HU201475B

HU201475B - Process for producing liquide insulin compositions

Info

Publication number: HU201475B
Application number: HU874683A
Authority: HU
Inventors: Klavs Holger Joergensen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1987-10-19
Publication date: 1990-11-28
Also published as: AU7990787A; YU191887A; CA1316819C; FI874596A0; NO170754C; GR3004912T3; IE872799L; PT85949A; NO874347L; FI86254C; NZ222214A; EP0265213A2; ES2033871T3; NO874347D0; EP0265213B1; DE3778287D1; EP0265213A3; IE60264B1; US5070186A; FI874596A

Description

A jelen találmány tárgya eljárás olyan folyékony inzulin-készítmények előállítására, amelyek magnézium-ionokat tartalmaznak. Az ilyen készítmények javított gyógyászati hatással rendelkeznek.

A cukorbetegség kezelésére használatos inzulinkészítmények lehetnek az inzulin oldatai vagy szuszpenziói. Az inzulin-szuszpenziók mind nyújtott hatásúak, ezek pH-értéke 7 körül van. Az inzulin-oldatok ρΗ-értéke vagy 3 körül van (azonnal ható, valamint nyújtott hatású oldatok), vagy pedig 7 körül (csak azonnal ható oldatok).

Az inzulin-oldatok e két pH-tartománya között azért van ilyen nagy eltérés, mert az inzulin az izoelektromos pontja (körülbel pH = 5,3) környékén vízben rosszul oldódik, mind cink-ionok távollétében (Tanford és Epstein, J. Am. Chem. Soc., 76, 2163-2169 (1954), 1. ábra), mind pedig cink-ionok jelenlétében (Fredericq és Neurath, J. Am. Chem. Soc., 72,2684-2691 (1950), 4. ábra).

A savas kémhatású inzulin-oldatokat ma már nem használják olyan széleskörűen, mint az inzulin alkalmazásának kezdetén, mituán ilyen közegben az inzulin dezamidálás útján bomlik.

A jelen találmány szerinti eljárás a következő meglepő megfigyeléseken alapszik:

q) A gyógyászati hatás kifejtéséhez szükséges koncentrációjú inzulin-oldatokat lehet előállítani körülbelül 0,05 mól/1 és 0,5 mól/1 közötti magnézium-ion koncentrációk mellett, körülbelül 4 és 6,2 közötti pH-tartományban, vagyis az inzulin izoelektromos pontja környékén.

2) A körülbelül 3 és 4 közötti pH-tartományban, amely a inzulin esetében ennek kémiai bomlékonysága miatt nem alkalmas pH-tartomány, körülbelül 0,005 mól/1 és 0,5 mól/1 magnézium-ion koncentráció jelenlétében jól használható oldatokat készíthetünk olyan inzulin-származékokból, amelyekben az inzulin A-láncának 21-es helyén szereplő aszparagin helyett egy olyan aminosav áll, amely nem tartalmaz amidcsoportot.

3) A körülbelül 6,2 és 8,5 közötti pH-tartományban is készíthetünk jól használható, adott esetben inzulint csapadék formájában is tartalmazó inzulinoldatokat, körülbelül 0,005 mól/1 és 0,5 mól/1 közötti koncentrációjú magnézium-ionok jelenlétében.

A jelen találmány szerinti készítmények tulajdonságai felülmúlják a korábban ismert, szokásos inzulin-készítmények tulajdonságait.

A fenti 1) pont tekintetében meglepő módon azt találtuk, hogy sokféle magnézium-só, például a magnézium-klorid szolubilizáló (az oldódást elősegítő) hatást fejt ki az inzulinra körülbelül 4 és 6,2 közötti pH-értékeknél, mégpedig önmagában is, és a megfelelő nátrium-, kálium- és ammónium-sókkal összehasonlítva is (lásd alább az 1. példát). A magnézium-sók különféle keverékeinek ugyanilyen hatásuk van. Ebből arra következtetünk, hogy bizonyos koncentrációk mellett a magnézium-ionok jelenléte döntő jelentőségű tényező az inzulin oldhatósága szempontjából a körülbelül 4 és 6,2 közötti pH-artományban.

A „magnézium-ionok” kifejezés a jelen leírásban szabad vagy kötött magnézium-ionokat jelent.

Továbbá, meglepő módon azt találtuk, hogy a jelen találmány szerinti, körülbelül 4 és 6,2 közötti pH-értékű inzulin-oldatok tartalmazhatnak protamint is, anélkül, hogy a protamin-inzulin komplex kiválna az oldatból. Ha az oldat pH-ját körülbelül

7-re állítjuk, akkor e komplex kicsapódik.

A kalcium-ionok ugyancsak megnövelik az inzulin oldhatóságát a körülbelül 4 és 6,2 közötti pHtartományban. Az élő szervezetben uralkodó körülményeket utánzó in vitro kísérletek eredményei azonban azt mutatják, hogy ha valamely, kalciumionokat tartalmazó oldatot egy szövetbe injektálunk, akkor kalcium-karbonát és kalcium-foszfát csapódik ki, még 0,05 mól/l-nél sokkal kisebb kalcium-koncentrációk esetében is. További kísérletek azt mutatják, hogy a jelen találmány szerinti oldatokat injektálva, a megfelelő magnézium-vegyületek nem csapódnak ki. Miután a kalcium-származékoknak a szövetekben való kicsapódása káros (a mesterséges elmeszesedés veszélye miatt), a jelen találmány szerinti inzulin-készítmények szabad kalcium-ion tartalma nem lehet lényegesen magasabb, mint a kalcium-szint az extracelluláris (sejtek közötti) folyadékban. A jelen találmány szerinti készítmények előnyösen 10 mmól/l-nél alacsonyabb, és még előnyösebben körülbelül 2 mmól/1 koncentrációban tartalmaznak kalcium-ionokat.

