JP2019023223A - インスリンおよびインスリン類似体の薬物動態及び薬力学、ならびに注射部位の疼痛を調節するためのマグネシウム組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】速効型注射用インスリン製剤と関連した注射部位の疼痛を調節する組成物及び方法の提供。【解決手段】注射用インスリン製剤であって、有効量の溶解／安定化剤、及び有効量のキレート剤、及び前記インスリン内の亜鉛をキレート化するための１つ又は複数のマグネシウム化合物を含み、注射部位の不快感が、ＥＤＴＡナトリウムを有し、かつ前記１つ又は複数のマグネシウム化合物が存在しない製剤よりも少ない、注射用インスリン製剤。【選択図】図９

Description

関連出願への相互参照
本願は、２０１２年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／７０４，０６６号、および２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第１３／８３６，８０６号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願のすべては、その全体が本明細書中に参考として援用される。

発明の分野
本発明は、注射用速効型薬物送達インスリン製剤とその使用方法、及び注射時の疼痛低減に関する一般的分野に含まれる。

発明の背景
糖尿病の概要
グルコースは、エネルギーを生み出し、生命を維持するために身体のすべての細胞により使用されている単糖である。ヒトは、生き続けるために常時それらの血液中の最小限のレベルのグルコースを必要とする。身体が血糖を産生する主な方法は、食物の消化による。人がこのグルコースを食物の消化により得ていない場合、グルコースは、組織中の貯蔵物から産生され、肝臓により放出される。身体のグルコースレベルは、インスリンにより調節されている。インスリンは、膵臓により自然に分泌されるペプチドホルモンである。インスリンは、グルコースが生命維持に必要なエネルギー源を供給するために体細胞に入ることを助ける。

健常者が食事を始めるとき、膵臓が第１相インスリン分泌と呼ばれるインスリンの自然スパイク（ｎａｔｕｒａｌ ｓｐｉｋｅ）を分泌する。第１相インスリン分泌は、食物の消化により血液中に入ってくるグルコースを処理するのに十分なインスリンを供給することに加えて、食物の消化が起こっている間にグルコースを産生することを停止させるための肝臓へのシグナルとして作用する。肝臓がグルコースを産生しておらず、消化によるグルコースを処理するのに十分なさらなるインスリンが存在するため、健常者の血糖値は比較的に一定のままであり、それらの血糖値は高くなりすぎることはない。

糖尿病は、異常に高いレベルの血糖及び不十分なレベルのインスリンによって特徴づけられる。２つの主要なタイプの糖尿病、すなわち１型と２型が存在する。１型糖尿病において、身体はインスリンを産生しない。２型糖尿病の初期段階において、膵臓はインスリンを産生するが、身体は適切な時点にインスリンを産生しないか、又は体細胞はインスリンを無視する（インスリン抵抗性として公知の状態）。

任意の他の症状が存在する前でさえ、２型糖尿病の最初の影響の１つは、食事誘発性の第１相インスリン分泌の喪失である。第１相インスリン分泌が存在しない場合、肝臓は、グルコースを産生することを停止させるそのシグナルを受けない。結果として、肝臓は、身体が食物の消化により新たなグルコースを産生し始めるときにグルコースを産生し続ける。結果として、糖尿病患者の血糖値は、高血糖として公知の状態である、食後に高すぎる状態になる。高血糖は、グルコースを血液中の特定のタンパク質に異常に結合させ、小血管の完全性を維持するという正常な機能を果たすタンパク質の能力を妨害する。毎回の食事の後に起こる高血糖により、毛細血管（ｔｉｎｙ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ）は、最終的に崩壊し、漏れる。高血糖の長期有害作用は、失明、腎臓機能の喪失、神経損傷及び感覚の喪失並びに四肢の切断を必要とする可能性がある末梢における不十分な循環を含む。

食後２時間から３時間の間に、未処置糖尿病患者の血糖は非常に高くなるため、膵臓は異常に大量のインスリンを分泌するシグナルを受ける。初期２型糖尿病を有する患者において、膵臓は、まだ反応し、この大量のインスリンを分泌することができる。しかし、これは、消化がほぼ終了し、血糖値が低下し始めるときに起こる。この異常に大量のインスリンは、２つの好ましくない作用を有する。第１に、それは、既に障害が起きた膵臓に対して過度の極端な要求を課し、これが、その急速な悪化につながり、最終的に膵臓がインスリンを産生することをできなくする可能性がある。第２に、消化後のあまりにも多くのインスリンは、体重増加をもたらし、これが、疾患状態をさらに悪化させる可能性がある。

糖尿病の現在の処置法及びそれらの限界
１型糖尿病患者はインスリンを産生しないので、１型糖尿病の主要な治療法は、日常の集中的なインスリン療法である。２型糖尿病の治療法は、一般的に食事及び運動の管理から開始する。短期間では有益であるが、食事及び運動のみによる処置は、２型糖尿病を有する大多数の患者に対する有効な長期の解決策ではない。食事及び運動がもはや十分でない場合、処置は、種々の非インスリン経口薬から始める。これらの経口薬は、膵臓により産生されるインスリンの量を増加させることにより、インスリン感受性細胞の感受性を増加させることにより、肝臓のグルコース産出量を減少させることにより、又はこれらのメカニズムのある組合せにより、作用する。これらの処置は、疾患を効果的に管理するそれらの能力が限られており、一般的に、体重増加及び高血圧などの重大な副作用を有する。非インスリン療法に限界があるため、２型糖尿病を有する多くの患者は、時間の経過とともに悪化し、それらの代謝を維持するためのインスリン療法を最終的に必要とする。患者のインスリン抵抗性が進行するに従い、グルコースレベルを下げるのに必要なインスリン投与量は徐々に高まる。最高Ｕ−５００（１ｍｌ当たり５００ユニット）の濃縮型インスリンが、そのような患者のために市販されているが、低速吸収プロファイルのため、基礎的利用に限定される。

インスリン療法は、糖尿病を処置するために８０年間以上にわたり使用されている。この療法は、毎日インスリンの数回の注射を適用することを通常必要とする。これらの注射は、１日１回又は２回の長時間作用性基礎注射及び食事時の速効性インスリンの注射を適用することからなる。この処置レジメンは、有効と認められているが、限界を有する。第１に、不便さと針の痛みのため、患者は一般的に自分でインスリンを注射することを好まない。結果として、患者は、処方された処置レジメンを十分に遵守しない傾向があり、しばしば薬物治療を不適切に受けることとなる。

より重要なことに、適切に投与されている場合でさえ、インスリン注射は、インスリンの自然の時間−作用プロファイルを再現しない。特に、糖尿病を有さない人における第１相インスリン分泌の自然スパイクは、食物からのグルコースが血液中に入ってから数分以内の血中インスリンレベルの上昇をもたらす。これに反して、注射されたインスリンは、血液に徐々に入り、ピークのインスリンレベルは、レギュラーヒトインスリンの注射後８０〜１００分以内に生じる。

可能な解決策は、食物を食べる直前に糖尿病患者の静脈内にインスリンを直接注射することである。インスリンの静脈内注射の試験において、患者は、食事後３〜６時間にわたる血糖のより良好なコントロールを示した。しかし、様々な医学的理由のため、毎回の食事の前のインスリンの静脈内注射は、実際的な療法ではない。

インスリン処置の重要な改善の１つは、１９９０年代におけるＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）（インスリンリスプロ）、ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標）（インスリンアスパルト）及びＡＰＩＤＲＡ（登録商標）（インスリングルリシン）などの速効型インスリン類似体の導入であった。しかし、速効型インスリン類似体を用いた場合でさえ、最高インスリンレベルは、一般的に注射後５０〜７０分以内に生じる。速効型インスリン類似体は第１相インスリン分泌を十分に模倣するものではないため、インスリン療法を用いる糖尿病患者は、食事の開始時に存在する不十分なレベルのインスリン及び食間に存在する過剰なインスリンを有し続ける。このインスリンの送達の遅延は、食事の開始後の初期の高血糖をもたらし得る。さらに、食間の過剰なインスリンは、低血糖として公知の異常に低いレベルの血糖をもたらし得る。低血糖は、知力の喪失、精神錯乱、心拍数の増加、空腹感、発汗及び脱力をもたらし得る。非常に低い血糖値では、低血糖は、意識喪失、昏睡及び死亡さえをももたらし得る。米国糖尿病協会、すなわちＡＤＡによれば、インスリン使用糖尿病患者は、年間平均１．２件の重篤な低血糖事象を経験し、それらの事象の多くが患者による病院救急処置室への来訪を必要とする。

インスリン作用の速効性は、インスリンがどの程度速く吸収されるかに依存する。レギュラーヒトインスリンを１００ＩＵ／ｍｌで皮下注射した場合、製剤は六量体（およそ３６ｋＤａ）から主に構成されるが、サイズ及び電荷に起因して容易に吸収されない。六量体中には、分子を安定化する２個の亜鉛原子が位置する。注後射、皮下組織内で濃度依存性の動的平衡が生じ、六量体から二量体（約１２ｋＤａ）、次に単量体（約６ｋＤａ）への解離を引き起こす。従来、このようなレギュラーヒトインスリン製剤は、最高血漿濃度レベルに到達するのにおよそ１２０分を要する。

作用が急速発現するインスリン製剤、例えばＶＩＡｊｅｃｔ（登録商標）は、米国特許第７，２７９，４５７号、並びに米国特許出願公開第２００７／０２３５３６５号、同第２００８／００８５２９８号、同第２００８／９０７５３号、及び同第２００８／００９６８００号、並びにＳｔｅｉｎｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第５１巻：１６０２〜１６０６頁（２００８年）に記載されている。速効型インスリン製剤は、インスリン類似体よりもなお急速な薬物動態プロファイルを提供し、こうして患者が注射後の最初の１時間で高血糖となり、また２〜４時間後には低血糖となるのを回避するインスリン製剤を生み出すように設計された。ＶＩＡＪＥＣＴ（登録商標）が急速に発現するのは、２つの重要な添加剤、すなわち亜鉛キレート剤、例えばインスリン六量体を単量体及び二量体に急速に解離させるＥＤＴＡ二ナトリウム（ＥＤＴＡ）及び／又はＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム等、並びに溶解／安定化剤、例えば血液中に吸収される前に、解離した単量体及び二量体を安定化するクエン酸等が含まれていることに起因する（Ｐｏｈｌら、Ｊ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ． ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２年、第６巻（４号）７５５〜７６３頁）。

残念ながら、この製品を用いた初期の臨床試験では、注射部位の不快感が認められた。塩化カルシウム及び／又はＥＤＴＡのカルシウム塩としてカルシウムを含めると、注射部位の疼痛は軽減し、疼痛は注射部位近傍の細胞外液からカルシウムが除去されることに起因するという理論の裏づけとなった。しかし、カルシウムの添加は薬物動態を変化させた。

