PL214718B1 - Tricykliczny antagonista receptora trombinowego, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna i jego zastosowanie - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy podstawionego tricyklicznego antagonisty receptora trombinowego, farmaceutycznej kompozycji zawierającej ten związek i jego zastosowania w leczeniu chorób związanych z zakrzepicą, miażdżycą tętnic, nawrotem zwężenia, nadciśnieniem, dusznicą bolesną, arytmią serca, niewydolnością serca, niedokrwieniem mózgu, udarem, chorobami zapalnymi, chorobami neurodegeneratywnymi i rakiem. Ujawniono także kombinację nowego związku i innych środków sercowonaczyniowych.

Wiadomo, że trombina ma różne aktywności w różnych typach komórek i wiadomo, że receptory trombinowe występują w takich typach komórek jak ludzkie płytki krwi, komórki naczyniowych mięśni gładkich, komórki śródbłonkowe i fibroblasty. Zatem możliwe, że antagoniści receptora trombinowego, także znani jako antagoniści receptora aktywującego proteazę (PAR), będą użyteczni w leczeniu chorób zakrzepowych, zapalnych, miażdżycowych i fibroproliferatywnych, jak i innych chorób w których trombina i jej receptory pełnią patologiczną rolę.

Peptydowi antagoniści receptora trombinowego zostali zidentyfikowani w oparciu o badania strukturalnej aktywności obejmujące podstawianie aminokwasów w receptorach trombinowych. Bernatowicz i in., J. Med. Chem. tom 39, str. 4879-4887(1996), ujawnili tetra- i pentapeptydy o aktywności silnych antagonistów receptora trombinowego, np. N-transcynamoilo-p-fluoroPhe-p-guanidynoPhe-Leu-Arg-NH₂ i N-transcynamoilo-p-fluoroPhe-p-guanidynoPhe-Leu-Arg-Arg-NH2. Peptydowych antagonistów receptora trombinowego ujawniono w publikacji WO 94/03479, opublikowanej 17 lutego, 1994.

Podstawione tricykliczne związki będące antagonistami receptora trombinowego ujawniono w patentach USA o numerach US 6063847, US 6326380 i zgłoszeniach o patent USA o numerach 09/880222(WO 01/96330) i 10/271715.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze

albo jego farmaceutycznie dopuszczalny izomer, sól lub solwat. Korzystnie ten związek jest w postaci soli - wodorosiarczanu.

Przedmiotem wynalazku jest także farmaceutyczna kompozycja zawierająca składnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, która jako składnik aktywny zawiera skuteczną ilość powyższego związku.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie powyższego związku do wytwarzania leku do leczenia zakrzepicy, miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia, nadciśnienia, dusznicy bolesnej, arytmii serca, niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego, udaru zakrzepowego, udaru zakrzepowozatorowego, chorób obwodowego układu naczyniowego.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powyższego związku w kombinacji z dodatkowym środkiem sercowo- naczyniowym do wytwarzania leku do leczenia zakrzepicy, miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia, nadciśnienia, dusznicy bolesnej, arytmii serca, niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego, udaru zakrzepowego, udaru zakrzepowo-zatorowego, chorób obwodowego układu naczyniowego.

Związek według niniejszego wynalazku mieści się w grupie antagonistów receptora trombinowego o wzorze (I):

PL 214 718 B1

albo farmaceutycznie dopuszczalnych soli albo solwatów, w którym:

pojedyncza przerywana linia oznacza ewentualne pojedyncze wiązanie; -· --- oznacza ewentualne podwójne wiązanie; n wynosi 0 do 2;

Q oznacza

₁

R¹ jest niezależnie wybrany z grupy składającej się z H, grupy (C1 (C1-C6)alkilo-, difluoro(C1-C6)alkilo-, trifluoro(C1-C6)alkilohydroksy(C1-C6)alkilo- i amino (C1-C6)-alkilo-;

₂

R² jest niezależnie wybrany z grupy składającej (C1-C6)alkilo-, difluoro(C1-C6)alkilo-, trifluoro(C1-C6)alkilohydroksy(C1-C6)alkilo-, i amino(C1-C6)alkilo-;

-SO2R¹⁷, -C(O)OR¹ (C1-C6)alkilowej, atom fluorowca, grupę fluoro(C1-C6)alkilo-, difluoro(C1C6)alkilo-, trifluoro(C1-C6)alkilo-, (C3-C6)-cykloalkilowej, (C3-C6)cykloalkilo(C1-C6)alkilo-, (C2-C6)alkenylowej, arylo(C1-C6)alkilo-, arylo(C2-C6)alkenylo-, heteroarylo(C1-C6)alkilo-, heteroarylo(C2-C6)alkenylo-, hydroksy(C1-C6)alkilo-, -NR²²R²³, NR²²R²³-(C1-C6)alkilo-, aryIowej, tio(C1-C6)alkilo-, (C1-C6)alkilotio(C1-C6)alkilo-, (C1-C6)aIkoksy(C1-C6)alkilo-, NR¹⁸R¹⁹-C(O)-(C1-C6)alkiIo- albo (C3-C6)cykloalkilo(C1-C6)alkilo-;

Het oznacza mono- albo bi-cykliczną grupę heteroarylową o 5 do 10 atomach zawierającą od 1 do 9 atomów węgla i 1 do 4 heteroatomów niezależnie wybranych z grupy składającej się z atomów N, O i S, przy czym pierścieniowy atom azotu może tworzyć grupę N-tlenku, albo czwartorzędową grupę z grupą C1-C4-alkilową, i przy czym Het jest przyłączony do B przez pierścieniowy atom węgla, i przy czym grupa Het jest podstawiona przez W;

W oznacza 1 do 4 podstawników niezależnie wybranych z grupy składającej się z H, grupy (C1-C6)alkilowej, fluoro(C1-C6)alkilo-, difluoro(C1-C6)alkilo-, trifluoro(C1-C6)alkilo-, (C3-C6)cykloalkilowej, hydroksy(C1-C6)alkilo-, dihydroksy(C1-C6)alkilo-, NR²⁵R²⁶-( C1-C6)alkilo-, tio(C1-C6)alkilo-, -OH, (C1-C6)alkoksylowej, atomu fluorowca, grupy -NR⁴R⁵, -C(O)OR¹⁷, -C(O)R¹⁶, (C₁-C₆)alkilotio-, R²¹-arylowej,

R²¹-arylo(C1-C6)alkilo-, arylowej, przy czym sąsiadujące atomy węgla tworzą pierścień obejmujący 21 grupę metylenodioksylową, i grupę R²¹-heteroarylową;

R⁴ i R⁵ są niezależnie wybrane z grupy składającej się z H, grupy (C1-C6)alkilowej, fenylowej, 45 benzylowej i (C3-C6)-cykloalkilowej, albo R⁴ i R⁵ razem wzięte tworzą grupę -(CH2)4-, -(CH2)5- albo -(CH2)2NR⁷-(CH2)2- i tworzą pierścień z atomem azotu, do którego są przyłączone;

(C3-C6)cykloalkilowej,

-C6)alkilowej, fluoro (C2-C6)alkenylowej, się z H, grupy (C1-C6)alkilowej, fluoro(C3-C6)cykloalkilowej, (C2-C6)alkenylowej,

R³ oznacza H, OH, grupę (C1-C6)alkoksylową, -SOR¹⁶, -(C1-C6)alkiIo-C(O)NR¹⁸R¹⁹

-C(O)NR¹⁸R¹⁹,

R⁶ oznacza H, grupę (C1-C6)alkilową lub fenylową;

R⁷ oznacza H, grupę (C1-C6)alkilową, -C(O)-R¹⁶, -C(O)OR¹⁷ lub -SO2R

PL 214 718 B1 ft 1 η 11 11

R⁸, R¹⁰ i R¹¹ są niezależnie wybrane z grupy składające] się z R¹ i -OR¹, pod warunkiem że gdy 10 występuje ewentualne podwójne wiązanie, to R¹⁰ nie występuje;

R⁹ oznacza H, OH albo grupę (C1-C6)alkoksylową;

B oznacza -(CH₂)_n3-, cis albo trans -(CH₂)_n4CR¹²=CR^12a(CH₂)_n5 albo -(CH₂)_n4CnC(CH₂)_n5-, w któ12 12a rych n3 wynosi 0 do 5, n4 i n5 niezależnie wynoszą 0 do 2, a R¹² i R^12a są niezależnie wybrane z grupy składającej się z H, grupy (C1-C6) alkilowej i atomu fluorowca;

X oznacza -O- albo -NR⁶- gdy przerywana linia oznacza pojedyncze wiązanie, albo X oznacza20

OH lub -NHR , gdy wiązanie nie występuje;

Y oznacza =O, =S, (Η, Η), (H, OH) albo (H, (C1-C6)alkoksy) gdy przerywana linia oznacza pojedyncze wiązanie, albo gdy wiązanie nie występuje, Y oznacza =O, (Η, H), (H, OH), (H, SH) albo (H, (C1-C6)alkoksy);

R¹³, każdy, jest niezależnie wybrany z H, grupy (C1-C6)alkilowej, (C3-C8)cykloalkilowej, -(CH2)n6NHC(O)OR^16b, -(CH2)n6NHC(O)R^16b, -(CH2)n6NHC(O)NR⁴R⁵, -(CH2)n6NHSO2R¹⁶,

-(CH2)n6NHSO2NR⁴R⁵, i -(CH2)n6C(O)NR²⁸R²⁹ gdzie n6 wynosi 0 do 4, grupy fluorowcoalkilowej i atomu fluorowca;

R¹⁴, każdy, jest niezależnie wybrany z H, grupy (C1-C6)alkilowej, -OH, (C1-C6)alkoksylowej,

R²⁷-arylo(C1-C6)alkilowej, heteroarylowej, heteroaryloalkilowej, heterocyklilowej, heterocykliloalkiIowej, -(CH2)n6NHC(O)OR^16b, -(CH2)n6NHC(O)R^16b, -(CH2)n6NHC(O)NR⁴R⁵, -(CH2)n6NHSO2R¹⁶, -(CH2)n6NHSO2NR⁴R⁵, i -(CH2)n6C(O)NR²⁸R²⁹ gdzie n6 wynosi 0 do 4, atomu fluorowca i grupy fluorowcoalkilowej; albo

14

R¹³ i R¹⁴, razem wzięte, tworzą pierścień spirocykliczny lub heterospirocykliczny o 3-6 atomach;

14 przy czym co najmniej jeden z R¹³ lub R¹⁴ jest wybrany z grupy składającej się z -(CH2)n6NHC(O)OR^16b, -(CH2)n6NHC(O)R^16b, -(CH2)n6NHC(O)NR⁴R⁵, -(CH2)n6NHSO2R^16b,

-(CH2)n6NHSO2R¹⁶, -(CH2)n6NHSO2NR⁴R⁵, i -(CH2)n6C(O)NR²⁸R²⁹ gdzie n wynosi 0 do 4;

R¹⁵ nie występuje, gdy przerywana linia oznacza pojedyncze wiązanie i oznacza H, grupę (C1-C6)alkilową, -NR¹⁸R¹⁹, albo -OR¹⁷, gdy wiązanie nie występuje;

R¹⁶ jest niezależnie wybrany z grupy składającej się z grupy (C1-C6)alkilowej, fenylowej i benzylowej;

R^16b oznacza H, grupę alkoksylową, (C1-C6)alkilową, (C1-C6)alkoksy(C1-C6)alkilo-, R²²-O-C(O)21 21 (C1-C6)alkilo-, (C3-C6)cykloalkilową, R²¹-arylową, R²¹-arylo(C1-C6)alkilową, fluorowcoalkilową, alkenylową, fluorowcopodstawioną grupę alkenylową, alkinylową, fluorowcopodstawioną grupę alkinylową, R²¹-heteroarylową, R²¹-(C1-C6)alkiloheteroarylową, R²¹-(C1-C6)alkiloheterocykloalkilową, R²⁸R²⁹N-(C1-C6)alkilową, R²⁸R²⁹N-(CO)(C1-C6)alkilową, R²⁸R²⁹N-(CO)O(C1-C6)alkilową, R²⁸O(CO)N(R²⁹)(C1-C6)alkilową, R²⁸S(O)2N(R²⁹)(C1-C6)alkilową, R²⁸R²⁹N-(CO)N(R²⁹)-(C1-C6)alkilową, R²⁸R²⁹N-S(O)2N-(R²⁹)-(C1-C6)-alkilową, R²⁸-(CO)N(R²⁹)-(C1-C6)alkilową, R²⁸R²⁹N-S(O)2-(C1-C6)alkilową, HOS(O)2-(C1-C6)alkilową, (OH)2P(O)2(C1-C6)alkilową, R²⁸-S-(C1-C6)alkilową, R²⁸-S(O)2-( C1-C6)alkilową albo hydroksy(C1-C6)alkilową;