A feltaláló tudomása szerint a magnézium-ionokat tartalmazó inzulin-oldatokkal kapcsolatos szakirodalom nem tárgyalja a 4 és 6,2 közötti pHtartományba eső ilyen oldatokat, vagy a 0,005 mól/1 és 0,5 mól/1 közötti magnézium-ion koncentrációjú oldatokat.

A 63,000 számú dán szabadalmi leírás olyan szuszpenziós készítményeket tárgyal, amelyek az inzulinból, hatásnyújtó szerekből (vagyis protaminból) és magnézium-ionokból álló komplexek szuszpenzióit tartalmazzák, e készítmények pH-értéke 6,5 és 7 között, magnézium-koncentrációjúak pedig 0,004 mól/1 alatt van. E készítmények nyújtott hatásúak.

A 4.196.196 számú amerikai szabadalmi leírás olyan készítményt ír le, amely kóros állapotokban javítja az artériás és vénás keringést, e készítmény glükózt, inzulint és magnézium-dikálium-etiléndiamin-tetraacetátot tartalmaz. A megadott példa szerint ez az ismert készítmény ml-enként 0,02 egység inzulint tartalmaz.

A 4.472.385 számú amerikai szabadalmi leírás a cink-oldatoknak a 7 és 8 közötti pH-tartományban való stabilizálásával foglalkozik, jobb stabilitást értek el körülbelül 0,0004 mól/1 és 0,01 mól/1 közötti koncentrációjú kalcium- vagy magnézium-ionok alkalmazásával. Az ismert példákban a magnéziumkoncentráció felső határa 0,001 mól/1.

A találmány értelmében magnézium-ionokat adhatunk - a fent megadott koncentráció-tartományban - inzulin vagy egy inzulin-származék oldatához, amely oldat kívánt esetben tartalmazhat szilárd formájú inzulint vagy inzulin-származékot, amelynek nyújtott hatása van. Szubkután (bőr alá való) adagolás céljaira olyan készítményt használunk, amelyhez magnézium-ionokat adunk a hatás gyorsabb kifejlődése érdekében, illetve abban az esetben, ha az oldat protamint tartalmaz, akkor egy ilyen oldat nyújtott hatású. Ha a jelen találmány szerinti készítmény szilárd inzulint vagy inzulin-2HU 201475 Β származékot is tartalmaz, akkor kétfázisú készítményről van szó. A jelen találmány szerinti, kétfázisú készítmények vércukorszint-csökkentő hatása gyorsabban kifejlődik, mint az ismert, kétfázisú inzulin-készítményeké. A készítményben jelenlevő, szilárd inzulin lehet például kristályos cink-inzulin és protamin-cmk-inzulin.

így a jelen találmány tárgya eljárás - adott esetben szilárd formájú inzulint is tartalmazó - parenterálisan (a gyomor- és bélrendszer megkerülésével) adagolható, körülbelül 3 és 8,5 közötti pH-jú és körülbelül 0,005 mól/1 és 0,5 mól/1 közötti koncentrációban magnézium-ionokat tartalmazó inzulinoldatok előállítására.

Az oldott inzulin koncentrációja ml-enként körülbelül 20 inzulin-egység és 500 inzulin-egység között lehet.

Az inzulin-készítményekben a szokásos, önmagában ismert stabilizálószerek és konzerválószerek is lehetnek.

A készítmények tartalmazhatnak protamint is, mégpedig kívánt esetben az inzulin súlyára számítva 8 súly% és 40 súly% közötti, és előnyösen 10 súly% és 30 súly% közötti mennyiségben.

A hatásnyújtó anyagot nem tartalmazó, jelen találmány szerinti inzulin-oldatokból az inzulin meglepő módon gyorsabban szívódik fel, mint az összehasonlító inzulin-készítményből (lásd az alábbiakban a 2-9. és 11. példát). Ez a tulajdonság igen hasznos egy gyors hatású inzulin-készítmény esetében, különösen akkor, ha a kezelést rendszeresen ismételt injekciók formájában végezzük, amikor minden étkezés előtt inzulint adagolunk a betegnek. Miután a hatás gyorsabban kifejlődik, az inzulint kényelmes módon az étkezéshez közelebbi időpntban adhatjuk be, mint a korábban ismert, szokásos, gyors hatású inzulin-oldatok esetében. Ezenkívül, az inzulin gyorsabb kiürülése valószínűleg csökkenti az étkezés utáni hipoglikémia (alacsony vércukorszint) veszélyét.

A jelent találmány szerinti, 3 és 6,2 közötti pHértékű inzulin-oldatokat különösen jól alkalmazhatjuk olyan esetekben, amikor egy infúziós szivattyúval infúziót adagolunk, ugyanis ebben az esetben a szén-dioxidnak a katéterbe való bediffundálása nem okozhatja az inzulin kicsapódását. Ilyen kicsapódást figyeltek meg esetenként semleges infúziós oldatoknál, és feltételezik, hogy ez a széndioxid által lecsökkented pH-értéknek tulajdonítható.