同一の概念を念頭においた濃縮インスリン製剤が開発されたが、但しこの製剤は、超急速作用と作用持続時間の若干の延長とが組み合わされた独特のプロファイルを有する。この製剤は、食事時のインスリン注射及び基礎インスリン注射を必要とするインスリン抵抗性の個体に特に良く適する。このＵ−４００製剤を用いれば、吸収プロファイルは、食事時のインスリンニーズ及び中間型インスリン（すなわちＮＰＨ）ニーズの両方を満たし得るので、注射を２回するのは不要となる。さらに、このような濃縮インスリン製剤は、イ
ンスリン抵抗性の患者用のインスリンポンプと共に利用可能である。容積が減少すれば、小型ポンプ、又は人工膵臓用に開発されているポンプ等の双ホルモンポンプを将来設計することが可能となる。

注射部位の不快感が低減した超速効型注射用インスリン組成物である組成物を提供することが、本発明の目的である。インスリン抵抗性の糖尿病を処置するための特別な濃縮インスリン製剤を提供することも本発明の目的であるが、同製剤は、皮下注射部位からの吸収速度を増加させることにより、注射用インスリン組成物の薬物動態及び薬力学を調節する。

米国特許第７，２７９，４５７号明細書 米国特許出願公開第２００７／０２３５３６５号明細書 米国特許出願公開第２００８／００８５２９８号明細書 米国特許出願公開第２００８／９０７５３号明細書 米国特許出願公開第２００８／００９６８００号明細書

Ｊ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ．ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２年、第６巻（４号）７５５〜７６３頁

発明の要旨
注射部位の忍容性が改善した、Ｕ−１００、超急速類似体、及びＵ−４００超速効型注射用インスリン製剤の薬物動態及び薬力学を調節する組成物及び方法が開発された。当該製剤は、亜鉛キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）等、溶解／安定化剤、例えばクエン酸及び／又はクエン酸ナトリウム等、１つ又は複数のマグネシウム化合物、並びに任意選択的に追加の添加剤と組み合わせてインスリンを含有する。

１つの実施形態では、製剤は、組換えヒトインスリン、ＥＤＴＡナトリウム、溶解／安定化剤、例えばクエン酸及び／又はクエン酸ナトリウム、並びに１つ又は複数のマグネシウム化合物、例えばＥＤＴＡマグネシウム、Ｍｇ（ＯＨ）_２、ＭｇＳＯ_４、又はこれらの組み合わせを含有する。特別な実施形態では、マグネシウム化合物は、ＭｇＳＯ_４である。マグネシウム化合物の濃度は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜約２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．２〜約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．２〜０．３ｍｇ／ｍｌのＭｇ（ＯＨ）_２（例えば、０．２８２）、約１．７〜２．０のＥＤＴＡマグネシウム（例えば、１．８９）、及び／又は約０．４〜０．５の硫酸マグネシウム（例えば、０．４８１）を含有する。ｍ−クレゾール濃度及びクエン酸イオン濃度を最適化することにより、安定性が強化される。製剤中のインスリン濃度は、１００〜５００ユニット／ｍＬに変化する。

好ましい実施形態では、製剤は皮下注射により投与される。

図１は、露出した表面電荷を示し、電荷をマスクするのに適当なサイズの分子（「溶解剤及びキレート化剤」）と重ね合わされたインスリンの３次元概略図である。 図２及び３は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較した、ＥＤＴＡ−Ｍｇインスリン製剤であるＢＩＯＤ１２３及び１２５について、投薬後の時間（図２、０〜６０分；図３、０〜４８０分）の関数としての平均インスリン濃度（ｍＵ／Ｌ）のグラフである。 図２及び３は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較した、ＥＤＴＡ−Ｍｇインスリン製剤であるＢＩＯＤ１２３及び１２５について、投薬後の時間（図２、０〜６０分；図３、０〜４８０分）の関数としての平均インスリン濃度（ｍＵ／Ｌ）のグラフである。 図４及び５は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較した、ＥＤＴＡ−Ｍｇインスリン製剤であるＢＩＯＤ１２３及び１２５について、時間（分）の関数としての平均ＧＩＲ（ｍｇ／ｋｇ／分）のグラフである。 図４及び５は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較した、ＥＤＴＡ−Ｍｇインスリン製剤であるＢＩＯＤ１２３及び１２５について、時間（分）の関数としての平均ＧＩＲ（ｍｇ／ｋｇ／分）のグラフである。 図６は、糖尿病のミニブタにおける、時間に対するベースラインを差し引いた平均インスリン値（実線）及びグルコース値（点線）を示す図である。ＢＩＯＤ−５３０（黒色）及びＬｉｌｌｙ Ｕ−５００（灰色）、±ＳＥＭ。 図７は、糖尿病のブタにおける、ベースラインを差し引いた平均インスリン値（実線）、及びグルコース低下量（破線）を、ＢＩＯＤ−５３０（濃い灰色）、ＢＩＯＤ−５３１（薄い灰色）、及びＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）（黒色）について示すグラフである。ｎ＝９、±ＳＥＭ。 図８は、糖尿病のミニブタにおける、時間に対するベースラインを差し引いた平均インスリン濃度を、ＢＩＯＤ−５３０（黒色）、ＢＩＯＤ−５３２（濃い灰色）、及びＢＩＯＤ−５３３（薄い灰色）について示す図である。ｎ＝９、±ＳＥＭ。 図９は、糖尿病のミニブタにおける、異なるインスリン製剤を投与した後の、時間に対するベースラインを差し引いた平均インスリン値（実線）及びグルコース値（点線）を示す図である。

発明の詳細な説明
本明細書で開示するインスリン製剤は、食事の直前又は食事終了時に投与される。製剤は、現在市販されている速効型インスリン又はインスリン類似体より速く血液中に吸収されるように設計される。インスリン製剤の１つの重要な特徴として亜鉛キレート剤が含まれていることが挙げられるが、同剤は、六量体型形態のインスリンを単量体型及び／又は二量体型形態のインスリンに解離又は分離させ、また注射後の六量体型形態への再会合を防止する又は最低限に抑え、これにより注射後の血流中への急速吸収を促進する。亜鉛キレート剤、例えばＥＤＴＡ二ナトリウムの濃度と血液からのグルコース吸収スピードとの間に系統的な関連性が存在することが判明した。ＥＤＴＡ濃度が変化すれば、その変化は速効型インスリン製剤の薬物動態及び薬力学を変化させる。

理論に束縛されないが、ＥＤＴＡ−クエン酸−インスリン製剤の注射部位における不快感についてなし得る説明として、ＥＤＴＡ二ナトリウムによる細胞外カルシウムのキレート化が挙げられる。カルシウムは、細胞外液中におよそ１ｍＭの濃度で存在し、また興奮収縮連関、筋肉機能、神経伝達物質の放出、及び細胞の代謝に必要不可欠である。局在性のカルシウムが失われると、筋テタニー（ｍｕｓｃｌｅ ｔｅｔａｎｙ）を引き起こし得るが、これは間欠性の緊張筋収縮により顕在化し、線維性振戦、知覚異常、及び筋肉痛を伴う障害である。この相互作用を回避するために、細胞外液からカルシウムを取り除く製剤を用いるべきではない。

ＥＤＴＡ二ナトリウムの代わりに、カルシウムをキレート化した形態のＥＤＴＡ（すなわち、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム）を用いれば、同一量のＥＤＴＡ二ナトリウムと比較して注射部位の疼痛を軽減し得る。しかし、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムは、吸収速度をｉｎ ｖｉｖｏで若干遅延させる。したがって、過剰のＥＤＴＡをキレート化するのにマグネシウムをカルシウムの代わりに用いた。製剤にマグネシウムを添加すると、注射部位の忍容性が高まったが、インスリン吸収速度は変化しなかった。

１つの実施形態では、製剤は、組換えヒトインスリン、ＥＤＴＡナトリウム、溶解／安定化剤、例えばクエン酸及び／又はクエン酸ナトリウム、並びに１つ又は複数のマグネシウム化合物、例えばＥＤＴＡマグネシウム、Ｍｇ（ＯＨ）_２、ＭｇＳＯ_４、又はこれらの組み合わせを含有する。特別な実施形態では、マグネシウム化合物はＭｇＳＯ_４である。マグネシウム化合物の濃度は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜約２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．２〜約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．２〜０．３ｍｇ／ｍｌのＭｇ（ＯＨ）_２（例えば、０．２８２）、約１．７〜２．０のＥＤＴＡマグネシウム（例えば、１．８９）、及び／又は約０．４〜０．５の硫酸マグネシウム（例えば、０．４８１）を含有する。ｍ−クレゾール濃度及びクエン酸イオン濃度を最適化することにより、安定性が強化される。製剤中のインスリン濃度は、１００〜５００ユニット／ｍＬで変化する。

Ｉ．定義
本明細書で用いているように、「インスリン」は、特に指定しない限り、ヒト若しくは非ヒト組換え、精製又は合成インスリン若しくはインスリン類似体を意味する。

本明細書で用いているように、「ヒトインスリン」は、天然源から分離されたか、又は遺伝子改変した微生物により産生されたかにかかわりなく、膵臓により分泌されるヒトペプチドホルモンである。本明細書で用いているように、「非ヒトインスリン」は、ヒトインスリンと同じであるが、ブタ又はウシなどの動物源からのものである。

本明細書で用いているように、インスリン類似体は、膵臓により分泌されるインスリンと異なるが、天然インスリンと同じ作用を果たすために身体に利用できる改変インスリンである。基礎をなすＤＮＡの遺伝子操作により、インスリンのアミノ酸配列を変化させて、そのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝及び排泄）特性を変化させることができる。例としては、インスリンリプロ、インスリングラルギン、インスリンアスペルト、インスリングルリシン、およびインスリンデテミルなどがある。インスリンは、化学的に、例えば、アセチル化により修飾することもできる。本明細書で用いているように、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンと同じ作用を果たすことができる改変ヒトインスリンである。

本明細書で用いているように、「キレート剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）」又は「キレート化剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」は、亜鉛イオンに対する１つ以上の結合を形成する能力を有する化合物を意味する。結合は、一般的にイオン結合又は配位結合である。キレート剤は、無機又は有機化合物であってよい。キレート錯体は、金属イオンがキレート化剤の２つ以上の原子に結合している錯体である。

