O)CC=2C(=CC=C(O)C=2)O)=C1 ULTTYPMRMMDONC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 3
- 229940126638 Akt inhibitor Drugs 0.000 description 3
- DQYBRTASHMYDJG-UHFFFAOYSA-N Bisindolylmaleimide Chemical compound C1=CC=C2C(C=3C(=O)NC(C=3C=3C4=CC=CC=C4NC=3)=O)=CNC2=C1 DQYBRTASHMYDJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150012716 CDK1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000013717 Cyclin-Dependent Kinase 5 Human genes 0.000 description 3
- 241001453233 Doodia media Species 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 229940125373 Gamma-Secretase Inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 description 3
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 3
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 3
- 101001032602 Homo sapiens Homeobox protein goosecoid Proteins 0.000 description 3
- 102100034170 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Human genes 0.000 description 3
- 101710089751 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 239000012825 JNK inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229940118135 JNK inhibitor Drugs 0.000 description 3
- GEHJIACZUFWBTK-UHFFFAOYSA-N ML-7 Chemical compound C1=CC=C2C(I)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 GEHJIACZUFWBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100034388 Netrin-4 Human genes 0.000 description 3
- 101710121532 Netrin-4 Proteins 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 3
- 108700020479 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 3
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 3
- 102000014104 Transcription factor MafA Human genes 0.000 description 3
- 108050003977 Transcription factor MafA Proteins 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- FQCPPVRJPILDIK-UHFFFAOYSA-N chembl126077 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C(N=O)=C1C1=C(O)NC2=CC=CC=C21 FQCPPVRJPILDIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZQSIJRDFPHDXIC-UHFFFAOYSA-N daidzein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC=C2C1=O ZQSIJRDFPHDXIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 239000003540 gamma secretase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 description 3
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 description 3
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- HBDSHCUSXQATPO-BGBJRWHRSA-N indirubin-3'-monoxime Chemical compound O=C/1NC2=CC=CC=C2C\1=C\1/C(=N/O)/C2=CC=CC=C2N/1 HBDSHCUSXQATPO-BGBJRWHRSA-N 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 3
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- GTVPOLSIJWJJNY-UHFFFAOYSA-N olomoucine Chemical compound N1=C(NCCO)N=C2N(C)C=NC2=C1NCC1=CC=CC=C1 GTVPOLSIJWJJNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003197 protein kinase B inhibitor Substances 0.000 description 3
- PMXCMJLOPOFPBT-HNNXBMFYSA-N purvalanol A Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)C(C)C)=NC=1NC1=CC=CC(Cl)=C1 PMXCMJLOPOFPBT-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 3
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 3
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- UOHFCPXBKJPCAD-UHFFFAOYSA-N tyrphostin 1 Chemical compound COC1=CC=C(C=C(C#N)C#N)C=C1 UOHFCPXBKJPCAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- QDLHCMPXEPAAMD-QAIWCSMKSA-N wortmannin Chemical compound C1([C@]2(C)C3=C(C4=O)OC=C3C(=O)O[C@@H]2COC)=C4[C@@H]2CCC(=O)[C@@]2(C)C[C@H]1OC(C)=O QDLHCMPXEPAAMD-QAIWCSMKSA-N 0.000 description 3
- BGVLELSCIHASRV-QPEQYQDCSA-N (1z)-1-(3-ethyl-5-methoxy-1,3-benzothiazol-2-ylidene)propan-2-one Chemical compound C1=C(OC)C=C2N(CC)\C(=C\C(C)=O)SC2=C1 BGVLELSCIHASRV-QPEQYQDCSA-N 0.000 description 2
- JKNOYWVMHPMBEL-UNXLUWIOSA-N (3z)-2-amino-4-(3,4,5-trihydroxyphenyl)buta-1,3-diene-1,1,3-tricarbonitrile Chemical compound N#CC(C#N)=C(N)\C(C#N)=C\C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 JKNOYWVMHPMBEL-UNXLUWIOSA-N 0.000 description 2
- CRDNMYFJWFXOCH-YPKPFQOOSA-N (3z)-3-(3-oxo-1h-indol-2-ylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound N/1C2=CC=CC=C2C(=O)C\1=C1/C2=CC=CC=C2NC1=O CRDNMYFJWFXOCH-YPKPFQOOSA-N 0.000 description 2
- UAKWLVYMKBWHMX-PTNGSMBKSA-N (3z)-3-[[4-(dimethylamino)phenyl]methylidene]-1h-indol-2-one Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\C=C/1C2=CC=CC=C2NC\1=O UAKWLVYMKBWHMX-PTNGSMBKSA-N 0.000 description 2
- DOEWDSDBFRHVAP-KRXBUXKQSA-N (E)-3-tosylacrylonitrile Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)\C=C\C#N)C=C1 DOEWDSDBFRHVAP-KRXBUXKQSA-N 0.000 description 2
- USOXQZNJFMKTKJ-XVNBXDOJSA-N (e)-2-cyano-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enamide Chemical compound NC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 USOXQZNJFMKTKJ-XVNBXDOJSA-N 0.000 description 2
- VPBYZLCHOKSGRX-UHFFFAOYSA-N 1-[2-chloro-4-(6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl)oxyphenyl]-3-propylurea Chemical compound C1=C(Cl)C(NC(=O)NCCC)=CC=C1OC1=NC=NC2=CC(OC)=C(OC)C=C12 VPBYZLCHOKSGRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GMGIWEZSKCNYSW-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one;dihydrate Chemical compound O.O.C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 GMGIWEZSKCNYSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PRJNNPMIUGYOST-UHFFFAOYSA-N 2-N-(4-aminocyclohexyl)-8-propan-2-yl-4-N-[(4-pyridin-2-ylphenyl)methyl]pyrazolo[1,5-a][1,3,5]triazine-2,4-diamine Chemical compound CC(C)c1cnn2c(NCc3ccc(cc3)-c3ccccn3)nc(NC3CCC(N)CC3)nc12 PRJNNPMIUGYOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YZOFLYUAQDJWKV-UHFFFAOYSA-N 2-[(3,4,5-trihydroxyphenyl)methylidene]propanedinitrile Chemical compound OC1=CC(C=C(C#N)C#N)=CC(O)=C1O YZOFLYUAQDJWKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTJXFTPMFYAJJU-UHFFFAOYSA-N 2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylidene]propanedinitrile Chemical compound OC1=CC=C(C=C(C#N)C#N)C=C1O VTJXFTPMFYAJJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQVIIUBWMBHLOZ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-hydroxyethyl-[6-[(4-methoxyphenyl)methylamino]-9-propan-2-ylpurin-2-yl]amino]ethanol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CNC1=NC(N(CCO)CCO)=NC2=C1N=CN2C(C)C NQVIIUBWMBHLOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHDJEAZLMYPLGL-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[(phenylmethyl)amino]-9-propan-2-yl-2-purinyl]amino]ethanol Chemical compound N1=C(NCCO)N=C2N(C(C)C)C=NC2=C1NCC1=CC=CC=C1 WHDJEAZLMYPLGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFPLHASLIOXVGS-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-(4-methylanilino)-1,3-benzothiazole-4,7-dione Chemical compound S1C(C)=NC(C2=O)=C1C(=O)C=C2NC1=CC=C(C)C=C1 HFPLHASLIOXVGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GAMKNLFIHBMGQT-UHFFFAOYSA-N 3-hexadecanoyloxy-4-(trimethylazaniumyl)butanoate;hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CC(O)=O)C[N+](C)(C)C GAMKNLFIHBMGQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XHEQSRJCJTWWAH-UHFFFAOYSA-N 4-[[6-(cyclohexylmethoxy)-7h-purin-2-yl]amino]-n,n-diethylbenzamide Chemical compound C1=CC(C(=O)N(CC)CC)=CC=C1NC1=NC(OCC2CCCCC2)=C(NC=N2)C2=N1 XHEQSRJCJTWWAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XVECMUKVOMUNLE-UHFFFAOYSA-N 5-(2-phenyl-3-pyrazolo[1,5-a]pyridinyl)-2H-pyrazolo[3,4-c]pyridazin-3-amine Chemical compound C1=C2C(N)=NNC2=NN=C1C(=C1C=CC=CN1N=1)C=1C1=CC=CC=C1 XVECMUKVOMUNLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NEBCAMAQXZIVRE-UHFFFAOYSA-N 5-(methoxymethyl)-4-[2,3,4-trihydroxy-6-(methoxymethyl)phenyl]benzene-1,2,3-triol Chemical compound COCC1=CC(O)=C(O)C(O)=C1C1=C(O)C(O)=C(O)C=C1COC NEBCAMAQXZIVRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LULATDWLDJOKCX-UHFFFAOYSA-N 5-[(2,5-dihydroxyphenyl)methylamino]-2-hydroxybenzoic acid Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(NCC=2C(=CC=C(O)C=2)O)=C1 LULATDWLDJOKCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHSIXKUPQCKWBY-IOSLPCCCSA-N 5-iodotubercidin Chemical compound C1=C(I)C=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WHSIXKUPQCKWBY-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 2
- PRIGRJPRGZCFAS-UHFFFAOYSA-N 6-phenyl[5h]pyrrolo[2,3-b]pyrazine Chemical compound N1C2=NC=CN=C2C(CCCC)=C1C1=CC=C(O)C=C1 PRIGRJPRGZCFAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010026870 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000019025 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 2
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 2
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100026805 Cyclin-dependent-like kinase 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 2
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 description 2
- 108010087745 Hepatocyte Nuclear Factor 3-beta Proteins 0.000 description 2
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 description 2
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 2
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 2
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 2
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 2
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000979190 Homo sapiens Transcription factor MafB Proteins 0.000 description 2
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- UVSVTDVJQAJIFG-VURMDHGXSA-N LFM-A13 Chemical compound C\C(O)=C(/C#N)C(=O)NC1=CC(Br)=CC=C1Br UVSVTDVJQAJIFG-VURMDHGXSA-N 0.000 description 2
- 229940122696 MAP kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- MZOPWQKISXCCTP-UHFFFAOYSA-N Malonoben Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(C=C(C#N)C#N)=CC(C(C)(C)C)=C1O MZOPWQKISXCCTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 2
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N N(6),N(6)-dimethyladenine Chemical compound CN(C)C1=NC=NC2=C1N=CN2 BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 102100023234 Transcription factor MafB Human genes 0.000 description 2
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 2
- AMJJLDJPDLKNJA-UHFFFAOYSA-N [hydroxy(naphthalen-2-yl)methyl]phosphonic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C(O)P(O)(O)=O)=CC=C21 AMJJLDJPDLKNJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- RAMROQQYRRQPDL-HNNXBMFYSA-N aminopurvalanol Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)C(C)C)=NC=1NC1=CC(N)=CC(Cl)=C1 RAMROQQYRRQPDL-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- RSQPNXBTPUXMQN-UHFFFAOYSA-N chembl258721 Chemical compound C1=2N=C(CC=3C=CC(OCCO)=CC=3)NC(=O)C=2C(C(C)C)=NN1C1=C(Cl)C=CC=C1Cl RSQPNXBTPUXMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZGHQGWOETPXKLY-XVNBXDOJSA-N chembl77030 Chemical compound NC(=S)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 ZGHQGWOETPXKLY-XVNBXDOJSA-N 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010069764 helospectin I Proteins 0.000 description 2
- HTMVMVKJOPFRMK-OYZAELBCSA-N helospectin i Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HTMVMVKJOPFRMK-OYZAELBCSA-N 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- BTXNYTINYBABQR-UHFFFAOYSA-N hypericin Chemical compound C12=C(O)C=C(O)C(C(C=3C(O)=CC(C)=C4C=33)=O)=C2C3=C2C3=C4C(C)=CC(O)=C3C(=O)C3=C(O)C=C(O)C1=C32 BTXNYTINYBABQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- CRDNMYFJWFXOCH-UHFFFAOYSA-N indirubin Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C2=CC=CC=C2NC1=O CRDNMYFJWFXOCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- BMGQWWVMWDBQGC-IIFHNQTCSA-N midostaurin Chemical compound CN([C@H]1[C@H]([C@]2(C)O[C@@H](N3C4=CC=CC=C4C4=C5C(=O)NCC5=C5C6=CC=CC=C6N2C5=C43)C1)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 BMGQWWVMWDBQGC-IIFHNQTCSA-N 0.000 description 2
- RDTDWGQDFJPTPD-UHFFFAOYSA-N n-{3-[(4-{[3-(trifluoromethyl)phenyl]amino}pyrimidin-2-yl)amino]phenyl}cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)N=CC=2)=C1 RDTDWGQDFJPTPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- DEZFNHCVIZBHBI-ZHACJKMWSA-N rottlerin Chemical compound CC(=O)C1=C(O)C(C)=C(O)C(CC=2C(=C(C(=O)\C=C\C=3C=CC=CC=3)C=3OC(C)(C)C=CC=3C=2O)O)=C1O DEZFNHCVIZBHBI-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- ATFNSNUJZOYXFC-RQJHMYQMSA-N terreic acid Chemical compound O=C1C(C)=C(O)C(=O)[C@@H]2O[C@@H]21 ATFNSNUJZOYXFC-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 1
- ZJFMARHFPUZEKI-XCVCLJGOSA-N (3E)-5-chloro-3-[(3,5-dichloro-4-hydroxyphenyl)methylidene]-1H-indol-2-one Chemical group C1=C(Cl)C(O)=C(Cl)C=C1\C=C\1C2=CC(Cl)=CC=C2NC/1=O ZJFMARHFPUZEKI-XCVCLJGOSA-N 0.000 description 1
- QJKBRWSJWQVKLY-UKTHLTGXSA-N (3e)-3-[(2-chloro-1h-indol-3-yl)methylidene]-1h-indol-2-one Chemical compound O=C/1NC2=CC=CC=C2C\1=C/C1=C(Cl)NC2=CC=CC=C21 QJKBRWSJWQVKLY-UKTHLTGXSA-N 0.000 description 1
- IQNTXIMXKCURDC-YBEGLDIGSA-N (3z)-5-pyridin-3-yl-3-(1h-pyrrol-2-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=C(C=3C=NC=CC=3)C=C2\C1=C\C1=CC=CN1 IQNTXIMXKCURDC-YBEGLDIGSA-N 0.000 description 1
- SQWZFLMPDUSYGV-POHAHGRESA-N (5Z)-5-(quinoxalin-6-ylmethylidene)-1,3-thiazolidine-2,4-dione Chemical compound S1C(=O)NC(=O)\C1=C\C1=CC=C(N=CC=N2)C2=C1 SQWZFLMPDUSYGV-POHAHGRESA-N 0.000 description 1
- XOLMRFUGOINFDQ-YBEGLDIGSA-N (5z)-5-(quinolin-6-ylmethylidene)-2-(thiophen-2-ylmethylamino)-1,3-thiazol-4-one Chemical compound S1\C(=C/C=2C=C3C=CC=NC3=CC=2)C(=O)N=C1NCC1=CC=CS1 XOLMRFUGOINFDQ-YBEGLDIGSA-N 0.000 description 1
- SVJQCVOKYJWUBC-OWOJBTEDSA-N (e)-3-(2,3,4,5-tetrabromophenyl)prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC(Br)=C(Br)C(Br)=C1Br SVJQCVOKYJWUBC-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- ZGDACLBJJXLKJY-UHFFFAOYSA-N 1,2-dimethyl-6-thiophen-2-ylimidazo[4,5-g]quinoxaline Chemical compound C=1N=C2C=C3N(C)C(C)=NC3=CC2=NC=1C1=CC=CS1 ZGDACLBJJXLKJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UOFGSWVZMUXXIY-UHFFFAOYSA-N 1,5-Diphenyl-3-thiocarbazone Chemical compound C=1C=CC=CC=1N=NC(=S)NNC1=CC=CC=C1 UOFGSWVZMUXXIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSASWRWALCMOQP-UHFFFAOYSA-N 1-(2-naphthalenyl)-3-[(phenylmethyl)-propan-2-ylamino]-1-propanone Chemical compound C=1C=C2C=CC=CC2=CC=1C(=O)CCN(C(C)C)CC1=CC=CC=C1 JSASWRWALCMOQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYQSWJNGTWVFOL-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chloro-1,4-dioxonaphthalen-2-yl)pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C(Cl)=C1N1C(=O)CCC1=O GYQSWJNGTWVFOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBLWOZUPHDKFOT-UHFFFAOYSA-N 1-(5-chloro-2-methoxyphenyl)-3-(2-methyl-4-quinolinyl)urea Chemical compound COC1=CC=C(Cl)C=C1NC(=O)NC1=CC(C)=NC2=CC=CC=C12 YBLWOZUPHDKFOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDQXJQSQYMMKRA-UHFFFAOYSA-N 1-NM-PP1 Chemical compound C12=C(N)N=CN=C2N(C(C)(C)C)N=C1CC1=CC=CC2=CC=CC=C12 GDQXJQSQYMMKRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHKSBKQXCWHTQL-UHFFFAOYSA-N 1-[2-hydroxy-4-(4-morpholinyl)phenyl]ethanone Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)C)=CC=C1N1CCOCC1 YHKSBKQXCWHTQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RODAAYVFYDKHGT-AUWJEWJLSA-N 1-nitro-2-[(z)-[5-(3-nitrophenyl)furan-2-yl]methylideneamino]guanidine Chemical compound O1C(/C=N\N=C(N[N+]([O-])=O)/N)=CC=C1C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 RODAAYVFYDKHGT-AUWJEWJLSA-N 0.000 description 1
- HLCDNLNLQNYZTK-UHFFFAOYSA-N 2,2-diphenyl-N-[2,2,2-trichloro-1-[[(4-fluoro-3-nitroanilino)-sulfanylidenemethyl]amino]ethyl]acetamide Chemical compound C1=C(F)C([N+](=O)[O-])=CC(NC(=S)NC(NC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C(Cl)(Cl)Cl)=C1 HLCDNLNLQNYZTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFWGZXMTCUOPFI-UHFFFAOYSA-N 2,3-diphenyl-6-quinoxalinecarboxylic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=NC2=CC(C(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 LFWGZXMTCUOPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZEFMZCNXDQXOZ-UHFFFAOYSA-N 2-(2-hydroxyethylamino)-6-(3-chloroanilino)-9-isopropylpurine Chemical compound CC(C)N1C=NC2=C1NC(NCCO)=N\C2=N/C1=CC=CC(Cl)=C1 XZEFMZCNXDQXOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKTZALUTXUZPSN-UHFFFAOYSA-N 2-(4-morpholinyl)-4-benzo[h][1]benzopyranone Chemical compound O1C2=C3C=CC=CC3=CC=C2C(=O)C=C1N1CCOCC1 KKTZALUTXUZPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SAYGKHKXGCPTLX-UHFFFAOYSA-N 2-(carbamoylamino)-5-(4-fluorophenyl)-3-thiophenecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=C(NC(=O)N)SC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1 SAYGKHKXGCPTLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRHRPGSSSVYBRG-UHFFFAOYSA-N 2-[(3-iodophenyl)methylthio]-5-pyridin-4-yl-1,3,4-oxadiazole Chemical compound IC1=CC=CC(CSC=2OC(=NN=2)C=2C=CN=CC=2)=C1 ZRHRPGSSSVYBRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXGJAOIJSROTTN-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(4-chlorophenoxy)phenyl]-3h-benzimidazole-5-carboxamide Chemical compound N1C2=CC(C(=O)N)=CC=C2N=C1C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1 UXGJAOIJSROTTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILDBNQGLZFSHQZ-UTLKBRERSA-N 2-amino-1-[(3s)-3-methyl-4-(4-methylisoquinolin-5-yl)sulfonyl-1,4-diazepan-1-yl]ethanone;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C[C@H]1CN(C(=O)CN)CCCN1S(=O)(=O)C1=CC=CC2=CN=CC(C)=C12 ILDBNQGLZFSHQZ-UTLKBRERSA-N 0.000 description 1