Ha a jelen találmány szerinti, olyan inzulin-oldatokat, amelyek az inzulin súlyára számítva több mint körülbelül 5 súly%, előnyösen több mint körülbelül 8 súly%, és legelőnyösebben több mint körülbelül 10 súly% protamint tartalmaznak, szubkután injekció formájában sertéseknek beadjuk, akkor az inzulin lassabban szívódik fel, mint az összehasonlító inzulin-készítményből (lásd a 4. és 5. példát).

A készítmény protamin-tartalma előnyösen körülblül 50% alatt van, mégpedig előnyösen körülbelül 40% alatt, és még előnyösebben körülbelül 30% alatt. A jelen találmány szerinti, protamint is tartalmazó inzulin-készítményeknek a nyújtott hatású, semleges inzulin-protamin szuszpenziókkal szemben az az előnyük, hogy a jelen találmány sze4 rinti készítményekben nem ülepedik ki az oldatlan hatóanyag. Az ismert, semleges protamin-inzulin készítmények szuszpenziók, míg a jelen találmány szerinti, előnyös protamin-inzulin készítmények körülbelül 6,2-es és ez alatti pH-értékek mellett is oldatok.

A jelen találmány szerinti oldatokat feltehetőleg különösen jól lehet adagolni azokkal a töltőtoll-szerű eszközökkel, amelyekkel a rendszeresen ismételt inzulin-injekciókat adjuk be.

A jelen találmány szerinti készítmények egy természetes eredetű inzulin és/vagy ennek valamely származékát tartalmazhatják. A jelen találmány szerinti készítmények gyakorlati előállítása során előnyösen humán sertés vagy szarvasmarha inzulint, legelőnyösebben humán inzulint használunk. Ezenkívül a jelen találmány szerinti eljárás gyakorlati megvalósítása során használhatunk más, természetes eredetű inzulin-féleségeket is. Előnyösen nagytisztaságú inzulint alkalmazunk. A jelen leírásban az „inzulin” kifejezésen - amikor többes vagy általános értelemben használjuk - mind a természetes inzulin-féleségeket, mind az inzulin származékait is értjük.

Várható, hogy a természetes eredetű inzulin-féleségek és az inzulin-származékok egyes tulajdonságai eltérnek egymástól.

A jelen leírásban az „inzulin-származékok” kifejezésen olyan, a vércukorszintet csökkentő peptideket értünk, amelyek aminosav-összetétele azonos a humán inzulinéval, azzal a megkötéssel, hogy néhány aminnsav helyett a humán inzulintól eltérő aminosav szerelep, és adott esetben a B-lánc C-terminálisán szerelő karboxilcsoport védett formában van. Ilyen inzulin-származékokat ismertet többek között a 86301755 és 86306721 számú európai szabadalmi bejelentés, e bejelentésekre itt utalunk.

Abban az esetben, ha a jelen találmány szerinti oldatok készítéséhez humán, sertés vagy szarvasmarha inzulint használunk, akkor az inzulin cinktartalmának alacsonynak kell lennie, előnyösen hexamerenként legfeljebb 0,1 cink-ion lehet jelen (amely az inzulin súlyára számítva 0,02 súly% cinktartalomnak fele meg), hogy így elkerüljük az inzulinnak a körülbelül 4 feletti pH-értékeknél bekövetkező kicsapódását, ugyanez érvényes a protamint tartalmazó oldatokra is. A kristályos cink-inzulint cinkmentesíthetjük, például egy kisózási eljárással, majd ezt követően pH = 5-nél végzett kicsapással (Schlichtkrull, Acta Chem. Scan., 10., 1455-1458 /1956/). Ha azonban a készítmény a cinkkel komplexet képző anyagot, például citrátot is tartalmaz, akkor a cink-tartalom a fent megadottnál magasabb is lehet.

Ha a készítményekben inzulin-származékokat használunk, akkor a készítmény cink-tartalma nem ennyire kritikus. Bizonyos inzulin-származékok esetében az inzulin a jelen találmány szerinti oldatokban oldott állapotban marad nagyobb cink-ion koncentrációk (például hexamerenként legfeljebb 10 cink-ion) mellett is; sőt, e nagyobb cink-koncentráció kívántos is lehet (vés össze a 86301755 számú európai szabadalmi bejelentéssel).

Ismeretes, hogy a protamin heterogén (több összetevőből álló) keverék. A protamint bizonyos

-3HU 201475 Β halfajtákból nyerhetjük, például az Oncorhynchus keta-ból. Használhatunk azonban más halfajtábkól származó protamint is. A protamin általában protamin-szulfát formájában kerül forgalomba. Használhatunk azonban más sókat is. Előnyösen nagy tisztaságú protamint alkalmazunk.

A jelen találmány szerinti, további előnyös készítmények például a mind cinket, mind protamint tartalmazó készítmények. Az ilyen készítmények lehetnek valamely inzulin-származék oldatai (pH = 3-4), va® valamely emlős eredetű inzulin semleges szuszpenziói, ezekben a cink-tartalom az inzulinra va® inzulin-származékra számítva, hexamerenként legfeljebb körülbelül 25 cink-ion lehet.