本明細書で用いているように、「可溶化剤」は、溶媒中の物質、例えば水溶液中のインスリンの溶解度を高める化合物である。可溶化剤の例として、ポリソルベート（ＴＷＥＥＮ（登録商標））等の界面活性剤、エタノール等の溶媒、オキシエチレンモノステアレート等のミセル形成化合物、及びｐＨ調節剤が挙げられる。

本明細書で用いているように、「溶解／安定化剤（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）」又は「溶解／安定化剤（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」は、酸又はその塩であり、インスリン及びＥＤＴＡに添加すると、下記実施例に記載する上皮細胞のトランスウェルプレートアッセイ法を用いて測定されるように、同一ｐＨにおけるＨＣｌ及びＥＤＴＡと比較して、インスリンの輸送及び吸収を増強する。ＨＣｌは溶解／安定化剤ではないが、可溶化を支援し得る。クエン酸は、このアッセイ法で測定した場合、溶解／安定化剤である。

本明細書で用いているように、「無機性のマグネシウム化合物」又は「無機性のマグネシウム塩」は、陰イオンが１つの炭素原子も含有しない化合物を意味する。

本明細書で用いているように、「有機性のマグネシウム化合物」又は「有機性のマグネシウム塩」は、陰イオンが１つ又は複数の炭素原子を含有する化合物を意味する。

本明細書で用いているように、「添加剤」は、キレート剤又は溶解／安定化剤以外の不活性物質であり、インスリンの担体として用いられる、又は製品を製造するプロセスを支援するために利用される。そのような場合、活性物質は、添加剤に溶解される又はこれと混合される。

本明細書で用いているように、「生理学的ｐＨ」は、６．８〜７．６の間、好ましくは７〜７．５の間、最も好ましくは約７．４である。

本明細書で用いているように、「Ｃｍａｘ」は、薬物の投与後に認められるその最大濃度又はピーク濃度である。

本明細書で用いているように、「Ｔｍａｘ」は、最大濃度（Ｃｍａｘ）が生じる時間である。本明細書で用いているように、１／２Ｔｍａｘは、血液中でインスリン濃度がその最大濃度の半分（１／２Ｃｍａｘ）となる時間である。これは、Ｔ５０％ｅａｒｌｙｍａｘとしても表され得る。

ＩＩ．製剤
製剤には、インスリン又はインスリン類似体、亜鉛キレート剤、及び溶解／安定化剤（複数可）、マグネシウム、並びに任意選択的に１つ又は複数のその他の添加剤が含まれる。好ましい実施形態では、製剤は皮下投与に適し、また皮下組織に急速に吸収される。溶解／安定化剤及びキレート剤の選択、溶解／安定化剤及びキレート剤の両者の濃度、並びに製剤が調整されるｐＨ、これらすべては、システムの有効性に顕著な影響を与える。多くの組合せで有効性は認められるが、好ましい実施形態は、安全性、快適性、安定性、制御プロファイル、及び性能を含む理由から選択される。

好ましい実施形態では、製剤成分のうち少なくとも１つは、インスリン上の電荷をマスクするために選択される。これは、インスリンの膜透過輸送を促進し、こうしてインスリンの作用発現及び生物学的利用能の両方を向上させるものと考えられている。また、成分は、水性媒体中に急速に溶解する組成物を形成するためにも選択される。好ましくは、インスリンは吸収され、血漿に速く輸送され、急速な作用発現を引き起こし、好ましくは投与後約５分以内に開始し、また投与後約１５〜３０分でピークに達する。

ＥＤＴＡ等のキレート剤は、インスリン内の亜鉛をキレート化し、こうして亜鉛をインスリン分子から取り除く。こうすると、六量体型インスリンの二量体型及び単量体型形態への解離を引き起こし、また注射後の六量体状態への再会合を遅らせる。これら２形態は、濃度依存性の平衡状態にあるので、単量体が吸収されるに従い、より多くの単量体が生み出される。したがって、インスリン単量体が皮下組織を通じて吸収されるに従い、さらなる二量体が分解（ｄｉｓｓｅｍｂｌｅ）してより多くの単量体が形成される。単量体型形態は、六量体型形態の分子量の６分の１に満たない分子量を有し、こうしてインスリン吸収スピード及びその量の両方を顕著に増加させる。キレート剤（例えばＥＤＴＡ）及び／又は溶解／安定化剤（例えばクエン酸）とインスリンとの水素結合の範囲内において、これらは、インスリン上の電荷をマスクし、インスリンの膜透過輸送を促進し、こうしてインスリンの作用発現及び生物学的利用能の両方を向上させるものと考えられている。

マグネシウム塩は、薬物動態プロファイルを顕著に変化させない一方、同時に注射部位の疼痛を軽減することが判明している。

好ましい実施形態では、Ｍ−クレゾールは、その抗微生物特性及び使用期限延長の理由から添加される。

インスリン
インスリン又はインスリン類似体は、本製剤で利用可能である。好ましくは、インスリンは組換えヒトインスリンである。組換えヒトインスリンは、いくつかの供給元から入手可能である。インスリンの用量は、その生物学的利用能及び処置の対象となる患者に依存する。インスリンは、個体のインスリン抵抗性レベルに応じて１．５〜２００ＩＵの用量範囲で一般的に含まれる。インスリンは、２００、４００、又は５００Ｕ／ｍｌのその他の提供形態が本明細書に記載されているが、一般的に、１００ＩＵバイアルで提供される。最も好ましい実施形態では、注射用製剤は、１ｍｌの容積で１００Ｕのインスリンを含有する。追加の実施形態には、より高濃度のインスリン製剤が含まれ、最も好ましくはＵ−４００である。

いくつかの異なる種類の市販インスリンが糖尿病患者にとって利用可能である。これらの種類のインスリンは、（１）血流に到達し、血糖レベル低下を開始するのにどのくらい時間がかかるか、（２）インスリンが最大強度でどのくらい長く作用するか、及び（３）インスリンがどのくらい長く血糖に対して影響を与え続けるか、によって異なる。

速効性インスリン（ｆａｓｔ ａｃｔｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ）
速効性インスリンは、食事中の炭水化物摂取に由来するグルコースに反応するように意図されている。速効性インスリンは、１〜２０分以内にその働きを開始し、約１時間後にピークに達し、そして３〜５時間持続する。速効性インスリンは、体循環に完全に吸収されるのに約２時間かかる。速効性インスリンとして、ｐＨ７で等張溶液中に投与されるレギュラー組換えヒトインスリン（例えばＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ社より市販されているＨＵＭＵＬＩＮ（登録商標）、及びＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ社より市販されているＮＯＶＡＬＩＮ（登録商標））が挙げられる。ウシ及びブタインスリンは、ヒトインスリンとはいくつかのアミノ酸が異なるが、ヒトにおいて生体活性であり、また速効性インスリンである。

濃縮インスリン製剤
より濃縮された形態のインスリンが、インスリン抵抗性の個体のために提供されている。市販の製剤であるＨｕｍｕｌｉｎ Ｒ Ｕ−５００は、非常に長い作用持続時間を有するが、その徐放性プロファイルに起因して基礎的利用に限り適する。

速効型インスリン（ｒａｐｉｄ−ａｃｔｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ）
糖尿病患者の一部は、食事の際に速効型インスリン、及び「バックグラウンド」持続性インスリンとして長時間作用性インスリンを利用する。この群には、その吸収速度を高めるために、改変された又はアミノ酸の位置が変化したインスリンが含まれる。

現時点では、３種類の速効型市販インスリン類似体が利用可能である：インスリンリスプロ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社よりＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）として販売されているリジン−プロリンインスリン）、インスリングルリジン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ社よりＡＰＩＤＲＡ（登録商標）として販売されている）、及びインスリンアスパルト（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社よりＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標）として販売されている）。

中間型インスリン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ａｃｔｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ）
中間型インスリンは、短時間作用性インスリンより長い寿命を有するが、作用開始までが遅く、またその最大強度に達するのにより長い時間がかかる。中間型インスリンは、注射後２〜４時間内に、通常その働きを開始し、４〜１４時間のどこかでピークに達し、最長２４時間有効な状態に留まる。中間型インスリンの種類として、ＮＰＨ（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ Ｈａｇｅｄｏｒｎ）及びＬＥＮＴＥインスリンが挙げられる。インスリンが血流に到達するのにより長い時間がかかるが、ピーク及び寿命がより長くなるように、ＮＰＨインスリンは吸収スピードを減速させるプロタミンを含有する。中間型インスリンは、１日当たりの合計注射回数を低減するために、中性のｐＨで速効型インスリンと組み合わせられ得る。

即時作用性インスリン及び中間型インスリンのブレンド：
速効型インスリン及びＮＰＨインスリンのブレンドが、単回注射での食事時の使用及び基礎的な使用のニーズを満たすために市販されている。これらのインスリンブレンドは、レギュラー組換えインスリンベース（ＨＵＭＵＬＩＮ（登録商標）７０／３０（７０％ヒトインスリンイソフェン及び３０％ヒトインスリン、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）、又はＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）Ｍｉｘ７５／２５（７５％インスリンリスプロプロタミン懸濁物及び２５％インスリンリスプロ溶液）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）等の類似体ベースであり得、またこれらは１００Ｕ−ｍｌである。これらのブレンドは、ＨＵＭＵＬＩＮ（登録商標）Ｒ（レギュラーヒトインスリン）又はＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）Ｒを用いてインスリン作用持続時間を延長して食事時のニーズをカバーするために、プロタミンインスリン懸濁物（ＨＵＭＵＬＩＮ（登録商標）又はＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）ベース）を利用する。

長時間作用性インスリン（ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ）
長時間作用性インスリンの例として、インスリングラルギン（商標名ＬＡＮＴＵＳ（登録商標）で市販、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ社）、及びインスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ社）が挙げられる。ＬＡＮＴＵＳ（登録商標）の作用持続時間延長は、皮下注射後にｐＨが４から７に上昇することにより通常誘発される。これにより、インスリングラルギンの溶解度が変化し、微小析出物が生成する。この微小析出物（ｍｉｃｒｏｐｒｅｃｉｐａｔｅ）は皮下組織中でゆっくりと溶解し、最長２４時間そのグルコース低下効果が持続する。このインスリンは、ヒトインスリンと異なり、位置２１でアスパラギンの代わりにグリシンを有し、また２つのアルギニンがβ鎖のカルボキシ末端に付加されている。

溶解／安定化剤
図１に示す通り、特定のポリ酸は、インスリン上の電荷をマスクし、取り込み及び輸送を増強すると思われる。電荷マスキング剤ではない塩酸に対し、溶解／安定化剤として有効なそのような酸として、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、アジピン酸、及びその塩が挙げられる。有効な酸として、すべての二酸又はポリ酸が挙げられる。例えば、活性な作用物質がインスリンの場合には、好ましい溶解／安定化剤は、クエン酸及び／又はクエン酸ナトリウムである。塩酸は、任意の製剤と組み合わせてｐＨ調整のために使用され得るが、溶解／安定化剤ではない。