- CBIAKDAYHRWZCU-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-4-[(6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl)amino]phenol Chemical compound C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(O)C(Br)=C1 CBIAKDAYHRWZCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHLFDBSTLNYPFS-LSDHHAIUSA-N 2-n-[(1r,2s)-2-aminocyclohexyl]-2-n-(3-chlorophenyl)-9-ethylpurine-2,6-diamine Chemical compound N1=C2N(CC)C=NC2=C(N)N=C1N(C=1C=C(Cl)C=CC=1)[C@@H]1CCCC[C@@H]1N JHLFDBSTLNYPFS-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- UTBSBSOBZHXMHI-LSDHHAIUSA-N 2-n-[(1r,2s)-2-aminocyclohexyl]-6-n-(3-chlorophenyl)-9-ethylpurine-2,6-diamine Chemical compound N1=C(N[C@H]2[C@H](CCCC2)N)N=C2N(CC)C=NC2=C1NC1=CC=CC(Cl)=C1 UTBSBSOBZHXMHI-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- IGRZXNLKVUEFDM-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-N-(5-propan-2-yl-2-thiazolyl)acetamide Chemical compound S1C(C(C)C)=CN=C1NC(=O)CC1=CC=CC=C1 IGRZXNLKVUEFDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWHVZCLBMTZRQM-UHFFFAOYSA-N 2H-pyrazolo[4,3-b]quinoxalin-3-amine Chemical compound C1=CC=CC2=NC3=C(N)NN=C3N=C21 DWHVZCLBMTZRQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBLFSMURWWWWMH-UHFFFAOYSA-N 3-(9-nitro-6-oxo-7,12-dihydro-5h-indolo[3,2-d][1]benzazepin-2-yl)propanenitrile Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=C(CCC#N)C=C2C2=C1C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N2 UBLFSMURWWWWMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDEJZKULWCZIHL-UHFFFAOYSA-N 3-[1-(3-hydroxypropyl)pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl]-4-pyrazin-2-ylpyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CN=C2N(CCCO)C=C1C(C(NC1=O)=O)=C1C1=CN=CC=N1 ZDEJZKULWCZIHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWCQHVUQEFDRIW-UHFFFAOYSA-N 3-[1-[[4-(6-phenyl-8H-imidazo[4,5-g]quinoxalin-7-yl)phenyl]methyl]piperidin-4-yl]-1H-benzimidazol-2-one Chemical compound O=c1[nH]c2ccccc2n1C1CCN(Cc2ccc(cc2)-c2[nH]c3cc4ncnc4cc3nc2-c2ccccc2)CC1 IWCQHVUQEFDRIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCNBZFRECRPCKU-UHFFFAOYSA-N 3-[2-[4-[bis(4-fluorophenyl)methylidene]-1-piperidinyl]ethyl]-2-sulfanylidene-1H-quinazolin-4-one Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(C=1C=CC(F)=CC=1)=C1CCN(CCN2C(C3=CC=CC=C3NC2=S)=O)CC1 ZCNBZFRECRPCKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 3-[[6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol Chemical compound NC1=CC=CC(C=2NC3=NC=NC(OC=4C=C(O)C=CC=4)=C3C=2)=C1 VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037263 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- LLJRXVHJOJRCSM-UHFFFAOYSA-N 3-pyridin-4-yl-1H-indole Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1C1=CC=NC=C1 LLJRXVHJOJRCSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMEUKWOOQOHUNA-UHFFFAOYSA-N 4-(3-chloro-4-fluoroanilino)-6-(pyridin-3-ylmethylamino)-1,7-naphthyridine-3-carbonitrile Chemical compound C1=C(Cl)C(F)=CC=C1NC(C1=C2)=C(C#N)C=NC1=CN=C2NCC1=CC=CN=C1 NMEUKWOOQOHUNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYOZTVGMEWJPKR-VOMCLLRMSA-N 4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-yl-1-cyclohexanecarboxamide Chemical compound C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IYOZTVGMEWJPKR-VOMCLLRMSA-N 0.000 description 1
- TWOSIFOFWWXXIG-PTGBLXJZSA-N 4-[(E)-[2-(2-hydroxy-1H-indol-3-yl)indol-3-ylidene]amino]oxybutane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)CCO\N=C1\C(=Nc2ccccc12)c1c(O)[nH]c2ccccc12 TWOSIFOFWWXXIG-PTGBLXJZSA-N 0.000 description 1
- ODYAQBDIXCVKAE-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2-fluorophenyl)phenyl]-N-(4-hydroxyphenyl)butanamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CCCC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)F)C=C1 ODYAQBDIXCVKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001255 4-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1F 0.000 description 1
- 102100036009 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- RONQPWQYDRPRGG-UHFFFAOYSA-N 5,6-bis(4-fluoroanilino)isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1NC(C(=C1)NC=2C=CC(F)=CC=2)=CC2=C1C(=O)NC2=O RONQPWQYDRPRGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QMBDONCHHMIWFJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-phenylpyrazolo[1,5-a]pyridin-3-yl)-1,2-dihydropyrazolo[3,4-c]pyridazin-3-one Chemical group C1=C2C(=O)NNC2=NN=C1C(=C1C=CC=CN1N=1)C=1C1=CC=CC=C1 QMBDONCHHMIWFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYQAUKPBNJWPIE-UHFFFAOYSA-N 5-[[3-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)methoxy]phenyl]methyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1COC(C(=C1)OC)=CC=C1CC1=CN=C(N)N=C1N MYQAUKPBNJWPIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FNZTULJDGIXMJJ-UHFFFAOYSA-N 5-phenyl-n-[4-(2-pyrrolidin-1-ylethoxy)phenyl]-1,3-thiazol-2-amine Chemical compound C=1C=C(NC=2SC(=CN=2)C=2C=CC=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCC1 FNZTULJDGIXMJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOELZIQOLWZLQC-UHFFFAOYSA-N 6-(4-fluorophenyl)-5-pyridin-4-yl-2,3-dihydroimidazo[2,1-b]thiazole Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C1=C(C=2C=CN=CC=2)N2CCSC2=N1 YOELZIQOLWZLQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122485 ATM kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940125775 ATR kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229940123877 Aurora kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003989 Aurora kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000433 Aurora kinases Proteins 0.000 description 1
- 229940118364 Bcr-Abl inhibitor Drugs 0.000 description 1
- AYZRKFOEZQBUEA-UHFFFAOYSA-N CAN-508 Chemical compound NC1=NNC(N)=C1N=NC1=CC=C(O)C=C1 AYZRKFOEZQBUEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010034798 CDC2 Protein Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150108519 CDK4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 101710010675 Cerberus Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- CRDNMYFJWFXOCH-BUHFOSPRSA-N Couroupitine B Natural products N\1C2=CC=CC=C2C(=O)C/1=C1/C2=CC=CC=C2NC1=O CRDNMYFJWFXOCH-BUHFOSPRSA-N 0.000 description 1
- 229940122560 Cyclin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010024986 Cyclin-Dependent Kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010025461 Cyclin-Dependent Kinase 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100032857 Cyclin-dependent kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100036239 Cyclin-dependent kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100024457 Cyclin-dependent kinase 9 Human genes 0.000 description 1
- QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N Cyclopamine Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC2=C3C)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@@]13O[C@@H]2C[C@H](C)CN[C@H]2[C@H]1C QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000027355 Ferocactus setispinus Species 0.000 description 1
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 1
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000037060 G2 phase arrest Effects 0.000 description 1
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 1
- 102000012004 Ghrelin Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 1
- MCAHMSDENAOJFZ-UHFFFAOYSA-N Herbimycin A Natural products N1C(=O)C(C)=CC=CC(OC)C(OC(N)=O)C(C)=CC(C)C(OC)C(OC)CC(C)C(OC)C2=CC(=O)C=C1C2=O MCAHMSDENAOJFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000600756 Homo sapiens 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000783681 Homo sapiens 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001045740 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000911772 Homo sapiens Hsc70-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 101000572950 Homo sapiens POU domain, class 3, transcription factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 101000642523 Homo sapiens Transcription factor SOX-7 Proteins 0.000 description 1
- 101001117146 Homo sapiens [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase isozyme 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100027037 Hsc70-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 102100036342 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710199015 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710199010 Interleukin-1 receptor-associated kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100023533 Interleukin-1 receptor-associated kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 229940122245 Janus kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- ZXGIBSBJQLLUEE-UHFFFAOYSA-N Ki11502 Chemical compound C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=CC=1OC(C=C1)=CC=C1NC(=S)NC(=O)C1=CC=CC=C1C ZXGIBSBJQLLUEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 1
- HOGVTUZUJGHKPL-UHFFFAOYSA-N LSM-1546 Chemical compound C=12C3=NC=NC=1N(C)N=C(N)C2=CN3C1OC(CO)C(O)C1O HOGVTUZUJGHKPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYKOWOGZBMOVBJ-UHFFFAOYSA-N LSM-3164 Chemical compound C12=NC3=CC=CC=C3N2C(=O)C2=CC=CC3=C2C1=CC=C3C(=O)O MYKOWOGZBMOVBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002569 MAP Kinase Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010068304 MAP Kinase Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 102100026299 MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710139011 MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229940125895 MET kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000607573 Mus musculus Unknown protein from 2D-PAGE of fibroblasts Proteins 0.000 description 1
- NSGDYZCDUPSTQT-UHFFFAOYSA-N N-[5-bromo-1-[(4-fluorophenyl)methyl]-4-methyl-2-oxopyridin-3-yl]cycloheptanecarboxamide Chemical compound Cc1c(Br)cn(Cc2ccc(F)cc2)c(=O)c1NC(=O)C1CCCCCC1 NSGDYZCDUPSTQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 101710096141 Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101100519293 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pdx-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010055723 PDGF receptor tyrosine kinase Proteins 0.000 description 1
- INTPTKHSGKBHHW-UHFFFAOYSA-N PDGF receptor tyrosine kinase inhibitor III Chemical compound C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=NC=1N(CC1)CCN1C(=O)NC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 INTPTKHSGKBHHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026450 POU domain, class 3, transcription factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101150075026 PRKCB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150075928 Pax4 gene Proteins 0.000 description 1
- IIXHQGSINFQLRR-UHFFFAOYSA-N Piceatannol Natural products Oc1ccc(C=Cc2c(O)c(O)c3CCCCc3c2O)cc1O IIXHQGSINFQLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- LHHQTXPEHJNOCX-UHFFFAOYSA-N Rottlerin Natural products CC(=O)c1c(O)c(C)c(O)c(Oc2c(O)c3C=CC(C)(C)Cc3c(C(=O)C=Cc4ccccc4)c2O)c1O LHHQTXPEHJNOCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAKWLVYMKBWHMX-UHFFFAOYSA-N SU4312 Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C=C1C2=CC=CC=C2NC1=O UAKWLVYMKBWHMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 229940123928 Sphingosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDSJDASOXWCHPN-UHFFFAOYSA-N TDZD-8 Chemical compound O=C1N(C)SC(=O)N1CC1=CC=CC=C1 JDSJDASOXWCHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- ATFNSNUJZOYXFC-UHFFFAOYSA-N Tenein-saeure Natural products O=C1C(C)=C(O)C(=O)C2OC21 ATFNSNUJZOYXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 102100036730 Transcription factor SOX-7 Human genes 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- CZDUJGOCEPWCNA-UHFFFAOYSA-N [2-(1h-indole-2-carbonyl)-1h-indol-5-yl] butanoate Chemical compound C1=CC=C2NC(C(=O)C=3NC4=CC=C(C=C4C=3)OC(=O)CCC)=CC2=C1 CZDUJGOCEPWCNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALILNHGILFDLC-UHFFFAOYSA-N [2-hydroxy-4-(4-morpholinyl)phenyl]-phenylmethanone Chemical compound OC1=CC(N2CCOCC2)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 FALILNHGILFDLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DYTKVFHLKPDNRW-UHFFFAOYSA-N [4-(2-amino-4-methyl-thiazol-5-yl)-pyrimidin-2-yl]-(3-nitro-phenyl)-amine Chemical compound N1=C(N)SC(C=2N=C(NC=3C=C(C=CC=3)[N+]([O-])=O)N=CC=2)=C1C DYTKVFHLKPDNRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- OLUKILHGKRVDCT-UHFFFAOYSA-N alsterpaullone Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=CC=C2C2=C1C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N2 OLUKILHGKRVDCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 description 1
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 description 1
- 239000005441 aurora Substances 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- NIMIWWQLOGNYHD-UHFFFAOYSA-N bis(5-hydroxy-1h-indol-2-yl)methanone Chemical compound OC1=CC=C2NC(C(=O)C=3NC4=CC=C(C=C4C=3)O)=CC2=C1 NIMIWWQLOGNYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- NGOLMNWQNHWEKU-DEOSSOPVSA-N butyrolactone I Chemical compound C([C@@]1(C(=O)OC)C(=C(O)C(=O)O1)C=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C(CC=C(C)C)=C1 NGOLMNWQNHWEKU-DEOSSOPVSA-N 0.000 description 1
- FQYAPAZNUPTQLD-DEOSSOPVSA-N butyrolactone I Natural products COC1=C(c2ccc(O)cc2)[C@](Cc3ccc(O)c(CC=C(C)C)c3)(OC1=O)C(=O)O FQYAPAZNUPTQLD-DEOSSOPVSA-N 0.000 description 1
- 230000028956 calcium-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 101150073031 cdk2 gene Proteins 0.000 description 1
- FLKYBGKDCCEQQM-WYUVZMMLSA-M cefazolin sodium Chemical compound [Na+].S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 FLKYBGKDCCEQQM-WYUVZMMLSA-M 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- IWDDMLCHUYBHHD-UHFFFAOYSA-N chembl1532112 Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)N)=CC=C1N=NC1=C(O)NC2=CC=C(Br)C=C12 IWDDMLCHUYBHHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003138 coordinated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N cyclopamine Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C(CC2=C3C)C1C2CCC13OC2CC(C)CNC2C1C QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000007240 daidzein Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 1
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical class C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- PMUJUSJUVIXDQC-LCYFTJDESA-N ethyl 2,4-dimethyl-5-[(z)-(2-oxo-1h-indol-3-ylidene)methyl]-1h-pyrrole-3-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC=CC=C3NC\2=O)=C1C PMUJUSJUVIXDQC-LCYFTJDESA-N 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- PWUOOJVYZQILBG-UHFFFAOYSA-N fascaplysine Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=CC=[N+]4C5=CC=CC=C5C(=O)C4=C3NC2=C1 PWUOOJVYZQILBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002435 fasudil Drugs 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 1
- 230000014101 glucose homeostasis Effects 0.000 description 1
- MCAHMSDENAOJFZ-BVXDHVRPSA-N herbimycin Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C\C=C/[C@H](OC)[C@@H](OC(N)=O)\C(C)=C\[C@H](C)[C@@H](OC)[C@@H](OC)C[C@H](C)[C@@H](OC)C2=CC(=O)C=C1C2=O MCAHMSDENAOJFZ-BVXDHVRPSA-N 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940005608 hypericin Drugs 0.000 description 1
- PHOKTTKFQUYZPI-UHFFFAOYSA-N hypericin Natural products Cc1cc(O)c2c3C(=O)C(=Cc4c(O)c5c(O)cc(O)c6c7C(=O)C(=Cc8c(C)c1c2c(c78)c(c34)c56)O)O PHOKTTKFQUYZPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- KOZFSFOOLUUIGY-IYYJOCMQSA-N k-252a, nocardiopsis sp. Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@@H]1C[C@](C(=O)OC)(O)[C@@]4(C)O1 KOZFSFOOLUUIGY-IYYJOCMQSA-N 0.000 description 1
- NMFKDDRQSNVETB-UHFFFAOYSA-N k00024 Chemical compound C1=CC=C2C3=C(C(=O)NC4=O)C4=C4C5=CC=C(Br)C=C5NC4=C3NC2=C1 NMFKDDRQSNVETB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229950010895 midostaurin Drugs 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- ZDNURMVOKAERHZ-UHFFFAOYSA-N n-(3-fluorophenyl)-6,7-dimethoxy-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-amine Chemical compound N=1NC=2C=3C=C(OC)C(OC)=CC=3CC=2C=1NC1=CC=CC(F)=C1 ZDNURMVOKAERHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KQMPRSZTUSSXND-UHFFFAOYSA-N n-(4-amino-5-cyano-6-ethoxypyridin-2-yl)-2-(2,5-dimethoxyphenyl)acetamide Chemical compound NC1=C(C#N)C(OCC)=NC(NC(=O)CC=2C(=CC=C(OC)C=2)OC)=C1 KQMPRSZTUSSXND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GGPZCOONYBPZEW-UHFFFAOYSA-N n-(4-chlorophenyl)-2-[(pyridin-4-ylmethyl)amino]benzamide Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC=C1NCC1=CC=NC=C1 GGPZCOONYBPZEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YAEMHJKFIIIULI-UHFFFAOYSA-N n-(4-methoxybenzyl)-n'-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CNC(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YAEMHJKFIIIULI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLPSDPPZXRJQOY-UHFFFAOYSA-N n-[4-(3-chloro-4-fluoroanilino)pyrido[3,4-d]pyrimidin-6-yl]but-2-ynamide Chemical compound N1=CN=C2C=NC(NC(=O)C#CC)=CC2=C1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 DLPSDPPZXRJQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODZGYELAMAOARP-UHFFFAOYSA-N n1-methyl-1,9-pyrazoloanthrone Chemical group C12=CC=CC=C2C(=O)C2=CC=CC3=C2C1=NN3C ODZGYELAMAOARP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- OWXORKPNCHJYOF-UHFFFAOYSA-N o6-cyclohexylmethoxy-2-(4'-sulphamoylanilino) purine Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)N)=CC=C1NC1=NC(OCC2CCCCC2)=C(N=CN2)C2=N1 OWXORKPNCHJYOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002935 phosphatidylinositol 3 kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- CDRPUGZCRXZLFL-OWOJBTEDSA-N piceatannol Chemical compound OC1=CC(O)=CC(\C=C\C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 CDRPUGZCRXZLFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 1
- SSKVDVBQSWQEGJ-UHFFFAOYSA-N pseudohypericin Natural products C12=C(O)C=C(O)C(C(C=3C(O)=CC(O)=C4C=33)=O)=C2C3=C2C3=C4C(C)=CC(O)=C3C(=O)C3=C(O)C=C(O)C1=C32 SSKVDVBQSWQEGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- WUWDLXZGHZSWQZ-WQLSENKSSA-N semaxanib Chemical compound N1C(C)=CC(C)=C1\C=C/1C2=CC=CC=C2NC\1=O WUWDLXZGHZSWQZ-WQLSENKSSA-N 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 102000009076 src-Family Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010087686 src-Family Kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- QDLHCMPXEPAAMD-UHFFFAOYSA-N wortmannin Natural products COCC1OC(=O)C2=COC(C3=O)=C2C1(C)C1=C3C2CCC(=O)C2(C)CC1OC(C)=O QDLHCMPXEPAAMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к увеличению экспрессии инсулина и MAFA в панкреатических эндокринных клетках. Способ включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток человека, полученных без разрушения человеческого эмбриона, или плюрипотентных стволовых клеток человека не эмбрионального происхождения, или клеток из линий человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 или H7, или H9, или SA002, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и последующее культивирование в среде, содержащей добавленное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, что приводит к увеличению экспрессии инсулина и MAFA. Изобретение позволяет увеличить экспрессию инсулина и MAFA в панкреатических эндокринных клетках. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл., 12 пр.