R¹⁷, R¹⁸ i R¹⁹ są niezależnie wybrane z grupy składającej się z H, grupy (C1-C6) alkilowej, fenylowej, i benzylowej;

R²⁰ oznacza H, grupę (C1-C6) alkilową, fenylową, benzylową, -C(O)R⁶ lub -SO2R⁶;

R²¹ oznacza 1 do 3 podstawników niezależnie wybranych z grupy składającej się H, CN, -CF3, -OCF3, atomu fluorowca, -NO2, grupy (C1-C6)alkilowej, -OH, (C1-C6)alkoksylowej, (C1-C6)-alkiloamino-, di((C1-C6)alkilo)amino-, NR²⁵R²⁶(C1-C6)alkilo-, hydroksy(C1-C6)alkilo-, -C(O)OR¹⁷, -COR¹⁷, -NHCOR¹

-NHSO₂R¹⁶, -NHSO2CH2CF3-, C(O)NR²⁵R²⁶, -NR²⁵-C(O)-NR²⁵R²⁶, -S(O)R¹³, -S(O)2R¹³ i -SR¹³;

R²² oznacza H lub grupę (C1-C6)alkilową;

R²³ oznacza H, grupę (C1-C6)alkilową, -C(O)R²⁴, -SO2R²⁴, -CONHR²⁴ albo -SO2NHR²⁴;

R²⁴ oznacza grupę (C1-C6) alkilową, hydroksy(C1-C6)alkilową albo NR²⁵R²⁶-((C1-C6)alkilo)-;

R²⁵ i R²⁶ są niezależnie wybrane z grupy składającej się z H i grupy (C1-C6)alkilowej;

R²⁷ oznacza 1, 2 albo 3 podstawniki wybrane z grupy składającej się z H, grupy (C1-C6)alkilowej, (C3-C6)cykloalkilowej, (C1-C6)alkoksylowej, atomu fluorowca i -OH; a

R²⁸ i R²⁹ są niezależnie wybrane z grupy składającej się z H, grupy (C1-C6) alkilowej, (C1-C6)alko27 ksylowej, R²⁷-arylo(C1-C6)alkilowej, heteroarylowej, heteroarylo-alkilowej, hydroksy(C1-C6)alkilowej, (C1-C6)alkoksy-(C1-C6)alkilowej, heterocyklilowej, heterocykliloalkilowej, i fluorowcoalkilowej; albo

26

26

R²⁸ i R²⁹, razem wzięte, tworzą spirocykliczny lub heterospirocykliczny pierścień o 3-6 atomach. Powyższe związki będące antagonistą receptora trombinowego mogą mieć aktywność przeciw zakrzepową, przeciw agregacji płytek krwi, przeciw miażdżycową, przeciw nawrotowi zwężenia i/albo przeciw krzepnięciu krwi. Związane z zakrzepicą choroby leczone takimi związkami obejmują zakrzePL 214 718 B1 picę, miażdżycę tętnic, nawrót zwężenia, nadciśnienie, dusznicę bolesną, arytmię serca, niewydolność serca, zawał mięśnia sercowego, zapalenie kłębuszkowe nerek, udar zakrzepowy, udar zakrzepowozatorowy, choroby obwodowego układu naczyniowego i inne choroby sercowo-naczyniowe, niedokrwienie mózgu, choroby zapalne i raka, jak też inne choroby, w których trombina i jej receptor pełnią patologiczną rolę.

Związki o wzorze (I) mogą być stosowane w kombinacji co najmniej jednego związku o wzorze (I) z jednym, albo więcej, dodatkowym środkiem sercowo-naczyniowym do leczenia zakrzepicy, agregacji płytek krwi, krzepnięcia krwi, raka, chorób zapalnych albo chorób układu oddechowego. A sposób leczenia obejmuje podawanie kombinacji co najmniej jednego związku o wzorze (I) i co najmniej jednego dodatkowego środka sercowo-naczyniowego ssakowi potrzebującemu takiego leczenia. W szczególności, taką kombinację stosuje się do leczenia zakrzepicy, miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia, nadciśnienia, dusznicy bolesnej, arytmii serca, niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego, zapalenia kłębuszków nerkowych, udaru zakrzepowego, udaru zakrzepowo-zatorowego, chorób obwodowego układu sercowo-naczyniowego, niedokrwienia mózgu, raka, reumatoidalnego zapalenia stawów, liszaja rumieniowatego układowego, stwardnienia rozsianego, cukrzycy, osteoporozy, niewydolności nerek, udaru mózgu, niedokrwienia mózgu, zapalenia nerek, chorób zapalnych płuc i drogi żołądkowo-jelitowej, odwracalnego zaczopowania dróg oddechowych, chronicznej astmy albo zapalenia oskrzeli. Rozważa się, że taka kombinacja może być użyteczna w leczeniu więcej niż jednej z wymienionych chorób.

Odpowiednia farmaceutyczna kompozycja zawiera terapeutycznie skuteczną ilość kombinacji co najmniej jednego związku o wzorze (I) i co najmniej jednego dodatkowego środka sercowonaczyniowego w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

Zastosowania antagonisty receptora trombinowego mogą obejmować stosowanie ujawnionego w dowolnym z patentów US 6063847, US 6326380, zgłoszeń patentowych 09/880222 i 10/271715, w kombinacji z jednym, albo więcej, dodatkowym środkiem sercowo-naczyniowym, do leczenia zakrzepicy, miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia, nadciśnienia, dusznicy bolesnej, arytmii serca, niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego, zapalenia kłębuszków nerkowych, udaru zakrzepowego, udaru zakrzepowo-zatorowego, chorób obwodowego układu sercowo-naczyniowego, niedokrwienia mózgu, raka, reumatoidalnego zapalenia stawów, liszaja rumieniowatego układowego, stwardnienia rozsianego, cukrzycy, osteoporozy, niewydolności nerek, udaru mózgu, niedokrwienia mózgu, zapalenia nerek, chorób zapalnych płuc i drogi żołądkowo-jelitowej, odwracalnego zaczopowania dróg oddechowych, chronicznej astmy albo zapalenia oskrzeli.

Ponadto taka kombinacja może być dostarczana jako zestaw zawierający w jednym opakowaniu co najmniej jeden związek o wzorze (I) w farmaceutycznej kompozycji, i co najmniej jedną oddzielną farmaceutyczną kompozycją zawierającą środek sercowo-naczyniowy.

Dla związków przedstawionych wzorem (I) korzystne znaczenia podstawników są następujące:

Korzystnie n wynosi 0 do 2, a bardziej korzystnie 0. Korzystnie ewentualne podwójne wiązanie nie występuje (tj. wiązanie jest wiązaniem pojedynczym).

Q korzystnie oznacza:

CH3. Korzystnie R¹⁴ oznacza H lub -CH3. Dla pięcioczłonowego pierścienia Q korzystnie nie więcej niż 13 14 dwa podstawniki R¹³ i R¹⁴ mają znaczenia inne niż H. Dla sześcioczłonowego pierścienia Q, korzystnie 13 14 nie więcej niż cztery podstawniki R¹³ i R¹⁴ mają znaczenia inne niż H, bardziej korzystnie nie więcej niż 13 14 dwa podstawniki R¹³ i R¹⁴ mają znaczenia inne niż H.

Szczególnie korzystnie pierścienie Q to:

PL 214 718 B1

odpowiednio.

16b

W powyższych korzystnych pierścieniach Q, R korzystnie oznacza -(CH2)n6NHC(O)OR¹

-(CH2)n6NHC(O)R^16b, -(CH2)n6NHC(O)NR⁴R⁵, -(CH2)n6NHSO2R¹⁶ albo -(CH2)n6NHSO2NR⁴R⁵ w których n6 wynosi 0 do 2, i R^16b, R¹⁶ i R⁴ oznaczają grupę (C1-C6) alkilową a R⁵ oznacza H. Bardziej korzystne są związki o wzorze (I) w których R oznacza -NHC(O)OR^16b, -NHC(O)R^16b, -NHC(O)NR⁴R⁵,

-NHSO₂R¹⁶ albo -NHSO2NR⁴R⁵ w których R^16b, R¹⁶ i R⁴ oznaczają grupę (C1-C₆)alkilową a R⁵ oznacza

H. Nawet bardziej korzystne są związki o wzorze (I) w których R oznacza -NHC(O)OR^16b,

-NHC(O)R^16b albo -NHC(O)NR⁴R⁵, gdzie R^16b i R⁴ oznaczają grupę (C₁-C₆)alkilową a R⁵ oznacza H. 12

Korzystnie R¹ i R² są niezależnie wybrane z grupy składającej się z H i grupy (C1-C6)alkilowej; 12 a bardziej korzystnie, R¹ oznacza grupę (C1-C6)alkilową a R² oznacza H; w szczególności korzystnie 12 są związki, w których R¹ oznacza -CH3 i R² oznacza H.

₃

Korzystnie R³ oznacza H, -OH, grupę (C1-C6)alkilową, (C1-C6)alkoksylową, atom fluorowca, 17 22 23 3 grupę (C₃-C₆)cykloalkilową, -C(O)OR albo -NR R ; a bardziej korzystnie R oznacza H lub grupę (C1-C6)alkilową.

Korzystnie Het oznacza grupę pirydylową przyłączoną do B przez pierścieniowy atom C, i korzystnie jest ona podstawiona przez 1 albo 2 podstawniki wybrane z W, bardziej korzystnie przez

21 podstawnik. Korzystnie W oznacza grupę R²¹-arylową lub R²¹-heteroarylową. Korzystnie grupa arylowa oznacza grupę fenylową. Korzystnie grupa heteroarylowa (heteroaryl) oznacza grupę pirydylową.

Korzystnie R²¹ oznacza H, atom fluorowca albo -CN lub -CF3, w szczególności oznacza F, -CN albo -CF3.

O d Q -1 -1

Korzystnie R⁸, R¹⁰ i R¹¹, każdy niezależnie, oznacza H lub grupę (C3-C6)alkilową, a bardziej koO -1 -1 rzystnie H lub -CH3; w szczególności korzystne są związki o wzorze (I) w których każdy R⁸, R¹⁰ i R¹¹ oznacza H.

Korzystnie R⁹ oznacza H, OH albo grupę (C1-C6)alkoksylową; a bardziej korzystnie R⁹ oznacza H.

Korzystnie B oznacza grupę cis lub trans -(CH₂)_n4CR¹²=CR^12a(CH₂)_n5 - w której n4, n5, R¹² i R^12a

12a mają znaczenia jak wyżej podane; a bardziej korzystnie każdy R¹² i R^12a oznacza H, i każdy n4 i n5 wynosi zero. W szczególności korzystne są związki, w których B oznacza grupę transalkenylową, a zwłaszcza -CH=CH-.

Korzystną grupą związków są takie gdzie występuje ewentualne pojedyncze wiązanie, X ozna15 cza -O-, Y oznacza =O, i R¹⁵ nie występuje. Inną korzystną grupą związków są takie gdzie ewentualne pojedyncze wiązanie nie występuje, X oznacza -OH, Y oznacza (H, OH) i R¹⁵ oznacza H. Związki, w których ewentualne pojedyncze wiązanie występuje, X oznacza -O-, Y oznacza =O, i R¹⁵ nie występuje, są jeszcze bardziej korzystnie.

W szczególności korzystnie są związki o wzorze (I) w których R oznacza -HC(O)OR^16b gdzie R^16b oznacza grupę (C1-C6)alkilową. Korzystnie R^16b oznacza metyl lub etyl. Także korzystne są związki gdzie R jest przyłączony do pozycji C-7 pierścienia Q, jak pokazano na wzorze (IA).

PL 214 718 B1

Korzystną podgrupą stanowią związki o wzorze (IA):

9 9 ft 1 η 11 w którym R¹, R², R³, R⁸, R¹⁰, R¹¹, B, i Het mają znaczenia określone wyżej jako korzystne. Korzystnie, co najmniej jeden pierścieniowy atom węgla 5-8 jest podstawiony przez -(CH2)n6NHC(O)OR^16b, -(CH2)n6NHCOR^16b i -(CH2)n6NHCONR⁴R⁵, (CH2)n6NHSO2R¹⁶ albo -(CH2)n6NHSO2NR⁴R⁵ w których n6 wynosi 0 do 2, i R^16b, R¹⁶ i R⁴ oznaczają grupę (C₁-C₆)alkilową a R⁵ oznacza H.

Bardziej korzystną podgrupę stanowią związki o wzorze (IB):

w którym Het oznacza grupę pirydylową podstawioną przez grupę R²¹-arylową, korzystnie 21 21

R²¹-fenylową, gdzie R²¹ korzystnie oznacza F lub -CF3.

Szczególnie korzystnie są związki o wzorze (IA) lub (IB), w których co najmniej jeden pierścieniowy atom węgla 5-8 oznacza -NHC(O)OR^16b, gdzie R^16b oznacza grupę (C1-C6)-alkilową. Korzystnie R^16b oznacza metyl lub etyl.

Powyżej i w całym opisie, poniższe określenia, jeżeli nie podano inaczej, powinny być rozumiane jako oznaczające:

„Pacjent obejmuje zarówno ssaki jak i zwierzęta niebędące ssakami.

„Ssak obejmuje ludzi i inne zwierzęta będące ssakami.

„Ewentualnie podstawiony oznacza ewentualny podstawnik z określonych grup, rodników lub ugrupowań. Należy zwrócić uwagę, że dla dowolnego atomu o niepełnej wartościowości występującego w tekście, na schemacie, w przykładach i tabelach przyjmuje się, że ma atom(-y) wodoru uzupełniający(-e) wartościowości.

Poniższe definicje stosuje się niezależnie od tego czy występują samodzielnie czy w kombinacji z innymi określeniami, jeżeli nie podano inaczej. Zatem definicja grupy „alkilowej („alkilu) stosuje się do samej grupy alkilowej, jak też do „alkilowych części grup „hydroksyalkilowej, „fluorowcoalkilowej, „alkoksylowej itp.

Stosowane tutaj określenie grupa „alkilowa („alkil) oznacza alifatyczną grupę węglowodorową, która może być prosta lub rozgałęziona, i zawiera 1 do około 20 atomów węgla w łańcuchu. Korzystnie grupy alkilowe zawierają od 1 do około 12 atomów węgla w łańcuchu. Bardziej korzystnie grupy alkilowe zawierają od 1 do około 6 atomów węgla w łańcuchu.

Określenie „rozgałęziona oznacza, że jedna, albo więcej, niższa grupa alkilowa, jak metyl, etyl albo propyl, jest przyłączona do liniowego alkilowego łańcucha. Grupa alkilowa może być podstawiona przez jeden, albo więcej, podstawnik niezależnie wybrany z grupy składającej się z atomu fluorowca, grupy arylowej, cykloalkilowej, cyjanowej, hydroksylowej, alkoksylowej, alkilotiolowej, aminowej, -NH(alkilo), -NH(cykloalkilo), -N(alkilo)2 (gdzie grupy alkilowe mogą być takie same, albo różne), grupy karboksylowej i -C(O)O-alkilowej. Nieograniczające przykłady odpowiednich grup alkilowych obejmują metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, t-butyl, n-pentyl, heptyl, nonyl, decyl, fluorometyl, trifluorometyl i cyklopropylometyl.

PL 214 718 B1

Określenie grupa „alkenylowa („alkenyl) oznacza alifatyczną węglowod orową grupę (o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu węglowym) zawierającą w łańcuchu jedno, albo więcej, podwójne wiązanie, które mogą być skoniugowane lub nieskoniugowane. Użyteczne grupy alkenylowe mogą zawierać 2 do około 15, korzystnie 2 do około 12, a bardziej korzystnie 2 do około 6 atomów węgla w łańcuch. Grupa alkenylowa może być podstawiona przez jeden, albo więcej, podstawnik niezależnie wybrany z grupy składającej się z atomu fluorowca, grupy alkilowej, arylowej, cykloalkilowej, cyjanowej alkoksylowej. Nieograniczające przykłady odpowiednich grup alkenylowych obejmują etenyl, propenyl, n-butenyl, 3-metylobutenyl i n-pentenyl.

Gdy alkilowy lub alkenylowy łańcuch łączy dwa inne podstawniki i dlatego jest dwuwartościowy, to stosowane są odpowiednio określenia alkileno i alkenyleno.

Określenie grupa „alkoksylowa („alkoksyl) oznacza grupę alkilo-Ο-, gdzie grupa alkilowa ma znaczenie jak wcześniej podane. Użyteczne grupy alkoksylowe mogą zawierać 1 do około 12, korzystnie 1 do około 6 atomów węgla. Nieograniczające przykłady odpowiednich grup alkoksylowych obejmują metoksyl, etoksyl i izopropoksyl. Grupa alkilowa z grupy alkoksylowej jest przyłączona do sąsiadującego ugrupowania przez eterowy atom tlenu.

Grupa „alkinylowa („alkinyl) oznacza alifatyczną węglowodorową grupę zawierającą, co najmniej jedno potrójne wiązanie węgiel-węgiel, i która może być prosta lub rozgałęziona, i zawiera około do około 15 atomów węgla w łańcuchu. Korzystnie grupa alkinylowa ma około 2 do około 12; a bardziej korzystnie około 2 do około 4 atomów węgla w łańcuchu. Rozgałęziona oznacza, że jedna, albo więcej, niższa grupa alkilowa, jak metyl, etyl albo propyl, jest przyłączona do liniowego łańcucha alkinylowego. Nieograniczające przykłady odpowiednich grup alkinylowych obejmują etynyl, propynyl, 2-butynyl, 3-metylobutynyl, n-pentynyl, i decynyl. Grupa alkinylowa może być podstawiona przez jeden, albo więcej, podstawnik, które mogą być takie same lub różne, a każdy jest niezależnie wybrany z grupy składającej się z grupy alkilowej, arylowej i cykloalkilowej.

Grupa „arylowa („aryl) oznacza aromatyczny monocykliczny lub multicykliczny układ pierścieniowy zawierający około 5 do około 14 atomów węgla, korzystnie około 6 do około 10 atomów węgla. Grupa arylowa może być podstawiona przez jeden, albo więcej, podstawnik, jak wyżej określone, które mogą być takie same lub różne. Nieograniczające przykłady odpowiednich grup arylowych obejmują fenyl, naftyl, indenyl, tetrahydronaftyl i indanyl. Grupa „arylenowa („arylen) oznacza dwuwartościową grupę fenylową, w tym podstawioną w pozycji orto, meta i para.

Określenie „Boc odnosi się do grupy N-tert-butoksykarbonylowej.

Określenie grupa „cykloalkilowa („cykloalkil) oznacza niearomatyczny mono- albo multicykliczny układ pierścieniowy zawierający od około 3 do około 10 atomów węgla, korzystnie około 5 do około 10 atomów węgla. Korzystnie pierścienie cykloalkilowe zawierają od około 5 do około 7 pierścieniowych atomów. Grupa cykloalkilowa może być podstawiona przez jeden, albo więcej, podstawnik, jak wyżej zdefiniowany, które mogą być takie same lub różne. Nieograniczające przykłady odpowiednich monocyklicznych grup cykloalkilowych obejmują cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl i podobne. Nieograniczające przykłady odpowiednich multicyklicznych grup cykloalkilowych obejmują 1-dekalinyl, norbornyl, adamantyl i podobne. Grupa „cykloalkilenowa („cykloakilen) oznacza odpowiedni dwuwartościowy pierścień, w którym punkty przyłączenia do innych grup obejmują wszystkie pozycyjne izomery.

Określenie grupa „dihydroksy-(C1-C6)alkilowa oznacza alkilowy łańcuch podstawiony przez dwie grupy hydroksylowe na dwóch różnych atomach węgla.

Określenia grupa „fluoroalkilowa, „difluoroalkilowa i „trifluoroalkilowa oznaczają alkilowe łańcuchy, w których końcowy atom węgla jest odpowiednio podstawiony przez 1, 2 albo 3 atomy F, np. -CF3, -CH2CF3, -CH2CHF2 albo -CH2CH2F.

Określenie „atom fluorowca („halogen) albo „halo odnosi się do rodnika atomu fluoru, chloru, bromu albo jodu. Korzystne są rodniki fluoro-, chloro- albo bromo-, a bardziej korzystne są rodniki fluoro- i chloro-.

Określenie grupa „heteroarylowa („heteroaryl) oznacza jednopierścieniową, bicykliczną albo benzoskondensowaną grupę heteroarylową o 5 do 14 pierścieniowych atomach, korzystnie od około 5 do 10 pierścieniowych atomów, zawierających od 1 do 13 atomów węgla i 1 do 4 heteroatomów niezależnie wybranych z grupy składającej się z atomów N, O i S, pod warunkiem, że pierścienie nie obejmują sąsiadujących atomów tlenu i/albo siarki. Obejmuje także N-tlenki na pierścieniowych atomach N, jak też związki gdzie pierścieniowy atom N jest podstawiony grupą (C1-C4)alkilową, tworząc czwartorzędową aminę. Przykładami jednopierścieniowych grup heteroarylowych są pirydyl, oksazolil, izoksazolil, oksadiazolil, furanyl, pirolil, tienyl, imidazolil, pirazolil, tetrazolil, tiazolil, izotiazolil, tiadiazoPL 214 718 B1 lil, pirazynyl, pirymidyl, pirydazynyl i triazolil. Przykładami bicyklicznych grup heteroarylowych są naftyrydyl (np. 1,5 albo 1,7), imidazopirydyl, pirydo[2,3]imidazolil, pirydopirymidynyl i 7-azaindolil. Przykładami benzoskondensowanych grup heteroarylowych są indolil, chinolil, izochinolil, ftalazynyl, benzotienyl (np. tionaftenyl), benzymidazolil, benzofuranyl, benzoksazolil i benzofurazanyl. Rozważane są wszystkie pozycyjne izomery, np. 2-pirydyl, 3-pirydyl i 4-pirydyl.

Określenie „het jest ilustrowane przez pojedynczy pierścień, bicykliczną i benzoskondensowaną grupę heteroarylową jak zdefiniowana bezpośrednio wyżej. Grupy Het są przyłączone do grupy B przez pierścieniowy atom C, na przykład Het oznacza 2-pirydyl, 3-pirydyl albo 2-chinolil. Pierścień het może być podstawiony na dowolnym dostępnym pierścieniowym atomie C przez grupę W; i 1 do 4 podstawników W może występować na pierścieniu het.

Określenie grupa „heterocykloalkilowa („heterocykloalkil) oznacza 4 do 6 członowy nasycony pierścień zawierający 3 do 5 atomów węgla i 1 albo 2 heteroatomy wybrane z grupy składającej się z atomów N, S i O, pod warunkiem, że heteroatomy nie sąsiadują ze sobą. Przykładami pierścieni heterocykloalkilowych są pirolidynyl, piperydynyl, piperazynyl, morfolinyl, tiomorfolinyl, tiazolidynyl, 1,3-dioksolanyl, 1,4-dioksanyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydrotiofenyl i tetrahydrotiopiranyl.

Określenie grupa „heterospirocykliczna oznacza spirocykliczną strukturę zawierającą 3 do 5 atomów węgla i 1 albo 2 heteroatomy wybrane z grupy składającej się z atomów N, S i O, pod warunkiem, że heteroatomy nie sąsiadują ze sobą.

Określenie „ewentualne pojedyncze wiązanie oznacza wiązanie pokazane przerywaną linią 15 między X i atomem C do którego są przyłączone Y i R¹⁵, na wzorze (I). Ewentualne podwójne wiązanie pokazane jest przez Ł-ygr. co oznacza że co najmniej jedno pojedyncze wiązanie musi występo10 wać, ale wtedy gdy podwójne wiązanie występuje to R¹⁰ nie występuje.

Gdy R⁴ i R⁵ łączą się tworząc pierścień z atomem N, do którego są przyłączone, to utworzone pierścienie to 1-pirolidynyl, 1-piperydynyl i 1-piperazynyl, w których pierścień piperazynylowy może także być podstawiony w pozycji 4-N przez R⁷.

W powyższych objaśnieniach, gdzie np. podano, że R⁴ i R⁵ są niezależnie wybrane z grupy podstawników, to oznacza że R⁴ i R⁵ są niezależnie wybrane wtedy gdy są przyłączone do tego sa45 mego atomu N, ale również gdy R⁴ lub R⁵ występują więcej niż jeden raz w cząsteczce, to ich znacze13 14 nia są wybrane niezależnie od siebie. Podobnie, każde występowanie R¹³ lub R¹⁴ jest niezależne od

14 innych R¹³ lub R¹⁴, w tym samym pierścieniu Q. Fachowcy wiedzą, że rozmiar i natura podstawnika(-ów) będzie wpływała na liczbę podstawników, jakie mogą występować.

Powyższe związki mają, co najmniej jeden asymetryczny atom węgla, zatem wszystkie izomery, w tym enancjomery, stereoizomery, rotamery, tautomery i racematy związków o wzorze (I) (wtedy gdy istnieją) są rozważane. Zatem, izomery d i l zarówno w czystej postaci jak i w mieszaninie, w tym racemiczne mieszaniny. Izomery można wytwarzać konwencjonalnymi technikami, zarówno w reakcji optycznie czystych, lub optycznie wzbogaconych, materiałów wyjściowych, albo przez wydzielanie izomerów. Izomery mogą też obejmować geometryczne izomery, np. gdy występuje podwójne wiązanie. Postacie polimorficzne związków, zarówno postacie krystaliczne jak i amorficzne, także są rozważane.