酸は直接的に又は水溶液中で解離する塩の形態で添加可能である。酸の塩は、酢酸ナトリウム、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩及びアジピン酸塩を含む。有機酸の塩は、金属水酸化物、金属酸化物、金属炭酸塩及び金属重炭酸塩、金属アミン、並びに塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム等などのアンモニウム塩基を含むが、これらに限定されない様々な塩基を用いて調製することができる。適切な金属は、一価及び多価金属イオンを含む。例としての金属イオンは、リチウム、ナトリウム及びカリウムなどのＩ族金属、バリウム、マグネシウム、カルシウム及びストロンチウムなどのＩＩ族金属、並びにアルミニウムなどのメタロイドを含む。多価金属イオンは、２つ以上のカルボン酸基と同時に錯体を形成できるので、複数のカルボン酸基を含有する有機酸が望ましい場合がある。

溶解／安定化剤の範囲は、インスリン及びＥＤＴＡ二ナトリウムと組み合わせたクエン酸の有効量に対応する。例えば、９．３７×１０^−４Ｍ〜９．３７×１０^−２Ｍのクエン酸の範囲は、クエン酸が、モル質量がおよそ１９２グラム／モルの無水クエン酸の場合、約０．１８ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌの重量／容積に対応する。いくつかの実施形態では、無水クエン酸の量は、１．８ｍｇ／ｍｌの約５０％（０．９ｍｇ／ｍｌ）〜１．８ｍｇ／ｍｌの約５００％（９ｍｇ／ｍｌ）、より好ましくは１．８ｍｇ／ｍｌの約７５％（１．３５ｍｇ／ｍｌ）〜１．８ｍｇ／ｍｌの約３００％（５．４ｍｇ／ｍｌ）の範囲である。好ましい実施形態では、無水クエン酸の量は、約１．８ｍｇ／ｍｌ、又は約２．７ｍｇ／ｍｌ、又は約３．６ｍｇ／ｍｌ、又は約５．４ｍｇ／ｍｌであり得る。最も好ましい実施形態では、クエン酸の量は、注射用製剤の２．７ｍｇ／ｍｌである。例えば、無水クエン酸の代わりにクエン酸一水和物若しくはクエン酸三ナトリウム又は別のクエン酸が用いられる場合には、重量／容積は調整され得る。

好ましい溶解／安定化剤は、インスリン製剤が生理的ｐＨ範囲のｐＨを有する場合、クエン酸ナトリウムである。

特に好ましい実施形態では、製剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウムとクエン酸との混合物を含有する。一般的に、ＥＤＴＡ二ナトリウムに対するクエン酸の比は、３００：１００の範囲、例えば１００：１２０、１００：１００、２００：１００、１５０：１００、３００：２００、及び５００：１００である。

キレート剤
好ましい実施形態では、亜鉛キレート剤はインスリンと混合される。キレート剤は、イオン性であっても非イオン性であってもよい。キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、アルギン酸、α−リポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ＣＤＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）、及びクエン酸三ナトリウム（ＴＳＣ）が挙げられる。塩酸はｐＨを調整するためにＴＳＣと併用され、そのプロセスにおいて溶解／安定化剤であるクエン酸が形成させられる。

キレート剤は、インスリンから亜鉛を捕捉し、こうして六量体型形態よりも単量体型又は二量体型形態のインスリンが優勢となり、投与部位周辺組織（例えば、粘膜又は脂肪組織）内へのインスリン吸収を促進する。さらに、キレート剤の水素はインスリンに結合し得、それによりインスリン単量体の電荷マスクを支援し、またインスリン単量体の膜透過輸送を促進する。

好ましい実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。最も好ましい実施形態では、製剤は、インスリン、ＥＤＴＡ二ナトリウム、塩化カルシウム、及びクエン酸又はクエン酸ナトリウム等の溶解／安定化剤を含有する。

２．４２×１０^−４Ｍ〜９．６８×１０^−２Ｍの範囲のＥＤＴＡは、ＥＤＴＡが、モル質量がおよそ２９２グラム／モルであるエチレンジアミン四酢酸の場合には、約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約２８ｍｇ／ｍｌの重量／容積に対応する。ＥＤＴＡの濃度が低下すると、インスリン吸収速度が低下し、またインスリン注射に対するグルコースの反応が遅延する可能性がある。この濃度をさらに増加させても、吸収速度は無視し得る程度に増加するにすぎない。

好ましい実施形態では、ＥＤＴＡの量は、１．８ｍｇ／ｍｌの約５％（０．０９ｍｇ／ｍｌ）〜１．８ｍｇ／ｍｌの約５００％（９ｍｇ／ｍｌ）、より好ましくは１．８ｍｇ／ｍｌの約１５％（０．２７ｍｇ／ｍｌ）〜１．８ｍｇ／ｍｌの約２００％（３．６ｍｇ／ｍｌ）の範囲である。例えば、ＥＤＴＡの量は、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、又は２．４ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡであり得る。

ＥＤＴＡの濃度が低下すると、インスリン吸収速度が低下し、またインスリン注射に対するグルコースの反応が遅延する可能性がある。好ましい実施形態では、キレート剤は、好ましくは２．０ｍｇ／ｍｌに等しいか又はそれ未満の量のＥＤＴＡ二ナトリウムである。この濃度をさらに増加させても、吸収速度は無視し得る程度に増加するにすぎない。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、ＥＤＴＡ二ナトリウムとＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムを組み合わせたものである。例えば、１つの実施形態では、ＥＤＴＡは約１．８〜２．０ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムと組み合わせた約０．２７〜０．３ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ二ナトリウムである。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、約１．８〜２．０ｍｇ／ｍｌの間のＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム又はＥＤＴＡ二ナトリウム及びＣａＣｌ_２である。

マグネシウム化合物
製剤は、１つ又は複数の薬学的に許容されるマグネシウム化合物を含有する。これまでに議論したように、ＥＤＴＡは、投与部位における内因性カルシウムの錯体形成に起因して、注射部位における炎症を引き起こす可能性がある。ＥＤＴＡカルシウムを含めることにより、この炎症は改善し得るが、製剤にＥＤＴＡカルシウムを添加すると、インスリン吸収が減速する。注射部位の炎症を最低限に抑えるか又は防止し、かつ皮下吸収速度を変化させないために、１つ又は複数のマグネシウム化合物が製剤に組み込まれる。

マグネシウム化合物は、無機及び／又は有機のマグネシウム塩であり得る。適する無機マグネシウム塩として、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）_２）、硫酸マグネシウム（Ｍｇ（ＳＯ_４））、ハロゲン化マグネシウム、例えば塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、臭化マグネシウム（ＭｇＢｒ_２）、及びヨウ化マグネシウム（ＭｇＩ_２）等；ピロリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム七水和物、並びに酸化マグネシウム（ＭｇＯ_２）が挙げられるが、これらに限定されない。

適する有機マグネシウム塩として、ＥＤＴＡマグネシウム、乳酸マグネシウム、アミノ酸キレート、例えばアスパラギン酸マグネシウム等；酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣＯ_３）_２）、クエン酸マグネシウム、及びグルコン酸マグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。

特別な実施形態では、１つ又は複数のマグネシウム化合物は、ＥＤＴＡマグネシウム、Ｍｇ（ＯＨ）_２、ＭｇＳＯ_４、又はこれらを組み合わせたものである。１つの実施形態では、１つ又は複数のマグネシウム化合物はＭｇＳＯ_４である。

１つ又は複数のマグネシウム化合物の濃度は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜約２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．２〜約２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．２〜０．３ｍｇ／ｍｌのＭｇ（ＯＨ）_２（例えば、０．２８２）、約１．７〜２．０のＥＤＴＡマグネシウム（例えば、１．８９）、及び／又は約０．４〜０．５の硫酸マグネシウム（例えば、０．４８１）を含有する。

添加剤
薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性化合物の処理を促進する添加剤及び助剤を含む１つ以上の生理的に許容されるキャリアを用いて従来の方法で処方することができる。薬物の製剤化は、例えば、Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９７５年）並びにＬｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ． Ａ．及びＬａｃｈｍａｎ， Ｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０年）に記載されている。

好ましい実施形態において、水性媒体への速やかな溶解を促進するために、１つ以上の可溶化剤をインスリンとともに含める。適切な可溶化剤は、ポリソルベート、グリセリン及びポロキサマー類などの湿潤剤、非イオン性及びイオン性界面活性剤類、食用酸類及び食用塩基類（例えば、重炭酸ナトリウム）並びにアルコール類並びにｐＨ調節用の緩衝塩類を含む。好ましい実施形態において、ｐＨは塩酸（ＨＣｌ）又は水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて調整される。注射用製剤のｐＨは、一般的に約６．８〜７．８の間、好ましくは約７．１である。

安定剤は、薬物分解反応を阻害する又は遅らせるのに用いられるが、そのような反応として、事例的に酸化反応が挙げられる。いくつかの安定剤が利用可能である。適する安定剤として、バッファー；例えばクエン酸塩、リン酸塩、及び酢酸塩等；多糖類、例えばセルロース及びセルロース誘導体、硫酸化多糖複合体等、並びに単純アルコール、例えばグリセロール（又はグリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、若しくはグリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ））等；静菌剤、例えばフェノール、ベンジルアルコール（ａｌｃｈｏｈｏｌ）、メタ−クレゾール（ｍ−クレゾール）、２−フェノキシエタノール、及びメチル／プロピルパラベン等；等張化剤、例えば塩化ナトリウム、グリセロール（又はグリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、若しくはグリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ））、環状アミノ酸、アミノ酸、及びグルコース等；レシチン、例えば天然レシチン（例えば、卵黄レシチン又はダイズレシチン）等、及び合成又は半合成レシチン（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、又はジステアロイルホスファチジルコリン）等；ホスファチジン酸；ホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン、例えばジステアロイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、及びジアラキドイルホスファチジルセリン（ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌｐｈｏｓｐａｈｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）等；ホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；カルジオリピン；スフィンゴミエリンが挙げられる。また、溶媒又は共溶媒系（エタノール、ＰＥＧ−３００、グリセリン、プロピレングリコール）、並びに可溶化剤、例えばポリソルベート２０／８０；ポロキサマー１８８、及びソルビトール等も含まれる。１つの例では、安定剤は、グリセロール、静菌剤、及び等張化剤を組み合わせたものであってもよい。最も好ましい製剤には、グリセリン及びｍ−クレゾールが含まれる。グリセリンの範囲は、約１〜３５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０〜２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１９．５〜２２．５ｍｇ／ｍｌである。ｍ−クレゾールの範囲は、約０．７５〜６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１．８〜３．２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２又は３ｍｇ／ｍｌである。塩化カルシウムは、あらゆる遊離ＥＤＴＡを「中和する」ために製剤に添加可能であり、またクエン酸ナトリウム及び／又はクエン酸は、解離した単量体を安定化するために添加される。塩化カルシウムは、キレート剤がＥＤＴＡ二ナトリウムの時、製剤に、より一般的に添加される。塩化カルシウムは、ＥＤＴＡ二ナトリウムとほぼ等モル濃度に一致させて添加される。例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウムが５ｍＭである場合には、やはり５ｍＭの塩化カルシウムが用いられるべきである。有効範囲は、ＥＤＴＡ二ナトリウムの８０〜１２０％である。塩化カルシウムに対応するさらに可能性のある候補として、類似した量で添加されるマグネシウムが挙げられる。塩化カルシウムの範囲は、約０．１〜１０ｍＭ、好ましくは、より好ましくは約２．５〜７．５ｍＭ、最も好ましくは約５ｍＭである。