Description
В рамках настоящего изобретения испрашивается приоритет заявки с серийным номером 61/110287, поданной 31 октября 2008 года.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предлагаются способы стимуляции дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток. В частности, в настоящем изобретении предлагается способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF-3-бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия Pdx1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в публикации Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщается о дифференцировании эмбриональных стволовых клеток мыши в инсулин-секретирующие структуры, сходные с островками поджелудочной железы. В публикации Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщается, что инсулин-секретирующие клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши, нормализовали гликемию у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином.
В одном примере, в публикации Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид 3-киназы (LY294002) приводила к образованию клеток, сходных с β-клетками.
В другом примере, в публикации Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003), сообщается о получении инсулин-продуцирующих клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши с конститутивной экспрессией Pax4.
В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцирования эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).
В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Эти результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, P48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Также авторы наблюдали, что на уровень экспрессии мРНК инсулина и Pdx1 не влияла ретиноевая кислота; однако обработка раствором FGF7 с концентрацией 3 нM приводила к повышению уровня транскрипта Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).
В публикации Gordon et al. продемонстрирована индукция образования эндодермальных клеток brachyury+/HNF-3-бета+ из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального пути Wnt (US 2006/0003446A1).
В публикации Gordon et al. (PNAS, Vol 103, page 16806, 2006) говорится: «Для образования передней первичной полоски требовались одновременно сигнальные пути Wnt и TGF-бета/Nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например, у человека.
В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека должны культивироваться в очень специфических условиях (патенты США № 6200806; WO 99/20741; WO 01/51616).
D’Amour et al. описывают производство обогащенных культур сформированной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology, 23, 1534-1541 (2005)). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки сформированной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшему дифференцированию в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).
В публикации D’Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) говорится: «Мы разработали процесс дифференцирования, преобразующий человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭС) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы, инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через стадии, напоминающие образование сформированной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны».
В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US 2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Сначала человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировали с антагонистами TGF-β, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бета-целлюлином с получением Pdx1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование запускалось никотинамидом.
В одном примере Benvenistry et al. сообщают: «Мы делаем вывод, что сверхэкспрессия Pdx1 увеличивала экспрессию панкреатических обогащенных генов, а для индукции экспрессии инсулина могут требоваться дополнительные сигналы, присутствующие только in vivo» (Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930).
Циклины задействованы в функциях бета-клеток. Например, в работе Lilja et al сообщается, что Cdk5 присутствует в секретирующей инсулин панкреатической β-клетке (J. Biol. Chem., Vol. 276, Issue 36, 34199-34205, 07 сентября 2001 г.). Lilja et al утверждают, что «Cdk5 присутствует в β-клетках и действует как положительный регулятор экзоцитоза инсулина».
В другом примере Marzo et al утверждают, что «мыши с вставкой гена Cdk4 имеют значительно более высокую массу бета-клеток и являются физиологически функциональными, и это показывает, что Cdk4 является потенциальной мишенью для восстановления массы панкреатических бета-клеток при диабетах 1 типа» (Diabetalogia, Vol. 47, Number 4, 686-694, 01 апреля 2004 г.).
В другом примере Ubeda et al сообщают, что ингибирование активности циклин-зависимой киназы 5 защищает панкреатические бета-клетки от глюкотоксичности (J. Biol. Chem., Vol. 281, Issue 39, 28858-28864, 29 сентября 2006 г.).
В другом примере в публикации Wei et al сообщается о Cdk5-зависимой регуляции стимулируемой глюкозой секреции инсулина (Nature Medicine 11, 1104-1108 (01 октября 2005 г.)).
В другом примере Vanderford et al утверждают, что «MafA является основным транскрипционным фактором с лейциновыми застежками, экспрессируемым в бета-клетках поджелудочной железы, и он необходим для поддержания нормального глюкозного гомеостаза, поскольку задействован в различных аспектах биологии бета-клеток. Известно, что концентрация белка MafA увеличивается в ответ на высокий уровень глюкозы посредством пока не до конца охарактеризованных механизмов. Мы провели исследование, чтобы определить, контролируется ли экспрессия MafA дискретными событиями внутриклеточной сигнализации. Мы обнаружили, что общий ингибитор киназ стауроспорин индуцирует экспрессию MafA, не влияя на стабильность этого белка. Ингибирование MAP-киназы JNK имитирует влияние стауроспорина на экспрессию MafA. Кальмодулиновая киназа и кальциевая сигнализация также играют важную роль при стимуляции экспрессии MafA высоким уровнем глюкозы. Однако стауроспорин, JNK и кальмодулиновая киназа оказывают различные эффекты на индукцию экспрессии инсулина. Эти данные показывают, что концентрации MafA жестко контролируются скоординированными влияниями нескольких киназных путей» (Archives of Biochemistry and Biophysics (2008), doi: 10.1016/j.abb.2008.10.001).
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке способов дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндокринные клетки, клетки, экспрессирующие панкреатические гормоны, или клетки, секретирующие панкреатические гормоны. В настоящем изобретении предлагаются способы увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий в себя этапы культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей достаточное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии MAFA.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.1, панель a, показано измеренное методом ПЦР в реальном времени влияние соединений из библиотеки ингибиторов киназ EMD Calbiochem на отношение экспрессии глюкагона к экспрессии инсулина в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Буквенно-цифровое обозначение соответствует идентификатору соединения, показанному в Таблице 1. На панели b показано измеренное методом ПЦР в реальном времени влияние соединений из библиотеки ингибиторов киназ EMD Calbiochem на отношение экспрессии MAFA к экспрессии ARX4 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Буквенно-цифровое обозначение соответствует идентификатору соединения, показанному в Таблице 1.
На фиг.2 A) показана 4-кратная микрофотография клеток, обработанных в соответствии со способами, описанными в Примере 1, на 4 день обработки, соответствующей стадии 6. На панели B) показана 4-кратная микрофотография клеток, обработанных соединением PubChem № 5330812 в концентрации 0,5 мкM, на 4 день обработки. На панели C) показана 4-кратная микрофотография клеток, обработанных соединением PubChem № 5330812 в концентрации 1 мкM, на 4 день обработки. На панели D) показана 20-кратная микрофотография клеток, обработанных в соответствии со способами, описанными в Примере 1, на 6 день обработки, соответствующей стадии 6. На панели E) показана 20-кратная микрофотография клеток, обработанных 0,5 мкM соединения PubChem № 5330812, на 6 день обработки. На панели F) показана 20-кратная микрофотография клеток, обработанных соединением PubChem № 5330812 в концентрации 1 мкM, на 6 день обработки.
На фиг.3 показана экспрессия 23 обозначенных генов в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и после пятидневной обработки соединением PubChem № 5330812 в концентрации 0,5 мкM (темные столбцы) или 1,0 мкM (светлые столбцы). Уровни экспрессии определяли в день 0, день 2 и день 5.
На фиг.4 показано влияние обработки CDK-ингибитором III на экспрессию маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток, в клетках, прошедших обработку, соответствующую стадии 7 протокола дифференцирования, описанного в Примере 4.
На фиг.5 показано влияние обработки CDK-ингибитором III на окрашивание дитиазоном кластеров, подобных островкам поджелудочной железы.
На фиг.6 показана экспрессия инсулина, синаптофизина и глюкагона в инсулин-продуцирующих клетках, полученных в соответствии со способами, описанными в Примере 5. Экспрессию указанных белков определяли методом FACS.
На фиг.7 показана экспрессия инсулина, синаптофизина и глюкагона в инсулин-продуцирующих клетках, полученных в соответствии со способами, описанными в Примере 5. Экспрессию указанных белков определяли методом FACS.
На фиг.8 показана экспрессия MAFA (панель a) и инсулина (панель b) в инсулин-продуцирующих клетках, полученных способами, составляющими предмет настоящего изобретения. Образцы клеток для ПЦР-анализа отбирали в дни 1, 2, 3 и 4. После 4 дней обработки ингибитором CDK ингибитор CDK убирали из культуральной среды и клетки культивировали еще 4 дня в среде DMEM-F12 + 1% B27 + 20 нг/мл активина A. По истечении четырех дней отбирали в трех повторностях образцы для ПЦР-анализа.
На фиг.9 показано измеренное методом ПЦР в реальном времени влияние соединений из библиотеки ингибиторов I киназ EMD Calbiochem на экспрессию MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
На фиг.10 показано измеренное методом ПЦР в реальном времени влияние генестеина на экспрессию мРНК инсулина, глюкагона, соматостатина и MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
По потенциалу развития стволовые клетки классифицируются следующим образом: (1) тотипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным и внеэмбриональным типам клеток; (2) плюрипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным типам клеток; (3) мультипотентные, т.е. способные давать начало группе клеточных линий дифференцирования в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гематопоэтические стволовые клетки (HSC) могут давать таких потомков, как HSC (самообновление), олигопотентные предшественники, ограниченные клетками крови, и все типы клеток и клеточных элементов (таких как тромбоциты), являющиеся нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, т.е. способные давать начало более ограниченному набору клеточных линий дифференцирования, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, т.е. способные давать начало единственной клеточной линии дифференцирования (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.
Термин «β-клеточная линия дифференцирования» используется в настоящем документе для обозначения клеток, положительных по экспрессии гена транскрипционного фактора PDX-1 и по меньшей мере одного из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3-бета, MAFA, PAX4 или PAX6. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования, относятся β-клетки.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3-бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки сформированной эндодермы.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF- или HB9. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, или PTF1-альфа. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток, включают в себя панкреатические эндокринные клетки, панкреатические клетки, экспрессирующие гормоны и панкреатические клетки, секретирующие гормоны, а также клетки β-клеточной линии дифференцирования.
Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3-бета, GATA4, SOX17, церберус, OTX2, гузекоид, C-Kit, CD99 или MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «внеэмбриональная эндодерма» относится к популяции клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX7, AFP или SPARC.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» обозначает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
Используемый в настоящей заявке термин «мезэндодермальная клетка» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: CD48, эомезодермин (EOMES), SOX17, DKK4, HNF3-бета, GSC, FGF17 или GATA6.
Используемые в настоящей заявке термины «панкреатическая эндокринная клетка» или «клетка, экспрессирующая гормон поджелудочной железы» относятся к клетке, экспрессирующей по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин или панкреатический полипептид.
Используемый в настоящей заявке термин «клетка панкреатической эндодермы» относится к клеткам, способным к экспрессии по меньшей мере одного из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, PAX4 или NKX2.2.
Используемый в настоящей заявке термин «клетка, продуцирующая гормон поджелудочной железы» относится к клетке, способной производить по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин или панкреатический полипептид.
Термин «клетка, секретирующая гормон поджелудочной железы» в настоящем документе обозначает клетку, способную секретировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Используемый в настоящей заявке термин «клетка задней части передней кишки» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, HNF1, PTF1-альфа, HNF6, HB9 или PROX1.
Используемый в настоящей заявке термин «клетка-предшественник клетки первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Nodal и FGF8.
Термин «клетка первичной кишечной трубки» в настоящем документе обозначает клетку, способную секретировать по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF1 или HNF4A.
Используемый в настоящей заявке термин «клетка первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок или FGF4.
Выделение, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или несколько стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к утрате экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81 (если имеются) и к увеличению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют Oct-4 и TERT, обнаруживаемые способом ОТ-ПЦР (RT-PCR).
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся стабильные линии плюрипотентных клеток, получаемых из ткани, формирующейся после наступления беременности, в том числе из преэмбриональной ткани (например, бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе беременности, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).
В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовят, как описано в следующих публикациях Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные клетки в различных отношениях. Как вариант, плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенного дифференцирования. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
Например, в публикациях Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147) описано культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с применением слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов.
В публикации Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003) анализировали набор из 11 различных слоев питающих клеток, полученных от взрослых, новорожденных и эмбрионов людей, по их способности осуществлять поддержку культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Richards et al. сообщают: «линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивируемые на питающих слоях из фибробластов кожи взрослых людей, сохраняют морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток, и остаются плюрипотентными».
В заявке на патент US20020072117 описываются линии клеток, продуцирующие среду, осуществляющую поддержку плюрипотентных стволовых клеток приматов в культуре, не содержащей питающих клеток. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимо- и фибробластоподобные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент US20020072117 также описывается использование этих клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.
В другом примере Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) описывают способы длительного выращивания человеческих плюрипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, получаемую в результате спонтанного дифференцирования человеческих эмбриональных стволовых клеток.
В еще одном примере Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают источник питающих клеток, получаемых из человеческой плаценты.
Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческой крайней плоти.
В другом примере Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческих постнатальных фибробластов крайней плоти.
В патенте US6642048 описывается среда, поддерживающая рост плюрипотентных стволовых клеток приматов (пПС) в среде, не содержащей питающих клеток, и клеточные линии, которые могут использоваться для производства такой среды. В патенте US6642048 говорится: «Данное изобретение включает мезенхимо- и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В документе описываются и иллюстрируются способы получения таких клеточных линий, обработки среды и выращивания стволовых клеток с применением кондиционированной среды».
В другом примере, в заявке на патент WO2005014799, описывается кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцирования клеток млекопитающих. В заявке на патент WO2005014799 говорится: «Культуральная среда, произведенная в соответствии с настоящим изобретением, кондиционируется при помощи секреторной активности клеток мыши, в частности, активности дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов, именуемых MMH (Met Murine Hepatocyte)».
В другом примере Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для увеличения экспрессии обратной транскриптазы человеческой теломеразы.
В другом примере, заявке на патент US20070010011, описывается культуральная среда определенного химического состава для поддержания плюрипотентных стволовых клеток.
В альтернативной культуральной системе используется не содержащая сыворотки среда, обогащенная факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 октября 2005 г.) описывают не содержащую питающих клеток и сыворотки культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере, Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды, с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF).
В другом примере, в заявке на патент US20050148070, описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде с определенным составом без сыворотки и без питающих клеток-фибробластов, где данный способ включает: культивирование стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере один трансферрин или заменитель трансферрина, по меньшей мере один инсулин или заместитель инсулина, культуральную среду, по существу не включающую эмбриональную сыворотку млекопитающих и содержащую по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, причем фактор роста происходит из источника, отличного от просто слоя питающих клеток-фибробластов, среду, поддерживающую пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без слоя питающих клеток или кондиционированной среды.
В другом примере, в заявке на патент US20050233446, описывается среда с определенным составом, которая может быть использована при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. В растворе среда является по существу изотонической относительно культивируемых стволовых клеток. В данной культуре указанная среда содержит основную среду и количество bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста зародышевых стволовых клеток без существенного дифференцирования.
В другом примере, в заявке на патент US6800480, отмечается: «В одном варианте осуществления предлагается культуральная среда для выращивания зародышевых стволовых клеток приматов в по существу недифференцированном состоянии, содержащая основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. Основная среда объединяется с питательной сывороткой, способной поддерживать рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбираемым из группы, состоящей из питающих клеток и экстраклеточного матрикса, полученного из питающих клеток. Среда дополнительно содержит аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, состоящей из нуклеозидов и соли-пирувата».
В другом примере, в заявке на патент US20050244962, говорится: «В одном аспекте в изобретении предлагается способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируются в культуре, по существу свободной от эмбриональной сыворотки млекопитающих (предпочтительно также по существу свободной от сыворотки любых животных) и в присутствии фактора роста фибробластов, полученного из источника, отличного от просто слоя питающих фибробластов. В предпочтительной форме слой питающих фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится необязательным вследствие добавления достаточного количества фактора роста фибробластов».
В другом примере, в заявке на патент WO2005065354, описывается изотоническая культуральная среда определенного состава, по существу не содержащая питающих клеток и сыворотки, содержащая: a. базальную среду; b. количество bFGF, достаточное для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; c. количество инсулина, достаточное для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d. количество аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.
В другом примере, в заявке на патент WO2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним членом семейства белков трансформирующего ростового фактора бета (TGF-β), одним членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Подходящая культуральная среда может содержать следующие компоненты, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), Gibco № 11965-092; модифицированную по способу Дульбекко среду Игла Knockout (KO DMEM), Gibco № 10829-018; базальную среду Хэма F12/50% DMEM; 200 мM L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco № 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.
Образование панкреатических продуцирующих гормоны клеток из плюрипотентных стволовых клеток
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения панкреатических продуцирующих гормоны клеток из плюрипотентных стволовых клеток, включающий:
a. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток,
b. Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы,
c. Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и
d. Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки.
Плюрипотентные стволовые клетки, соответствующие целям настоящего изобретения, включают, например, эмбриональные стволовые клетки человека линии H9 (код NIH: WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07) и эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, которые экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, крипто, CD9, FOXD3, коннексин43, коннексин45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA3, SSEA4, Tra1-60 или Tra1-81.
Маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбираются из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3-бета, GSC, CER1, NODAL, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксового белка, FGF4 CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбирают из группы, состоящей из PDX1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбирают из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, и PTF1-альфа. В одном из вариантов осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую экспрессирующую гормоны клетку. В качестве альтернативы панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую секретирующую гормоны клетку.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии, экспрессирует Pdx1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3-бета, MAFA, PAX4 или PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии, представляет собой β-клетку.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al, Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al, Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой, а затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 23, 1534-1541 (2005).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А и лиганд Wnt в отсутствие сыворотки, затем удаления лиганда Wnt и культивирования клеток с активином A и сывороткой. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 60/990529.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076889.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076900.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076908.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076915.
Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)) и иммунологические способы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, метод проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких из следующих факторов: ABCG2, крипто, FOXD3, коннексин43, коннексин45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA3, SSEA4, Tra1-60 или Tra1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или с использованием способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, фактором роста фибробластов и ингибитором сигнального пути Hedgehog KAAD-циклопамином с последующим удалением содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин среды и культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 60/990529.
Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, хорошо известны специалистам в данной области, и дополнительные маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, продолжают выявляться. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии панкреатической эндодермы. К маркерам, характерным для линии панкреатической эндодермы, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, HLXB9, PTF1-альфа, PDX1, HNF6 или HNF1-бета.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)) и иммунологические способы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, метод проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или с использованием способа, раскрываемого в настоящем изобретении.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей DAPT и экзендин-4, с последующим удалением содержащей DAPT и экзендин-4 среды и культивированием клеток в среде, содержащей экзендин-1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей экзендин-4, с последующим удалением содержащей экзендин-4 среды и культивированием клеток в среде, содержащей экзендин-1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей DAPT и экзендин-4. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 24, 1392-1401 (2006).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей экзендин-4. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 24, 1392-1401 (2006).
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 11/736,908, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 60/953178, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 60/990529.
В одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ увеличения экспрессии маркеров, ассоциированных с линией панкреатических эндокринных клеток, включающий обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток средой, содержащей достаточное количество агониста рецептора TGF-β, чтобы вызвать увеличение экспрессии маркеров, ассоциированных с линией панкреатических эндокринных клеток, в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/110278.
Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии панкреатических эндокринных клеток. К маркерам, характерным для линии панкреатических эндокринных клеток, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, NGN3, NEUROD или ISL1.
Маркеры, характерные для линии β-клеток, хорошо известны специалистам в данной сфере, и дополнительные маркеры, характерные для линии β-клеток, продолжают выявляться. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные для β-клеточной линии дифференцирования. К специфичным характеристикам β-клеточной линии дифференцирования относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, PDX1, NKX2.2, NKX6.1, ISL1, PAX6, PAX4, NEUROD, HNF1-бета, HNF6, HNF3-бета или MAFA. Такие факторы транскрипции широко используются в данной области для идентификации эндокринных клеток. См., например, обзор Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. В качестве альтернативы эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии β-клеток.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)) и иммунологические способы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, метод проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
В одном из аспектов настоящего изобретения эффективность дифференцирования определяли путем измерения процентной доли инсулин-положительных клеток в данной клеточной культуре после обработки. В одном из вариантов осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 100% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 90% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 80% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 70% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 60% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 50% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 40% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 30% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 20% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 10% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 5% инсулин-положительных клеток в данной культуре.
В одном из аспектов настоящего изобретения эффективность дифференцирования определяли путем измерения стимулированной глюкозой секреции инсулина, определявшейся по количеству С-пептида, секретируемого клетками. В одном из вариантов осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 1000 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 900 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 800 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 700 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 600 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 500 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 400 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 500 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 400 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 300 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 200 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 100 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 90 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 80 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 70 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 60 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 50 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 40 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 30 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 20 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 10 нг C-пептида/пг ДНК.
Увеличение экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий этапы культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей достаточное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии MAFA.
Ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 1. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 2. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 4. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 5. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 9. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать несколько изоформ циклин-зависимой киназы, в любом их сочетании.
Ингибитор циклин-зависимых киназ может представлять собой белок. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может представлять собой пептид. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может представлять собой малую молекулу. В одном варианте осуществления низкомолекулярный ингибитор циклин-зависимых киназ может быть выбран из группы, состоящей из 7-н-бутил-6-(4-гидроксифенил)[5H]пирроло[2,3-b]пиразина, 9-нитро-7,12-дигидроиндоло[3,2-d][1]бензазепин-6(5H)-она, 3-(6-оксо-9-нитро-5,6,7,12-тетрагидроиндоло[3,2-d][1]бензазепин-2-ил)пропионитрила, (2R)-2-((6-((3-амино-5-хлорфенил)амино)-9-(1-метилэтил)-9H-пурин-2-ил)амино)-3-метил-1-бутанола, аркириафлавина A, [6-бензиламино-2-(3-гидроксипропиламино)-9-изопропилпурина, бутиролактона I, (Z)-1-(3-этил-5-метокси-2,3-дигидробензотиазол-2-илиден)пропан-2-она, 2-(3-гидроксипропиламино)-6-(o-гидроксибензиламино)-9-изопропилпурина, 1-(2,6-дихлорфенил)-1,5-дигидро-6-((4-(2-гидроксиэтокси)фенил)метил)-3-(1-метилэтил)-4H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-4-она, Cdk/циклин-ингибиторного пептида III, 3-(2-хлор-3-индолилметилен)-1,3-дигидроиндол-2-она, этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилата, RO-3306, N-(цис-2-аминоциклогексил)-N-(3-хлорфенил)-9-этил-9H-пурин-2,6-диамина, 6-циклогексилметокси-2-(4′-сульфамоиланилино)пурина, 5-амино-3-((4-(аминосульфонил)фенил)амино)-N-(2,6-дифторфенил)-1H-1,2,4-триазол-1-карботиоамида, 3-амино-1H-пиразоло[3,4-b]хиноксалина, Cdk2-ингибитора I, Cdk2-ингибитора II, 2(бис-(гидроксиэтил)амино)-6-(4-метоксибензиламино)-9-изопропилпурина, 4-(6-циклогексилметокси-9H-пурин-2-иламино)-N,N-диэтилбензамида, N4-(6-аминопиримидин-4-ил)-сульфаниламида, (4-(2-амино-4-метилтиазол-5-ил)пиримидин-2-ил)-(3-нитрофенил)амина, 2-бром-12,13-дигидро-5H-индоло[2,3-a]пирроло[3,4-c]карбазол-5,7(6H)-диона, 1,4-диметоксиакридин-9(10H)-тиона, 5-(N-(4-метилфенил)амино)-2-метил-4,7-диоксобензотиазола, 4-(3,5-диамино-1Hпиразол-4-илазо)-фенола, 2-(2-гидроксиэтиламино)-6-(3-хлоранилино)-9-изопропилпурина, фаскаплизина, индирубин-3′-моноксима, индирубин-3′-моноксима, 5-иодо-, индирубин-3′-моноксим-5-сульфоновой кислоты, изогранулатимида, 2-(2-гидроксиэтиламино)-6-бензиламино-9-метилпурина, 6-(2-гидроксибензиламино)-2-((1R)-(гидроксиметил)пропил)амино)-9-изопропилпурина, 5-бром-3-(2-(4-фторфенил)-2-оксоэтилидин)-1,3-дигидроиндо-2-она, N6,N6-диметиладенина, 2-(1R-изопропил-2-гидроксиэтиламино)-6-(3-хлоранилино)-9-изопропилпурина, рапамицина, 2-(R)-(1-этил-2-гидроксиэтиламино)-6-бензиамино-9-изопропилпурина, сцитонемина, 3-[1-(3H-имидазол-4-ил)-мет-(Z)-илиден]-5-метокси-1,3-дигидроиндо-2-она и 4-(3′-гидроксифенил)амино-6,7-диметоксихиназолин.
В одном варианте осуществления ингибитор циклин-зависимой киназы представляет собой этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилат. В одном варианте осуществления этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилат добавляют к клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии эндокринных клеток, в количестве от приблизительно 0,1 мкM до приблизительно 10 мкM на период от приблизительно одного до приблизительно семи дней.
В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток, обрабатывают этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилатом в течение периода от приблизительно одного до приблизительно семи дней.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется, помимо прочего, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в панкреатические эндокринные клетки в отсутствие эмбриональной бычьей сыворотки
Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1, пассаж 52, культивировали на чашках, покрытых препаратом MATRIGEL® (разведение 1:30), и к ним применяли приведенный далее протокол дифференцирования для их дифференцирования в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
a. Среда RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота), с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота), с добавлением 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, Нью-Джерси), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A, с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
b. среда DMEM/F12 + 2% БСА + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина (№ 239804, Calbiochem, Калифорния) в течение двух дней (стадия 2), далее
c. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина + 2 мкM ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R & D Systems, Миннесота) в течение четырех дней (стадия 3), далее
d. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкM DAPT (ингибитор гамма-секретазы) (№ по кат. 565784, Calbiochem, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (№ по кат. 616452, Calbiochem, Калифорния) + 100 нг/мл Netrin-4 (R&D Systems, Миннесота) в течение трех дней (стадия 4), далее
е. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) в течение семи дней (стадия 5).
Среду заменяли ежедневно. На каждой стадии количество клеток подсчитывали с помощью гемоцитометра и для ПЦР-анализа отбирали образцы РНК. Все образцы отбирали в трех повторностях.
Пример 2
Скрининговое исследование влияния соединений из библиотеки ингибиторов II киназ EMD на клетки, обработанные в соответствии с протоколом дифференцирования, описанном в Примере 1
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 44, культивировали на 24-луночных планшетах с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 1, до стадии 5. После этого клетки в течение четырех дней обрабатывали средой DMEM/F12 + 1% B27, содержащей соединение из библиотеки EMD Calbiochem (№ по кат. 539745, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) в итоговом количестве 1 мкM. В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. На всем протяжении выполнения протокола среду меняли ежедневно. Все образцы проходили обработку в двух повторностях. По завершении обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировали методом ПЦР в реальном времени на экспрессию инсулина, глюкагона, MAFA и Arx4. Результаты, измеренные методом ПЦР в реальном времени, выражали в виде отношения инсулин/глюкагон (фиг.1, панель a) или отношения MAFA к ARX4 (фиг.1, панель b) в образцах, прошедших обработку, в сравнении с необработанной контрольной группой. В Таблице 1 приведены соответствующие идентификационные номера соединений для каждого номера лунки.
При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединениями A6, B7, B8 или C2 в количестве 1 мкM отношение инсулин/глюкагон составляло приблизительно 3,0 или выше (см. фиг.1, панель a).
Далее исследовали влияние этих соединений на отношение MAFA/ARX4 и наблюдали, что при обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, некоторыми соединениями изменение отношения MAFA/ARX4 было значительно более сильным, чем при обработке другими протестированными соединениями из библиотеки: в клетках, обработанных соединением B8, наблюдаемое отношение MAFA/ARX4 составляло приблизительно 1000. При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединением C2 соотношение MAFA/ARX4 составляло приблизительно 100 (см. фиг.1, панель b).
Пример 3
Влияние обработки ингибитором циклин-зависимых киназ на экспрессию инсулина и MAFA в клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 1
Некоторые из соединений, повышавших отношение экспрессии инсулин/глюкагон или экспрессии MAFA/ARX4 в Примере 2, представляли собой ингибиторы циклин-зависимых киназ. Одним таким соединением было соединение № 5330797 (5-амино-3-((4-(аминосульфонил)фенил)амино)-N-(2,6-дифторфенил)-1H-1,2,4-триазол-1-карботиоамид) (№ по каталогу 217714; Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния). Для подтверждения этих наблюдений человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1, пассаж 42, культивировали в чашках площадью 10 см2, покрытых препаратом MATRIGEL®, и обрабатывали в соответствии со способами, описанными в Примере 1, до стадии 5. После стадии 5 клетки обрабатывали средой DMEM/F12 с добавлением 1% B27, содержащей соединение № 5330797 в количестве 1 мкM, в течение шести дней. Среду меняли через день. Образцы клеток отбирали для анализа методом ПЦР в реальном времени до обработки соединением и на второй и пятый дни обработки соединением.
На фиг.2 представлены характерные микрофотографии клеток на 4 и 6 день обработки соединением в сравнении с необработанными контрольными группами. Необработанные клетки расположены очень плотно (фиг.2, панели a и d), и различить отдельные клетки сложно. При этом после обработки соединением № 5330797 в количестве 0,5 мкM или 1 мкM в течение шести дней отдельные ядра становятся видимыми (фиг.2, панели e и f) в сравнении с необработанной контрольной группой (фиг.2, панель d), и это свидетельствует о том, что в популяции клеток происходит дифференцирование. Также это сопровождалось гибелью некоторого числа клеток, как отмечено пробелами в слоях клеток на фиг.2, панели b и c.
Обработка клеток соединением № 5330797 в разной степени приводила к увеличению экспрессии инсулина, глюкагона, MAFA, MAFB и соматостатина. На фиг.3, панели a-v, показана относительная индукция экспрессии генов в зависимости от обработки, в сравнении с днем 0 (до обработки). Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые подвергали обработке соединением № 5330797 в количестве 1 мкM, демонстрировали приблизительно 1,5-кратное увеличение экспрессии глюкагона через 48 часов обработки. Через 5 дней обработки указанная экспрессия снижалась до уровня меньшего, чем до обработки. Увеличение экспрессии глюкагона не наблюдалось при обработке соединением № 5330797 в количестве 0,5 мкM (см. фиг.3, панель a).
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые обрабатывали соединением № 5330797 в количестве 1 мкM в течение пяти дней, демонстрировали приблизительно 1,5-кратное увеличение экспрессии инсулина (см. фиг.3, панель b).
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые обрабатывали соединением № 5330797 в количестве 1 мкM в течение пяти дней, демонстрировали приблизительно 200-кратное увеличение экспрессии MAFA (см. фиг.3, панель d).
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые обрабатывали соединением № 5330797 в количестве 0,5 мкM в течение пяти дней, демонстрировали приблизительно 1,5-кратное увеличение экспрессии MAFB (см. фиг.3, панель c). Наблюдали дозозависимое увеличение экспрессии соматостатина (фиг.3, панель e).
Не наблюдали изменений в экспрессии амилазы в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые обрабатывали соединением № 5330797 в течение пяти дней (см. фиг.3, панель f). Однако наблюдали снижение уровня экспрессии PAX4 (фиг.3, панель h), NKX6.1 (фиг.3, панель k), PDX1 (фиг.3, панель l), NEUROD (фиг.3, панель o) и BRN4 (фиг.3, панель q).
Пример 4
Обработка ингибитором циклин-зависимых киназ повышала экспрессию MAFA в кластерах, подобных островкам поджелудочной железы
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 52, культивировали на чашках с покрытием MATRIGEL® (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 1. Была введена дополнительная стадия (стадия 6) для дальнейшего созревания клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Стадия 6 в данном примере включала семидневную обработку средой DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния). Среду заменяли ежедневно.
После стадии 6 клетки обрабатывали в течение 5 минут при комнатной температуре 1X раствором аккутазы (Sigma, Миссури). Аккутазу удаляли и добавляли к клеткам среду DMEM/12 + 1% B27. Прикрепленные клетки снимали клеточным скребком, аккуратно ресуспендировали и пропускали через клеточный фильтр на 40 мкм. Клетки, оставшиеся на фильтре, снимали путем промывания базальной средой и культивировали в суспензии на сверхнизкопрофильных культуральных планшетах Ultra-Low (№ по кат. 3471, Corning, Массачусетс). Далее клетки проходили следующую обработку: клетки культивировали в среде DMEM/F12 + 1 % B27, содержащей 20 нг/мл активина A (AA), 1 мкм CDK-ингибитора III (№ по кат. 217714, Calbiochem, Калифорния) в течение 10 дней (стадия 7). В качестве контрольной группы использовали клетки, обработанные средой. В дни с 7 по 10 отбирали образцы для ПЦР-анализа и окрашивания дитизоном. Предполагалось, что клетки, культивированные в суспензии в соответствии со способами, описанными в данном примере, имели морфологию, сходную с кластерами в островках поджелудочной железы. Обработка CDK-ингибитором III, по-видимому, не влияла на морфологию кластеров, сходных с островками поджелудочной железы.
На фиг.4, панели a-i, показано влияние обработки CDK-ингибитором III на профиль экспрессии генов в клеточных кластерах. Обработка CDK-ингибитором III повышала экспрессию маркеров, ассоциированных с линией панкреатических эндокринных клеток и, в частности, повышала экспрессию проинсулинового транскрипционного фактора MAFA.
На фиг.5, панели a-b, показано влияние CDK-ингибитора III на окрашивание кластеров дитиазоном (DTZ). Клеточные кластеры, обработанные CDK-ингибитором и окрашенные DTZ, имели более красный характер окраски, чем кластеры, не обработанные CDK-ингибитором III.
Пример 5
Анализ методом FACS инсулин-продуцирующих клеток, получаемых способами, составляющими предмет настоящего изобретения
Эмбриональные человеческие стволовые клетки линии H1, пассаж 42, культивировали на планшетах, покрытых препаратом MATRIGEL®, и дифференцировали в инсулин-продуцирующие клетки с использованием следующего протокола:
a. среда RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота), с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота), с добавлением 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, Нью-Джерси), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A, с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
b. среда DMEM/F12 + 2% БСА + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина (№ 239804, Calbiochem, Калифорния) в течение двух дней (стадия 2), далее
c. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина + 2 мкM ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R & D Systems, Миннесота) в течение четырех дней (стадия 3), далее
d. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкM DAPT (ингибитор гамма-секретазы) (№ по кат. 565784, Calbiochem, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (№ по кат. 616452, Calbiochem, Калифорния) + 100 нг/мл Netrin-4 (R&D Systems, Миннесота) в течение трех дней (стадия 4), далее
e. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) в течение семи дней (стадия 5), далее
f. среда DMEM/F12 + 1% B27 в течение семи дней (стадия 6), далее
g. обработка аккутазой в течение 5 минут, затем удаление скребком оставшихся прикрепленными клеток. Затем клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр 40 мкм. Клетки, оставшиеся на фильтре, извлекали путем смывания базальной средой и культивировали в суспензии на сверхнизкопрофильных культуральных планшетах в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (№ по кат. 11995-073, Invitrogen, Калифорния) + 1 % B27 + 20 нг/мл активина A (AA) и 1 мкМ CDK-ингибитора III (№ по кат. 217714, Calbiochem, Калифорния) в течение 5 дней (стадия 7).
