PT85949B

PT85949B - Processo para a preparacao de composicoes de insulina contendo ioes magnesio

Info

Publication number: PT85949B
Application number: PT85949A
Authority: PT
Inventors: Klavs Holger Jorgensen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1987-10-19
Publication date: 1990-07-31
Also published as: FI874596A0; EP0265213B1; DE3778287D1; NZ222214A; EP0265213A3; KR880004819A; HUT46232A; IE60264B1; NO170754B; AU7990787A; AU616381B2; PH23446A; NO874347L; NO170754C; CA1316819C; PT85949A; YU191887A; EP0265213A2; IL84203A; NO874347D0

Description

A oresente invenção diz resneito a comoosiçoes de insulina contendo iões magnésio. Estas composições mostram propriedades terapêuticas aperfeiçoadas.

As comnosiçoes de insulina utilizadas oara tra tamento dos diabéticos compreendem soluções e suspensões de insulina. ?’-s suspensões de insulina, todas com acção prolongada, nossuem valores de nH de cerca de 7. As soluções de insulina nossuem valores de oH, quer de cerca de 3 (as que ac) tuam rapidamente, assim como as soluções de acção prolongada), quer de cerca de 7 (apenas, as soluções de acção ráoida),

A razão da lacuna entre os dois intervalos do nH oara soluções de insulina é a baixa solubilidade na água da insulina no seu oH isoeléctrico (aproximadamente 5,3)» na ausência de ioes zinco (Tanford e Eostein? J. Am. Chem. Soe. 76 (1954), 2163-69, Fig. 1) e na presença de iões zinco (Fredericq e Neurathí J. Am. Chem. Soc. 72 (1950), 2684-91, Fig. 4).

As soluções ácidas de insulina não sao tao largamente utilizadas como no início da era insulínica., devido à degradação da insulina oor meio de desamidação.

A presente invenção baseia-se nas surpreendentes descobertas seguintes:

1) Soluções que contêm insulina em concentrações terapêuticas apropriadas podem ore_xarar-se com concentrações em ioes magnésio, de cerca de 0,05 a 0,5 moles/litro numa escala de oH de cerca de 4 a 6,2, isto é, em relação ao ponto isoeléctrico da insulina,

2) Numa escala do oH, de cerca, de 3-4 que é inaoropriada para a insulina devido à instabilidade química, as soluções apropriadas de derivados da insulina podem preoarar-se na presença de ioes magnésio em concentrações de cerca de 0,J05 a 0,5 moles, sob a condição de Asn ser substituído por um resíduo aminoácido nao contendo um grupo amido.

3) Também, na escala do nH de cerca de 6,2 a 8,5, soluções de insulina aoronriadas, eventualmente contendo um precipitado insulínico, podem nreparar-se na presença de iões magnésio em concentrações de cerca de 0,005 a 0,5 moles.

As comoosições da presente invenção possuem propriedades que são superiores às das comoosições insulínicas convencionais, anteriores.

Hoje suroreendentemente, considera-se que muitos sais de magnésio, tal como na alínea 1), por exemplo o cloreto de magnésio, possuem um efeito solubilizante sobre a insulina, com valores de oH de cerca de 4 a 6,2, ambos per se, e em comnaração, com os correspondentes sais de sódio, potássio e amónio (ver o Exemnlo 1 seguinte). Várias misturas de sais de magnésio possuem o mesmo efeito. Por conseguinte, conclui-se que a oresença de iões magnésio, em certas concen trações, constitui um parâmetro crítico para a solubilidade da insulina com valores de oH de cerca de 4 a 6,2.

termo iÕes magnésio, neste texto, comoreende iÕes magnésio livres e associados.

Além disso, foi surpreendente constatar que a nrotamina node estar incluída nas soluções insulínicas da nresente invenção possuindo valores de pH de cerca de 4 a

6,2 sem precipitação do complexo insulína-protamina. Com ajustamento do valor do pH a cerca de 7, tal complexo precipita.

Os iÕes cálcio, também, aumentam a solubilidade insulínina, numa escala do oH de cerca de 4 a 6,2. Porém, | os resultados das exneriêneias in vitro, sob condições fisioló gicas simuladas, indicam que a injecção de uma solução, contendo iões cálcio, dentro do tecido, poderá causar precipita ção do carbonato de cálcio e fosfato de cálcio, mesmo com concentrações de cálcio muito inferiores a 0,05 moles. Outras experiências indicam que a precipitação dos conoostos de magnésio correspondentes não terá lugar com a injecção de soluções de acordo com a oresente invenção. Como a orecinita ção dos comoostos de cálcio, nos tecidos, node ser prejudicial (devido ao risco de calcificação artificial), o contetí- 4 / f

í ·» do de iões cálcio livres, nas oreoarações insulínicas da ore sente invenção, não deverá ser mais alto, substancialmente, do que o corresoondente ao nível de cálcio dos fluidos extra-celulares. De oreferência, as nrenarações da oresente invenção contêm menos do que cerca de 10 mM de iões cálcio, com maior oreferência, menos do que cerca de 2 mM de iões cálcio.

Até aqui, como o inventor sabe, os ensinamentos anteriores referentes à matéria, relativos às soluções de insulina contendo iões magnésio, não consideram o intervalo do valor do nH de 4 a 6,2 ou as concentrações iónicas de nagnésio de 0,005 a 0,5 moles/litro.

A patente de invenção dinamarquesa n^s 63.OOO trata de preparações que contêm suspensões de complexos formados por insulina, agentes de acçao prolongada (isto é, a protamina) e ioes magnésio, com valores de pH de 6,5 a 7; as concentrações de magnésio oublicadas são inferiores a 0,004 moles.

A patente de invenção norte-americana n^s | 4.196.196 refere-se a uma composição oara aumentar a perfusão vascular e reperfusão em situações de doença, cuja como£ sição consiste em glicose , insulina e magnésio diootássio etileno diamina ácido tetra-acético. De acordo com o exemplo, a preparação conhecida contém 0,02 unidades de insulina por mililitro.

A oatente de invenção norte-americana nfi

4.472.385 trata da estabilização de soluções de insulina e .

zinco, com valores de nH de 7 a 8, e a melhoria da estabilidade obtém-se por meio da adição de cerca de 0,0004 a 0,01 moles de ioes cálcio ou magnésio. 0 limite superior da concentração de ioes magnésio, nos exemplos conhecidos, é de 0,002 moles.

A matéria das três patentes anteriores referidas está fora do âmbito da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, os ioes mag nésio na escala de concentração, descrita antes, podem adicionar-se a uma solução de insulina ou de um derivado de insulina cuja solução, eventualmente, além disso, contém insulina precipitada ou um derivado precicitado de insulina possuindo acção prolongada. Com a finalidade de administração subcutânea, adicionam-se ioes magnésio com o fim de obter uma solução com um início de acção mais rápido ou, se a solução contém protamina, um efeito prolongado. Se a composição da presente invenção, também contém insulina nrecioitada ou um derivado precipitado de insulina, pode obter-se uma preparação bifásica. Comoaradas com as preparações de insulina bifásicas, conhecidas, as preparações bifásicas de acordo com a presente invenção nossuem um início mais rá.oido do efeito de diminuição do açúcar no sangue. Exemplos de insulina preci itada são os cristais de insulina e zinco e os cristais de insulina, nrot mina e zinco.

- 6 / / c

BREVE RESUMO DA PRESENTE INVENÇÃO

Assim, a presente invenção diz respeito a solu ções de insulina, eventualmente contendo um precipitado de insulina oara administração oarentérica oossuindo um valor de nH na escala de cerca de 3 a 3,5 e contendo iões magnésio numa escala de concentração de cerca de 0,005 a 0,5 moles.

A concentração da insulina dissolvida oode situar-se na escala de cerca de 20 a 500 unidades de insulina

I nor mililitro.

Conhecidos pelos entendidos na matéria, agentes conservantes e estabilizantes podem estar presentes na orenaraçao insulínica.

A orotamina pode estar presente de preferência, de 8 a 40$ (oeso/oeso) baseado no peso da insulina, mais oref erencialmente de 10 a 30$ (peso/peso).

ATRIBUTOS DA PRESEITTE INVENÇÃO

Ausência de substancias retardadoras nas soluções de insulina da oresente invenção, constatou-se surpreendentemente que a absorção da insulina é mais rápida do que a da insulina referida (ver Exemolos 2 a 9 e 11, seguintes). Esta propriedade é útil nara una insulina de acção rá.ida, em particular em conjunto com um regime múltiplo de injecções em que a insulina se administra antes de cada refeição. Com início mais ráoido de actuação, a insulina, pode tomar-se, convenientemente, mais oróxima da refeição do que com soluções de

insulina convencionais de acção rápida. Além disso, um desa parecimento mais rápido da insulina diminui, provavelmente, o risco de hipoglicémia post-prandial.

As soluções de insulina da presente invenção que possuem um valor de oH na escala de 3 & 6,2, oodem ser também, oarticularmente úteis ₍.ara o método de infusão por meio de bombas, devido à falta, da precipitação insulínica originada pela difusão do dióxido de carbono, através dos cateteres. Tal precipitação tem-se observado, ocasionalmente, com soluções de infusão neutras e julga-se ser atribuível à diminuição do valor do oH causada oelo dióxido de carbono.

às soluções de insulina da presente invenção que contêm acima de cerca de 5%, de preferência acima de 8% e com maior preferência acima, de cerca de 10% (oeso/peso), com orotamina na base da insulina, apresentam uma absorção demorada da insulina, após injecçao subcutânea, em porcos, comparada co.m a insulina referida (ver Exemplos 4 e 5 seguintes). De preferência, o conteúdo de protamina está abaixo de cerca de 50%, mais preferentemente abaixo de cerca de 30% (peso/peso). As reparações de insulina-orotamina da presente invenção têm uma vantagem sobre as suspensões de insulina-protamina, neutras, de acção protrátil, Porque não existe o inconveniente da sedimentação. As preparações de insulina-orotamina, neutras, conhecidas, sao as suspensões, ao passo aue as preparações de insulina-orotamina, yireferi-

das, da presente invenção são soluções com valores de pH abai xo de cerca de 6,2.

Acredita-se que as soluções da aresente invenção estão narticularmente indicadas aara serem orescritas na aplicação de esquemas utilizados na múltiola terapia insulínica injectável.

DISCUSSÃO Da PRESENTE INVENÇÃO

As preoarações da _f,resente invenção oodem conter uma insulina nnturalmente ocorrente e/ou um seu derivado. As insulinas oreferidas c.^ra a prática da aresente invenção são humanas, oorcinas e bovinas, mais oreferentemente humanas. Também, outras insulinas natural-mente ocorrentes se aodem utilizar na critica da oresente invenção. De mreferência, utiliza-se uma insulina de alta oureza. Dentro do contexto da oresente invenção, o termo insulina, quando utilizado no olural ou em sentido genérico, significa incluir tanto as insulinas naturalmente ocorrentes como os seus derivados.

Algumas propriedades diferentes oodem existir entre as insulinas natural-mente ocorrentes e os seus derivados.

Aqui, o termo derivados de insulina (ou derivados insulínicos) aolica-se aos péptidos que oossuem efeito de diminuição do açúcar no sangue e que oossuem uma composição a.ninoácida que é idêntica à da insulina humana com a condição de alguns dos resíduos aninoácidos estarem trocados por outros resíduos aminoácidos e, oacionalmente, o gruno carboxi

terminal C da cadeia B estar protegido. Exemnlos de tais derivados insulínicos estão descritos, entre outros, em dois pedidos de '.atentes de invenção europeias, publicados com os n$s. 85301755 e 86306721, cujo conteúdo está incorporado, aaui, como referência.

Quando se utiliza a insulina humana, porcina ou bovina nas soluções de acordo com a nresente invenção, 0 conteúdo de zinco da insulina tem de ser baixo, de oreferencia inferior a 0,1 iões zinco/hexâmero (correspondente a menos que 0,02% (oeso/oeso) na base de insulina), com a finalidade de evitar a precipitação da insulina com valores de pH acima de cerca de 4 e, isto, também se aolica ès soluções contendo protamina. Os cristais de insulina e zinco oodem ser libertos do zinco, por exemplo, oor meio de um processo de sa lificação seguido de precipitação com pll ⁼ 5 (Schlichtkrull: Acta Chem. Scand, 10 (1956), 1455-58). Porém, se agentes, susceptíveis de formar comolexos com zinco, estiverem presentes, tal como os citratos, 0 conteúdo de zinco oode ser | mais alto.

Quando se utilizam derivados de insulina, 0 conteúdo de zinco oode não ser crítico, na mesma prooorção. Nalguns casos de derivados de insulina, um nível elevado de iões zinco (por exemplo, acima de 10 iÕes zinco/hexâmero) node ser compatível com solubilidades âe insulina, nas condições das soluções de acordo com a presente invenção e oode, mesmo, ser desejável (ver pedido de patente de invenção eurooeia n9 86301755).

- 10 /

A prota nina é conhecida como una mistura heterogénea. A protamina pode obter-se a partir de peixes, tais como o Oncorhynchus Keta. lorém, também se podem utilizar orotaminas de outros peixes. Normalmente, a protamina vende-se no mercado, sob a forma de sulfato. Contudo, também se podem utilizar outros sais. Be preferência, utiliza-se a oro tamina de alta oureza.

Como exemplos de outras preparações preferidas da nresente invenção, oodem mencionar-se as preparações contendo zinco e orotanina. Em tais oreparaçÕes, que podem ser soluções de derivados de insulina, cujo olí se situa na escala de 3 θ- 4 ou suspensões neutras de insulina de mamíferos, o conteúdo de zinco pode situar-se acima de cerca de 25 iÕes de zinco por hexamero insulínico ou de derivado de insulina.

conteúdo de insulina, nas soluções da ore sente invenção pode situar-se na escala de 20 a. 500 Ul/ml, de oreferência na escala de 40 a 100 Ul/ml, nas oreoaraçÕes para injecçÕes. Porém, para outras modalidades de administração parentérica, o conteúdo de insulina pode ser mais alto. A solução de insulina pode misturar-se com um produto insulínico sólido, tal como cristais de insulina e zinco ou cristais de insulina, protamina e zinco.

De acordo com a presente invenção, oode utilizar-se uma variedade de sais de magnésio solúveis, separadamente e misturados. Exemolos de aniÕes aplicáveis são: cloreto, sulfato, monocarboxilatos como o acetato, propionato e

butirato e dicarboxilatos como o succinato, aspartato e glutamato. A concentração óntima de ioes magnésio depende do(s) salÉis) aplicado(s) e ooderá escolher-se consoante os requisi tos desejados oura o ajustamento da preparação, a solubilidade insulínica e a proximidade da composição ès condições isotónicas. As concentrações isotónicas dos sais de magnésio mos tram grande variação, como se pode ilustrar w meio de con centrações isotónicas de cloreto de magnésio e sulfato de magnésio, sendo aoroximadamente 0,1 moles, e 0,26 moles, respectivamente. Outros sais, aminoácidos e agentes n~o-iónicos (também os conservantes) oodem estar orescntes se não são tóxicos e se são comoatíveis com a nre_taração insulínica, como um todo.

De acordo com a oresente invenção, a escala de concentrações de iões magnésio, aplicável, é de cerca de 0,005 moles a 0,5 moles, de ^referência acima de 0,05 moles. 0 limite sunerior é um tanto arbitrário, sendo escolhido a nartir da hiaótese de que, em alguns casos (oor exemplo, paira a infusão intraperitoneal), algum excesso de isotonicidade deva aceitar-se. De acordo com um asoecto oreferido da oresen te invenção, as preoaraçÕes contêm cerca de 0,08 moles a 0,3 moles de ioes magnésio.

agente conservante oresente nas oreaaraçÕes de insulina da presente invenç~o pode ser o mesmo das oreoaraçÕes de insulina convencionais, anteriores, por exemolo, fenol, m-cresol e netiloarabeno.

' / / i

'....../

Para a preparação das soluções aquosas de insulina de acordo co^i ? mreaente invenção, pode .nisturar-se uma solução ligeiramente ácida, de insulina co 1 uma solução contendo todos os outros comoonentes da preparação final. Depois, segue-se o ajustamento do valor do oH desejado, agitando até se obter uma solução clara e, final mente, uma filtração esterilizada. Eventualnente, uma suspensão de insulina de acção prolongada, esterilizada, pode adieionar-se a uma so luçao de insulina esterilizada originando uma oreoaração com acção bifásica. Com a finalidade de proteger as orenaraçoes da desnaturação que pode ter lugar oor meio de aquecimento e agitação, ocasionais, podem incluir-se agentes estabilizantes conhecidos, tais como os fosfolíoidos.

As oremaraçÕes contendo um derivado de insulina prenaram-se de modo an'logo.

As preoaraçÕes de insulina da presente invenção podem utilizar-se no tratamento dos diabéticos, Recomenda-se que a dosagem das nreoaraçoes de insulina da presente invenção | sejam escolhidas por um médico, de modo semelhante £ escolha da dosagem das preoaraçoes de insulina, conhecidas, para injecçoes.

Os exennlos seguintes ilustram como os ioes magné sio aumentam a solubilidade da insulina, como se pode orensrsr as oreparaçÕes de insulina, preferidas, da presente invenção e como actuam, aoós injecção em porcos.

Exemplo1

Ajustaram-se a valores de pH indicados na. tabela I soluções Acidas contendo 200 UI de insulina humana, monocomponente, livre de zinco, por mililitro, vestígios de mono-insulina humana Ι^{χ ?}(A19), 2 g de fenol/litro e um sal (registado no Quadro I seguinte), em concentrações aproximadamente isotónicas, Determinaram-se as solubilidades por meio da medida das concentrações de radioactividade nos sobrenadantes I e conversão dos resultados em Ul/ml (uma (1) UI corresaonde a 38 gg de insulina). 0 efeito dos sais na solubilidade da insulina (Ul/ml), à temperatura ambiente, pode verificar-se no Quadro I.

Quadro I

pH	0,1 Γ .....-.........-.....- :^-2-	0,15 7 NaCl	0,15 W KC1	0,15 L NU Cl
3,5	acima de 200	acima de 200	acima de 200	aci na- de 200
4,0	135	79	93	109
4,5	85	20	26	29
5,0	104	16	17	22
5,5	124	18	21	25
6,0	70	25	32	29
6,5	21	41	56	27

Quadro I mostra aue a. solubilidade da insulina numa solução aproximadamente isotónica de cloreto de magnésio é, suroreendentemente, nuito mais alta do aue as solubilidades nas correspondentes soluções cie cloreto de sódio, cloreto de potássio e cloreto de ’nónio, todas con oH de 4 a 6, e aoroximaçoes de 100 Ul/ml, una concentração utilizada, vulgarmente, nas preparações de insulina para. injecçÕes.

Determinou-se a solubilidade da insulina (UI/ /ml) à temoeratura ambiente, com oH = 5,5 e em diferentes con centraçoes de sais. As diferentes solubilidades são indicadas no Quadro II seguinte.

Quadro II

Concentração

salina M	ÍTgCl ₀	NaCl	EC1	n:í₄ci
0,025			12	4	4	5
0,050			33	5	6	5
0,075			72	7	9	8
0,10			101	11	12	11
0,15	acima	de	200	21	21	25
0,20	acima	de	200	37	34	33
0,25	acima	de	200	41	54	06
0,30	acima	de	200	76	74	103
0,35	acima	de	200	69	84	123
0,40	acima	de	200	100	119	146

-ΙίΟ Quadro II evidencia una solubilidade suierior nas soluções de cloreto de magnésio em relação ãs soluções de cloreto de sódio, cloreto de ootássio e cloreto de amónio para uma vasta gama de concentrações salinas.

Exemplo 2

Prenarou-se uma solução, designada oor 1, com a comoosição seguinte: 0,15 moles de butirato de magnésio, 0,006 moles de ácido cítrico,2 g de fenol/litro e 100 Ul/ml de insulina humana, monocomponente, livre de sinco; oH: 5,δ.

Utilizou-se como referencia, uma solução, designada oor p, feita como uma nreo^ração de. insulina oadrão de acçao r/ ida Âctranid HM, com a connosiçao seguinte: 16 g de glicerol/litro, 2 g de fenol/litro e 100 Ul/nl de insulina humana monocomponente (2 ioes zinco/hexânero); oH: 7,4. 0 meio obedece aos requisitos da Farmaconeia XIX dos Estados Unidos oara injecçÕes de insulina neutra.

Adicionou-se insulina humane. mono-I (A19), | em pequenas concentrações (0,3 - 1 p.Ci/ml), a ambas as soluções. Deoois, injectou-se oor via subcutânea, seoaradamente, 0,1 ml de cada solução em dois íorcos. Seguiu-se a absorção por meio de controlo externo da radioactividadc remanescente no local da injecçao oor intermédio de um detector de cintilação cristalina, associado a um esaectrómetro, nor analogia com um método desenvolvido oara estudos de absorção nos seres humanos (Binder (1969): Ábsorotion of injected insulin Thesis). Tiraram-se amostras de sangue oara determina — 16 —

ção da glicose no plasma e de insulina no plasma. Lbstram-se os resultados no Quadro III seguinte.

Quadro III mostra a duração da radioactividade residual, da glicose no nlasma e da IIR no plasma (insulina imuno-reactiva, determinada oor meio de radioi.iunoensaio). As quantidades de radioactividade no local da injecção são dadas em percentagens da quantidade medida imediatamente após a injecção (temoo=0). As concentrações de glicose no plasma são dadas em percentagens do valor da amostra sanguínea, tomado inediatamente antes da injecção (temno^O),

Solução Cz solução de referência dada a um porco (neso: 77 Kg).

Solução 1? solução do teste dada a outro porco (peso í 79 Kg).

Tempo após % Radloactivldade % Glucose no plasma IIR no plasma/xil/ml

H| o|

O w o> q O «rl Φ E •o β •rl

φ Ό	un Φ Ό	CM	cn CM	oo rH	-4* rH	1Λ	Φ Ό	m φ Ό
0	0						0	O
X	X						X	X
•H	rl						tH	•H
Λ	ti						ti	ti
£>	A
ti	ti						ti	ti
	m	Ό	00	ch	Π	O	Ch	b-
		rH	H	H	H	rH
Φ	φ
Ό	Ό
0	0
X	X
•rl	Ή
(0	ti

Ri	ti

00	o	rH	Ch	cn	rH	un	00	00
Ch	o	-3*	-d·	.d-	-d*	j-	t-	o
	rH							H

t- \o h í- co m \o n m -cr m ό

O	t-	d	o	b-	rH	in cn
O	\O		-cr	CM	rH
rH

o	H	43	Ch	\o	00	cn	-d·
o	σ\	b-		m	cn	CM	H

H

un o	O	o	O	O	o	o	O
H	cn	VO	Ch	CM	00	<r	O
1				rH	rH	CM	cn

Como se vê no Juvdro III, a insulina cio teste é absorvida mais denressa do que a insulina de referência. Isto está em comoleto acordo com as afinidades entre a duração da percentagem de glicose no plasma oara as soluções 0 e 1 e entre a duração da IIR no plasma para as soluções 0 e 1, respectivamente.

Exemplo 3

Preoarou-se una solução, designada 2, coa a com posição seguinte: 0,175 moles de acetato cie magnésio, 0,0375 moles de ácido acético, 2 g de fenol/litro e 100 Ul/nl de in sulina humana, monocom lonente, livre de zinco; oH: 5,5»

Adicionaram-se vestígios de insulina, como no Exemolo 2. Injectou-se, oor via subcutânea, 0,1 ml da. solução 2 num porco, num lado do pescoço, enquanto que se injectou, por via subcutânea, 0,1 ml da solução 0 âe insulina, de referência (oreparada como se descreve no Exemolo 2), no mesmo porco, mas no outro lado do pescoço.

A absorção foi seguida co.no no Exemplo 2. Após uma semana, repetiu-se a experiência com troca, dos locais de injecção. ifostram-se os resultados no Quadro IV.

Quadro IV

Curso do temoo da % de radioactividade residual. Valores mé dios de duas experiências no mesmo aorco.

Temoo aoós injecção min.

% Radioactividade

0	100	100
30	92	79
60	86	63
90	73	53
120	83	44
180	42	26
24-0	25	12
300	15	5

Conclui-se, a partir deste quadro, aue a insulina do teste é absorvida mais deoressa do que a insulixia de referência.

Exemplo 4

Prepararan-se duas soluçoes, designadas 3* e JB, com as comoosiçoes seguintes: JAj 0,14 moles de 'g30^, 0,05 moles de MgCl₂, 2 g de fenol/litro e 100 Ul/ml de insulina humana, monocomponente, livre de zinco: pH ajustado a

I

5,5 com HC1. 3Β· como 3A, mas com a adição de 1 mg de sulfato de protamina/ml.

Adicionaram-se pequenas quantidades de insulina, como no Exemplo 2. Injectou-se, „.or via subcutânea, 0,1 ml da solução 3A nos oorcos I e II, num lado do pescoço. Injectou-se 0,1 ml da solução JB, correspondente mente, nos oorcos III e IV. Injectou-se, por via subcutânea, 0,1 ml de us solução 0 de insulina de referência. ( - eparada como se descreve no Exemolo 2), em cada um dos quatro oorcos, no outro lado do pescoço. Seguiu-se a absorção como no Exemplo 2. Mostram-se os resultados no Quadro V.

Cursos do tempo da radioactividade residual.

3Aí sem protamina.	3B: com protamina
	Γ	Radioactividade
Tempo após
injecçao	Borco	I	Porco II	Borco	III	Porco	IV
min.	0	3A	0	3A	0	3B	0	3B

0	100	100	100	100	100	100	100	100
30	97	89	85	79	92	103	94	95
60	89	69	75	54	77	93	78	93
90	71	63	62	43	60	95	65	33
120	66	45	54	29	50	86	53	82
180	45	25	38	13	30	32	34	73
240	26	12	24	6	15	83	18	71
300	16	6	17	3	9	73	11	66

Conclui-se, a partir deste quadro, que a insulina do teste é absorvida mais depressa do que a insulina de referência, na ausência de orotamina, mas mais lentamente do que a insulina de referência, na presença de protaiina.

Exemolo 5

Preparar?m-se três soluções, designadas 4A, 4B e 40. com as comoosiçoes seguintes? 4A· 0,18 moles de succinato de magnésio, 0,01 moles UgC^, 0,002 moles de ínSO^, 0,02 moles de ácido succínico, 2 g de fenol/litro e 100 Ul/ /ml de insulina humana, monocomponente, livre de zinco; oH? 5,6. 4B; como 4A mas com a adição de 0,55 ag de sulfato de orotamina/ml. 40? como 4A mas com a adição de 0,73 mg de sulfato de orotamina/ml.

Adicionaram-se pequenas quantidades de insulina como no Exe.molo 2. Injectou-se, por via subcutânea, 0,1 ml das soluções 4A, 4B e 40 em porcos A, B e 0, resoectivamente, num lado do pescoço. Injectou-se, oor via subcutânea, 0,1 ml de uma. solução 0 de insulina de referência (preparada como se descreve no Exemplo 2), em cada um dos três norcos, no outro lado do pescoço. Seguiu-se a absorção como no Exemplo 2. Após uma semana, reoetiu-se a experiência com troca dos locais de injecção. '/ostram-se os resultados no Quadro VI.

Quadro VI

Dados do Exemplo 5. Duração da radioactividade. Valores ?iédios das duas experiências. 4A; sem protamina. 4Bí com oro ta mina, baixo conteúdo. 40: com protamina, alto conteúdo.

Tempo após injecção min.	% Radioactividade
Porco A	Porco B	Porco C
0	4A	0	4B	0	4C
0	100	100	100	100	100	100
30	91	82	92	87	92	89
60	78	71	87	86	84	87
90	66	57	74	80	71	85
120	51	45	63	73	59	81
180	33	23	47	62	40	70
240	21	15	35	54	25	66
300	15	9	25	46	17	56
480	10	6	16	35	9	45
600	8	4	8	27	5	31
720	6	4	5	17	4	19

Conclui-se, a nartir deste quadro, que e i relação A insulina de referência, a insulin* do teste é absorvida mais deoressa na ausência de mrotamina, .mais lentamente com o baixo conteúdo de orotamina e, ainda, mais lentamente

com o alto conteúdo de protanina.

Nos Exemplos 6,7,3,10 e 11, examinar--m-se as propriedades de absorção das nreparaçoes do teste, em relação com uma solução humana, Actranid, de referência, como nos Exemplos 2,3,4 e 5· No Exemnlo 9, utilisou-se outra solução de referência, como se vê a seguir. Por causa da ; ipplificação, porém, dá-se o resultado da comparação por inter médio da média da relação:

H ^{= T}5($ (^teste)/T₅₀^ (ref.)

os temoos que decorrem a partir do temno da injecção até a radioactividade, medida no local da injecção, ter diminuído para metade dos valores iniciais nara teste e referência, respectivamente. 0 número de oorcos envolvidos designa-se pelo símbolo N.

Exemplo 6

Solução do teste: 0,14 moles de -gSO^, 0,05 mo les de MgClg, 0,01 moles de acetato de magnésio, 0,002 moles de CaCH^, 2 g de m-cresol/1. e 100 Ul/ml de insulina humana, monocomponente, livre de zinco, e pequenas quantidades de insulina humana; valor de oH ajustado a 5,7 com ^cido clorídrico.

Injectou-se, em cada oorco, 0,04 ml de cada uma das soluções do teste e de referência.

valor de R encontrado foi de 0,73 ($=6).

Exemplo 7

Solução do teste: 0,02 moles de MgClg,

0,11 mo les de monocloridrato de arginina, 2 g de fenol/1 e 100 UI/ /ml de insulina humana, monocomponente, livre de zinco e pequenas quantidades de insulina: valor do pH ajustado a 7,7 com NaOH.

Injectou-se em cada porco, 0,08 ml de cada, uija das soluções do teste e de referência.

valor de R encontrado foi de 0,74 (N-2).

Exemplo 8

Solução do teste: 0,095 moles de ;IgCl₂, 2 g de fenol/1 e 100 UI eq uivai entes/ml de monodesamidoinsulina porcina livre de zinco e vestígios do comaosto derivado; valor de pH ajustado a 3,2 com 'eido clorídrico.

Injectou-se em cada porco, 0,08 ml de cada uma das soluções do teste e de referência.

valor de R encontrado foi de 0,71 (N^s2).

Exemolo 9

Solução do teste? 0,095 moles de 2 g de fenol/1. ® 100 UI equivalentes/ml de derivado de insulina hu mana livre de zinco com Ser(B9) substituído por Asp e Thr (B27) substituído por Glu, e vestígios do comoosto derivado; valor do oH ajustado a 7»4.

Poraue se constatou, anteciaada.nente, que o

-25-/ c

composto derivado, formulado como Actrapid, foi absorvido mais rapidamente do que Actrapid humana (veja-se o pedido de patente de invenção europeia n^s. 33306721), a solução de referência utilizada neste Exemolo, foi o comosto derivado, formulado corno Actraoid, com 100 UI equivalentes/ml do composto derivado.

I 0 valor de R encontrado foi de 0,85 (N=5).

Assim, também, com este derivado insulínico mais rapidamente absorvível, obtém-se um aumento na absorção, através dos iões magnésio.

Exemplo 10

Solução do teste 1; 0,095 moles de í.TgClg,

0,002 moles de acetato de zinco, 1 mg de sulfato de orotamina/ml, 3 g de m-cresol/ml e 100 UI eαuivaientes/ml de monodesamidoinsulina porcina livre de zinco mais vestígios do | comoosto derivado; valor do pH a justado a. 3,2 com ácido clorídrico.

Solução do teste 2j como a 1, exceoto que

0,095 moles de MgClg foram substituídos nor 0,14 noles de NaCl.

Injectou-se em cada porco, 0,05 nl da solução do teste (quer 1 quer 2) e da solução de referência (ActranicP humana e vestígios de insulina humana).

Os valores de R encontrados fora v 3,7 (N=2) e / ι ' /...

2,9 (Ν=2) oara as soluções 1 e 2 do teste, reaoectivatwite.

Os resultados orovam o efeito de acção prolongada dos ioes magnésio, em adição ao dos ioes zinco, cara a protamina contendo soluções de monodeganidoinsulina.

Exemolo 11

Efectuou-se una investigação farmacocinética em voluntários saudáveis. Solução do teste? 0,14 moles de tflgSO^, 0,05 moles de NgCl^, 0,01 moles de acetato de magnésio, 2 g de m-cresol/1. e 100 Ul/ml de insulina humana, monocomponente, livre de zinco; valor de mH ajustado a 5,7 oom ácido clorídrico. Solução de referência (nctranid Hh): 16 g de glicerolA , 3 g de m-cresolA e 100 Ul/ml õe insulina humana, monocomoonente (3 ioes zinco/hexâmero); pH: 7,4.

125

Adicionou-se insulina humana I , em pequenas concentrações de 5 e 3 juCi/ml, à solução do teste e à solução de referência, respectivamente. Injectou-se, por via. subcutânea, 4 UI da solução do teste numa coxa e 4 UI da so| lução de referência na outra coxa de cada oessoa. A colocação das dua_s preoarações entre a coxa direita e esquerda foi feita ao acaso. Seguiu-se a absorção nor meio de controlo ex terno, contínuo, da radioactividade remanescente no local da in.iecção em cada coxa.

valor de R encontrado foi de 0,78 (N=15). Assim, ausentes as substâncias de acção retardada, também se obtém um efeito de aumento na absorção da insulina, por meio de ioes magnésio, nos seres hum'nos.

-27-/ / ί k_________

Elementos essenciais, referidos na descrição anterior e nas reivindicações seguintes, nodem constituir, separadaraente e em qualquer sua combinação, material para a realização da presente invenção, nas suas diversas formas.

Claims

Reivindicações

1. - Processo para a preparação de composições de insu lina apropriadas para administração parentêrica contendo pelo menos 20 unidades de insulina por ml, caracterizado pelo facto de se preparar uma solução com um pH compreendido entre cerca de 3 e 8,5, de preferência inferior a 8, contendo insulina ou um seu derivado iões magnésio em uma concentração compreendida entre 0,05 e 0,5M e, eventualmente, um precipitado de insulina ou de um seu derivado com acção prolongada, mediante mistura de um sal de magnésio, insulina ou.um seu derivado e água em proporções convenientes e, eventualmente., de se ajustar o valor pH.

2. - Processo.de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se ajustar o pH a um valor compreendido entre cerca de 4 e cerca de 6,2 e de se utilizar iões magnésio com vantagem em uma concentração superior a cerca de 0,05 M.

3. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar iões magnésio em uma concentração superior a cerca de 0,01 M, de preferência superior a cerca de 0,05 M e mais preferentemente compreendida entre 0,08 M e 0,3 M.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar uma solução com uma actividade inferior a cerca de 500 unidades de insulina/ml, de preferência compreendida entre cerca de 30 e 200 unidades de insulina/ml e mais preferentemente entre cerca de 40 e 100 unidades de insulina/ml .

5. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se ajustar o pH a valores compreendidos entre cerca de 5 e 6.

6. - Processo de.acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se incluir na solução zinco e/ou protamina.

7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se preparar uma so- l lução contendo menos do que cerca de um ião zinco por hexâmero de insulina ou derivado de insulina, de preferência menos do que 0,5 iões zinco por hexâmero de insulina ou derivado de insulina, mais preferentemente menos do que cerca de 0,1 iões zinco por hexâmero de insulina ou derivado de insulina.

8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se preparar uma solução contendo insulina de acção rápida.

9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se preparar uma solução contendo uma concentração superior a cerca de 5 % (p/p), de preferência superior a cerca de 10 %, de protamina, em relação ao teor de insulina ou derivado de insulina e de preferência inferior a cerca de 50% de protamina, mais preferentemente inferior a cerca de 40 % de protamina, com a condição de o pH ser inferior a 6,2.