Fachowcy wiedzą, że dla pewnych związków, jeden izomer będzie miał większą farmakologiczną aktywność niż inne izomery.

Korzystnie takie związki mają poniższą stereochemię:

Het przy czym, związki mające taką absolutną stereochemię są bardziej korzystne.

Opisane związki mogą tworzyć farmaceutycznie dopuszczalne sole z organicznymi i nieorganicznymi kwasami. Przykładami odpowiednich kwasów tworzących sól są kwas solny, siarkowy, fosforowy, octowy, cytrynowy, szczawiowy, malonowy, salicylowy, jabłkowy, fumaronowy, bursztynowy, askorbinowy, maleinowy, metanosulfonowy i inne kwasy mineralne i karboksylowe, znane fachowcom. Korzystne są sole wodorosiarczanowe. Sól wytwarza się przez kontaktowanie postaci wolnej zasady z ilością żądanego kwasu wystarczającą do utworzenia soli. Postać wolnej zasady można regenerować przez traktowanie soli

PL 214 718 B1 odpowiednio rozcieńczonym wodnym roztworem zasady, jak rozcieńczony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodu. Postać wolnej zasady różni się od odpowiednich soli pewnymi własnościami fizycznymi, jak rozpuszczalność w polarnych rozpuszczalnikach, ale czasami sól jest równoważna postaci wolnej zasady. Związki mogą także tworzyć farmaceutycznie dopuszczalne solwaty, w tym hydraty.

Pewne powyższe związki są kwasowe (np. te które mają grupę karboksylową). Takie związki tworzą farmaceutycznie dopuszczalne sole z nieorganicznymi i organicznymi zasadami. Przykładami takich soli są sól sodu, potasu, wapnia, glinu, litu, złota i srebra. Także sole utworzone z farmaceutycznie dopuszczalnymi aminami, jak amoniak, alkiloaminy, hydroksyalkiloaminy, N-metyloglukamina i podobne.

Określenie „solwaty oznacza fizyczne połączenie związku z jedną, albo więcej, cząsteczką rozpuszczalnika. Takie fizyczne połączenie obejmuje zmienny stopień jonowości i kowalencyjnego wiązania, w tym wiązania wodorowego. W pewnych przypadkach solwat będzie nadawał się do wydzielania, np. gdy jedna, albo więcej, cząsteczka rozpuszczalnika jest włączona w siatkę krystaliczną krystalicznego ciała stałego. Określenie „solwat obejmuje zarówno fazę rozpuszczoną jak i nadające się do wydzielania solwaty. Nieograniczające przykłady odpowiednich solwatów obejmują etanolany, metanolany, i podobne. Określenie „hydrat oznacza solwat, w którym cząsteczką rozpuszczalnika jest H2O.

Powyższe związki, w których n6 wynosi 0 można wytwarzać zgodnie ze sposobami znanymi w stanie techniki, np. opisanymi w publikacji patentowej US-6 063 847, i sposobami podanymi przykładowo poniżej.

Powyższe związki, w których n6 oznacza 1 albo 2, ogólnie wytwarza się zgodnie z procesami pokazanymi na schemacie:

Schemat

PL 214 718 B1

Keton 4 poddaje się reakcji Wittiga dla wytworzenia winylowego eteru 5, który hydrolizuje się w kwasowych warunkach dla wytworzenia aldehydu 6. Ten aldehyd redukuje się do alkoholu 7 i przekształca do azydu 8, przez jego mezylan. Redukcja grupy azydowej za pomocą. Me3P daje aminę 9, którą traktuje się różnymi elektrofilami dla otrzymania analogów.

Poniżej przedstawiono przykłady wytwarzania związków o wzorze (I). Związek według niniejszego wynalazku jest przedstawiony w Przykładzie 2.

W przykładach stosowano poniższe skróty: Et (etyl); Me (metyl); Pr (propyl); Ac (acetyl); rt (pokojowa temperatura); PTLC (preparatywna cienkowarstwowa chromatografia); THF (tetrahydrofuran); TBAF (fluorek tetra-n-butyloamoniowy); Tips (triizopropylosilil); i Tf (trifluorometanosulfonyl).

Etap 1:

Związek 1, opisany w US-6 063 847, (1,95 g, 4,2 mmola) rozpuszczano w EtOH (40 ml) i CH2Cl2 (10 ml). Następnie, do roztworu bąbelkowano NH3 (g) przez 5 min. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C, i dodawano Ti(OiPr)4(1,89 ml, 6,3 mmola). Po mieszaniu w 0⁰C przez 1 godz., dodawano 1M TiCl4 (6,3 ml, 6,3 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez dodatkowe 45 min. i zatężano do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczano w CH3OH (10 ml) i dodawano NaBH3CN (510 mg, 8 mmola). Otrzymaną zawiesinę mieszano przez noc w rt. Potem mieszaninę reakcyjną wylewano do 1N roztworu NaOH (100 ml) i ekstrahowano z EtOAc (3 x 100 ml). Organiczne warstwy połączono i wysuszono nad Na2SO4. Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano produkt, związek 2 (1,2 g, 62%). Po dalszym oczyszczaniu przez PTLC (5% 2M NH3 w CH₃OH/CH₂CI₂) otrzymano związek β-2(plamka 1) i związek α-2 (plamka 2) w stosunku 1:2. Związek β-2: ¹H NMR (CDCI3): δ 0.81-1.15(m, 2H), 1.11-1.38(m, 4H), 1.42(d, J=6 Hz, 3H), 1.82-2.01(m, 3H), 2.37(m, 2H), 2.45(szeroki m, 1H), 2.65(m, 1H), 2.81(m, 1H), 4.75(m, 1H), 6.61(m, 2H), 7.26(m, 2H), 7.75-7.85(m, 4H), 8.77(d, J= 1,6 Hz, 1H), Związek α-2: ¹H NMR (CDCl3): δ 0.95(m, 1H), 1.101.40 (m, 5H), 1.41(d, J=6 Hz, 3H), 1.52-1.65(m, 2H), 1.75(m, 1H), 1.84-2.0 (m, 2H), 2.37(m, 1H), 2.45(m, 1H), 2.65(m, 1H), 3.42(szeroki s, 1H), 4.70 (m, 1H), 6.61(m, 2H), 7.26(m, 2H), 7.75-7.85(m, 4H), 8.77(d, J=I,6 Hz, 1H).

Etap 2:

Związek α-2(110 mg), chloromrówczan etylu (0,4 ml) i Et3N (0,5 ml) w CH2Cl2 (6 ml) mieszano przez 2 godz. Mieszaninę reakcyjną bezpośrednio rozdzielano przez PTLC (EtO-Ac/heksan, 1:1),

PL 214 718 B1 otrzymano tytułowy związek (100 mg, 79%). MS m/z 543(M+1). HRMS obliczone dla C30H34N2O4F3 (M+1): 543,2471, znaleziono 543,2467.

P r z y k ł a d 1A:

N-metylowy związek porównawczy

Etap 1:

Związek 1 (646 mg, 1,38 mmola) rozpuszczano w 2,0M CH3NH2 w CH3OH (15 ml, 30 mmola) i mieszano w rt przez 5 min., a następnie dodawano NaCNBH3(173 mg, 2,75 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez noc i zatężano do sucha, pod obniżonym ciśnieniem. Po usunięciu rozpuszczalnika i rozdzielaniu przez PTLC (7% 1M NH3 w CH3OH/CH2CI2 otrzymano związek β-4 (plamka 1, 76 mg, 11%) i związek α-4 (plamka 2, 100 mg, 15%). Związek β-4: ¹H NMR (CDCl3): δ 1.15-1.24(m, 5H), 1.42(d, J=6 Hz, 3H), 1.42-1.61(m, 2H), 1.71-1.95(m, 4H), 2.21(m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.45(m, 1H), 2.71(m, 1H), 2.84(m, 1H), 4.75(m, 1H), 6.51-6.63(m, 2H), 7.26(m, 2H), 7.75-7.85(m, 4H), 8.77(d, J=2,0 Hz, 1H), Związek α-4: ¹H NMR (CDCl3): δ 0.95(m, 2H), 1.10-1.40 (m, 5H), 1.41(d, J=6 Hz, 3H), 1.82-1.95(m, 5H), 2.38(m, 2H), 2.42(s, 3H), 2.65(m, 1H), 4.79(m, 1H), 6.51-6.63(m, 2H), 7.26(m, 2H), 7.75-7.85(m, 4H), 8.77(d, J=2,0 Hz, 1H).

Etap 2:

Związek α-4 (50 mg), chloromrówczan etylowy (0,15 ml) i Et₃N (0,3 ml) w CH₂Cl₂ (5 ml) mieszano przez 2 godz. Mieszaninę reakcyjną bezpośrednio rozdzielano przez PTLC (EtO-Ac/heksan, mieszanina 1:1), otrzymano tytułowy związek (48 mg, 84%). MS m/z 557 (M+1). HRMS obliczone dla C31H36N2O4F3 (M+1): 557,2627, znaleziono 557,2620.

P r z y k ł a d 2

PL 214 718 B1

Etap 1:

Fosfonian, związek 7, opisany w US-6 063 847, (3,27 g, 8,1 mmola) rozpuszczono w THF (12 ml) i ochłodzono do 0°C, a potem dodawano 2,5M roztwór n-BuLi (3,2 ml, 8,1 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 10 min., i ogrzewano do rt. Do mieszaniny dodawano roztwór aldehydu, związek 6, opisany w US-6063847, w THF (12 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 min. Po standardowej obróbce wodą, a potem kolumnowej chromatografii (30-50% EtOAc w heksanie) otrzymano produkt, związek 8. ¹H NMR (CDCI3): δ 0.92-1.38(m, 31Η), 1.41(d, J=6 Hz, 3H), 1.40-1.55(m, 2H), 1.70-1.80 (m, 2H), 1.81-1.90(m, 2H), 2.36(m, 2H), 2.69(m, 1H), 3.89(m, 4H), 4.75(m, 1H), 6.28-6.41(m, 2H), 7.05-7.15(m, 2H), 8.19(szeroki s, 1H).

Etap 2:

Związek 8 (2,64 g, 4,8 mmola) rozpuszczono w THF (48 ml), i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C, a potem dodawano 1M roztwór TBAF (4,8 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 5 min., a potem po standardowej obróbce wodą i kolumnowej chromatografii (50% EtOAc/ heksan) otrzymano produkt, związek 9 (1,9 g, 100%). ¹H NMR (CDCl3): δ 1.15-1.55(m, 6H), 1.41(d, J=6 Hz,

3H), 1.70-1.82(m, 3H), 1.85-1.90(m, 1H), 2.36(m, 2H), 2.69(m, 1H), 3.91(m, 4H), 4.75(m, 1H), 6.186.45(m, 2H), 7.19(szeroki s, 2H), 8.19(szeroki s, 1H).

Etap 3:

Do roztworu związku 9 (250 mg, 0,65 mmola) w pirydynie (5 ml) ochłodzonego do 0°C dodawano Tf₂O (295 pi, 2,1 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w rt. Po standardowej obrób₁ ce wodnej i kolumnowej chromatografii otrzymano produkt, związek 10 (270 mg, 80%). ¹H NMR (CDCl3): δ 1.15-1.55(m, 6H), 1.41(d, J=6 Hz, 3H), 1.70-1.82(m, 3H), 1.85-1.90(m, 1H), 2.36(m, 2H), 2.69(m, 1H), 3.91(m, 4H), 4.75(m, 1H), 6.42-6.68(m, 2H), 7.25(m, 1H), 7.55(m, 1H), 8.49(d, J=2,8 Hz, 1H).

PL 214 718 B1

Etap 4:

Związek 10 (560 mg, 1,1 mmola), kwas 3-fluorofenyloboronowy (180 mg, 1,3 mmola) i K2CO3 (500 mg, 3,6 mmola) mieszano z toluenem (4,4 ml), H2O (1,5 ml) i EtOH (0,7 ml) w zamkniętej rurze. W atmosferze azotu (N2) dodawano Pd (Ph3P)4 (110 mg, 0,13 mmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 100°C przez 2 godz., w atmosferze N2. Potem mieszaninę reakcyjną ochłodzono do rt, wylewano do EtOAc (30 ml) i przemywano wodą (2x 20 ml). Roztwór EtOAc wysuszono z NaHCO3 i zatężano pod obniżonym ciśnieniem, do otrzymania pozostałości. Po rozdzielaniu pozostałości przez pre₁ paratywną TLC (50% EtOAc w heksanie) otrzymano produkt, związek 11 (445 mg, 89%). ¹H NMR (CDCl3): δ 1.15-1.59(m, 6H), 1.43(d, J=6 Hz, 3H), 1.70-1.79(m, 2H), 1.82(m, 1H), 1.91(m, 2H), 2.41(m, 2H), 2.69(m, 1H), 3.91(m, 4H), 4.75(m, 1H), 6.52-6.68(m, 2H), 7.15(m, 1H), 7.22(m, 2H), 7.35(m, 1H), 7.44(m, 1H), 7.81(m, 1H), 8.77(d, J=1,2Hz, 1H).

Etap 5:

Związek 11 (445 mg, 0,96 mmola) rozpuszczano w mieszaninie acetonu (10 ml) i 1N roztworze

HCl (10 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 50°C przez 1 godz. Po standardowej obróbce wodą i rozdzielaniu przez preparatywną TLC (50% EtOAc w heksanie) otrzymano produkt, związek 12 (356 mg. 89%). ¹H NMR (CDCl3): δ 1.21-1.45(m, 2H), 1.47(d, J=5,6 Hz, 3H), 1.58-1.65(m, 2H), 2.15(m, 1H), 2.18-2.28(m, 2H), 2.35-2.51(m, 5H), 2.71(m, 1H), 4.79(m, 1H), 6.52-6.68(m, 2H), 7.15(m, 1H), 7.22(m, 2H), 7.35(m, 1H), 7.44(m, 1H), 7.81(m, 1H), 8.77(d, J=1,2 Hz, 1H).

Etap 6:

Związek 12 (500 mg, 4,2 mmola) rozpuszczono w EtOH (40 ml) i CH2Cl2 (15 ml) do roztworu bąbelkowano NH3 (g) przez 5 min. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C, a potem dodawano Ti(OiPr)4 (1,89 ml, 6,3 mmola). Po mieszaniu w 0°C przez 1 godz. dodawano 1M roztwór TiCl4 (6,3 ml, 6,3 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez 45 min., i zatężano do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczano w CH3OH (10 ml) i dodawano NaBH3CN (510 mg, 8 mmola).

PL 214 718 B1

Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w rt, i tę mieszaninę wylewano do 1N roztworu NaOH (100 ml) i ekstrahowano z EtOAc (3x100 ml). Organiczne warstwy połączono i wysuszono z NaHCO3.

Po usunięciu rozpuszczalnika i rozdzieleniu przez PTLC (5% 2M NH3 w CH3OH/CH2Cl2) otrzymano związek β-13 (plamka 1, 30 mg, 6%) i związek α-13 (plamka 2, 98 mg, 20%). Związek β-13 ¹H NMR (CDCl3): δ 1.50-1.38(m, 5H), 1.42(d, J=6 Hz, 3H), 1.51-1.75(m, 5H), 1.84(m, 2H), 2.38(m, 1H), 2.45(m, 1H), 3.38 (szeroki s, 1H), 4.78(m, 1H), 6.59(m, 2H), 7.15(m, 1H), 7.26(m, 2H), 7.36(m, 1H), 7.42(m, 1H), 7.82(m, 1H), 8.77(d, J=2 Hz, 1H). Związek α-13 ¹H NMR (CDCl3): δ 0.95(m, 2H), 1.02-1.35 (m, 6H), 1.41 (d, J=6 Hz, 3H), 1.82-1.95(m, 4H), 2.37(m, 2H), 2.69(m, 2H), 4.71(m, 1H), 6.71(m, 2H), 7.11(m, 1H), 7.25(m, 2H), 7.38(m, 1H), 7.42(m, 1H), 7.80 (m, 1H), 8.76(d, J=1,6 Hz, 1H).

Etap 7:

Związek α-13 (300 mg, 0,71 mmola) rozpuszczono w CH₂CI₂ (10 ml) a potem dodawano Et₃N (0,9 ml). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i dodawano chloromrówczan etylowy (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez 1 godz. Mieszaninę reakcyjną bezpośrednio rozdzielano przez preparatywną TLC (EtOAc/heksan, 1:1); otrzymano tytułowy związek (związek 14) (300 mg, 86%). MS m/z 493 (M+1). HRMS obliczone dla C29H34N2O4F (M+1): 493,2503; znaleziono 493,2509.

Etap 1:

P r z y k ł a d 2A:

N-metylowany związek porównawczy

Związek 12 (130 mg, 0,31 mmola) rozpuszczono w 2,0M roztworze CH3NH2 w CH3OH (5 ml, 10 mmola). Po mieszaniu w rt przez 5 min. dodawano NaCNBH3(40 mg, 0,62 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez noc. Po usunięciu rozpuszczalnika i rozdzielaniu przez PTLC (7% 1M roztwór NH3 w CH3OH/CH2CI2) otrzymano związek β-15 (plamka 1, 20 mg, 15%) i związek α-15 (plamka 2, 25 mg, 19%). Związek β-15: ¹H NMR (CDCl3): 1.15-1.25(m, 5H), 1.42(m, 3H), 1.42-1.61(m, 2H), 1.75-1.90 (m, 3H), 2.25-2.45(m, 2H), 2.41(s, 3H), 2.70 (m, 1H), 2.85(m, 1H), 4.75(m, 1H), 6.516.61(m, 2H), 7.11(m, 1H), 7.23-7.27(m, 2H), 7.35(m, 1H), 7.45(m, 1H), 7.80(m, 1H), 8.76(d, J=2,4 Hz, 1H). Związek α-15: ¹H NMR (CDCl3): δ 0.90 (m, 2H), 1.10-1.35(m, 5H), 1.41(d, J=5,6 Hz, 3H), 1.822.01(m, 4H), 2.36(m, 2H), 2.39(s, 3H), 2.55-2.65(szeroki s, 1H), 2.71(m, 1H), 4.79(m, 1H), 6.51-6.63(m, 2H), 7.08(m, 1H), 7.26(m, 2H), 7.34(m, 1H), 7.42(m, 1H), 7.81(m, 1H), 8.76(d, J=2,0 Hz, 1H).

Etap 2:

Związek α-15 (25 mg, 0,06 mmola) rozpuszczono w CH₂Cl₂ (5 ml) a potem dodawano Et₃N (0,2 ml). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i dodawano chloromrówczan etylowy (0,1 m). Potem mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez 1 godz. Mieszaninę reakcyjną bezpośrednio rozdzielano przez preparatywną TLC (EtOAc/heksan, mieszanina 1:1); otrzymano tytułowy związek (25 mg, 85%). MS m/z 507 (M+1). HRMS obliczono dla C30H36N2O4F (M+1): 507,2659; znaleziono 507,2652.

PL 214 718 B1

Związek α-13 (10 mg, 0,02 mmola) rozpuszczono w CH2Cl2 (3 ml) a potem dodawano Et3N (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i dodawano CH3SO2Cl (0,2 ml). Potem mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez 1 godz. Mieszaninę reakcyjną bezpośrednio rozdzielano przez preparatywną TLC (EtOAc/heksan, mieszanina 1:1); otrzymano tytułowy związek (10 mg, 84%). MS m/z 499 (M+1). HRMS obliczono dla C27H32N2O4FS (M+1): 499,2067; znaleziono 499,2071.

P r z y k ł a d 4

Związek α-13 (50 mg, 0,1 mmola) rozpuszczono w CH2Cl2 (5 ml) a potem dodawano CH3NCO (250 mg). Mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez 1 godz. Mieszaninę reakcyjną bezpośrednio rozdzielano przez preparatywną TLC (CH3OH/CH2Cl2, 7%); otrzymano tytułowy związek (60 mg jako sól HCl, 98%). MS m/z 478 (M+1). HRMS obliczono dla C28H33N3O3F (M+1): 478,2506, znaleziono 478,2516.

P r z y k ł a d 5

Związek α-13 (50 mg, 0,1 mmola) rozpuszczono w CH2Cl2 (3 ml) a potem dodawano Et3N (0,5 ml). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C i dodawano bezwodnik octowy (0,2 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w rt przez noc, i bezpośrednio rozdzielano przez preparatywną TLC (CH3OH/CH2Cl2, 8%); otrzymano tytułowy związek (52 mg, 94%). MS m/z 463(M+1). HRMS obliczono dla C28H32N2O3F (M+1): 463,2397; znaleziono 463,2399.

Stosując metody jak wyżej opisane, wytworzono poniższe związki:

PL 214 718 B1

Tabela 1

Przysiad	Ri1	R	Daneliz-chem
δ	-cf3	-NHCOa-f-bufyS	MS (M+1): obsetved: 571
7	-CF3	-NHCO2CH3	HRMS (M+1): observed:529,2323
δ	-CF3	-NHCO2CH2CH3	HRMS (M+1): observed:543.2467
9	-cf3	-NHCO2CH2CH2OCH3	HRMS (M+1): observed:573.2569
10	H	-NHCO2CH2CH3	HRMS (M+1): observed:475.2592
11	F	^nhco2ch2ch3	HRMS (M+1): observed:493.2509
12*	-CFa	-N(n-Pr)CQiCH2CH3	HRMS (M+1): observed:585.2951
13*	-cf3	-N(n-Pr)CO2CH2CH3	HRMS (M+1): observed:585.2951
14	-cf3	•*»»INHCOCH3	HRMS (M+1): observed:513.2362
15	-cf3	-«NHCOCH3	HRMS (M+1): observed:513.2367
16	p	•|INHCOCH2CH3	HRMS (M+1): observed:477-.2S8O
y	F	0 •«HNHC—<3	HRMS (M+1): observed:48S.2557
16	F	-*nhcoch3	HRMS (M+1): observed:463.2401
19	-cf3	-NHCOCH2OCH3	HRMS (M+1): observed :543,2465
20	-CF3	-NHCOCH2OC(O)CH3	HRMS (M+1): observed:571.241S
21	-CFa	-nhconhch2ch3	HRMS (M+1): observed:542.2636
22	-cf3	-MHCONHCH3	HRMS (M+1): observed;556.2795
23	F	-«NHCONHCHa	HRMS (M+1): observed:478,2511
24	F	-NHCONHCH2CH3	HRMS (M+1): observed :492.2669
25	f	-*nhconhch2ch3	HRMS (M+1): observed :492.2668
26	-cf3	-nhso2ch3	HRMS (M+1): observed:563.2198
27	-cf3	-NHSOsCHsCHj	HRMS (M+1): observed:549.2024
28	-CFs	-nhso2ch2ch2ch3	HRMS (M+1): observed:577.2352
29	H	-nhso2ch3	HRMS (M+1): observed:481.2164
30	-cf3	•HINHSO2CH3	HRMS (M+1): observed:549,2026
31	F	•'ilNHSO2CH2CH3	HRMS (M+1): observed:513.2217

* Przykład porównawczy

Zastępując grupę pirydynową w związku 1 przez grupę chinolinową wytworzono poniższe związki:

PL 214 718 B1

w których R i Ar mają znaczenia jak podane w Tabeli 2:

Tabela 2

Przykład	Ar	-R	Dane fiz-cftem
	o.	isNHAc	MS nVz453(MH+)
33	ΥΥί	HNHCONHEt	MS m/z 482 (ΜΗ*)
34	'Οχ	”lNHCO2Et	MS mfe483(MH+)
35	ΌΟς	'^•NHCOjsEt	MS m/z 483 (MH+)
38	Όσα	”»NHCO2Et	MS m/z483(MH+)
37	τχ>	•'•iiNHCOjrEt	MS m/z 483 (MH+)
38	w°	«tiNHAc	MS m/z453(MH+)
40	Cl Όό	.........	MS m/z 453 (MH+)
41	Cl YrS	'«iNHCONHEt	MS m/z 482 (MH+)
42	'CÓ	iiiNHCOjEt	MS m/z 483 (MH*)
43	Cl YYS	-^NHCO2Et	MS m/z483(MH+)

Poniższe analogi wytworzono stosując dalsze znaczenia W wybrane z podstawionych grup fenylowych i grup heteroarylowych:

w których R i Ar mają znaczenia jak podane w Tabeli 3:

PL 214 718 B1

Tabela 3

Przykład	Ar	-R	Dane fiz-chem
44	Ό	••«iiNHCO2Et	MS m/z476(MH+)
45	ó	••<HNHCO2B	MS m/z493(MH+)
46	ΌΓ5ΜΘ	•'UNHCO2Et	MS m/z 521 (MH+)
47		............	MS m/zS06(MH+)
48	ν	............	MS m/z477(MH+)
49	Ό	iNHCO2Et	MS m/z476(MH+)
50		•>lNHCO2Et	MS m/z518(MH+)
51	η	•'«iNHCOzEt	MS m/z476(MH+)
52		”iNHCO2Et	MS m/z 482 {MH+}
53		•HNHCC^Et	MS m/z465(MH+)
54	CN ό	............	MS m/z500(MH+)
55	Ό	^NHCO2Et	MS m/z476(MH+)
56		-*NHCO2Et	MS m/z 500 (MH+)
57	^Ο^°ΝΗ2'	-»NHCO2Et	MS m/z518(MH+)
58	F Ό	-*NHCO2E1	MS m/z 493 (MH+)
59	V	-*NHCO2Et	MS m/z 509 (MH+)
60	xf	•fiNHCO2Et	MS m/z509(MH+)
61	ν	HNHCO2Et	MS m/z 511 (MH+)
62	yF	~*NHCO2Et	MS m/z 511 (MH+)

PL 214 718 B1

63	V	.....NHCO2CH2CONH2	MS m/z 522 (MH+)
64	V	-*nhco2ch2conh2	MS m/z522(MH+)
65	OMe Ό	•>'ilNHCO2Et	MS m/z 505 (MH+)
66	Ό	-*NHCO2Et	MS m/z 505 (MH+)
67	V	-<iiNHCO2CH2CO2Me	MS m/z 537 (MH+)
68	'0’	•‘•'tNHCO2CH2CO2H	MS m/z523(MH+)

P r z y k ł a d 69

Etap 1:

Związek 17 (100 mg, 0,239 mmola) wytworzony jako opisano w US-6 063 847 mieszano z octanem amonu (1,84 g, 23,9 mmola) i NaCNBH3 (24 mg, 0,38 mmola) w CH3OH (7 ml) w rt, w atmosferze azotu (N2), przez 16 godz. Mieszaninę traktowano NH4OH (10 ml, 29% wodny roztwór), rozcieńczano CH2Cl2 (75 ml), i przemywano NaHCO3 (roztwór nasycony). Organiczną warstwę wysuszono (MgSO4) i zatężano pod próżnią. Po rozdzielaniu pozostałości przez PTLC z 2,0M roztworem NH3/CH3OH-CH2Cl2 (5-95) jako eluentem, otrzymano związek 18A (43 mg, 43%, mniejszy Rf), MS (ESI) m/z 421 (MH+) i związek 18B (17 mg, 17%, większy Rf). MS (ESI) m/z 421 (MH+).

Etap 2:

Związek 18A (0,100 g, 0,238 mmola) mieszano z chloromrówczanem etylowym (0,195 ml, 2,38 mmola) i Et3N (0,5 ml, 3,6 mmola) w CH2Cl2 (10 ml) w 0°C przez 10 minut, i w rt przez 1 godz. Mieszaninę rozcieńczano EtOAc (50 ml) i przemywano NaHCO3 (roztwór nasycony). Organiczną warstwę wysuszono (MgSO4) i zatężano pod próżnią. Po rzutowej chromatografii pozostałości na kolumnie z żelem krzemionkowym z mieszaniną EtOAc-heksan (50-50) jako eluentem; otrzymano związek

PL 214 718 B1 z Przykładu 69A (100 mg, 85%). MS (ESI) m/z 493 (MH+). Podobnie związek 32B wytworzono ze związku 18B. MS (ESI) m/z 493 (MM+).

P r z y k ł a d 70

Etap 1:

Stosując procedurę według Przykładu 32, etap 1, rozpoczynając od związku 19 (patrz US6 063 847), wytworzono związek 20A (mniejszy Rf), MS (FAB) m/z 421 (MH+), i związek 20B (większy Rf) MS (FAB) m/z 421(MH+).

Etap 2:

Stosując procedurę według Przykładu 69, etap 2, ze związku 20A wytworzono związek z Przykładu 70A: MS (ESI) m/z 493 (MH+). Stosując procedurę według Przykładu 69, etap 2, ze związku 20B wytworzono związek z Przykładu 70B: MS (ESI) m/z 493 (MH+).

P r z y k ł a d 71

Etap 1:

PL 214 718 B1

Lakton, związek 21, opisany w US-6 063 847 (10 g, 0,0251 mola) rozpuszczano w acetonie, dodawano 1N roztwór HCl i mieszaninę ogrzewano w 55°C przez 4 godziny. Mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia do rt, zneutralizowano za pomocą NaHCO3 i ekstrahowano z EtOAc. Ekstrakty wysuszono i zatężano pod obniżonym ciśnieniem, otrzymano związek 22 (7,35 g) jako olej. MS m/z

355 (M+1).

Etap 2:

Keton, związek 22 (7,35 g, 0,0207 mola) rozpuszczono w THF i ochłodzono do 0°C, dodawano tert-butanolan potasu (2,55 g, 1,1 równoważnika). Po mieszaniu przez 10 min., dodawano CH3I (2,58 ml, 2 równoważniki). Mieszaninę mieszano przez 2,5 godz. Po standardowej obróbce wodnej z NH4CI (roztwór nasycony), a potem kolumnowej chromatografii (30-50% EtOAc w heksanie); otrzymano związek 23 (1,63 g). MS m/z 383 (M+1).

Keton, związek 23 (1,634 g, 0,00426 mola) rozpuszczono w CH3OH, i dodawano NH4OAc i NaCNBH3. Mieszaninę mieszano przez 2 godz. Reakcję gaszono za pomocą NH4OH i mieszaninę ekstrahowano z CH2Cl2. Organiczne ekstrakty wysuszono i zatężano, otrzymano olej. MS m/z 383 (M+1).

Olej rozpuszczono w CH2Cl2, dodawano Et3N i mieszaninę chłodzono do 0°C. Dodawano chloromrówczan etylu i mieszaninę mieszano przez noc. Po standardowej obróbce wodą z NH4CI (sól) a potem kolumnowej chromatografii (30% EtOAc w heksanie); otrzymano 0,797 g nienadającej się do rozdzielenia mieszaniny 3:1 związków α-24 i β-24. MS m/z 456 (M+1).

Produkt w postaci mieszaniny z etapu 3 (330 mg, 0,724 mmola) rozpuszczano w EtOAc (14 ml) i dodawano Pd(C) (10% wagowych). Mieszaninę mieszano w atmosferze wodoru (H2) (1 atmosfera) przez 2 godz. Mieszaninę przefiltrowano, zatężano i rozpuszczano w CH3OH (15 ml). Następnie dodawano PtO2 (10% wagowych), tę mieszaninę umieszczano w atmosferze H2 (50 psi), i mieszano w wytrząsarce parra przez 3 dni. Mieszaninę przefiltrowano i zatężano; otrzymano 280 mg kwasów, związek 25. MS m/z 368 (M+1).

PL 214 718 B1

Surowe kwasy, związek 25 (0,724 mmola) rozpuszczano w CH2Cl2. Dodawano (COCl)2 (0,1 ml, ₁

1,5 równoważnika) i kroplę DMF. Mieszaninę mieszano przez 30 min., aż analiza ¹H NMR wykazała całkowite przekształcenie. CH2Cl2 zastąpiono toluenem i tak otrzymany roztwór ochłodzono do 0°C, dodawano Pd(Ph3P)4, a potem kroplami dodawano Bu3SnH. Po mieszaniu w 0°C przez 30 min., analiza TLC wykazała zakończenie reakcji, a po kolumnowej chromatografii (20-50% EtOAc w heksanie) otrzymano 248 mg aldehydu, związek 26. MS m/z 352 (M+1).

Etap 6:

Fosfonian, związek 27 (248 mg, 0,768 mmola, 3 równoważniki), patrz US - 6 063 847, rozpuszczano w THF (4 ml) i tę mieszaninę ochłodzono do 0°C. Dodawano LHMDS (0,768 ml, 3 równoważniki 1M roztwór w THF) i otrzymaną mieszaninę mieszano przez 30 min. Dodawano Ti(i-OPr)4 (0,227 ml, 3 równoważniki) i 5 min. później dodawano roztwór aldehydów, związek 26, (90 mg, 0,256 mola) w THF (4 ml). Mieszaninę mieszano przez 1,5 godz., aż analiza TLC pokazała zakończenie przekształcenia. Dodawano nasycony roztwór winianu sodowo-potasowego i THF usuwano pod próżnią, a pozostałość ekstrahowano z EtOAc. Wysuszono, zatężano i oczyszczano przez PTLC (mieszanina 1:1 EtOAc/ heksan); otrzymano tytułowy związek (80 mg). MS m/z 521 (M+1).

P r z y k ł a d 72

Etap 1:

Do roztworu 1,35 g (2,75 mmola) wyjściowego materiału, 0,57 ml Et3N (4,13 mmola, 1,5 równoważnika) i 70 mg DMAP (0,57 mmola, 0,2 równoważnika) w 20 ml CH3CN w 60°C dodawano 2 równoważniki (Boc)2O. Następnie dodawano 5 równoważników (Boc)2O w ciągu 5 godz. Potem roztwór ochłodzono, zatężano i chromatografowano, otrzymano 0,86 g produktu. MS: 593,1 (MH+).

Etap 2:

PL 214 718 B1

Do roztworu 280 mg wyjściowego materiału w 5 ml THF w 0°C dodawano 0,95 ml (0,95 mmola, 2 równoważniki) 1M roztwór LHMDS w THF. Mieszaninę mieszano przez 30 min., i przez balon wprowadzano O2. Po mieszaniu przez 1 godz., reakcję gaszono przez dodawanie 50 ml wodnego roztworu Na2SO3 i mieszano przez 1 godz. Wodną warstwę ekstrahowano 3 x 25 ml z octanem etylu i połączone organiczne warstwy przemywano solanką, wysuszono nad MgSO4 i chromatografowano z 30% EtOAc-heksany; otrzymano 125 mg hydroksylowanego produktu. MS: 609,1 (MH+).

Etap 6:

Do roztworu 125 mg wyjściowego materiału w 1 ml CH2CI2 w rt dodawano 1 ml kwasu trifluorooctowego, mieszano przez 1 godzinę i zatężano. Do tego dodawano 50 ml wodnego roztworu Na2CO3 i ekstrahowano z 3 x 10 ml CH2CI2. Połączone organiczne warstwy przemywano 10 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano, zatężano 90 mg produktu. HRMS: 509,2459 (MH+).

P r z y k ł a d 73 i chromatografowano z 50% EtOAc-heksany; otrzymano

Do roztworu 500 mg (0,84 mmola) wyjściowego materiału w 8 ml THF dodawano 1,7 ml (1,7 mmola, 2 równoważniki) 1M LHMDS w THF. Ten roztwór mieszano przez 30 minut i ochłodzono do -78°C, a potem dodawano 390 mg (1,7 mmola, 2 równoważniki) di-tert-butyloazodikarboksylanu (DBAD) w 2 ml THF. Następnie mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do rt przez 3 godz., wylewano do 100 ml wodnego roztworu NH4CI i ekstrahowano z 3 x 30 ml EtOAc. Połączone organiczne warstwy przemywano 30 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano i zatężano; otrzymano surowy produkt.

Ten produkt mieszano z 15 ml mieszaniny 1:1 TFA-DCM w rt przez 1 godz., zatężano i przeprowadzano w roztwór zasadowy za pomocą 100 ml wodnego roztworu Na2CO3. Wodną warstwę ekstrahowano z 3 x 25 ml DCM, połączone organiczne warstwy przemywano 25 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano i zatężano; otrzymano surowy hydrazyd.

Surowy hydrazyd rozpuszczano w 10 ml lodowatego kwasu octowego i dodawano 2 g proszku Zn, małymi porcjami i mieszano przez około 1,5 godz. Następnie filtrowano przez celit i spłukiwano 100 ml DCM. Ten roztwór DCM przemywano 2 x 50 ml H2O, 2 x 50 ml wodnego roztworu NaHCO3,

PL 214 718 B1 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano, zatężano i chromatografowano z mieszaniną 87:10:3 DCM-aceton-MeOH; otrzymano 105 mg produktu. HRMS: 508,2607(MH+).

P r z y k ł a d 74

Etap 1:

Do zawiesiny chlorku (metoksymetylo)trifenylofosfoniowego (3,20 g, 9,34 mmola) w 30 ml THF w 0°C dodawano 1M roztwór t-BuOK w THF (10,3 ml, 10,3 mmola) i mieszano przez 30 min. Do tego roztworu dodawano roztwór ketonu (1,95 g, 4,65 mmola) w 25 ml THF i 10 ml DMF. Mieszaninę mieszano w rt przez 1 godz., wylewano do 300 ml wodnego roztworu NH4CI i ekstrahowano z 3 x 75 ml EtOAc. Połączone organiczne warstwy przemywano 75 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano, zatężano i chromatografowano z 40% EtOAc-heksany, otrzymano 1,67 g produktu. MS: 448,1 (MH+).

Etap 2:

Roztwór 1,67 g eteru winylowego w 15 ml 4N roztworze HCl w dioksanie i 1,5 ml H2O mieszano w rt przez 1,5 godz., wylewano do 250 ml wodnego roztworu Na2CO3 i ekstrahowano z 3 x 50 ml DCM. Połączone organiczne warstwy przemywano 50 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano, zatężano i chromatografowano z 40% EtOAc-heksany; otrzymano 1,36 g aldehydu.

Do roztworu tego aldehydu w 20 ml MeOH i 10 ml THF w 0°C dodawano 120 mg NaBH4 i mieszano przez 10 min. Ten roztwór wylewano do 150 ml wodnego roztworu NH4CI, i ekstrahowano

PL 214 718 B1 z 3 x 50 ml EtOAc. Połączone organiczne warstwy przemywano 50 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano i zatężano; otrzymano 1,27 g alkoholu jako białe ciało stałe. HRMS: 436,2275 (MH+).

Etap 3:

Do roztworu alkoholu (1,27 g, 2,92 mmola) w 20 ml DCM w około -40°C dodawano 0,63 ml Et3N i 0,27 ml MeSO2Cl i roztwór pozostawiono do ogrzania do 0°C przez 1 godz. Potem dodawano dalszą porcję 0,16 ml Et3N i 0,07 ml MeSO2Cl i mieszano przez dalszą 1 godz. w 0°C. Produkt rozcieńczono 100 ml EtOAc i przemywano 2x 30 ml wodnym roztworem NaHCO3, 30 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano i zatężano; otrzymano 1,6 g mezylanu.

Roztwór tego mezylanu mieszano z 950 mg NaN3(14,6 mmola, 5 równoważników) w 10 ml DMSO w 65°C przez 1,5 godz. Produkt rozcieńczono 150 ml EtOAc, przemywano 3 x 50 ml H2O, 50 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano i zatężano; otrzymano 1,3 g azydu.

Do roztworu tego azydu w 15 ml EtOAc i 0,2 ml H2O w 0°C dodawano 1M roztwór Me3P w THF i mieszano w rt przez 4 godz. Produkt zatężano i chromatografowano z 4% MeOH-DCM; otrzymano 1,06 g aminy. HRMS: 435,2445 (MH+).

P r z y k ł a d y 75 - 84

Stosując metody wyżej opisane, aminę traktowano różnymi elektrofilami i wytworzono poniższe związki:

w których R ma znaczenie określone w Tabeli 4

PL 214 718 B1

Przykład	R	HRMS (MH+)
74	H	435.2445
75	' 0 ,A	507.2664
76	O γ\<	493.2497
77	...........................................................0	477.2548
78	0	491.2703
79	O II γ®^ O	513.2213
80	- U Y®^ x o	527.2388
81	o yC^NH2	506.2822
82	O μ h	532.2970
83	Ó....... .......... YC'N^ X H	506.2822
84	O Ά Y/NH	546.3124

P r z y k ł a d y 85 do 92

Etap 1:

Do roztworu aldehydu (2,19 g, 4,53 mmola) w 40 ml CH3CN i 5 ml DCM dodawano roztwór NaH2PO4(135 mg, 1,13 mmola, 0,25 równoważnika) i 30% wodny roztwór H2O2 (0,51 ml, 4,99 mmola, 1,1 równoważnika) w 8 ml H2O. Do tego roztworu dodawano roztwór 80% NaClO2 (0,72 g, 6,37 mmola,

PL 214 718 B1

1,4 równoważnika) w 5 ml H2O i mieszaninę mieszano w rt przez 2 godz. Następnie rozcieńczano 150 ml H2O, zakwaszano za pomocą 1N roztworu HCl do wartości pH około 3 i ekstrahowano z 3x 50 ml DCM. Połączone organiczne warstwy przemywano 50 ml solanki, wysuszono nad MgSO4, filtrowano, zatężano, otrzymano 2,2 g kwasu karboksylowego w postaci ciała stałego. NRMS: 450,2077 (MH+).

Etap 2:

Procedura ogólna:

Do roztworu kwasu i aminy (3 równoważniki) w mieszaninie DMF-DCM dodawano HATU (2 równoważniki) i mieszano przez noc w rt. Produkt rozcieńczano EtOAc, przemywano wodnym roztworem NaHCO3, solanką, wysuszono nad MgSO4, filtrowano, zatężano i chromatografowano; otrzymano amid.

Stosując metody opisane wyżej wytworzono związki:

w których NRR' ma znaczenie podane w Tabeli 5:

Tabela 5

Przykład	NRR’	(MH+)HRMS
85		576.2481
86		576.2472
87	H	513.2370
88	H	527.2517
89	H	543.2477
90	H	541.2669
91	vO.,0H	569.2632
92	n^Y-oh vv	569.2627

PL 214 718 B1

Stosowane przy wytwarzaniu farmaceutycznych kompozycji z opisanymi tutaj związkami, obojętne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą być ciałami stałymi lub cieczami. Preparaty w postaci ciała stałego obejmują proszki, tabletki, dyspergowalne granule, kapsułki, saszetki i czopki. Proszki i tabletki mogą zawierać od około 5 do około 95 procent składnika aktywnego. Odpowiednie stałe nośniki są znane w stanie techniki, np. węglan magnezu, stearynian magnezu, talk, cukier lub laktoza. Tabletki, proszki, saszetki i kapsułki mogą być stosowane, jako stałe postacie dawkowania odpowiednie do podawania doustnego. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych nośników i sposoby wytwarzania różnych kompozycji można znaleźć w publikacji A. Gennaro (ed.), The Science and Practice of Pharmacy. 20-te wydanie, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, (2000).

Ciekłe postacie preparatów obejmują roztwory, zawiesiny i emulsje. Przykładowo można wymienić wodne lub woda-glikol propylenowy roztwory do pozajelitowego wstrzykiwania, albo z dodanymi substancjami słodzącymi i zmętniającymi przeznaczone do podawania doustnego roztwory, zawiesiny i emulsje. Ciekłe postacie preparatów mogą także obejmować roztwory przeznaczone do podawania donosowego.

Preparaty aerozolowe odpowiednie do podawania przez inhalację mogą obejmować roztwory i stałe proszki, które mogą być w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, jak obojętny sprężony gaz, np. azot.

Takie kompozycje obejmują też stałe preparaty przeznaczone do przekształcania, na krótko przed ich użyciem, w ciekłe postacie preparatów zarówno do doustnego jak i pozajelitowego podawania. Takie ciekłe postacie obejmują roztwory, zawiesiny i emulsje.

Opisane wyżej związki mogą też być dostarczane przezskórnie. Kompozycje przeskórne mogą mieć postać kremów, lotionów, aerozoli i/albo emulsji, i mogą obejmować przeskórne plasterki typu matrycy albo zbiorniczka, które są konwencjonalnie stosowane w tej dziedzinie do tego celu.

Korzystnie związek podaje się doustnie.

Korzystnie, farmaceutyczny preparat ma postać jednostkowej dawki. W takiej postaci, preparat dzieli się na odpowiedniego wymiaru jednostkowe dawki zawierające odpowiednią ilość aktywnego składnika, np. skuteczną do osiągnięcia żądanego efektu.

Dzienna dawka związku o wzorze (I) do leczenia chorób, lub stanów, podanych powyżej wynosi około 0,001 do około 100 mg/kg masy ciała na dzień, korzystnie około 0,001 do około 10 mg/kg. Dla przeciętnej wagi ciała 70 kg, dawka wynosi od około 0,1 do około 700 mg leku na dzień, podawana w jednej dawce, albo w 2-4 dawkach podzielonych.

Ilość i częstotliwość podawania takich związków, i/albo ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, będzie regulowana zgodnie z oceną prowadzącego lekarza klinicysty, przy rozważaniu takich czynników jak wiek, stan i wielkość pacjenta, jak też ciężkość leczonych symptomów.

Związki o wzorze (I) można podawać razem z co najmniej jednym dodatkowym środkiem sercowo-naczyniowym. Rozważanym dodatkowym środkiem sercowo-naczyniowym jest taki, który różni się występującymi atomami, albo ich ustawieniem, od związków o wzorze (I). Dodatkowe środki sercowo-naczyniowe, które mogą być stosowane w kombinacji z nowymi związkami obejmują leki mające aktywność przeciw zakrzepową, przeciw agregacji płytek krwi, przeciw miażdżycową, przeciw nawrotowi zwężenia i/albo przeciw krzepnięciu krwi. Takie leki są użyteczne w leczeniu chorób związanych z zakrzepicą w tym zakrzepicą, miażdżycą tętnic, nawrotem zwężenia, nadciśnieniem, dusznicą bolesną, arytmią serca, niewydolnością serca, zawałem mięśnia sercowego, zapaleniem kłębuszkowym nerek, udarem zakrzepowym i udarem zakrzepowo-zatorowym, chorobami naczyń obwodowych, innymi chorobami sercowo-naczyniowymi, niedokrwieniem mózgu, chorobami zapalnymi i rakiem, jak też innymi chorobami, w których trombina i jej receptory pełnią patologiczne role. Odpowiednie środki sercowo-naczyniowe są wybrane z grupy składającej się z inhibitorów biosyntezy tromboksanu A2, jak aspiryna; antagonistów tromboksanu, jak seratrodast, pikotamid i ramatroban; inhibitorów difosforanów adenozyny (ADP), jak klopidogrel; inhibitorów cyklooksygenazy, jak aspiryna, meloksykam, rofekoksyb i celekobsyd; antagonistów angiotensyny, jak walsartan, telmisartan, kandesartran, irbesartran, losartan i eprosartan; antagonistów endoteliny, jak tezosentan; antagonistów fosfodiesterazy, jak milrinoon i enoksymon; inhibitorów enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE), jak kaptopril, enalapril, enaliprilat, spirapril, chinapril, perindopril, ramipril, fosinopril, trandolapril, lisinopril, moeksipril i benazapril; inhibitorów obojętnej endopeptydazy, jak kandoksatril i ekadotril; antykoagulantów, jak ksimelagatran, fondaparin i enoksaparin; diuretyków, jak chlorotiazyd, hydrochlorotiazyd, kwas etakrynowy, furosemid i amilorid; inhibitorów agregacji płytek krwi, jak abcyksymab i eptifibatyd; i antagonistów GP Ilb/IIIa.

PL 214 718 B1

Korzystnymi typami leków do stosowania w kombinacji z opisanymi tutaj związkami są inhibitory biosyntezy tromboksanu A2, inhibitory cyklooksygenazy i antagoniści ADP. W szczególności korzystnie do stosowania w takich kombinacjach są aspiryna i wodorosiarczan klopidogrelu.

W przypadku kombinacji związku o wzorze (I) i innego środka sercowo-naczyniowego, dwa aktywne składniki mogą być podawane jednocześnie lub kolejno, albo można podawać pojedynczą farmaceutyczną kompozycję zawierającą związek o wzorze (I) i drugi środek sercowo-naczyniowy w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Komponenty kombinacji można podawać pojedynczo, lub razem, w dowolnych konwencjonalnych postaciach dawkowania, jak kapsułki, tabletki, proszki, saszetki, zawiesiny, roztwory, czopki, donosowe spraye, itp. Dawki środka sercowo-naczyniowego można określić z różnych opublikowanych materiałów, i mogą wynosić od 1 do 1000 mg na dawkę.

W niniejszym opisie, określenie „co najmniej jeden związek o wzorze (I) oznacza, że jeden do trzech różnych związków o wzorze (I) można zastosować w farmaceutycznej kompozycji, lub opisanym sposobie leczenia. Korzystnie, stosuje się jeden związek o wzorze (I). Podobnie określenie „jeden albo więcej niż jeden dodatkowy środek sercowo-naczyniowy oznacza, że jeden do trzech dodatkowych leków można podawać w kombinacji ze związkiem o wzorze (I); korzystnie, jeden dodatkowy związek podaje się w kombinacji ze związkiem o wzorze (I). Dodatkowe środki sercowonaczyniowe można podawać kolejno, lub jednocześnie, z danym związkiem o wzorze (I).

Gdy oddzielne związki o wzorze (I) i inne środki sercowo-naczyniowe podaje się jako oddzielne kompozycje, to można je dostarczać w zestawie obejmującym w pojedynczym opakowaniu, jeden pojemnik zawierający związek o wzorze (I) w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, i oddzielny pojemnik zawierający drugi środek sercowo-naczyniowy w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, przy czym związek o wzorze (I) i drugi środek sercowo-naczyniowy występują w takich ilościach, że ich kombinacja jest terapeutycznie skuteczna. Taki zestaw jest korzystny do podawania, wtedy gdy np. komponenty muszą być podawane w różnych odstępach czasu, albo gdy mają różne postacie dawkowania.

Aktywność związków o wzorze (I) można określić w następujących procedurach.

Procedura testowania in vitro dla antagonistów receptora trombinowego

Wytwarzanie [³H]haTRAP

A(pF-F)R(ChA) (hR) (I2-Y)-NH2(1,03 mg) i 10% Pd/C (5,07 mg) zawieszono w DMF (250 pi) i diizopropyloetyloaminie (10 pl). Naczynie podłączono do linii trytu, zamrożono w ciekłym azocie odparowano w próżni. Następnie do kolby dodano gazowy tryt (342 mCi), mieszano w rt przez godz. Po zakończeniu reakcji usunięto nadmiar trytu a roztwór przereagowanego peptydu rozcieńczono DMF (0,5 ml) i filtrowano dla usunięcia katalizatora, zebrany roztwór surowego peptydu rozcieńczono wodą i liofilizowano dla usunięcia labilnego trytu, ciało stałe peptydu powtórnie rozpuszczo₃ no w wodzie i powtórzono proces liofilizacji, peptyd z trytem ([³H]haTRAP) rozpuszczono w 0,5 ml

0,1% wodnego roztworu TFA i oczyszczano za pomocą HPLC w warunkach: kolumna: Vydac C18, cm x 9,4 mm I.D.; faza ruchoma: (A) 0,1% TFA w wodzie, (B) 0,1% TFA w CH3CN; gradient: (A/B) od 10% do 40/60 w ciągu 30 minut; szybkość przepływu: 5 ml/min; detekcja: UV przy 215 nm, radio₃ chemiczna czystość [³H]haTRAP: 99% jak zanalizowano za pomocą HPLC. Otrzymano porcję 14,9 mCi o specyficznej aktywności 18,4 Ci/mmol.

Wytwarzanie membran płytek krwi

Membrany płytek krwi wytwarzano stosując modyfikację metody Natarajan'a i in. (Natarajan i in., Int. J. Peptide Protein Res, tom 45, str. 145-151(1995)) z 20 jednostkami koncentratów płytek krwi otrzymanych z North Jersey Blood Center (East Orange, NJ) z kolekcji 48 godzinnej. Wszystkie etapy prowadzono w 4°C w odpowiednio bezpiecznych warunkach. Płytki krwi wirowano 100x g przez 20 minut w 4°C dla usunięcia czerwonych komórek, supernatanty zdekantowano i wirowano 3000x g przez 15 min. dla zgrudkowania płytek krwi. Płyki krwi powtórnie zawieszono w 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, do całkowitej objętości 200 ml i wirowano 4400x g przez 10 min. Ten etap powtórzono jeszcze dwa razy. Płytki krwi zawieszono powtórnie w 5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA do końcowej objętości w przybliżeniu 30 ml i homogenizowano z 20 uderzeniami w homogenizatorze Dounce. Grudkowano membrany przy 41000x g, powtórnie zawieszono w 40-50 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM ditiotreitolu i 10 ml podjednostki zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C. Dla zakończenia procesu wytwarzania membran podjednostki rozmrażano, zbierano i homogenizowano z 5 uderzeniami w homogenizatorze Dounce. Membrany grudkowano i przemywano 3 krotnie 10 mM trietanoloamina-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, i powtórnie zawiePL 214 718 B1 szano w 20-25 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, i 1% DMSO. Podjednostki membran zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C. Membrany były stabilne przez co najmniej 3 miesiące. 20 jednostek koncentratów płytek krwi zazwyczaj dawało 250 mg membran protein. Stężenie protein było określane testem Lowry'ego (Lowry i in., J. Biol. Chem., tom 193; str. 265275(1951)).

Wysokosprawny test przyłączania Radioligandu receptora trombinowego

Antagoniści receptora trombinowego byli badani przy użyciu testu przyłączania radioligandu receptora trombinowego Ahn'a i in. (Ahn i in., Mol. Pharmacol., tom 51; str. 350-356(1997)). Test prowadzono w 96 otworkowych płytach Nunc (Cat. Nr 269620) w końcowej objętości 200 pl. Membrany pły₃ tek krwi i [³H]haTRAP rozpuszczano odpowiednio do 0,4 mg/ml i 22,2 nM, w wiążącym buforze (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% BSA). Wyjściowe roztwory (10 mM w 100% DMSO) badanych związków rozpuszczano dalej w 100% DMSO. Jeżeli nie wskazano inaczej to 10 pl roztworu rozcieńczonego związku i 90 pl radioligandu (końcowe stężenie 10 nM w 5% DMSO) dodawano do każdego dołka i rozpoczynano reakcję przez dodanie 100 pl membran (40 pg proteiny/dołek). Wiązanie nie było znacząco hamowane przez 5% DMSO. Związki testowano w trzech stężeniach (0,1, 1 i 10 pM). Płyty przykryto i łagodnie mieszano na wytrząsarce Lab-Line Titer Plate Shaker przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Packard UniFilter GF/C filtrowe płytki zanurzano na co najmniej 1 godzinę w 0,1% polyetylenoiminie. Inkubowane membrany utwardzano przy użyciu Packard FilterMate Universal Harvester i szybko przemywano cztery razy 300 pl chłodzonym lodem roztworem 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA. Scyntylacyjny koktajl MicroScint 20 (25 pl) dodawano do każdego dołka, i płytki liczono w liczniku Packard TopCount Microplate Scintillation Counter. Specyficzne przyłączenie było definiowane jako całkowite przyłączenie minus niespecyficzne przyłączenie obserwowane w obecności nadmiaru (50 pM) nieznaczonego haTRAP.

₃ % zahamowania przez związek przyłączenia [³H]haTRAP do receptorów trombinowych był obliczany z następującego równania:

całkowite przyłączenie - przyłączenie w obecności badanego związku % zahamowania = ------------------------------------------------------------------------------------------- x 100 całkowite przyłączenie - niespecyficzne przyłączenie

Wartości powinowactwa (Ki) określano stosując poniższy wzór:

^IC50

Ki = -------------------------------------------------------------Stężenie radioligandu + -------------------------------------------powinowactwo (KD) radioligandu

Zatem, mniejsza wartość Ki wskazuje na większe powinowactwo do wiązania.

Materiały

A(pF-F)R(ChA)(hR)Y-NH₂ i A(pF-F)R(ChA)(hR)(I₂-Y)NH₂, były zwyczajnie syntetyzowane przez AnaSpec Inc. (San Jose, CA). Czystość tych peptydów wynosiła >95%. Gazowy tryt (97%) był dostarczany z firmy EG&G Mound, Miamisburg Ohio. Gaz był ładowany i przechowywany w urządzeniu IN/US Systems Inc. Trisorber. Koktail scyntylacyjny MicroScint 20 otrzymano z firmy Packard Instrument Co.

Test ex-vivo agregacji płytek krwi Cynomolgus dla pełnej krwi

Podawanie leku i zbieranie krwi

Świadome siedzące małpy cynomolgus pozostawiono do aklimatyzacji przez 30 min. Cewnik igłowy wprowadzono do żyły barkowej dla wprowadzania testowanych leków. Inny cewnik igłowy wprowadzano do drugiej żyły barkowej lub do piszczelowej i używano do pobierania próbek krwi. W tych doświadczeniach związek jest podawany doustnie i tylko jeden cewnik jest używany. Podstawową próbkę krwi (1-2 ml) pobiera się do próżniowej probówki zawierającej inhibitor trombinowy CVS 2139 (100 pg/0,1 ml solanki) jako antykoagulant. Lek następnie wprowadza się dożylnie w czasie

PL 214 718 B1 min. Pobiera się próbki krwi w 5, 10, 20, 30 minucie i w 30, 60, 90 minut po zakończeniu podawania leku. W doświadczeniach PO zwierzętom dawkowano lek przy użyciu zgłębnikowej kaniuli. Próbki krwi pobierano w czasie 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360 minut po podaniu. 0,5 ml krwi używano do agregacji pełnej krwi a drugie 0,5 ml krwi używano do określania stężenia w plazmie leku lub jego metabolitów. Agregację prowadzi się bezpośrednio po pobraniu próbek krwi, jak opisano poniżej.

Agregacja pełnej krwi

0,5 ml próbkę krwi dodano do 0,5 ml solanki i ogrzano do 37°C w agregometrze pełnej krwi Chronolog. Jednocześnie elektrodę impedancji ogrzewano w solance do 37°C. Próbkę krwi z kostką mieszającą umieszczano w ogrzewanym naczyniu, w próbce umieszczano elektrodę impedancji i rozpoczynano sterowany komputerem pomiar. Pomiar prowadzi się dopóki nie ustabilizuje się linia bazowa, następnie stosuje się opór 20Ω. Wartość 20Ω odpowiada 4 blokom na grafie generowanym przez program komputerowy. Dodaje się antagonistę (haTRAP) przez odpowiednio skalibrowaną pipetę (5-25 pl) i rysuje się krzywą agregacji przez 10 minut. Zapisywaną wartością jest maksimum agregacji w 6 minucie po podaniu antagonisty.

Agregacja płytek krwi in vitro

Badanie agregacji płytek krwi prowadzono zgodnie z metodą Bednar'a i in. (Bednar, B., Condra, C., Gould, R.J., i Connolly, T M., Trom. Res., tom 77; str. 453-463(1995)). Krew pobierano od zdrowych ludzi, którzy nie przyjmowali aspiryny przez co najmniej 7 dni, przez nakłucie żył stosując ACD jako antykoagulant. Wytwarzano plazmę wzbogaconą w płytki krwi przez wirowanie 100x g przez 15 min. w 15°C. Płytki krwi bryłkowano przy obrotach 3000x g i dwukrotnie przemywano buforowaną solanką zawierającą 1 mM EGTA i 20 pg/ml apirazy dla zahamowania agregacji. Agregacja zachodziła w rt w buforowanej solance uzupełnionej 0,2 mg/ml ludzkiego fibrynogenu. Badane związki i płytki krwi wstępnie inkubowano w 96-dołkowych, o płaskich dnach, płytach przez 60 minut. Agregację rozpoczynano przez dodawanie 0,3 μΜ haTRAP lub 0,1 U/ml trombiny i szybkie wytrząsanie mieszaniny przy użyciu Lab Line Titer Plate Shaker (szybkość 7). Kontrolowano procent agregacji jako wzrost transmitancji światła przy 405 nm w czytniku Spectromax Plate Reader.

Procedura przeciwrakowa in vivo

Prowadzono testy na modelu ludzkiego raka piersi u nagich myszy zgodnie z procedurą opisaną przez S. Even-Ram i in. Nature Medicine, 4, 8, str. 909-914(1988).

Opisane tutaj związki są nieoczekiwanie aktywne w modelowym teście agregacji płytek krwi exvivo. W tych badaniach związek według Przykładu 2, tj. związek według niniejszego wynalazku, po poustnym podaniu dawki 0,1 mg/kg, całkowicie hamował agregacje płytek krwi wywoływaną przez egzogennie podany peptyd aktywujący trombinowy receptor przy czasie pomiaru 24 godz. Nawet po 48 godz. utrzymywało się odpowiednio 65% zahamowania agregacji płytek krwi. Przeciwnie, analog N-alkilo-karbaminianowy, związki z Przykładów 1Α, 2A i 13 z US-6 063 847, były badane w podobnych warunkach w dawce 0,5 mg/kg, czyli w 5-krotnym zwiększeniu dawki stosowanej dla związku z Przykładu 2 (według niniejszego wynalazku). W tych warunkach N-alkilowe związki nie wykazały znacznego zahamowania agregacji płytek krwi w różnych punktach czasowych.

Claims (5)

1. Związek o wzorze strukturalnym albo jego farmaceutycznie dopuszczalny izomer, sól lub solwat.

PL 214 718 B1

2. Związek według zastrz. 1, którego solą jest wodorosiarczan.

3. Farmaceutyczna kompozycja zawierająca składnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera skuteczną ilość związku jak określony w zastrz. 1-2.

4. Zastosowanie związku jak określony w zastrz. 1-2, do wytwarzania leku do leczenia zakrzepicy, miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia, nadciśnienia, dusznicy bolesnej, arytmii serca, niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego, udaru zakrzepowego, udaru zakrzepowo-zatorowego, chorób obwodowego układu naczyniowego.

5. Zastosowanie związku jak określony w zastrz. 1-2, w kombinacji z dodatkowym środkiem sercowo-naczyniowym do wytwarzania leku do leczenia zakrzepicy, miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia, nadciśnienia, dusznicy bolesnej, arytmii serca, niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego, udaru zakrzepowego, udaru zakrzepowo-zatorowego, chorób obwodowego układu naczyniowego.