Сходные с островками кластеры диспергировали на одиночные клетки с помощью реактива TrypLE Express (Invitrogen, Carlsbad, Калифорния) и отмывали холодным PBS. Для фиксации клетки ресуспендировали в 200-300 мкл буфера Cytofix/Cytoperm (BD 554722, BD, Калифорния) и инкубировали в течение 30 мин. при 4°C. Клетки дважды отмывали в 1 мл буферного раствора Perm/Wash (BD 554723) и ресуспендировали в 100 мкл раствора для окраски/блокировки, содержащем 2% нормальной козьей сыворотки в буфере Perm/Wash. Для анализа методом проточной цитометрии клетки окрашивали следующими первичными антителами: антителами к инсулину (кроличьи моноклональные антитела, Cell Signaling № C27C9; разведение 1:100); антителами к глюкагону (мышиные моноклональные антитела, Sigma № G2654, 1:100); антителами к синаптофизину (кроличьи поликлональные антитела, DakoCytomation № A0010, 1:50). Клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°C, после чего дважды промывали буфером Perm/Wash, а затем в течение 30 минут инкубировали в подходящих вторичных антителах: козьих антикроличьих Alexa 647 (Invitrogen № A21246) или козьх антимышиных 647 (Invitrogen № A21235); козьих антикроличьих R-PE (BioSource № ALI4407). Все вторичные антитела применяли в разведении 1:200. Клетки отмывали по меньшей мере один раз в буфере Perm/Wash и анализировали с применением метода BD FACS. Для анализа фиксировали не менее 10000 событий. В качестве контрольной группы использовали недифференцированные клетки H1 и клетки линии β-TC (CRL-11506™ ATCC, Вирджиния).
На фиг.6, панели a-c, показана процентная доля инсулин-положительных, синаптофизин-положительных, а также инсулин- и глюкагон-положительных клеток среди клеток, подвергавшихся обработке, соответствующей стадии 7, в базовой среде. На фиг.7, панели a-c, показана процентная доля инсулин-положительных, синаптофизин-положительных, а также инсулин- и глюкагон-положительных клеток среди клеток, подвергавшихся обработке, соответствующей стадии 7, в среде, содержащей CDK-ингибитор III в количестве 1 мкM, в течение 5 дней. Количество клеток, положительных по одному гормону, инсулину, после обработки CDK-ингибитором увеличилось с 3% до 8%. Кроме того, процентная доля полигормональных (инсулин- и глюкагон-положительных) клеток после обработки CDK-ингибитором уменьшилась.
Пример 6
Кинетика экспрессии MAFA, индуцированной CDK-ингибитором
Эмбриональные человеческие стволовые клетки линии H1, пассаж 42, культивировали на планшетах, покрытых препаратом MATRIGEL®, и дифференцировали в инсулин-продуцирующие клетки с использованием следующего протокола:
a. среда RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота), с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота), с добавлением 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, Нью-Джерси), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A, с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
b. среда DMEM/F12 + 2% БСА + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина (№ 239804, Calbiochem, Калифорния) в течение двух дней (стадия 2), далее
c. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина + 2 мкM ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R & D Systems, Миннесота) в течение четырех дней (стадия 3), далее
d. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкM DAPT (ингибитор гамма-секретазы) (№ по кат. 565784, Calbiochem, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (№ по кат. 616452, Calbiochem, Калифорния) + 100 нг/мл Netrin-4 (R&D Systems, Миннесота) в течение трех дней (стадия 4), далее
e. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) в течение семи дней (стадия 5), далее
f. среда DMEM/F12 + 1% B27 в течение семи дней (стадия 6), далее
g. обработка аккутазой в течение 5 минут, затем удаление скребком оставшихся прикрепленными клеток. Затем клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр 40 мкм. Клетки, оставшиеся на фильтре, извлекали путем смывания базальной средой и культивировали в суспензии на сверхнизкопрофильных культуральных планшетах в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (№ по кат. 11995-073, Invitrogen, Калифорния) + 1% B27 + 20 нг/мл активина A (AA) и 2 мкм CDK-ингибитора III (№ по кат. 217714, Calbiochem, Калифорния) в течение 1-8 дней (стадия 7).
Образцы отбирали для ПЦР-анализа в дни 1, 2, 3 и 4. После 4 дней обработки CDK-ингибитором CDK-ингибитор извлекали из культуральной среды и клетки культивировали еще 4 дня в среде DMEM-F12 + 1% B27 + 20 нг/мл активина A. По истечении четырех дней отбирали в трех повторностях образцы для ПЦР-анализа.
На фиг.8, панели a-b, показан характер экспрессии MAFA и инсулина в разные моменты времени стадии 7. Обработка ингибитором CDK приводила к значительному увеличению экспрессии MAFA и инсулина, и это увеличение росло с течением времени. Однако удаление CDK-ингибитора приводило к значительному падению экспрессии как MAFA, так и инсулина в образцах, взятых через четыре дня после прекращения использования данного соединения.
Пример 7
Скрининговое исследование влияния соединений из библиотеки ингибиторов киназ BIOMOL™ на клетки, обработанные в соответствии с протоколом дифференцирования, описанном в Примере 1
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 51, сеяли на 24-луночные планшеты с покрытием MATRIGEL® (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 1, до стадии 5. После этого клетки выращивали в течение одного дня в среде DMEM/F12 + 1% B27, а затем обрабатывали в течение шести дней средой DMEM/F12 + 1% B27, содержащей соединение из библиотеки BIOMOL™ (№ по кат. 2832, BIOMOL, Plymouth Meeting, Пенсильвания) с итоговой концентрацией 4 мкM. В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. В течение всего протокола обработки среду, содержащую базовые компоненты или соединение, меняли через день. Все образцы проходили обработку в двух повторностях. По завершении обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировали методом ПЦР в реальном времени на экспрессию инсулина, глюкагона, MAFA и ARX4. Результаты, измеренные методом ПЦР в реальном времени, выражали в виде отношения инсулин/глюкагон (Таблица 2) или отношения MAF/Arx4 (Таблица 2) в образцах, прошедших обработку, относительно необработанной контрольной группы. В Таблице 3 указаны соответствующие № по кат., № CAS, название соединения или идентификационный номер для каждой обозначенной буквенно-цифровым кодом лунки.
При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединениями C8 или F1 в количестве 4 мкM отношение экспрессий инсулин/глюкагон составило приблизительно 10,0 или выше. У клеток, обработанных соединением D9, отношение экспрессий инсулин/глюкагон составляло приблизительно 1840,0 (Таблица 2).
Далее исследовали влияние этих соединений на отношение MAFA/ARX4 и наблюдали, что при обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, некоторыми соединениями изменение отношения MAFA/ARX4 было значительно более сильным, чем при обработке другими протестированными соединениями из библиотеки: в клетках, обработанных соединением B6 или F1, отношение MAFA/ARX4 составляло приблизительно 10. При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединением C8 соотношение MAFA/ ARX4 составляло приблизительно 84, а в клетках, обработанных соединением D9, отношение MAFA/ARX4 составило приблизительно 212 (Таблица 2).
Пример 8
Влияние ингибиторов циклин-зависимых киназ на экспрессию инсулина и MAFA в клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 1
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 51, культивировали на 24-луночных планшетах с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 1, до стадии 5. Далее клетки выращивали в течение восьми дней в среде DMEM/F12 + 1% B27, а затем обрабатывали в течение четырех дней средой DMEM/F12 + 1% B27, содержащей ингибитор циклин-зависимых киназ с итоговой концентрацией 0,6125, 1,25 или 5,0 мкM. Были протестированы 6 ингибиторов: № 5330812 (№ по кат. EMD 217714), № 4566 (№ по кат. EMD 217713), № 5330797 (№ по кат. EMD 219476), № 73292 (№ по кат. EMD 341251), № 4592 (№ по кат. EMD 495620) и № 160355 (№ по кат. EMD 557360). В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. В течение всего протокола обработки среду, содержащую базовые компоненты или соединение, меняли через день. Все образцы проходили обработку в двух повторностях. По завершению обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировали методом ПЦР в реальном времени на экспрессию инсулина, глюкагона, MAFA и ARX4. Результаты выражались в виде измеренной методом ПЦР в реальном времени кратности изменения относительно контрольной группы, обработанной чистой средой.
Мы наблюдали, что соединения № 5330812, № 4566, № 5330797 и № 73292 в протестированных количествах стимулировали экспрессию MAFA (Таблица 4). Соединения № 4592 и № 160355 в протестированных количествах не стимулировали экспрессию MAFA (Таблица 4). Оказалось, что соединения № 5330812, № 4566, № 5330797, № 4592 и № 160355 стимулировали экспрессию инсулина (Таблица 4). Соединение № 5330797 снижало экспрессию глюкагона и Arx4 (Таблица 4), а также стимулировало экспрессию MAFA.
Пример 9
Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в панкреатические эндокринные клетки с помощью среды DMEM, содержащей 25 мкM глюкозы (DMEM-HG) и не содержащей эмбриональной бычьей сыворотки
Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 культивировали на чашках, покрытых препаратом MATRIGEL® (разведение 1:30), и дифференцировали в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использованием следующего протокола:
a. среда RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота), с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота), с добавлением 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, Нью-Джерси), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A, с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
b. среда RPMI с добавлением 2% БСА + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина (№ 239804, Calbiochem, Калифорния) в течение двух дней (стадия 2), далее
c. среда DMEM-HG + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 50 нг/мл FGF7 + 0.25 мкM Cyclopamine- KAAD + 2 мкM ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R & D Systems, Миннесота) в течение шести дней (стадия 3), далее
d. среда DMEM-HG + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкM ALK5-ингибитора II (№ по кат. 616452, Calbiochem, Калифорния) в течение трех дней (стадия 4), далее
e. среда DMEM-HG + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) в течение семи дней (стадия 5).
Среду заменяли ежедневно. На каждой стадии количество клеток подсчитывали с помощью гемоцитометра и для ПЦР-анализа отбирали образцы РНК. Все образцы отбирали в трех повторностях.
Пример 10
Скрининговое исследование влияния соединений из библиотеки ингибиторов I киназ EMD на клетки, обработанные в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 9
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 45, культивировали на 24-луночных планшетах с покрытием MATRIGEL® (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 9, до стадии 5. Далее клетки культивировали и обрабатывали в дни 1, 3 и 5 стадии 5 средой, содержащей DMEM-HG, 1% B27 (Invitrogen, Калифорния), 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) и соединение из библиотеки EMD Calbiochem 1, разведенное в DMSO (№ по кат. 539744, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) с итоговой концентрацией при обработке 2,5 мкM. В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. На всем протяжении протокола среду меняли ежедневно, за искючением стадии 5, когда среду меняли через день. Все образцы проходили обработку в двух повторностях.
По завершению обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировали методом ПЦР в реальном времени на экспрессию MAFA. Результаты, измеренные методом ПЦР в реальном времени, выражали в виде кратности изменения экспрессии MAFA относительно необработанных человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (Таблица 5).
При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединениями A4 (№ по кат. 124001, Akt-ингибитор IV), E8 (№ по кат. 527450, ингибитор PKR) и F9 (№ по кат. 539648, стауроспорин, N-бензоил-) в количестве 2,5 мкM экспрессия MAFA возросла по меньшей мере в 4 раза в сравнении с контрольной группой, обработанной средой (Таблица 5). При обработке соединением E6 (№ по кат. 521233, ингибитор IV тирозинкиназы рецептора PDGF) в количестве 2,5 мкM экспрессия MAFA возрастала по меньшей мере в 2,5 раза в сравнении с контрольной группой, обработанной средой (Таблица 5).
Пример 11
Скрининговое исследование влияния соединений из библиотеки ингибиторов II киназ EMD на клетки, обработанные в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 9
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 46, культивировали на 24-луночных планшетах с покрытием MATRIGEL® (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 9, до стадии 5. Далее клетки культивировали и обрабатывали в дни 1, 3 и 5 стадии 5 средой, содержащей DMEM-HG, 1% B27 (Invitrogen, Калифорния), 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) и соединение из библиотеки EMD Calbiochem II, разведенное в DMSO (Таблицы 1 и 6, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) с итоговой концентрацией при обработке 2,5 мкM. В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. На всем протяжении протокола среду меняли ежедневно, за искючением стадии 5, когда среду меняли через день. Все образцы проходили обработку в двух повторностях.
По завершению обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировались методом ПЦР в реальном времени на экспрессию MAFA. Показаны измеренные методом ПЦР в реальном времени результаты по соединениям, стимулировавшим экспрессию MAFA, выраженные в форме кратности увеличения экспрессии MAFA в сравнении с контрольными образцами (фиг.9).
При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, любым из следующих соединений: алстерпауллоном, 2-цианоэтилом; SU9516; алстерпауллоном; Cdk1/2-ингибитором III; ингибитором казеинкиназы I, D4476; или MEK1/2-ингибитором, в количестве 2,5 мкM экспрессия MAFA увеличивалась в 4,5 раза относительно необработанной контрольной группы (Таблица 7).
Пример 12
Ингибирование смены фаз клеточного цикла в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, низкомолекулярными ингибиторами стимулирует экспрессию MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
Рост клеток, происходящий в результате смены фаз клеточного цикла, можно активировать и поддерживать, стимулируя клетки экстраклеточными ростовыми факторами. Ростовые факторы связываются с внеклеточными доменами рецепторов ростовых факторов и вызывают конформационное изменение внутриклеточного домена рецептора. Это изменение запускает димеризацию рецептора и активацию тирозинкиназ, расположенных на внутриклеточном домене рецептора, что ведет к фосфорилированию и активации нескольких нижележащих сериновых/треониновых киназ, и это в итоге приводит к продвижению клеток по фазам клеточного цикла и пролиферации клеток.
В нормальных физиологических условиях зрелые панкреатические бета-клетки, характеризующиеся экспрессией инсулина и транскрипционного фактора MAFA, находятся в состоянии покоя, оставаясь, как правило, в фазе G0 клеточного цикла. Тем не менее, для образования достаточного для формирования функционального органа количества клеток и удовлетворения потребностей зрелого организма животного, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, составляющие предмет изобретения, должны проходить через фазы клеточного цикла. Таким образом, в определенный момент эмбрионального развития клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, составляющие предмет настоящего изобретения, дифференцируются в бета-клетки и переходят из состояния активно меняющей фазы цикла пролиферирующей клетки в состояние покоящейся клетки.
Наши данные свидетельствуют, что путем ингибирования смены фаз клеточного цикла в результате блокады сигнальных каскадов при помощи низкомолекулярных ингибиторов киназ можно заставить клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, экспрессировать MAFA, маркер зрелых панкреатических бета-клеток. Ингибиторы киназ, нацеленные на рецептор ростовых факторов (ингибитор IV тирозинкиназ рецептора PDGF), или ингибиторы, нарушающие работу киназ, расположенных далее по каскаду от тирозинкиназных рецепторов (MEK1/2-ингибитор, PKR-ингибитор или Akt-ингибитор IV), нарушают работу пролиферативной сигнализации, связанной с ростовыми факторами и киназами, что приводит к остановке клеточного цикла и индукции экспрессии MAFA. Использование ингибиторов широкого спектра действия, таких как стауроспорин, позволяет эффективно индуцировать экспрессию MAFA, однако такой ингибитор в действующих количествах является цитотоксичным. Более специфические соединения, такие как ингибиторы циклин-зависимых киназ (алстерпауллон, 2-цианоэтил; SU9516; алстерпауллон или Cdk1/2-ингибитор III) индуцируют экспрессию MAFA и имеют меньшую цитотоксичность, чем ингибиторы широкого спектра действия, такие как стауроспорин.
Чтобы выяснить, способен ли ингибитор киназ широкого спектра действия индуцировать экспрессию MAFA и образование более зрелого фенотипа у клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, мы провели дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 в соответствии со способами, описанными в Примере 9, и обработали их в дни 1, 3 и 5 протеинтирозинкиназным ингибитором, генистеином, который, как было показано, индуцирует остановку фазы G2 в человеческих и мышиных клеточных линиях и ингибирует несколько киназ. При использовании доз 10 и 30 нг/мл наблюдался увеличенный уровень экспрессии эндокринных гормонов инсулина, соматостатина и транскрипционного фактора MAFA в сравнении с необработанной контрольной группой, тогда как при использовании дозы 10 нг/мл увеличивалась экспрессия эндокринного гормона глюкагона (фиг.10). При использовании дозы генистеина 100 нг/мл наблюдалась значительная токсичность, коррелировавшая с утратой экспрессии инсулина, глюкагона и соматостатина.
Эти данные показывают, что ингибируя смену фаз клеточного цикла путем блокирования сигнальных каскадов низкомолекулярными ингибиторами киназ, ориентированными на ингибирование трансдукции сигнала от тирозинкиназ рецепторов ростовых факторов, к ядру и циклин-зависимым киназам, можно заставить клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, составляющие предмет изобретения, экспрессировать MAFA, маркер зрелых панкреатических бета-клеток.
Публикации, цитируемые в настоящем документе, в силу ссылки на них полностью включены в настоящий документ. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.