A jelen találmány szerinti oldatokban az inzulin mennyisége ml-enként 20 nemzetközi e®ség és 500 nemzetközi e®ség között, előnyösen ml-enként 40 nemzetközi e®ség és 100 nemzetközi e®ség között lehet, A fenti adatok az injekciós készítményekre vonatkoznak. Ha azonban más, parenterális úton kívánjuk e készítményeket adagolni, akkor tartalmazhatnak a fentinél több inzulint is. Az inzulin-oldatot összekeverhetjük valamely szilárd halmazállapotú, inzulint tartalmazó anyaggal, például krisátlyos cink-inzulinnal, va® cink-protamin-inzulinnal.

A jelen találmány szerint használhatunk többféle oldható magnézium-sót, külön-külön vagy együtt. Alkalmas ilyen sókban szereplő anionok a klorid, szulfát, a monokarboxilátok, példuál az acetát, propionát és butirát, továbbá a dikarboxilátok, például a szukcinát, aszpartát és a glutamát. A magnézium-ionok legelőnyösebb koncentrációja az alkalmazott sótól (sóktól) függ, és e koncentrációt olyan tényezőktől függően kell me®álasztanunk, mint amilyenek a készítmény hatásának kívánt időzítése, az inzulin oldhatósága, valamint az, ho® mennyire közel áll a készítmény ozmózisnyomása az izotóniás nyomáshoz. A magnézium-sók izotóniás koncentrációi erősen eltérnek egymástól, í® például a magnézium-klorid izotóniás koncentrációja 0,1 mól/1, míg a magnézium-szulfát izotóniás koncentrációja 0,26 mól/1. A készítményekben jelen lehetnek továbbá más sók, aminosavak és nem-ionos szerek is (a konzerválószereken kívül), amennyiben ezek nem-toxikusak, és összeférhetek az inzulin-készítmény egészével.

A jelen találmány értelmében az alkalmazható magnézium-ion koncentrációk tartománya körülbelül 0,005 mól/1 és 0,5 mól/1 között, és előnyösen 0,05 mól/1 felett van. A felső határt bizonyos mértékig önkényesen választjuk meg, mégpedig abból a feltételezésből kiindulva, ho® bizonyos esetekben (például intraperitoneális infúziók esetében) elfogadható, ha az izotóniás ozmózisnyomást kismértékben túllépjük. A jelen találmány szerinti előnyös készítmények körülbelül 0,08 mól/1 és 0,3 mól/1 közötti koncentrációban tartalmaznak magnézium6 ionokat.

A jelen találmány szerinti inzulin-készítményekben konzerválószerként a korábbi, szokásos inzulin-készítményekben is alkalmazott konzerválószereket használhatjuk, például fenolt, m-krezolt és metil-parabent (p-hidroxi-benzoesav-metilésztert).

A jelen találálmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint a jelen találmány szerinti vizes inzulin-oldatokat ú® állíthatjuk elő, ho® az inzulinnak enyhén savas kémhatású oldatát összekeverjük e® olyan oldattal, amely tartalmazza a végső készítményben jelenlevő összes többi összetevőit. Ezután szükség esetén az ele® pH-ját beállítjuk, majd az ele®et mindaddig keverjük, míg tiszta oldatot nem kapunk, és végül sterilre szűrjük. Kívánt esetben az í® kapott, steril inzulin-oldathoz hozzáadhatjuk e® nyújtott hatású inzulin steril szuszpenzióját, és í® kétfázisú (azonnali és nyújtott hatású) készítményt kapunk. E készítmények melegítés és rázkódás hatására adott esetben denaturálódhatnak (bomolhatnak), ennek elkerülése céljából a készítményekhez hozzáadhatunk ismert stabilizálószereket, például foszfolipideket.

Hasonló módon állíthatjuk elő az inzulin-származékokat tartalmazó készítményeket is.

A jelen találmány szerinti inzulin-készítményeket cukorbetegek kezelésére használhatjuk. Ajánlatos, ho® a jelen találmány szerinti inzulin-készítmények dózisát a kezelőorvos u®anolyan módon válassza meg, mint a korábban ismert injekciós inzulin-készítmények esetében.

A találmány szeirnti eljárást a továbbiakban - a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül - példákkal szemléltetjük.

E példák bemutatják, ho®an növelik meg a magnézium-ionok az inzulin oldhatóságát, ho® állíthatjuk elő a jelen találmány szerinti előnyös inzulin-készítményeket, és ho®an fejtik ki e készítmények hatásukat, ha injekció formájában sertéseknek adjuk őket.

1. példa

Ml-enként 200 nemzetközi e®ség cinkmentes, humán, e®komponensű inzulin, nyomnyi mennyiségű humán mono¹²⁵I-(A19)-inzuÍint, 2 mg fenolt és az alábbi I. táblázatban megadott sót körülbelül izotóniás koncentrációban tartalmazó savas oldatok pH-ját az I. táblázatban megadott értékre állítjuk be. Az inzulin oldhatóságát ú® határozzuk meg, ho® a felülúszó folyadékban megmérjük a radioaktív anyag koncentrációját, és az eredményeket nemzetközi e®ség/ml e®ségre számítjuk át (1 nemzetközi e®ség megfelel 38 pg inzulinnak). A sóknak az inzulin nemzetközi e®ség/ml-ben kifejezett oldhatóságára szobahőmérsékleten kifejtett hatását az I. táblázat adatai szemléltetik.