いくつかの実施形態では、市販のインスリン調製物及びインスリン類似体調製物は、本明細書で開示する製剤のインスリンとして利用可能である。したがって、最終製剤には、市販のインスリン及びインスリン類似体の調製物によく見出される追加の添加剤が含まれ得るが、そのような添加剤として亜鉛、塩化亜鉛、フェノール、リン酸ナトリウム、酸化亜鉛、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、トロメタミン、及びポリソルベート２０が挙げられ、但しこれらに限定されない。また、これらは、本明細書に記載するキレート剤及び解離／安定化剤を添加する前に上記市販調製物から除去され得る。

製剤の例は、下記の実施例で詳細に記載されている。カルシウム−ＥＤＴＡ−クエン酸製剤は、以下を含有する：１００Ｕ／ｍｌのインスリン、１．８ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、２．７ｍｇ／ｍｌのクエン酸、２０．０８ｍｇ／ｍｌのグリセリン、及び３．０ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール（「ＢＩＯＤ−１０５」）、又は１００Ｕ／ｍｌのインスリン若しくはインスリン類似体、１．８ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ二ナトリウム、２．７ｍｇ／ｍｌのクエン酸、１８．１ｍｇ／ｍｌのグリセリン、２．０ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール、及び５ｍＭの塩化カルシウム（「ＢＩＯＤ−１０７」）。

１つ又は複数のマグネシウム化合物を含有するインスリン製剤は、表１に記載するように調製した。

ＩＩＩ．製剤作製方法
好ましい実施形態では、注射用製剤は、インスリン、ＥＤＴＡ二ナトリウム及び／又はＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、クエン酸、食塩水、又はグリセリン、ｍ−クレゾール、並びに塩化マグネシウムを含有する。最も好ましい実施形態では、皮下注射用製剤は、水、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＭｇＳＯ_４等のマグネシウム塩、クエン酸、グリセリン、ｍ−クレゾール、及びインスリンを合わせ、多数回使用注射バイアル又はカートリッジ内に滅菌濾過することより製造される。

注射用インスリン製剤の作製方法は、下記の実施例に詳細に記載されている。
１つの実施形態では、ＥＤＴＡは、クエン酸の前に製剤（複数可）に添加される。別の実施形態では、クエン酸ナトリウムがクエン酸の代わりに添加される。好ましい実施形態では、クエン酸は、ＥＤＴＡの前に製剤（複数可）に添加される。１つの好ましい実施形態では、製剤の以下の構成成分は、水に添加される：クエン酸、ＥＤＴＡ、グリセリン、ｍ−クレゾール、マグネシウム塩、及びインスリン。グリセロール及びｍ−クレゾールは溶液として添加されるが、一方クエン酸、ＥＤＴＡ、及びマグネシウム塩は、粉末、結晶として添加可能であるか、又は水に事前溶解可能である。

いくつかの実施形態では、皮下注射用製剤は、水、クエン酸、ＥＤＴＡ、グリセリン、及びｍ−クレゾールを混合して、濾過及び滅菌される溶液（「希釈液」と呼ばれる）を形成することにより製造される。インスリンは、水に個別に添加され、滅菌濾過され、そして指定量がいくつかの個別滅菌注射ボトルに添加され、次に凍結乾燥されて粉末を形成する。凍結乾燥された粉末は、その安定性を保持するために、希釈液とは分離して保管される。投与前に希釈液がインスリン注射ボトルに添加され、インスリンが溶解して最終的な再構成製品が製造される。

別の実施形態では、インスリンは溶液中に存在し、添加剤が凍結乾燥、スプレードライ化され、そして注射前にインスリンに添加される。なおも別の実施形態では、添加剤は濃縮液として作製され、そして注射前に液状のインスリンに導入される。

事前に決定された量のインスリンを患者に皮下注射した後、残りのインスリン溶液は、好ましくは冷蔵して保管可能である。好ましい実施形態では、インスリンは、バイアル又はカートリッジ内で、約ｐＨ７．０の水溶液として調製され、４℃に保たれる。

ＩＶ．製剤の使用方法
製剤は、皮下注射又は筋肉内注射することができる。製剤は、急速に吸収され、そして血漿に輸送されて全身的に送達されるように設計される。

活性な作用物質としてインスリンを含有する製剤は、食事前又は食事中に１型又は２型糖尿病患者に投与され得る。急速に吸収されることから、組成物は肝臓内でグリコーゲンがグルコースに変換するのを阻止し得るが、こうして糖尿病に由来する合併症の主要原因であり、また２型糖尿病の第１の症状である高血糖症を予防する。現在利用可能なヒトインスリンの標準的皮下注射剤は、摂食前約０．５〜１時間に投与されなければならないが、肝臓内グルコース産生を阻止するにはインスリンの吸収が遅すぎるので、得られる効果は希望するまでに至らない。上記のような新規超速効型製剤は、食事により近い時間に服用可能である。薬物動態が向上したこのような製剤における潜在的な利点として、インスリン処置で多発する合併症である肥満について、その発生率又は重症度の低減を挙げることができる。

（実施例１）
ヒトにおける注射部位の不快感に対するＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム濃度の影響
材料及び方法
ＶＩＡＪＥＣＴ（登録商標）７（ＶＪ７）は、１ミリリットル当たり以下を含有する：３．７ｍｇ（１００ＩＵ）の組換えヒトインスリン、１．８ｍｇのクエン酸、１．８ｍｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、２２．０７ｍｇのグリセリン、防腐剤として３．０ｍｇのｍ−クレゾール、並びにｐＨをおよそ７に調整する水酸化ナトリウム及び／又は塩酸。

ＢＩＯＤ１０２は、１ミリリットル当たり以下を含有する：３．７ｍｇ（１００ＩＵ）の組換えヒトインスリン、１．８ｍｇのクエン酸、２．４ｍｇのＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、１５．０ｍｇのグリセリン、防腐剤として３．０ｍｇのｍ−クレゾール、並びにｐＨをおよそ７．１に調整する水酸化ナトリウム及び／又は塩酸。

ＢＩＯＤ１０３は、１ミリリットル当たり以下を含有する：３．７ｍｇ（１００ＩＵ）の組換えヒトインスリン、１．８ｍｇのクエン酸、０．２５ｍｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、２．０ｍｇのＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、１５．０ｍｇのグリセリン、防腐剤として３．０ｍｇのｍ−クレゾール、並びにｐＨをおよそ７．１に調整する水酸化ナトリウム及び／又は塩酸。

各溶液をヒト志願者の皮下に注射し、注射と関連した疼痛の評定について当該志願者に質問した。

非線形モデリングを行わずに、基本的な薬物動態パラメータであるＣｍａｘ、Ｔｍａｘ、及び１／２Ｔｍａｘを見積もった。

ＶＪ７と比較して、各製剤から得られたデータについてｔ−検定を実施した。

結果
表２に示す通り、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムを含有するサンプル（ＢＩＯＤ１０２及びＢＩＯＤ１０３）は、ＥＤＴＡ二ナトリウムのみを含有するサンプル（ＶＪ７）よりも若干低めのＣｍａｘ及び遅めのＴｍａｘを有した。

表２：ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムとＥＤＴＡ二ナトリウムとの比較
薬物動態データ
ＶＩＡＪＥＣＴ（登録商標）７：１．８ｍｇのＥＤＴＡ二ナトリウム
ＢＩＯＤ１０２：２．４ｍｇのＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム
ＢＩＯＤ１０３：０．２５ｍｇのＥＤＴＡ二ナトリウム、２．０ｍｇのＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム

これらの結果から、最大インスリン濃度の半分に達するまでの平均時間及び最大インスリン濃度に達するまでの時間（表２）が示すように、カルシウム製剤は、当初のインスリン、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸製剤よりも有意に低下した取り込み速度を有することが実証される。

ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムを含有するインスリン製剤を注射すると、その結果注射部位の疼痛は、表３に示す通りＥＤＴＡ二ナトリウムサンプルよりも有意に低下した。
表３：注射部位の不快感データ
ＶＡＳ：０＝無し；１００＝考え得る最悪；ＶＲ絶対的不快感：０＝無し、１＝軽度、２＝中等度、３＝重度
ＶＲ相対的（通常の注射に対する）：１＝かなり低い；２＝低い；３＝同等；４＝高い；５＝かなり高い。

（実施例２）
糖尿病のミニブタにおける製剤ＢＩＯＤ１０５及びＢＩＯＤ１０７のインスリン吸収速度研究
この研究の目的は、忍容の改善と関連するものと予測される改変型インスリン製剤の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）特性を評価することであった。実施例１では、インスリン製剤（ＥＤＴＡ二ナトリウムを含有する）にＥＤＴＡカルシウムを添加すると、ＥＤＴＡ二ナトリウムを含有するインスリン製剤（ＥＤＴＡカルシウム無添加）と比較して、注射に対する部位反応が低減することが明らかにされた；しかし、製剤の速効性は、この置換により若干遅くなった。したがって、新規インスリン製剤が、時間的喪失（速効性）を取り戻し、また安定性を改善するために開発された。追加のクエン酸をいくつかの製剤に添加したが（当初の製剤であるＶＪ７と比較して１５０％）、また安定性を高めるために、ｍ−クレゾールを１／３削減することを検討した。