Таблица 1 Буквенно-цифровая маркировка лунок и соответствующие №№ библиотеки ингибиторов II для киназ Calbiochem EMD |
|||||||
Лунка | № | Лунка | № | Лунка | № | Лунка | № |
A2 | 16760529 | В2 | 16760303 | C2 | 5330797 | D2 | 9797929 |
A3 | 5278396 | B3 | 5326739 | C3 | 3004085 | D3 | 11493598 |
A4 | 6605258 | B4 | 5353431 | C4 | 481747 | D4 | 16760417 |
A5 | 5005498 | В5 | 2422 | C5 | 1893668 | D5 | 73292 |
A6 | 16760286 | B6 | 5472558 | C6 | 9969021 | D6 | 4124851 |
A7 | 5326843 | В7 | 2794188 | C7 | 2856 | D7 | 6539732 |
A8 | 3641059 | В8 | 5330812 | C8 | 6918386 | D8 | 448014 |
A9 | 6604931 | В9 | 438981 | С9 | 10202471 | D9 | 5287844 |
A10 | 11524144 | В10 | 6419753 | С10 | 9549301 | D10 | 6538818 |
A11 | 9549303 | В11 | 16760346 | С11 | 5339183 | D11 | 10020713 |
E2 | 5312137 | F2 | 11382492 | G2 | 6419739 | H2 | 176155 |
E3 | 6419766 | F3 | 11624601 | G3 | 4665 | H3 | 16219471 |
E4 | 6419741 | F4 | 490561 | G4 | 4713 | H4 | 3387354 |
E5 | 3674 | F5 | 3820 | G5 | 4712 | H5 | 5174 |
E6 | 9903786 | F6 | 5312122 | G6 | 5164 | H6 | 5228 |
E7 | 6419764 | F7 | 9951490 | G7 | 4987 | H7 | 16760659 |
E8 | 8515 | F8 | 389898 | G8 | 9549289 | H8 | 451705 |
E9 | 11665831 | F9 | 9549284 | G9 | 5702541 | H9 | 16760660 |
E10 | 11422035 | F10 | 11644425 | G10 | 5162 | H10 | 5289419 |
E11 | 16760525 | F11 | 509554 | G11 | 5353940 | H11 | 9549300 |
Таблица 2 Влияние соединений из библиотеки ингибиторов BIOMOL на отношение экспрессий инсулин/глюкагон и MAFA/Arx4, измеренное методом ПЦР в реальном времени в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Буквенно-цифровой код лунки соответствует идентификатору соединения из Таблицы 3. |
||
Отношение в сравнении с контрольной группой | ||
№ лунки | Инсулин к глюкагону | MAFA к Arx4 |
В1 | 1,6 | 0,9 |
В2 | 2,4 | 1,3 |
B3 | 2,9 | 2,9 |
B4 | 1,1 | 2,0 |
В5 | 1,3 | 1,3 |
B6 | 1,6 | 16,3 |
В7 | 1,3 | 0,5 |
В8 | 1,6 | 0,5 |
В9 | 1,1 | 1,5 |
В10 | 1,2 | 1,5 |
В11 | 1,1 | 2,1 |
В12 | 1,0 | 2,0 |
C1 | 0,7 | 0,8 |
C2 | 0,9 | 1,0 |
C3 | 1,3 | 0,9 |
C4 | 1,2 | 1,7 |
C5 | 1,0 | 1,1 |
C6 | 1,6 | 1,2 |
C7 | 4,3 | 0,2 |
C8 | 40,2 | 84,3 |
С9 | 0,8 | 0,5 |
С10 | 2,3 | 1,9 |
С11 | 1,1 | 0,4 |
С12 | 1,0 | 0,4 |
D1 | 2,7 | 1,2 |
D2 | 3,4 | 1,3 |
D3 | 1,7 | 2,1 |
D4 | 5,8 | 6,4 |
D5 | 1,4 | 1,1 |
D6 | 1,8 | 3,9 |
D7 | 1,7 | 0,6 |
D8 | 2,8 | 5,1 |
D9 | 1842,5 | 212,6 |
D10 | 0,9 | 1,3 |
D11 | 1,0 | 0,7 |
D12 | 1,1 | 2,5 |
E1 | 1,1 | 0,9 |
E2 | 0,8 | 0,8 |
E3 | 1,2 | 1,0 |
E4 | 2,1 | 1,3 |
E5 | 1,3 | 1,1 |
E6 | 2,0 | 1,5 |
E7 | 4,8 | 0,2 |
E8 | 3,7 | 0,0 |
E9 | 1,0 | 0,8 |
E10 | 0,6 | 0,2 |
E11 | 1,0 | 0,3 |
E12 | 0,8 | 0,2 |
F1 | 10,3 | 9,5 |
F2 | 2,9 | 1,9 |
F3 | 2,6 | 2,5 |
F4 | 1,5 | 2,7 |
F5 | 1,9 | 1,4 |
F6 | 1,6 | 1,2 |
F7 | 1,9 | 0,6 |
F8 | 1,5 | 0,6 |
F9 | 1,0 | 1,4 |
F10 | 5,4 | 3,4 |
F11 | 0,8 | 1,9 |
F12 | 1,0 | 1,4 |
G1 | 0,8 | 1,2 |
G2 | 0,6 | 1,1 |
G3 | 2,0 | 1,6 |
G4 | 1,3 | 1,6 |
G5 | 1,7 | 1,5 |
G6 | 1,5 | 1,3 |
G7 | 4,6 | 0,2 |
G8 | 3,9 | 0,4 |
G9 | 1,0 | 0,7 |
G10 | 1,3 | 0,7 |
G11 | 1,9 | 0,6 |
G12 | 1,4 | 0,8 |
H1 | 3,1 | 0,6 |
H2 | 1,8 | 3,5 |
H3 | 1,8 | 3,9 |
H4 | 1,2 | 4,0 |
H5 | 1,8 | 2,0 |
H6 | 1,4 | 2,9 |
H7 | 1,5 | 0,6 |
H8 | 2,1 | 0,8 |
Контрольная группа | 1,0 | 1,0 |
Таблица 3 Буквенно-цифровая маркировка лунок и соответствующие № по кат., № CAS, название соединения или идентификационный номер для библиотеки ингибиторов киназ BIOMOL |
|||
РАСПОЛОЖЕНИЕ НА ПЛАНШЕТЕ | № по кат. | № CAS | НАИМЕНОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЛИ № |
В1 | EI-360 | 167869-21-8 | PD-98059 |
В2 | EI-282 | 109511-58-2 | U-0126 |
B3 | EI-286 | 152121-47-6 | SB-203580 |
B4 | EI-148 | 84477-87-2 | H-7 |
В5 | EI-195 | 84468-17-7 | H-9 |
B6 | EI-156 | 62996-74-1 | Стауроспорин |
В7 | EI-228 | 133550-35-5 | AG-494 |
В8 | EI-267 | AG-825 | |
В9 | EI-185 | 125697-92-9 | Лавендустин A |
В10 | EI-253 | 136831-49-7 | RG-14620 |
В11 | EI-191 | 118409-57-7 | Тирфостин 23 |
В12 | EI-187 | 118409-58-8 | Тирфостин 25 |
C1 | EI-257 | 122520-85-8 | Тирфостин 46 |
C2 | EI-188 | 122520-86-9 | Тирфостин 47 |
C3 | EI-189 | 122520-90-5 | Тирфостин 51 |
C4 | EI-190 | 2826-26-8 | Тирфостин 1 |
C5 | EI-335 | 116313-73-6 | Тирфостин AG 1288 |
C6 | EI-277 | 63177-57-1 | Тирфостин AG 1478 |
C7 | AC-1133 | 71897-07-9 | Тирфостин AG 1295 |
C8 | EI-215 | 10537-47-0 | Тирфостин 9 |
С9 | EI-247 | HNMPA (гидрокси-2-нафталенилметилфосфоновая кислота) | |
С10 | EI-370 | 120685-11-2 | PKC-412 (протеинкиназа С) |
С11 | EI-271 | 10083-24-6 | Пицеатаннол |
С12 | EI-275 | 172889-26-8 | PP1 |
D1 | EI-272 | 133550-35-3 | AG-490 |
D2 | EI-263 | AG-126 | |
D3 | EI-229 | AG-370 | |
D4 | EI-258 | AG-879 | |
D5 | ST-420 | 154447-36-6 | LY 294002 |
D6 | ST-415 | 19545-26-7 | Вортманнин |
D7 | EI-246 | 133052-90-1 | GF 109203X |
D8 | EI-226 | 548-04-9 | Гиперицин |
D9 | EI-283 | 138489-18-6 | Ro 31-8220 |
D10 | EI-155 | 123-78-4 | Сфингозин |
D11 | EI-196 | 127243-85-0 | H-89 |
D12 | EI-158 | 84478-11-5 | H-8 |
E1 | EI-184 | 91742-10-8 | HA-1004 |
E2 | EI-233 | 103745-39-7 | HA-1077 |
E3 | EI-232 | HDBA (2-гидрокси-5-(2,5-дигидроксибензиламино)-бензойная кислота) | |
E4 | EI-230 | 127191-97-3 | KN-62 |
E5 | EI-268 | KN-93 | |
E6 | EI-197 | 109376-83-2 | ML-7 |
E7 | EI-153 | 105637-50-1 | ML-9 |
E8 | CC-100 | 452-06-2 | 2-аминопурин |
E9 | CC-202 | 158982-15-1 | N9-изопропилоломоуцин |
E10 | CC-200 | 101622-51-9 | Оломоуцин |
E11 | CC-201 | 101622-50-8 | изооломоуцин |
E12 | CC-205 | 186692-46-6 | Росковитин |
F1 | EI-293 | 24386-93-4 | 5-йодотуберцидин |
F2 | EI-295 | 62004-35-7 | LFM-A13 |
F3 | EI-294 | 152121-30-7 | SB-202190 |
F4 | EI-297 | 172889-27-9 | PP2 |
F5 | EI-298 | 208260-29-1 | ZM 336372 |
F6 | EI-306 | 5812-07-7 | SU 4312 |
F7 | EI-303 | 146535-11-7 | AG-1296 |
F8 | EI-307 | 220904-83-6 | GW 5074 |
F9 | AC-1121 | 6865-14-1 | Пальмитоил-DL-карнитин Cl |
F10 | EI-270 | 82-08-6 | Роттлерин |
F11 | EI-147 | 446-72-0 | Генистеин |
F12 | ST-110 | 486-66-8 | Даидзеин |
G1 | EI-146 | 63177-57-1 | Эрбстатина аналог |
G2 | AC-1142 | 6151-25-3 | Кверцитина дигидрат |
G3 | AC-1293 | SU1498 | |
G4 | EI-357 | 4452-06-6 | ZM 449829 |
G5 | EI-278 | 195462-67-7 | BAY 11-7082 |
G6 | EI-231 | 53-85-0 | DRB (5,6-дихлор-1-β-D-рибофуранозилбензимидазол) |
G7 | EI-273 | HBDDE (2,2',3,3',4,4'-гексагидрокси-1,1'-бифенил-6,6'-диметанола диметиловый эфир) | |
G8 | EI-305 | 129-56-6 | SP 600125 |
G9 | CC-206 | 479-41-4 | Индирубин |
G10 | CC-207 | 160807-49-8 | Индирубин-3'-моноксим |
G11 | EI-299 | 146986-50-7 | Y-27632 |
G12 | EI-310 | 142273-20-9 | Кенпауллон |
H1 | EI-328 | 121-40-4 | Терреиновая кислота |
H2 | EI-332 | 35943-35-2 | Трицирибин |
H3 | EI-336 | BML-257 | |
H4 | EI-343 | SC-514 | |
H5 | EI-344 | BML-259 | |
H6 | EI-345 | 520-36-5 | Апигенин |
H7 | EI-346 | BML-265 (аналог эрлотиниба) | |
H8 | A-275 | 53123-88-9 | Рапамицин |
Таблица 4 Влияние соединений из библиотеки ингибиторов BIOMOL на экспрессию инсулина, глюкагона, MAFA и Arx4, в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток |
||||
Количество и № | MAFA | Инсулин | Глюкагон | Arx4 |
0,61 мкM 5330812 | 46,3 | 0,9 | 0,26 | 0,68 |
1,25 мкМ 5330812 | 209,2 | 1,3 | 0,31 | 0,66 |
5,0 мкM 5330812 | 2909,9 | 66,3 | 4,71 | 0,92 |
0,61 мкM 4566 | 1,0 | 1,0 | 0,77 | 0,78 |
1,25 мкM 4566 | 0,8 | 1,1 | 0,90 | 0,78 |
5,0 мкM 4566 | 1,0 | 1,1 | 0,96 | 0,69 |
0,61 мкM 5330797 | 0,7 | 0,6 | 0,34 | 0,36 |
1,25 мкM 5330797 | 1,5 | 0,8 | 0,25 | 0,37 |
5,0 мкM 5330797 | 6,3 | 1,3 | 0,04 | 0,16 |
0,61 мкM 73292 | 0,7 | 0,7 | 0,29 | 0,38 |
1,25 мкM 73292 | 1,3 | 1,0 | 0,25 | 0,42 |
5,0 мкM 73292 | 3,1 | 0,8 | 0,13 | 0,33 |
0,61 мкM 4592 | 0,9 | 0,9 | 0,81 | 0,61 |
1,25 мкM 4592 | 1,0 | 1,0 | 0,70 | 0,54 |
5,0 мкM 4592 | 0,6 | 1,3 | 1,08 | 0,77 |
0,61 мкM 160355 | 0,9 | 0,9 | 0,76 | 0,77 |
1,25 мкM 160355 | 0,7 | 1,0 | 0,61 | 0,65 |
5,0 мкM 160355 | 0,8 | 1,1 | 0,59 | 0,86 |
Контрольная обработка | 1,0 | 1,0 | 1,00 | 1,00 |
Таблица 5 Буквенно-цифровая маркировка лунок и соответствующие № по кат., название соединения или идентификационный номер для библиотеки ингибиторов I киназ EMD Calbiochem |
|||
Местонахождение планшета | № по каталогу | Название соединения | Индукция экспрессии генов в сравнении с H1:MAFa |
A10 | 197221 | Bcr-abl-ингибитор | 1,5 |
A11 | 203290 | Бисиндолилмалеимид I | 0,8 |
A12 | DMSO | Контрольная группа | 1,5 |
A2 | 121767 | AG 1024 | 0,8 |
A3 | 121790 | AGL 2043 | 0,8 |
A4 | 124011 | Akt-ингибитор IV | 45,7 |
A5 | 124012 | Akt-ингибитор V, трицирибин | 0,9 |
A6 | 124018 | Akt-ингибитор VIII, изозим-селективный, Akti-1/2 | 1,6 |
A7 | 124020 | Akt-ингибитор X | 1,4 |
A8 | 521275 | PDK1/Akt/Flt-ингибитор двух каскадов | 2,1 |
A9 | 189404 | Ингибитор II киназы Aurora | 1,3 |
В10 | 317200 | DMBI | 1,9 |
В11 | 324673 | EGFR/ErbB-2-ингибитор | 2,4 |
В12 | DMSO | Контрольная группа | 1,9 |
В2 | 203297 | Бисиндолилмалеимид IV | 1,9 |
B3 | 203696 | BPIQ-I | 1,6 |
B4 | 220285 | Хелеритрина хлорид | 2,3 |
В5 | 234505 | Соединение 56 | 1,8 |
B6 | 260961 | DNA-PK-ингибитор II | 2,0 |
В7 | 260962 | DNA-PK-ингибитор III | 2,2 |
В8 | 528100 | PI-103 | 1,9 |
В9 | 266788 | Ингибитор II диацилглицериновой киназы | 1,5 |
С10 | 375670 | Гербимицин A, Streptomyces sp. | 1,3 |
С11 | 343022 | Flt-3-ингибитор III | 1,1 |
С12 | DMSO | Контрольная группа | 1,1 |
C2 | 324674 | EGFR-ингибитор | 3,5 |
C3 | 324840 | EGFR/ErbB-2/ErbB-4-ингибитор | 0,9 |
C4 | 343020 | Flt-3-ингибитор | 0,6 |
C5 | 343021 | Flt-3-ингибитор II | 0,5 |
C6 | 344036 | Ингибитор тирозинкиназы рецептора cFMS | 2,2 |
C7 | 365250 | Gц 6976 | 1,9 |
C8 | 365251 | Gц 6983 | 1,0 |
С9 | 371806 | GTP-14564 | 0,7 |
D10 | 440203 | LY 303511 | 1,7 |
D11 | 448101 | Ингибитор Met-киназы | 2,1 |
D12 | Пуст. | 1,7 | |
D2 | 407248 | IGF-1R-ингибитор II | 1,6 |
D3 | 407601 | IRAK-1/4-ингибитор | 2,2 |
D4 | 420099 | JAK-ингибитор I | 1,4 |
D5 | 420104 | JAK3-ингибитор II | 2,0 |
D6 | 420121 | JAK3-ингибитор IV | 1,7 |
D7 | 420126 | JAK3-ингибитор VI | 1,9 |
D8 | 428205 | Lck-ингибитор | 1,9 |
D9 | 440202 | LY 294002 | 2,3 |
E10 | 528106 | Ингибитор PI 3-Kg | 1,6 |
E11 | 528108 | Ингибитор PI 3-Kb II | 1,4 |
E12 | Пуст. | 1,6 | |
E2 | 513035 | PD 158780 | 0,8 |
E3 | 513040 | PD 174265 | 1,0 |
E4 | 521231 | Ингибитор II тирозинкиназы рецептора PDGF | 0,8 |
E5 | 521232 | Ингибитор III тирозинкиназы рецептора PDGF | 1,7 |
E6 | 521233 | Ингибитор IV тирозинкиназы рецептора PDGF | 5,5 |
E7 | 521234 | Ингибитор PDGF RTK | 1,9 |
E8 | 527450 | Ингибитор PKR | 24,6 |
E9 | 527455 | Ингибитор PKR, отрицательная контрольная группа | 1,5 |
F10 | 567805 | Ингибитор I Src-киназы | 2,3 |
F11 | 572660 | SU11652 | 1,7 |
F12 | DMSO | Контрольная группа | 2,1 |
F2 | 529574 | PP3 | 1,3 |
F3 | 529581 | PP1-аналог II, 1NM-PP1 | 2,3 |
F4 | 539652 | Ингибитор PKCbII/EGFR | 1,8 |
F5 | 539654 | Ингибитор PKCb | 1,6 |
F6 | 553210 | Рапамицин | 1,2 |
F7 | 555553 | Ингибитор III Rho-киназы, Rockout | 1,7 |
F8 | 555554 | Ингибитор IV Rho-киназы | 2,3 |
F9 | 539648 | Стауроспорин, N-бензоил- | 11,7 |
G10 | 658550 | AG 1295 | 1,4 |
G11 | 658551 | AG 1296 | 1,1 |
G12 | DMSO | Контрольная группа | 1,2 |
G2 | 574711 | Syk-ингибитор | 1,2 |
G3 | 574712 | Syk-ингибитор II | 0,8 |
G4 | 574713 | Syk-ингибитор III | 1,1 |
G5 | 616451 | Ингибитор киназы TGF-b RI | 1,1 |
G6 | 616453 | Ингибитор III TGF-b RI | 1,6 |
G7 | 658390 | AG 9 | 1,5 |
G8 | 658401 | AG 490 | 1,4 |
G9 | 658440 | AG 112 | 1,4 |
H10 | 189405 | Ингибитор III киназы Aurora | 2,0 |
H11 | 569397 | Стауроспорин, Streptomyces sp. | 0,0* |
H12 | DMSO | Контрольная группа | 1,5 |
H2 | 658552 | AG 1478 | 2,7 |
H3 | 676480 | Ингибитор I киназы VEGF-рецептора 2 | 1,7 |
H4 | 676481 | Ингибитор II тирозинкиназы рецептора VEGF | 1,0 |
H5 | 676482 | Ингибитор III тирозинкиназы рецептора VEGF, KRN633 | 1,6 |
H6 | 676485 | Ингибитор II киназы VEGF-рецептора 2 | 1,0 |
H7 | 676487 | Ингибитор III киназы VEGF-рецептора 2 | 1,1 |
H8 | 676489 | Ингибитор IV киназы VEGF-рецептора 2 | 2,1 |
H9 | 260964 | DNA-PK-ингибитор V | 1,5 |
Таблица 6 Буквенно-цифровая маркировка лунок и соответствующие № по каталогу и № соединений для библиотеки ингибиторов II киназ EMD Calbiochem® |
||
№ лунки | № по кат. | № соединения |
A1 | DMSO | |
A2 | 422706 | KN-62 |
A3 | 118500 | Ингибитор ATM-киназы |
A4 | 118501 | Ингибитор ATM/ATR-киназы |
A5 | 126870 | Алстерпауллон |
A6 | 126871 | Алстерпауллон, 2-цианоэтил |
A7 | 128125 | Алоизин A, RP107 |
A8 | 128135 | Алоизин, RP106 |
A9 | 164640 | Аминопурваланол A |
A10 | 171260 | Ингибитор AMPK, Соединение C |
A11 | 189405 | Ингибитор III киназы Aurora |
A12 | Пуст. | |
В1 | DMSO | |
В2 | 189406 | Ингибитор киназы Aurora / Cdk |
B3 | 402085 | Индирубин-3′-моноксим |
B4 | 196870 | BAY 11-7082 |
В5 | 203600 | Богемин |
B6 | 217695 | Ингибитор Cdk1 |
В7 | 217696 | Ингибитор Cdk1, CGP74514A |
В8 | 217714 | Cdk1/2-ингибитор III |
В9 | 217720 | Ингибитор Cdk1/5 |
В10 | 218696 | Ингибитор казеинкиназы I, D4476 |
В11 | 218710 | Ингибитор III казеинкиназы II, TBCA |
В12 | Пуст. | |
C1 | DMSO | |
C2 | 219476 | Cdk4-ингибитор |
C3 | 219477 | Cdk4-ингибитор II, NSC 625987 |
C4 | 219478 | Cdk4-ингибитор III |
C5 | 219479 | Ингибитор Cdc2-подобной киназы, TG003 |
C6 | 220486 | Chk2-ингибитор II |
C7 | 234503 | Соединение 52 |
C8 | 238803 | Cdk2-ингибитор III |
С9 | 238804 | Cdk2-ингибитор IV, NU6140 |
С10 | 219491 | Иннгибитор Cdk/Crk |
С11 | 328009 | ERK-ингибитор III |
С12 | Пуст. | |
D1 | DMSO | |
D2 | 688000 | Ингибитор ROCK, Y-27632 |
D3 | 328007 | ERK-ингибитор II, FR180204 |
D4 | 328008 | ERK-ингибитор II, отрицательная контрольная группа |
D5 | 341251 | Фаскаплизин, синтетический |
D6 | 361540 | GSK-3b-ингибитор I |
D7 | 361541 | GSK-3b-ингибитор II |
D8 | 361549 | GSK-3b-ингибитор VIII |
D9 | 361550 | GSK-3-ингибитор IX |
D10 | 361551 | GSK-3-ингибитор X |
D11 | 361553 | GSK-3b-ингибитор XI |
D12 | Пуст. | |
E1 | DMSO | |
E2 | 572635 | SU6656 |
E3 | 361555 | GSK-3-ингибитор XIII |
E4 | 371957 | Изогранулатимид |
E5 | 400090 | IC261 |
E6 | 401481 | IKK-2-ингибитор IV |
E7 | 402081 | Индирубиновое производное E804 |
E8 | 420119 | JNK-ингибитор II |
E9 | 420123 | JNK ингибитор, отрицательная контрольная группа |
E10 | 420129 | JNK-ингибитор V |
E11 | 420136 | JNK-ингибитор IX |
E12 | Пуст. | |
F1 | DMSO | |
F2 | 475863 | Ингибитор MK2a |
F3 | 420135 | JNK-ингибитор VIII |
F4 | 420298 | K-252a, Nocardiopsis sp. |
F5 | 422000 | Кенпауллон |
F6 | 422708 | KN-93 |
F7 | 444937 | MEK-ингибитор I |
F8 | 444938 | MEK-ингибитор II |
F9 | 444939 | Ингибитор MEK1/2 |
F10 | 454861 | Ингибитор MNK1 |
F11 | 481406 | Ингибитор активации NF-кB |
F12 | Пуст. | |
G1 | DMSO | |
G2 | 506121 | Ингибитор III MAP-киназы p38 |
G3 | 506126 | Ингибитор MAP-киназы p38 |
G4 | 513000 | PD 98059 |
G5 | 513030 | PD 169316 |
G6 | 559396 | SB220025 |
G7 | 540500 | Пурваланол A |
G8 | 361554 | GSK3b-ингибитор XII, TWS119 |
G9 | 371963 | H-89, дигидрохлорид |
G10 | 559387 | SB 202474, отрицательная контрольная группа для опытов с ингибированием p38 MAPK |
G11 | 559388 | SB 202190 |
G12 | Пуст. | |
H1 | DMSO | |
H2 | 559389 | SB 203580 |
H3 | 371970 | HA 1077, дигидрохлорида фасудил |
H4 | 559402 | SB 218078 |
H5 | 565625 | SC-68376 |
H6 | 567305 | SKF-86002 |
H7 | 567731 | Ингибитор сфингозинкиназы |
H8 | 569397 | Стауроспорин, Streptomyces sp. |
H9 | 570250 | STO-609 |
H10 | 572650 | SU9516 |
H11 | 616373 | Ингибитор Tpl2-киназы |
H12 | Пуст. |
Таблица 7 Кратность увеличения экспрессии MAFA некоторыми соединениями из библиотеки ингибиторов II киназ EMD в клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 9 |
|||
№ лунки | Кратность относительно контрольной группы | № по кат. | Наименование соединения |
A6 | 24,8 | 126871 | Алстерпауллон, 2-цианоэтил |
H10 | 18,0 | 572650 | SU9516 |
A5 | 15,3 | 126870 | Алстерпауллон |
В8 | 8,2 | 217714 | Cdk1/2-ингибитор III |
В10 | 5,7 | 218696 | Ингибитор казеинкиназы I, D4476 |
F9 | 4,92 | 444939 | Ингибитор MEK1/2 |
Claims (32)
1. Способ увеличения экспрессии инсулина и MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, где способ включает стадии:
а. последовательной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека с получением клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток; и
b. культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей добавленное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии инсулина и MAFA по сравнению с клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые не культивируют в среде, содержащей добавленное количество ингибитора циклин-зависимой киназы;
где ингибитор циклин-зависимой киназы представляет собой ингибитор CDK 1/2 и где плюрипотентные стволовые клетки человека представляют собой плюрипотентные стволовые клетки человека, полученные без разрушения человеческого эмбриона, плюрипотентные стволовые клетки человека не эмбрионального происхождения, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H7, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H9 или клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток SA002.
2. Способ по п.1, где ингибитор представляет собой 5-амино-3-((4-(аминосульфонил)фенил)амино)-N-(2,6,-дифторфенил)-1H-1,2,4-триазол-1-каботиамид.
3. Способ по п. 1, где ингибитор циклин-зависимой киназы добавляют к клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии эндокринных клеток, в концентрации от приблизительно 0,1 мкM до приблизительно 10 мкM на период от приблизительно одного до приблизительно семи дней.
4. Способ по п. 1, где маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток выбраны из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4 и PTF1-альфа.
5. Способ по п.1, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляют собой панкреатические эндокринные клетки.
6. Способ по п.1, где стадия а. включает:
дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы;
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы; и
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для пакреатической эндокринной линии, которые экспрессируют по меньшей мере один из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4 или PTF1-альфа.
7. Способ по п.6, где маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, выбраны из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3-бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2.