-4HU 201475 Β

I. táblázat

PH	0,1 mól/1 MgCb	0,15 mól/1 NaCl	0,15 mól/1 KC1	0,15 mól/1 NH4CI
3,5	200	200	200	200
	felett	felett	felett	felett
4,0	135	79	98	109
4,5	85	20	26	29
5,0	104	16	17	22
5,5	124	18	21	25
6,0	70	25	32	29
6,5	21	41	56	27

Az I. táblázat azt mutatja, hogy az inzulin oldhatósága a magnézium-klorid körülbelül izotóniás oldatában meglepő módon sokkal nagyobb, mint a nátrium-klorid, kálium-klorid és az ammóniumklorid megfelelő oldataiban, valamennyi oldat pHja 4-6, és a magnézium-klorid oldatban az inzulin oldhatósága megközelíti a 100 nemzetközi egység/ml értéket, vagyis az injekciós inzulin-készítményekben szokásos koncentrációt.

Az inzulin nemzetközi egyésg/ml-ben kifejett, szobahőmérsékleten, pH = 5,5-nél, és a sók különböző koncentrációi mellett mért oldhatóságát az alábbi II. táblázatban adjuk meg.

II. táblázat

Só koncentrációja mól/1	MgCh	NaCl	KC1	NH4CI
0,025	12	4	4	5
0,050	33	5	6	5
0,075	72	7	9	8
0,10	101	11	12	11
0,15	200 felett	21	21	25
0,20	200 felett	37	34	39
0,25	200 felett	41	54	66
0,30	200 felett	76	74	108
0,35	200 felett	69	84	123
0,40	200 felett	100	119	146

AII. táblázat azt bizonyítja, hogy az inzulin oldhatósága a magnézium-klorid-oldatokban sokkal nagyobb a nátrium-klorid, kálium-klorid és az ammónium-klorid oldataiban mérhető oldhatósághoz 45 képest, mégpedig e sók koncentrációjának széles tartományán belül.

2. példa

Elkészítünk egy 1 jelzésű, alábbi összetételű ol- 50 datot: 0,15 mól/1 magnézium-butirát, 0,006 mól/1 citromsav, 2 g/1 fenol és 100 nemzetközi egység/ml cinkmentes, humán, egykomponensű inzulin; az oldat pH-ja: 5,8.

Összehasonlító oldatként egy másik, Oielzésű 55 oldatot használunk, amelyet az Actrapid™ HM jelzésű, szokásos, azonnal ható inzulin-készítményhez hasonlóan készítünk εζ és amely oldat összetétele az alábbi: 16 g glicerin/1, 2 g fenol/1 és 100 nemzetközi egység/ml humán, egykomponensű in- 60 zulin (hexamerenként két cink-iont tartalmaz); az oldat pH-ja: 7,4. A közeg összetétele megfelel az Egyesült Államok XIX. Gyógyszerkönyvében a semleges inzulin-injekcióra megadott összetételnek. 65

Mindkét oldathoz hozzáadunk nyomnyi menynyiségű 1,1-3,7.10^{2 * 4} Bq/ml) humán mono¹²⁵I(A19)-inzulint. Ezután mindkét oldatból 0,1 ml térfogatú részletet külön-külön, szubkután injekció formájában beadunk két sertésnek. A felszívódást úgy követjük, hogy egy spektrométerrel összekapcsolt szcintillációs kristály-detektorral kívülről mérjük az injekció helyén maradó radioaktivás időbeli változását, az embereken végzett felszívódási vizsgálatok céljára kidolgozott módszer analógiájára (Binder (1969): „Absorption of injected insulin” (Az injekciós úton beadott inzulin feszívódása), doktori értekezés). Vérmintákat veszünk, és meghatározzuk a glükóz és az inzulin szintjét a plazmában. Az eredményeket a III. táblázat tartalmazza.

AIII. táblázat bemutatja a maradék radioaktivitás, a plazma glükózszintje és a plazma radioimmun-assay módszerrel meghatározott immunreaktív inzulin szintjének időbeli lefutását. Az injekció helyén mért radioaktivitást az injekció után közvetlenül (a 0 időpontban) mért érték %-ában adjuk meg. Á plazma glükóz-koncentrációját a közvetlenül az injekció előtt (a 0 időpontban) vett vérmintában meghatározott érték %-ában adjuk meg.

-5HU 201475 Β

Az 1 jelzésű oldat: vizsgálati oldat, amelyet egy másik sertésnek (testsúlya 79 kg) adunk be.

A 0 jelzésű oldat: összehasonlító oldat, amelyet az egyik sertésnek (testsúlya: 77 kg) adunk be.

III. táblázat

Az injekció után eltelt idő, perc	Radioaktivitás, %	Plazma glükóz, %	Plazma immunreaktív inzulin, mikroegység/ml
0	1	0	1	0	1
-15	—		98	98	5 alatt	5 alatt
0	100	100	100	100	5 alatt	5 alatt
30	91	67	95	41	16	25
60	76	54	67	49	18	23
90	69	40	56	43	19	18
120	56	27	51	41	13	14
180	38	11	47	45	10	5
240	23	5	58	78	9	5 alatt
300	14	3	65	108	7	5 alatt

Amint a III. táblázatból látható, a vizsgálati oldatból az inzulin gyorsabban felszívódik, mint az összehasonlító inzulin-oldatból. Ez a megfigyelés teljesen összhangban van a 0 és 1 jelzésű oldatok 25 esetében a plazma glükózszintje, valamint a plazma immunreaktív inzulin-szinje időbeli lefutására megfigyelt adatokkal.

3. példa 30

Elkészítünk egy 2 jelzésű, alábbi összetételű oldatot: 0,175 mól/1 magnézium-acetát, 0,0375 mól/1 ecetsav, 2 g/l fenol és 100 nemzetközi egység/ml cinkmentes, humán, egykomponensú inzulin; pH = 5,5. 35

Az oldathoz a 2. példában leírthoz hasonló módon nyomjelzű inzulint adunk, majd 2 jelzésű oldat 0,1 ml térfogatú részletét szubkután injekció formájában beadjuk egy sertésnek, mégpedig az állat nyakának egyik oldalára, míg ugyanennek az állat- 40 nak, a nyaka másik oldalára szubkután injekció formájában beadunk 0,1 ml 0 jelzésű, a 2. példában leírt módon előállított, összehasonlító inzulin-oldatot.

A felszívódást a 2. példában leírt módon követ- 45 jük. Egy hét múlva a kísérletet oly módon ismételjük meg, hogy az egyes oldatok injekciós helyét felcseréljük. Az eredményeket a IV. táblázatban mutatjuk be.

IV. táblázat

A %-os maradék radioaktivtás időbeli lefutása, két ugyanazon a sertésen elvégzett kísérlet átlag értékei

Az injekció után eltelt idő, perc	Radioaktivitás, %	55
0	2
0	100	100
30	92	79	60
60	86	63
90	73	53

IV. táblázat folytatása A %-os maradék radioaktivtás időbeli lefutása, két ugyanazon a sertésen elvégzett kísérlet átlag értékei

Az injekció után eltelt idő, perc	Radioaktivitás, %
0	2
120	63	44
180	42	26
240	25	12
300	15	5

A táblázatból látható, hogy a vizsgálati oldatból az inzulin gyorsabban felszívódik mint az összehasonlító inzulin-oldatból,

4. példa

Elkészítjük a 3A és 3B jelzésű, alábbi összetételű oldatokat:

3A: 0,14 mól/1 magnézium-szulfát, 0,05 mól/1 magnézium-klorid, 2 g/l fenol és 100 nemzetközi egység/ml cinkmentes, humán, egykomponensú inzulin; az oldat pH-ját sósavval 5,5-re állítjuk be.

3B: Az oldat összetétele azonos a 3A jelzésű oldat összetételével, de a fentieken kívül ml-enként 1 mg protamin-szulfátot is tartalmaz.

Az oldatokhoz a 2. példában leírt módon nyomjelző inzulint adunk. A 3A jelzésű oldat 0,1 ml térfogatú részletét szubkután injekció formájában beadjuk az 1. számú és a 2. számú sertésnek, az állatok nyakának egyik oldalára. A 3B jelzésű oldat 0,1 ml térfogatú részletét hasonló módon beadjuk a 3. számú és 4. számú sertésnek. Ezután a 0 j elzésű, a 2. példában leírt módon előállított összehasonlító inzulin-oldat 0,1 ml térfogatú részletét szubkután injekció formájában beadjuk mind a négy fenti állatnak, a nyakuk másik oldalára. Az inzulin felszívódását a 2. példában leírt módon követjük. Az eredményeket az V. táblázatban mutatjuk be.

-6HU 201475 Β

V. táblázat

A maradék radioaktivitás időbeli lefutása (3A:protamin nélkül; 3B: protaminnal)

Az injekció után eltelt idő, perc	1. számú sertés	Radioaktivitás, %	4. számmú sertés
2. szám sertés	3. számú sertés
0	3A	0	3A	0	3B	0	3B
0	100	100	100	100	100	100	100	100
30	97	89	85	79	92	103	94	95
60	89	69	75	54	77	93	78	93
90	71	63	62	43	60	95	65	88
120	66	45	54	29	50	86	53	82
180	45	25	38	13	30	82	34	73
240	26	12	24	6	15	83	18	71
300	16	6	17	3	9	63	11	66

A táblázatból látható, hogy protamin nélkül a 20 vizsgálati oldatból az inzulin gyorsabban felszívódik, mint az összehasonlító inzulin-oldatból, de protamin jelenlétében a vizsgálati oldatból a felszívódás lasabb, mint az összehasonlító oldatból.

5. példa

Elkészítjük a 4A, 4B, 4C jelzésű, alábbi összetételű oldatokat:

4A: 0,18 mól/1 magnézium-szukcinát, 0,01 mól/1 magnézium-klorid, 0,002 mól/1 mangán-szulfát, 30 0,02 mól/1 borostyánkősav, 2 g/l fenol és 100 nemzetközi egység/ml cinkmentes, humán, egykomponensű inzulin, pH = 5,6;

4B: az oldat összetétele azonos a fenti 4A jelzésű oldatéval, és a fentieken kívül 0,55 mg/ml portamin- 35 szulfátot is tartalmaz;

4C: az oldat összetétele azonos a 4A jelzésű oldatéval, de a fentieken kívül 0,73 mg/ml protamin-szulfátot is tartalmaz.

Az oldatokhoz a 2. példában leírt módon nyom- 40 jelző inzulint adunk. A 4A, 4B és 4C jelzésű oldatok 0,1 ml térfogatú részleteit szubkután injekció formájában beadjuk az A, B és C jelzésű sertéseknek, az állatok nyakának egyik oldalán. A 0 jelzésű, a 2. példában leírt módon előállított összehasonlító inzulin-oldat 0,1 ml térfogatú részleteit szubkután injekció formájában beadjuk mindhárom fenti sertésnek, az állatok nyakának másik oldalán. A felszívódást a 2. példában leírt módon követjük. Egy héttel később a kísérletet megismételjük oly módon, hogy az oldatok beadásának helyét felcseréljük. Az eredményeket a VI. táblázatban mutatjuk be.

VI táblázat

A maradék radioaktivitás időbeli lefutása, két kísérlet átlag értékei (4A: protamin nélkül; 4B: kevés protaminnal; és 4C: nagyprotamin-tartalommal).

VI táblázat (folytatás)

Az injekció után Radioaktivitás, % eltelt idő, perc A-jelű B-jelű C-jelű sertés sertés sertés

	0	4A	0	4B	0	4C
0	100	100	100	100	100	100
30	91	82	92	87	92	89
60	78	71	87	86	84	87
90	66	57	74	80	71	85
120	51	45	63	73	59	81
180	33	23	47	62	40	70
240	21	15	35	54	25	66
300	15	9	25	46	17	56
480	10	6	16	35	9	45
600	8	4	8	27	5	31
720	6	4	5	17	4	19

A táblázatból kitűnik, hogy az összehasonlító inzulin-oldathoz képest az inzulin a vizsgálati oldatból protamin nélkül gyorsabban szívódik fel, kevés protamin jelenlétében viszont lassabban, és nagy protamin-koncentráció mellett még lassabban.

A 6., 7., 8., 10. és 11. példában a vizsgálati készít7

-7HU 201475 Β mények felszívódási tulajdonságait vizsgáljuk a humán Actrapid összehasonlító oldathoz viszonyítva, a 2-5. példában leírt módon. A 9. példában egy másik összehasonlító oldatot használunk, lásd alább. Egyszerűség kedvéért azonban az összehasonlítás eredményeit az R átlagérték formájában adjuk meg, amelynek jelentése:

R = T50% (vizsgált)/T5o% (összehasonlító), ahol

T5o% (vizsgált) és T50% (összehasonlító) azon, az injekció után eltelt időtartamokat jelentik, amely alatt a vizsgált készítmény és az összehasonlító készítmény esetében az injekció helyén mérhető radioaktivitás a kezdeti értékek felére csökken.

6. példa

A vizsgált oldat: 0,14 mól/1 magnézium-szulfát, 0,05 mól/1 magnézium-klorid, 0,01 mól/1 magnézium-acetát, 0,002 mól/1 kalcium-klorid, 2 g/1 m-krezol, 100 nemzetközi egység/ml cinkmentes, humán, egykomponensű inzulin, plusz humán nyomjelző inzulin, az oldat pH-ját sósavval 5,7-re állítjuk be.

A sertéseknek a vizsgált oldat és az összehasonlító oldat 0,04 ml térfogatú részleteit adjuk be injekció formájában.

At R-érték: 0,73 (a vizsgált állatok száma: 6).

7. példa

A vizsgált oldat: 0,02 mól/1 magnézium-klorid, 0,11 mól/1 arginm-monohidroklorid, 2 g/1 fenol, 100 nemzetközi egység/ml cinkmentes, humán, egykomponensű inzulin plusz nyomjelző inzulin; az oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,7-re állítjuk be.

Minden egyes sertésnek a vizsgált oldat és az összehasonlító oldat 0,08 ml térfogatú részleteit adjuk be injekció formájában.

Az R-érték: 0,74 (a vizsgált állatok száma: 2).

8. példa

A vizsgált oldat: 0,095 mól/1 magnézium-klorid, 2 g/1 fenol, ml-enként 100 nemzetközi egységgel egyenértékű cinkmentes sertés monodezamido-inzulin plusz nyomjelző származék; az oldat pH-ját sósavval 3,2-re állítjuk be.

Az R-érték: 0,71 (a vizsgált állatok száma: 2).

9. példa

A vizsgált oldat: 0,095 mól/1 magnézium-klorid, 2 g/1 fenol, ml-enként 100 nemzetközi egységgel egyenértékű cinkmentes, humán inzulin-származék, ahol a B-lánc 9-es helyzetében levő szerint helyett aszparaginsav szerepel, továbbá a B-lánc 27-es helyzetében levő treonin helyett glutaminsav áll, plusz nyomjelző származék; az oldat pH-ját 7,4-re állítjuk be.

Miután már korábban ismeretes volt (vesd össze a 83306721 számú európai szabadalmi bejelentéssel), hogy e származék - az Actrapidhoz hasonló készítménybe foglalva - gyorsabban felszívódik, mint a humán Actrapid, ezért a jelen példában leírt kísérletben az összehasonlító oldat e származéknak az Actrapidhoz hasonló módon elkészített oldata, amely ml-enként 100 nemzetközi egységgel egyenértékű ilyen származékot tartalmaz.

Az R-érték: 0,85 (a vizsgált állatok száma: 5). így ennek a gyorsabban felszívódó inzulin-származéknak az esetében is a magnézium-ionok felgyorsítják a felszívódást.

10. példa

Elkészítjük az 1 jelzésű, alábbi összetételű oldatot: 0,095 mól/1 magnézium-klorid, 0,002 mól/1 cinkacetát, 1 mg/ml protamin-szulfát, 3 g/ml m-krezol, ml-enként 100 nemzetközi egységgel egyenértékű, cinkmentes sertés monodezamido-inzulin, plusz nyomjelző származék; az oldat pH-ját sósavval 3,2re állítjuk.

Elkészítjük a 2 jelzésű, a fenti 1 jelzésű oldattal azonos összetételű oldatot, azzal az eltéréssel, hogy a 0,095 mól/1 magnézium-klorid helyett 0,14 mól/1 nátrium-kloridot használunk.

Az 1 vagy 2 jelzésű vizsgálati oldatok és az összehasonlító oldat (humán Actrapid, plusz humán nyomjelző inzulin) 0,05 ml térfogatú részleteit beadjuk sertéseknek,

A talált R-értékek:

az 1 jelzésű oldatra: 3,7 (a vizsgált állatok száma: 2), és a 2 jelzésű oldatra: 2,9 (a vizsgált állatok száma:

2).

Az eredmények azt mutatják, hogy a protamint tartalmazó monodezamido-inzulin-oldatok hatását a magnézium-ionok a cink-ionok hasonló hatásán túlmenően, megnyújtják.

11. példa

Egészséges önkénteseken farmakokinetikai vizsgálatot végzünk. A vizsgálati oldat: 0,14 mól/1 magnézium-szulfát, 0,05 mól/1 magnézium-klorid, 0,01 mól/1 magnézium-acetát, 2 g/1 m-krezol és 100 nemzetközi egység/ml cinkmentes, humán, egykomponensű inzulin; az oldat pH-ját sósavval 5,7re állítjuk. Összehasonlító oldat (Actrapid^1MHM): 16 g/1 glicerin, 3 g/1 m-krezol, 100 nemzetközi egység/ml humán egykomponensű inzulin (hexamerénként 3 cink-iont tartalmaz); pH 7,4.

A vizsgálati oldathoz és az összehasonlító oldathoz nyomnyi mennyiségben (1.85.10⁵ Bq/ml, illetve 1,01 . 10⁵ Bq/ml) humán ^I-inzulint adunk. A vizsgált! oldat 4 nemzetközi egységnek megfelelő részletét szubkután injekció formájában beadjuk az egyik kísérleti személy egyik combjába, míg a másik combjába az összehasonlító oldat 4 nemzetközi egységnek megfelelő részletét adjuk be. A két készítmény beadásához véletlenszerűen választjuk ki a jobb vagy bal combot. A felszívódást úgy követjük, hogy külsőleg folyamatosan mérjük mindkét combon az injekció helyén maradó radioaktivitást.

A talált R-érték: 0,78 (a vizsgált személyek száma: 15). így, hatásnyújtó szerek nélkül a magnézium-ionok embereken is felgyorsítják az inzulin felszívódását.

-8HU 201475 Β

A jelen találmány szerinti eljárásnak a fenti leírásban és az alábbiakban következő igénypontokban ismertetett jellemző vonásai, külön-külön és együttesen is alapul szolgálnak a jelen találmány szerinti eljárás különböző változatainak kivitelezésére.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás parenteráüsan adagolható, legalább 20 inzuhn-egység/ml koncentrációjú folyékony inzulin készítmények előállítására, amely készítmények inzulinnak vagy valamely inzulin-származéknak az oldatát, magnézium-ionokat, valamint adott esetben csapadék formájú inzulin és/vagy hatásnyújtó anyagot tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy 0,005 mól/1 és 0,5 mól/1 közötti magnézium-koncentráicót biztosító vízoldható magnézium-sót; inzulint vagy inzulin-származékot; vizet és adott esetben hatásnyújtó anyagot összekeverünk, és szükséges esetben az elegy pH-ját 3 és 8,5 közé, előnyösen 8 alá állítjuk. (Elsőbbsége: 1987.07.10.).
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítmény pH-értékét 4 és 6,2 közé, magnézium-koncentrációját 0,05 mól/l-nél nagyobb értékre állítjuk be. (Elsőbbsége: 1986.10.20.)
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítmény magnézium-koncentrációját 0,01 mól/1, előnyösen 0,05 mól/1 feletti értékre, legelőnyösebben 0,08 mól/1 és 0,3 mól/1 közötti értékre állítjuk. (Elsőbbsége: 1987.07.10.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan készítmények előállítására, amelyekben az inzulin-aktivitás 500 inzulin-egység/ml alatt van, előnyösen 30 inzulin-egység/ml és 200 inzuhn-egység/ml közötti, legelőnyösebben 40 inzuhn-egység/ml és 100 inzulin-egység =ml közötti, azzal jellemezve, hogy megfelelő mennyiségű inzulint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.10.20.)
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítmény pH-értékét 5 és 6 közé állítjuk. (Elsőbbsége: 1986.10.20.)
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatásnyújtó anyagként cinket és/vagy protamint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.10.20.)
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás oldat formájú készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatásnyújtó anyagként az inzulin vagy inzulin-származék tömegére számítva 5 tömeg%-nál több, előnyösen 10 tömeg%-nál több, és 50 tömeg%-nál kevesebb, előnyösen 40 tömeg%nál kevesebb, protamint alkalmazunk, és a készítmény pH-ját 6,2 alá állítjuk.