新規製剤のうち、その１つでは、カルシウムがキレート化した形態のＥＤＴＡを実現するために、ＥＤＴＡ二ナトリウム及びＣａＣｌ_２を個別の添加剤として添加した（ＢＩＯＤ１０７）。ＢＩＯＤ１０７に由来するインスリン吸収速度を、ＥＤＴＡ−Ｃａが直接添加されたインスリン製剤（ＢＩＯＤ１０５）に由来するインスリン吸収速度と、ＶＪ７（ＥＤＴＡ二ナトリウムを含有し、カルシウム無添加）に由来するインスリン吸収速度と比較した。

方法及び材料
カルシウム−ＥＤＴＡ−クエン酸製剤（ＢＩＯＤ１０５）は以下を含有する：１００Ｕ／ｍｌのインスリン、１．８ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、２．７ｍｇ／ｍｌのクエン酸（＝ＶＪ７に含まれる量の１５０％）、２０．０８ｍｇ／ｍｌのグリセリン、及び３．０ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール。

ＣａＣｌ_２−ＥＤＴＡ−クエン酸製剤（ＢＩＯＤ１０７）は以下を含有する：１００Ｕ／ｍｌのインスリン又はインスリン類似体、１．８ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ二ナトリウム、２．７ｍｇ／ｍｌのクエン酸（＝ＶＪ７に含まれる量の１５０％）、１８．１ｍｇ／ｍｌのグリセリン、２．０ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール（＝ＶＪ７に含まれるｍ−クレゾールの量１／３削減）、及び５ｍＭの塩化カルシウム。

製剤、ＶＪ７、ＢＩＯＤ１０５、及び１０７をミニブタの皮下に注射し、これに続き各試験製剤を皮下投与した後のインスリン吸収速度を測定した。

糖尿病のミニブタ６〜８匹に、連日投与されるブタインスリンの代わりに０．２５Ｕ／ｋｇの試験製剤を午前中に注射した。動物にはブタ飼料５００ｇを与え、そして血漿サンプルを、投薬後−３０、−２０、−１０、０、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、２４０、３００、及び３６０分に、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｋ_２ＥＤＴＡバキュテーナーを用いて収集した。凍結血漿をインスリン含有量についてアッセイし（＃ＥＺＨＩ−１４Ｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、またグルコース濃度について分析した（ＹＳＩ３２００ ａｎａｌｙｚｅｒ、ＹＳＩ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）。非線形モデリングを行わずに持続時間を見積もった。投薬後にベースラインから血糖レベルが２０ポイント低下するのに必要とされる時間、及び最下点から血中グルコースが２０ポイント増加するのに要する時間から、薬力学的反応を計算した。これらのパラメータ間の時間は、作用持続時間として定義される。

吸収速度を、注射後のインスリン濃度の初期増加から導出された直線の傾きとして計算した（投薬後最大３０分）。

結果：
吸収速度パラメータを下記表４に示す：

表４： 当初の製剤ＶＪ７に対する製剤ＢＩＯＤ１０５及びＢＩＯＤ１０７の初期吸収速度の比較。
２０ポイント低下するまでの時間＝投薬後から血中グルコース濃度がベースラインよりも２０ポイント低下するまでの時間

ｔ−検定比較により、これら製剤の初期の吸収速度に統計的差異は認められないことが明らかとなった。濃度対時間プロファイルのプロットの曲線形状はわずかに異なるものの、初期の吸収速度曲線は、ほぼ重ね合わせることができた。これより、インスリンの作用発現は急速であることが保証される。

薬力学の結果を下記表５に示す。

表５：薬力学パラメータの計算。
２０ポイント低下するまでの時間＝投薬後から血中グルコース濃度がベースラインよりも２０ポイント低下するまでの時間
２０ポイント回復するまでの時間＝投薬後に、血中グルコースが最下点到達後から２０ポイント増加するまでの時間
持続時間は、２０ポイント低下した時刻と２０ポイント回復した時刻の間の時間である。

データは、ＥＤＴＡ二ナトリウムがＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムに置き換わり、またクエン酸イオンが増加しているにもかかわらず、当初の製剤と薬物動態的にもまた薬力学的にも類似した吸収プロファイルを実現したことを示している。

（実施例３）
マグネシウム塩を含有するインスリン製剤。
ＥＤＴＡ二ナトリウムを含有するインスリン製剤により得られた薬物動態、薬力学、及び注射部位の不快感に対して、マグネシウム塩が及ぼす影響を、ＨＵＭＬＡＯＧ（登録商標）と比較して評価した。ＨＵＭＬＡＯＧ（登録商標）は、１ミリリットル当たり以下を含有する：インスリンリスプロ１００ユニット、１６ｍｇのグリセリン、１．８８ｍｇのリン酸水素ナトリウム、３．１５ｍｇのメタクレゾール、含有量が０．０１９７ｍｇの亜鉛イオンとなるよう調整された酸化亜鉛、痕跡量のフェノール、及び注射用水。インスリンリスプロのｐＨは、７．０〜７．８である。ｐＨは、１０％塩酸及び／又は１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して調整する。

材料及び方法
インスリン製剤を、これまでに表１で記載したように調製した。

製剤を、ヒト志願者１２名で評価した。人口統計学／ベースライン情報、及び投薬の要約を表６に記載する。

表６． 人口統計学／ベースライン、及び投薬の要約

結果
ＢＩＯＤ１２３、ＢＩＯＤ１２５、及びＨＵＭＬＡＯＧ（登録商標）について、薬物動態（平均値±ＳＥ）を表７に示す。

ＥＤＴＡ及びマグネシウムに関して、ＢＩＯＤ−１２３（表１に示す）は、ＥＤＴＡ二ナトリウム及びＭｇＳＯ_４を含有し_、一方ＢＩＯＤ−１２５は、ＥＤＴＡ二ナトリウム（１．９８ｍｇ／ｍｌ）；クエン酸（２．７ｍｇ／ｍｌ）；グリセリン（１８ｍｇ／ｍｌ）；ｍ−クレゾール（３ｍｇ／ｍｌ）；ＣａＣｌ_２（３．３８ｍｇ／ｍｌ）；ｔｗｅｅｎ（１．５３ｍｇ／ｍｌ）を含有するが、マグネシウム化合物を含有しない。

表７．薬物動態（平均値±ＳＥ）

表７及び９に関して、ＡＵＣｉｎｓ０〜３０＝インスリンの０〜３０分曲線下面積；ＡＵＣｉｎｓ０〜４５＝インスリンの０〜４５分曲線下面積；ＡＵＣｉｎｓ０〜６０＝インスリンの０〜６０分曲線下面積；ＡＵＣｉｎｓ０〜１２０＝インスリンの０〜１２０分曲線下面積；ＡＵＣｉｎｓ０〜４８０＝インスリンの０〜４８０分曲線下面積；ＡＵＣｉｎｓ１２０〜４８０＝インスリンの１２０〜４８０分曲線下面積。

時間と関連する薬物動態（ＰＫ）パラメータ（メジアン）を表８に示す。
表８．時間に関連するＰＫパラメータ（メジアン）

薬力学（ＬＳ平均）を表９に示す。
表９．薬物動態（ＬＳ平均）
括弧内のｐ−値は予定されなかったが、またインスリンとリスプロのアッセイの間で差異が認められるので有効ではないと考えられる。ＡＵＣｉｎｓ０〜４５は予定外であった。

表１０．薬力学（ＬＳ平均）

ＧＩＲは、グルコース注入速度（ｍｇ／ｋｇ／分）、すなわち、インスリン注射後、一般的に８０〜１２０ｍｇ／ｄＬである正常血糖範囲に被験体を留めるのに必要とされるグルコース量である。ＧＩＲｍａｘは、ＴＧＩＲｍａｘの時に生じる最大グルコース注入速度である。最大速度の半分の速度は、ピーク前（ＧＩＲｅａｒｌｙ５０％）及びピーク後（ＧＩＲｌａｔｅ５０％）に、ＴＧＩＲ５０％ｅａｒｌｙ及びＴＧＩＲ５０％ｌａｔｅの時に生じる。ＧＩＲ曲線下面積を、全研究期間ＧＩＲＡＵＣ０〜４８０（ｍｇ／ｋｇ）、及び研究開始と終了の間の時間セグメント、０〜３０、０〜６０、０〜１２０、０〜１８０、及び１８０〜４８０分について見積もる。時間０〜６０分及び０〜４８０分における、平均濃度対時間プロファイルを示す図式表示を図２及び３にそれぞれ示す。図４及び５は、インスリン製剤ＢＩＯＤ１２３及び１２５についてＨｕｍａｌｏｇと比較した、時間（分）の関数として平均ＧＩＲ（ｍｇ／ｋｇ／分）を示すグラフである。

表７〜１０及び図２〜５に示す通り、ＢＩＯＤ−１２５（ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＣａＣｌ_２を含有し、マグネシウム化合物を含有しない）は、ＢＩＯＤ−１２３（ＥＤＴＡ二ナトリウム及びＭｇＳＯ_４を含有する）よりも急速なｉｎ ｖｉｖｏ吸収を示した。

注射部位の不快感に関する情報を以下の表に示す。表１１は、注射部位の不快感の結果−安全性母集団（ＬＳ平均）及び注射部位不快感の重症度を示す。
表１１． 注射部位の不快感の結果−安全性母集団（ＬＳ平均）及び注射部位不快感の重症度
注記：ＶＡＳ ０＝不快感無し、１００＝考え得る最悪；重症度 ０＝無し、１＝軽度等；相対的な不快感 ２＝通常未満、３＝通常に等しい等。
ＶＡＳ結果（算術平均±ＳＥ）；ＢＩＯＤ−１２３＝３．６±２．；ＢＩＯＤ−１２５＝６．８±２．９；Ｈｕｍａｌｏｇ＝１．８±１．１

表１２は、通常の食事時インスリン注射に関連した注射部位の不快感を示す。
表１２．通常の食事時インスリン注射に対する注射部位の不快感

不快感のタイプ、発現時間、及び持続時間に関する情報を表１３に示す。

表１３．

これまでに示した通り、マグネシウム化合物を含有する製剤（ＢＩＯＤ−１２３、ＭｇＳＯ_４）の方が、ＭｇＳＯ_４を含まない対応する化合物（ＢＩＯＤ−１２５）よりも、注射部位の不快感は有意に低減した。ＢＩＯＤ−１２３の不快感の持続時間は、ＢＩＯＤ−１２５よりも有意に短縮した（表１３）。

（実施例４）
注射部位の疼痛の低減及び超急速作用を実証する、ＢＩＯＤ−２５０及びＢＩＯＤ−２３８を用いたヒト研究
２つの超速効型インスリン類似体ベースの製剤、ＢＩＯＤ−２３８及びＢＩＯＤ−２５０に関する第１相臨床試験では、速効型インスリン類似体であるＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）（インスリンリスプロ）と比較して、薬物動態及び注射部位の忍容プロファイルが評価された。ＢＩＯＤ−２３８及びＢＩＯＤ−２５０は、Ｂｉｏｄｅｌ社が独自に保有する添加剤を市販された製剤であるＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と組み合わせたものである。ＢＩＯＤ−２５０の組成を表１に示す。ＢＩＯＤ−２３８は、マグネシウムを有さず、またＥＤＴＡ（０．２２５ｍｇ／ｍｌ）がより少ない点を除き、類似した組成を有する。

１型糖尿病の患者１２例において単一施設、ランダム化、二重盲検、３期交差試験を、オーストラリアで実施した。各治験薬を皮下に日を変えて投与した。薬物動態測定を、治験薬及びＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）中の有効成分を定量化するアッセイ法を用いて行った。臨床試験では、最大インスリン濃度の半分に達する時間の差異を測定する検出力が付与された。この研究で試験された仮説は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）からなるＢｉｏｄｅｌ社の製剤は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較して、同程度のピーク濃度からの減衰及び同程度の注射部位忍容性プロファイルを有しつつ、超急速吸収プロファイルを有するということであった。２つのアプローチ、すなわちＥＤＴＡ二ナトリウム濃度の低減（ＢＩＯＤ−２３８）、及び硫酸マグネシウムの添加（ＢＩＯＤ−２５０）が、注射部位の不快感を緩和するために採用されたが、これらはそれぞれ過去の研究で忍容を改善することが認められた。

ＢＩＯＤ−２３８及びＢＩＯＤ−２５０の薬物動態プロファイルは、類似体ベースの超速効型インスリンの目標とする製品プロファイルと整合することが証明された。ＢＩＯＤ−２３８及びＢＩＯＤ−２５０の吸収速度は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）のそれよりも有意に急速であったが、これは最大インスリン濃度の半分の濃度に達する平均時間（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）に対して、ＢＩＯＤ−２３８の場合ｐ＜０．００１及びＢＩＯＤ−２５０の場合ｐ＝０．００１）、及び最大インスリン濃度に達する時間（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）に対してＢＩＯＤ−２３８の場合ｐ＝０．０１３、及びＢＩＯＤ−２５０の場合ｐ＝０．０２５）が３５〜４５％減少したことにより示唆される。さらに、ＢＩＯＤ−２３８及びＢＩＯＤ−２５０の注射後の最初の３０分間に吸収される総インスリン量は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）について認められた量のおよそ二倍であった（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）に対して、ＢＩＯＤ−２３８の場合ｐ＜０．００１、及びＢＩＯＤ−２５０の場合ｐ＝０．００２）。ピーク到達後の最大濃度の半分の濃度に至る時間により示されるように、ピーク濃度からの減衰は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較してＢＩＯＤ−２３８及びＢＩＯＤ−２５０いずれについても有意に短縮した（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）に対してＢＩＯＤ−２３８の場合ｐ＝０．００９、及びＢＩＯＤ−２５０の場合ｐ＝０．０１６）。

局所的な注射部位の不快感は、１００ｍｍ視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）及び患者質問票を用いて測定した。不快感が考え得る最悪の場合、これを１００ｍｍと規定し、また不快感を有さない場合、これを０ｍｍと規定する。当該試験では、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較してＶＡＳスコアは数値的にはより低かったが、ＢＩＯＤ−２５０の場合顕著に異なってはいなかった（ＢＩＯＤ−２５０及びＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の平均ＶＡＳスコアは、それぞれ２．７ｍｍ及び８．２ｍｍ；ｐ＝ＮＳ）。ＢＩＯＤ−２３８のＶＡＳスコアは、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と関連した同スコアよりも有意に高かった（平均ＶＡＳスコアは２４．２ｍｍ、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）に対してｐ＝０．０２９）。ＢＩＯＤ−２３８、ＢＩＯＤ−２５０、及びＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の薬物動態プロファイル並びにこれらの注射部位の忍容プロファイルを、表１４及び１５にそれぞれ示す。

表１４： ＢＩＯＤ−２３８、ＢＩＯＤ−２５０、及びＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の薬物動態プロファイル

表１５： ＢＩＯＤ−２３８、ＢＩＯＤ−２５０、及びＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）の注射部位の忍容プロファイル
・データは、平均値±ＳＥＭを表す；メジアン値を括弧内に示す。
・１００ｍｍ視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）：０＝不快感無し、１００＝考え得る最悪の不快感
・絶対重症度スケール：０＝無し、１＝軽度、２＝中等度、３＝重度
・相対重症度（通常の食事時インスリン注射と比較）：１＝かなり低い、２＝低い、３＝同等、４＝高い、５＝非常に高い；＊ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）に対してｐ＜０．０５

結論として、この研究では、インスリンリスプロのＥＤＴＡ及びクエン酸塩製剤（ＢＩＯＤ−２３８及びＢＩＯＤ−２５０の両方）は、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較して、これよりも吸収速度は速く、またピーク濃度から速く減退することが実証される。さらに、ＢＩＯＤ−２５０中に硫酸マグネシウムが存在することにより、ＢＩＯＤ−２３８の超急速薬物動態プロファイルは変化することなく、局所的注射部位の不快感は有意に緩和される。

（実施例５）
糖尿病のミニブタにおける、市販のＵ−５００製剤と比較した時の速効型濃縮インスリン製剤のＰＫ及びＰＤ
本研究の狙いは、食事の際に用いるように設計された新規Ｕ−４００濃縮インスリン製剤について、その薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）特性を評価することであった。

方法及び材料
製剤ＢＩＯＤ−５３０の組成は次の通りであった：３．６ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ、１．８ｍｇ／ｍｌのクエン酸三ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール、１６ｍｇ／ｍｌのグリセリン、１２．１２ｍｇ／ｍｌのインスリン（４００Ｕ／ｍＬ）。

糖尿病のミニブタ最大１０匹に、連日投与されるインスリンの代わりに０．２５Ｕ／ｋｇのＬｉｌｌｙ Ｕ−５００Ｒ又はＢＩＯＤ−５３０を午前中に注射した。動物にはブタ飼料５００ｇを投薬直後に与え、そして血漿サンプルを、投薬後−３０、−２０、−１０、０、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、及び４８０分に、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｋ_２ＥＤＴＡバキュテーナーを用いて収集した。凍結血漿をインスリン含有量についてアッセイし（ｉｓｏｉｎｓｕｌｉｎキット、Ｍｅｒｃｏｄｉａ、米国）、またグルコース濃度について分析した（ＹＳＩ３２００ ａｎａｌｙｚｅｒ、ＹＳＩ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）。

結果：
薬物動態プロファイルを図６に図式的に示し、また計算したＰＫパラメータを表１７に示す。
表１７： 計算したＰＫパラメータ：

薬力学を、時間に対するベースラインを差し引いた平均グルコース値として図６に図式的に示す。

結論
データは、濃縮インスリン製剤は、Ｌｉｌｌｙ Ｕ−５００市販製剤と比較して急速作用プロファイルを有することを示す。ＢＩＯＤ−５３０製剤の急速性は、食事の際に利用するのに十分と考えられる。

（実施例６）
糖尿病のミニブタにおける、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）（Ｕ−１００）とＢＩＯＤ−５３０及びＢＩＯＤ−５３１との比較。
本研究の狙いは、食事の際に用いる速効型Ｕ−１００類似体インスリンであるＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と比較して、マグネシウムを含むＵ−４００濃縮インスリン製剤（ＢＩＯＤ−５３１）（表１）及びマグネシウムを含まない製剤（ＢＩＯＤ−５３０）（実施例４を参照）の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）特性を評価することであった。

方法及び材料
製剤ＢＩＯＤ−５３０の組成は次の通りであった：３．６ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ、１．８ｍｇ／ｍｌのクエン酸三ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール、１６ｍｇ／ｍｌのグリセリン、１２．１２ｍｇ／ｍｌのインスリン（４００Ｕ／ｍＬ）。ＢＩＯＤ−５３１は、ＢＩＯＤ−５３０と同一の組成物であったが、注射部位の忍容性の改善を意図して４ｍｍのＭｇＳＯ_４が添加された。

交差研究デザインを用いて、糖尿病のミニブタ９匹に、連日投与されるインスリンの代わりに、０．２５Ｕ／ｋｇのＢＩＯＤ−５３０、ＢＩＯＤ−５３１、又はＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）を午前中に注射した。動物にはブタ飼料５００ｇを投薬直後に与え、そして血漿サンプルを、投薬後−３０、−２０、−１０、０、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、及び４８０分に、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｋ_２ＥＤＴＡバキュテーナーを用いて収集した。凍結血漿をインスリン含有量についてアッセイし（ｉｓｏ ｉｎｓｕｌｉｎキット、Ｍｅｒｃｏｄｉａ）、またグルコース濃度について分析した（ＹＳＩ３２００ ａｎａｌｙｚｅｒ、ＹＳＩ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）。

結果：
時間に対するベースラインを差し引いた平均インスリン濃度及びグルコース濃度を図７に示す。薬物動態パラメータを表１８に示す。最大濃度に達する時間Ｔｍａｘは製剤全体を通じて類似したが、一方最大濃度の半分の濃度に達する時間（１／２Ｔｍａｘ）は、ＢＩＯＤ製剤で早まる傾向が認められた。

表１８： ＢＩＯＤ−５３０、ＢＩＯＤ−５３１、及びＨＵＭＬＯＧ（登録商標）の薬物動態プロファイル

結論：製剤にマグネシウムを添加しても、ＢＩＯＤ−５３０の薬物動態又は薬力学プロファイルは変化しなかった。さらに、濃縮製剤であるＢＩＯＤ−５３０及び５３１のいずれも、少なくともＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）と同等に急速吸収性であり、またその作用発現はＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）より若干速かった。総作用持続時間については、Ｕ−４００製剤の方がＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）よりも長かった。

（実施例７）
糖尿病のミニブタにおけるＥＤＴＡ二ナトリウムの低減と急速吸収性の喪失。
この研究の目的は、超急速吸収薬物動態プロファイルを維持するのに有効である最低ＥＤＴＡ濃度を見つけることであった。ＢＩＯＤ−５３０よりもＥＤＴＡ濃度が連続的に低減した２つの製剤を作製した。

ＢＩＯＤ−５３２は、２．７ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ二ナトリウムを有し、またＢＩＯＤ−５３３は、１．８ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ二ナトリウムを有していた。その他の構成成分は、ＢＩＯＤ−５３０の組成と同一のままであった（実施例４を参照）。

交差研究デザインを用いて、糖尿病のミニブタ９匹に、連日投与されるインスリンの代わりに、０．２５Ｕ／ｋｇのＢＩＯＤ−５３０、ＢＩＯＤ−５３２、又はＢＩＯＤ−５３３を午前中に注射した。動物にはブタ飼料５００ｇを投薬直後に与え、そして血漿サンプルを、投薬後−３０、−２０、−１０、０、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、及び４８０分に、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｋ_２ＥＤＴＡバキュテーナーを用いて収集した。凍結血漿をインスリン含有量についてアッセイし（ｉｓｏ ｉｎｓｕｌｉｎキット、Ｍｅｒｃｏｄｉａ）、またグルコース濃度について分析した（ＹＳＩ３２００ ａｎａｌｙｚｅｒ、ＹＳＩ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）。

結果：濃度対時間プロファイルを図８に示し、また薬物動態パラメータを表１９に示す。ＡＵＣ及びＣｍａｘは、製剤全体を通じて一定だったが、ＥＤＴＡ添加量が少なくなるに従い、吸収の早期発現は認められなくなった。
表１９： ＢＩＯＤ−５３０、ＢＩＯＤ−５３２、及びＢＩＯＤ−５３３の薬物動態プロファイル

結論：インスリン吸収の急速発現を維持するためには、２．７ｍｇ／ｍＬを上回るＥＤＴＡ二ナトリウムを使用しなければならない。

（実施例８）
改善した食事時超急速吸収を実現し、また基礎吸収がインスリンリスプロプロタミンミックスに類似した新規の濃縮組換えヒトインスリン製剤

背景及び狙い：Ｕ−１００組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）の製剤並びにＥＤＴＡ及びクエン酸塩を含有するインスリンリスプロ（ＩＬ）の製剤では、ＲＨＩ及びＩＬの市販製剤と比較して、ヒトに皮下（ｓｃ）注射した後の吸収速度に向上が認められる。ＢＩＯＤ−５３０及びＢＩＯＤ−５３１は、ＲＨＩ濃度が４００Ｕ／ｍｌの類似したＥＤＴＡ／クエン酸塩製剤である。糖尿病のブタにおける過去の研究では、ＢＩＯＤ−５３０は、有意により迅速な発現、並びにより大きな注射容積を必要とする２型糖尿病患者における食事時の適用範囲（ｐｒａｎｄｉａｌ ｃｏｖｅｒａｇｅ）及び基礎的な適用範囲（ｂａｓａｌ ｃｏｖｅｒａｇｅ）の両方を提供するＲＨＩ Ｕ−５００と類似した作用持続期間を有した。ＢＩＯＤ−５３１は、ＥＤＴＡに関連する注射部位の不快感を緩和するようにＭｇＳＯ_４を用いて開発された。この研究の狙いは、糖尿病のミニブタにおいて、ＢＩＯＤ−５３１の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）プロファイルを、糖尿病患者において食事時の適用範囲及び基礎的な適用範囲のいずれも提供する、ＩＬ−プロタミン（ＩＬＰ）とＩＬの５０／５０（ＩＬＰ／ＩＬ ５０／５０）及び７５／２５（ＩＬＰ／ＩＬ ７５／２５）の各混合物からなるＵ−１００製剤と比較することであった。

材料及び方法：ＩＬＰ／ＩＬ ７５／２５、ＩＬＰ／ＩＬ ５０／５０及びＢＩＯＤ−５３１から構成される試験製剤。各交差研究が行われる午前中に、試験製剤を糖尿病のミニブタにｓｃにて（０．２５Ｕ／ｋｇ）食前投薬した。研究１及び研究２では、ＢＩＯＤ−５３１をＩＬＰ／ＩＬ ７５／２５及びＩＬＰ／ＩＬ ５０／５０とそれぞれ比較した。血中グルコース及び血漿インスリンを、投薬後−３０〜４８０分にサンプリングした。血漿インスリン測定をＥＬＩＳＡ法により、及びグルコース濃度測定をＹＳＩにより行った。最大半量濃度に達するまでの時間（Ｔ_{５０％ｅａｒｌｙ}）をブタ毎に計算し、試験項目毎に平均した。各研究の結果について、Ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｔ−検定を用いて、ＢＩＯＤ−５３１とＩＬＰ／ＩＬ ７５／２５又は５０／５０混合物と比較した。

結果：濃度対時間プロファイルを図９に示す；ＢＩＯＤ−５３０及びＩＬに対応するデータを参考として含める。インスリン濃度は、ＢＩＯＤ−５３１注射後、ＩＬＰ／ＩＬのいずれの混合物と比較しても、より高いピークまで上昇した。より高いピークまで上昇したにもかかわらず、ＢＩＯＤ−５３１のＴ_{５０％ｅａｒｌｙ}（分）及びＡＵＣ_{０〜３０分}（μＵ／ｍｌ^＊分）として表される吸収速度（それぞれ、研究１：２５±５及び１５８２±３９７；研究２：１１±２及び１４７５±１３４）は、ＩＬＰ／ＩＬ ７５／２５（それぞれ、３５±６及び３５１±８２^＊）又はＩＬＰ／ＩＬ ５０／５０（それぞれ、２３±３^＊及び７７７±１２８^＊）より速く、またグルコース濃度のより急速な減衰を引き起こした（^＊ＢＩＯＤ−５３１に対してｐ＜０．０５）。総ＡＵＣ_{１８０〜４８０分}の百分率として表される作用の持続時間は、製剤全体を通じて類似した：ＢＩＯＤ−５３１（３２〜４３％）、ＩＬＰ／ＩＬ ７５／２５（４５％）、及びＩＬＰ／ＩＬ ５０／５０（３５％）。ＩＬ投与後約２４０分付近で、インスリン及びグルコース濃度はベースラインレベルに向かって戻ったものの、３製剤すべてのグルコース濃度は、最長４８０分まで抑制された状態に留まった。

結論：ＢＩＯＤ−５３１では、ＩＬに匹敵する急速な作用発現及びＩＬＰ／ＩＬ事前混合型インスリンに類似した基礎的制御プロファイルが認められる。ＢＩＯＤ−５３１は、食事時の適用範囲について改善をもたらし、また注射容積が小さい事前混合型インスリンに匹敵する基礎的適用範囲をもたらす可能性を有する。

Claims (23)

1. 注射用インスリン製剤であって、有効量の溶解／安定化剤、及び有効量のキレート剤、及び前記インスリン内の亜鉛をキレート化するための１つ又は複数のマグネシウム化合物を含み、注射部位の不快感が、ＥＤＴＡナトリウムを有するが前記１つ又は複数のマグネシウム化合物が存在しない製剤よりも少ない、注射用インスリン製剤。
2. 前記インスリンが、ヒト組換えインスリンである、請求項１に記載の製剤。
3. 前記インスリンが、インスリン類似体である、請求項１に記載の製剤。
4. 前記インスリンの濃度が、１００、２００、４００、又は５００Ｕ／ｍＬである、請求項１に記載の製剤。
5. 前記１つ又は複数のマグネシウム化合物が、無機マグネシウム塩、有機マグネシウム塩、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の製剤。
6. 前記無機マグネシウム塩が、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）_２）、硫酸マグネシウム（Ｍｇ（ＳＯ_４）_２）、ハロゲン化マグネシウム、例えば、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、臭化マグネシウム（ＭｇＢｒ_２）、及びヨウ化マグネシウム（ＭｇＩ_２）；ピロリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム七水和物、酸化マグネシウム（ＭｇＯ_２）、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載の製剤。
7. 前記有機マグネシウム塩が、ＥＤＴＡマグネシウム、乳酸マグネシウム、アミノ酸キレート、例えばアスパラギン酸マグネシウム；酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣＯ_３）_２）、クエン酸マグネシウム、及びグルコン酸マグネシウムからなる群より選択される、請求項４に記載の製剤。
8. 前記１つ又は複数のマグネシウム化合物が、Ｍｇ（ＯＨ）_２、ＭｇＳＯ_４、ＥＤＴＡマグネシウム、又はこれらの組み合わせである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製剤。
9. 前記１つ又は複数のマグネシウム化合物の濃度が、約０．１〜約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜約２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．２〜約２ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
10. 約０．２〜０．３ｍｇ／ｍｌのＭｇ（ＯＨ）_２、約１．７〜２．０のＥＤＴＡマグネシウム、約０．４〜０．５の硫酸マグネシウム、又はこれらの組み合わせを含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
11. 前記溶解／安定化剤が、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、アスパラギン酸、マイレン酸、フマル酸、アジピン酸、及びこれらの塩からなる群より選択される、請求項１に記載の製剤。
12. 前記溶解／安定化剤が、クエン酸イオンを形成し、及びｐＨが約７である、請求項１に記載の製剤。
13. 前記溶解／安定化剤が、クエン酸又はクエン酸ナトリウムである、請求項１１に記載の製剤。
14. 前記溶解／安定化剤が、２．０×１０^−４Ｍ〜４．５×１０^−３Ｍの範囲のクエン酸又はクエン酸ナトリウムである、請求項１１に記載の製剤。
15. 前記溶解／安定化剤が、７×１０^−３Ｍ及び２×１０^−２Ｍの範囲のクエン酸又はクエン酸ナトリウムである、請求項１に記載の製剤。
16. 前記溶解／安定化剤が、約９．３７×１０^−３Ｍ又は約１．４×１０^−２Ｍのクエン酸又はクエン酸ナトリウムである、請求項１に記載の製剤。
17. 塩化カルシウムをさらに含む、請求項１に記載の製剤。
18. グリセリン及びｍ−クレゾールをさらに含む、請求項１に記載の製剤。
19. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡナトリウムである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製剤。
20. １００Ｕ／ｍｌのヒト組換えインスリン、約１．５ｍｇ／ｍｌの無水クエン酸、約１．５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡナトリウム、約１８ｍｇ／ｍｌのグリセリン、約０．４８１ｍｇ／ｍｌのＭｇＳＯ_４、及び約３．０ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾールを含む、ｐＨが約７．０のインスリン製剤。
21. ４００Ｕ／ｍＬのヒト組換えインスリン、３．６ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ、１．８ｍｇ／ｍｌのクエン酸三ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌのｍ−クレゾール、１６ｍｇ／ｍｌのグリセリン、１２．１２ｍｇ／ｍｌのインスリン（４００Ｕ／ｍＬ）、及び０．４８１ｍｇ／ｍｌのＭｇＳＯ_４を含むインスリン製剤。
22. 糖尿病を有する個体を処置する方法であって、有効量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載の製剤を、前記個体に注射するステップを含む、方法。
23. 糖尿病を有する個体の注射部位の疼痛を軽減する方法であって、有効量の請求項１に記載の製剤を、前記個体に注射するステップを含む、方法。