8. Способ по п.6, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, являются сформированными клетками энтодермы.
9. Способ по п.6, где маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбраны из группы, состоящей из PDX1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HB9 и PROX1.
10. Способ по п.6, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляют собой клетки панкреатической эндодермы.
11. Способ увеличения экспрессии инсулина и MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, где способ включает стадии:
а. последовательной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека с получением клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток;
b. культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей добавленное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии инсулина и MAFA по сравнению с клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые не культивируют в среде, содержащей добавленное количество ингибитора циклин-зависимой киназы;
где ингибитор циклин-зависимой киназы представляет собой ингибитор CDK 4 и где плюрипотентные стволовые клетки человека представляют собой плюрипотентные стволовые клетки человека, полученные без разрушения человеческого эмбриона, плюрипотентные стволовые клетки человека не эмбрионального происхождения, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H7, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H9 или клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток SA002.
12. Способ по п.11, где ингибитор представляет собой 2-бром-12,13-дигидро-5Н-индол[2,3-а]пирроло[3,4-с]карбазол-5,7,(6Н)дион.
13. Способ по п.11, где ингибитор циклин-зависимой киназы добавляют к клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии эндокринных клеток, в концентрации от приблизительно 0,1 мкM до приблизительно 10 мкM на период от приблизительно одного до приблизительно семи дней.
14. Способ по п. 11, где маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток выбраны из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4 и PTF1-альфа.
15. Способ по п.11, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляют собой панкреатические эндокринные клетки.
16. Способ по п.11, где стадия а. включает:
дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы;
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы; и
дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, которые экспрессируют по меньшей мере один из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4 или PTF1-альфа.
17. Способ по п.16, где маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, выбраны из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3-бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2.
18. Способ по п.16, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, являются сформированными клетками энтодермы.
19. Способ по п.16, где маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбраны из группы, состоящей из PDX1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HB9 и PROX1.
20. Способ по п.16, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляют собой клетки панкреатической эндодермы.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11028708P | 2008-10-31 | 2008-10-31 | |
US61/110,287 | 2008-10-31 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011121842/10A Division RU2522001C2 (ru) | 2008-10-31 | 2009-10-23 | Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018111225A Division RU2687378C1 (ru) | 2008-10-31 | 2018-03-29 | Способ получения популяции клеток, экспрессирующих mafa (варианты) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014114039A RU2014114039A (ru) | 2015-10-20 |
RU2664226C2 true RU2664226C2 (ru) | 2018-08-15 |
Family
ID=41404335
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011121842/10A RU2522001C2 (ru) | 2008-10-31 | 2009-10-23 | Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток |
RU2014114039A RU2664226C2 (ru) | 2008-10-31 | 2014-04-09 | Дифференцирование человеческой эмбриональной стволовой клетки в линию панкреатических эндокринных клеток |
RU2018111225A RU2687378C1 (ru) | 2008-10-31 | 2018-03-29 | Способ получения популяции клеток, экспрессирующих mafa (варианты) |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011121842/10A RU2522001C2 (ru) | 2008-10-31 | 2009-10-23 | Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018111225A RU2687378C1 (ru) | 2008-10-31 | 2018-03-29 | Способ получения популяции клеток, экспрессирующих mafa (варианты) |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9234178B2 (ru) |
EP (1) | EP2346988B1 (ru) |
JP (1) | JP5785088B2 (ru) |
KR (1) | KR101712085B1 (ru) |
CN (2) | CN102272291B (ru) |
AU (3) | AU2009308967C1 (ru) |
BR (1) | BRPI0919885A2 (ru) |
CA (1) | CA2742268C (ru) |
ES (1) | ES2634445T3 (ru) |
MX (1) | MX2011004565A (ru) |
PL (1) | PL2346988T3 (ru) |
RU (3) | RU2522001C2 (ru) |
WO (1) | WO2010051223A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201103985B (ru) |
Families Citing this family (69)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8017395B2 (en) | 2004-12-17 | 2011-09-13 | Lifescan, Inc. | Seeding cells on porous supports |
PL1888123T3 (pl) | 2005-06-08 | 2013-06-28 | Janssen Biotech Inc | Terapia komórkowa chorób degeneracyjnych oka |
US8741643B2 (en) * | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
EP2185693B1 (en) | 2007-07-31 | 2019-07-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
EP2229434B1 (en) | 2007-11-27 | 2011-09-07 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
CA2959401C (en) | 2008-02-21 | 2021-12-07 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment |
EP2310492B1 (en) | 2008-06-30 | 2015-07-22 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
CA2742268C (en) | 2008-10-31 | 2020-02-18 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
US9012218B2 (en) | 2008-10-31 | 2015-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
AU2009316583B2 (en) | 2008-11-20 | 2016-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates |
RU2555538C2 (ru) | 2008-11-20 | 2015-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Культура плюрипотентных стволовых клеток на микроносителях |
GB2485113B (en) | 2009-07-20 | 2016-12-28 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells into cells of the pancreatic endoderm lineage |
CN102482640B (zh) | 2009-07-20 | 2015-03-11 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
BR112012001480A2 (pt) | 2009-07-20 | 2015-09-01 | Janssen Biotech Inc | Diferenciação de células-tronco embriônicas humanas |
US9150833B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
RU2664864C1 (ru) | 2009-12-23 | 2018-08-23 | Янссен Байотек, Инк. | Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы |
WO2011109279A2 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
CN102884176B (zh) | 2010-05-12 | 2017-09-05 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
PL2611909T3 (pl) | 2010-08-31 | 2018-05-30 | Janssen Biotech, Inc | Zróżnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych |
RU2673946C1 (ru) | 2010-08-31 | 2018-12-03 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток |
PL2611910T3 (pl) | 2010-08-31 | 2018-06-29 | Janssen Biotech, Inc | Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych |
AT510456B1 (de) * | 2010-09-27 | 2012-11-15 | Univ Wien Tech | Thiazolamin-derivate als zelldifferenzierungsbeschleuniger |
CA2821562A1 (en) * | 2010-11-02 | 2012-05-10 | National University Corporation Kumamoto University | Method of producing intestinal cells |
EP2646557B1 (en) * | 2010-12-03 | 2017-08-09 | BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH | Method for cellular rna expression |
CN105001165B (zh) | 2011-04-22 | 2020-06-23 | 西格诺药品有限公司 | 取代的二氨基嘧啶其组合物,和用其治疗的方法 |
US9617517B2 (en) | 2011-05-02 | 2017-04-11 | National University Corporation Kumamoto University | Small chemical compound which promotes induction of differentiation of stem cells into insulin-producing cells and method for inducing differentiation of stem cells into insulin-producing cells using said small chemical compound |
ES2902650T3 (es) | 2011-06-21 | 2022-03-29 | Novo Nordisk As | Inducción eficiente de endodermo definitivo a partir de células madre pluripotentes |
EP2733140A4 (en) * | 2011-07-15 | 2014-11-26 | Univ Nihon | INDIRUBIN DERIVATIVE HAVING HIGHLY SELECTIVE CYTOTOXICITY FOR MALIGNANT TUMORS |
BR112014015417A8 (pt) * | 2011-12-22 | 2017-07-04 | Janssen Biotech Inc | diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas |
AU2013230020B2 (en) | 2012-03-07 | 2018-08-09 | Janssen Biotech, Inc. | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
JP6450674B2 (ja) * | 2012-05-07 | 2019-01-09 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | ヒト胚性幹細胞の膵臓の内胚葉への分化 |
CN104334719B (zh) * | 2012-06-08 | 2018-02-13 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化 |
US20150247123A1 (en) * | 2012-09-03 | 2015-09-03 | Novo Nordisk A/S | Generation of pancreatic endoderm from Pluripotent Stem cells using small molecules |
GB201216796D0 (en) * | 2012-09-20 | 2012-11-07 | Cambridge Entpr Ltd | In vitro pancreatic differentiation |
MX2015008619A (es) | 2012-12-31 | 2016-01-12 | Janssen Biotech Inc | Suspension y agrupamiento de celulas humanas pluripotentes para la diferenciacion a celulas endocrinas pancreaticas. |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
MX2015008578A (es) * | 2012-12-31 | 2015-09-07 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9. |
RU2018116647A (ru) | 2012-12-31 | 2018-10-24 | Янссен Байотек, Инк. | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки |
CN103194424A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-07-10 | 于涛 | 一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法 |
CN106414718A (zh) | 2013-06-11 | 2017-02-15 | 哈佛学院校长同事会 | SC-β细胞以及用于产生其的组合物和方法 |
EP3039122B1 (en) * | 2013-08-30 | 2019-07-17 | Novo Nordisk A/S | Generation of endocrine progenitor cells from human pluripotent stem cells using small molecules |
NZ715903A (en) | 2014-01-30 | 2017-06-30 | Signal Pharm Llc | Solid forms of 2-(tert-butylamino)-4-((1r,3r,4r)-3-hydroxy-4-methylcyclohexylamino)-pyrimidine-5-carboxamide, compositions thereof and methods of their use |
RU2694311C2 (ru) * | 2014-05-16 | 2019-07-11 | Янссен Байотек, Инк. | Применение малых молекул для увеличения экспрессии mafa в панкреатических эндокринных клетках |
JP6762940B2 (ja) | 2014-12-16 | 2020-09-30 | シグナル ファーマシューティカルズ,エルエルシー | 2−(tert−ブチルアミノ)−4−((1R,3R,4R)−3−ヒドロキシ−4−メチルシクロヘキシルアミノ)−ピリミジン−5−カルボキサミドの製剤 |
JP6903577B2 (ja) | 2014-12-16 | 2021-07-14 | シグナル ファーマシューティカルズ,エルエルシー | 皮膚におけるc−Jun N末端キナーゼの阻害の測定方法 |
WO2016100898A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof |
WO2016100930A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived b cells and methods of use thereof |
US20180022710A1 (en) | 2015-01-29 | 2018-01-25 | Signal Pharmaceuticals, Llc | Isotopologues of 2-(tert-butylamino)-4-((1r,3r,4r)-3-hydroxy-4-methylcyclohexylamino)-pyrimidine-5-carboxamide |
CN107922287B (zh) | 2015-07-24 | 2021-04-09 | 细胞基因公司 | 合成(1r,2r,5r)-5-氨基-2-甲基环己醇盐酸盐的方法和其中可用的中间体 |
MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
MA45502A (fr) * | 2016-06-21 | 2019-04-24 | Janssen Biotech Inc | Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases |
JP2018014972A (ja) * | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 国立大学法人大阪大学 | 未分化細胞が除去された分化誘導細胞集団の製造方法 |
JP7139951B2 (ja) * | 2017-01-05 | 2022-09-21 | 味の素株式会社 | インスリン産生細胞分化誘導促進剤 |
EP3591040A4 (en) * | 2017-03-03 | 2020-11-11 | Kyoto University | METHOD FOR PRODUCING PANCREATIC ANALYZER CELLS |
US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
US10391156B2 (en) | 2017-07-12 | 2019-08-27 | Viacyte, Inc. | University donor cells and related methods |
CA3081762A1 (en) | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Semma Therapeutics, Inc. | Islet cell manufacturing compositions and methods of use |
CA3108275A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
US20200080107A1 (en) | 2018-09-07 | 2020-03-12 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
CA3139591C (en) | 2019-05-31 | 2024-01-16 | Timothy M. BRUHN | A biocompatible membrane composite |
WO2020243668A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | W. L. Gore & Associates, Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
EP3975926A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
JP2022534545A (ja) | 2019-05-31 | 2022-08-01 | ダブリュ.エル.ゴア アンド アソシエイツ,インコーポレイティド | 生体適合性メンブレン複合体 |
CN114364791A (zh) | 2019-09-05 | 2022-04-15 | 克里斯珀医疗股份公司 | 通用供体细胞 |
US11104918B2 (en) | 2019-09-05 | 2021-08-31 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
CA3203392A1 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Alireza Rezania | Universal donor cells |
CN113234664B (zh) * | 2021-05-11 | 2024-05-10 | 澳门大学 | 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用 |
WO2024008810A1 (en) * | 2022-07-06 | 2024-01-11 | Novo Nordisk A/S | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050118148A1 (en) * | 2002-12-20 | 2005-06-02 | Roland Stein | Compositions and methods related to mammalian Maf-A |
WO2006138433A2 (en) * | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
RU2359671C2 (ru) * | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
Family Cites Families (237)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
US3935067A (en) * | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
US5215893A (en) * | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5089396A (en) * | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) * | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5863531A (en) * | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
US5759830A (en) * | 1986-11-20 | 1998-06-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo |
US5567612A (en) * | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
CA1340581C (en) * | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
US5837539A (en) * | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
WO1992019759A1 (en) | 1991-04-25 | 1992-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
US5449383A (en) * | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
AU687386B2 (en) | 1993-04-08 | 1998-02-26 | Human Cell Cultures, Inc. | Cell culturing method and medium |
US5523226A (en) * | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
GB9310557D0 (en) * | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
TW257671B (ru) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
US5834308A (en) * | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
US6703017B1 (en) * | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
KR100252743B1 (ko) | 1994-12-29 | 2000-09-01 | 나가야마 오사무 | Il-6 안타고니스트를 함유하는 항종양제의 작용증강제 |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5718922A (en) * | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
US5908782A (en) * | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
ES2202840T3 (es) | 1997-04-24 | 2004-04-01 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Imidazoles sustituidos utiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias. |
DE69837491T2 (de) * | 1997-07-03 | 2008-01-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
EP1538206B1 (en) * | 1997-09-16 | 2010-03-24 | Centocor, Inc. | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
CA2307807C (en) * | 1997-10-23 | 2008-09-02 | Andrea G. Bodnar | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
CO4980885A1 (es) * | 1997-12-29 | 2000-11-27 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Compuestos de trifenilpropanamida utiles en el tratamiento de inflamaciones y metodos para preparar dicho compuesto |
AU755888B2 (en) | 1998-03-18 | 2003-01-02 | Mesoblast International Sarl | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
MY132496A (en) * | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US6667176B1 (en) * | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
US6413556B1 (en) * | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
US6458593B1 (en) * | 1999-01-21 | 2002-10-01 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
US6815203B1 (en) * | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
US6306424B1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
CA2385628A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Ammon B. Peck | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6685936B2 (en) * | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
US6753153B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-06-22 | The Scripps Research Institute | Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors |
US7005252B1 (en) * | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US7439064B2 (en) * | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
US6436704B1 (en) * | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
JP4621410B2 (ja) * | 2000-06-26 | 2011-01-26 | Ncメディカルリサーチ株式会社 | 神経細胞へ分化しうる細胞分画の調製方法及び神経変性疾患治療薬の製造方法 |
JP4524072B2 (ja) * | 2000-10-23 | 2010-08-11 | グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 新規化合物 |
AU2737102A (en) | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors |
YU46603A (sh) | 2000-12-08 | 2006-05-25 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical Inc. | Indazolil-supstituisana jedinjenja pirolina, kao inhibitori kinaze |
US6599323B2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
JP2005503759A (ja) | 2001-01-24 | 2005-02-10 | アメリカ合衆国 | 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法 |
US6713446B2 (en) | 2001-01-25 | 2004-03-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Formulation of boronic acid compounds |
US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
JP2004527249A (ja) * | 2001-04-19 | 2004-09-09 | デヴェロゲン アクチエンゲゼルシャフト フュア エントヴィックルングスビオローギッシェ フォルシュング | 幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法 |
WO2002088335A1 (fr) | 2001-04-24 | 2002-11-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Cellules souches et procede d'extraction de ces cellules |
