CN116133660A - 可用作因子XIa抑制剂的化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及因子XIa抑制剂、其互变异构体、立体异构体、同位素体及其药学上可接受的盐和溶剂化物、含有所述化合物的药物组合物以及所述化合物在治疗和/或预防血栓栓塞性病症、炎性病症和其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状中的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月22日提交的美国临时申请63/054,826的权益，其全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及因子XIa抑制剂、其互变异构体、立体异构体、同位素体及其药学上可接受的盐和溶剂化物、含有所述化合物的药物组合物以及所述化合物在治疗和/或预防血栓栓塞性病症、炎性病症和其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状中的用途。
背景技术
尽管可获得抗凝血剂诸如华法林(warfarin)
肝素、低分子量肝素(LMWH)以及合成的五糖和抗血小板剂诸如阿司匹林(aspirin)和氯吡格雷(clopidogrel)
但是血栓栓塞性疾病仍然是发达国家主要的死亡原因。口服抗凝血剂华法林抑制凝血因子VII、IX、X和凝血酶原的翻译后成熟，并且已经证明在静脉和动脉血栓形成中有效。然而，由于其治疗指数窄、治疗效果起效缓慢、多种饮食和药物相互作用以及需要监测和剂量调整，其使用受到限制。因此，发现和开发用于预防和治疗大范围的血栓栓塞性病症的安全且有效的口服抗凝血剂已经变得越来越重要。
因子XIa是牵涉血凝调节的血浆丝氨酸蛋白酶。虽然血凝是调节生物体稳态的必要且重要的部分，但是异常的血凝也可具有有害作用。例如，血栓形成是血管或心腔内部血块的形成或存在。这种血块可留在血管中，阻塞循环并诱发心脏病发作或中风。血栓栓塞性病症是工业化世界中死亡和残疾的最大原因。
血液凝结是控制哺乳动物存活所必需的血流的过程。伤口愈合后凝结以及凝块的后续溶解的过程已经发生，在血管损伤后开始并且可以分成四个阶段。第一阶段，血管收缩或血管挛缩，可导致受损区域的失血减少。在下一阶段，血小板受凝血酶活化，血小板附着于血管壁损伤部位并形成血小板聚集物。在第三阶段，凝结复合物的形成导致凝血酶的大量形成，凝血酶通过两个小肽的切割将可溶性纤维蛋白原转化成纤维蛋白。在第四阶段，在伤口愈合后，通过内源纤维蛋白溶解系统的关键酶即纤溶酶的作用溶解血栓。
两种可替代的途径可导致纤维蛋白凝块的形成，即内源性途径和外源性途径。这些途径通过不同的机制引发，但在后一阶段它们会聚以产生凝结级联的共同最终途径。在该最终凝结途径中，凝结因子X被活化。活化的因子X负责由在血液中循环的无活性前体凝血酶原形成凝血酶。在没有伤口的异常血管壁的底部形成血栓是内源性途径的结果。作为对组织损伤或损害的响应的纤维蛋白凝块形成是外源性途径的结果。两种途径都包含相对大量的蛋白质，这些蛋白质被称为凝结因子。内源性途径需要凝结因子V、VIII、IX、X、XI和XII并且还需要前激肽释放酶、高分子量激肽原、钙离子和来自血小板的磷脂。
因子XIa，一种牵涉血凝调节的血浆丝氨酸蛋白酶，在体内通过组织因子(TF)与因子VII(FVII)的结合而引发，以生成因子VIIa(FVIIa)。所得TF:FVIIa复合物活化因子IX(FIX)和因子X(FX)，导致因子Xa(FXa)的产生。在该途径被组织因子途径抑制剂(TFPI)关闭之前，生成的FXa催化凝血酶原转化成少量凝血酶。然后该凝血过程经由催化量的凝血酶对因子V、VIII和XI的反馈活化进一步传播。(Gailani,D.等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,27:2507-2513(2007))。所引起的凝血酶爆发将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，纤维蛋白聚合形成血块的结构框架，并活化血小板，血小板是凝血的关键细胞组分(Hoffman,M.,Blood Reviews,17:S1-S5(2003))。因此，因子XIa在传播该扩增环中起关键作用，因此是抗血栓形成疗法的有吸引力的靶标。
除了经由组织因子刺激外，凝血系统尤其可以在带负电荷的表面上被活化，这些表面不仅包括外来细胞(例如细菌)的表面结构，而且包括人造表面，诸如血管假体、支架和体外循环。在表面上，最初因子XII(FXII)被活化为因子XIIa，其随后将附着于细胞表面的因子XI活化为因子XIa。这导致如上所述的凝血级联的进一步活化。另外，因子XIIa还将结合的血浆前激肽释放酶活化为血浆激肽释放酶(PK)，后者在增强环中导致进一步的因子XII活化，总体上引起凝血级联起始的放大。另外，PK是一种重要的缓激肽释放蛋白酶，其导致内皮渗透性增加。已经描述的其它底物是肾素原和尿激酶原，它们的活化可以影响肾素-血管紧张素系统和纤维蛋白溶解的调节过程。因此PK的活化是凝血和炎性过程之间的重要联系。
因此，仍然需要具有适于用作治疗和/或预防血栓栓塞性病症的人类药物的药代动力学和药效学特性的因子XIa抑制剂化合物。
发明内容
本发明涉及式(I)的化合物
也称为7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
本发明还涉及式(II)的化合物
也称为4-(2-(7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
本发明还涉及式(III)的化合物
也称为4-(2-(7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
本发明还涉及式(IV)的化合物
也称为7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸及其立体异构体、同位素体和盐。
本发明还涉及式(V)的化合物
其中A1是C1-4烷基，及其立体异构体、同位素体和盐。
本发明还涉及式(VI)的化合物
其中A2为C1-4烷基，并且A3选自-O-SO2-CF3、-O-SO2-CF2CF2H或-O-SO2-CF2CF2CF3，及其立体异构体、同位素体和盐。
本发明还涉及制备式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物、式(IV)的化合物、式(V)的化合物或式(VI)的化合物的方法。本发明还涉及根据本文所述的任何方法制备的式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物、式(IV)的化合物、式(V)的化合物或式(VI)的化合物。
本发明的示例是包含药学上可接受的载体和如本文所述的式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物的药物组合物。本发明的一个示例是通过将如本文所述的式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物与药学上可接受的载体混合而制成的药物组合物。说明本发明是制备药物组合物的方法，该方法包括将如本文所述的式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物与药学上可接受的载体混合。
举例说明本发明是用于治疗和/或预防如本文所述的血栓栓塞性病症、炎性病症或其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状的方法，这些方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的任何上述化合物或药物组合物。
举例说明本发明是用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症的方法，这些血栓栓塞性病症诸如动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管血栓栓塞性病症、动脉脑血管血栓栓塞性病症和静脉脑血管血栓栓塞性病症，这些方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的任何上述化合物或药物组合物。血栓栓塞性病症的示例包括但不限于不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心房纤颤、首发性心肌梗塞、复发性心肌梗塞、缺血性猝死、短暂性脑缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉栓塞形成、脑动脉栓塞形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。
在一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，这些化合物用作药物。在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，这些化合物用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症、炎性病症或其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，这些化合物用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症，诸如动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管血栓栓塞性病症、动脉脑血管血栓栓塞性病症和静脉脑血管血栓栓塞性病症。在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，这些化合物用于治疗和/或预防选自由以下项组成的组的血栓栓塞性病症：不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心房纤颤、首发性心肌梗塞、复发性心肌梗塞、缺血性猝死、短暂性脑缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉栓塞形成、脑动脉栓塞形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物或式(II)的化合物，这些化合物用于治疗和/或预防选自由遗传性血管水肿(HAE)和糖尿病性黄斑水肿(DME)组成的组的血栓栓塞性病症。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，用于治疗和/或预防如本文所述的病症、疾病或病状。在另一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，该化合物包含式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症、炎性病症或其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症，诸如动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管血栓栓塞性病症、动脉脑血管血栓栓塞性病症和静脉脑血管血栓栓塞性病症。在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，用于治疗和/或预防选自由以下项组成的组的血栓栓塞性病症：不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心房纤颤、首发性心肌梗塞、复发性心肌梗塞、缺血性猝死、短暂性脑缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉栓塞形成、脑动脉栓塞形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含式(I)的化合物或式(II)的化合物，用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症诸如遗传性血管水肿(HAE)和糖尿病性黄斑水肿(DME)。
本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在制备用于治疗和/或预防如本文所述的病症、疾病或病状的药物中的用途。本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在制备用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症、炎性病症或其中牵涉血浆激肽释放酶活性的病症或病状的药物中的用途。
本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在制备用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症的药物中的用途，该血栓栓塞性病症选自由以下项组成的组：(a)动脉心血管血栓栓塞性病症、(b)静脉心血管血栓栓塞性病症、(c)动脉脑血管血栓栓塞性病症和(d)静脉脑血管血栓栓塞性病症。本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在制备用于治疗和/或预防以下疾病的药物中的用途：(a)不稳定型心绞痛、(b)急性冠状动脉综合征、(c)心房纤颤、(d)首发性心肌梗塞、(e)复发性心肌梗塞、(f)缺血性猝死、(g)短暂性脑缺血发作、(h)中风、(i)动脉粥样硬化、(j)外周闭塞性动脉疾病、(k)静脉血栓形成、(l)深静脉血栓形成、(m)血栓性静脉炎、(n)动脉栓塞、(o)冠状动脉栓塞形成、(p)脑动脉栓塞形成、(q)脑栓塞、(r)肾栓塞、(s)肺栓塞，或(t)由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在制备用于治疗和/或预防以下疾病的药物中的用途：(a)遗传性血管水肿(HAE)或(b)糖尿病性黄斑水肿(DME)。
本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在用于治疗对其有需要的受试者中如本文所述的血栓栓塞、炎性或其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状的方法中的用途。
本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在用于治疗和/或预防对其有需要的受试者中的以下疾病的方法中的用途：(a)动脉心血管血栓栓塞性病症、(b)静脉心血管血栓栓塞性病症、(c)动脉脑血管血栓栓塞性病症或(d)静脉脑血管血栓栓塞性病症。本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在用于治疗和/或预防对其有需要的受试者中的以下疾病的方法中的用途：(a)不稳定型心绞痛、(b)急性冠状动脉综合征、(c)心房纤颤、(d)首发性心肌梗塞、(e)复发性心肌梗塞、(f)缺血性猝死、(g)短暂性脑缺血发作、(h)中风、(i)动脉粥样硬化、(j)外周闭塞性动脉疾病、(k)静脉血栓形成、(l)深静脉血栓形成、(m)血栓性静脉炎、(n)动脉栓塞、(o)冠状动脉栓塞形成、(p)脑动脉栓塞形成、(q)脑栓塞、(r)肾栓塞、(s)肺栓塞，或(t)由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。本发明的另一个示例是本文所述的任何化合物在用于治疗和/或预防对其有需要的受试者中的以下疾病的方法中的用途：(a)遗传性血管水肿(HAE)或(b)糖尿病性黄斑水肿(DME)。
在另一个示例中，本发明涉及如本文所述的化合物，该化合物用于治疗和/或预防对其有需要的受试者中的如本文所述的病症、疾病或病状的方法中。在另一个示例中，本发明涉及如本文所述的化合物，该化合物用于治疗和/或预防对其有需要的受试者中如本文所述的血栓栓塞性病症、炎性病症或其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状的方法中。
在另一个示例中，本发明涉及如本文所述的化合物，该化合物用于治疗和/或预防对其有需要的受试者中的血栓栓塞性病症的方法中，该血栓栓塞性病症诸如动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管血栓栓塞性病症、动脉脑血管血栓栓塞性病症和静脉脑血管血栓栓塞性病症。在另一个示例中，本发明涉及如本文所述的化合物，该化合物用于治疗和/或预防对其有需要的受试者中的以下疾病的方法中：不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心房纤颤、首发性心肌梗塞、复发性心肌梗塞、缺血性猝死、短暂性脑缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉栓塞形成、脑动脉栓塞形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。在另一个示例中，本发明涉及如本文所述的化合物，该化合物用于治疗和/或预防对其有需要的受试者中的遗传性血管水肿(HAE)或糖尿病性黄斑水肿(DME)的方法中。
本发明还涉及如本文所述的化合物、组合物(例如药物组合物)、治疗方法、制备方法或用途。
具体实施方式
本发明涉及式(I)的化合物
及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还涉及式(II)的化合物
及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还涉及式(III)的化合物
及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
本发明的式(I)的化合物、式(II)的化合物和式(III)的化合物可用于治疗和/或预防血栓栓塞性病症、炎性病症和其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-A)的化合物
也称为(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-B)的化合物
也称为(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基-4-d)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-C)的化合物
也称为(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-D)的化合物
也称为(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-E)的化合物
也称为(3S*,8aS)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-F)的化合物
也称为(3S,8aR*)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-G)的化合物
也称为(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-1,1,8,8,8a-d5及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-H)的化合物
也称为(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基-4-d)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-J)的化合物
也称为(3R,8aS)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基-d)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-K)的化合物
也称为(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8,8,8a-d3及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I-L)的化合物
也称为(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-A)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-B)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基-4-d)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-D)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-8a-d)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-E)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aS)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-8a-d)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-F)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR*)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-8a-d)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-G)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-1,1,8,8,8a-d5)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-J)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基-d)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-K)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-8,8,8a-d3)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(II-L)的化合物
也称为4-(2-((3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-A)的化合物
也称为(4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-B)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基-4-d)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶-1-氧化物、其立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-C)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-D)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-8a-d)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-E)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aS)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-8a-d)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-F)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR*)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-8a-d)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-G)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-1,1,8,8,8a-d5)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-H)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基-4-d)-3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-J)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基-d)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-K)的化合物
也称为4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基-8,8,8a-d3)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明涉及式(III-L)的化合物
也称为4-(2-((3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶-1-氧化物及其互变异构体、立体异构体、同位素体和药学上可接受的盐或溶剂化物。
本发明还涉及式(IV)的化合物
也称为7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸及其立体异构体、同位素体和盐。本发明还涉及式(V)的化合物
及其立体异构体、同位素体和盐。本发明还涉及式(VI)的化合物
其中A2为C1-4烷基，并且A3选自-O-SO2-CF3、-O-SO2-CF2CF2H或-O-SO2-CF2CF2CF3，及其立体异构体、同位素体和盐。
式(IV)的化合物、式(V)的化合物和式(VI)的化合物在式(I)的化合物、式(II)的化合物和/或式(III)的化合物的合成中可用作中间体。
在某些实施方案中，本发明还涉及式(IV-A)的化合物
也称为(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸及其立体异构体、同位素体和盐。
在本发明的某些实施方案中，A1是C2-4烷基。在本发明的某些实施方案中，A1选自由甲基、乙基、异丙基和叔丁基组成的组。在本发明的某些实施方案中，A1选自由甲基、乙基和叔丁基组成的组。在本发明的某些实施方案中，A1选自甲基或乙基。在本发明的某些实施方案中，A1是甲基或叔丁基。在本发明的某些实施方案中，A1是甲基。在本发明的某些实施方案中，A1是乙基或叔丁基。在本发明的某些实施方案中，A1是乙基。
在某些实施方案中，本发明涉及式(V-S)的化合物
也称为5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯及其立体异构体、同位素体和盐。在某些实施方案中，本发明还涉及式(V-A)的化合物
也称为(3S)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯及其立体异构体、同位素体和盐。
在本发明的某些实施方案中，A2选自由甲基、乙基、异丙基和叔丁基组成的组。在本发明的某些实施方案中，A2选自由甲基、乙基和叔丁基组成的组。在本发明的某些实施方案中，A2选自甲基或乙基。在本发明的某些实施方案中，A2是甲基或叔丁基。在本发明的某些实施方案中，A2是甲基。
在本发明的某些实施方案中，A3选自-O-SO2-CF3或-O-SO2-CF2CF2H。在本发明的某些实施方案中，A3选自-O-SO2-CF3或-O-SO2-CF2CF2CF3。在本发明的某些实施方案中，A3是-O-SO2-CF3。在本发明的某些实施方案中，A3是-O-SO2-CF2CF2H。在本发明的某些实施方案中，A3是-O-SO2-CF2CF2CF3。
本发明涉及式(VI-S)的化合物
也称为5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯及其立体异构体、同位素体和盐。在某些实施方案中，本发明涉及式(VI-A)的化合物
也称为(3S,8aR)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯及其立体异构体、同位素体和盐。
在本发明的某些实施方案中，式(IV)的化合物、式(V)的化合物和/或式(VI)的化合物以过量的对应8S-对映体存在。
在某些实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防血栓栓塞性病症的方法，该方法包括向需要这种治疗和/或预防的患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物中的至少一者。
如本文所用，术语“血栓栓塞性病症”包括动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管或脑血管血栓栓塞性病症以及心腔中或外周循环中的血栓栓塞性病症。如本文所用，术语“血栓栓塞性病症”还包括选自但不限于以下的特定病症：不稳定型心绞痛或其它急性冠状动脉综合征、心房纤颤、首发性或复发性心肌梗塞、缺血性猝死、短暂性脑缺血发作、卒中、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉栓塞形成、脑动脉栓塞形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。医疗植入物或装置包括但不限于：假体瓣膜、人工瓣膜、留置导管、支架、血液氧合器、分流器、血管接入口、心室辅助装置和人工心脏或心腔以及血管移植物。手术包括但不限于：心肺旁路术、经皮冠状动脉介入术和血液透析。在某些实施方案中，术语“血栓栓塞性病症”包括急性冠状动脉综合征、中风、深静脉血栓形成和肺栓塞。在某些实施方案中，“血栓栓塞性病症”包括遗传性血管水肿(HAE)和糖尿病性黄斑水肿(DME)。
在某些实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防炎性病症的方法，该方法包括：向需要这种治疗和/或预防的患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物中的至少一者。炎性病症的示例包括但不限于脓毒症、急性呼吸窘迫综合征和全身炎性响应综合征。
在某些实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状的方法，该方法包括：向需要这种治疗和/或预防的患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物中的至少一者。其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状包括但不限于：视敏度受损、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管水肿、糖尿病、胰腺炎、肾病、心肌病、神经病变、炎性肠病、关节炎、炎症、脓毒性休克、低血压、癌症、成人呼吸窘迫综合征、弥散性血管内凝血和心肺旁路手术。
在某些实施方案中，本发明提供了用于初级预防血栓栓塞性病症的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于初级预防血栓栓塞性病症的方法，其中该血栓栓塞性病症选自不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心房纤颤、心肌梗塞、缺血性猝死、短暂性脑缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉栓塞形成、脑动脉栓塞形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。在另一个实施方案中，本发明提供了用于初级预防血栓栓塞性病症的方法，其中该血栓栓塞性病症选自急性冠状动脉综合征、中风、静脉血栓形成和由医疗植入物和装置引起的血栓形成。
在某些实施方案中，本发明提供了用于次级预防血栓栓塞性病症的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于次级预防血栓栓塞性病症的方法，其中该血栓栓塞性病症选自不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心房纤颤、复发性心肌梗塞、短暂性脑缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉栓塞形成、脑动脉栓塞形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由医疗植入物、装置或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的手术引起的血栓形成。在另一个实施方案中，本发明提供了用于次级预防血栓栓塞性病症的方法，其中该血栓栓塞性病症选自急性冠状动脉综合征、中风、心房纤颤和静脉血栓形成。
在本发明的某些实施方案中，式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物可以与一种或多种抗凝血剂、抗凝血酶剂、抗血小板剂、纤维蛋白溶解剂、降血脂剂、抗高血压剂和/或抗缺血剂组合施用。合适的示例包括但不限于华法林、肝素、抑肽酶、合成的五糖、硼精氨酸衍生物、硼肽、肝素、水蛭素、阿加曲班(argatroban)、血栓烷-A2-受体拮抗剂、血栓烷-A2-合成酶抑制剂、PDE-III抑制剂、PDE V抑制剂、ADP受体拮抗剂、嘌呤能受体P2Y1的拮抗剂、嘌呤能受体P2Y12的拮抗剂、组织纤溶酶原激活物及其改性形式、阿尼普酶(anistreplase)、尿激酶、链激酶、替奈普酶(tenecteplase)、拉诺替普酶(lanoteplase)、PAI-I抑制剂、α-2-抗纤维蛋白溶酶抑制剂、茴香酰化纤溶酶原链激酶激活物复合物、HMG-CoA还原酶抑制剂、角鲨烯合成酶抑制剂、贝特(fibrate)、胆酸螯合剂、ACAT抑制剂、MTP抑制剂、脂肪氧合酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转运蛋白抑制剂、α肾上腺素能阻断剂、β肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、利尿剂、肾素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素-II-受体拮抗剂、ET受体拮抗剂、双重ET/A11拮抗剂、中性内肽酶抑制剂、血管肽酶抑制剂、I类药剂、II类药剂、III类药剂、IV类药剂、IAch抑制剂、IKur抑制剂和强心苷。
如本文所用，符号“*”应表示存在立体中心。
如果根据本发明的化合物具有至少一个手性中心，则它们可以对映体形式相应地存在。如果化合物具有两个或更多个手性中心，则它们另外可以非对映体形式存在。应当理解，所有的此类异构体及其混合物涵盖在本发明的范围内。
技术人员将认识到，在对本发明的化合物进行命名时，S*(或*S)和R*(或*R)名称指示尽管该化合物是以过量的对应立体异构体制备的/或存在的，但确切的立体构型未确定。S和R名称指示该化合物是以过量的对应S或R立体异构体制备的/或存在的，确切的立体构型正如指出的那样。
优选地，如果化合物以对映体形式存在，则该对映体以大于或等于约80％的对映体过量存在，更优选地以大于或等于约90％的对映体过量存在，还更优选地以大于或等于约95％的对映体过量存在，还更优选地以大于或等于约98％的对映体过量存在，最优选地以大于或等于约99％的对映体过量存在。类似地，如果化合物以非对映体形式存在，则该非对映体以大于或等于约80％的非对映体过量存在，更优选地以大于或等于约90％的非对映体过量存在，还更优选地以大于或等于约95％的非对映体过量存在，还更优选地以大于或等于约98％的非对映体过量存在，最优选地以大于或等于约99％的非对映体过量存在。
在某些实施方案中，本发明涉及为R-对映体或S-对映体之一(在标有“*”的任一立体中心处)的对映体过量的式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物。在本发明的某些实施方案中，式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物以约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的R-对映体或S-对映体之一(在标有“*”的任一立体中心处)的对映体过量存在。优选地，式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物以大于或等于约80％，优选地大于或等于约90％，更优选地大于或等于约93％，更优选地大于或等于约95％，更优选地大于或等于约97％，更优选地大于或等于约98％，更优选地大于或等于约99％的R-对映体或S-对映体之一(在标有“*”的任一立体中心处)的对映体过量存在。
在某些实施方案中，本发明涉及为可能的非对映体或立体异构体之一的非对映体或立体异构过量的式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物。在本发明的某些实施方案中，式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物以约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的可能的非对映体或立体异构体之一的非对映体或立体异构过量存在。优选地，式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物以大于或等于约80％，优选地大于或等于约90％，更优选地大于或等于约93％，更优选地大于或等于约95％，更优选地大于或等于约97％，更优选地大于或等于约98％，更优选地大于或等于约99％的可能的非对映体或立体异构体之一的非对映体或立体异构过量存在。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，其中在六氢吲哚嗪-5(1H)-酮的3-位的立体中心以对应的S立体异构体或R立体异构体的立体异构过量存在。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，其中在六氢吲哚嗪-5(1H)-酮的8-位的立体中心以对应的S立体异构体或R立体异构体的立体异构过量存在。
在某些实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物，其中在六氢吲哚嗪-5(1H)-酮的3-位的立体中心以对应的S立体异构体的立体异构过量存在，并且其中在六氢吲哚嗪-5(1H)-酮的8-位的立体中心以对应的R立体异构体的立体异构过量存在。
此外，本发明的化合物的一些晶体形式可以多晶型存在，并且同样旨在包括于本发明中。此外，本发明的一些化合物可与水形成溶剂化物(即水合物)或与常用有机溶剂形成溶剂化物，并且此类溶剂化物也旨在涵盖在本发明的范围内。
除非另有说明，否则如本文所用，术语“同位素体”应意指仅在其同位素组成方面不同的分子。更具体地说，分子的同位素体与母体分子的不同之处在于它含有至少一个是同位素的原子(即具有与其母体原子不同数目的中子)。
例如，水的同位素体包括但不限于“轻水”(HOH或H2O)，具有与氕相等比例的氘同位素的“半重水”(HDO或1H2HO)，每个分子具有氢的两个氘同位素的“重水”(D2O或2H2O)，其中氢原子被氚(3H)同位素取代的“超重水”或氚化水(T2O或3H2O)，两种重-氧水同位素体(H2 18O和H2 17O)及其中氢原子和氧原子可以各自独立地被同位素取代的同位素体，例如双标记的水同位素体D2 18O。在某些实施方案中，同位素体可以是“同位素异构体(isotopomer)”。同位素异构体包括仅基于同位素体位置的结构异构体和立体异构体。例如，CH3CHDCH3和CH3CH2CH2D是正丙烷的一对结构同位素异构体；而(R)-CH3CHDOH和(S)-CH3CHDOH或者(Z)-CH3CH＝CHD和(E)-CH3CH＝CHD分别是乙醇和正丙烯的同位素体立体异构体的示例。
在本发明的范围内，任一个或多个元素(尤其是当针对式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物而提及时)意在应以其天然丰度或以其同位素富集形式包含所述元素的全部同位素体或同位素混合物(天然存在的或合成制备的)。例如，对氢的提及在其范围内包括1H、2H(D)和3H(T)。类似地，对碳和氧的提及在其范围内分别包括12C、13C和14C以及16O和18O。同位素可为放射性的或非放射性的。式(I)的化合物或式(II)的化合物的放射性标记化合物可包含一种或多种放射性同位素，该放射性同位素选自3H、11C、18F、122I、123I、125I、131I、75Br、76Br、77Br和82Br的组。优选地，放射性同位素选自包括3H、11C和18F的组。
在本发明的某些实施方案中，式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物含有一个或多个、优选地一至八个、更优选地一至六个、更优选地一至五个、更优选地一至三个、更优选地一至两个与环或链碳原子结合的氘原子。在本发明的某些实施方案中，式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物含有一个或多个、优选地一至三个、更优选地一至两个与环或链碳原子结合的氘原子。
本领域技术人员将进一步认识到，式(I)的化合物、式(II)的化合物和式(III)的化合物可以作为互变异构体(即，可以容易地相互转化的结构异构体)存在，更特别地作为化合物的咪唑基部分的互变异构体存在。本领域技术人员将进一步认识到，式(I)的化合物、式(II)的化合物和式(III)的化合物可以作为任一互变异构形式或作为其互变异构形式的任何混合物存在。
还旨在本发明包括本文所述的化合物，包括其所有异构体(包括但不限于立体异构体、对映体、非对映体、互变异构体、同位素体、阻转异构体等)。
在本公开全部内容中使用的标准命名法下，指定侧链的末端部分首先描述，随后是朝向附接点的邻接官能团。因此，例如“苯基C1-C6烷基氨基羰基C1-C6烷基”是指下式的基团：
用于本说明书，特别是方案和实施例中的缩写如下表A中所列：
表A：缩写
如本文所用，除非另外指明，否则术语“分离的形式”应意指该化合物以与和另一化合物的任何固体混合物、与溶剂系统或与生物环境分开的形式存在。在本发明的一个实施方案中，式(I)的化合物以分离的形式存在。在本发明的一个实施方案中，式(II)的化合物以分离的形式存在。在本发明的一个实施方案中，式(III)的化合物以分离的形式存在。
如本文所用，除非另外指明，术语“基本上纯的形式”应是指分离的化合物中杂质的摩尔百分数小于约5摩尔％，优选小于约2摩尔％，更优选小于约0.5摩尔％，最优选小于约0.1摩尔％。在本发明的一个实施方案中，式(I)的化合物作为基本上纯的形式存在。在本发明的一个实施方案中，式(II)的化合物作为基本上纯的形式存在。在本发明的一个实施方案中，式(III)的化合物作为基本上纯的形式存在。
除非另有指明，否则如本文所用的术语“基本上不含对应的盐形式”当用来描述式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物时，应意指分离的式(I)的化合物、分离的式(II)的化合物或分离的式(III)的化合物中的对应盐形式的摩尔百分数小于约5摩尔％，优选小于约2摩尔％，更优选小于约0.5摩尔％，最优选小于约0.1摩尔％。在本发明的一个实施方案中，式(I)的化合物以基本上不含对应盐形式的形式存在。在本发明的一个实施方案中，式(II)的化合物以基本上不含对应盐形式的形式存在。在本发明的一个实施方案中，式(III)的化合物以基本上不含对应盐形式的形式存在。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“治疗”等应当包括出于对抗疾病、病状或病症的目的，对受试者或患者(优选地哺乳动物，更优选地人)的管理和护理，并且包括施用本发明的化合物以防止症状或并发症的发作、缓解症状或并发症、减缓该疾病或病症的进展或消除该疾病、病状或病症。术语“治疗”还包括：(a)抑制疾病状态，即阻止其发展；和/或(b)减轻疾病状态，即引起疾病状态的消退。
如本文所用，“预防”是通过向患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐或溶剂化物中的至少一种来保护性治疗疾病状态以降低和/或最小化疾病状态的风险和/或降低疾病状态复发的风险。可以基于已知与一般群体相比会增加患临床疾病状态的风险的因素来选择进行预防疗法的患者。对于预防治疗，临床疾病状态的病状可以存在或者也可以不存在。“预防”治疗可分为(a)初级预防和(b)次级预防。初级预防定义为在尚未呈现临床疾病状态的患者中降低或最小化疾病状态的风险的治疗，而次级预防定义为最小化或降低相同或相似临床疾病状态的复发或第二次发生的风险。
如本文所用，“防止”涵盖对哺乳动物，特别是人的亚临床疾病状态的防止性治疗，其目的在于降低临床疾病状态发生的可能性。基于已知与一般群体相比会增加患临床疾病状态的风险的因素来选择进行防止疗法的患者。
如本文所用，“风险降低”涵盖降低临床疾病状态发展的发生率的疗法。因此，初级和次级防止疗法是风险降低的示例。
本领域技术人员将认识到，在本发明涉及预防方法的情况下，对其有需要的受试者(即需要进行预防的受试者)应包括任何已经历或表现出待防止的病症、疾病或病状的至少一种症状的受试者或患者(优选为哺乳动物，更优选为人)。此外，对其有需要的受试者还可以是没有表现出待防止的病症、疾病或病状的任何症状，但被医师、临床医生或其它医疗专业人员认为具有发展所述病症、疾病或病状的风险的受试者(优选为哺乳动物，更优选为人)。例如，由于该受试者的病史，包括但不限于家族史、易患病的体质、共存的(共病)病症或病状、遗传测试等，该受检者可被认为具有发展病症、疾病或病状的风险(并因此需要预防或预防性治疗)。
如本文所用，术语“受试者”是指已成为治疗、观察或实验对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。优选地，受试者已经历和/或表现出待治疗和/或预防的疾病或病症的至少一种症状。
如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品，以及通过组合指定量的指定成分而直接或间接得到的任何产品。
本文所用的术语“治疗有效量”意指能在组织系统、动物或人体上引起研究人员、兽医、医生或其它临床医师正在寻求的生物或药物响应(包括所治疗疾病或病症的症状的缓解)的活性化合物或药剂的量。
本发明的化合物优选以治疗有效量单独施用给哺乳动物。然而，本发明的化合物也可以与如下定义的另外的治疗剂组合以治疗有效量施用给哺乳动物。当以组合施用时，化合物的组合优选但不一定是协同组合。例如，当组合施用时化合物的效果(在这种情况下，是对期望靶标的抑制作用)大于作为单一药剂单独施用时化合物的加和效果时，可发生协同作用。一般来说，在化合物的次优浓度下最清楚地证明了协同效果。与单独组分相比，协同作用可以是在组合的较低细胞毒性、增加的抗凝血效果或一些其它有益作用方面来说的。
“组合施用”或“组合疗法”意指将本发明的化合物和一种或多种另外的治疗剂同时或连续地施用给所治疗的哺乳动物。当组合施用时，每种组分可以在同一时间施用或在不同时间点以任何顺序依次施用。因此，每种组分可以分开但在时间上足够接近地施用，以便提供期望的治疗效果。
一种或多种另外的药理学活性剂可以与本发明的化合物组合施用。另外的活性剂(或多种另外的活性剂)旨在意指在体内有活性的药学活性剂(或多种药学活性剂)，包括在施用后转化成不同于式(I)的化合物或式(II)的化合物的药学活性形式的前药，并且还包括所述另外的活性剂的游离酸、游离碱和药学上可接受的盐(当这样的形式在商业上销售或另外在化学上可能时)。通常，任何合适的一种或多种另外的活性剂，包括但不限于抗高血压剂、另外的利尿剂、抗动脉粥样硬化剂(诸如脂质改性化合物)、抗糖尿病剂和/或抗肥胖剂可以与式(I)的化合物或式(II)的化合物以任何组合以单一剂量制剂(固定剂量药物组合)使用，或者可以以一种或多种分开的剂量制剂施用于患者，分开的剂量制剂允许同时或依次施用活性剂(共同施用分开的活性剂)。
可采用的另外的活性剂的示例包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂(例如，阿拉普利(alacepril)、贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、西罗普利(ceronapril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、咪达普利(imidapril)、赖诺普利(lisinopril)、莫维普利(moveltipril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)或群多普利(trandolapril))；血管紧张素II受体拮抗剂，也称为血管紧张素受体阻滞剂(ARB)(例如氯沙坦(losartan)(即，
)、缬沙坦(valsartan)、坎地沙坦(candesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、替美沙坦(telmesartan)、依普罗沙坦(eprosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)和与氢氯噻嗪组合使用的这些药物中的任一者，诸如
(氯沙坦与氢氯噻嗪的组合))；利尿剂，例如氢氯噻嗪(HCTZ)；保钾利尿剂，诸如盐酸阿米洛利(amiloride HCl)、螺甾内酯(spironolactone)、依普利酮(epleranone)、三氨蝶呤(triamterene)，各自含有或不含有HCTZ；中性内肽酶抑制剂(例如，塞奥芬(thiorphan)和膦酰二肽(phosphoramidon))；醛固酮拮抗剂；醛固酮合酶抑制剂；肾素抑制剂(例如二肽和三肽的脲衍生物(参见美国专利5,116,835)、氨基酸和衍生物(美国专利5,095,119和5,104,869)、通过非肽键连接的氨基酸链(美国专利5,114,937)、二肽和三肽衍生物(美国专利5,106,835)、肽基氨基二醇(美国专利5,063,208和4,845,079)和肽基β-氨基酰基氨基二醇氨基甲酸酯(美国专利5,089,471)；另外，在以下美国专利5,071,837；5,064,965；5,063,207；5,036,054；5,036,053；5,034,512和4,894,437中所公开的多种其它肽类似物，和小分子肾素抑制剂(包括二醇磺酰胺和亚磺酰基(美国专利5,098,924)、Ν-吗啉代衍生物(美国专利5,055,466)、N-杂环醇(美国专利4,885,292)和吡咯咪唑酮(美国专利5,075,451)；另外，胃酶抑素衍生物(美国专利4,980,283)和含斯特酮肽的氟和氯衍生物(美国专利5,066,643)；依纳克林(enalkrein)；RO 42-5892(CAS登记号126222-34-2，也称为瑞米吉仑(remikiren))；A 65317(CAS登记号119625-78-4)；CP 80794(CAS登记号119625-78-4，也称为特拉吉仑(terlakiren)))；ES 1005(CAS登记号115404-79-0)；ES 8891(CAS登记号129445-88-1)；SQ 34017(CAS登记号695226-77-8)；阿利吉仑(aliskiren)(2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(2-氨基甲酰基-2-甲基丙基)-5-氨基-4-羟基-2,7-二异丙基-8-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)-苯基]-辛酰胺半富马酸盐)；内皮素受体拮抗剂；血管扩张剂(例如，硝普盐)；钙通道阻滞剂(例如，氨氯地平(amlodipine)、硝苯地平(nifedipine)、维拉帕米(verapamil)、地尔硫卓(diltiazem)、非洛地平(felodipine)、戈洛帕米(gallopamil)、尼鲁地平(niludipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼卡地平(nicardipine))；钾通道活化剂(例如，尼可地尔(nicorandil)、吡那地尔(pinacidil)、克罗卡林(cromakalim)、米诺地尔(minoxidil)、阿普利卡林(aprilkalim)、氯普唑仑(loprazolam))；交感神经药；β-肾上腺素能阻断药物(例如，醋丁洛尔(acebutolol)、阿替洛尔(atenolol)、倍他洛尔(betaxolol)、比索洛尔(bisoprolol)、卡维地洛(carvedilol)、美托洛尔(metoprolol)、酒石酸美托洛尔(metoprolol tartate)、纳多洛尔(nadolol)、普萘洛尔(propranolol)、索他洛尔(sotalol)、噻吗洛尔(timolol))；α肾上腺素能阻断药物(例如，多沙唑嗪(doxazocin)、哌唑嗪(prazocin)或α甲基多巴(alpha methyldopa))；中枢α肾上腺素能激动剂；外周血管扩张剂(例如肼苯哒嗪(hydralazine))；降脂剂，例如HMG-CoA还原酶抑制剂，诸如辛伐他汀(simvastatin)和洛伐他汀(lovastatin)，其作为
和
以内酯前药形式销售并在施用后起抑制剂的作用，以及二羟基开环酸HMG-CoA还原酶抑制剂的药学上可接受的盐，诸如阿托伐他汀(atorvastatin)(特别是以
销售的钙盐)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)(特别是以
销售的钙盐)、普伐他汀(pravastatin)(特别是以
销售的钠盐)和氟伐他汀(fluvastatin)(特别是以
销售的钠盐)；胆固醇吸收抑制剂诸如依泽替米贝(ezetimibe)
和依泽替米贝与任何其它降脂剂诸如上述HMG-CoA还原酶抑制剂，特别是与辛伐他汀
或与阿托伐他汀钙的组合；立即释放或控制释放形式的烟酸，特别是烟酸与DP拮抗剂诸如拉罗皮兰(laropiprant)
和/或与HMG-CoA还原酶抑制剂的组合；立即释放或控制释放形式的烟酸，特别是烟酸与DP拮抗剂诸如拉罗皮兰
和/或与HMG-CoA还原酶抑制剂的组合；烟酸受体激动剂，诸如阿昔莫司(acipimox)和阿昔呋喃(acifran)，以及烟酸受体部分激动剂；代谢改变剂，包括胰岛素增敏剂和用于治疗糖尿病的相关化合物，诸如双胍类(例如，二甲双胍(metformin))、氯茴苯酸类(例如，瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide))、磺酰脲类(例如，氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)、妥拉磺脲(tolazamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide))；噻唑烷二酮，也称为格列酮类(例如，吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone))、α葡糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol))、二肽基肽酶抑制剂(例如，西他列汀(sitagliptin)
阿格列汀(alogliptin)、维格列汀(vildagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利格列汀(linagliptin)、度格列汀汀(dutogliptin)、吉格列汀(gemigliptin))、麦角生物碱(例如，溴隐亭(bromocriptine))、组合药物诸如
(西他列汀与二甲双胍)和可注射的糖尿病药物诸如艾塞那肽(exenatide)和醋酸普兰林肽(pramlintide acetate)；或与有益于预防或治疗上述疾病的其它药物一起使用，所述其它药物包括但不限于二氮嗪；并且在化学上可能的情况下包括上述活性剂的游离酸、游离碱和药学上可接受的盐形式。可另选地或另外地与本发明的化合物组合施用的化合物包括但不限于抗凝血剂、抗凝血酶剂、抗血小板剂、纤维蛋白溶解剂、降血脂剂、抗高血压剂和抗缺血剂。
可与本发明的化合物组合使用的抗凝血剂(或凝血抑制剂)包括华法林、肝素(未分级肝素或任何市售低分子量肝素，例如依诺肝素(enoxaparin)和达肝素(dalteparin))、抑肽酶、因子Xa的合成五糖抑制剂(诸如磺达肝素(fondaparinux)和依达肝素(idraparinux))、直接因子Xa抑制剂(诸如利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)、贝曲西班(betrixaban)、依度沙班(edoxaban)、奥米沙班(otamixaban))、直接作用凝血酶抑制剂(包括水蛭素、达比加群(dabigatran)、阿加曲班、希美加群(ximelagatran)、美拉加群(melagatran)、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin)和比伐卢定(bivalirudin))，以及其它因子VIla抑制剂、VIlla抑制剂、DCa抑制剂、Xa抑制剂、XIa抑制剂、纤维蛋白原受体拮抗剂(包括阿昔单抗(abciximab)、依替巴肽(eptifibatide)和替罗非班(tirofiban))、TAFI抑制剂和本领域已知的其它物质。因子DCa抑制剂包括合成的活性位点阻断的竞争性抑制剂、口服抑制剂和RNA适体。这些描述于先前引用的Howard等人的参考文献中(Howard,EL,Becker KC,Rusconi,CP,Becker RC.Factor IXa Inhibitors asNovel Anticoagulants.Arterioscler Thromb Vase Biol.2007；27:722-727.)。
如本文所用，术语抗血小板剂(或血小板抑制剂)表示例如通过抑制血小板的聚集、粘附或颗粒分泌来抑制血小板功能的药剂。此类药剂包括但不限于各种已知的非甾体抗炎药(NSAIDS)，诸如阿司匹林、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、舒林酸(sulindac)、吲哚美辛(indomethacin)、甲灭酸(mefenamate)、屈
昔康(droxicam)、双氯芬酸(diclofenac)、磺吡酮(sulfinpyrazone)和吡罗昔康(piroxicam)，包括其药学上可接受的盐或前药。在NSAIDS中，阿司匹林(乙酰水杨酸或ASA)和吡罗昔康是优选的。其它合适的血小板抑制剂包括Ilb/IIIa拮抗剂(例如替罗非班、依替巴肽和阿昔单抗)、血栓烷-A2-受体拮抗剂(例如伊非曲班(ifetroban))、血栓烷-A2-合成酶抑制剂、磷酸二酯酶-III(PDE-III)抑制剂(例如双嘧达莫(dipyridamole)、西洛他唑(cilostazol))和PDE V抑制剂(诸如西地那非(sildenafil))，及其药学上可接受的盐或前药。
如本文所用，术语抗血小板剂(或血小板抑制剂)还旨在包括ADP(二磷酸腺苷)受体拮抗剂，优选嘌呤能受体P2Y1和P2Y12的拮抗剂，甚至更优选P2Y12。优选的P2Y12受体拮抗剂包括噻氯匹定(ticlopidine)、普拉格雷(prasugrel)、氯吡格雷、依利格雷(elinogrel)、替格瑞洛(ticagrelor)和坎格雷洛(cangrelor)，包括其药学上可接受的盐或前药。氯吡格雷是甚至更优选的药剂。噻氯匹定和氯吡格雷也是优选的化合物，因为已知它们在使用中对胃肠道是温和的。本发明的化合物还可与抑肽酶组合给药。
如本文所用，术语凝血酶抑制剂(或抗凝血酶剂)表示丝氨酸蛋白酶凝血酶的抑制剂。通过抑制凝血酶，破坏了各种凝血酶介导的过程，诸如凝血酶介导的血小板活化(即，例如，血小板的聚集，和/或纤溶酶原激活物抑制剂-I和/或血清素的颗粒分泌)、内皮细胞活化、炎性响应，和/或纤维蛋白形成。许多凝血酶抑制剂是本领域技术人员已知的，并且这些抑制剂预期与本发明化合物组合使用。此类抑制剂包括但不限于硼精氨酸衍生物、硼肽、肝素、水蛭素、达比加群和阿加曲班，包括其药学上可接受的盐和前药。硼精氨酸衍生物和硼肽包括硼酸的N-乙酰基和肽衍生物，诸如赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、高精氨酸及其对应的异硫脲
类似物的C-末端α-氨基硼酸衍生物。如本文所用，术语水蛭素包括水蛭素的合适的衍生物或类似物，在本文中称为二价水蛭素，诸如二硫酸根合水蛭素。
术语“凝血酶受体拮抗剂”，也称为蛋白酶活化受体(PAR)拮抗剂或PAR-1拮抗剂，可用于治疗血栓形成、炎性、动脉粥样硬化和纤维增生性病症，以及凝血酶及其受体在其中起病理作用的其它病症。基于涉及凝血酶受体上氨基酸取代的结构-活性研究，已经鉴定了凝血酶受体拮抗剂肽。在Bernatowicz等人，J Med.Chem.，第39卷，第4879-4887页(1996)中，公开了作为有效凝血酶受体拮抗剂的四肽和五肽，例如N-反式-肉桂酰基-p-氟Phe-p-胍基Phe-Leu-Arg-NH2和N-反式-肉桂酰基-p-氟Phe-p-胍基Phe-Leu-Arg-Arg-NH2。WO 94/03479中也公开了肽凝血酶受体拮抗剂。取代的三环凝血酶受体拮抗剂公开于美国专利6,063,847、6,326,380和WO 01/96330和US 7,037,920中。其它凝血酶受体拮抗剂包括美国专利7,304,078、7,235,567、7,037,920、6,645,987和欧洲专利EP1495018和EP1294714中公开的那些。
如本文所用，术语溶栓剂(或纤维蛋白溶解剂)(或溶栓剂或纤维蛋白溶解剂)表示溶解血凝块(血栓)的药剂。此类药剂包括组织纤溶酶原激活物(TPA，天然的或重组的)及其改性形式、阿尼普酶、尿激酶、链激酶、替奈普酶(TNK)、拉诺替普酶(nPA)、因子VIla抑制剂、PAI-I抑制剂(即组织纤溶酶原激活物抑制剂的灭活剂)、α-2-抗纤维蛋白溶酶抑制剂和茴香酰化纤溶酶原链激酶激活物复合物，包括其药学上可接受的盐或前药。如本文所用，术语阿尼普酶是指茴香酰化纤溶酶原链激酶激活物复合物，如例如欧洲专利0028489中所述。如本文所用，术语尿激酶旨在表示双链和单链尿激酶，后者在本文中也称为尿激酶原。与本发明化合物组合使用的合适的抗心律失常剂的示例包括：I类药剂(诸如普罗帕酮(propafenone))；II类药剂(诸如卡维地洛和普萘洛尔)；III类药剂(诸如索他洛尔、多非利特(dofetilide)、胺碘酮(amiodarone)、阿齐利特(azimilide)和伊布利特(ibutilide))；IV类药剂(诸如地尔硫卓(ditiazem)和维拉帕米)；IAch抑制剂和IKur抑制剂(例如，诸如WO01/40231中公开的那些化合物)。
如本书面说明书所更广泛地提供，本文所用的诸如“反应”和“使...反应”之类的术语是用于指以下任一者的化学实体：(a)此类化学实体的实际列举形式，和(b)此类化学实体在介质中的任何形式，在命名时即已考虑化合物处于该介质中。
本领域技术人员将认识到，在不另外指明的情况下，则反应步骤是根据已知的方法在合适的条件下进行，以提供所需产物。本领域技术人员还将认识到，在本文给出的说明书和权利要求书中，如果试剂或试剂类别/类型(例如碱、溶剂等)在方法的多于一个步骤中叙及，则独立地选择各试剂用于每个反应步骤并且各试剂可以彼此相同或不同。例如，如果方法的两个步骤列举了有机碱或无机碱作为试剂，则选择用于第一步骤的有机碱或无机碱可以与第二步骤的有机碱或无机碱相同或不同。此外，本领域技术人员将认识到，如果本发明的反应步骤可在多种溶剂或溶剂体系中进行，则所述反应步骤也可在合适的溶剂或溶剂体系的混合物中进行。
本领域技术人员将认识到，如果本发明的反应步骤可在多种溶剂或溶剂体系中进行，则所述反应步骤也可在合适的溶剂或溶剂体系的混合物中进行。
本领域技术人员将进一步认识到，允许如本文所述的反应或工艺步骤进行足够的时间段直至反应完成，如通过本领域技术人员已知的任何方法，例如色谱法(例如HPLC)所确定的。在本文中，“完成的反应或工艺步骤”应意指与反应开始时各自存在的量相比，反应混合物含有显著减少量的起始材料/试剂和显著增加量的期望产物。
为了提供更简明的描述，本文给出的一些数量表述没有用术语“约”修饰。应当理解，无论是否明确地使用了术语“约”，本文所给出的每个量都意在指代实际的给定值，并且还意在指代由本领域的普通技术人员可合理推测出的这些给定值的近似值，包括这些给定值的由实验和/或测量条件所引起的近似值。
为了提供更简洁的描述，本文中一些定量表述被叙述为约X量至约Y量的范围。应当理解，当叙述范围时，所述范围并不限制于所叙述的上下界限，而应包括约X量至约Y量的整个范围或者其中的任何量或范围。
合适的溶剂、碱、反应温度及其它反应参数和组分的示例在跟随下文的详细描述中给出。本领域技术人员将认识到，列举所述示例并非意在且不应理解为以任何方式限制下文所附权利要求中阐述的本发明。
除非另外指明，否则如本文所用，术语“离去基团”应意指在取代或置换反应期间脱离的带电荷或不带电荷的原子或基团。合适的示例包括但不限于Br、Cl、I、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐等。
在用于制备本发明的化合物的任何方法中，可能必需和/或期望保护任何有关分子中的敏感基团或反应性基团。这可通过常规保护基团来实现，诸如描述于ProtectiveGroups in Organic Chemistry,J.F.W.McOmie编辑，Plenum Press,1973；以及T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,1991中的那些。可使用本领域已知的方法在方便的后续阶段除去保护基团。
除非另外指明，否则如本文所用，术语“氮保护基团”应意指可连接至氮原子以保护所述氮原子避免参与反应并且可在反应后容易除去的基团。合适的氮保护基团包括但不限于氨基甲酸酯，即式–C(O)O-R的基团，其中R为例如甲基、乙基、叔丁基、苄基、苯乙基、CH2＝CH-CH2-等；酰胺，即式–C(O)-R’表示的基团，其中R’为(例如)甲基、苯基、三氟甲基等；N-磺酰基衍生物，即式–SO2-R”的基团，其中R”为例如甲苯基、苯基、三氟甲基、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-基-、2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯等。其它合适的氮保护基团可在文本诸如T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,1991中确定。
除非另外指明，否则如本文所用，术语“氧保护基团”应意指可连接至氧原子以保护所述氧原子避免参与反应并且可在反应后容易除去的基团。合适的氧保护基包括但不限于乙酰基、苯甲酰基、叔丁基-二甲基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基(TMS)、MOM、THP等。其它合适的氧保护基团可在文本诸如T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis,John Wiley&Sons,1991中确定。
如果用于制备根据本发明的化合物的方法产生立体异构体的混合物，则这些异构体可通过常规技术诸如制备型色谱来分离。所述化合物可以外消旋形式制备，或者可通过对映体特异性合成或通过拆分来制备单独的对映体。例如，可通过标准技术，如通过与光学活性酸(诸如(-)-二对甲苯酰-D-酒石酸和/或(+)-二对甲苯酰-L-酒石酸)形成盐来形成非对映体对，然后分级结晶并再生游离碱，来将化合物拆分成它们的组分对映体。这些化合物还可通过形成非对映异构体酯或酰胺，随后进行色谱分离并去除手性助剂来拆分。另选地，可使用手性HPLC柱拆分所述化合物。
另外，可使用手性HPLC与标准物对比来确定对映体过量百分比(％ee)。对映体过量可如下进行计算：
[(R摩尔-S摩尔)/(R摩尔+S摩尔)]×100％
其中R摩尔和S摩尔是混合物中的R和S摩尔分数，使得R摩尔+S摩尔＝1。另选地，对映体过量也可如下所述由所需的对映体和所制备的混合物的比旋光度来计算：
ee＝([α-obs]/[α-max])×100。
本发明在其范围内包括本发明化合物的前药。一般来讲，此类前药将是所述化合物的功能衍生物，其可容易地在体内转化成所需的化合物。因此，在本发明的治疗方法中，术语“施用”应涵盖使用具体公开的化合物或未具体公开的化合物来治疗所述的多种病症，而该未具体公开的化合物可在向患者施用后，在体内转化为指定化合物。例如，在“Designof Prodrugs(《前药设计》)”，H.Bundgaard编辑，Elsevier(爱思唯尔)，1985年中描述了用于选择和制备适宜的前药衍生物的常规工序。
对于在医学中使用而言，本发明的化合物的盐类是指非毒性的“药学上可接受的盐”。然而，其它盐类也可用于制备根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐。化合物的合适的药学上可接受的盐包括酸加成盐，其可(例如)通过将该化合物的溶液与药学上可接受的酸(诸如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液混合来形成。此外，如果本发明的化合物具有酸性部分，其合适的药学上可接受的盐可包括碱金属盐，例如钠盐或钾盐；碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)；和与合适的有机配体形成的盐(例如季铵盐)。因此，代表性的药学上可接受的盐包括但不限于以下物质：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐、己基苯间二酚盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘和戊酸盐。
可用于制备药学上可接受的盐的代表性酸包括但不限于以下物质：酸，包括乙酸、2,2-二氯乙酸、酰化氨基酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基-乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、L-谷氨酸、α-氧代-戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸和十一碳烯酸。
可用于制备药学上可接受的盐的代表性碱包括但不限于以下物质：碱，包括氨、L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星、氢氧化钙、胆碱、丹醇、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙氨基)-乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、海巴明、1H-咪唑、L-赖氨酸、氢氧化镁、4-(2-羟乙基)-吗啉、哌嗪、氢氧化钾、1-(2-羟乙基)-吡咯烷、氢氧化钠、三乙醇胺、氨基丁三醇和氢氧化锌。
合成
本发明的式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物、式(IV)的化合物、式(V)的化合物和式(VI)的化合物可如下文的合成实施例中所述制备。用于下文的合成实施例中的起始材料的制备完全在本领域技术人员的技术范围内。
药物组合物
本发明还包括药物组合物，其包含式(I)的化合物和/或式(II)的化合物和/或式(III)的化合物与药学上可接受的载体。可以根据常规的药物配混技术，通过将本文所述的本发明化合物中的一种或多种与药用载体紧密混合来制备含有所述化合物作为活性成分的药物组合物。取决于期望的给药途径(如口服给药、肠胃外给药)，载体可采取多种形式。因此，对于诸如混悬剂、酏剂和溶液剂的液体口服制剂，合适的载体和添加剂包括水、二元醇、油、醇类、矫味剂、防腐剂、稳定剂、着色剂等；对于诸如散剂、胶囊剂和片剂之类的固体口服制剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂等。固体口服制剂还可包覆有物质诸如糖或包覆有肠溶衣，以便调节主要的吸收位点。对于肠胃外给药，载体将通常由无菌水组成，并可加入其它成分以增加溶解度或防腐性。注射用混悬剂或溶液剂也可以利用水基载体连同合适的添加剂来制备。
为了制备本发明的药物组合物，根据常规的药物配混技术，将作为活性成分的一种或多种本发明化合物与药用载体紧密混合，所述载体取决于施用(例如经口施用或诸如肌内施用之类的肠胃外施用)所期望的制剂形式而可采取多种形式。在制备口服剂型的组合物时，可以采用任何可用的药用介质。因此对于诸如混悬剂、酏剂和溶液剂之类的液体口服制剂，合适的载体和添加剂包括水、二元醇、油、醇类、矫味剂、防腐剂、着色剂等；对于固体口服制剂(诸如例如散剂、胶囊剂、囊片、胶囊锭剂和片剂)，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂等。由于其在给药方面的方便性，片剂和胶囊剂代表了最有利的口服单位剂型，在这种情况下显然采用固体药学上可接受的载体。如果需要，片剂可通过标准技术包糖衣或包肠溶衣。对于胃肠外给药，载体将通常包含无菌水，但还可包含其它成分，例如用于诸如帮助溶解或防腐之类的目的。还可以制备注射用混悬剂，在这种情况下，可以采用合适的液体载体、悬浮剂等。本发明的药物组合物每剂量单位(例如，每片、每粒胶囊、每份散剂、每支注射剂、每茶匙等)将包含递送上述有效剂量必需的活性成分的量。本文的药物组合物每单元剂量单位(例如每片、每粒胶囊、每份散剂、每支注射剂、每支栓剂、每茶匙等)将含有约0.01mg至约1000mg或其中的任何量或范围，并且可以约0.05mg/天至约1000mg/天或其中的任何量或范围，约0.1mg/天至约500mg/天或其中的任何量或范围，优选约1mg/天至约300mg/天或其中的任何量或范围的剂量给药。
然而，根据患者的需要、所治疗的病症的严重程度和所采用的化合物，剂量可以有所不同。可采用每日给药或周期后给药。
优选地，这些组合物为单位剂型，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液剂或混悬剂、计量气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿剂、自动注射装置或栓剂；用于口服、肠胃外给药、鼻内给药、舌下给药或直肠给药，或用于经吸入或吹入给药。另选地，组合物可以适于每周一次或每月一次给药的方式提供；例如，活性化合物的不溶性盐(如癸酸盐)可适于提供用于肌内注射的长效制剂。为制备固体组合物诸如片剂，将主要的活性成分与药学上可接受的载体(例如常规的制片成分，诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)以及其它药用稀释剂(例如水)混合，以形成含有本发明的化合物或其药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组合物称为均匀时，意指活性成分在整个组合物中均匀分散，使得该组合物可容易细分成等效剂型，诸如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂组合物细分成含有约0.01mg至约1,000mg或者其中的任何量或范围的本发明活性成分的上述类型的单位剂型。可将该新型组合物的片剂或丸剂进行包覆或者以其它方式配混，以生成能提供长效优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内剂型组分和外剂型组分，后者为在前者上面的包层的形式。这两种组分可通过肠溶层分开，该肠溶层起到防止在胃中崩解的作用，并且使内组分完整地进入十二指肠或得以延迟释放。多种材料可被用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括与诸如紫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素之类的材料一起的多种聚合酸材料。
可掺入本发明新型组合物用于口服或注射施用的液体制剂包括水溶液剂、适当矫味的糖浆剂、水性或油性混悬剂和用食用油(棉籽油、芝蔴油、椰子油或花生油)矫味的乳剂，以及酏剂和类似药用介质。适用于水性混悬剂的分散剂或悬浮剂包括合成树胶或天然树胶，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。
本发明中所述的治疗和/或预防血栓栓塞性病症的方法也可使用包含如本文所定义的任何化合物和药学上可接受的载体的药物组合物来进行。药物组合物可含有约0.01mg至约1000mg的化合物或其中的任何量或范围，优选约0.05mg至约300mg的化合物或其中的任何量或范围，更优选约0.1mg至约100mg的化合物或其中的任何量或范围，更优选约0.1mg至约50mg的化合物或其中的任何量或范围；并且可构成适合于所选施用方式的任何形式。载体包括必要且惰性的药用赋形剂，包括但不限于粘结剂、悬浮剂、润滑剂、矫味剂、甜味剂、防腐剂、染料和包衣。适用于口服的组合物包括固体形式，例如丸剂、片剂、囊片、胶囊剂(分别包括速释型、定时释放型和持续释放型)、颗粒剂和散剂；以及液体形式，如溶液剂、糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬剂。可用于肠胃外给药的形式包括无菌溶液剂、乳剂和混悬剂。
有利地，本发明的组合物可以单次日剂量施用，或总的日剂量可以每日两次、三次或四次的分剂量施用。此外，本发明的化合物可通过局部使用合适的鼻内溶媒以鼻内形式施用，或通过本领域普通技术人员所熟知的透皮药贴剂施用。要以透皮递送体系的形式施用，则在整个剂量方案中剂量施用将当然是连续的而不是间断的。
例如，对于以片剂或胶囊剂形式口服给药，可以将活性药物组分与口服、无毒性的药学上可接受的惰性载体,诸如乙醇、甘油、水等等组合。此外，在希望或必要时，也可以将合适的粘结剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入到该混合物中。合适的粘结剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖类(例如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然树胶和合成树胶(如阿拉伯树胶、黄蓍胶)或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
液体形式在可包括适当矫味的混悬剂或分散剂，诸如合成树胶和天然树胶，例如黄蓍胶、阿拉伯树胶、甲基纤维素等。对于非肠道给药，无菌混悬剂和溶液剂是期望的。当需要进行静脉内施用时，采用通常含有合适的防腐剂的等渗制剂。
为了制备本发明的药物组合物，根据常规的药物配混技术，将作为活性成分的式(I)的化合物和/或式(II)的化合物和/或式(III)的化合物与药用载体紧密混合，所述载体根据施用(例如口服施用或肠胃外施用)所期望的制剂形式而可采取多种形式。合适的药学上可接受的载体是本领域所熟知的。有关这些药学上可接受的载体中的一些的描述可在American Pharmaceutical Association和Pharmaceutical Society of Great Britain出版的The Handbook of Pharmaceutical Excipients中找到。配制药物组合物的方法描述于多个出版物，诸如Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Second Edition,Revisedand Expanded，第1-3卷，由Lieberman等人编辑；Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications，第1-2卷，由Avis等人编辑；和Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems，第1-2卷，由Lieberman等人编辑；以上出版物由Marcel Dekker,Inc.出版。
每当需要治疗或预防血栓栓塞性病症、炎性病症和其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状时，可以任何前述组合物并根据本领域确立的给药方案施用本发明的化合物。
产品的日剂量可在每个成人每天约0.01mg至约1,000mg的宽范围内变化，或在其中的任何量或范围内变化。对于口服给药，组合物优选地以含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250和500毫克的活性成分的片剂形式提供，用于根据待治疗患者的症状来调节剂量。有效量的药物通常可以约0.005mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天或其中的任何量或范围的剂量水平提供。优选地，该范围为约0.01mg/kg体重/天至约5.0mg/kg体重/天或其中的任何量或范围，更优选地，约0.1mg/kg体重/天至约1.0mg/kg体重/天或其中的任何量或范围，更优选地，约0.1mg/kg体重/天至约0.5mg/kg体重/天或其中的任何量或范围。可以将化合物按每天1至4次的方案给药。
本领域技术人员可容易地确定待施用的最佳剂量，并且最佳剂量将随所使用的具体化合物、施用方式、制剂强度和疾病状况的进展而变化。此外，与接受治疗的具体患者相关的因素，包括患者年龄、体重、饮食以及施用时间，将导致需要调节剂量。
本领域技术人员会认识到，使用合适的、已知的且通常接受的细胞和/或动物模型进行的体内试验和体外试验均能预测测试化合物治疗或预防给定病症的能力。
本领域的技术人员还将认识到，在健康患者和/或患有给定病症的那些中的人类临床试验(包括人体首次、剂量范围和功效试验)可以根据临床和医学领域熟知的方法来完成。
以下实施例是为了帮助理解本发明而示出的，并非旨在且不应该被解释为以任何方式限制实施例之后的权利要求书中所示出的本发明。
在以下实施例中，列出了一些已经作为残余物分离出来的合成产物。本领域普通技术人员将理解，术语“残余物”不限制产物被分离时的物理状态，并且可包括例如固体、油状物、泡沫、胶状物、浆状物等。
合成实施例
实施例1：中间体1式(IV-A)的化合物
(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸
步骤1：(2S)-5-甲氧基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯的合成
在-78℃处和在N2下，向(S)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(2.1g，8.63mmol，1.0当量)在THF(40mL)中的溶液中逐滴添加三乙基硼氢化锂(13mL，13mmol，1.5当量，1M的THF溶液)。将反应在-78℃处搅拌40min，然后在-78℃处添加Na2CO3(水溶液，10mL)，并且将混合物温热至0℃。添加过氧化氢(1mL，30％)并且将所得混合物在室温处搅拌30min。在真空下从混合物中除去THF，并且将所得残余物用乙醚萃取，用盐水洗涤，干燥并真空浓缩，得到无色油状物。将无色油状物溶解在甲醇(40mL)中，并且向混合物中添加对甲苯磺酸(149mg，0.86mmol，0.1当量)。将所得溶液在室温处搅拌过夜。将反应用水淬灭，并且将所得混合物用乙醚萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到呈无色油状物的(2S)-5-甲氧基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯。
步骤2：(2S)-5-烯丙基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯的合成
在-40℃处和在N2气氛下，向(2S)-5-甲氧基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(10g，38.6mmol，1.0当量)在Et2O(200mL)中的溶液中添加烯丙基三甲基硅烷(27ml，169.7mmol，4.4当量)和三氟化硼合乙醚(6.57g，46.3mmol，1.2当量)。将所得混合物在-40℃处搅拌30min，温热至室温，然后搅拌40min。将反应用Na2CO3(水溶液)淬灭，并且将所得混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0-20％ EtOAc/石油醚)纯化，得到呈黄色油状物的(2S)-5-烯丙基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯。LC/MS：C14H23NO4的质量计算值为269.16，实测值为270.20[M+H]+。
步骤3：(2S)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯的合成
向(2S)-5-烯丙基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(7.3g，27.1mmol，1.0当量)在THF/H2O(120mL)中的溶液中添加OsO4(347mg，1.36mmol，0.05当量)。将所得混合物在室温处在黑暗中搅拌5min，然后添加高碘酸钠(14.5g，67.8mmol，2.5当量)。将混合物在室温处搅拌4h。将反应用水淬灭，并且将所得混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤并经Na2SO4干燥。滤出固体。将滤液真空浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0-40％EA/PE)纯化，得到呈黄色油状物的(2S)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯。LC/MS：C13H21NO5的质量计算值为271.14，实测值为272.15[M+H]+，216.05[M-C4H9]+。
步骤4：外消旋(2R)-5-(4-乙氧基-2-羟基-4-氧代丁基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯的合成
在-78℃处，在N2气氛下，向乙酸乙酯(0.936mL，9.583mmol，4当量)在四氢呋喃(10mL)中的溶液中添加1M双(三甲基甲硅烷基)氨基锂(9.583mL，9.583mmol，4当量)。在相同温度处搅拌30min后，向混合物中添加(2S)-5-(2-氧代乙基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(650mg，2.396mmol，1当量)的四氢呋喃溶液(10mL)，并且将混合物在-78℃处搅拌30min。将反应用饱和氯化铵水溶液淬灭，随后使用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。将有机层经硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩。将获得的残余物通过硅胶色谱法(0-45％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到呈黄色油状物的外消旋-(2R)-5-(4-乙氧基-2-羟基-4-氧代丁基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(747mg，86.751％收率)。LC/MS：C17H29NO7的质量计算值为359，实测值为382[M+Na]+。
步骤5：(2S)-5-(4-乙氧基-2,4-二氧代丁基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯的合成
向(2S)-5-(4-乙氧基-2-羟基-4-氧代丁基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(3.3g，9.2mmol，1.0当量)在乙腈(30mL)中的溶液中添加2-碘酰基苯甲酸(IBX)(10.3g，36.8mmol，4.0当量)。将所得混合物在50℃处搅拌过夜。除去溶剂并在EtOAc和盐水之间分配。将有机层分离，干燥并在减压下浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0-80％ EtOAc/石油醚)纯化，得到呈黄色油状物的(2S)-5-(4-乙氧基-2,4-二氧代丁基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯。LC/MS：C17H27NO7的质量计算值为357.18，实测值为380.15[M+Na]+。
步骤6：(3S)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯的合成
向(2S)-5-(4-乙氧基-2,4-二氧代丁基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(900mg，2.5mmol，1.0当量)在DCM(2.5ml)中的溶液中添加HCl(在1,4-二
烷中，4M，2.5ml)。将所得混合物在室温处搅拌1h。然后真空除去溶剂，得到黄色油状物。将黄色油状物溶解在甲苯(5mL)中，并且添加碳酸氢钠(2.1g，25.2mmol，10.0当量)。将所得混合物在110℃处搅拌过夜。将反应用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0-50％ EtOAc/石油醚)纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯。LC/MS：C10H13NO4的质量计算值为211.08，实测值为212.10[M+H]+。
步骤7：(3S)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯的合成
向(3S)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯(370mg，1.75mmol，1.0当量)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中添加三乙胺(355mg，3.5mmol，2.0当量)和N,N-双(三氟甲基磺酰基)苯胺(751mg，2.1mmol，1.2当量)。将所得混合物在室温处搅拌过夜。然后将混合物浓缩，并且将残余物通过硅胶色谱法(0-80％ EA/PE)纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯。LC/MS：C11H12F3NO6S的质量计算值为343.03，实测值为344.05[M+H]+。
步骤8：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯的合成
向(3S)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯(350mg，1.02mmol，1.0当量)、(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)硼酸(232mg，1.2mmol，1.2当量)和碳酸钾(282g，2.04mmol，2.0当量)在1,4-二
烷/H2O(5mL，10/1)中的溶液中添加[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(37mg，0.05mmol，0.1当量)。将所得混合物在80℃处在N2下搅拌2h。将反应用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤并经Na2SO4干燥。滤出固体，并将滤液在真空下浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0-100％EtOAc/石油醚)纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯。LC/MS：C16H16ClFN2O3的质量计算值为338.08，实测值为339.10[M+H]+。
步骤9：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸的合成
向(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯(210mg，0.62mmol，1.0当量)在THF/H2O/MeOH(5mL，3/1/1)中的溶液中添加氢氧化锂(124mg，3.10mmol，5.0当量)。将所得混合物在室温处搅拌1h。将所得混合物用HCl调节至pH4，然后用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤，干燥并真空浓缩，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸。LC/MS：C15H14ClFN2O3的质量计算值为324.07，实测值为325.05[M+H]+。
实施例2：中间体2式(V-A)的化合物
(3S)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯
步骤1：(2S)-5-烯丙基吡咯烷-2-甲酸甲酯的合成
将(2S)-5-烯丙基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(10g，37.128nmol，1.0当量)溶解在HCl溶液(90mL，10当量)(4M的1,4-二
烷溶液)中。将所得混合物在室温处在搅拌下保持2h。在减压下除去溶剂，得到(2S)-5-烯丙基吡咯烷-2-甲酸甲酯，其未经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤2：(2S)-1-丙烯酰基-5-烯丙基吡咯烷-2-甲酸甲酯的合成
在-78℃处，向(2S)-5-烯丙基吡咯烷-2-甲酸甲酯(6g，35.457mmol，1.0当量)在THF(200mL)中的溶液中添加TEA(23mL，177.283mmol，5.0当量)，随后添加丙烯酰氯(3.2g，35.457mmol，1.0当量)。将所得混合物在室温处在搅拌下保持40min。将反应用NH4Cl(水溶液)淬灭，并分离所得层。将水相用乙酸乙酯萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将获得的所得残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/PE)纯化，得到呈黄色油状物的(2S)-1-丙烯酰基-5-烯丙基吡咯烷-2-甲酸甲酯。
步骤3：(3S)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯的合成
在N2下，向(2S)-1-丙烯酰基-5-烯丙基吡咯烷-2-甲酸甲酯(7.2g，32.248mmol，1.0当量)在DCM(100mL)中的溶液中添加Grubbs 2代催化剂(2.7g，3.225mmol，0.1当量)。将所得混合物在45℃处加热10h。在减压下除去溶剂，并且将所得残余物通过硅胶柱色谱法(EA/PE)纯化，得到呈棕色油状物的(3S)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯。
步骤4：(3S)-7-羟基-5-氧代-八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯的合成
在N2下，向CuCl(0.102g，1.025mmol，0.2当量)在THF(100mL)中的溶液中添加BINAP(0.638g，1.025mmol，0.2当量)。将所得混合物在室温处在搅拌下保持15min。将t-BuONa(0.098g，1.025mmol，0.2当量)添加到混合物中。搅拌30min后，将4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-双(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(1.561g，6.147mmol，1.2当量)添加到混合物中，随后添加(3S)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯(1g，5.123mmol，1.0当量)。然后逐滴添加MeOH(0.328g，10.245mmol，2.0当量)。将所得混合物在室温处搅拌16h，然后冷却至0℃。然后添加H2O2(6mL，51.226mmol，10当量)，并且将所得混合物再搅拌1h。在减压下除去溶剂，并且将残余物通过硅胶柱色谱法(DCM/MeOH)纯化，得到呈棕色油状物的(3S)-7-羟基-5-氧代-八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯。
步骤5：(3S)-5,7-二氧代-八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯的合成
向(3S)-7-羟基-5-氧代-八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯(1g)在DCM(100mL)中的溶液中添加氯铬酸吡啶
(2g，9.38mmol，2.0当量)。将所得混合物在室温处搅拌16h。在减压下除去溶剂，并且将残余物通过硅胶柱色谱法(EA/PE)纯化，得到呈黄色油状物的(3S)-5,7-二氧代-八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯。
实施例3：中间体3式(VI-A)的化合物
(3S,8aR)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯
步骤1：(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氧代庚二酸7-苄酯1-甲酯的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的10L 3颈圆底烧瓶中添加1M LDA的THF溶液(1132.2mL，1.00当量)、溶剂THF(3400.00mL)，随后在-78℃处在搅拌下逐滴添加乙酸苄酯(170.00g，1131.998mmol，1.00当量)在THF(850.0mL)中的溶液。将所得溶液在-78℃处搅拌30min。然后在-78℃处，在搅拌下，向该溶液中逐滴添加(2S)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-甲酯(275.37g，1131.998mmol，1.00当量)在THF(850.0mL)中的溶液。将所得溶液在室温处在搅拌下保持过夜，然后通过添加5000mL NH4Cl淬灭。将所得溶液用乙酸乙酯(3×4000mL)萃取。将所得混合物用盐水(1×1000mL)洗涤。将所得混合物经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶柱纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:9)洗脱，得到呈黄色油状物的(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代庚二酸7-苄酯1-甲酯。
步骤2：(S,Z)-5-(2-(苄氧基)-2-氧代亚乙基)吡咯烷-2-甲酸甲酯的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的5000mL圆底烧瓶中添加(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代庚二酸7-苄酯1-甲酯(290.00g，1.00当量)和TFA(469.50g，6.00当量)。将所得溶液在室温处搅拌2h，然后真空浓缩以除去大部分TFA。用Na2CO3将该溶液的pH值调节至8。将所得溶液用DCM(3×500mL)萃取。将合并的有机相用盐水(1×500mL)洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥并真空浓缩，得到呈半固体状的(2S,5Z)-5-[2-(苄氧基)-2-氧代亚乙基]吡咯烷-2-甲酸甲酯。
步骤3：(2S,5R)-5-(2-(苄氧基)-2-氧代乙基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯的合成
向5000mL高压釜中放入(2S,5Z)-5-[2-(苄氧基)-2-氧代亚乙基]吡咯烷-2-甲酸甲酯(175.00g，635.661mmol，1.00当量)、MeOH(3500.00mL)、(Boc)2O(138.73g，635.661mmol，1.00当量)和PtO2(43.30g，190.698mmol，0.30当量)。将所得混合物在氢气气氛(15atm)下反应。将所得溶液在35℃处搅拌12h。滤出沉淀，并浓缩滤液，得到(2S,5R)-5-(2-(苄氧基)-2-氧代乙基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯，其直接用于下一步骤。
步骤4：(2S,5R)-5-(2-(苄氧基)-2-氧代乙基)吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的5000mL圆底烧瓶中放入(2S,5R)-5-[2-(苄氧基)-2-氧代乙基]吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯(244.00g，1.00当量)、DCM(2440.00mL)和含HCl(气体)的1,4-二
烷(220.00g，4.000mmol，5.00当量)。将所得溶液在室温处搅拌3h。将反应浓缩，得到呈黄色油状物的(2S,5R)-5-[2-(苄氧基)-2-氧代乙基]吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐。
步骤5：(2S,5R)-5-(2-(苄氧基)-2-氧代乙基)-1-(3-甲氧基-3-氧代丙酰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的5000mL 3颈圆底烧瓶中放入(2S,5R)-5-[2-(苄氧基)-2-氧代乙基]吡咯烷-2-甲酸甲酯(197.00g，710.371mmol，1.00当量)、DMF(1970.00mL)和1-甲基3-丙二酸钾(221.89g，1420.741mmol，2.00当量)。这之后在0℃处添加吡啶(140.48g，1775.927mmol，2.50当量)。然后在0℃处向所得混合物中添加T3P(452.05g，1420.742mmol，2.00当量)。将所得溶液在25℃处搅拌12h。然后将反应通过添加水(2000mL)淬灭并用乙酸乙酯(3×2000mL)萃取。将合并的有机相用盐水(1×2000mL)洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥并且浓缩。将所得残余物通过快速制备型HPLC用以下条件(IntelFlash-1)纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN-H20＝45，在20分钟内增加至ACN-H20＝60；得到呈黄色油状物的(2S,5R)-5-[2-(苄氧基)-2-氧代乙基]-1-(3-甲氧基-3-氧代丙酰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯。
步骤6：2-((2R,5S)-1-(3-甲氧基-3-氧代丙酰基)-5-(甲氧基羰基)吡咯烷-2-基)乙酸的合成
向3000mL圆底烧瓶中放入(2S,5R)-5-[2-(苄氧基)-2-氧代乙基]-1-(3-甲氧基-3-氧代丙酰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(151.00g)、IPA(1510.00mL)和Pd/C(15.10g)。将所得悬浮液在室温处在2atm H2下搅拌2h。滤出沉淀，并浓缩滤液，得到呈黄色油状物的[(2R,5S)-1-(3-甲氧基-3-氧代丙酰基)-5-(甲氧基羰基)吡咯烷-2-基]乙酸。
步骤7：(3S,8aR)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3,6-二甲酸二甲酯的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的5000mL 3颈圆底烧瓶中放入[(2R,5S)-1-(3-甲氧基-3-氧代丙酰基)-5-(甲氧基羰基)吡咯烷-2-基]乙酸(104.00g，362.031mmol，1.00当量)、THF(3120.00mL)和CDI(88.05g，543.047mmol，1.50当量)。将所得混合物在室温处搅拌0.5h。然后向所得混合物中添加DBU(82.67g，543.047mmol，1.50当量)。将混合物在室温处搅拌2小时，然后通过添加水/冰(2000mL)淬灭。用HCl(2mol/L)将该溶液的pH调节至pH 3。将所得溶液用DCM/MeOH＝3:1(3×1500mL)萃取，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到呈淡黄色油状物的(3S,8aR)-5,7-二氧代-六氢吲哚嗪-3,6-二甲酸3,6-二甲酯。
步骤8：(3S,8aR)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯的合成
向3000mL圆底烧瓶中放入(3S,8aR)-5,7-二氧代-六氢吲哚嗪-3,6-二甲酸3,6-二甲酯(94.00g，1.00当量)和AcOH(940.00mL)。将所得溶液在110℃处搅拌30min。将所得溶液用DCM/MeOH＝2:1(3×2000mL)萃取，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到呈黄色油状物的(3S,8aR)-5,7-二氧代-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯。
步骤9：(3S,8aR)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯的合成
向用氮气惰性气氛吹扫并保持的3000mL圆底烧瓶中放入(3S,8aR)-5,7-二氧代-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯(55.00g，1.00当量)、DCM(1100.00mL)、DIEA(67.38g，2.00当量)和PhNTf2(111.73g，1.20当量)。将所得溶液在室温处搅拌4h。将所得混合物用NaHCO3(2×2000mL)洗涤。将所得混合物真空浓缩，并且将残余物通过PE/EA＝1/4的硅胶纯化，得到呈白色固体状的(3S,8aR)-5-氧代-7-(三氟甲烷磺酰基氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢-1H-吲哚嗪-3-甲酸甲酯。
实施例4：中间体4
(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)硼酸
步骤1：N-(4-氯-3-氟苯基)-2,2,2-三氟乙酰胺的合成
在-10℃处，在搅拌下，向4-氯-3-氟苯胺(20g，137.398mmol，1.00当量)和Na2CO3(24.7g，233.577mmol，1.70当量)在Et2O(400mL)中的混合物中逐滴添加TFAA(34.6g，164.878mmol，1.20当量)。使所得混合物升温至室温过夜，然后用己烷(400mL)稀释并过滤。将滤液用饱和碳酸氢钠溶液(2×200mL)、盐水(2×200mL)洗涤，经Na2SO4干燥并过滤。将滤液浓缩，得到呈白色固体状的N-(4-氯-3-氟苯基)-2,2,2-三氟乙酰胺。
步骤2：6-氨基-3-氯-2-氟苯基硼酸的合成
在氮气惰性气氛下，在-78℃处，在搅拌下，向N-(4-氯-3-氟苯基)-2,2,2-三氟乙酰胺(30g，124.188mmol，1.00当量)在THF(500mL)中的混合物中逐滴添加n-BuLi(99mL，248.375mmol，2.00当量，2.5M的己烷溶液)。将所得混合物在-78℃处搅拌15min，然后使其升温至-50℃。将所得澄清棕色溶液冷却至-78℃，然后逐滴添加B(O-iPr)3(51.3g，273.213mmol，2.20当量)。将混合物在-78℃处搅拌10分钟，然后使其升温至室温。将所得橙色悬浮液在室温处搅拌4h，然后在冰浴中冷却并用1M HCl(300mL)淬灭。将所得混合物在室温处搅拌过夜，然后用EtOAc(300mL×3)萃取，经Na2SO4干燥并过滤。将滤液浓缩，并且将残余物重结晶(EtOAc/PE：1/10)，得到呈白色固体状的6-氨基-3-氯-2-氟苯基硼酸。
实施例5：式(I-A)的化合物
(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮
步骤1：2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶的合成
向(3-氟吡啶-2-基)甲醇(15.0g，118.002mmol，1.0当量)在DMF(200mL)中的溶液中添加咪唑(16.1g，236.496mmol，2.0当量)，随后添加叔丁基氯二甲基硅烷(21.3g，141.320mmol，1.2当量)。将混合物在室温处搅拌过夜。将反应用水(200mL)淬灭。将所得混合物用乙酸乙酯(3×400mL)萃取，然后用水(3×200mL)洗涤。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0-30％ PE/EA)纯化，得到呈黄色油状物的2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶。LC/MS：C12H20FNOSi的质量计算值为241.13，实测值为242.10[M+H]+。
步骤2：2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟-4-碘吡啶的合成在-78℃处，向2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶(24.0g，99.430mmol，1.0当量)在THF(400mL)中的溶液中添加LDA(59.7mL，119.4mmol，1.2当量)。将混合物在-78℃处搅拌0.5h。然后在-78℃处向所得混合物中添加碘(30.3g，119.381mmol，1.2当量)在THF(60mL)中的溶液。将混合物在-78℃处搅拌3h。将反应用NH4Cl溶液(200mL)淬灭并用乙酸乙酯(3×400mL)萃取。将合并的萃取物用水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(0-30％EA/PE)纯化，得到呈白色固体状的2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟-4-碘吡啶。LC/MS：C12H19FINOSi的质量计算值为367.03，实测值为368.20[M+H]+。
步骤3：2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶的合成
向2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟-4-碘吡啶(20.0g，54.455mmol，1.0当量)和双(三苯基膦)氯化钯(II)(3.8g，5.414mmol，0.1当量)在1,4-二
烷(200mL)中的溶液中添加三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(29.5g，81.683mmol，1.5当量)。将混合物在90℃处搅拌2h。在冷却至室温后，将反应用水(200mL)淬灭，然后用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将所得残余物通过Al2O3色谱法(0-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到呈黄色油状物的2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶。LC/MS：C16H26FNO2Si的质量计算值为311.17，实测值为312.15[M+H]+。
步骤4：2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮的合成
向2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶(15g，48.159mmol，1.0当量)在THF(120mL)和H2O(30mL)中的混合物中添加NBS(8.6g，48.319mmol，1.0当量)。将反应在室温处搅拌2h。然后将所得混合物用EtOAc(700mL)稀释，用盐水(3×200mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到呈灰白色固体状的2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮。LC/MS：C14H21BrFNO2Si的质量计算值为361.05，实测值为362.00[M+H]+。
步骤5：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯的合成
将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸(9.3g，28.64mmol，1.0当量)和Cs2CO3(5.6g，17.18mmol，0.6当量)在DMF(90mL)中的混合物在40℃处搅拌30min。然后添加2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮(14.5g，40.09mmol，1.4当量)，并且将混合物在室温处搅拌4h。将所得混合物用EtOAc(900mL)稀释，用水(3×150mL)、盐水(2×150mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将所得残余物施加到硅胶柱(330g，MeOH/DCM：1/20)上，得到呈淡黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯。LC/MS：C29H34ClF2N3O5Si的质量计算值为605.19，实测值为606.15[M+H]+。
步骤6：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮的合成
在氮气惰性气氛下，将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯(15.0g，24.75mmol，1.0当量)和NH4OAc(19.1g，247.47mmol，10.0当量)在AcOH(30mL)和甲苯(300mL)中的混合物在110℃处搅拌1h。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物施加到硅胶柱(330g，MeOH/DCM：1/15)上，得到呈淡黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。LC/MS：C29H34ClF2N5O2Si的质量计算值为585.21，实测值为586.15[M+H]+。
步骤7：(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮的合成
将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮(8g，13.648mmol，1.00当量)、TMSN3(15.724g，136.484mmol，10.00当量)和三甲氧基甲烷(14.484g，136.484mmol，10.00当量)在AcOH(60mL)中的混合物在55℃处搅拌过夜。减压浓缩所得混合物。将残余物施加到C18反相柱(330g，ACN/H2O(0.05％ NH4HCO3)：5％>>>35％>>>40％)上，得到呈白色固体状的(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。将白色固体通过制备型SFC(柱：Exsil Chiral-NR，250mm*30mm，8μm；流动相A：CO2，流动相B：MeOH(0.1％2M NH3-MeOH)；流速：100mL/min；梯度：50％ B；220nm；RT1：6.78；RT2：8.45；进样体积：3ml；运行次数：37；)进一步纯化，得到呈白色固体状的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.25(s,1H),9.82(s,1H),8.32(d,J＝5.0Hz,1H),7.95(t,J＝8.7Hz,1H),7.88(t,J＝5.4Hz,1H),7.70(d,J＝8.7Hz,1H),7.55(d,J＝3.9Hz,1H),5.68(d,J＝2.6Hz,1H),5.26(t,J＝5.9Hz,1H),5.02(d,J＝8.7Hz,1H),4.61(dd,J＝5.9,2.3Hz,2H),3.68-3.75(m,1H),2.67-2.75(m,1H),2.52-2.54(m,1H),2.14-2.21(m,1H),2.05-2.11(m,1H),1.93-1.97(m,2H)；19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-112.85,-130.14；LC/MS：C24H19ClF2N8O2的质量计算值为524.13，实测值为525.10[M+H]+。
实施例6：式(I-B)的化合物
(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基-4-d)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮
步骤1：(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-4-碘-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮的合成
将(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮(180mg，0.343mmol，1.0当量)和NIS(77mg，0.342mmol，1.0当量)在DMF(8mL)中的混合物在室温处搅拌2h。将所得混合物用EtOAc(80mL)稀释，用水(4×20mL)、盐水(2×20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物施加到硅胶柱(40g，MeOH/DCM：1/15)上，得到呈淡黄色固体状的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-4-碘-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。LC/MS：C24H18ClF2IN8O2的质量计算值为650.03，实测值为650.95[M+H]+。
步骤2：(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基-4-d)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮的合成
将(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-4-碘-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮(210mg，0.323mmol，1.0当量)和Zn(211mg，3.226mmol，10.0当量)在CD3COOD(8mL)和D2O(4mL)中的混合物在室温处搅拌10min。将所得混合物过滤，并浓缩滤液。将残余物施加到C18反相柱(330g，ACN/H2O(0.05％ NH4HCO3)：5％>>>40％>>>40％)上，得到呈淡黄色固体状的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基-4-d)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.30(br,1H),9.84(s,1H),8.30-8.40(m,1H),7.97(t,J＝7.9Hz,1H),7.89(t,J＝5.4Hz,1H),7.71(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),5.70(d,J＝2.7Hz,1H),5.13-5.50(m,1H),5.05(d,J＝8.7Hz,1H),4.64(s,2H),3.65-3.83(m,1H),2.62-2.83(m,1H),2.53-2.60(m,1H),2.05-2.30(m,2H),1.83-2.04(m,2H)；19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-112.51,-130.07；LC/MS：C24H18ClDF2N8O2的质量计算值为525.14，实测值为526.15[M+H]+。
实施例7A：式(I-C)的化合物
(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮
步骤1：(3-氟吡啶-2-基)甲烷-d2-醇的合成
在0℃处，向3-氟吡啶甲酸甲酯(5g，32.232mmol，1.00当量)在EtOH(80mL)中的混合物中分批添加NaBD4(4.0g，96.696mmol，3.0当量)。将所得混合物在室温处搅拌2h。然后将反应用饱和氯化铵溶液(60mL)淬灭。通过ROTOVAP在减压下蒸发除去EtOH溶剂。然后将所得混合物用EtOAc(3×100mL)萃取，经Na2SO4干燥并浓缩，得到呈淡黄色固体状的(3-氟吡啶-2-基)甲烷-d2-醇。
步骤2：2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶的合成
向(3-氟吡啶-2-基)甲烷-d2-醇(3.2g，24.781mmol，1.0当量)和TBSCl(5.6g，37.172mmol，1.5当量)在DMF(60mL)中的混合物中添加Et3N(7.5g，74.344mmol，3.0当量)。然后将所得混合物在室温处搅拌5h。将所得混合物用EtOAc(600mL)稀释，用水(3×150mL)、盐水(2×150mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物施加到硅胶柱(80g，EtOAc/PE：1/3)上，得到呈淡黄色固体状的2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶。LC/MS：C12H18D2FNOSi的质量计算值为243.14，实测值为244.10[M+H]+。
步骤3：2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟-4-碘吡啶的合成
在氮气惰性气氛下，在-78℃处，向2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶(4.8g，19.721mmol，1.00当量)在THF(120mL)中的混合物中添加LDA(11.8mL，23.666mmol，1.2当量，2M的THF溶液)，并且将所得混合物在-78℃处搅拌30min。然后在-78℃处向所得混合物中添加I2(5.5g，21.694mmol，1.1当量)在THF(25mL)中的溶液。将混合物在-78℃处搅拌2h。将所得混合物用饱和氯化铵溶液(200mL)淬灭，用EtOAc(3×200mL)萃取，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物施加到硅胶柱(80g，EtOAc/PE：1/4)上，得到呈淡黄色固体状的2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟-4-碘吡啶。
步骤4：2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶的合成
在氮气惰性气氛下，将2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟-4-碘吡啶(2.7g，7.311mmol，1.0当量)、三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(5.3g，14.623mmol，2.0当量)和Pd(PPh3)4(845mg，0.731mmol，0.1当量)在1,4-二
烷(50mL)中的混合物在100℃处搅拌过夜。将所得混合物浓缩，并且将残余物施加到硅胶柱(80g，EtOAc/PE：1/3)上，得到呈黄色固体状的2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶。LC/MS：C16H24D2FNO2Si的质量计算值为313.18，实测值为314.10[M+H]+。
步骤5：2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮的合成
向2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶(2.5g，7.975mmol，1.0当量)在THF(60mL)和H2O(20mL)中的混合物中添加NBS(1.4g，7.975mmol，1.0当量)。将反应在室温处搅拌1h。然后将所得混合物用EtOAc(500mL)稀释，用盐水(3×100mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到呈淡黄色油状物的2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮。
步骤6：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯的合成
将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸(2.4g，7.391mmol，1.0当量)和Cs2CO3(1.4g，4.434mmol，0.6当量)在DMF(60mL)中的混合物在40℃处搅拌30min。然后添加2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮(2.7g，7.391mmol，1.0当量)，并且将混合物在室温处搅拌4h。然后将所得混合物用EtOAc(500mL)稀释，用水(3×100mL)、盐水(2×100mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物施加到硅胶柱(80g，MeOH/DCM：1/20)上，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯。LC/MS：C29H32ClD2F2N3O5Si的质量计算值为607.20，实测值为608.15[M+H]+。
步骤7：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(4-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮的合成
在氮气惰性气氛下，将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯(3.5g，5.755mmol，1.0当量)和NH4OAc(3.5g，46.042mmol，8.0当量)在AcOH(10mL)和甲苯(100mL)中的混合物在110℃处搅拌1h。将所得混合物浓缩。将残余物施加到硅胶柱(80g，MeOH/DCM：1/15)上，得到呈淡黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(4-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。LC/MS：C29H32ClD2F2N5O2Si的质量计算值为587.23，实测值为588.15[M+H]+。
步骤8：(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮的合成
将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(4-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮(2.8g，4.761mmol，1.0当量)、TMSN3(5.5g，47.606mmol，10.0当量)和三甲氧基甲烷(5.1g，47.606mmol，10.0当量)在AcOH(50mL)中的混合物在55℃处搅拌过夜。将所得混合物浓缩。将残余物施加到C18反相柱(330g，ACN/H2O(0.05％ NH4HCO3)：5％>>>35％>>>40％)上，得到呈白色固体状的(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。将白色固体通过制备型SFC(柱：Exsil Chiral-NR，250mm*30mm，8μm；流动相A：CO2，流动相B：MeOH(0.5％2M NH3-MeOH)--HPLC；流速：100mL/min；梯度：45％ B；220nm；RT1：9.02；RT2：11.5；进样体积：4.8ml；运行次数：13；)进一步纯化，得到呈白色固体状的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.27(s,1H),9.85(s,1H),8.35(d,J＝5.0Hz,1H),7.98(t,J＝8.0Hz,1H),7.90(t,J＝5.4Hz,1H),7.72(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),7.58(d,J＝1.6Hz,1H),5.71(d,J＝2.8Hz,1H),5.24(s,1H),5.05(d,J＝8.7Hz,1H),3.65-3.84(m,1H),2.73(t,J＝15.4Hz,1H),2.54-2.62(m,1H),2.17-2.30(m,1H),2.06-2.16(m,1H),1.89-2.05(m,2H)；19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-112.85,-130.23；LC/MS：C24H17ClD2F2N8O2的质量计算值为526.14，实测值为527.05[M+H]+。
实施例7B：式(I-C)的化合物
(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮
步骤1：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯
将((3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸(260mg，0.80mmol，1.0当量)和Cs2CO3(156mg，0.48mmol，0.6当量)在DMF(12mL)中的混合物在40℃处搅拌30min。然后将2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮(437mg，1.20mmol，1.5当量)添加到混合物中。将反应混合物在室温处搅拌4h。然后将所得混合物用EA(120mL)稀释，用水(3×30mL)、盐水(2×20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱法(0→10％ MeOH/DCM)纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯。LC/MS：C29H32ClD2F2N3O5Si的质量计算值为607.20，实测值为608.10[M+H]+。
步骤2：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮
将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯(280mg，0.46mmol，1.0当量)和NH4OAc(355mg，4.60mmol，10.0当量)在AcOH(3mL)和甲苯(30mL)中的混合物在110℃处搅拌1h，然后冷却至室温并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱法(0→9％MeOH/DCM)纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。LC/MS：C23H18ClD2F2N5O2的质量计算值为473.14，实测值为474.05[M+H]+。
步骤3：(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮
将((3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮(200mg，0.422mmol，1.00当量)、TMSN3(486mg，4.22mmol，10.0当量)和三甲氧基甲烷(448mg，4.22mmol，10.0当量)在AcOH(10mL)中的混合物在50℃处搅拌4h，然后在减压下浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱法(0→10％MeOH/DCM)纯化，得到呈淡黄色固体状的(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮，将其通过手性HPLC进一步纯化，得到呈白色固体状的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。
LC/MS：C24H17ClD2F2N8O2的质量计算值为526.14，实测值(ES,m/z)为527.05[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)d 12.27(s,1H),9.85(s,1H),8.35(d,J＝5.0Hz,1H),7.98(t,J＝8.0Hz,1H),7.90(t,J＝5.4Hz,1H),7.72(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),7.58(d,J＝1.6Hz,1H),5.71(d,J＝2.8Hz,1H),5.24(s,1H),5.05(d,J＝8.7Hz,1H),3.65-3.84(m,1H),2.73(t,J＝15.4Hz,1H),2.54-2.62(m,1H),2.17-2.30(m,1H),2.06-2.16(m,1H),1.89-2.05(m,2H)。19FNMR(376MHz,DMSO-d6)d-112.85,-130.23
实施例8：式(I-D)的化合物
(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d
步骤1：(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-8a-d。
向(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸-8a-d(300mg，0.80mmol，1.0当量)在CH3CN(10mL)中的溶液中添加K2CO3(142mg，1.03mmol，1.3当量)。在室温处搅拌0.5h后，添加2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮(430mg，1.20mmol，1.5当量)。将混合物在室温处搅拌1h。将所得混合物用MeOH/DCM(0→7％)通过硅胶柱纯化，得到呈黄色油状物的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-8a-d。LC/MS：C30H32DClF2N6O5Si的质量计算值为659.20，实测值(ES,m/z)为660.15[M+H]+。
步骤2：(3S)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d。
向(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-8a-d(380mg，0.58mmol，1.0当量)在甲苯(10mL)和乙酸(1mL)中的溶液中添加乙酸铵(665mg，8.63mmol，15.0当量)。将混合物在100℃处搅拌1h。真空除去溶剂，并且将残余物用MeOH/DCM(0→10％)通过硅胶柱纯化，得到呈黄色油状物的(3S)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d。LC/MS：C30H32DClF2N8O2Si的质量计算值为639.22，实测值(ES,m/z)为640.20[M+H]+。
步骤3：(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d。
向(3S)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d(280mg，0.44mmol，1.0当量)在THF(5mL)中的溶液中添加三乙胺三氟化氢(1.3mL)。将混合物在70℃处搅拌1h。真空除去溶剂，并且将残余物通过C18柱[条件：ACN-水-6.5mMNH4HCO3+NH3H2O(5→50％)]纯化，得到第二残余物。将第二残余物通过手性HPLC[柱：(R,R)WHELK-O1，4.6*50mm，3.5μm；流动相：Hex(0.1％DEA):EtOH＝55:45；流速：1mL/min]纯化，得到呈灰白色固体状的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d。
LC/MS：C24H18ClDF2N8O2的质量计算值为525.14，实测值(ES,m/z)为526.10[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.25(s,1H),9.84(s,1H),8.34(d,J＝5.1Hz,1H),7.94-8.00(m,1H),7.86-7.90(m,1H),7.71(dd,J＝8.6,1.5Hz,1H),7.57(d,J＝3.8Hz,1H),5.70(d,J＝2.7Hz,1H),5.23-5.29(m,1H),5.04(d,J＝8.7Hz,1H),4.63(dd,J＝6.0,2.3Hz,2H),2.65-2.77(d,J＝16.7Hz,1H),2.52-2.58(m,1H),2.16-2.29(m,1H),2.06-2.14(m,1H),2.90-2.02(m,2H)。19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-112.85,-130.16。
实施例9：式(I-E)的化合物
(3S,8aS)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d
根据如上文在实施例8中所述的程序制备标题化合物，分离第二级分并冻干，得到呈白色固体状的标题化合物。
LC/MS：C24H18DClF2N8O2的质量计算值为525.14，实测值(ES,m/z)为526.10[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.52(s,1H),9.84(s,1H),8.34(d,J＝5.1Hz,1H),7.94-8.01(m,1H),7.85-7.92(m,1H),7.71(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),7.62(d,J＝3.7Hz,1H),5.70(d,J＝2.7Hz,1H),5.00-5.08(m,1H),4.64(d,J＝2.2Hz,2H),2.42-2.46(m,1H),2.31-2.41(m,1H),2.20-2.30(m,1H),1.95-2.08(m,1H),1.64-1.78(m,1H),1.14-1.28(m,1H)。19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-113.06,-129.81。
实施例10：式(I-F)的化合物
(3S,8aR*)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d
步骤1：(2S)-5-甲氧基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯-5-d
向(2S)-5-羟基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯-5-d(14g，56.85mmol，1.0当量)在MeOH(140mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸一水合物(2.7g，14.21mmol，0.25当量)。将混合物在室温处搅拌过夜。真空除去溶剂，并且将残余物用EA/PE(0％-35％)通过硅胶柱纯化，得到呈黄色油状物的(2S)-5-甲氧基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯-5-d。
步骤2：(2S)-5-((2,2-二甲基-4-氧代-4H-1,3-二氧杂环己烯-6-基)甲基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯-5-d
在-40℃处，在10min内向(2S)-5-甲氧基吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯-5-d(10g，38.4mmol，1.0当量)和((2,2-二甲基-4-亚甲基-4H-1,3-二氧杂环己烯-6-基)氧基)三甲基硅烷(14.0g，65.32mmol，1.7当量)在叔丁基甲基醚(100mL)中的溶液中添加BF3πEt2O(6.8g，47.91mmol，1.25当量)。将所得混合物在-78℃处搅拌40min。使反应升温至环境温度过夜。将反应用饱和碳酸氢钠溶液(50mL)淬灭。将所得混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(0-40％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到呈黄色油状物的(2S)-5-((2,2-二甲基-4-氧代-4H-1,3-二氧杂环己烯-6-基)甲基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯-5-d。LC/MS：C18H26DNO7的质量计算值为370.19，实测值为393.20[M+H]+。
步骤3：(2S)-5-((2,2-二甲基-4-氧代-4H-1,3-二氧杂环己烯-6-基)甲基)吡咯烷-2-甲酸甲酯-5-d
向(2S)-5-((2,2-二甲基-4-氧代-4H-1,3-二氧杂环己烯-6-基)甲基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-(叔丁酯)2-甲酯-5-d(8g，21.60mmol，1.0当量)在DCM(50mL)中的溶液中添加TFA(10mL)。将混合物在室温处搅拌1h。将混合物用NaHCO3溶液(2×10mL)和NaCl溶液(1×10mL)洗涤。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到呈黄色油状物的(2S)-5-((2,2-二甲基-4-氧代-4H-1,3-二氧杂环己烯-6-基)甲基)吡咯烷-2-甲酸甲酯-5-d。LC/MS：C13H18DNO5的质量计算值为270.13，实测值为213.05[M+H-CO2Me]+。
步骤4：(3S)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯-8a-d
将(2S)-5-((2,2-二甲基-4-氧代-4H-1,3-二氧杂环己烯-6-基)甲基)吡咯烷-2-甲酸甲酯-5-d(6g，22.20mmol，1.0当量)在甲苯(60mL)中的混合物在100℃处搅拌1h。真空除去溶剂，并且将残余物用MeOH/DCM(0％-20％)通过硅胶柱纯化，得到呈黄色油状物的(3S)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯-8a-d。
在0℃处，向(3S)-5,7-二氧代八氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯-8a-d(1g，4.71mmol，1.0当量)和三乙胺(1.4g，14.14mmol，3.0当量)在DCM(10mL)中的溶液中添加1,1,1-三氟-N-苯基-N-((三氟甲基)磺酰基)甲磺酰胺(1.7g，4.71mmol)。将混合物在室温处搅拌1h。将反应用水(20mL)淬灭。将所得混合物用DCM(1×50mL)萃取，并用水和NaCl溶液(30mL)洗涤。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(0-20％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到呈黄色油状物的(3S)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯-8a-d。LC/MS：C11H11DF3NO6S的质量计算值为344.04，实测值为345.00[M+H]+。
步骤5：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯-8a-d
向(3S)-5-氧代-7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯-8a-d(1g，2.91mmol，1.0当量)在1,4-二
烷(15mL)和H2O(2mL)中的溶液中添加(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)硼酸(1.1g，5.81mmol，1.0当量)，随后添加K2CO3(803mg，5.81mmol，2.0当量)、Pd(dppf)Cl2(237mg，0.29mmol，0.1当量)。将所得混合物保持在氮气下并在90℃处搅拌2h。将反应用饱和氯化铵溶液(20mL)淬灭。将所得混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(0-20％MEOH/DCM)纯化，得到呈棕色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯-8a-d。LC/MS：C16H15ClDFN2O3的质量计算值为339.09，实测值为340.05[M+H]+。
步骤6：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸-8a-d
向(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸甲酯-8a-d(1.6g，4.71mmol，1.0当量)在四氢呋喃(20mL)和水(4mL)中的溶液中添加LiOH(169mg，7.06mmol，1.5当量)。将反应在室温处搅拌1h。用2M HCl将pH值调节至2～5。将所得混合物用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到呈棕色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸-8a-d。LC/MS：C15H13ClDFN2O3的质量计算值为325.07，实测值为326.20[M+H]+。
步骤7：(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸-8a-d
向(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸-8a-d(1.6g，4.91mmol，1.0当量)在AcOH(6mL)中的溶液中添加TMSN3(3ml)和三甲氧基甲烷(3mL)。将混合物在室温处搅拌过夜。真空除去溶剂，并且将残余物用CH3CN/水(5％-35％)通过C18柱纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸-8a-d。LC/MS：C16H12ClDFN5O3的质量计算值为378.08，实测值为379.05[M+H]+。
步骤8：(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-8a-d
向(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸-8a-d(300mg，0.80mmol，1.0当量)在CH3CN(10mL)中的溶液中添加K2CO3(142mg，1.03mmol，1.3当量)。在室温处搅拌0.5h后，然后添加2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮(432mg，1.19mmol，1.5当量)。将混合物在室温处搅拌1h。将所得混合物通过硅胶色谱法(0-7％ MeOH/DCM)纯化，得到呈黄色油状物的(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-8a-d。LC/MS：C30H30ClD3F2N6O5Si的质量计算值为661.21，实测值为662.15[M+H]+。
步骤9：(3S)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d
向(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-8a-d(280mg，0.42mmol，1.0当量)在甲苯(10mL)和冰醋酸(1mL)中的溶液中添加乙酸铵(489mg，6.34mmol，15.0当量)。将混合物在100℃处搅拌1h。真空除去溶剂，并且将残余物用MeOH/DCM(0％-10％)通过硅胶柱纯化，得到呈黄色油状物的(3S)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d。LC/MS：C30H30ClD3F2N8O2Si的质量计算值为641.23，实测值为642.20[M+H]+。
步骤10：(3S,8aR*)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d
向(3S)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基-d2)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d(140mg，0.22mmol，1.0当量)在THF(4mL)中的溶液中添加三乙胺三氟化氢(1mL)。将混合物在70℃处搅拌1h。真空除去溶剂，并且将残余物通过C18柱[条件：ACN-水-6.5mMNH4HCO3+NH3H2O(5％-50％)]纯化，得到残余物。将残余物通过手性HPLC[柱：(R,R)-Whelk-O1，4.6*50mm，3.5μm；流动相A：Hex(0.1％DEA):EtOH＝50:50，流动相B：；流速：1mL/min]纯化，得到呈灰白色固体状的(3S,8aR*)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8a-d。
LC/MS：C24H16D3ClF2N8O2的质量计算值为527.15，实测值(ES,m/z)为642.20[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)(400MHz,DMSO-d6)δ12.29(s,1H),9.84(s,1H),8.34(d,J＝5.1Hz,1H),7.93-8.02(m,1H),7.84-7.92(m,1H),7.70-7.75(m,1H),7.58(d,J＝4.0Hz,1H),5.69(d,J＝2.7Hz,1H),5.12-5.32(m,1H),5.04(d,J＝8.7Hz,1H),2.63-2.80(m,1H),2.50-2.56(m,1H),2.17-2.31(m,1H),2.05-2.15(m,1H),1.90-2.01(m,2H)。19F-NMR:(376MHz,DMSO-d6)δ-112.86,-130.13。
实施例11：式(I-G)的化合物
(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-1,1,8,8,8a-d5
步骤1：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-1,1,8,8,8a-d5。
将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸-1,1,8,8,8a-d5(120mg，0.36mmol，1.0当量)和Cs2CO3(71mg，0.22mmol，0.6当量)在DMF(8mL)中的混合物在室温处搅拌30min。然后将2-溴-1-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)乙-1-酮(185mg，0.51mmol，1.4当量)添加到混合物中。将反应混合物在室温处搅拌4h。然后将所得混合物用EtOAc(120mL)稀释，用水(3×20mL)、盐水(2×20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱法(40g，MeOH/DCM：1/20)纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-1,1,8,8,8a-d5。LC/MS：C29H29ClD5F2N3O5Si的质量计算值为610.22，实测值(ES,m/z)为611.15[M+H]+。
步骤2：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-1,1,8,8,8a-d5。
在氮气惰性气氛下，将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-1,1,8,8,8a-d5(130mg，0.21mmol，1.0当量)和NH4OAc(164mg，2.13mmol，10.0当量)在AcOH(2mL)和甲苯(20mL)中的混合物在110℃处搅拌30min，然后浓缩。将残余物通过硅胶快速柱色谱法(40g，MeOH/DCM：1/15)纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-1,1,8,8,8a-d5。LC/MS：C29H29D5ClF2N5O2Si的质量计算值为590.25，实测值(ES,m/z)为591.30[M+H]+。
步骤3：(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-1,1,8,8,8a-d5。
将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-1,1,8,8,8a-d5(80mg，0.14mmol，1.0当量)、TMSN3(156mg，1.35mmol，10.0当量)和三甲氧基甲烷(143mg，1.35mmol，10.0当量)在AcOH(8mL)中的混合物在55℃处搅拌过夜。将溶剂在减压下除去，并且将残余物施加到C18反相柱(330g，ACN/H2O(0.05％ NH4HCO3)：5→50％)上，得到呈白色固体状的(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-1,1,8,8,8a-d5，将其通过制备型手性HPLC进一步纯化，得到呈白色固体状的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-1,1,8,8,8a-d5。
LC/MS：C24H14D5ClF2N8O2的质量计算值为529.16，实测值(ES,m/z)为530.10[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)(400MHz,DMSO-d6)δ12.26(s,1H),9.84(s,1H),8.34(d,J＝5.0Hz,1H),7.90-8.00(m,1H),7.90(t,J＝5.4Hz,1H),7.75-7.85(m,1H),7.51-7.62(m,1H),5.70(s,1H),5.27(t,J＝6.0Hz,1H),5.04(d,J＝8.7Hz,1H),4.58-4.69(m,2H),2.13-2.30(m,1H),1.84-2.00(m,1H)。19F-NMR:(376MHz,DMSO-d6)δ-112.86,-130.15。
实施例12：式(I-H)的化合物
(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基-4-d)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮
向(3R,8aS)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-4-碘-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮(25mg，0.038mmol)和Zn粉(25mg，0.38mmol)的混合物中添加1.5g CD3COOD(1.5g)，并且将所得混合物在室温处搅拌4h。然后滤出沉淀。将滤液在减压下浓缩，并且将残余物通过Gilson HPLC纯化，得到呈淡黄色固体状的3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基-4-d)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。
C24H19ClF2N8O2的LC/MS计算值为527.1，实测值为528.3(MH+)；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.62(s,1H),8.56(s,1H),8.46(s,1H),7.85(dd,J＝7.83,8.80Hz,1H),7.58(dd,J＝1.71,8.56Hz,1H),5.77-5.85(m,1H),5.21-5.30(m,1H),3.96-4.13(m,1H),2.75-2.88(m,1H),2.66-2.73(m,1H),2.35-2.45(m,1H),2.27-2.33(m,1H),2.16-2.24(m,1H),2.02-2.12(m,1H)。
实施例13：式(I-J)的化合物
(3R,8aS)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基-d)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮
在NMR管中向(3S,8aR)-7-[3-氯-2-氟-6-(四唑-1-基)苯基]-3-[4-[2-[二氘(羟基)甲基]-3-氟-4-吡啶基]-1H-咪唑-2-基]-2,3,8,8a-四氢-1H-吲哚嗪-5-酮(35mg，0.07mmol)在CD3OD中的溶液中添加NaHCO3，并且通过1H NMR分析样品。在几分钟内，四唑环中的酸性质子与氘交换，得到(3R,8aS)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基-d)苯基)-3-(4-(3-氟-2-(羟甲基-d2)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮。
C24H16D3ClF2N8O2的LC/MS计算值为527.1，实测值为528.3(MH+)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.02(dd,J＝8.31,9.78Hz,1H),7.78-7.88(m,1H),7.54-7.61(m,1H),7.14(d,J＝3.42Hz,1H),6.49(dd,J＝1.96,8.31Hz,1H),5.73(d,J＝2.93Hz,1H),5.16(d,J＝8.80Hz,1H),3.84-3.96(m,1H),2.89-3.04(m,1H),2.56-2.65(m,1H),2.28-2.39(m,1H),2.16-2.26(m,2H),1.99-2.12(m,1H)。
实施例14：式(I-K)的化合物
(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8,8,8a-d3
步骤1：(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8,8,8a-d3
向(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟吡啶-4-基)-2-氧代乙酯-8,8,8a-d3(0.51g，0.837mmol，1.0当量)在甲苯(10mL)中的溶液中添加NH4OAc(0.65g，8.4mmol，10当量)和AcOH(0.5mL)，并且将所得混合物在100℃处搅拌1h。然后将混合物浓缩并通过C18反相色谱法(80g，MeCN/H2O(0.05％ CF3COOH)：0>45％)纯化，得到呈黄色固体状的(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8,8,8a-d3(0.24g，60.4％收率)。LC/MS：C23H17ClD3F2N5O2的质量计算值为474.15，实测值为476.20[M+H]+。
步骤2：(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8,8,8a-d3
将(3S)-7-(6-氨基-3-氯-2-氟苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8,8,8a-d3(0.22g，0.463mmol，1.0当量)、三甲氧基甲烷(2mL)、叠氮三甲基硅烷(2mL)和乙酸(2mL)的混合物在室温处搅拌2h。真空蒸发溶剂，得到(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8,8,8a-d3。将外消旋产物通过手性HPLC(柱：CHIRALPAK IF-3，4.6*50mm，3μm；流动相：MtBE(0.1％ DEA):EtOH＝70:30；流速：1mL/min)分离，得到呈白色固体状的(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮-8,8,8a-d3。
LC/MS：C24H16ClD3F2N8O2的质量计算值为527.15，实测值为528.10[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)d 12.27(s,1H),9.85(s,1H),8.30–8.40(m,1H),7.94-8.01(m,1H),7.86-7.93(m,1H),7.69-7.75(m,1H),7.54-7.60(m,1H),5.70(s,1H),5.28(t,J＝6.0Hz,1H),5.08–5.01(m,1H),4.64(dd,J＝5.9,2.3Hz,2H),2.14-2.28(m,1H),1.91-2.00(m,2H)。
实施例15：式(II-A)的化合物
4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸
向(3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-3-(5-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)-1H-咪唑-2-基)-2,3,8,8a-四氢吲哚嗪-5(1H)-酮(1.2g，2.286mmol，1.00当量)在DCM(60mL)和H2O(30mL)中的混合物中添加TEMPO(179mg，1.146mmol，0.50当量)和PhI(OAc)2(2.2g，6.830mmol，3.0当量)。将反应混合物在室温处搅拌2h。将所得混合物浓缩，并且将残余物施加到C18反相柱(330g，ACN/H2O(0.05％ NH4HCO3)：5％>>>23％>>>25％)上，得到呈白色固体状的4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶甲酸。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.30(br.,1H),9.85(s,1H),8.28(d,J＝8.0Hz,1H),7.93-8.01(m,1H),7.84-7.92(m,1H),7.71(d,J＝8.7Hz,1H),7.55(d,J＝4.0Hz,1H),5.69(d,J＝2.7Hz,1H),5.05(d,J＝8.8Hz,1H),3.65-3.85(m,1H),2.63-2.86(m,1H),2.52-2.62(m,1H),2.15-2.19(m,1H),2.05-2.14(m,1H),1.89-2.05(m,2H)；19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-112.81,-127.49；LC/MS：C24H17ClF2N8O3的质量计算值为538.11，实测值为539.05[M+H]+；
实施例16：式(III-A)的化合物
4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶1-氧化物
步骤1：2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶
将2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氟-4-碘吡啶(0.80g，2.178mmol，1.00当量)、三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(1.180g，3.267mmol，1.50当量)和Pd(PPh3)4(0.252g，0.218mmol，0.10当量)在1,4-二
烷(10mL)中的混合物在100℃处搅拌4h。将反应用水稀释并用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩，得到呈淡黄色固体状的2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶。LC/MS：C16H26FNO2Si的质量计算值为311.2，实测值为312.2[M+H]+。
步骤2：1-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)乙-1-酮
向2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-(1-乙氧基乙烯基)-3-氟吡啶(2.5g，8.027mmol，1当量)在THF(15mL)中的溶液中添加2M HCl(20mL)。将混合物在室温处搅拌5h，然后用NaHCO3溶液将pH值调节至8～10。将所得混合物用EA萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并真空浓缩，得到呈淡黄色固体状的1-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)乙-1-酮。
步骤3：4-乙酰基-3-氟-2-(羟甲基)吡啶1-氧化物
向1-(3-氟-2-(羟甲基)吡啶-4-基)乙-1-酮(1.25g，7.390mmol，1当量)在DCM(20mL)中的溶液中添加m-CPBA(2.550g，14.780mmol，2.0当量)。将反应混合物在室温处搅拌2h，然后用NaHCO3溶液淬灭。将所得混合物用DCM萃取三次。将合并的有机层经Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物施加到具有EA/PE(0-100％)的硅胶柱上，得到呈白色固体状的4-乙酰基-3-氟-2-(羟甲基)吡啶1-氧化物。LC/MS：C8H8FNO3的质量计算值为185.05，实测值为186.05[M+H]+
步骤4：2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-溴乙酰基)-3-氟吡啶1-氧化物
向4-乙酰基-3-氟-2-(羟甲基)吡啶1-氧化物(0.9g，4.861mmol，1当量)在乙酸(20mL)中的溶液中添加溴化氢的乙酸溶液(2.384g，9.722mmol，2当量)，随后缓慢添加三溴化吡啶
(1.477g，4.618mmol，0.95当量)。将反应混合物在室温处搅拌2h，然后真空浓缩。将残余物与水和EA混合。收集有机相，经Na2SO4干燥并真空浓缩，得到呈淡黄色油状物的2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-溴乙酰基)-3-氟吡啶1-氧化物。LC/MS：C10H9BrFNO4的质量计算值为304.97，实测值为306.00[M+H]+，308.00[M+2+H]+。
步骤5：2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-(((3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-羰基)氧基)乙酰基)-3-氟吡啶1-氧化物
向(3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-甲酸(0.01g，0.026mmol，1.0当量)在MeCN(1mL)中的溶液中添加碳酸钾(0.007g，0.053mmol，2.0当量)。将混合物搅拌30min后，添加2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-溴乙酰基)-3-氟吡啶1-氧化物(0.012g，0.040mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温处搅拌2h。LCMS显示生成了2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-(((3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-羰基)氧基)乙酰基)-3-氟吡啶1-氧化物，并且该反应混合物未经进一步分离或纯化即用于下一步骤。LC/MS：C26H21ClF2N6O7的质量计算值为602.11，实测值为603.15[M+H]+。
步骤6：2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-((3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶1-氧化物
在N2下，向2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-(((3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-羰基)氧基)乙酰基)-3-氟吡啶1-氧化物(0.34g，0.564mmol，1.0当量)在甲苯(15mL)中的溶液中添加乙酸铵(0.870g，11.290mmol，20当量)，随后添加乙酸(0.5mL)。将反应混合物在100℃处搅拌1h，然后冷却至室温，并真空浓缩。将残余物用MeOH/DCM(0-15％)通过硅胶色谱法纯化，得到呈淡黄色油状物的2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-((3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶1-氧化物。LC/MS：C26H21ClF2N8O4的质量计算值为582.13，实测值为583.10[M+H]+
步骤7：4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶1-氧化物
向2-(乙酰氧基甲基)-4-(2-((3S)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟吡啶1-氧化物(0.16g，0.274mmol，1当量)在乙腈(10mL)中的溶液中添加LiBr(0.119g，1.372mmol，5当量)、三乙胺(0.278g，2.745mmol，10当量)和水(0.25mL)。将反应混合物在60℃处搅拌5h，然后真空浓缩。将残余物通过(柱：YMC-Actus Triart C18 ExRS，30mm×150mm，5μm；流动相A：水(10mmol NH4HCO3)，流动相B：ACN；流速：60mL/min；梯度：12min内20B至30B)纯化，得到呈白色固体状的4-(2-((3S,8aR)-7-(3-氯-2-氟-6-(1H-四唑-1-基)苯基)-5-氧代-1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪-3-基)-1H-咪唑-5-基)-3-氟-2-(羟甲基)吡啶1-氧化物。
LC/MS：C30H19ClF4N6O4的质量计算值为540.12，实测值为541.15[M+H]+。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)d 9.57(s,1H),8.29(d,J＝6.9Hz,1H),8.10(t,J＝7.9Hz,1H),7.81(dd,J＝8.7,7.6Hz,1H),7.60(d,J＝4.1Hz,1H),7.55(dd,J＝8.7,1.6Hz,1H),5.76(d,J＝2.7Hz,1H),5.16(d,J＝8.6Hz,1H),4.94(d,J＝3.2Hz,2H),3.88-4.01(m,1H),2.72-2.89(m,1H),2.56-2.69(m,1H),2.14-2.39(m,3H),1.97-2.12(m,1H)；19F NMR(376MHz,甲醇-d4)d-113.62,-124.02。
本领域技术人员将认识到，式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物、式(IV)的化合物、式(V)的化合物和式(VI)的化合物的另外的立体异构体(例如对映体、非对映体等)可如本文所述通过选择和适当地取代对映体和/或非对映体富集(例如≥90％ee，优选≥98％ee)的试剂或起始材料，和/或通过制备对应的外消旋化合物，随后通过例如制备型手性超临界流体色谱法(SFC)进行手性分离(其中为了最佳收集效率使用等度方法条件和堆叠进样)，通过用手性拆分试剂结晶盐、动力学拆分或其它已知方法来制备。
生物学实施例
生物学实施例1：因子XIa抑制测定
使用荧光团-猝灭剂对肽底物
基于荧光强度的测定用于监测因子XIa的抑制。基于FXI序列选择肽底物5Fam-KLTRAETV-K5Tamra(购自New England Peptide)。酶原FIX向其活化形式FIXa的转化通过FXIa在两个位点Arg146和Arg180处的蛋白水解裂解而发生。用于该测定中的定制肽基于Arg146裂解位点。用荧光团-猝灭剂对设计肽底物，其中荧光被猝灭直至FXIa在Arg残基后裂解8聚体肽。将底物KM拟合于底物抑制模型，其中kcat＝0.86s-1，KM＝12.4μM，Ki＝61.6μM，具有酶效率，以及kcat/KM＝69523M-1s-1。
因子XIa FLINT测定与以下5Fam-KLTRAETV-K5Tamra测定缓冲液一起使用：使用50mM Tris，pH 7.5、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mg/mL BSA、0.03％ CHAPS。通过将所有成分新鲜混合来制备测定缓冲液。首先在100％ DMSO中制备2X 5Fam-KLTRAETV-K5Tamra肽底物，然后在100％ DMSO中稀释10mM至3mM。然后将测定缓冲液直接添加到3mM底物原液中以制备30μM 2X工作浓度(15μM最终浓度)。对于200pM工作储备溶液(100pM最终浓度)，通过在1X测定缓冲液中稀释6.562μM原液来制备2X因子XIa储备溶液。
测试化合物以11点，3倍系列稀释度运行，最终顶部化合物浓度为100nM。测定中的最终DMSO为2％ DMSO。将FXIa和化合物预温育30分钟，然后添加底物以引发反应。使用100pM FXIa超过30分钟的测定是线性的。更具体地，如下运行测定：
·将100nL的1mM测试化合物分配到黑色384孔非结合Greiner BioOne 784900板中，得到10μM最终浓度和1％ DMSO最终浓度；
·将5μL的1X测定缓冲液分配到第24列(低对照)，并且将5μL 2X因子XIa溶液分配到第1-23列(第23列高对照)；
·将板用“盖”板以500rpm离心1min
·将板在室温处预温育30分钟并盖上板；
·将5μL的2X 5Fam-KLTRAETV-K5Tamra肽底物分配到整个板(第1-24列)中；
·将板用盖板以500rpm离心1min；
·使用荧光模块F1 485mm/520mm，在室温处在BMG PHERAStar上动态监测荧光强度来读取板。
每个测试的化合物生成抑制百分比(IC50)曲线，并且使用GeneData Screener使用4参数逻辑拟合来分析数据。使用以下等式将相对荧光单位(RFU)值归一化为抑制百分比：
抑制％＝((HC-LC)-(化合物-LC)/(HC-LC))*100
其中LC–低对照＝无因子XIa或100％抑制因子XIa的平均信号；HC–高对照＝因子XIa+仅含DMSO的5Fam-KLTRAETV-K5Tamra肽底物的平均信号。
使用GENDATA生成测试化合物的11点剂量响应曲线以基于以下等式确定IC50值：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)*HillSlope))
其中Y是在X抑制剂浓度存在下的抑制％，Top＝高对照＝因子XIa+仅含DMSO的5Fam-KLTRAETV-K5Tamra肽底物的平均信号；Bottom＝低对照-无因子XIa或100％抑制因子XIa的平均信号；Hillslope–Hill系数；以及IC50＝相对于top/高对照具有50％抑制的化合物的浓度。
生物学实施例2：激肽释放酶抑制测定
利用猝灭的AMC肽底物
基于荧光强度的测定用于监测人血浆激肽释放酶的抑制。肽底物，Z-Gly-Pro-Arg-AMC(购自Bachem；目录#I-1150)基于其相对低的激肽释放酶KM来选择，这使得能够在较低底物浓度下运行测定以控制背景荧光。通过将滴定数据拟合至产生KM＝40μM、kcat＝0.76s-1和kcat/KM＝18932M-1s-1的Michaelis-Menten方程来确定该底物的动力学参数。
激肽释放酶FLINT测定与以下Z-Gly-Pro-Arg-AMC测定缓冲液一起使用：50mMTris，pH 7.5、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mg/mL BSA、0.03％CHAPS。通过将所有成分新鲜混合来制备测定缓冲液。2X Z-Gly-Pro-Arg-AMC肽底物通过将10mM原液稀释到1X测定缓冲液中达到100μM工作浓度(50μM最终浓度)来制备。对于4nM工作储备溶液(2nM最终浓度)，通过在1X测定缓冲液中稀释14.76μM原液来制备2X激肽释放酶储备溶液。
测试化合物以11点，3倍系列稀释度运行，最终顶部化合物浓度为1μM。测定中的最终DMSO：2％ DMSO。将2nM激肽释放酶和测试化合物预温育30分钟，然后添加50μM底物以引发反应。使用2nM激肽释放酶超过30分钟的测定是线性的。更具体地，如下运行测定：
·将100nL的1mM测试化合物分配到黑色384孔非结合Greiner BioOne 784900板中，得到10μM最终浓度和1％ DMSO最终浓度；
·将5μL的1X测定缓冲液分配到第24列(低对照)，并且将5μL 2X人激肽释放酶溶液分配到第1-23列(第23列高对照)；
·将板用盖板以500rpm离心1min
·将板在室温处预温育30分钟并盖上板；
·将5μL的2X Z-Gly-Pro-Arg-AMC肽底物分配到整个板(第1-24列)中；
·将板用“盖”板以500rpm离心1min；
·使用荧光模块F1 340mm/440mm，在室温处在BMG PHERAStar上动态监测荧光强度来读取板。
每个测试的化合物生成抑制百分比(IC50)曲线，并且使用GeneData Screener使用4参数逻辑拟合来分析数据。使用以下等式将相对荧光单位(RFU)值归一化为抑制百分比：
抑制％＝((HC-LC)-(化合物-LC)/(HC-LC))*100
其中LC–低对照＝人激肽释放酶或100％抑制人激肽释放酶的平均信号；HC–高对照＝人激肽释放酶+仅含DMSO的Z-Gly-Pro-Arg-AMC肽底物的平均信号。
使用GENDATA生成测试化合物的11点剂量响应曲线以基于以下等式确定IC50值：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)*HillSlope))
其中Y是在X抑制剂浓度存在下的抑制％，Top＝高对照＝人激肽释放酶+仅含DMSO的Z-Gly-Pro-Arg-AMC肽底物的平均信号；Bottom＝低对照–无人激肽释放酶或100％抑制人激肽释放酶的平均信号；Hillslope–Hill系数；以及IC50＝相对于top/高对照具有50％抑制的化合物的浓度。
根据上文生物学实施例1和生物学实施例2中所述的程序测试本发明的代表性化合物，结果列于下表B-1中。
表B-1：FXIa和血浆激肽释放酶生物活性
| 测定 | 化合物式 | 结果 |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-A) | 1.8nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-B) | 2.9nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-C) | 2.2nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-D) | 5.7nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-E) | 22.5nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-F) | 5.1nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-G) | 3.9nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-H) | 3.2nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-J) | 4.1nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (I-K) | 5.0nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (II-A) | 0.3nM |
| <![CDATA[因子XIa IC<sub>50</sub>]]> | (III-A) | 45.4nM |
| 测定 | 化合物式 | 结果 |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-A) | 13nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-B) | 25nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-C) | 17nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-D) | 43nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-E) | 72nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-F) | 34nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-G) | 33nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-H) | 27nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-J) | 32nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (I-K) | 9.7nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (II-A) | 11nM |
| <![CDATA[血浆激肽释放酶(PK)IC<sub>50</sub>]]> | (III-A) | 420nM |
生物学实施例3
人肝微粒体中的反应性代谢物研究
使用GSH和KCN作为捕集剂评估式(I-A)的化合物在HLM中的生物活化。将化合物在补充有NADPH、KCN和GSH的人肝微粒体中在37℃处温育60min。用1mg/mL蛋白、10μM底物、1mMGSH(未标记且以3:1标记)和1mM KCN(未标记且以3:1标记)以1mL的总体积进行温育。在与阳性对照相同的条件下温育奈法唑酮(Nefazodone)(10μM)。温育后，通过与5X体积的乙腈混合进行蛋白质沉淀以提取代谢物。通过离心(3000rpm，10分钟，4℃)将蛋白质沉淀，并且将上清液转移到干净的试管中，并在温和的氮气流下蒸发至干。将所得残余物在300μL的含有0.1％甲酸的水:乙腈(8:2v/v)的溶剂混合物中重构，然后使用0.45μm尼龙过滤器以10,000×g在室温处过滤3分钟。将滤液转移到96孔板中进行液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)分析。
LC-MS/MS分析：将Agilent 1260Infinity UHPLC联接到Bruker Q-TOF。质谱仪以正电喷雾电离模式操作。柱是Phenomenex,Luna C8(150×2.0mm ID，3μm)。流动相为A：0.1％甲酸的水溶液；流动相B：0.1％甲酸的乙腈溶液。在整个分析过程中使用流速为0.2mL/min的线性梯度，如下所示：
| 时间(min) | 乙腈％ |
| 0 | 5 |
| 5 | 5 |
| 20 | 95 |
| 24 | 95 |
| 24.5 | 5 |
| 30 | 5 |
根据上述HLM测定程序中的反应性代谢物测试式(I-A)的化合物并且不形成GSH加合物或KCN加合物。
生物学实施例4
人冷冻保存的肝细胞的体外代谢
用于式(I-A)的化合物的体外代谢的人肝细胞购自Bioreclamation IVT(Westbury,NY)；冷冻保存的男性人肝细胞(批号：UYG)。
肝细胞温育
将冷冻保存的肝细胞在冰上快速解冻，并且将小瓶放置于37℃水浴中大约90秒，然后立即添加到预热的肝细胞解冻培养基中。将细胞重悬于培养基中，然后在室温处以700×g离心7分钟。弃去上清液，并且将细胞重悬于2mL的含有12.5mM HEPES pH 7.4(KHB)的Krebs-Henseleit缓冲液中。通过台盼蓝排除法测定细胞活力和产量。然后将肝细胞在KHB中稀释至2×106个细胞/mL的细胞浓度(在10mL玻璃管中500μL/孔)。将管放置在供应有5％CO2的加湿器培养箱中的旋转振荡器上，并在使用之前允许在37℃处适应15分钟。然后将KHB中的式(I-A)的化合物或阳性对照双氯芬酸(10μM)添加到肝细胞中以达到10μM的最终浓度和1×106个细胞/mL的细胞浓度(1000μL最终培养体积)。将细胞温育零小时或3小时。在温育期结束时，将细胞用6体积的含有0.02％甲酸的冰冷乙腈淬灭，涡旋并超声处理(5min)。通过离心(3000rpm，10分钟，4℃)将沉淀的蛋白质沉淀，并且将上清液转移到硼硅酸盐管中，并在温和的氮气流下蒸发至干。
样品制备
将蒸发后得到的残余物在250μL的含有0.01％甲酸的水:乙腈(9:1v/v)中重构，超声处理并涡旋以帮助溶解药物衍生物质，然后在室温处使用0.45μ尼龙过滤器以10,000×g过滤10分钟。将滤液转移到96孔板中进行液相色谱/紫外/质谱(LC-UV/MS)分析。
LC/UV/MS(液相色谱/紫外/质谱)
LTQ/Orbitrap(Thermo Scientific,Inc.,Bremen,Germany)通过在单离子锁定质量模式下，对于全扫描MS以15,000的分辨率以及对于MS2(也称为MS/MS或串联质谱)以7,500的分辨率的数据依赖性精确质量测量来进行。使用来自Phenomenex,Inc.(Torrance,CA,US)的Kinetex苯基-己基柱(150×2.1mm ID，1.7μm)实现未改变的药物和代谢物的色谱分离，该柱保持在35℃处并用由水(溶剂A)和含有0.1％甲酸的乙腈(溶剂B)组成的非线性梯度洗脱。
未改变的药物及其代谢物的定量通过积分单独的色谱分离的UV峰并提供总峰面积的百分比来进行。
结果：
根据如上所述的体外代谢物测定程序测试式(I-A)的化合物。式(I-A)的化合物在人肝细胞中表现出低代谢周转，由温育产生三种氧化代谢物和两种葡糖苷酸代谢物。双氯芬酸用作研究的阳性对照，并且双氯芬酸从人肝细胞的代谢周转为89％，表明温育系统是有效的。(3-氟吡啶-2-基)甲醇部分是式(I-A)的化合物的主要代谢软点。羧酸代谢物，式(II-A)的化合物
是人肝细胞中的代谢物。
生物学实施例5：PK研究
动物：将雄性Sprague-Dawley大鼠(7-8周龄，体重250g-300g)放在塑料笼中，自由获取标准大鼠饮食(Keaoxieli,Beijing,China)和水。在实验前将动物保持在20-25℃的温度处，12小时光照/黑暗循环和40％-70％的相对湿度。
大鼠的药代动力学：在研究前2天-3天对大鼠的颈静脉插管进行预处理。将测试化合物(溶解在PEG400/水(1:1)中或悬浮在0.5％ HPMC中)经由口服管饲法以5mg/kg或10mg/kg的剂量口服施用至3只大鼠，并且将测试化合物(溶解在20％ HPbCD或PEG400/水(1:1)中)以1mg/kg或2mg/kg的剂量注射至3只大鼠的尾静脉。
在给药后0分钟(作为给药前)、5分钟(仅用于IV施用)、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、240分钟、360分钟、480分钟和1440分钟从颈静脉收集血液样品(各自大约0.2ml)。在获得每个血液样品后立即使用0.2ml体积的肝素化0.9％ NaCl可注射溶液剂(50U/mL)冲洗每根插管，以防止血液凝结和补偿流体损失。通过离心分离血液样品，并且将大约0.1ml血浆等分试样储存在-80℃处直至分析。
LC-MS/MS分析：通过液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)方法测定分析物。LC-MS/MS系统由Shimadzu HPLC系统(Kyoto,Japan)和配备有涡轮电喷雾电离(ESI)源的API5500三重四极质谱仪(AB Sciex,Toronto,Canada)组成。LC条件如下：柱，Synergi 2.5μPolar-RP 100A(50*3.0mm)(Phenomenex,Torrance,CA)；用含有0.1％甲酸的5％乙腈的水溶液或含有0.1％甲酸的95％乙腈的水溶液以0.5mL/min进行梯度洗脱；以及进样体积，10μL。选择多反应监测(MRM)方法进行定量分析。分析物和内标物的优化转变分别为Q1→Q3和M1→M3。仪器参数设定如下：离子喷雾电压：5500V；气帘气体：30psi；雾化气体：50psi；涡流气体：50psi；碰撞气体：10psi；温度：450℃。
数据分析：使用标准方法计算药代动力学参数，诸如从时间0至无穷大的血浆浓度-时间曲线下的总面积(AUC0–t)和终末半衰期，使用非房室分析(WinNonlin)，从实验数据直接确定峰值血浆浓度(Cmax)和达到Cmax的时间(Tmax)。
结果：根据上述测定程序测量式(I-A)的化合物的大鼠PK，结果列于下表B-2中：
表B-2：式(I-A)的化合物的大鼠PK
| IV清除率 | 19.6ml/min/kg |
| <![CDATA[t<sub>1/2</sub>(IV)]]> | 3.25h(制剂媒介物：20％HPbCD，2mg/kg) |
| <![CDATA[口服C<sub>max</sub>]]> | 3767ng/ml |
| <![CDATA[t<sub>1/2</sub>(PO)]]> | 2.66h |
| F | 53.4％(制剂媒介物：0.5％HPMC，10mg/kg) |
生物学实施例6：hERG测定
HERG(人ether-à-go-go相关基因)编码具有类似于心肌细胞中快速激活延迟整流器K+电流(IKr)的生物物理学特性的钾通道。该IKr电流有助于负责心脏动作电位的复极化阶段的K+电流。该电流的阻断可延长动作电位持续时间并导致长QT-综合征。QT延长的发展可导致室性心律失常诸如尖端扭转性室性心动过速的发生，其可导致猝死。
实验程序：使用单电极全细胞电压钳技术在单细胞水平上研究测试化合物对HERG电流的影响。
细胞：使用稳定转染HERG的人胚肾细胞系(HEK293)。将细胞连续保持培养。在使用前，将细胞接种到用聚-L-赖氨酸涂覆的小培养皿中。在接种后1天-2天对细胞进行实验。
溶液：电解液含有(以mM为单位)150NaCl、4KCl、5葡萄糖、10HEPES、1.8CaCl2和1MgCl2(pH 7.4，用NaOH)。移液管溶液含有(以mM为单位)120KCl、5EGTA、10HEPES、4MgATP、0.5CaCl2和2MgCl2(pH 7.2，用KOH)。将测试化合物溶解在DMSO中以产生10-2M或10-1M的储备溶液。对照(＝电解液+DMSO)和测试溶液(＝电解液+DMSO+测试化合物)含有0.3％或0.03％DMSO。使用Y-管系统将溶液应用于正在研究的细胞，从而允许快速改变细胞附近溶液(小于0.5s)。
电生理测量：通过EPC-9膜片钳放大器装置用膜片钳技术在不同的膜电位下测量细胞的膜电流。保持电位为-80mV。HERG电流(K+-选择性向外电流)被确定为在2秒去极化至+60mV后在-40mV处的最大尾电流。脉冲循环速率为15s。在每个测试脉冲之前，给出从保持电位至-60mV的短脉冲(0.5s)以确定(线性)漏电流。在建立全细胞构型后，5分钟平衡期允许用移液管溶液内部灌注细胞。此后，给予测试脉冲5分钟以量化对照条件下的HERG电流。在继续脉冲方案的同时，将灌注从对照溶液切换到含有测试化合物的溶液。在药物施用5分钟后测量测试化合物的效果。每个细胞测试一至三种浓度的测试化合物。
测量：HERG电流被确定为在从-80mV的保持电位开始2秒去极化至+60mV后在-40mV处的最大尾电流。
即使在对照条件下，HERG电流的幅度也随时间逐渐减小。为了准确量化测试化合物的阻断程度，必须考虑HERG电流的连续降低。因此，将HERG电流的时程以指数方式拟合至对照溶液中5分钟的初始时期，并外推至实验的其余部分。如果没有给出测试化合物，这些外推提供估计的电流幅度。为了确定测试化合物的阻断程度，计算外推至相同时间点的对照溶液中的测量电流与拟合电流之间的比率。
标准条件：将测试化合物溶解在DMSO中(最终DMSO浓度：0.3％或0.03％)。在药物施用5分钟后测量测试化合物对HERG电流的影响。
全或无标准：如果可观察到HERG电流降低超过5％，则认为R-化合物(部分)阻断HERG电流。
结果：根据上述程序在hERG测定中测试式(I-A)的化合物，并测量显示出>30μM的IC50。
生物学实施例7：AMES II测定
本研究的目的是评估化合物和/或它们的代谢物在哺乳动物代谢活化系统不存在和存在下诱导需要组氨酸的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株的基因中的回复突变以产生这些细菌的组氨酸非依赖性菌株的能力。Ames回复突变测试已经显示是广泛化学类别的诱变活性的快速和灵敏的指示物。
通过使用来自Xenometrics(Boulder,CA,USA)的Ames II诱变性测定试剂盒的内部适应性来评估诱变潜力。本研究中使用的菌株TA98和混合的TA(6个菌株的组合)能够分别检测移码突变和碱基对取代。
实验程序：将测试化合物溶解在DMSO中，并在所有时间以降低任何意外暴露于人员和环境的风险的方式进行处理。
在体外基因回复突变测试中，通过将鼠伤寒沙门氏菌的突变菌株暴露于不同浓度的测试化合物来测定效果。通常，鼠伤寒沙门氏菌能够合成其生长所需的组氨酸，但该测试中使用的突变菌株不能发挥该功能。当大量这些细菌暴露于诱变剂时，在一定比例的细菌群体中发生对原始组氨酸非依赖性形式的回复突变。这些菌落(回复体)由于其在组氨酸缺陷型培养基上生长的能力而易于检测。由于许多化合物直到它们被细菌细胞中不可用的酶系统代谢才发挥其诱变作用，因此将测试化合物和细菌在取自预先用已知诱导更高水平酶活性的化合物处理的动物的补充肝部分存在下温育。细菌回复突变测试使用需要氨基酸的鼠伤寒沙门氏菌的菌株来检测点突变，点突变涉及一个或几个DNA碱基对的取代、添加或缺失。该细菌回复突变测试的原理是其检测突变，其回复测试菌株中存在的突变并恢复细菌合成必需氨基酸的功能能力。通过它们在不存在亲本测试菌株所需的氨基酸的情况下生长的能力来检测回复体细菌。细菌回复突变测试已经显示是多种化学类别的诱变活性的灵敏、快速和准确的指示物。在该研究中使用鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98和混合的TA。它们是组氨酸依赖性的(his-)并且通过突变回复为组氨酸原养型(his+)。这些菌株具有增加其对诱变剂的敏感性的额外突变。在细菌中，几乎所有诱变剂对DNA造成的主要损伤都通过切除和修复系统进行修复，因此仅表达一小部分潜在的诱变损伤。uvrB突变是uvrB基因中的缺失，其导致缺陷型DNA切除修复系统，使得菌株对诱变剂更敏感。uvrB缺失延伸通过bio基因，使得细菌也需要生物素来生长。rfa突变(深度粗糙)影响细胞膜，使得正常脂多糖(LPS)细胞壁是有缺陷的。rfa突变增加了细胞壁对大分子(诸如那些含有大环系统的大分子)的渗透性，否则这些大分子将被正常细胞壁排除。含有质粒pKM101的菌株被许多诱变剂回复，这些诱变剂用携带非质粒的亲本菌株微弱地检测或根本检测不到。该pKM101质粒通过增强易错DNA修复系统而增加化学和自发诱变。
用于该测定中的鼠伤寒沙门氏菌的基因型列于下表B-3中。
表B-3：鼠伤寒沙门氏菌菌株的基因型
使用储存在-70℃以下的冷冻菌株，从新鲜的过夜Oxoid营养肉汤培养物制备测试菌株。通过用冷冻培养物接种Oxoid营养肉汤并在37℃处温育过夜来获得用于研究的细菌培养物。
体外代谢活化系统由大鼠肝酶(S9-级分)和含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)的能量产生系统(核心)构成。简言之，在处死前五天用500mg/kg的Aroclor 1254处理的来自由成年雄性Wistar大鼠制备的肝匀浆的9000×g上清液中含有酶。用Aroclor 1254处理用于诱导能够将化学物质代谢为更活性的形式的混合功能氧化酶。将S9级分保持冷冻在约-70℃处直至使用。S9级分在使用前立即解冻并与核心组合以形成下表B-4中所述的活化系统(S9-mix)。
表B-4：AMES活化系统(S9-mix)
| 组分 | 最终浓度 |
| NADP | 4mM |
| G-6-P | 5mM |
| Mg | 8mM |
| KCl | 33mM |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | 0.1M |
| S9 | 30％ |
标准条件：在即将使用前制备测试化合物浓度和S9-mix。在存在细菌的情况下，将所有浓度水平的测试化合物、阴性对照和阳性对照一式三份接种在24孔板中。在90min温育(37℃)步骤(轨道式振荡器，250rpm)后，将2.75ml指示剂培养基添加到每个孔中，随后根据固定模式将50μl体积转移到384孔板中。将384孔板在黑暗中在37℃处温育48h。温育后，通过对阳性孔的数量(在孔底部可见黄色或细菌菌落)进行评分来分析板。还记录了化合物在孔中可能沉淀的信息。通过细菌菌株和代谢活化系统，将单独的板计数直接输入到计算机中，该计算机允许每个板计数相对于对照或化合物的板计数正确呈现。
全或无标准：将溶剂对照板上的黄色孔的数量作为测试的突变背景水平。如果满足以下条件，则认为回复值为阳性：(a)与同时溶剂对照相比，测试化合物在一种或多种浓度水平下与一种菌株(TA98或混合的)产生的回复体的平均数增加至少三倍。由于菌株的性质，低自发突变率有时可导致溶剂对照中回复体孔的数量极低。此时，必须考虑历史背景水平；以及(b)观察到剂量-效应关系。
这些标准在大多数情况下都适用。如果获得模棱两可的结果，则需要更多测试来评估测试化合物的诱变潜力。如果测试化合物在单次测试中产生不能在另外的运行中再现的阳性响应，则初始阳性测试数据被打折扣。
对照实验：在认为测试有效之前，对阳性对照进行测试并显示回复体孔的数量比混合菌株和TA98的溶剂对照值增加至少三倍。
PIR-观察结果：记录如下：
PIR1＝回复体菌落没有增加
PIR2＝模棱两可的增加(无明显的剂量响应或再现性)
PIR3＝回复体菌落中明显的剂量相关和可再现的增加。
参考化合物：阳性对照制品是用于代谢活化实验的2-氨基蒽和用于无代谢活化实验的2-硝基芴和4-硝基喹啉-N-氧化物，如下表B-5所列。
表B-5：AMES参考化合物
| 化合物 | CAS编号 | 溶剂 | 最终浓度 | S9 | 菌株 |
| 2-氨基蒽 | 613-13-8 | DMSO | 5.0μg/ml | + | 所有菌株 |
| 2-硝基芴 | 607-57-8 | DMSO | 1.0μg/ml | - | TA98 |
| 4-硝基喹啉-N-氧化物 | 56-57-5 | DMSO | 1.0μg/ml | - | 混合的TA |
对照制品在所有时间以降低任何意外暴露于人员和环境的风险的方式进行处理。在使用前立即制备阳性对照制品溶液，并且每个培养物中将存在最终的2％ DMSO溶剂溶液。溶液中阳性对照制品的稳定性是未知的，但在预期范围内回复体菌落数量的增加证明了生物稳定性。
结果：根据上述程序测试式(I-A)的化合物，并在AMES II测定中确定为阴性。
生物学实施例8：体外微核测定
体外微核测试(MNT)是用于检测间期细胞的细胞质中的微核(MN)的遗传毒性测试。微核可源自无着丝粒染色体片段(即缺乏着丝粒)或不能在细胞分裂后期迁移至两极的整个染色体。在哺乳动物代谢活化系统不存在和存在下，评估化合物和/或其代谢物在TK6人淋巴母细胞样细胞系中诱导染色体/基因组畸变的能力。人TK6细胞经常用于体外微核测试，并且值得注意的是，这些细胞具有野生型p53状态，一些小组推测的特征可有助于降低假阳性结果的频率。通过手动和/或半自动显微镜分析进行评估。已经表明体外MNT是用于评估化学和物理试剂在原代细胞和细胞系中的遗传毒性潜力的灵敏测试。MN具有与间期核相同的形态，除了它们小于细胞中的主要核，因此称为“微核”。
使用TK6细胞的体外微核测试是公认的调节性遗传毒性测试。设计涉及TK6中的微核测定的研究以满足由OECD 487测试指南和ICH S2(R1)发布的当前国际指南的要求。
参考化合物：同时使用阳性对照试剂以确保测试系统的响应性并证明代谢系统将前诱变剂转化为活性代谢物的潜力，但不提供用于与测试项目比较的标准。本测试中用于每种处理条件(处理时间和代谢活化)的阳性对照化学品如下表B-5所示。用于每种阳性对照化学品的溶剂和每种条件下的最终测试浓度如下表B-6所列。
表B-6：阳性对照
含有二甲基亚砜(DMSO)的同时阴性(媒介物)对照；CAS编号67-68-5)的同时阴性(载体)对照(最终DMSO浓度为1％)。
测定原理：将细胞培养物在具有和不具有外源代谢活化源的情况下暴露于测试化合物。同时阴性、溶剂/媒介物和阳性对照包括在所有测试中。在暴露于测试化合物期间或之后，使细胞生长足以使染色体或纺锤体损伤以导致间期细胞中微核形成的时间。分析收获和染色的间期细胞中微核的存在。重要的是证明所分析的细胞可能在暴露于测试化合物期间或之后经历细胞分裂。对于所有方案，重要的是证明在对照和处理的培养物中发生细胞增殖，并且在对微核评分的培养物中评估测试化合物诱导的细胞毒性和/或白细胞郁滞的程度。总持续时间允许细胞完成至少一次分裂，并且因此将诱导的病变表达为微核(即，应当发生1-5-2.0次细胞倍增)。
使用两种处理方案进行体外微核测试：在存在基于大鼠肝脏S9的代谢活化系统(S9 mix)的情况下处理三小时，并且在不存在S9 mix的情况下连续处理大约24小时。根据需要，进行第二次测试以确认第一次的结果。
测定中使用的装置：冷冻机(大约-10℃至-30℃)；冷冻机(大约-80℃)；冷藏机(大约2℃至8℃)；离心机(能够离心96孔板)；CO2调节的37℃培养箱；Z1库尔特计数器；ShandonCytospin 4Thermo；涡旋混合器；超声波浴(Grant Water Bath OLS 200)；显微镜(AxioImager 2–Zeiss)；和显微镜(GXML3201–GX显微镜)
测定中使用的测试特定材料：细胞系TK6(ATTC CRL-8015)；R10P培养基；含有RPMI1640+GlutamaxTM–I(GibcoTM61870044)+马灭活血清(Gibco 16050-122)+青霉素/链霉素(Gibco 15140-122)+丙酮酸钠(Gibco 11360-039)+普朗尼克酸(Gibco 24040-032)的培养基；离心管(15ml/50ml)-5mL圆底管(Corning/falcon 352054)；微量移液器/多通道细胞培养瓶T75(Falcon，BD-目录号353136)；96孔板U形底，无菌，聚苯乙烯(Star Lab E2996-1700)；气密密封膜(Sigma Aldrich/Merck2380059)；96孔平底板，带盖无菌-96孔板V形底，无菌，聚苯乙烯(Thermo Fisher 249662)；DMSO(Fisher BP231-100)
方法和程序：将测试化合物溶解在DMSO(二甲基亚砜)中。根据需要采用涡旋混合、超声处理和升温至37±2℃以帮助溶解。将测试化合物在室温处避光保存。在DMSO中配制并用于初始实验后，将剩余配制的测试化合物在室温处储存在与干燥剂一起避光的通风储存柜中。
在给药前立即根据相关的Gentronix标准操作程序制备测试化合物制剂。简而言之，制备测试化合物在溶剂中的储备溶液，然后在相同溶剂中稀释以配制所需浓度。用于任何后续测试的剂量基于初始测试中的结果。
TK6细胞系购自欧洲认证细胞培养物保藏中心。然后将其用于产生TK6细胞的内部主原液，并由此产生工作原液。所有原液储存在液氮中。将细胞维持在对数期，每1-4天在含有10％热灭活马血清(Gibco,Life Technologies,UK)、抗生素和Pluronic F68的RPMI1640中传代一次。
用2.2μl测试化合物溶液或阳性对照溶液处理TK6培养孔；用相同体积的溶剂处理阴性对照培养物。将218μl的细胞添加到孔中。最终总体积为220μl。
测定程序：
第1天：将TK6细胞以大约200,000个细胞/ml的密度接种到T75培养瓶中(5％ CO2，在37℃处)。
第2天：在处理当天，在平底96孔板中以200,000个细胞/ml的密度制备培养物。将细胞用至少24个浓度的测试化合物处理，重复3次(DMSO的最终浓度为1％)。包括同时阴性、媒介物和阳性对照。进行至少2种可能的处理设计。将细胞在大鼠代谢活化系统存在下处理3小时，之后将培养物离心(在U形底96孔板中)，用培养基洗涤，然后用新鲜培养基再悬浮以进行处理后恢复期(在U形底96孔板中)。用Z1库尔特计数器对细胞进行计数。在没有代谢活化的情况下进行连续治疗(23小时-28小时)。
用于代谢活化的哺乳动物肝脏线粒体后级分(S9匀浆)由用Aroclor1254诱导并购自Molecular Toxicology Inc.(MOLTOX,USA)的雄性Sprague Dawley大鼠制备。将S9批次冷冻储存(-80℃)并在临使用前解冻。由制造商证明每个批次的无菌性、蛋白含量、细胞色素P450催化的酶活性和将已知前诱变剂转化为细菌诱变剂的能力。S9级分需要外源辅因子用于活化。使用的辅因子由购自Apollo的NADPH再生系统组成。在R10P培养基中如下制备辅因子试剂：(a)7.0g/L的葡萄糖-6-磷酸(摩尔重量260.14)，最终溶液为25mM；以及(b)3.8g/L的NADP(摩尔重量743.41)，最终溶液为5mM。
将等量的两种溶液混合并用1M氢氧化钠水溶液调节至pH 7.2。将溶液过滤灭菌并将大约5.5mL等分试样分配到合适的容器中。所有溶液在大约-80℃处储存并在六个月内使用。
将S9匀浆调节至30mg/mL的蛋白含量，然后添加到培养基中。测试系统中肝匀浆(S9)的最终浓度为2.0％：
第3天：细胞毒性概况：处理后，使用Z1库尔特计数器通过重复培养孔之一的细胞计数来确定活细胞的数量，以计算群体倍增数(PD)和相对群体倍增数(RPD)：
PD＝[log(Ni/N0)]/log 2
其中N0：时间零点的基线计数；Ni：给定时间点(i，温育结束)的细胞浓度。对于经处理的培养物，PD表示为同时媒介物对照中PD数量的百分比。
RPD＝[经处理的培养物中的PD数/对照培养物中的PD数]×100
基于获得的细胞毒性概况，选择测试化合物浓度(每个处理组)用于MN分析。目的是选择至少一种覆盖55±5％细胞毒性的浓度。如果未观察到细胞毒性或沉淀，则最高测试浓度选择为对应于1mM或500μg/ml，以较低者为准(ICH S2(R1)，2011)。当溶解度是限制因素时，最大浓度是在培养物中可见最小沉淀的最低浓度，条件是对评分没有干扰。在处理结束时通过光学显微镜法进行沉淀的评估。
显微镜分析：处理后，将细胞离心(细胞离心涂片器)到载玻片上，在甲醇中固定并用吖啶橙(手动分析)或DAPI(半自动分析)染色。对于所有选择的测试条件(测试化合物和阳性对照)，由单独的培养物制成细胞载玻片：2个培养物用于显微镜分析。
进行(盲编码的细胞载玻片的)显微镜分析以确定微核细胞(MNC)的数量。在每个测试条件至少2000个单核细胞(每个培养物至少1000个细胞；每种浓度2个培养物)中评估微核的存在。作为遗传毒性的量度，MNC的数量用于计算MNC的百分比：
MNC％＝[MNC数/分析的单核细胞数]×100
此外，计算经处理的培养物中MNC与同时媒介物对照相比倍数增加：
MNC的倍数增加＝经处理的培养物中的MNC％/VC培养物中的MNC％
对于半自动分析，还手动评估获得的图像(Metafer 4.0.8和Neon1.1.6)以排除假阳性。为了确认获得的结果，通过手动显微镜分析验证特定浓度。手动显微镜分析允许量化另外的细胞效应，诸如双核(BN)、多核(POLY)和凋亡(APO)细胞的诱导；通常不通过半自动分析量化的端点。
显微镜评分标准：由分析人员选择合适的载玻片区域(即，不过于薄或密集地展开)。细胞不应重叠，并且细胞质必须在细胞核周围清晰可见。根据以下标准确认或拒绝疑似MN：(a)MN直径小于主核直径的三分之一并位于细胞的完整细胞质内；(b)MN染色均匀，颜色相同并与主核在同一焦平面内；(c)MN是非折射的和球形的，具有良好限定的轮廓；以及(d)MN不与主核联结或连接。注意不要对具有不规则形状或两个核大小差异很大的双核细胞进行评分；双核细胞也不会与扩散差的多核细胞混淆。分析多核细胞的微核。
测试验收标准：如果满足以下条件，则认为处理条件对于评估遗传毒性效应是可接受的：(a)在媒介物对照培养物中发生至少1.5次细胞群体倍增；(b)媒介物对照培养物中MNC的频率接近来自Gentronix的历史对照数据库和/或公布值的可接受范围的频率；(c)阳性对照化合物诱导MNC频率的生物学显著增加(统计学上显著且在历史媒介物对照范围之外)高于同时媒介物对照值；(d)最大浓度达到(i)约55±5％的细胞毒性限值(RPD＝45±5％)，(ii)溶解度限值或(iii)500μg/ml或1mM，以较低者为准。注意，测试验收标准不是绝对的，并且其它情有可原的因素可进入最终的可接受性决策。根据需要独立地重复实验以满足验收标准。
测试评估标准：如果符合测试验收标准，则基于OECD 487测试指南(2016)使用以下标准来评估结果：
明显阳性(得分3)：(a)与同时媒介物对照相比，至少一个测试浓度诱导统计学上显著的(Fisher精确检验，p值<0.05)增加。(b)当用趋势检验(Cochran Armitage检验，p值<0.05)评估时，MNC的增加在至少一个实验条件中是剂量相关的。(c)MNC的任何统计学上显著的增加都超出实验室历史媒介物对照数据的分布(基于Poisson的95％置信限)。在至少一个实验条件(处理组)中满足所有上述标准的测试化合物被认为能够在该系统中诱导生物学相关的染色体断裂和/或染色体增加或丢失。
明显阴性(得分1)：(a)与同时媒介物对照(Fisher精确检验)相比，测试浓度均未诱导统计学上显著的增加。(b)用趋势检验评估的MNC中没有浓度相关的增加(p值<0.05)。(c)所有结果都在历史媒介物对照数据的分布内(95％对照限值)。满足所有上述标准的测试化合物被认为不能在该测试系统中诱导染色体断裂和/或获得或丢失。
模棱两可(得分2)：通过专家判断和/或进一步研究(例如分析来自现有实验的更多细胞或用调整的浓度范围重复测试)来评估仅满足上述关于明显阳性或明显阴性响应的标准中的一些标准的测试化合物。在极少数情况下，即使在进一步调查之后，数据集也无法得出肯定或否定的结论，因此结果被视为模棱两可。
不确定(得分0)：不符合测试验收标准，在最终化合物分类之前需要进一步测试。
注意，不需要验证明显阳性或明显阴性结果。前述标准不是绝对的，并且其它情有可原的因素可进入最终的评估决策。趋势检验仅被认为对观察到统计学上显著的MN诱导的那些实验有效。
结果：根据上述体外MNT测定程序测试式(I-A)的化合物，并且其为阴性(得分为1)。
生物学实施例9
使用IC50偏移法评估TDI潜力
为了确定特定P450同工酶的TDI潜力，将测试化合物在辅因子NADPH存在下与HLM在一定浓度范围(通常0.04μM至10μM)内预温育30分钟。预温育后，然后以固定浓度添加已知被所研究的同种型特异性代谢为确定的代谢物的探针底物。在预定的温育期(例如，对于CYP3A4睾酮测定为10分钟)后，通过添加含有内标物的合适的有机溶剂(通常为乙腈)来终止反应。在通过LC-MS/MS分析进行分析之前将样品离心，并且使用曲线拟合计算IC50 TDI值。将其与当在不存在测试化合物的情况下进行预温育步骤时获得的可逆抑制的IC50(IC50 Rev)进行比较。预温育后IC50的向左移动(即抑制增加)表明该同工酶的TDI潜力。IC50偏移值计算为IC50 Rev/IC50 TDI的比率。
在全自动Tecan机器人系统上进行测定。使用探针底物代谢物的稳定标记的内标物经由LC-MS/MSMS进行样品分析。
最终的温育条件列于下表B-7中：
表B-7：温育条件、TDI潜力测定
结果：CYP3A4(睾酮)：在标准溶剂条件下，根据如上所述的TDI潜力测定来测试式(I-A)的化合物。在没有预温育的情况下，测量的IC50为12.2±1.4μM(68.2％最大浓度)。在预温育的情况下，测量的IC50为17.5±2.5μM(62.8％最大浓度)。IC50偏移为0.70。
生物学实施例10
人肝微粒体CYP450混合物抑制测定
混合物DDI测定用于评估测试化合物在早期发现中经由抑制临床上重要的P450同种型(CYP1A2、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4)引起药物-药物相互作用的潜力。通过使用已知被所研究的同种型选择性代谢为确定的代谢物的特定探针底物的混合物来实现测试化合物对每种同种型的抑制潜力的区分。例如，已知右美沙芬(dextromethorphan)仅被2D6同种型脱甲基化。探针底物在人肝微粒体(HLM)中与抑制剂浓度范围内的测试化合物共温育允许同时计算多种CYP同种型的IC50值，并且因此与传统的单探针测定相比提供更高的通量。
方法和程序：温育中的最终蛋白质浓度为0.2mg/ml并且温育时间为10分钟。温育中的最终总溶剂为0.15％ DMSO和0.8％乙腈。在具有多通道移液工具(8通道和96通道)的Beckman Biomek FX自动化液体处理器上，在甲板试剂冷却能力和具有平板摇动设施(Kendro)的集成的自动化Cytomat培养箱(37℃)上自动进行测定。
测试化合物以5mM DMSO储备溶液提供。使用Na2HPO4π12H2O和KH2PO4在室内制备0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)。
将冷冻的人肝微粒体(HLM)在37℃处解冻，同时定期搅拌直至整个体积解冻，然后保持在冰上。基于HLM批次的蛋白质浓度，将悬浮液在测定缓冲液和探针底物混合物(每种CYP同种型的底物)中进一步稀释，得到0.2mg/mL的最终蛋白质浓度。
在测定缓冲液(非那西汀(phenacetin)、甲苯磺丁脲、S-美芬妥因、右美沙芬)或水(阿莫地喹(amodiaquine)、咪达唑仑(midazolam))中分别制备探针底物。将它们与HLM和测定缓冲液组合(以每种底物合适的浓度)，得到最终的酶/底物混合物。
温育中的最终总溶剂为0.15％ DMSO和0.8％乙腈。制备NADPH(5.27mM)作为测定缓冲液(室温)中的溶液。将含有七种探针底物代谢物中的每一种的氘化类似物的淬灭溶液以适当浓度溶解在乙腈中。
测定程序：通过将适当体积的酶/底物混合物(80μl)和测试或参考抑制剂的储备溶液(从稀释系列中添加的1μl溶液)组合来制备用于温育的样品。在预温育期(通常为10分钟)后，通过添加NADPH溶液(19μl，5.27mM)来引发反应。将样品在37℃处温育10分钟。通过添加1.6体积的冷藏的淬灭溶液来淬灭培养物。然后将培养物在4℃处以4000rpm离心10分钟。将限定体积的上清液(S/N)转移到单独的容器中并用水稀释(S/N:水＝60μL/180μL)。使用LC/MS方法将每个样品进样到UPLC/MS系统上，该LC/MS方法选择性地同时测量所有七种探针底物代谢物(和相关的氘化内标物)。
计算和公式：活性百分比计算为
活性％＝(Ri/R)*100
其中Ri和R分别是在存在和不存在TC的情况下的代谢物与内标物峰面积比。然后将活性百分比数据对log(TC浓度)进行作图，并且使用3DX内的数据缩减工具将曲线拟合至数据以返回IC50。具体地，工具中使用的算法基于S形四参数关系：响应(活性％)作为浓度的函数，其中四个参数为IC50、Hill斜率、基线和范围，并且它们之间的关系是：
响应＝范围/(1+(浓度/IC50)^Hill)+基线。
使用上述关系的最佳拟合线是使用Marquardt-Levenberg的非线性拟合算法实现的。由七个单点浓度生成的曲线用于计算IC50。
结果：根据上述TDI潜力测定程序测试式(I-A)的化合物，其中测量的针对人肝微粒体的IC50值列于下表B-8中。
表B-8：人肝微粒体抑制
| HLM | <![CDATA[计算的IC<sub>50</sub>]]> |
| 1A2 | <![CDATA[IC<sub>50</sub>>20μM<!-- 73 -->]]> |
| 2C19 | <![CDATA[IC<sub>50</sub>>20μM]]> |
| 2C8 | <![CDATA[IC<sub>50</sub>>20μM]]> |
| 2C9 | <![CDATA[IC<sub>50</sub>>20μM]]> |
| 2D6 | <![CDATA[IC<sub>50</sub>>20μM]]> |
| 3A4 | <![CDATA[IC<sub>50</sub>：14.4μM]]> |
生物学实施例11：Seahorse测定
该测定的目的是使用Agilent Seahorse XFe96分析仪研究式(I-A)的化合物对HepG2细胞中线粒体呼吸的影响。还与Seahorse测定平行地在HepG2细胞中测定细胞活力。
HepG2细胞中线粒体呼吸的测量：在100％ DMSO中制备化合物剂量，随后在测定培养基中稀释以达到0.10％的最终溶剂浓度。将HepG2细胞以40,000个细胞/孔的密度在含有10％ HI FBS和1X Pen/Strep细胞培养物的EMEM中接种在Seahorse板(AgilentTechnologies,Santa Clara,California)中过夜。将培养物用含有Seahorse XF基础培养基(Agilent，部件号103334-100)、16mM谷氨酰胺、5.5mM葡萄糖和8mM丙酮酸盐的测定培养基洗涤两次。洗涤后，添加175μl测定培养基，并且将板置于37℃(无CO2)培养箱中开始测定。根据制造商的方案，使用Seahorse Mito Stress测试测定在Agilent Seahorse XFe96分析仪上测量线粒体呼吸，以耗氧率(OCR)定量。简而言之，为了评估化合物对线粒体功能的特异性作用，添加每种测试化合物(浓度为0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM和100μM)或媒介物对照(0.1％ DMSO)，随后依次添加三种线粒体调节剂，每种调节剂改变细胞的独特代谢参数。分别地，首先是2μM寡霉素(一种复合物V(ATP合酶)抑制剂)，随后是1μM FCCP(羰基氰-对三氟甲氧基苯腙)(一种解偶联试剂)，以及最后是0.5μM鱼藤酮/抗霉素A的组合(复合物I和III抑制剂)。
细胞活力测量：将HepG2细胞以40,000个细胞/孔的密度在含有10％HI FBS和1XPen/Strep的EMEM中接种到黑壁96孔板上并使其附着过夜。第二天，制备测试化合物并将其在EMEM中稀释。在与测试制品温育一小时后，根据制造商的方案使用Cell Titer Fluor测定(Promega，目录号G6081)评估细胞活力。活力测定监测组织蛋白酶(在活细胞中发现的普遍存在的蛋白酶)的活性。
数据分析：通过从最大呼吸速率中减去基础呼吸速率来计算线粒体SRC(备用呼吸量)。SRC值由报告生成器(Agilent Technologies-版本4.0)自动生成。所有实验一式三份进行，并且计算每个测试浓度的平均值和标准偏差。将所有数据归一化为媒介物对照。
IC50值通过非线性回归和将剂量响应曲线拟合成具有可变斜率(Hill系数)的双参数方程来确定：
Y＝[100/(1+10^([logTC50-X]*Hill系数))]
其中Y是0％和100％之间的归一化响应，并且X是log(抑制剂浓度)。使用GraphPadPrism 7.0(San Diego,California)进行所有分析。
结果：根据上述的Seahorse测定程序测试式(I-A)的化合物，并表现出对IC50>100μM的线粒体呼吸没有直接影响，如通过备用呼吸量所测量。对细胞活力也没有影响，IC50>100μM。
生物学实施例12
兔子AV分流(血栓形成)测定和离体凝血时间
雄性新西兰白兔(NZW)购自Charles River Lab(CRL)，体重范围为2.45kg-3.22kg，以及约10-14周龄。将动物圈养在标准兔笼中，每笼一只动物，并在动物房中保持在22℃处，12h日光循环。提供标准兔子饮食和水，以及丰富的水果和胡萝卜。未提供绿叶以避免干扰抗凝剂研究。
如文献中所述建立兔子AV分流模型(Wong,P.C.等人,Nonpeptide factor Xainhibitors III:e ects of DPC423,an orally-active pyrazole antithromboticagent,on arterial thrombosis in rabbits,J Pharmacol Exp Ther,2002；第993-1000页，第303(3)卷)。将兔子随机分成不同的实验组，并且组大小(n＝2-5)根据测试化合物的可用性而变化。
将盐酸开他敏(20.0mg/kg-50.0mg/kg，IM)和甲苯噻嗪(2.0mg/kg-10.0mg/kg，IM)用于麻醉导入。在研究期间，根据需要(即，大约每30分钟-50分钟)用盐酸开他敏(以22.7mg/kg-25.0mg/kg/～0.5小时，IM)和甲苯噻嗪(以2.27mg/kg-5.0mg/kg/～0.5小时，IM)提供随后的麻醉维持。另选地，诱导兔子并随后保持异氟烷气体麻醉剂(2-4％异氟烷和经由鼻锥0.9L/min-1.2L/min的O2流速)。
麻醉后，在每条大腿上做2cm切口以分别从相对的大腿暴露股动脉和静脉。用PE-100管对静脉和动脉进行插管。在血管插管之后，使兔子平衡20分钟。然后将AV分流装置连接在股动脉(一条大腿)和股静脉(另一条大腿)插管之间。分流装置由外部TYGON管片(长度，8cm；内径，7.9mm)和内部管片(长度，2.5cm；内径，4.8mm)组成。分流器还含有8cm长的2-0丝线作为血栓形成的触发器。开始血液流经分流器四十(40)分钟后，断开分流器，并取出丝线以及凝块并称重。
以下测试化合物和媒介物用于兔子AV分流研究：
·式(I-A)的化合物与35％羟丙基β-环糊精(HPβCD)在10mM磷酸盐缓冲液(pH7)中的媒介物；
·70/20/10PEG/水/乙醇的媒介物。
每天以不同剂量在媒介物中新鲜制备给药溶液。在开始AV分流血栓形成研究(初始或负荷剂量)之前20分钟，经由耳缘静脉使用静脉内给药施用媒介物或测试化合物，随后连续输注40分钟(维持剂量)。
统计分析：所有数据表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism软件(v8.0)进行统计分析。以p<0.05定义显著性，如通过单因素ANOVA所确定。将Tukey检验用于多重比较。
结果：
与媒介物相比，式(I-A)的化合物的血栓重量减少如下表B-9中所列。
表B-9：凝血酶重量
离体凝血测定：
以下凝血试剂购自Diagnostica Stago(Parsippany,NJ)：针对凝血酶时间(TT)的Thrombin 10(目录号：00611，批号：251851)，针对凝血酶原时间(PT)的
Cl 5(目录号：00666，批号：01504)，针对活化部分凝血活酶时间(aPTT)的
5(目录号：00597，批号：112768)和CaCl2(0.025M，目录号：00367，批号：254158)。凝血计STA rt4(Diagnotica Stago)用于离体凝血时间分析。
在从股动脉插管建立分流之前和之后，在3.2％柠檬酸钠(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)中收集血液样品(各1mL)，并在20℃处以2500g离心15分钟。将所得贫血小板血浆(PPP)转移到干净的试管中并储存在80℃处直至使用。
在4通道凝血计STA rt4(Diagnotica Stago)中用PPP进行凝血测定。对于aPTT分析，50μl C.K.将预设的试剂与50μl PPP在37℃处在比色杯中温育3min，并通过添加50μl25mM CaCl2引发凝血。记录凝血开始时间作为凝血时间。
统计分析：所有数据表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism软件(v8.0)进行统计分析。以p<0.05定义显著性，如通过单因素ANOVA所确定。将Tukey检验用于多重比较。
结果：
与媒介物相比，测量的式(I-A)的化合物的凝血开始如下表B-10和表B-11中所列。
表B-10：个体兔子离体aPTT凝血开始时间
a测试时间点是初始给药后
表B-11：离体aPTT凝血开始时间
a测试时间点是初始给药后
制剂实施例1
固体口服剂型-假想实施例
作为口服组合物的具体实施方案，将100mg如上文实施例5中制备的式(I-A)的化合物或上文实施例13中制备的式(II-A)的化合物与足够细碎的乳糖一起配制以提供580mg至590mg的总量来填充O号硬凝胶胶囊。
尽管上述说明通过提供的实施例进行说明来指出了本发明的原理，但应当理解，本发明的实践涵盖以下权利要求书及其等同形式的范围内的所有一般变型形式、改变形式和/或修改形式。
在整篇本申请中，引用了多篇出版物。由此将这些出版物的公开内容以引用方式并入本申请中，以更全面描述本发明所属技术领域的现状。
Claims (26)
1.一种式(I)的化合物
或其互变异构体、立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物。
2.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有式(I-A)
或其互变异构体、立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物。
3.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物选自
(a)式(I-B)的化合物
(b)式(I-C)的化合物
(c)式(I-D)的化合物
(d)式(I-E)的化合物
(e)式(I-F)的化合物
(f)式(I-G)的化合物
(h)式(I-H)的化合物
(j)式(I-J)的化合物
(k)式(I-K)的化合物
或其互变异构体、立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物。
4.一种式(II)的化合物
或其互变异构体、立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物。
5.根据权利要求4所述的化合物，所述化合物具有式(II-A)
或其互变异构体、立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物。
6.一种式(III)的化合物
或其互变异构体、立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物。
7.根据权利要求6所述的化合物，所述化合物具有式(III-A)
或其互变异构体、立体异构体、同位素体或药学上可接受的盐或溶剂化物。
8.一种化合物，所述化合物选自由以下项组成的组
(a)式(IV-A)的化合物
或其立体异构体、同位素体或盐；
(b)式(V-A)的化合物
或其立体异构体、同位素体或盐；
和(c)式(VI-A)的化合物
或其立体异构体、同位素体或盐。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物。
10.一种用于治疗或预防(a)血栓栓塞性病症；(b)炎性病症或某种病症；或(c)其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述血栓栓塞性病症选自由以下项组成的组：动脉心血管血栓栓塞性病症、静脉心血管血栓栓塞性病症、动脉脑血管血栓栓塞性病症和静脉脑血管血栓栓塞性病症。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述血栓栓塞性病症选自由以下项组成的组：不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、心房纤颤、首发性心肌梗塞、复发性心肌梗塞、缺血性猝死、短暂性脑缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞性动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉栓塞形成、脑动脉栓塞形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由人工瓣膜或其它植入物、留置导管、支架、心肺旁路术、血液透析或其中血液暴露于促进血栓形成的人工表面的其它手术引起的血栓形成。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述血栓栓塞性病症选自由遗传性血管水肿(HAE)和糖尿病性黄斑水肿(DME)组成的组。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述炎性病症选自由脓毒症、急性呼吸窘迫综合征和全身炎性响应综合征组成的组。
15.根据权利要求10所述的方法，其中牵涉血浆激肽释放酶活性的所述疾病或病状选自由以下项组成的组：视敏度受损、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、遗传性血管水肿、糖尿病、胰腺炎、肾病、心肌病、神经病变、炎性肠病、关节炎、炎症、脓毒性休克、低血压、癌症、成人呼吸窘迫综合征、弥散性血管内凝血和心肺旁路手术。
16.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物制备用于在对其有需要的受试者中治疗或预防(a)血栓栓塞性病症、(b)炎性病症或(c)其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状的药物的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述血栓栓塞性病症是(a)动脉心血管血栓栓塞性病症、(b)静脉心血管血栓栓塞性病症、(c)动脉脑血管血栓栓塞性病症或(d)静脉脑血管血栓栓塞性病症。
18.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物，所述化合物用于在对其有需要的受试者中治疗或预防(a)血栓栓塞性病症、(b)炎性病症或(c)其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状的方法中。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中对其有需要的受试者中的所述血栓栓塞性病症选自由以下项组成的组：(a)动脉心血管血栓栓塞性病症、(b)静脉心血管血栓栓塞性病症、(c)动脉脑血管血栓栓塞性病症和(d)静脉脑血管血栓栓塞性病症。
20.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物，所述化合物用作药物。
21.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物，所述化合物用于在对其有需要的受试者中治疗或预防(a)血栓栓塞性病症、(b)炎性病症或(c)其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状。
22.根据权利要求21所述的化合物，所述化合物用于在对其有需要的受试者中治疗或预防选自由以下项组成的组的血栓栓塞性病症：(a)动脉心血管血栓栓塞性病症、(b)静脉心血管血栓栓塞性病症、(c)动脉脑血管血栓栓塞性病症和(d)静脉脑血管血栓栓塞性病症。
23.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物，用于治疗或预防(a)血栓栓塞性病症、(b)炎性病症或(c)其中牵涉血浆激肽释放酶活性的疾病或病状。
24.根据权利要求23所述的组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的化合物，用于治疗或预防选自由以下项组成的组的血栓栓塞性病症：(a)动脉心血管血栓栓塞性病症、(b)静脉心血管血栓栓塞性病症、(c)动脉脑血管血栓栓塞性病症和(d)静脉脑血管血栓栓塞性病症。
25.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物，所述化合物用于根据权利要求10至15中任一项所述的方法中。
26.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的化合物制造用于根据权利要求10至15中任一项所述的方法的药物的用途。
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