EP1393066A4 (en) | 2001-05-15 | 2006-01-25 | Rappaport Family Inst For Res | INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS |
US6626950B2 (en) * | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
GB0117583D0 (en) * | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
AU2002319780A1 (en) * | 2001-08-06 | 2003-02-24 | Bresagen, Ltd. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
US6617152B2 (en) * | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
US20050053588A1 (en) * | 2001-10-18 | 2005-03-10 | Li Yin | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
ATE438708T1 (de) | 2001-11-15 | 2009-08-15 | Childrens Medical Center | Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon |
US20030161816A1 (en) | 2001-12-07 | 2003-08-28 | Fraser John K. | Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells |
CA2692325C (en) * | 2001-12-07 | 2015-10-20 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
WO2003054169A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-03 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
WO2003055992A2 (en) | 2001-12-28 | 2003-07-10 | Cellartis Ab | A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst-derived stem cell line |
US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
DE10214095C1 (de) * | 2002-03-28 | 2003-09-25 | Bernd Karl Friedrich Kremer | Dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung |
AU2003231358A1 (en) * | 2002-04-17 | 2003-10-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | METHOD OF FORMING PANCREATIC Beta CELLS FROM MESENCHYMAL CELLS |
US20040161419A1 (en) * | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
ATE387444T1 (de) | 2002-05-08 | 2008-03-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren |
US20060003446A1 (en) * | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
CN1662643A (zh) | 2002-05-28 | 2005-08-31 | 贝克顿·迪金森公司 | 人腺泡细胞的扩增和转分化 |
MXPA04012188A (es) * | 2002-06-05 | 2005-07-25 | Johnson & Johnson | Derivados de bisindolil-maleimida como inhibidores de cinasa. |
GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
US6877147B2 (en) * | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
US7838290B2 (en) * | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
AU2003257938A1 (en) | 2002-07-29 | 2004-02-16 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for differentiation of insulin positive, glucose |
WO2004016747A2 (en) | 2002-08-14 | 2004-02-26 | University Of Florida | Bone marrow cell differentiation |
WO2004023100A2 (en) * | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Amcyte Inc. | Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
US9969977B2 (en) * | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
US20040062753A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
US20060252150A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-11-09 | Linzhao Cheng | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
US7144999B2 (en) * | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
EP1567639A4 (en) | 2002-12-05 | 2005-12-21 | Technion Res & Dev Foundation | CULTURE OF HUMAN PANCREATIC ISLANDS AND USES THEREOF |
CN100549163C (zh) | 2002-12-16 | 2009-10-14 | 技术研究及发展基金有限公司 | 制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物 |
US7976853B2 (en) | 2003-01-29 | 2011-07-12 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Process for producing coated preparation |
WO2005045001A2 (en) * | 2003-02-14 | 2005-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
CA2520861A1 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
US20060194315A1 (en) * | 2003-03-31 | 2006-08-31 | Condie Brian G | Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
US20090203141A1 (en) * | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
JP4950660B2 (ja) * | 2003-06-27 | 2012-06-13 | エチコン、インコーポレイテッド | 分娩後由来細胞を使用する眼組織の修復および再生 |
IL161903A0 (en) * | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
US7569385B2 (en) * | 2003-08-14 | 2009-08-04 | The Regents Of The University Of California | Multipotent amniotic fetal stem cells |
US7157275B2 (en) * | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
WO2005021728A2 (en) * | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Stemcells California, Inc. | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations |
WO2005058301A1 (en) | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
US20060030042A1 (en) * | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
CN112813019A (zh) | 2003-12-23 | 2021-05-18 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
AU2004309421B2 (en) * | 2003-12-23 | 2011-04-21 | Viacyte, Inc. | Definitive endoderm |
US20050233446A1 (en) * | 2003-12-31 | 2005-10-20 | Parsons Xuejun H | Defined media for stem cell culture |
TWI334443B (en) * | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
WO2005071066A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells |
WO2005080551A2 (en) | 2004-02-12 | 2005-09-01 | University Of Newcastle Upon Tyne | Stem cells |
WO2005080598A1 (ja) | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
CA2581424A1 (en) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
AU2005221079B2 (en) | 2004-03-10 | 2010-07-22 | Regents Of The University Of California | Compositions and methods for growth of embryonic stem cells |
WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
KR20070029681A (ko) | 2004-04-01 | 2007-03-14 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 줄기 세포의 내배엽 및 이자 혈통으로의 분화 |
JP4926946B2 (ja) | 2004-04-27 | 2012-05-09 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | Pdx1発現性内胚葉 |
CN102925406B (zh) | 2004-07-09 | 2019-11-22 | 维亚希特公司 | 鉴定用于分化定型内胚层的因子的方法 |
CA2576872C (en) | 2004-08-13 | 2013-11-12 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells |
WO2006026473A2 (en) | 2004-08-25 | 2006-03-09 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS |
DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
AU2005282414C1 (en) * | 2004-09-08 | 2011-04-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Culturing human embryonic stem cells |
CN101044235B (zh) | 2004-09-08 | 2013-01-02 | 威斯康星校友研究基金会 | 胚胎干细胞的培养基和培养 |
US7632839B2 (en) * | 2005-01-19 | 2009-12-15 | Merck & Co. Inc. | Mitotic kinesin inhibitors |
JP2008528038A (ja) * | 2005-01-31 | 2008-07-31 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | 胚性幹細胞の指示された分化及びその利用 |
AU2006218359A1 (en) | 2005-03-04 | 2006-09-08 | John O'neil | Adult pancreatic derived stromal cells |
GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
WO2006113470A2 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
WO2006114097A2 (en) | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Aarhus Universitet | Biosurface structure array |
CA2610598A1 (en) | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Irm Llc | Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells |
US20060287912A1 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-21 | Vinayak Raghuvamshi | Presenting advertising content |
EP1931764A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-06-18 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Method for cell culture |
CN101233226B (zh) | 2005-06-22 | 2017-08-11 | 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 | 人胚胎干细胞的悬浮培养物 |
ES2330789T3 (es) | 2005-06-30 | 2009-12-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anilino-piridinotriazinas ciclicas como inhibidores de gsk-3. |
GB2443370A (en) | 2005-07-29 | 2008-04-30 | Australian Stem Cell Ct Ltd | Compositions and methods for growth of pluripotent cells |
US20080194021A1 (en) | 2005-07-29 | 2008-08-14 | Mays Robert W | Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells |
WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
AU2006285468A1 (en) | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Agency For Science, Technology And Research | Method of deriving progenitor cell line |
GB2444686B (en) | 2005-09-12 | 2010-08-25 | Es Cell Int Pte Ltd | Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins |
WO2008048671A1 (en) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
NZ567082A (en) | 2005-10-14 | 2012-08-31 | Univ Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
DK2674485T3 (da) | 2005-10-27 | 2019-08-26 | Viacyte Inc | Pdx-1 udtrykkende dorsal og ventral fortarm endoderm |
EP2208786B1 (en) | 2005-12-13 | 2018-08-01 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
CA2643478C (en) * | 2006-02-23 | 2019-06-18 | Novocell, Inc. | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
CA2644468C (en) * | 2006-03-02 | 2022-02-01 | Cythera, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
US7695965B2 (en) * | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
WO2007127927A2 (en) | 2006-04-28 | 2007-11-08 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US8741643B2 (en) * | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US8685730B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
US20070259423A1 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-08 | Jon Odorico | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
WO2007139929A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | The Burnham Institute For Medical Research | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
US20090298169A1 (en) | 2006-06-02 | 2009-12-03 | The University Of Georgia Research Foundation | Pancreatic and Liver Endoderm Cells and Tissue by Differentiation of Definitive Endoderm Cells Obtained from Human Embryonic Stems |
WO2007149182A2 (en) | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
CA2656175C (en) | 2006-06-26 | 2018-08-28 | Lifescan, Inc. | Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture |
US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
US8968994B2 (en) | 2006-07-06 | 2015-03-03 | Jeremy Micah Crook | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
WO2008013664A2 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
US20080044390A1 (en) * | 2006-08-11 | 2008-02-21 | Xiaowei Jin | Methods and compositions for the treatment of neurodegenerative disorders |
KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
WO2008039521A2 (en) * | 2006-09-26 | 2008-04-03 | Nmt Medical, Inc. | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
BRPI0718310A2 (pt) | 2006-10-17 | 2013-11-19 | Stiefel Laboratories | Metabólitos de talarozol |
WO2008048647A1 (en) | 2006-10-17 | 2008-04-24 | Cythera, Inc. | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
WO2008056779A1 (fr) | 2006-11-09 | 2008-05-15 | Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan | Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire |
WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
CN103627671A (zh) | 2007-01-30 | 2014-03-12 | 佐治亚大学研究基金会 | 产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途 |
GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
US20090053182A1 (en) | 2007-05-25 | 2009-02-26 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
CN105176919A (zh) | 2007-07-18 | 2015-12-23 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
WO2009048675A1 (en) | 2007-07-31 | 2009-04-16 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells |
EP2185693B1 (en) | 2007-07-31 | 2019-07-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
WO2009027644A2 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Composition |
US20110151447A1 (en) | 2007-11-06 | 2011-06-23 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells |
EP2229434B1 (en) | 2007-11-27 | 2011-09-07 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
CA2959401C (en) | 2008-02-21 | 2021-12-07 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment |
WO2009110215A1 (ja) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | 独立行政法人 科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
WO2009116951A2 (en) * | 2008-03-17 | 2009-09-24 | Agency For Science, Technology And Research | Microcarriers for stem cell culture |
US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
DK2283117T3 (da) | 2008-04-21 | 2014-01-20 | Viacyte Inc | Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller |
WO2009132083A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells |
US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
WO2009154606A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-23 | Cythera, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
EP2310492B1 (en) | 2008-06-30 | 2015-07-22 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
CN102231983A (zh) * | 2008-10-01 | 2011-11-02 | 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 | 使用选择性细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂对抗电离辐射的造血防护 |
US20120010178A1 (en) * | 2008-10-21 | 2012-01-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compounds for treatment of neurodegenerative disorders |
US9012218B2 (en) | 2008-10-31 | 2015-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
CA2742268C (en) | 2008-10-31 | 2020-02-18 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
CA2742583C (en) | 2008-11-04 | 2022-09-27 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
ES2932850T3 (es) | 2008-11-14 | 2023-01-27 | Viacyte Inc | Encapsulación de células pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas |
RU2555538C2 (ru) | 2008-11-20 | 2015-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Культура плюрипотентных стволовых клеток на микроносителях |
EP2356218B1 (en) | 2008-12-05 | 2017-05-03 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells |
GB2485113B (en) | 2009-07-20 | 2016-12-28 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells into cells of the pancreatic endoderm lineage |
BR112012001480A2 (pt) | 2009-07-20 | 2015-09-01 | Janssen Biotech Inc | Diferenciação de células-tronco embriônicas humanas |
FI20096288A0 (fi) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
US9150833B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
WO2011081222A1 (ja) | 2009-12-29 | 2011-07-07 | 武田薬品工業株式会社 | 膵ホルモン産生細胞の製造法 |
CA2791846A1 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | National University Of Singapore | Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response |
CN105176930B (zh) | 2010-03-31 | 2021-05-04 | 斯克里普斯研究所 | 重编程细胞 |
EP2563908B1 (en) | 2010-04-25 | 2019-01-09 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells |
CN102884176B (zh) | 2010-05-12 | 2017-09-05 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
US9085757B2 (en) | 2010-06-17 | 2015-07-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of insulin producing cells |
AU2011285531B2 (en) | 2010-08-05 | 2015-04-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Simplified basic media for human pluripotent cell culture |
RU2673946C1 (ru) | 2010-08-31 | 2018-12-03 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток |
WO2012117333A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
WO2013055834A2 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | The New York Stem Cell Foundation | Er stress relievers in beta cell protection |
BR112014015417A8 (pt) | 2011-12-22 | 2017-07-04 | Janssen Biotech Inc | diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas |
US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
CN104334719B (zh) | 2012-06-08 | 2018-02-13 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化 |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
TW201522637A (zh) | 2013-03-15 | 2015-06-16 | Jackson Lab | 非胚胎幹細胞之單離及其用途 |
-
2009
- 2009-10-23 CA CA2742268A patent/CA2742268C/en active Active
- 2009-10-23 RU RU2011121842/10A patent/RU2522001C2/ru active
- 2009-10-23 MX MX2011004565A patent/MX2011004565A/es active IP Right Grant
- 2009-10-23 PL PL09752567T patent/PL2346988T3/pl unknown
- 2009-10-23 ES ES09752567.9T patent/ES2634445T3/es active Active
- 2009-10-23 CN CN200980153865.9A patent/CN102272291B/zh active Active
- 2009-10-23 EP EP09752567.9A patent/EP2346988B1/en active Active
- 2009-10-23 WO PCT/US2009/061774 patent/WO2010051223A1/en active Application Filing
- 2009-10-23 BR BRPI0919885-7A patent/BRPI0919885A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-10-23 KR KR1020117011905A patent/KR101712085B1/ko active IP Right Grant
- 2009-10-23 CN CN201711327734.0A patent/CN107904201B/zh active Active
- 2009-10-23 JP JP2011534638A patent/JP5785088B2/ja active Active
- 2009-10-23 AU AU2009308967A patent/AU2009308967C1/en active Active
- 2009-10-23 US US12/604,457 patent/US9234178B2/en active Active
-
2011
- 2011-05-30 ZA ZA2011/03985A patent/ZA201103985B/en unknown
-
2014
- 2014-04-09 RU RU2014114039A patent/RU2664226C2/ru active
-
2015
- 2015-12-09 US US14/963,436 patent/US9752126B2/en active Active
-
2016
- 2016-07-06 AU AU2016204685A patent/AU2016204685B2/en active Active
-
2017
- 2017-08-22 US US15/683,594 patent/US10421948B2/en active Active
-
2018
- 2018-01-19 AU AU2018200452A patent/AU2018200452A1/en not_active Abandoned
- 2018-03-29 RU RU2018111225A patent/RU2687378C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050118148A1 (en) * | 2002-12-20 | 2005-06-02 | Roland Stein | Compositions and methods related to mammalian Maf-A |
RU2359671C2 (ru) * | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
WO2006138433A2 (en) * | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ZHANG C et al. "MafA is a key regulator of glucose-stimulated insulin secretion", MolCellBio, 2005; 25(12): 4969-4976. * |
ZHANG C et al. "MafA is a key regulator of glucose-stimulated insulin secretion", MolCellBio, 2005; 25(12): 4969-4976. ZHANG C et al. "The islet beta cell-enriched MafA activator is a key regulator of insulin gene transcription", JBioChem. 2005; 280(12):11887-11894. * |
ZHANG C et al. "The islet beta cell-enriched MafA activator is a key regulator of insulin gene transcription", JBioChem. 2005; 280(12):11887-11894. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2687378C1 (ru) | Способ получения популяции клеток, экспрессирующих mafa (варианты) | |
RU2586506C2 (ru) | Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток | |
CA2809303C (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
KR101851956B1 (ko) | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |